SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
ENHANCER ANYAGOK: (-)-DEPRENIL ÉS (-)-BPAP, AZ AGYI NEURONOK KÜLÖNLEGES SERKENTŐI
Doktori (Ph.D.) értekezés
MIKLYA ILDIKÓ
Témavezető: Dr. Knoll József, akadémikus
Készült: MTA-SE, Neuropszichofarmakológiai Kutatócsoportjában
Budapest, 2002
Szigorlati Bizottság: Elnök: Dr. Török Tamás, D.Sc. Tagok: Dr. Dóda Margit, Ph.D. Dr. Szökő Éva, Med. Habil.
Hivatalos Bírálók: Dr. Gaszner Péter, D.Sc. Dr. Fenyvesi Tamás, D.Sc.
2
TARTALOMJEGYZÉK: TARTALOMJEGYZÉK............................................................................................................3 ÖSSZEFOGLALÓ......................................................................................................................5 SUMMARY..................................................................................................................................6 RÖVIDÍTÉSEK...........................................................................................................................7 1.
BEVEZETÉS........................................................................................................................8
2.
CÉLKITŰZÉSEK..............................................................................................................10
3.
IRODALMI HÁTTÉR.......................................................................................................11 3.1.
AZ ELSŐ ENHANCER ANYAG: A (-)-DEPRENIL...............................................................11
3.1.1. A (-)-deprenil felfedezése....................................................................................11 3.1.2. A (-)-deprenil hatása pszichiátriai kórképekben................................................12 3.1.3. A (-)-deprenil szelektív MAO-B enzim bénító hatása.........................................14 3.1.4. A (-)-deprenil főbb metabolikus útjai.................................................................17 3.1.5. A (-)-deprenil hatása neurodegeneratív betegségekben.....................................19 3.1.6. A (-)-deprenil kivédi neurotoxinok degeneratív hatásait....................................21 3.1.7. A (-)-deprenil a sejtek károsodását helyreállítja, csökkenti az apoptózist.........25 3.1.8. A (-)-deprenil anti-aging hatása.........................................................................29 3.2.
AZ ENDOGÉN ENHANCEREK..............................................................................................32
3.2.1. A “trace” aminok...............................................................................................32 3.2.2. A “trace” aminok receptorai és hatásai............................................................33 3.3.
A “TRACE” AMINOK ÉS A SZINTETIKUS ENHANCEREK HATÁSÁNAK ÖSSZEHASONLÍTÁSA...........................................................................................................35
4.
MÓDSZEREK....................................................................................................................37 4.1.
VEGYÜLETEK.........................................................................................................................37
4.2.
A KÍSÉRLETEKBEN ALKALMAZOTT ÁLLATOK............................................................37
4.2.1. Az állatok tartása és kezelése.............................................................................37 4.3.
JELZETT NORADRENALIN (NA), DOPAMIN (DA), SZEROTONIN (5-HT) FELSZABADULÁS MÉRÉSE IZOLÁLT PATKÁNY AGYTÖRZSBŐL..............37
4.4.
NA, DA, 5-HT FELSZABADULÁSÁNAK MÉRÉSE IZOLÁLT PATKÁNY AGYRÉSZLETEKBŐL.........................................................................................38
4.4.1. A preparátumok elkészítése................................................................................38 4.4.2. A kísérlet menete és a minták tisztítása..............................................................39 4.4.3. Kromatográfiás mérés elektrokémiai detektorral..............................................39 4.5.
STATISZTIKAI ANALÍZIS........................................................................................40
3
5.
EREDMÉNYEK.................................................................................................................41 5.1. A (-)-deprenil, a PEA és a tiramin enhancer hatása..................................................41 5.1.1. A (-)-deprenil enhancer hatása izolált patkány agytörzsön...............................41 5.1.2. Egyszeri (-)-deprenil adag enhancer hatása patkányon....................................45 5.1.3. PEA és tiramin enhancer hatásának bizonyítása izolált patkány agytörzsön....49 5.2. A (-)-metamfetaminnak, a (-)-deprenil anyavegyületének enhancer hatása..............50 5.3. A MAO-B bénító hatással nem rendelkező (-)-PPAP enhancer hatása.....................53 5.4. A triptamin enhancer hatása......................................................................................56 5.5. A (-)-deprenil és a (-)-BPAP enhancer hatásának sajátos dózis/koncentráció függése. A (-)-BPAP szelektívitása. ..........................................................................57
6.
MEGBESZÉLÉS................................................................................................................69 6.1. KÖVETKEZTETÉSEK.............................................................................................77
7.
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS...........................................................................................78
8.
IRODALOMJEGYZÉK....................................................................................................79
9.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK..........102
4
ÖSSZEFOGLALÓ DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS
Készült az MTA-SE, Neuropszichofarmakológiai Kutatócsoportjában Témavezető: DR. KNOLL JÓZSEF, AKADÉMIKUS Készítette: Miklya Ildikó ENHANCER ANYAGOK: (-)-DEPRENIL ÉS (-)-BPAP, AZ AGYI NEURONOK KÜLÖNLEGES SERKENTŐI Az indirekt módon ható endogén szimpatomimetikus aminok {β-feniletilamin (PEA), tiramin}, miként tartós hatású szintetikus analógjaik az amfetaminok, erőteljesen fokozzák a katecholaminok kiáramlását a transzmitter raktárakból (’releasing’ hatás). A 90-es években kiderült, hogy a ’releasing’ hatás évtizedekig elfedte a PEA és az amfetaminok fő hatását. Ezek a vegyületek fokozzák az idegingerlés hatására bekövetkező katecholamin és szerotonin kiáramlást, az exocitózist, az agyi neuronokban (’enhancer’ hatás). A (-)-deprenil (Selegiline, Jumex) volt az első, és máig is az egyetlen klinikumban használt PEA derivátum, mely elvesztette anyavegyületének ’releasing’ hatását, de megtartotta az ’enhancer’ hatást. Emellett a (-)-deprenil volt az elsőként leírt szelektív MAO-B bénító és e hatás alapján került a figyelem középpontjába. A (-)-deprenil enhancer hatása független a MAO-B enzim bénító hatásától, mert egy olyan (-)-deprenil analóg vegyület, a (-)-PPAP is ’enhancer’ hatású, mely már nem rendelkezik MAO gátló tulajdonsággal. Ezenkívül más MAO gátlók, mint a klorgilin (a MAO-A szelektív bénítója) és a lazabemid (a MAO-B szelektív bénítója) nem rendelkeznek enhancer hatással. További kutatások bizonyították, hogy az endogén indol-analóg triptamin is hatékony enhancer vegyület. Ez a felismerés vezetett egy olyan triptamin analóg, a (-)-BPAP kidolgozásához, mely hatékonyabb és szelektívebb mint a (-)-deprenil. A (-)-deprenil enhancer hatásának köszönheti, hogy lassítja a szexuális és a tanulási képesség korfüggő csökkenését, meghosszabbítja az élettartamot és szignifikánsan csökkenti a Parkinson és Alzheimer kór progresszióját. A (-)-BPAP, kísérleteink szerint várhatóan minden tekintetben hatékonyabb lesz mint a (-)-deprenil. (Arch int Pharmacodyn Ther 328:1-15, 1994; Life Sci 56:611-20, 1995; 58:817-27, 1996; 58:2101-14, 1996; Br J Pharmacol 128:1723-32, 1999; Life Sci 67:765-73, 2000)
5
SUMMARY PH.D. THESES Prepared under guidance of PROF. KNOLL JÓZSEF M.D., D. SC., in the Neuropsychopharmacological Research Unit of the Hungarian Academy of Sciences, in 2002
Miklya Ildikó ENHANCER SUBSTANCES: (-)-DEPRENYL AND (-)-BPAP, THE SPECIFIC STIMULATORS OF THE BRAIN NEURONS β-phenylethylamine
(PEA)
and
tyramine,
the
endogenous
indirectly
acting
sympathomimetic amines, like their long acting synthetic analogues, the amphetamines, are generally accepted to be releasers of catecholamines from their storage sites (’releasing ’ effect). It was shown in the early 90s that the releasing effect obscured for decades the main effect of PEA and the amphetamines. These substances are highly potent enhancers of the impulse propagation mediated release of catecholamines and serotonin in the brain (’enhancer’ effect). (-)-Deprenyl (Selegiline, Jumex) was the first, and is still the only clinically used PEA/amphetamine-derivative which lost the releasing effect but preserved its enhancer effect. (-)-Deprenyl was also the first described selective inhibitor of MAO-B and the international attention was primarily focused on this effect of the drug. The enhancer effect of (-)-deprenyl is independent from the MAO-B inhibitory effect, as proved by a (-)-deprenyl analogue, (-)-PPAP, which is an ’enhancer’ substance, but not an MAO inhibitor. Furthermore, clorgyline (selective inhibitor of MAO-A) and lazabemide (selective inhibitor of MAO-B) are devoid of enhancer effect. Further studies revealed that the endogenous indol-derivative, tryptamine is a potent enhancer substance, too. This led to the development of a tryptamine-analogue, (-)-BPAP, a highly selective and much more potent enhancer substance than (-)-deprenyl. Due to its enhancer effect (-)-deprenyl was found to slow the age-related decay of behavioural performances, to prolong life and to slow the progression of Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. (-)-BPAP is now a candidate to surpass the clinical efficiency of (-)-deprenyl. (Arch int Pharmacodyn Ther 328:1-15, 1994; Life Sci 56:611-20, 1995; 58:817-27, 1996; 58:2101-14, 1996; Br J Pharmacol 128:1723-32, 1999; Life Sci 67:765-73, 2000)
6
RÖVIDÍTÉSEK (-)-A
(-)-amfetamin
MAO
monoamino oxidáz
ACh
acetilkolin
MAO-A
monoamino oxidáz-A
AF64A
etilkolin-mustár-aziridium
MAO-B
monoamino oxidáz-B
(-)-BPAP DA
R-(-)1-(benzofurán-2-yl)-2-
MPTP
propilaminopentán dopamin
6-OHDA 6-hidroxi-dopamin
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6,tetrahydropiridine
NA
noradrenalin
NO
nitrogén oxid
DAT
dopamin traszporter
NOS
nitrogén-oxid-szintáz
DHBA
3,4-dihidroxi-benzilamin
PEA
β-feniletilamin
DMS
dezmetilselegilin
(-)-PPAP
DSP-4
β-kloroalkilamin
SOD
5-HT (-)-MA
szerotonin
TA
(5-hidroxitriptamin) (-)-metamfetamin
7
1-fenil-2propilaminopentan superoxid dizmutáz trace aminok (’nyom-aminok’)
BEVEZETÉS 1. BEVEZETÉS
Minden ember méltó, produktív, hosszú életet szeretne élni annak ellenére, hogy individuális adottságaink, képességeink igen eltérőek. Az ehhez szükséges hajtóerő tulajdonképpen mindenkiben ott lakozik, de egyfelöl az életkörülmények függvénye, hogy mi valósulhat meg, másfelől még alig tudunk valamit a hajtóerők valódi élettani mechanizmusáról ahhoz, hogy kellően befolyásolni tudjuk. E problematikával kezdett foglalkozni Knoll József már az 1950-es évek elején. Patkányok célorientált viselkedésének mechanizmusát elemezve arra a következtetésre jutott, hogy a ’hajtóerő’ fiziológiai lényege egy az agytörzsi és agykérgi neuronokban még ismeretlen specifikus aktivációs mechanizmus működése [81]. E mechanizmust csak 30 évvel később sikerült pontosan tisztáznia és enhancer regulációként leírnia [103]. Az enhancer reguláció tisztázásához vezető úton döntő fontosságú szerepe lett annak a vegyületnek, melyet Knoll 1964-65-ben dolgozott ki munkatársaival [78, 79]. A vegyület (-)-deprenil (Selegilin, Jumex, Eldepryl) néven vált nemzetközileg ismertté. A (-)-deprenil a magyar gyógyszerkutatás XX. századi történetének egyetlen originális vegyülete, mely az egész világon használt gyógyszerkincs része, minden kézikönyv részletesen tárgyalja, forgalma a világon évről évre ma is növekszik. Világhírét az alapozta meg , hogy a (-)-deprenil volt az első szelektív B típusú monoaminooxidáz (MAO-B) enzim bénító, így a kutatás referens vegyületévé vált. A (-)-deprenilnek ezt a tulajdonságát leíró első Knoll József és Magyar Kálmán által írt cikk [82] megjelenése után 10 évvel ’Citation classic’ lett. A (-)-deprenilt Eldepryl néven Európában az 1980-as évek elején, az USA-ban pedig, első magyar vegyületként, 1989-ben vezették be, először Parkinson kór, később Alzheimer kór kezelésére [15, 122, 138, 157, 175, 181]. A (-)-deprenil iránti érdeklődés, noha a vegyület már közel 40 éve ismert, még egyre növekszik. Ezt bizonyítja a referált cikkek számának állandó időbeli növekedése.
8
BEVEZETÉS 1964-1965
2 cikk
1966-1982
kb. 20 cikk/év
1983-1991
kb. 130 cikk/év
1992-1996
kb. 220 cikk/év
1997-től
több mint 300 cikk/év
Az irodalmi háttér című fejezetben részletesen bemutatott komplex hatásmód mellett, vagy
azok
összeségének
magyarázatára,
a
(-)-deprenil
rendelkezik
egy
új
tulajdonsággal, melyet a mechanizmus felismerője (Knoll) ’enhancer’ hatásnak nevezett [93, 95, 129], miszerint egyedülálló hatásmóddal stimulálja az agytörzsi neuronok ingerlékenységét. Ez a sajátos agytörzsi stimuláció, mellyel ismert gyógyszerek nem rendelkeznek, magyarázatot adhat a (-)-deprenilnek a világirodalomban mostanáig leírt sokféle hatására: 1. antidepresszív hatású [186] 2. neurodegeneratív betegségekben hatékony gyógyszer [15, 122, 138, 157, 175, 181] 3. kivédi számos neurotoxin hatását [30, 44, 64, 83, 111, 149] 4. szabadgyökök semlegesítését (scavanger funkció) fokozza [28, 87] 5. sejtek sérülés utáni károsodásának helyreállítását segíti [3, 143] 6. antiapoptotikus hatású [176] 7. lassítja a sexuális és tanulási teljesítmény kor-függő csökkenését, így javítja az életminőséget [85] 8. meghosszabítja az élettartamot [87] Munkánkban az eddig rejtve maradt enhancer reguláció, annak fiziológiai jelentősége, továbbá az endogén enhancer hatású vegyületek (β-feniletilamin, tiramin, triptamin), valamint a PEA-származékú szintetikus enhancer vegyületek {(-)-deprenil, (-)-PPAP} és az újonnan kifejlesztett szelektív enhancer hatással rendelkező, triptaminszármazékú enhancer vegyület, a (-)-BPAP, hatásmódja képezték vizsgálataink tárgyát.
