2012.11.27.
Neuronok előkészítése funkcionális vizsgálatokra. Az alkalmazható technikák előnyei és hátrányai
A központi idegrendszer funkcionális vizsgálata Molekuláris biológia: fehérjék, RNS, DNS jelenlétének detektálása Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális vizsgálata Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok vizsgálata Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak vizsgálata Szelet elektrofiziológia 2.: lokális neuronális hálózatok Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok vizsgálata Nagyobb agyi struktúrák vizsgálata: ferde megvilágítás (IR-LED) In vivo mérések: elektrofiziológia, optogenetika
2012.11.27. Pál Balázs
Viselkedési tesztek Klinikai vizsgálatok
Neuronok izolálása I – Az agy kipreparálása – A megfelelő agyterület elkülönítése • A funkcionális mérések és a preparálás mesterséges agyfolyadékban történnek (artificial Cerebro Spinal Fluid aCSF). Az aCSF a liquor ionösszetételét utánozza.
– A sejtek tényleges izolálása: • Általában egy kombinált enzimatikus emésztés és ezt követő mechanikai szétválasztás
Neuronok izolálása III
Neuronok izolálása II – Enzimatikus kezelés (fehérjék részleges hasítása; a protokoll laboratóriumonként változhat) pl.: • Collagenase/pronase (papain)
– – – –
Időtartam: 20-50 perc Hőmérséklet: 31 °C Folyamatos oxigenizáció Az enzimatikus emésztés leállítása (oldatcsere/ enzim inhibitor)
Festetlen minták mikroszkópos vizsgálata
•Az enzim kezelés után a sejteket nagyon óvatos mechanikai kezeléssel választjuk el egymástól. • A neuronok kiülepítése A kitapadást a poli-D-lysinnel bevont fedőlemez használata segítheti
•A neuronok vizualizálásához fázis kontraszt mikroszkópot használunk. (Vagy differenciál interferencia contrast mikroszkópiát.)
Fény mikroszkópia
Fázis kontraszt mikroszkópia
Nomarsky optika (DIC)
forrása: Animal Physiology – Mechanisms of adaptation
1
2012.11.27.
Előnyök és hátrányok Előnyök: • Kisebb eszközigény • Nem igényel nagy kézügyességet és gyakorlatot Hátrányok: • enzim kezelés – csatorna és receptor fehérjék sérülhetnek • A szövettani szerkezet NEM megtartott, a neuronok morfológiája is megváltozik • Az egyes idegsejt-típusok elkülönítése is nehézzé válik
Idegsejt tenyészetek létrehozása
1. Az idegsejtek izolálása a fentiek szerint 2. Az izolált sejtek életbentartása sejttenyészeti körülmények közt 3. A neuronok tenyésztésénél segíthet: NGF ASZTROCITÁkkal együtt tenyésztés - KOKULTÚRA
KOKULTÚRA
Idegsejt tenyészetek II
• Az asztrociták egy „ágyat” képeznek melyre ülepítve az idegsejtek, jelentősen növelhető a neuronok túlélése • Az asztrociták osztódnak a sejttenyészeti körülmények közt, az idegsejtek viszont nem. A gliasejtek osztódását ezért le kell állítani amikor a „monolayer” kész – fluoro-dezoxiuridinnel (FdUR).
Glia sejt marker : GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) Neuron marker : Beta III tubulin
Autaptikus kultúra
forrás: RD systems
Előnyök és hátrányok Előnyök: • folyamatos idegsejt kísérletekhez
ellátást
biztosíthat
funkcionális
Hátrányok: • A háttér asztrocita tenyészetet folyamatosan fenttartani nem könnyű. • Drága a sejttenyésztési körülmények biztosítása miatt. • A tenyészet befertőződésére mindig figyelni kell. Kammermeier P J , Worley P F PNAS 2007;104:6055-6060
©2007 by National Academy of Sciences
2
2012.11.27.
Organotópiás szelet
A központi idegrendszer funkcionális vizsgálata Molekuláris biológia: fehérjék, RNS, DNS jelenlétének detektálása Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális vizsgálata Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok vizsgálata Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak vizsgálata Szelet elektrofiziológia 2.: lokális neuronális hálózatok Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok vizsgálata Nagyobb agyi struktúrák vizsgálata: ferde megvilágítás (IR-LED)
Előnyök
Hátrányok
• Krónikusan fenntartható és kezelhető
• A gliasejtek túlnövik a neuronokat
• Az eredeti hálózatok részben megőrzöttek
• Felbomlik a hálózatok eredeti struktúrája
A vékony szelet preparátum • „Patch-clamp
mérések csak izolált neuronokon végezhetőek, melyek sejtmembránja tiszta, könnyen hozzáférhető” • Vagy mégsem...?
Bert Sakmann
In vivo mérések: elektrofiziológia, optogenetika Viselkedési tesztek Klinikai vizsgálatok
A preparálás legfontosabb lépései • Az agy (adott agyterület) kipreparálása • Az agy/agyterület leragasztása (a szeleteléshez) • 200-400 mikrométer vastag agyszeletek készítése (vibrotómmal) • A szeleteket 30-60 percig 37°C-on inkubáljuk majd szobahőmérsékleten tartjuk a mérés megkezdéséig
Erwin Neher
Artificial Cerebro Spinal Fluid (aCSF) • A CSF ionösszetételét utánozza • Emelt glükóz koncentráció a neuronok energiaigényének biztosítása érdekében • PH – bikarbonát puffer rendszer (folyamatos buborékoltatás karbogénnel; 5% CO2, 95% O2 ) • Folyamatos oxigenizálás (carbogen) • Hőmérséklet • Ozmolaritás
3
2012.11.27.
Vibráló mikrotóm (vibrotóm)
A szeletek életben tartásához használt kamra
Elektrofiziológia agyszeletben
Elektrofiziológia agyszeletben -20 mV
M-current amplitude (pA)
A
50
B
45
+/+
40
-20 mV -60 mV
55
control
XE991
***
35 0 pA
30 25 20
C
15
50 pA 200 ms
20 pA
10
-/-
5 0
0 pA
+/+ n = 17
Elektrofiziológia agyszeletben
-/n=8
Biocitin + immun jelölés Funkcionális és fehérje lokalizációs adatok ugyanazon neuronról.
Spontán posztszinaptikus áramok (AP-függő neurotranszmitterfelszabadulás is) Miniatűr posztszinaptikus áramok (csak spontán neurotranszmitterfelszabadulás)
4
2012.11.27.
Ic. Ca koncentráció mérés
Ic. Ca koncentráció mérés (agyszeletben)
• Kalciumkoncentrációfüggő fluoreszcens festék bejuttatása (termeltetése) a sejtekbe(n) • Fluoreszcens video mikroszkópia (CCD kamera)
Kalciumjelek és spontán tüzelés párhuzamos vizsgálata
A központi idegrendszer funkcionális vizsgálata Molekuláris biológia: fehérjék, RNS, DNS jelenlétének detektálása Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális vizsgálata Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok vizsgálata Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak vizsgálata Szelet elektrofiziológia 2.: lokális neuronális hálózatok Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok vizsgálata Nagyobb agyi struktúrák vizsgálata: ferde megvilágítás (IR-LED) In vivo mérések: elektrofiziológia, optogenetika Viselkedési tesztek Klinikai vizsgálatok
5