9
CÉLKITŰZÉSEK 2. CÉLKITŰZÉSEK A (-)-deprenil új hatásmódjának felismerése után fontosnak tartottuk az alábbi problémák kísérletes elemzését: 1./ Az enhancer reguláció működésének bizonyítása patkány központi idegrendszerében és a hatás néhány sajátosságának jellemzése katecholaminerg szerkezetű, ismert szintetikus {szelektív MAO-B bénító (-)-deprenil} és endogén (β-feniletilamin, tiramin) anyagok segítségével. 2./ A (-)-metamfetamin, a (-)-deprenil anyavegyülete és egyik fő metabolitja, enhancer hatásának vizsgálata. 3./ Olyan amfetamin változatú, szelektívebb és hatékonyabb enhancer vegyület, a (-)-PPAP, hatásának analízise, melynek segítségével igazoltuk, hogy az enhancer hatás független a MAO-B enzim bénításától. 4./ A triptamin, mint indol struktúrájú, ismert endogén enhancer anyag hatásának vizsgálata annak bizonyítására, hogy az enhancer hatás nem kötődik a feniletilamin struktúrához. 5./ A (-)-deprenil kémiai szerkezetétől már jelentősen eltérő, de annál sokkal erősebb enhancer hatással rendelkező, szelektív, triptamin-származékú újonnan kifejlesztett vegyület, a (-)-BPAP, sajátos dózisfüggő enhancer hatásának in vivo és ex vivo elemzése.
10
IRODALMI HÁTTÉR 3. IRODALMI HÁTTÉR
3.1. AZ ELSŐ ENHANCER ANYAG: A (-)-DEPRENIL Knoll József 45 évi központi idegrendszer működésével, pontosabban az agyi aktiváció és célorientált viselkedéssel kapcsolatos kutatómunkájának eredményeként, az 1990-es évek elején felfedezett egy új, alapvető fiziológiás jelentőségű folyamatot az általa kidolgozott (-)-deprenil segítségével, melyet enhancer hatásnak nevezett el [81, 91, 93, 95]. Enhance, magyarul annyit jelent fokoz, növel, emel. Ez az elnevezés általános jelentésű, de nagyon specifikus jelenséget takar a (-)-deprenil és az azt követő vegyületek hatékonyságának vonatkozásában. Az eddig ismeretlen hatás lényegének megértéséhez röviden tekintsük át a (-)-deprenil keletkezésének és a ma ismert hatásspektrum kialakulásának történetét.
3.1.1. A (-)-deprenil felfedezése A deprenil története az 1960-as évek elején kezdődik, amikor Knoll József kidolgozott egy új fenilalkilamin struktúrát, melynek farmakológiai hatásspektrumát munkatársaival analizálták. Az 1963-ban befejeződött szerkezet-hatás összefüggés elemzés eredményei alapján 30 vegyületből az E-250 kódnévvel jelölt, később (-)-deprenilnek nevezett anyagra esett a választás (1. ábra), mert ez a vegyület egyszerre rendelkezett az amfetamin jellegű pszichostimuláns hatással és a pargilinra jellemző erős MAO bénító tulajdonsággal is. Azonban az amfetamintól eltérően a motilitást nem fokozta számottevően és a vérnyomást sem emelte, hanem süllyesztette a patkányokon végzett kísérletekben [78, 79]. Knoll az anyag ezen unikális viselkedése alapján választotta ki a vegyületet gyógyszerré fejlesztésre és ez a paradox viselkedés volt a kiindulópontja annak a kutatásnak, mely a (-)-deprenil későbbi sikeréhez vezetett.
11
IRODALMI HÁTTÉR 1. ábra CH 3
|
CH 3
|
—CH 2—CH—N—CH 2 —C ≡ CH • HCl
dl-fenilizopropilmetilpropinilamin • HCl (E-250, (±)-deprenil, selegilin)
Az E-250 ugyanis olyan pszichostimuláns hatással rendelkezik, mely független az amfetamin és a metamfetamin katecholaminokat felszabadító hatásától. Ebben már megmutatkozott a (-)-deprenil sajátos, új típusú hatása, de ennek pontos tisztázására csak a ’90-es évek elején került sor. Kezdetben csak a vegyület antidepresszív hatását vizsgálták, és a klinikai vizsgálatok eredményeként már 1965-ben bizonyítást nyert, hogy a (-)-deprenil kedvező hatású depresszióban [186].
3.1.2. A (-)-deprenil hatása pszichiátriai kórképekben Az 1964/1965-ben megjelent cikkekben közölt adatok nyitották meg az utat az új hatásspektrumú MAO bénító antidepresszívumként történő bevezetésére. Bár e hatást a későbbiekben megerősítették [126, 142], a (-)-deprenil mégsem e tulajdonsága alapján vált ismert gyógyszerré. Mintegy 40 év telt el azóta, és a pszichofarmakológia fejlődésével és a (-)-deprenilről azóta összegyűlt ismereteink alapján, a vegyület ismét az érdeklődés középpontjába került mint pszichofarmakon. Depresszióban [49, 118, 131, 171], anxietásban, epilepsziában [53, 56, 115], negatív tünetekkel járó schizophreniában [13, 55, 144, 145], Tourett szindrómában [70, 72] újra vizsgálják hatékonyságát. A depresszió kialakulásáért részben a noradrenerg és szerotonerg rendszer deficitjét teszik felelőssé. Ezért a monoamin-teória alapján többek között a MAO bénítók is szóba jöhetnek a kórkép terápiájában. A (-)-deprenilnek 30-40-60 [118, 171] és 10 mg-os
12
IRODALMI HÁTTÉR [49, 131, 142] napi dózisai mellett írtak le igen kedvező hatásokat a három hétnél tovább tartó kettős-vak, placebo-kontrolos kezelések során endogén, atípusos és öregkori depresszióban. A (-)-deprenil egereken végzett kísérletekben 10, 20 és 40 mg/kg mennyiségben szignifikáns antikonvulzív hatást mutat a pentilentetrazol (PTZ)-okozta és elektroshockkal kiváltott konvulzióval szemben. A litium-pilocarpin által létrehozott status epilepticust azonban nem tudja kivédeni. Kombinációban alkalmazva 10 mg/kg (-)-deprenilt, 1 mg/kg szubprotektív dózisú diazepammal és 10 mg/kg phenitoinnal potencírozott antikonvulzív hatást nyújt. Ezenkívül, a (-)-deprenil meggátolja az antikonvulzív terápiában használatos milacemid lebomlását, amely GABA- és glicintermelődését serkentő anyag. Az eredmények alapján a szerzők a (-)-deprenilt adjuváns antiepileptikus terápiára javasolják [53, 56, 115]. Már bizonyított tény, hogy negatív szimptómás schizophreniás betegek centrális dopaminerg, szerotonerg és noradrenerg aktivitása csökkent, mely struktúrális agykárosodásokhoz vezethet (kortikális atrófia vagy megnövekedett ventrikulum). A MAO bénítók, így a (-)-deprenil is csak a negatív tünetekkel járó schizophreniában hatásosak az atipusos antipszichotikumok mellett [12, 13, 55, 146]. A (-)-deprenilt hatékonynak találták még a neuroleptikumok által okozott parkinsonizmusban is hat hétig adagolt 10 mg-os napi dózisban [49, 147]. A Tourett szindróma neurokémiai háttere még nem igazán ismert, de az tény, hogy számos olyan gyógyszer, mely a dopaminerg illetve a szerotonerg tónust fokozza a központi idegrendszerben, hatékony lehet a kórképben. Így Tourett szindrómában megjelenő ADHD-ben (attention deficit hyperactivity disorder - hiperaktivitással együttjáró
figyelemhiány)
a
(-)-deprenil
is
számottevő
mellékhatás
nélkül,
biztonságosan alkalmazható [70, 72]. A fentiek alapján elmondhatjuk, hogy a pszichiátriában és a pszichofarmakológiában a (-)-deprenilnek többnyire csak nagy dózisainak hatását vizsgálják. A szükségesnél
13
IRODALMI HÁTTÉR nagyobb mennyiség adása azonban nem szerencsés választás, mert minden gyógyszer elveszti szelektivitását és nem specifikus hatások is felléphetnek nagyobb dózistartományokban [99, 101]. Ezen túlmenően, a pszichét tekintve sokkal nagyobb individuális különbségeket találunk, tehát az úgynevezett átlag dózis helyett finomabb, árnyaltabb terápiára van szükség. Munkánk során többek között azt is bizonyítottuk, hogy a (-)-deprenil dózisát is nagy gondossággal kell kiválasztani, mert a vegyület komplex hatással rendelkezik, és az adag nagyságától függően más és más hatásokat észlelhetünk. Állatkísérletekben a (-)-deprenil például 10 mg/kg-ban
MAO-A,
0.25 mg/kg-ban MAO-B bénító, míg mikromoláris nagyságrendben az újonan felismert enhancer hatást fejti ki. A (-)-deprenil többirányú pszichiátriai alkalmazását az teszi lehetővé, hogy a vegyület a központi idegrendszerben számos eddig ismert és ismeretlen biokémiai, fiziológiai folyamatot befolyásol. Elsőként azonban a szelektív MAO-B enzim bénításával vált világszerte ismertté mint: Anipryl, Cyprenyl, Eldepryl, Eprenyl, Jumex, Movergan, Plurimen, Selegil készítmény.
3.1.3. A (-)-deprenil szelektív MAO-B enzim bénító hatása
Zeller 1938-ban monoamin oxidáznak (MAO) nevezte el azt az enzimcsoportot , mely a monoaminok oxidatív dezaminálásáért felelős [193]. A MAO (amine: oxigén oxidoreduktáz, EC 1.4.3.4.) a mitokondriális külső membránon található meg [69, 161, 184] és az erythrociták kivételével jelen van szinte minden emlős sejtben. A MAO fontos szerepet játszik a monoaminok (feniletilamin, tiramin, noradrenalin, dopamin, oktopamin, szerotonin, triptamin, metilhisztamin) intracelluláris koncentrációjának szabályozásában és mind az exogén, mind az endogén aminok inaktíválásában.
14
IRODALMI HÁTTÉR
Az enzim egy 8-alfa-ciszteinil-flavin-adenin-dinukleotid (FAD) tartalmú, 100.000 dalton molekula méretű fehérje, mely az alábbi oxidatív deaminációt katalizálja [107, 110]:
RCH2NH2 + E-FAD → RCH = NH + E-FADH2 RCH = NH + H2O → RCHO + NH3 E-FADH2 + O2 → E-FAD + H2O2
A folyamat során keletkezett aldehid alkohollá alakul, a hidrogén-peroxidot pedig normál körülmények között a glutation rendszer eliminálja, kataláz jelenlétében vízzé alakul, patológiás körülmények között azonban citotoxikus szabadgyököt képez [46].
Az enzimnek jelenleg két funkcionálisan különböző formája ismert: MAO-A és MAO-B. A két enzim forma felfedezése gyakorlati jelentőségű is, mivel nem homogén módon oszlanak el a szövetekben. Az ember szervezetében a májban a legnagyobb az enzim aktivitása, itt megközelítően egyenlő arányban van jelen a két izoenzim. Az A típusú enzim 75%-a az intenstinumban, míg a B típusú enzim 70%-a az agyban található. Patkány agyban azonban a MAO-B enzim teljes aktivitásának csak 45%-a mérhető. Humán agyban főleg a hypothalamusban és a nigrostriatalis rendszerben található, de fellelhető a frontalis cortexben, hippocampusban és a thalamusban is. A MAO-A enzim humán agyban elsősorban a noradrenerg neuronokban található meg, mint például a locus coeruleusban, a MAO-B pedig inkább a 5-HT tartalmú neuronokban. A glia sejtek azonban mindkét enzimet tartalmazzák [104, 137, 151, 160]. A
kétféle
enzim
gátolhatóságukban
között és
70%-os
szubsztrát
szerkezeti
homológia
specificitásukban
van
[6,
különböznek
109],
de
egymástól.
Legfontosabb szubsztrátjai a neurotranszmitterek és neuromodulátorok (3.1.3.1. táblázat).
15
IRODALMI HÁTTÉR
3.1.3.1. táblázat: A MAO-A és MAO-B enzim szubsztrátjai [110]
MAO-A
MAO-B
MAO-A és MAO-B
Szerotonin Oktopamin Adrenalin Noradrenalin
Benzilamin Feniletilamin Metilhisztamin n-Acetilputreszcin MTPT n-Fenilamin Decilamin Oktilamin Milacemid
Dopamin Triptamin Tiramin 3-metoxi-tiramin Kinuramin
A kétféle enzim létezésének bizonyítása Johnston nevéhez fűződik, aki kidolgozta a klorgilint, és hatását vizsgálva észlelte, hogy az rendkívül erősen gátolta a szerotonin bontását, ugyanakkor csak igen nagy adagokban befolyásolta a benzilaminét. A klorgilin-érzékeny enzimet nevezte MAO-A-nak a másikat MAO-B-nek [73]. Ma is ez a nómenklatúra az elfogadott. Hiányzott azonban egy olyan gátlószer, mely a B-típusú enzimet gátolta volna. A MAO-bénítók megjelenése az 50-es évek végén nagy áttörést jelentett a pszichofarmakológiában, használatukat azonban korlátozta jellegzetes mellékhatásuk. A jelenség okát Blackwell ismerte fel [17, 18]. Rámutatott arra, hogy MAO bénítóval kezelt betegen, mivel a táplálékban lévő tiramin nem bomlik el a bélben, a tiraminban gazdag táplálék (sajt, csokoládé) fogyasztása fokozott NA kiáramláshoz vezet
a
noradrenerg raktárakból, ezért a vérnyomás emelkedik, akár végzetes kimenetelű hipertóniás krízis is felléphet [108]. Ez a ’sajt-reakció’-nak nevezett mellékhatás korlátozta a MAO-bénítók további klinikai alkalmazását.
16
IRODALMI HÁTTÉR A (-)-deprenil megjelenése viszont új lendületet adott a MAO bénítók további kutatásának. A (-)-deprenil volt a MAO-B enzim első szelektív bénítója [82], de ma már számos B típusú enzimet szelektíven bénító vegyület létezik (3.1.3.2.táblázat). 3.1.3.2. táblázat: A MAO-A és MAO-B enzim néhány ismertebb szelektív és nem szelektív bénítója [110] MAO-A
MAO-B
szelektív bénítói
szelektív bénítói
klorgilin moclobemid brofaromin
(-)-deprenil lazabemid fludepryl MDL72974a
Nem szelektív bénítók
pargilin isocarboxazid fenelzin
Az irreverzibilis MAO bénítók hatásmódjának lényege, hogy az enzim flavincsoportjával a vegyület valamely specifikus csoportja, például egy hidrazid- vagy propargil-gyök, kovalens kötésbe lép és így az enzim irreverzibilisen inaktíválódik. Aktivitás tehát csak az új enzim szintézise után térhet vissza [84, 166]. A (-)-deprenil kis dózisban (0.25 mg/kg) szelektív MAO-B bénító, nagyobb dózisban (10 mg/kg) pedig már a MAO-A enzimet is irreverzibilisen bénítja [84]. Hatása sztereospecifikus. A balra forgató (-)-deprenil hatékonyabb, mint a jobbra forgató (+)-deprenil [90]. Dezalkilációs metabolizmusa során nem történik inverzió vagy racemizáció [173].
3.1.4. A (-)-deprenil főbb metabolikus útjai A (-)-deprenil metabolizmusa főleg a májban történik a mikroszomális citokróm P-450 rendszeren keresztül, de sokkal kisebb mennyiségben végbemegy a tüdőben és a vesében is. Ahogy a 3.1.4.1. ábra mutatja, metabolizmusa során csak balra forgató termékek
keletkeznek
[65,
74].
Első
17
lépésben
dezmetilselegilinné
(DMS)
IRODALMI HÁTTÉR (norselegilinnek is nevezik) és L-(-)-metamfetaminná alakul (L-MA). A DMS tovább alakul L-(-)-amfetaminná (L-A). Következő lépésben mind az L-A, mind a L-MA parahidroxilált metabolittá alakul. Az L-MA mindhárom szövetben kimutatható metabolit patkányban, de az L-A csak a májban detektálható. Szex és strain különbségek fordulnak elő a máj-metabolizmus során. Hím patkányokban a máj-metabolizmus kétszer olyan gyors, mint nőstényekben [57, 74, 117, 191, 192].
Selegilin
L-(-)-dezmetilselegilin
L-(-)-amfetamin
L-(-)-metamfetamin
L-(-)-hidroxiamfetamin
L-(-)-hidroximetamfetamin
további metabolitok
3.1.4.1. ábra. A (-)-deprenil főbb metabolikus útjai [65, 74]
Annak ellenére, hogy a (-)-deprenil egy metamfetamin származék és amfetaminná illetve annak származékaivá metabolizálódik, függőség nem alakul ki a vegyülettel szemben terápiás dózisban és az amfetaminra, metamfetaminra jellemző központi idegrendszeri hatásokat sem váltja ki. Az évekig tartó alapos ’DATATOP study’-ban sem észleltek fizikai dependenciát és elvonási tüneteket a gyógyszer tartós szedése során és a (-)-deprenil csak igen nagy dózisú alkalmazásánál, nyílván a metabolitok miatt, figyelhető meg stereotíp viselkedés [134, 138, 163, 182, 183, 188, 189].
18
IRODALMI HÁTTÉR
Mivel a (-)-deprenil nem rendelkezik az amfetaminokra jellemző transzmitter kiáramlást okozó tulajdonsággal, Knoll szerint ennek köszönhető, hogy hozzászokás nélkül, biztonságosan használható ’smart drug’ [103].
Általános gyakorlat az, hogy a sikeres gyógyszert a szabadalmi védettség lejárta után, tisztán anyagi okok miatt, egy hasonló újjal (’me-too drug’) gyorsan megpróbálják pótólni. Ez a (-)-deprenil esetében nagy cégek próbálkozásai ellenére máig nem sikerült. Ennek oka , hogy csak a (-)-deprenillel versenyképes új szelektív MAO-B bénító kidolgozására törekedtek. Újabb szelektív MAO-B bénítót ugyan találtak, de a (-)-deprenil klinikai sikerének titka, hogy ma az egyedüli enhancer hatású gyógyszer, és csak egy jobb enhancer követheti eredményesen a (-)-deprenilt a klinikumban [101]. Ma a (-)-deprenilt elsősorban Parkinson kór és az Alzheimer kór kezelésére használják, de hatékonysága a neurodegeneratív betegségekben minden bizonnyal enhancer hatásának köszönhető [91].
3.1.5. A (-)-deprenil hatása neurodegeneratív betegségekben
1960 óta ismert, hogy a Parkinson kóros beteg striatumában 30% alá csökken a dopamin mennyisége [39]. Hornykiewitz e felfedezése alapján, Birkmayer, korának egyik legnevesebb neurológusa, először adott levodopa formájában dopamint parkinsonos betegeknek a hiány pótlására. A levodopa gyakori mellékhatásai miatt a dózis csökkentése érdekében megpróbálták MAO-bénítóval együttadni a levodopát. Ez az út azonban járhatatlan volt, mert a kombináció hipertóniás reakciókhoz vezetett. Birkmayer a (-)-deprenil megjelenése után az 1962-ben abbahagyott kísérleteit újrakezdte, mivel már ismerte a (-)-deprenil ’sajt-reakcó’-tól mentes hatását. Az eredmény a várakozásnak megfelelő volt, így a (-)-deprenilt sajátos hatásspektruma alapján bevezették a Parkinson kór kezelésére 1975 után, majd gyorsan elterjedt először Európában [16], majd világszerte.
19
IRODALMI HÁTTÉR
Az USA-ban csak jó 10 éves késéssel fogadták el, hogy a (-)-deprenil biztonságos vegyület, mentes a MAO-bénítók szokásos mellékhatásaitól. 1989-ben nagyarányú klinikai felmérés (DATATOP Study; 800 beteg, 23 amerikai és 5 kanadai klinika) eredményeként igazolták a farmakológiai kutatásokból levont következtetéseket. Bizonyították, hogy újonnan diagnosztizált, kezeletlen Parkinsonos betegeken a (-)-deprenil lassítja a nigrostriatalis dopaminerg rendszer hanyatlását és a (-)-deprenillel kezeltek később igényelnek levodopát [138, 139, 140, 181]. Ezért frissen diagnosztizált parkinsonos betegek kezelését ma világszerte (-)-deprenil monoterápiával kezdik. A DATATOP Study eredményeit megerősítő ’multi-center’ klinikai vizsgálatokat végeztek még Franciaországban [1], Finnországban [133], Norvégiában és Dániában [113] is.
Ma már ismert , hogy az idősődő emlős szervezetben lassan, egyenletesen csökken a striatalis dopamin mennyisége. Emberen a 45. életév után tíz évenként átlagosan 13% a csökkenés mértéke. Akinél a hanyatlás gyorsabb, még életükben túllépik a kritikus 30%-os határt és a Parkinson kór tünetei jelentkeznek [150]. Parkinson kórban a kezdeti (kompenzatórikus) dopamin-receptorszám növekedését követően a striatális dopaminerg neuronok degenerációja következik be. Ekkor az emelkedett dopamin lebontása H2O2, majd reaktív OH-gyökök fokozott képződéséhez vezet. Ugyanezt a folyamatot 6-OH-dopaminnal és MPTP-vel is szimulálni lehet, melyek a striatalis dopaminerg neuronok elpusztításával parkinsonismushoz vezetnek. Ezen hatások ellen védhet a dopamin transzport gátlása mazindollal, az NMDA receptorok gátlása dizocilpin maleáttal, az agyi neurotrofikus faktorok adagolása, antioxidánsok és a MAO-B gátlása. Ez utóbbi a neurotrofikus hatása révén a leghatásosabb [38].
Az első cikkek, melyek a (-)-deprenilt Alzheimer kórban is hatásosnak találták 1987-ben jelentek meg [122, 17]. Az erre vonatkozó első “multi-center” tanulmány 1997-ben jelent meg, melyben kettős-vak, placebo-kontrolos, randomizált klinikai vizsgálatokkal tanúsították, hogy 341 közepesen súlyos Alzheimer kórban szenvedő beteg
állapotát
(-)-deprenil
kezeléssel
szignifikánsan
javították,
a
betegség
progresszióját lassították, továbbá csökkentették a senilis/amiloid plakkok számát, a
20
IRODALMI HÁTTÉR neurofibrilláris degenerációt [157]. Pozitív hatásában a kolinerg neuronok aktivitásának fokozódását feltételezik [141]. Figyelemreméltó ebből a szempontból, hogy a szelektív nagyhatású enhancer vegyület, a (-)-BPAP, erősen fokozza tenyésztett hippocampalis kolinerg neuronok aktivitását [100]. Knoll már 1992-ben rámutatott arra, hogy a (-)-deprenil terápiás hatásának lényege nem a MAO-B enzim bénítása, hanem a nigrostriatalis dopaminerg neuronok sajátos hatásmóddal történő serkentése, melynek pontos mechanizmusa akkor még ismeretlen volt [91]. Ma már bizonyított tény, hogy az enhancer hatás, amint ezt a későbbiekben bemutatott (-)-BPAP-val végzett kísérleteink is igazolják, nemcsak a katecholaminerg és szerotonerg agytörzsi neuronokon, de a hippocampalis kolinerg neuronokon is kimutatható [100].
3.1.6. A- (-)-deprenil kivédi különböző neurotoxinok degeneratív hatását
A (-)-deprenilnek a neuroprotektív hatása kimutatható számos neurotoxinnal (MPTP, 6-OHDA, DSP-4 és AF64A) szemben. E hatásokért csak részben felelős a MAO-B enzim bénítása. AZ MPTP DOPAMINERG RENDSZERT KÁROSÍTÓ HATÁSA
Az első cikk 1977-ben írta le gyógyszerfüggésben szenvedők parkinsonos tüneteit (extrapiramidális szindróma, jellegzetes hipokinézia, rigiditás, tremor), majd többen igazolták azt utánvizsgálatokban [7, 19, 33, 105, 111, 112, 168,]. Először a hosszantartó levodopa terápiának tulajdonították a mellékhatásként megjelenő tüneteket, de később kiderült, hogy ezek a betegek meperidint szedtek, mely szennyezésként tartalmazott 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropiridine-t (MPTP) és ez az anyag volt felelős a megjelenő parkinsonos tünetekért. Mivel a rágcsálók ugyanolyan érzékenyek MPTP-re, mint az ember, farmakológiája jól vizsgálható.
A 3.1.6.1. ábra szerint nem az MPTP váltja ki közvetlenül a neurotoxikus hatást, hanem annak a MAO-B enzim által transzformált MPP+ származéka [29], mely
21
IRODALMI HÁTTÉR elsősorban a katecholaminerg rendszerben, különösképpen a dopaminerg rendszerben koncentrálódik [71]. Neuropathológusok azt találták, hogy az MPTP, illetve annak metabolitja, károsítja a substantia nigrát, de a mesolimbikus rendszert nem [25, 112, 121]. Az MPP+ az aktív felvevő mehanizmussal, dopamin transzporterrel (DAT) jut be a sejtbe és a mitokondriális külső membránon akkumulálódik [145], ahol az oxidatív foszforilációs mechanizmuson keresztül kiváltja a sejtpusztulást [130, 135]. Az MPTP neurotoxikus származéka idősebb állatokban nagyobb mértékben képes a striatalis dopaminszintet csökkenteni, mint fiatalabbakban, mert azokban nagyobb a MAO-B enzim aktivitása. MAO-B gátlók alkalmazásakor eltűnik a különböző korú állatok között tapasztalható különbség [45].
3.1.6.1. ábra. Az MPTP okozta toxicitás dopaminerg neuronon és a (-)-deprenil neuroprotektív hatásának lehetséges mechanizmusa [65].
MPTP
MPDP+
MPP+
MAO-B
uptake
MAO-B
uptake
Dopaminerg neuron
vagy nem enzimatikus
Neuromelanin +
Mitokondrium NADH-ubiquinone (complex 1) ATP
+
N
N
N
CH3
CH3
CH3
(-)-deprenil lehetséges hatáshelyei
Az úgynevezett MPTP-parkinsonizmus kivédhető szelektív és nem szelektív MAO-B bénítókkal. A (-)-deprenil igen hatásos, de a MAO-A enzimet gátló klorgilin hatástalan. Szintén védelmet nyújtanak a toxin ellen az uptake gátlók, mint a nomifensin és a
22
IRODALMI HÁTTÉR mazindol [125]. A mazindol gátolja a dopamin transzportert. A (-)-deprenil toxicitást védő hatását erősíti még az is, hogy meggátolja a DA+MPP+ oldhatatlan komplex kialakulását [50]. További bizonyíték még a (-)-deprenil MPTP elleni védő hatása mellett, hogy a toxin által okozott centrális hypotermiát is sikeresen gátolja [158, 159]. Azonban igencsak kiemelendő szempont az, hogy a (-)-deprenil neuroprotektív hatása még akkor is kimutatható volt, ha az MPTP kiváltotta toxikus károsodást csak 3 nap múlva kezdték gátolni 3 héten át tartó 0.25 mg/kg dózisú kezelésekkel [176]. Az MPTP egy igen értékes eszköz az antiparkinson szerek kutatásában, de a legcélravezetőbb egy endogén toxin alkalmazása [27, 67, 174]. Ilyen MPTP analóg endogén neurotoxin a tetrahidroisquinolin (TIQ), mely szintén parkinsonos tüneteket idéz elő. A (-)-deprenil kivédi a TIQ neurodegeneratív hatását is [52].
A 6-OH-DOPAMIN NEUROTOXIKUS HATÁSA
A 6-hidroxi-dopamin (6-OHDA) a dopaminerg pályák károsítására a leggyakrabban alkalmazott
toxin,
melyet
főleg
Parkinson
kór
modellezésére
használnak
állatkísérletekben. Ilyen célú alkalmazását az is indokolja, hogy a neurotoxin Parkinson kóros betegek vizeletéből kimutatható [2]. A 6-OHDA által okozott nigrostriatalis dopaminerg lézió a hidrogén-peroxid, szuperoxid és hidroxil gyökök felszaporodásának köszönhető [54, 63, 154]. 6-OHDA-nal kezelt állat striatumaból fokozódik az acetilkolin (ACh) kiáramlása, mivel a nigrostriatalis dopaminerg neuronok élettani hatása, hogy gátolják a kolinerg neuronok működését a striatumban. A (-)-deprenil egyszeri nagy dózisa, vagy kis dózis 3 hétig adva normalizálja az ACh szintet. Még az 5 mg/kg (-)-deprenillel történt előkezelés is képes megakadályozni a 6-OHDA hatására létrejött fokozott ACh releaset [62, 83, 87]. A (-)-deprenilnek ez a 6-OHDA-nal szemben kimutatott védő hatása volt az első bizonyíték a vegyület neuroprotektív hatékonyságára.
Nomifensin és racém amfetamin, (-)-deprenilhez hasonlóan, szintén védi a 6-OHDA hatást, míg a klorgilin tovább növeli az ACh kiáramlását. Így feltételezhető, hogy a
23
IRODALMI HÁTTÉR (-)-deprenil gátolja a 6-OHDA felvételét a neuron preszinaptikus részén. Egy másik bizonyíték a (-)-deprenil 6-OHDA toxikus hatásával szembeni védelemre, hogy a 6-OHDA kiváltotta posztszinaptikus túlérzékenységet is gátolja a (-)-deprenil [83].
A DSP-4 NORADRENERG RENDSZERRE KIFEJTETT TOXIKUS HATÁSA
A DSP-4 egy β-kloroalkilamin {N-(2- chloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzilamin HCl}, melynek predilectiós helye a locus coeruleus noradrenerg végződései. Egyik támadáspontja a dopamin-β-hidroxiláz enzim, a másik viszont a NA uptake mechanizmus. Mindkét helyen szelektív, tartós gátlást hoz létre. A központi idegrendszerben akár 1 hónapig is fennálló NA depléciót okozhat [112]. Patkányban és egeren egyszeri ip. DSP-4 injekció gyorsan és tartósan kiüríti a noradrenalint a cortexből, hippocampusból, cerebellumból és a gerincvelőből is. Az irreverzibilis MAO-B enzim gátló (-)-deprenil (10 mg/kg) kivédi a DSP-4 toxicitást ha a toxikus anyag előtt 1 órával adjuk be és 50%-os védelmet kapunk, ha 24 órával korábban kezeljük az állatot. Más irreverzibilis MAO-B gátlók, mint például az MDL 72974, nem rendelkeznek ezzel a hatással [14, 44]. A DSP-4 fiziológiás körülmények között ciklizálódik egy aziridium formává, azonban az még nem ismert, hogy a MAO-B enzim szerepet játszana ebben a biotranszformációban. Feltételezhető, hogy inkább a (-)-deprenil uptake gátló hatása gátolja meg a DSP-4 toxikus hatását [65, 115].
A KOLINERG RENDSZER NEUROTOXINJA, AZ AF64A
Az AF64A egy etilkolin-mustár-aziridinium, mely icv. kezelés után 4 hét múlva szelektíven és irreverzibilisen károsítja a hippocampalis kolinerg neuronokat. Szignifikánsan csökkenti ezen a területen az ACh bioszintézisében részt vevő kolin-acetil-transzferáz és a katabolikus acetilkolin-észteráz enzim aktivitását, viszont erőteljesen fokozza a MAO-B enzim aktivitását. A szelektivitását mutatja, hogy a
24
IRODALMI HÁTTÉR neostriatumban ez a hatása elmarad. A neurotoxin nem csökkentette a hippocampusban található
muszkarin
receptorok
M1-es
altípusának
denzitását,
ellentétben
az
M2 receptorokéval, melyeknek sűrűségét csökkentette. A (-)-deprenil kezelés az összes említett folyamatot megfordította, ellenkezően befolyásolta, azaz
ennek a
neurotoxinnak is védte a neurodegeneratív hatását [149].
Mivel a (-)-BPAP, mint előbb már szó volt róla, meggátolja hippocampus tenyészeten a β-amiloid toxikus hatását is [100], ez tovább valószínűsíti, hogy az enhancer hatás felelős az agytörzsi kolinerg neuronokon észlelt neuroprotektív hatásokért is.
3.1.7. A (-)-deprenil a sejtek károsodását helyreállítja, csökkenti az apoptosist
Neurodegeneratív károsodást az előzőekben bemutatott neurotoxinokon kívűl oxidatív stresszel és excitátoros aminosavakkal (arginin, glutaminsav) is ki lehet váltani. Mindkét folyamatban szabadgyökök keletkeznek, melyeket kóros körülmények között a szervezet nem tud eliminálni és végül egy láncreakció eredményeként a sejt pusztulását hozzák létre.
A szabadgyökök olyan molekulák vagy molekulafragmentek (3.1.7.1. táblázat), melyek párosítatlan elektront tartalmaznak, ezért kémiailag rendkívül reaktívak és ennek megfelelően élettartamuk nagyon rövid. Kémiai kötések szakadhatnak szimmetrikusan, amikor a termékek szabadgyökök lesznek, vagy aszimmetrikusan, amikor ionok keletkeznek [35, 36]. A szabadgyök reakciók általában láncreakciók. Szabadgyökök
normális
metabolizmus
során,
körülmények
melyek
között
celluláris
is
léteznek
komponensekkel
pusztulásához vezetnek, azaz öregítik a szervezetet [38, 141].
25
vagy
keletkeznek
kapcsolódva
annak
IRODALMI HÁTTÉR 3.1.7.1. táblázat: A szabadgyökök formái 1./ Egy párosítatalan elektront tartalmaz (normál állapotban is): nitrogén –oxid (NO) nitrogén-dioxid (NO2)
2./ Két párosítatlan elektront tartalmaz (biradikális) molekuláris oxigén (O2)
3./ Gyökionok (egy pozitív illetve egy negatív töltésű szabadgyök): protonált amingyök (NH+3) szuperoxid aniongyök (O-2)
Szabadgyökök közömbösítésére a sejtek többféle mechanizmussal rendelkeznek: 1./ enzimes védelem a./ szuperoxid aniongyök (O-2) → szuperoxid-dizmutáz (SOD) b./ hidrogén-peroxid (H2O2)
→ kataláz → glutation-peroxidáz(GP)
2./ antioxidánsok (scavengerek)
→ lipidperoxidáció egyes lépéseit gátolva
OXIDATÍV STRESSZ SZEREPE
Élő sejtekben az egyik leggyakoribb szabadgyök a szuperoxid anion (O-2). A szuperoxid inaktíválásában a szuperoxid dizmutáz (SOD) játszik szerepet, melynek két formája létezik: a Cu/Zn tartalmú citosol és a Mn tartalmú mitokondriális enzim. A szuperoxid anionból az SOD hatására közbülső termékként H2O2 keletkezik, mely kataláz hiányában illetve vas-ion (Fe2+) jelenlétében még reaktívabb hidroxil gyökké alakul. A folyamat során keletkező •OH fokozza a lipid peroxidációt, károsítja a sejtmembránt, ami DNS károsodáshoz, excitátoros aminosavak felszabadulásához és végül a sejt pusztulásához vezet. A (-)-deprenil kezelés fokozza a SOD dizmutáz
26
IRODALMI HÁTTÉR mindkét formájának aktivitását és a hidrogénperoxid inaktíválásában részt vevő kataláz enzim működését is [28, 87]. A mitokondrialis toxinok által kiváltott sejtmembrán károsodást az antioxidánsok ugyan kivédik, azonban az idejében diagnosztizált Parkinson kór terápiájában a Parkinson Study Group az E vitamint a randomizált, placebo-kontrolos kísérletekben nem találta hatékonynak [139].
feniletilamin dopamin
O2 + OH- + •OH
MAO-B
Fe Fe
3+ 2+
H2O2 SOD
2GSH GSSG
2O-2 + 2H+
2H2O
3.1.7.2. ábra: H2O2 keletkezésének és lebomlásának folyamata [51, 52]
EXCITÁTOROS AMINOSAVAK KÁROSÍTÓ HATÁSA
Az excitátoros aminosavak citotoxikus hatása több támadáspontú: 1. NMDA, AMPA/kainát-receptorokon keresztül 2. Intracelluláris Ca2+ szint növekedéssel a. proteázok, lipázok aktíválásával b. mitokondriális energiatermelő mechanizmust károsításával c. NO szintézis fokozásával d. arachidonsav felszabadulás fokozódásával a sejtmembránból e. DNS fragmentációval
27
IRODALMI HÁTTÉR
A folyamatban részt vevő NO szabadgyök fokozza a glutamát felszabadulását, mely tovább erősíti a láncreakciót. A NO fiziológiás körülmények között argininből nitrogén-oxid-szintáz (NOS) hatására keletkezik. Az enzimnek egy Ca/Kalmodulin függő, konstitutív és egy Ca/Kalmodulin független indukálható formája létezik. A Ca/Kalmodulin forma által termelt NO neuromodulátorként is viselkedhet. A konstitutív formán belül megkülönböztethető az endoteliális (eNOS) és a neuronális (nNOS) enzim. Az utóbbi feltehetően szerepet játszik a neurodegeneratív folyamatokban [164].
H2O, NADPH, BH4
L-ARGININ
NO Nitrogén-oxid -szintáz
L-CITRULLINE
⊕ Ca++-Kalmodulin komplex
3.1.7.3. ábra A NO szintézise az L-arginin L-citrulliná konvertálásakor, mely reakciót a nitrogén oxid szintáz katalizál. A folyamat kofaktorai: a tetrahidrobiopterin (BH4) és a NDPH [164].
A (-)-deprenil megváltoztatja a NO szintáz, a szuperoxid dizmutáz (SOD 1,2) bcl-2, bcl-XL, c-jun és a NAD-dehidrogenáz gének expresszióját egyaránt [178].
A KÜLSŐ BEHATÁSOKRA LÉTREJÖVŐ KÁROSODÁSOK
A (-)-deprenil 0.005-0.01 mg/kg-os utókezeléssel fokozza az agyi trauma vagy motoneuron axotomia utáni reaktív astrocytozist, az osztódást és a CNTF (ciliary neurotroph factor)-expresszióját egyaránt, és a látóideg átvágását követő retina
28
IRODALMI HÁTTÉR ganglionsejtek pusztulását is mérsékelte az axonok növekedési faktorainak fokozott szintézisével [3, 26, 156].
Az apoptózis (’levélhullás’), mint programozott sejthalál, a természetes folyamatok egyike, mely részben védi a szervezetet az életre képtelen sejtek elszaporodásától, de ha a folyamat kóros körülmények között felgyorsul, a szervezet ellen is fordulhat. Ezért mindenképpen fontos a különböző módon provokált folyamat gátlásának vizsgálata. NGF-fel neuronális irányba differenciálódott PC-12 pheochromocytoma sejtek szérum megvonásra bekövetkező apoptózisát sikeresen gátolta a (-)-deprenil. Ezen kívül a növekedési faktorok elvonásával indukált apoptózist az A-2058 melanoma és PC12 sejtvonalon igen kis koncentrációban (10-9, 10-13 M) csökkentette [172, 177]. A (-)-deprenil a különböző apoptotikus hatásokat a MAO-B gátlástól független módon gyengíti. Ezért részben a lebomlásakor keletkező (-)-desmetildeprenilt teszik felelőssé. PC-12-es
sejtvonalon
a
(-)-deprenil
kezelés
hatására
a
mitikondriumok
membránpotenciálja nem csökken, amint az apoptotikus folyamatok korai fázisában csökkeni szokott, és egyben a reaktív gyökök eliminálását is indukálja. A (-)-deprenil kezelés nem befolyásolja a MAO enzim expresszióját [178, 179].
3.1.8. A (-)-deprenil anti-aging hatása
Az elmúlt 100 év alatt, a fejlett országokban a higiéne , a kemoterápia és az immunológia korszakos fejlődésének eredményeként az emberek átlagos életkora 55 évről mintegy 80 évre tolódott ki. De nem csak az emberek átlagos élettartama, életszínvonala hanem a társadalomban betöltött szerepük is megváltozott. A kollektív ember egyre inkább átalakul individuális lénnyé, mely természetesen magával hozza a fokozott önmegvalósítási vágyat, amihez elengedhetetlen a célorientált viselkedés a kapott vagy szerzett aktív gócokon keresztül. Ez az aktív góc adja a hajtóerőt, mely fáradhatatlanul űzi az egyént céljának elérése felé és amíg ez munkálkodik, addíg a hanyatlás mint ellenerő nem tud működésbe lépni.
29
IRODALMI HÁTTÉR
A (-)-deprenil enhancer hatása éppen a hanyatlás ellen fordul, és attól függően, hogy milyen mértékű volt, vagy szinten tartja, vagy visszafordítja azt. Jól igazolják ezt a Knoll és munkatársai által végzett állatkísérletek eredményei. Fokozza a tanulási képességet [77], növeli a szexuális teljesítményt, ezáltal az életminőséget jó irányba megváltoztatja és így hosszabbítja az élettartamot [87, 88, 89]. Ezt legjobban egy két évig tartó kísérletsorozatban kapott eredmények bizonyítják, melyben 1600 hím patkány közül kiválasztották a szexuálisan legjobban teljesítő, ’high performing’ (HP), összesen 99
állatot
és
a
veleszületetten
inaktív
’low
performing’
(LP),
összesen
94 állatot. Mindkét csoportban az állatok felét sóval, másik felét 0.25 mg/kg (-)-deprenillel kezelték heti 3 alkalommal. Az állatok tanulási és szexuális teljesítményét élethosszig vizsgálták. A (-)-deprenil kezelés mindkét állatcsoportban szignifikánsan javította a teljesítményt és meghosszabította az élettartamot [94].
Először 1988-ban közölte Knoll, hogy (-)-deprenillel élethosszig kezelt állatok szignifikánsan tovább élnek, mint sóval kezelt társaik [87, 89]. Ezt erősítette meg a fenntebb leírt kísérletsorozat [94]. A (-)-deprenilnek ezt a hatását számos külföldi kutatócsoport utánvizsgálta és megrősítette patkányokon [76, 127], kutyákon [153] és szíriai hörcsögön [169].
Az öregedés folyamata mindezideig pontosan nem ismert. Bizonyos, hogy idő múlásával a szervezet energiája fogy, a rendszer kopik, tehát lassan minden leépül. Ma még az öregedést szükséges rossznak, megfordíthatatlannak tartják. Egyetlen farmakológiai tankönyvben sem találunk még olyan fejezetet, mely az öregedés normális folyamatát lassító (anti-aging) vegyületekkel foglalkozna, noha már számos olyan készítmény áll rendelkezésünkre, a vitaminokon, az ásványi anyagokon, nyomelemeken kívül, melyek az öregedési folyamatot valamilyen módon kedvezően befolyásolják.
30
IRODALMI HÁTTÉR
Az öregedés folyamatát értelmezni próbáló elméletek száma már jelentős [8, 24, 58, 61, 103, 128, 152, 194], lásd 3.1.8.1. táblázat.
3.1.8.1. táblázat. Az öregedést értelmezni próbáló mai elméletek
ELMÉLET
AZ ÖREGEDÉSÉRT FELELŐSSÉ TETT MECHANIZMUS
1.
genetikus
telomeráz hiányában a telomérek kisebbek
2.
neuroendokrin
csökkent hypothalamikus kontrol
3.
neuroprotektív
szabadgyökök, toxikus oxigén
4.
membrán
csökkent víz és lipid tartalom
5.
Hayflick
sejtosztódási limit
6.
mitokondriális
energiatermelés csökken
7.
’cross-linking’
keresztkötések cukrok, fehérjék, DNA között →tumor
8.
enhancer regulációs
endogén enhancer anyagok fokozatos csökkenése
Az öregedés enhancer-regulációs elmélete abban különbözik a többitől, hogy a (-)-deprenil, mely úgy tűnik az enhancer reguláció serkentésével hat, egyszerre több fontosnak tartott tényezőt befolyásol kedvezően. A (-)-deprenil az első vegyület, mely állatok élettartamát szignifikánsan megnyújtja és azt akár a technikai határ (technical life span , TLS) fölé is emeli [87]. A (-)-deprenilt ma a leghatékonyabb ’anti-aging’ vegyületnek tartják és százezrekre becsülik azok számát, akik naponta profilaktikus célból az agy öregedése lassulásának reményében szedik [167].
31
IRODALMI HÁTTÉR
3.2. AZ ENDOGÉN ENHANCEREK 3.2.1. A “trace” aminok
Azokat a biogén aminokat, amelyek igen kis mennyiségben, mondhatni nyomokban találhatóak az emlős szervezet központi idegrendszerében, “trace” (nyom) aminoknak (TA) nevezik. Kimutatásukat nemcsak a mennyiségi viszonyok nehezítik, hanem gyors bomlásuk is. Ilyen endogén TA anyag a: tiramin, β-feniletilamin, oktopamin, melyek számos viselkedésre kifejtett hatása hasonlít az amfetaminéhoz [23, 37, 66, 132]. A katecholaminerg transzmisszió kotranszmittereinek, neuromodulátorainak vagy “hamis” transzmittereinek is nevezték őket [21, 22, 34]. A nyom-aminok közé tartozik még a triptamin is, de ez az indol-amin abban különbözik a feniletilamin származékoktól, hogy nincs releasing hatása. PEA alapstruktúrával rendelkező TA-ok kémiai szerkezete
—CH 2—CH 2—NH 2
HO—
β-feniletilamin
—CH 2—CH 2—NH 2
p-tiramin
CH 3 | —CH 2—CH 2—NH 2
HO—
OH | —CH 2—CH 2—NH 2 p-octopamin
d-amfetamin
Indolamin struktúrájú TA —CH 2—CH 2—NH 2 N triptamin
3.2.1.1. ábra. TA-ok kémiai szerkezete
32
IRODALMI HÁTTÉR
Az endogén tiramin különböző bioszintetikus folyamatok során keletkezik, mint páldául: p-tirozin dekarboxilációja, feniletilamin parahidroxilációja és a DA, DOPA dehidroxilációjával.
Az
exogén
tiramin
viszonylag
magas
koncentrációban
(0.2-1.0 g/kg) található meg a fermentált és/vagy érlelt táplálékokban (sajtok, szalámi) [32]. A PEA fenilalaninból dekarboxilációval keletkezik. Hatásmódja alapján “endogén amfetamin”-nak is nevezik [155]. Megtalálható élelmiszerekben is (sajt, csokoládé). Humán agyban főleg a cerebellumban, hypothalamusban, hippocampusban és a putamenben mutatható ki [124]. A PEA tartalmú neuronok a DA tartalmú neuronok közelében lokalizálódnak és 6-OHDA kezeléssel létrehozott destrukciójuk a DA és PEA szint csökkenéséhez vezet a substantia nigrában. A PEA-t a MAO-B metabolizálja fenilecetsavvá. A (-)-deprenil kezelés viszont növeli a PEA szintet mind a rágcsálókban, mind a humán agyban [148].
3.2.2. A “trace” aminok receptorai és hatásai
A NA, DA, 5-HT klasszikus biogén amin neurotranszmitterek, melyekről már régóta tudjuk, hogy G-protein kapcsolt receptoron fejtik ki hatásukat. A TA-ok indirekt és direkt úton hatnak. Indirekt hatást úgy hozzák létre, hogy a klasszikus biogén aminokat kiáramoltatják, és azok fejtik ki hatásukat specifikus receptoraikon. Direkt hatást pedig specifikus, saját receptoraikhoz kötődve hoznak létre. A PEA direkt posztszinaptikus hatását 1977-ben [4], az oktopaminét 1978-ban [31] írták le. A p-[3H]-tiramin receptorokat, a PEA és a [3H]-triptamin nagy affinitású kötőhelyeit a központi idegrendszerben pedig 1982-ben igazolták [60]. Borowsky és munkatársai specifikus TA receptor családról számol be 2001-ben megjelent cikkükben [20], miszerint a TAkötőhelyek is G-protein kapcsolt receptorok. A TA1 főleg tiramin és PEA által aktívált, míg a triptamin, oktopamin csak gyengén kötődik ehhez a helyhez. A TA2 kötőhely nagy affinitással kapcsolja a PEA-t és a triptamint.
Az ember szervezetében a TA1 receptorok megtalálhatóak a perifériás szervek szöveteiben (gyomor, vese, tüdő) és a központi idegrendszerben, elsősorban az
33
IRODALMI HÁTTÉR amygdala-ban. TA3 receptor csak a vesében, a TA4 a hippocampusban mutatható ki, míg a TA4 és TA5 a vesében és az amygdala-ban is fellelhető. A vesében található receptoroknak szerepet adnak a vérnyomás és az elektrolit háztartás szabályozásában. Ugyancsak felelőssé teszik a tiramin által kiváltott “sajt reakció” létrejöttért. Mivel a PEA és a triptamin funkcionális deficitje együttjár depresszióval és anxietással, feltételezik, hogy ezekben a kórképekben potenciális etiológiai faktorok lehetnek. Elképzelhető, hogy a megnövekedett PEA szint váltja ki a mániás, vagy a bipoláris depressziót. Ezen túlmenően skizofréniás betegek vizeletéből nagy mennyiségű PEA mutaható ki, így feltétlenül tovább kell vizsgálni ezt a lehetőséget is. A receptor család felfedezésével választ kaphatunk a TA-ok fiziológiai szerepére, és ezáltal a pszichiátriai betegségek etiológiája talán érthetőbbé válik.
Az amfetaminhoz hasonlóan a három PEA struktúráju TA fokozza a locomotor aktivitást [119] és sztereotíp viselkedést okoz [48]. Az amfetamin kiváltotta pszichózis szindrómának megfelelően PEA és a tiramin is szerepet játszhat a skizofrénia patogenezisében. [155, 187]. Raiteri 1977-ben jelzett [3H]-DA-nal igazolta, hogy a TA-ok is fokozzák a szinaptoszómákból történő dopamin kiáramlását csakúgy, mint az amfetamin [144]. Ez a “releasing” hatás a perifériás noradrenerg neuronokon is ugyanúgy érvényesül, mint az agyban. A PEA és az amfetamin között csak a hatás tartamában van különbség. A PEA-t a MAO-B enzim elbontja, ezért hatástartama rövid, míg az amfetaminok nem jó szubsztrátjai a MAO-nak, sőt az enzimet gyengén kompetetíve gátolják, ezért hatásuk tartós. A DA visszavételét gyengén gátolják [68, 144]. Ezek a vegyületek gátolják az elektromos ingerlés kiváltotta [3H]-acetylcholin ’release’-t patkány striatumon pargilin jelenlétében [10].
A (-)-deprenyl az első olyan MAO bénító, mely nem potencírozza, hanem gátolja a tiramin katecholaminokat felszabadító hatását. Az akkor új vegyületnek ez az egyedülálló tulajdonsága, melynek okát csak 1996-ban fejtettük meg [97, 98], kulcsszerepet játszott a (-)-deprenil első klinikai alkalmazásában [80].
34
IRODALMI HÁTTÉR
3.3. A “TRACE” AMINOK ÉS A SZINTETIKUS ENHANCEREK HATÁSÁNAK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
A (-)-deprenil enhancer hatásának felfedezése világította meg azt, hogy a PEA, melynek a (-)-deprenil származéka, endogén enhancer hatású vegyület [95, 97]. További előrehaladást jelentett az enhancer reguláció kutatásában a 1-fenil2-propilaminopentan, a (-)-PPAP kidolgozása, mert szelektívebb enhancer mint a (-)-deprenil, mivel nem gátolja a MAO-B-t és nem bomlik le amfetamin származékokra [92]. 3.3.1. táblázat: Az endogén és a szintetikus enhancer anyagok hatásspektrumának összehasonlítása
Vegyület
Enhancer hatás
Releasing hatás
MAO-bénító hatás
PEA
+
+
MAO-B szubsztrát
Amfetamin
+
+
gyenge bénító
(-)-deprenil
+
0
erős MAO-B bénító
(-)-PPAP
+
0
0
Triptamin
+
0
MAO-A szubsztrát
(-)-BPAP
+
0
gyenge MAO-A bénító
A triptamin enhancer hatásának felfedezése [94] pedig megnyitotta az utat egy triptamin-származékú új, szelektív, a (-)-deprenilnél több mint 100-szor hatékonyabb enhancer hatású vegyület, R-(-)1-benzofurán-2-yl)-2-propilaminopentán HCl, (-)-BPAP, kifejlesztésére [100]. A 3.3.1. táblázat összefoglalva mutatja az eddig kísérletesen alaposan vizsgált endogén enhancerek és az azokból derivált szinetetikus származékok hatásspektrumát.
35
MÓDSZEREK
4. MÓDSZEREK 4.1 VEGYÜLETEK
Kísérleteinkben az alábbi vegyületeket használtuk: •
Chinoin, Budapest: feniletilamin HCl (PEA), (-)-metamfetamin, dezmetilimipramin HCl (DMI), (-)1-phenyl-2-propilaminopentan HCl [(-)-PPAP], (-)-deprenil HCl, (-)-amfetamin,
•
Fluka, :(-)-noradrenalin HCl, dopamin HCl, serotonin HCl
•
Serva, Heidelberg: tiramin HCl
•
Műszaki Egyetem, Szerves Kémiai Tanszék, Budapest: tetrabenazin HCl,
•
Macfarlan, Edinburgh: cocain HCl,
•
Amersham, Buckinghamshire, U.K.: [3H]-noradrenalin (l-[7,8-3H]-noradrenalin; specifikus aktivitás: 30-50 Ci/mM), [3H]-dopamin ([2,5,6-3H]-dopamin; specifikus aktivitás: 5-15 Ci/mM), [3H]-szerotonin ([5-hidroxi-G-3H]-triptamin kreatinin szulfát; specifikus aktivitás: 10-20 Ci/mM),
•
Fujimoto Pharmaceutical Corp.: R-(-)1-benzofurán-2-yl)-2-propilaminopentán HCl [(-)-BPAP], Lazabemid HCl,
•
Sigma:
3,4-DHBA,
N-metil-szerotonin,
fluoxetin
HCl,
pergolid
mezilát,
bromokriptin mezilát, klorgilin HCl
4.2. A KÍSÉRLETEKBEN ALKALMAZOTT ÁLLATOK
Az agytörzsi és a meghatározott agyrészleteket igénylő munkákhoz 200-230 g-os Wistar hím patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat kísérletek előtt legalább 3 napon át aklimatizáltuk. 12 órás sötét/világos ciklusban megvilágított helységben (22±2°C) tartottuk őket. Vizet és préselt tápot ad libitum fogyaszthattak.
36
MÓDSZEREK
4.3. JELZETT NORADRENALIN (NA), DOPAMIN (DA), SZEROTONIN (5-HT) FELSZABADULÁSÁNAK MÉRÉSE IZOLÁLT PATKÁNY AGYTÖRZSBŐL
Ebben a kísérletben hím patkányok agytörzsét használtuk, melyet a dekapitálás után gyorsan kipreparáltuk és azonnal karbogénnel telített, 37 C°-os, 2 ml térfogatú Krebs oldatba helyeztük és a szövetet 30 percig hagytuk equilibrálódni. 4.3.1. táblázat: A normál Krebs oldat összetétele (mM):
Na+
K+
Ca++
Mg++
Cl-
HCO3-
H2PO4-
SO42-
Glükóz
137.4
5.9
2.5
1.2
120.2
25.0
1.2
1.2
11.5
A 4.3.1. táblázatban feltüntetett anyagokon kívül a Krebs oldat tartalmazott még irreverzibilis MAO enzim gátló pargilint (12 mM), antioxidáns aszkorbinsavat (0.3 mM) és Na2-EDTA-t (0.03 mM) az oldatban esetleg előforduló nehézfém ionok megkötésére. Preinkubációval inkorporáltuk a patkány agytörzs transzmitter raktáraiba az izotóppal jelzett biogén amin valamelyikét, [3H]-noradrenalint, [3H]-dopamint, vagy [3H]-szerotonint.
A preparátumot ezután 37 C°-ra temperált szervtartó edénybe függesztettük fel (térfogata: 5 ml). Ezt követően folyamatos karbogenizálás mellett, perisztaltikus pumpa segítségével a preparátumot először 800 ml Krebs oldattal mostuk (áramlási sebesség: 8 ml/perc). A Krebs oldat azonban pargilin helyett most a neuronális ’uptake’-gátlására kokaint (0.03 mM) tartalmazott. Az oldatot egy másik perisztaltikus pumpával szívtuk el a szervtartó edényből, majd az áramlási sebességet 4 ml/percre csökkentve a preparátumot az extraneuronális ’uptake’-gátlására kortikoszteront (0.05 mM) is tartalmazó Krebs oldattal tovább mostuk. A kokain és a kortikoszteron egyidejű alkalmazása esetén az ingerlésre felszabaduló [3H]-noradrenalin 86%-a nem metabolizált és nem vevődik fel neuronális illetve extraneuronális ’uptake’ segítségével [43].
37
MÓDSZEREK
A preparátumon átfolyó oldatból 3 perces frakciókat gyűjtöttünk. A kísérlet kezdeténél 3x3 perces nyugalmi periódus után ingereltük először a preparátumot 3 percig tartó négyszög impulzusokkal (3Hz, 1 ms, 60 V). Majd ezt követően az ingerléses periódusok között 7x3 perces nyugalmi szakaszt hagytunk. A vizsgálandó anyagot mindig a 3. ingerlés előtt 1 perccel adtuk a szervfürdőhöz (5-50 µl-es térfogatban). 60x3 perces frakció gyűjtése után a kísérlet végén az agytörzs súlyát lemértük. A kb. 8 órás kísérlet utáni preparátum nedves szövetsúlya átlagban kb. 800 mg volt, melyet 2 ml-Soluene-100 oldatban szolubilizáltuk. Az így elroncsolt szövetet tartalmazó mintából 50 µl-t pipettáztunk 10 ml szcintillációs oldatba. A kísérlet során gyűjtött frakciókból 1-1 ml-t fecskendeztünk 10-ml szcintillációs oldatba.
A felszabadult jelzett biogén amin mérése liquid-szcintillációs spektrométeren (Beckman LS-900) történt. Az egyes mintákat a készülék 4 percig mérte, az eredményt pedig percenkénti beütésszámban (cpm) kaptuk meg. Az egyes minták jelzett biogén amin tartalmát számítógépes program segítségével kapjuk meg pmol-ban. A módszer természetesen nem méri a felszabadult ’hideg’ noradrenalin tartalmat.
4.4.
NORADRENALIN
(NA),
DOPAMIN
FELSZABADULÁSÁNAK
MÉRÉSE
(DA),
SZEROTONIN
IZOLÁLT
(5-HT)
PATKÁNY
AGYRÉSZLETEKBŐL
4.4.1. A preparátumok elkészítése
Dekapitálás után mindkét oldalról kipreparáltuk a következő biogén aminok felszabadulásának meghatározására a megfelelő agyrészletet patkány agy atlasz alapján és azonnal 37 C°-os, 2 ml térfogatú Krebs oldatba helyeztük (összetételét a 4.3.1. táblázat mutatja).
•
dopamin - striatumból, substantia nigraból, tuberculum olfactoriumból
•
noradrenalin - locus coruleusból
•
szerotonin – rapheból
38
MÓDSZEREK Egy szervfürdőbe helyezett preparátumok száma a következő volt: (1) 4 db striatum, mindegyik felezve (2) 4 db substantia nigra (3) 4 db tuberculum olfactorium (4) 8 db locus coeruleus (5) 8 db raphe. Az agymintákat 20 percig inkubáltuk, majd a 2 ml Krebs oldatot frissre cseréltük és ismét 20 percig hagytuk a szövetmintát a szervfürdőben. Az ezidő alatt felszabadult biogén amin mennyiségét mértük. A mesterséges manipulációk minimalizálása érdekében a neuronális és extraneuronális felvételt csakúgy, mint az aminok metabolizmusát nem befolyásoltuk. Tehát a nettó amin mennyiséget mértük, mely a második 20 perces áztatási idő alatt szabadult fel, és ezt az értéket tekintettük a túlélő neuron élettani aktivitása indikátorának.
4.4.2. A kísérlet menete és a minták tisztítása
A kísérletek egy részében a felhasznált állatokat dekapitálás előtt 30 perccel sc. kezeltük a vizsgálandó anyaggal illetve a kontrol csoportot a kísérleti anyag oldószerével. A kísérletek másik felében viszont közvetelenül a szervfűrdőhöz adtuk a vizsgálandó anyagokat minden alkalommal 10 µl-es mennyiségben. A második 20 perc eltelte után a 2 ml Krebs oldatot leszívtuk a szövetekről, centrifugáltuk 3000g-vel 20 percig és a katecholaminokat 60 mg aluminium tartalmú (BDH Chemicals Ltd), a szerotonin mintákat pedig 15 mg Sephadex G-10 (Pharmacia) mikrooszlopokon megtisztítottuk. Tisztítás előtt a megfelelő internal standardot adtuk a mintákhoz
{3,4-dihidroxi-benzilamin (DHBA), n-metil-szerotonin} 5 ng/10 µl koncentrációban [5, 75]. A mikrooszlopról lecsöpögő eluenst Eppendorf csőbe szedtük és az így kapott mintákból határoztuk meg a biogén aminok mennyiségét HPLC segítségével. 4.4.3. Kromatográfiás mérés elektrokémiai detektorral
Eluensként trietilamin-foszfát puffert (pH=5.2) használtunk mindhárom biogén amin meghatározásnál.
A
puffer
tartalmazott
még
ionpár
képzésre
200
mg/l
oktánszulfonsavat, 18 mg/l dinátrium-EDTA-t és 6 % acetonitrilt. Az eluenshez felhasznált vizet Milli-QPlus desztilláló készüléken tisztítottuk, a kész puffert
39
MÓDSZEREK felhasználása előtt 0,5 µm pórusméretű szűrőn megszűrtük (Millipore, USA) és hélium gázzal (Linde) légtelenítettük. A módszer validálása után a detektor érzékenységének meghatározása céljából NA-t, DA-t, DHBA-t, 5-HT-t és n-metil szerotonint injektáltunk a biológiai minták előtt. A mikrooszlopokról lecsöpögő mintákból, centrifugálás után (mikrocentrifuga) 2-5-10 µl-t injektáltunk a HPLC rendszerbe. A mérési eredmények értékelése az integrátor által megadott belső standard és a minta csúcsaihoz tartozó területek alapján történt. A mérés során használt készülékek, eszközök: HPLC-pumpa: Waters 510 Injektor: Waters U6K-kézi injektor Detektor: Waters 460 Electrochemical Detector Detektálási potenciál: 0.65 V Referens elektród: Ag/AgCl 3M KCl (Waters) Munkaeletród: Waters glassy carbon Integrátor: Waters 746 Data Modul Oszlop: Waters Resolve 5µm Spherical C18 3,9x150mm Oszlop előszűrő: Waters Áramlási sebesség: 0,8 ml/min Oszlophőmérséklet: 27°C Milli-QPlus desztilláló készülék (Millipore, USA) Eluens szűrő: Millipore Asztali centrifugák: Fischer Millipore microcentrifuga
4.5. STATISZTIKAI ANALÍZIS Kísérleteinkben a kapott eredmények kiértékelésére Student t-tesztet használtuk a PCS (Pharmacologic Calculation System) 4.2 Versio (Springer-Verlag New York Inc) softwer segítségével. A választott szignifikancia határ 5% volt.
40
EREDMÉNYEK
5. EREDMÉNYEK 5.1. A (-)-DEPRENIL, A PEA ÉS A TIRAMIN ENHANCER HATÁSA
5.1.1. A (-)-deprenil enhancer hatása izolált patkány agytörzsön Knoll már 1987-ben kimutatta, hogy a (-)-deprenil facilitálja a nigrostiatalis dopaminerg neuronokat [86]. Kísérleteinkben először kimutattuk, hogy ez a hatás nem csak erre az egy agyterületre vonatkozik. Ezért megmértük kezeletlen patkány agytörzsének ingerlékenységét [3H]-NA, [3H]-DA és [3H]-5-HT jelenlétében különkülön, 42 x 3 percig tartó időtartam alatt. A preparátumot a [3H]-NA-nal és a [3H]-DAnal végzett kísérletekben a 4., 12., 20., 28., 36 és a [3H]-5-HT-nal végzett kísérletekben 4.,14., 24., és a 34. 3 perces intervallumban négyszög impulzussal ingereltük. Minden amin felszabadulását 4 preparátumon vizsgáltuk.
3H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
30 25 20 15 10 5 0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
5.1.1.1. ábra Példa a [3H]-noradrenalin felszabadulására kezeletlen patkány agytörzsből. A preparátumot 3 percig ingereltük (3 Hz, 1 ms, 60 V).
A [3H]-NA felszabadulás az impulzusok hatására jelentős mértékben fokozódott, sőt a második 3 percben (amikor az idegingerlés már szünetelt) még erőteljesebb volt, majd azt követően visszaállt fokozatosan az alapértékre. Az egymást követő ingerlési
41
EREDMÉNYEK periódusokban a kiáramló [3H]-NA az idő múlásával csökkent, a preparátum aktivitása arányosan gyengült, amint azt példaként az 5.1.1.1. ábra mutatja. A [3H]-DA és [3H]-5-HT jelenlétében kapott kontrol értékek hasonlóak voltak az 5.1.1.1. ábrán látható görbe adataihoz.
A kontrol görbe felvétele után megvizsgáltuk a szervfürdőbe adott (-)-deprenil hatását, külün-külön a [3H]-NA-nal, [3H]-DA-nal és [3H]-5-HT-vel telített, előzőleg kezeletlen patkány agytörzsén. Az anyagot a 3. ingerlés előtti 3 perc kezdetén injektáltuk a szervfűrdőbe minden alkalommal. Minden aminra vonatkozó kísérletet 4 preparátumon végeztük.
3H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
30 25 20 15 10 5 0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
(-)-deprenil 2 µg/ml
5.1.1.2. ábra Példa a 2 µg/ml (-)-deprenil noradrenerg neuronokra kifejtett enhancer hatására patkány agytörzsön.
Az 5.1.1.2. ábrán látható, hogy a (-)-deprenil 2 µg/ml koncentrációban alig befolyásolta a nyugalomban kiáramló [3H]-noradrenalin mennyiségét, azonban az idegingerlés hatására bekövetkező transzmitter áramlást erőteljesen megemelte. A (-)-deprenil hatása nem szűnt meg az anyag kimosódásával (4 ml/perc), a preparátum
42
EREDMÉNYEK ingerlékenységét tartósan fokozta gyakorlatilag a kísérlet végéig, mintegy 1 órán keresztül.
¤ Stimuláció
90 80 70 60 50 40 30 20 10
3
H-dopamin felszabadulás (pmol)
3 min.
0
¤
¤
¤ 20
10
¤
¤ 30
40
(-)-deprenil 0.2 pg/ml
5.1.1.3. Példa 0.2 pg/ml (-)-deprenil dopaminerg neuronokra kifejtett enhancer hatására izolált patkány agytörzsön.
3
H-szerotonin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
¤
¤ 10
¤ 20
¤ 30
40
(-)-deprenil 0.2 µg/ml
5.1.1.4. Példa 0.2 µg/ml (-)-deprenil szerotonerg neuronokra kifejtett enhancer hatására izolált patkány agytörzsön.
43
EREDMÉNYEK
A (-)-deprenil a jól ingerelhető preparátumon a [3H]-DA release-t 0.2 pg/ml mennyiségben is fokozta még, bár a hatása itt már nem mutatkozott tartósnak (5.1.1.3. ábra). Ezzel szemben 0,2 µg/ml (-)-deprenil a [3H]-5-HT-os agytörzs készítményen, mely kezdetben alig-alig reagált az ingerlésre, jelentősen fokozta az ingerlékenységet és a hatás a következő ingerlésnél is fennmaradt (5.1.1.4. ábra).
3H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
500 400 300 200 100 0
¤ 10
20
30
40
(-)-A 0.5 µg/ml/perc
5.1.1.5. ábra Példa 0.5 µg/ml/perc (-)-amfetamin ’releasing’ hatására izolált patkány agytörzsön.
Az 5.1.1.5. ábra jól szemlélteti, hogy a (-)-amfetamin 0.5 µg/ml/perc dózisban idegingerlés nélkül is jelentősen fokozza a [3H]-noradrenalin felszabadulását. A (-)-amfetaminnak ezt a hatását nevezzük ’releasing’ hatásnak, mely elfedi az ’enhancer’ anyagok idegingerléssel kiváltott, exctitózist létrehozó tulajdonságát. A (-)-amfetaminnak, az erőteljes [3H]-noradrenalin felszabadulást létrehozó hatása még az anyag kimosódása után is fennmarad, mintegy 30 percen keresztül, míg az enhancer hatás kialakulása után a preparátum gyorsabban visszatér a nyugalmi állapotba.
44
EREDMÉNYEK
3 min.
¤ Stimuláció
20
15
10
5
3
H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
25
0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
(-)-klorgilin 2 µg/ml
5.1.1.6. ábra Példa 2 µg/ml klorgilin hatástalanságára izolált patkány agytörzsön.
Az 5.1.1.6. ábra jól szemlélteti, hogy a szelektív MAO-A enzim bénító klorgilin 2 µg/ml-es dózisa nem befolyásolja [3H]-noradrenalin felszabadulásnak sem az alap értékét, sem az idegingerlésre bekövetkezett válaszát, a kontrol görbéknek megfelelő lefutást mutatnak a mért adatok.
5.1.2. Egyszeri (-)-deprenil adag enhancer hatása patkányon Mivel a (-)-deprenil a jelzett DA –nal végzett vizsgálatokban igen alacsony dózisban még hatásosnak mutatkozott, megmértük a MAO-B enzim bénító hatással már nem rendelkező mikrogramos dózistartomány effektusát patkány agyból preparált substantia nigran, tuberculum olfactoriumon, striatumon, locus coeruleuson és raphen. Az állatokat sc. kezeltük (-)-deprenillel és 30 perccel a kezelés után kivett mintákból mértük a biogén amin felszabadulást.
45
EREDMÉNYEK
(-)-deprenil (mg/kg) 0 0,01
SUBSTANTIA NIGRA
*** ***
0,025 0,05
***
0,1
***
0,25
0 0,01
**
0,025
TUBERCULUM OLFACTORIUM
*** ***
0,05 0,1
***
0,25
0 0,01
*
0,025
STRIATUM
*** ***
0,05 0,1
***
0,25 0
2
4
6
8
dopamin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.1.2.1. ábra Egyszeri (-)-deprenil kezelés hatása az agytörzsi dopaminerg rendszer
működésére
patkányon.
A
dopamin
felszabadulását
megfelelő mintából (substantia nigra, tuberculum olfactorium, striatum) HPLC-vel elektrokémiai detektor segítségével mértük. (N=8) Szignifikancia: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001
46
EREDMÉNYEK
Az elektrokémiai detektoros HPLC technika segítségével kimutattuk, hogy a (-)-deprenil kezelés dózis-függően, szignifikánsan emeli a biogén aminok (dopamin, noradrenalin) szintjét az 5.1.2.1. és az 5.1.2.2. ábrán feltüntetett agyrészleteken.
(-)-deprenil (mg/kg) Locus coeruleus
0
*
0,01
0,025
* *
0,05
0,1
* *
0,25
0
2
4
6
8
10
noradrenalin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.1.2.2. ábra. Egyszeri (-)-deprenil kezelés hatása az agytörzsi noradrenerg rendszer működésére patkányon. A noradrenalin felszabadulását locus coeruleusból HPLC-vel elektrokémiai detektor segítségével mértük. (N=4) Szignifikancia: *p<0,01
47
EREDMÉNYEK
Az egyszeri (-)-deprenil kezelés nem fokozta a szerotonin felszabadulását a rapheból, sőt 0.25 mg/kg dózisban kis mértékben, bár szignifikánsan csökkentette azt (5.1.2.3. ábra).
(-)-deprenil (mg/kg) Raphe
0
0,01
0,025
0,05
0,1
0,25
* 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
szerotonin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.1.2.3. ábra Egyszeri (-)-deprenil kezelés hatása az agytörzsi szerotonerg rendszer működésére patkányon. A szerotonin felszabadulását rapheból HPLC-vel elektrokémiai detektor segítségével mértük. (N=4) Szignifikancia: *p<0,05
48
EREDMÉNYEK
5.1.3. PEA és tiramin enhancer hatásának bizonyítása izolált patkány agytörzsön
A PEA és a tiramin enhancer hatását [3H]-NA segítségével mértük izolált patkány agytörzsön. Minden preparátumon csak egy amin hatását vizsgáltuk. Mindkét amin hatását négy-négy preparátumon mértük. Mind a PEA, mind a tiramin nagyon hatékonynak mutatkozott, kb. 8-9-szeresére emelték az idegingerlés hatására kiáramló [3H]-NA mennyiségét. A tiramin hatása elhúzúdó volt. Az 5.1.3.1. és az 5.1.3.2. ábra mutat példát a PEA illetve a tiramin enhancer hatására.
3
H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
50
40
30
20
10
0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
PEA 2 µg/ml
5.1.3.1. ábra Példa a 2 µg/ml PEA enhancer hatására izolált patkány agytörzsön.
49
EREDMÉNYEK
H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
30
20
10
0
3
¤ Stimuláció
40
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
tiramin 2 µg/ml
5.1.3.2. ábra Példa a 2 µg/ml tiramin enhancer hatására a [3H]-NA felszabadulására izolált patkány agytörzsön.
5.2. A (-)-MA-nak, a (-)-deprenil anyavegyületének enhancer hatása
3
H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
20
15
10
5
0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
(-)-MA 2 µg/ml
5.2.1. ábra Példa a 2 µg/ml (-)-MA enhancer hatására izolált patkány agytörzsön.
50
EREDMÉNYEK
(-)-MA (mg/kg) 0 0,1
SUBSTANTIA NIGRA
***
0,25
***
1
0
**
0,1
TUBERCULUM OLFACTORIUM
***
0,25
***
1
0 0,1
STRIATUM
0,25
***
1
* 0
2
4
6
8
dopamin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.2.2. ábra Egyszeri (-)-MA kezelés hatása az agytörzsi dopaminerg rendszer
működésére
patkányon.
A
dopamin
felszabadulását
megfelelő mintából (substantia nigra, tuberculum olfactorium, striatum) HPLC-vel elektrokémiai detektor segítségével mértük. (N=8) Szignifikancia: *p<0,05, **p<0,02, ***p<0,001
51
EREDMÉNYEK
A (-)-deprenil metabolizmusa során csak balra forgató származékok keletkeznek, mint a (-)DMD, (-)-A és a (-)-MA. Ezek közül a (-)-MA NA release-t fokozó hatását analizáltuk 2 µg/ml-es mennyiségben. A (-)-MA a (-)-deprenilhez hasonló mértékben fokozta az idegingerléssel kiváltott NA felszabadulását patkány agytörzsből. Ez a hatás a (-)-MA kimosódásával azonnal megszűnt. Négy preparátumon végeztünk mérést, a kísérletek egyikét mutatja be az 5.2.1. ábra. Ha azonban (-)-MA hatását megfelelő agyrészleteken vizsgáltuk, a (-)-depreniltől eltérően a substantia nigran és a striatumon a hatása már 0.1 mg/kg-ban megszűnt, 10-szer gyengébbnek mutatkozott. A hátáskülönbség viszont a tuberculum olfactoriumon csak 4-szeresnek mondható (5.2.2. ábra).
Egyszeri (-)-MA-val kezelt patkányokon is mértük a vegyület enhancer hatását. A szövetmintákat a kezelés után 30 perccel izoláltuk. Az 5.2.2. az 5.2.3. és 5.2.4. ábra mutatja a kísérletek eredményét.
(-)-MA (mg/kg) Locus coeruleus
0
0,1
0,25
**
1
* 0
1
2
3
4
5
6
7
noradrenalin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.2.3. ábra Egyszeri (-)-MA kezelés hatása az agytörzsi noradrenerg rendszer működésére patkányon. A noradrenalin felszabadulását locus coeruleusból HPLC-vel elektrokémiai detektor segítségével mértük. (N=4) Szignifikancia: *p<0,05, **p<0,01
52
EREDMÉNYEK
A (-)-MA hatását a locus coeruleuson 25-ször gyengébbnek mértük, viszont a raphen a
(-)-deprenillel
megeggyező
módon
0.25
mg/kg-ban
gátolta
a
szerotonin
felszabadulását és az alacsonyabb dózisokban hatástalan volt (5.2.3., 5.2.4. ábra).
(-)-MA (mg/kg) Raphe
0
0,1
*
0,25
1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
szerotonin felszabadulás 20 perc alatt (nmol/g)
5.2.4. ábra Egyszeri (-)-MA kezelés hatása az agytörzsi szerotonerg rendszer működésére patkányon. A szerotonin felszabadulását raphe-ból HPLC-vel
elektrokémiai
detektor
segítségével
mértük.
(N=4)
Szignifikancia: *p<0,02
5.3. A MAO-B bénító hatással nem rendelkező 1-fenil-2-propilaminopentan, a (-)-PPAP, enhancer hatása Munkánk során fontosnak tartottuk, hogy egy olyan vegyületet is megvizsgáljunk, mely egyáltalán nem rendelkezik MAO-B bénító tulajdonsággal. Erre a célra a Knoll által,
az
1990-es
évek
elején
kifejlesztett
53
és
munkatársaival
kivizsgált
EREDMÉNYEK 1-fenil-2-propilaminopentan, a (PPAP), (-)enantiomerje volt a legmegfelelőbb, mert a (-)-deprenilhez hasonlóan ennek a vegyületnek sincs releasing hatása [98].
3H-noradrenalin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
40
30
20
10
0
¤
¤ 10
¤ 20
¤
¤ 30
40
(-)-PPAP 2 µg/ml
5.3.1. ábra Példa 2 µg/ml (-)-PPAP [3H]-NA felszabadulására kifejtett hatására izolált patkány agytörzsön.
A (-)-PPAP is, mint anyavegyülete a (-)-deprenil, a dopaminerg rendszeren volt a leghatékonyabb. Az elektromos stimulációra éppenhogy csak reagáló izolált rendszert tartós , egyenletes, szabályos működésre állította át 0.2 µg/ml-es adagban. Mindhárom jelzett izotóp felszabadulását fokozta a patkány agytörzsön, legcsekélyebb mértékben a [3H]-5-HT-t.
Minden
transzmitterre
vonatkozóan
a
(-)-PPAP
hatását
preparátumon vizsgáltuk. A hatásokra példát mutat a 5.3.1, 5.3.2. és 5.3.3. ábra.
54
négy
EREDMÉNYEK
3H-dopamin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
50 40 30 20 10 0
¤
¤
¤ 20
10
¤
¤ 30
40
(-)-PPAP 0.2 µg/ml
5.3.2. ábra Példa 0.2 µg/ml (-)-PPAP a [3H]-DA felszabadulására kifejtett hatására izolált patkány agytörzsön.
3
H-szerotonin felszabadulás (pmol)
3 min.
¤ Stimuláció
35 30 25 20 15 10 5 0
¤
¤ 10
¤ 20
¤ 30
40
(-)-PPAP 5 µg/ml
5.3.3. ábra Példa 5 µg/ml (-)-PPAP [3H]-5-HT felszabadulására kifejtett hatására izolált patkány agytörzsön.
55
EREDMÉNYEK
5.4. A triptamin enhancer hatása patkány agytörzsön
Annak további igazolására, hogy a (-)-deprenil enhancer hatása nem a MAO-B enzim bénító hatásának köszönhető, nem katecholamin szerkezetű endogén trace amin, a triptamin hatását is kivizsgáltuk az általunk alkalmazott teszteken.
ingerlés nélkül
ingerléssel
ingerlés utáni alapérték
triptamin + ingerlés
izotóppal jelzett biogén aminok felszabadulása (pmol)
25 20
[3H]-NA
[3H]-DA
*
[3H]-5-HT
*
*
15 10 5 0
2 µg/ml
5 µg/ml
0,2 µg/ml
5.4.1. ábra A triptamin enhancer hatása izolált patkány agytörzsön: [3H]-NA- jelenlétében 2 µg/ml [3H]-DA- jelenlétében 5 µg/ml [3H]-5-HT-jelenlétében 0,2 µg/ml Szignifikancia: *p<0,05
Az 5.4.1. ábrán jól látható, hogy a triptamin is fokozta mindhárom jelzett biogén amin felszabadulását szignifikánsan, legerőteljesebben a szerotoninét, leggyengébben pedig a jelzett dopaminét.
56
EREDMÉNYEK
5.5.
A
(-)-deprenil
és
a
(-)-BPAP
enhancer
hatásának
sajátos
dózis/koncentráció függése. A (-)-BPAP szelektivitása
Sajátos dózis-függésre lettük figyelmesek már a ’90-es évek elején, amikor a (-)-deprenilnek a katecholaminerg és szerotonerg neuronokat serkentő hatását vizsgáltuk oly módon, hogy a patkányokat 21 napig, naponta egyszer kezeltük 0.01, 0.25, 0.05, 0.1 illetve 0.25 mg/kg s.c. adott (-)-deprenillel és az utolsó kezelés után 24 óra múlva kivett agyrészleteken határoztuk meg a szövetből felszabaduló noradrenalin, dopamin, illetve
NORADRENALIN FELSZABADULÁS (nmol/g)
szerotonin mennyiségét [96].
12
**
10
**
8
*
6
**
4 2 0 -
0.01
0.025
0.05
0.10
0.25
(-)- D E P R E N I L (mg/kg) 5.5.1. ábra (-)-Deprenil enhancer hatásának sajátos dózis-függése 3 héten át kezelt patkányok locus coeruleus-án mérve. A patkányokat 3 héten át naponta s.c. kezeltük a feltüntetett (-)-deprenil dózissal és az utólsó injekció után 24 h-val vettük ki a szövetet. N=12; Student t-teszt; *P<0.01,**P<0.001
Az 5.5.1. ábra az említett sajátos viselkedést illusztráló kísérletet mutat be. Először is látjuk, hogy ebben a kísérletsorozatban a MAO-B enzimet szelektíven és teljes mértékben bénító szokásos dózis (0.25 mg/kg) volt az alkalmazott maximális dózis, de adtuk a (-)-deprenilt ennél 2.5x, 5x, 10x, illetve 25x kisebb dózisban is. Mint látjuk, már a legkisebb alkalmazott adag, 0.01 mg/kg szignifikánsan fokozta a locus coeruleus-ból kiáramló noradrenalin mennyiségét. Az enhancer hatás tehát már a
57
EREDMÉNYEK MAO-B bénításra alkalmazott szokványos dózis 1/25-ében is kifejlődött. Már ez a korai, 1995-ben végzett kísérlet is bizonyította, hogy az enhancer hatáshoz jóval kisebb (-)-deprenil dózis elégséges, mint amennyi a MAO-B szelektív bénításához szükséges.
Az 5.5.1. ábrán látható másik nagyon figyelemre méltó jelenség, hogy a 0.01 mg/kg-nál 2.5x nagyobb, 0.025 mg/kg (-)-deprenillel kezelt állatokból kivett locus coeruleus-ból nem áramlott ki szignifikánsan nagyobb adag noradrenalin, mint a fiziológiás sóoldattal kezelt kontrol állatokból vett szövetmintából. A dózis további, 0.05, 0.1 illetve 0.25 mg/kg-ra emelésével az enhancer hatás ismét megjelent, szignifikánsan növekedett a kiáramló noradrenalin mennyisége. A kísérlet az alacsony koncentráció tartományban egy harang alakú dózis hatás görbére utalt. Az enhancer hatásnak ezt a jellemző dózis-függését meggyőzőbben sikerült igazolni a (-)-BPAP, egy
NORADRENALIN FELSZABADULÁS (nmol/g)
a (-)-deprenilnél több mint százszor hatékonyabb enhancer vegyülettel (lásd később).
10
*
8 6 4 2 0 -
0,1
0,5
2,5
50
(-) B P A P (µg/kg)
5.5.2. ábra (-)-BPAP enhancer hatásának kezelt patkányok locus coeruleus-án naponta s.c. kezeltük a feltüntetett injekció után 24 h-val vettük ki a *P<0.001
sajátos dózis-függése 3 héten át mérve. A patkányokat 3 héten át (-)-BPAP dózissal és az utólsó szövetet. N=12; Student t-teszt;
Az 5.5.2. ábra mutatja, hogy napi 0.0001, 0.0005, 0.0025 illetve 0.05 mg/kg (-)-BPAP-val 21 napig s.c. kezelt patkányoknak az utolsó injekció után 24 óra múlva
58
EREDMÉNYEK kivett locus coeruleus-ából csak a legkisebb dózissal kezeltek esetében észleltük a noradrenalin kiáramlás szignifikáns fokozódását, míg az ennél nagyobb adaggal kezelt
NORADRENALIN FELSZABADULÁS (nmol/g)
patkányokon az enhancer hatás nem volt kimutatható.
18
***
15 12 9
**
6
*
3 0 -
0,1
0,5
2,5
50
(-) B P A P (µg/kg) 5.5.3. ábra (-)-BPAP enhancer hatásának sajátos dózis-függése egyszeri adaggal kezelt patkányok locus coeruleus-án mérve. A patkányokat s.c. kezeltük a feltüntetett (-)-BPAP dózissal és az injekció után 30 perc múlva vettük ki a szövetet. N=12; Student t-teszt; *P<0.02,**P<0.01, ***P<0.001
Az 5.5.3. ábra mutatja, hogy ugyanezen dózisok egyszeri adagjával kezelt patkányoknak, 30 perccel a kezelés után kivett locus coeruleus-ából csak akkor észleltük szignifikánsan nagyobb mennyiségű noradrenalin kiáramlását, ha az alkalmazott dózis 0.0001 illetve 0.0005 mg/kg volt, míg a két nagyobb dózis hatástalannak bizonyult.
Az 5.5.2. és a 5.5.3. ábra egyértelműen bizonyítja, hogy az alacsony dózis tartományban egy harang alakú dózis-hatás görbe jellemzi a (-)-BPAP enhancer hatását. Mivel a (-)-BPAP enhancer hatása akkor is kimutatható, ha a vegyületet közvetlenül a szövet fürdőhöz tesszük, az enhancer hatás koncentráció függését ezzel a módszerrel pontosabban tudtuk bemérni.
59
EREDMÉNYEK
***
NORADRENALIN FELSZABADULÁS (nmol/g)
10
*** 8
*
*** **
6
**
4
2
0
-
10-17 10-16 10-15 10-14 10-13 10-12 10-10 10-9 10-8 10-6 10-5 10-4 M
(-) B P A P
5.5.4. ábra Patkány izolált locus coeruleus-ához a szövetfürdőbe adott (-)-BPAP enhancer hatásának sajátos dózis-függése. Kezeletlen patkányokból kivett locus coeruleus-ához adtuk a (-)-BPAP-t és mértük a 20 perc alatt felszabadult noradrenalin mennyiségét. N=12; Student t-teszt; *P<0.01,**P<0.001
Az 5.5.4. ábrán láthatjuk az
izolált locus coeruleus-on vizsgált (-)-BPAP
enhancer hatásának változását a 10-17 M-tól 10-4 M-ig terjedő koncentráció tartományban. Egyértelműen bizonyítást nyert ebben a kísérletsorozatban, hogy a (-)-BPAP a nanomoláris tartományban egy harang alakú koncentráció-hatás görbe formájában befolyásolja a neuron működését és ebben a koncentráció tartományban 10-13 M-nál észlelhető a hatás maximuma. Egy másik harang alakú görbe jellemzi a (-)-BPAP enhancer hatását a mikromoláris tartományban is, e görbének a maximuma 10-6 M-nál van.
60
EREDMÉNYEK
SZEROTONIN FELSZABADULÁS (nmol/g)
2
*** **
1,6 1,2
**
**
**
0,8
*
*
*
*
*
0,4 0
-
10-16 10-15 10-14 10-13 10-12 10-10 10-9 10-8 10-6 10-5 10-4 M
(-)-B P A P 5.5.5. ábra Patkány izolált raphe-jához a szövetfürdőbe adott (-)-BPAP enhancer hatásának sajátos dózis-függése. Kezeletlen patkányokból kivett raphe-hoz adtuk a (-)-BPAP-t és mértük a 20 perc alatt felszabadult
szerotonin
mennyiségét.
N=12;
Student
t-teszt;
*P<0.01,**P<0.001.
Az 5.5.5. ábra mutatja, hogy hasonló módon fejti ki a (-)-BPAP enhancer hatását a szerotonerg neuronokon is. Az ábrán az izolált raphe-hoz hozzáadott (-)-BPAP hatását látjuk. Ebben a kísérletsorozatban 10-16 M-tól 10-4 M-ig terjedő koncentráció tartományban vizsgáltuk a vegyület hatását. A nanomoláris tartományban 10-12 M-nál észleltük a maximális hatást, a mikromoláris tartományban 10-6 M-nál volt a hatás maximuma.
61
EREDMÉNYEK A (-)-BPAP SZELEKTIVITÁSA (-)-BPAP
szignifikánsan
növelte
az
idegingerlés
hatására
felszabaduló
katecholaminok és szerotonin mennyiségét. A noradrenalin, illetve dopamin kiáramlására már 50 nanogram/ml koncentrációban, a szerotonin kiáramlására már 10 nanogram/ml koncentrációban fejtett ki maximális hatást. Annak érdekében, hogy a (-)-BPAP enhancer hatásának szelektivitását vizsgáljuk, megfelelő koncentrációkat alkalmazva olyan ismert vegyületekkel hasonlítottuk össze a (-)-BPAP hatását, melyek az enhancer hatású anyagoktól eltérő mechanizmussal serkentik az agytörzs katecholaminerg és szerotonerg neuronjait.
Állatkísérletekben
a
pszichofarmakonok
farmakológiai
vizsgálata
során
a
leggyakoribb hiba, hogy a szelektíven ható pszichofarmakont a szükségesnél nagyobb dózisban adagolják. Az agy a legkomplexebb felépítésű szerv, és olyan nagy érzékenységű, hogy minden szelektíven ható pszichofarmakon gyorsan elveszíti szelektivitását, ha a szükségesnél nagyobb adagban adjuk. Példa erre a (-)-deprenil, az elsőként bevezetett szelektív MAO-B bénító és az ezidő szerint egyetlen klinikailag használt enhancer vegyület. A vegyületet állatokon, főleg patkányokban, az agyi MAO-B szelektív bénítására, dolgozatok ezreiben használták. A (-)-deprenil 0.05 mg/kg adagban fejti ki enhancer hatását és 0.25 mg/kg adagban gátolja szelektíven az agyi MAO-B aktivitást [99]. A 0.05 mg/kg-nál nagyobb dózist használni enhancer hatás mérésére és 0.25 mg/kg-nál nagyobb dózist használni a MAO-B bénítására szükségtelen és csak indokolatlan következtetésekhez vezet. Mindazonáltal nagy számban találunk olyan dolgozatokat, amelyekben a szerzők 1-10 mg/kg, vagy még magasabb (-)-deprenil dózist
alkalmaztak
és
téves
következtetéseket
vontak
le
a
vegyület
hatásmechanizmusára vonatkozóan.
Az izolált patkány agytörzsön végzett kísérletekben olyan gyógyszer koncentrációkat alkalmaztunk, amelyben a vegyület a reá jellemző, specifikus hatását fejti ki és ezt az adagot hasonlítottuk össze a (-)-BPAP legkisebb enhancer hatású koncentrációjával.
62
EREDMÉNYEK
3
[ H]-Noradrenalin felszabadulás (pikomol)
Ingerlés nélkül
Ingerléssel
8
D A:B P<0.05 C:D P<0.05 B:D P>0.05
7 6
A:B P<0.05 C:D P<0.01 B:D P<0.01
5 4 3 2
B A
B
D C
C
A
1 0 Kontrol
DMI
Kontrol
(-)BPAP
250 ng/ml
50 ng/ml
5.5.6. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből nanogram/ml
felszabaduló
[3H]-NA
dezmetilimipramin
mennyiségét,
(DMI),
mely
a
míg
250
noradrenalin
felvételét már gátolja, hatástalan. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-NA mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk.
Az 5.5.6. ábra mutatja, hogy 250 nanogram/ml DMI, mely már teljesen gátolja a noradrenalin visszavételét [170], még nem növelte az idegingerlés hatására felszabaduló 3
[ H]-noradrenalin mennyiségét, míg 50 nanogram/ml (-)-BPAP rendkívül hatékony volt.
63
EREDMÉNYEK
Az 5.5.7. ábrából kitűnik, hogy 50 nanogram/ml fluoxetin, mely teljes mértékben gátolja szerotonin visszavételét [11], nem befolyásolta az idegingerlésre felszabaduló 3
[ H]-szerotonin mennyiségét, míg 10 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan növelte azt.
Ingerléssel D
10 A:B P>0.05 C:D P>0.05 B:D P>0.05
8
A:B P>0.05 C:D P<0.001 B:D P<0.001
6 4
A
B
C
D
A
B
C
2
3
[ H]-Szerotonin felszabadulás (pikomol)
Ingerlés nélkül
0 Kontrol
Fluoxetin 50 ng/ml
Kontrol
(-)BPAP 10 ng/ml
5.5.7. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 10 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből
felszabaduló
[3H]-5-HT
mennyiségét,
míg
250
nanogram/ml fluoxetin, mely a szerotonin felvételét már gátolja, hatástalan. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-5-HT mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk.
Az 5.5.8. és az 5.5.9. ábra további bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az izolált agytörzs tesztjén a szelektív enhancer hatású vegyület jól eldifferenciálható a katecholaminerg, illetve szerotonerg neuronokat más hatásmóddal ingerlő ismert vegyületektől.
64
EREDMÉNYEK
3
[ H]-Noradrenalin felszabadulás (pikomol)
Ingerlés nélkül
Ingerléssel
10 A:B P>0.05 C:D P>0.05 8 B:D P>0.05
A:B P>0.05 C:D P>0.05 B:D P>0.05
A:B P>0.05 C:D P<0.001 D B:D P<0.001
6 4 2 0
D
B A
B A
C
Kont.
Klorgilin 250 ng/ml
Kont.
B
D C
Lazabemid 250 ng/ml
A
Kont.
C
(-)BPAP 50 ng/ml
5.5.8. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből felszabaduló [3H]-NA mennyiségét, míg 250 nanogram/ml klorgilin, mely szelektíven gátolja a MAO-A hatását, csakúgy mint 250 nanogram/ml lazabemid, mely szelektíven gátolja a MAO-B hatását, hatástalan. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-NA mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk.
Az 5.5.8. ábra mutatja, hogy 250 nanogram/ml koncentrációban a klorgilin, mely ebben a koncentrációban szelektíven bénítja agyszövetben a MAO-A enzimet [41], illetve a lazabemid, mely ebben a koncentrációban szelektíven bénítja a MAO-B enzimet
[59],
nem
változtatta
meg
az
idegingerlés
hatására
felszabaduló
3
[ H]-noradrenalin mennyiségét, míg 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozta azt. Az 5.5.9. ábra azt mutatja, hogy mind a klorgilin, mind a lazabemid változatlanul 3
hagyta az idegingerlés hatására felszabaduló [ H]-szerotonin mennyiségét, míg 10 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan növelte ezt.
65
EREDMÉNYEK Ingerlés nélkül A:B P>0.05 C:D P>0.05 B:D P>0.05
10
3
[ H]-Szerotonin felszabadulás (pikomol)
12
Ingerléssel
A:B P>0.05 C:D P>0.05 B:D P>0.05
A:B P>0.05 D C:D P<0.001 B:D P<0.001
8 6 4
AB
AB
C D
AB
C D
C
2 0
Kont.
Klorgilin 250 ng/ml
Kont.
Lazabemid 250 ng/ml
Kont.
(-)BPAP 10 ng/ml
5.5.9. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 10 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből felszabaduló [3H]-5-HT mennyiségét, míg 250 nanogram/ml klorgilin, mely szelektíven gátolja a MAO-A hatását, csakúgy mint 250 nanogram/ml lazabemid, mely szelektíven gátolja a MAO-B hatását, hatástalan. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-5-HT mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk. Ingerlés nélkül
8
A:B P<0.01 C:D P<0.01 B:D P>0.05
A:B P<0.01 C:D P<0.01 B:D P>0.05
D
D
B
6 4
A:B P<0.02 D C:D P<0.001 B:D P<0.01 B
B A
C
A
C
A
C
2
3
[ H]-Dopamin felszabadulás (pikomol)
10
Ingerléssel
0
Kont.
Pergolid 50 ng/ml
Kont. Bromokriptin 50 ng/ml
Kont.
(-)BPAP 50 ng/ml
5.5.10. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből felszabaduló [3H]-DA mennyiségét, míg 50 nanogram/ml pergolid, illetve bromokriptin, melyek már szignifikánsan izgatják a dopamin receptorokat, hatástalan. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-DA mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk ki.
66
EREDMÉNYEK
Az 5.5.10. ábrán azt látjuk, hogy 50 nanogram/ml pergolid, mely mind a D1, mind a D2 receptorokat erőteljesen izgatja [47], csakúgy mint 50 nanogram/ml bromokriptin a D2 receptorok erős izgatója [185], nem befolyásolták szignifikánsan az 3
izolált patkány agytörzsön az idegingerlés hatására felszabaduló [ H]-dopamin mennyiségét, míg 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikáns hatású volt.
D
10 8
Ingerléssel
A:B P<0.01 C:D P<0.01 B:D P>0.05
A:B P<0.01 D C:D P<0.01 B:D P>0.05
A:B P<0.02 C:D P<0.001 D B:D P<0.01
6 4
B
B A
2
C
A
B C
A
C
3
[ H]-Noradrenalin felszabadulás (pikomol)
Ingerlés nélkül
0
Kont.
Pergolid 10 µg/ml
Kont.
Bromokriptin 10 µg/ml
Kont.
(-)BPAP 50 ng/ml
5.5.11. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 50 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből felszabaduló [3H]-NA mennyiségét. Ugyanilyen hatást lehet elérni a már nem szelektív módon ható nagy koncentrációjú (10 µg/ml) pergoliddal, illetve bromokriptinnel. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-NA mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk.
67
EREDMÉNYEK Ingerlés nélkül A:B P>0.05 C:D P<0.01 B:D P<0.02
8
D
D
6 4
A B
D
A:B P>0.05 C:D P<0.001 B:D P<0.01
A:B P>0.05 C:D P<0.01 B:D P<0.02
C
A
B
C
A
B
C
2
3
[ H]-Szerotonin felszabadulás (pikomol)
10
Ingerléssel
0
Kont.
Pergolid 10 µg/ml
Kont.
Bromokriptin 10 µg/ml
Kont.
(-)BPAP 10 ng/ml
5.5.12. ábra A szelektív enhancer hatást kifejtő 10 nanogram/ml (-)-BPAP szignifikánsan fokozza az elektromosan ingerelt izolált patkány agytörzsből felszabaduló [3H]-5-HT mennyiségét. Ugyanilyen hatást lehet elérni a már nem szelektív módon ható nagy koncentrációjú (10 µg/ml) pergoliddal, illetve bromokriptinnel. Az oszlopok a 3 perc alatt felszabaduló [3H]-5-HT mennyiségét adják meg pikomol/ml-ben. N=6. A feltüntetett szórást (S.E.M.) Student t-teszttel számítottuk.
Annak igazolására, hogy ha pszichofarmakonokat, amelyek megfelelő koncentráció tartományban szelektív hatást fejtenek ki, jelentősen nagyobb koncentrációban alkalmazunk, elvesztik szelektivitásukat és nem specifikus hatást fejtenek ki, példát mutat a 5.5.11. illetve 5.5.12. ábra. Amikor pergolidot illetve bromokriptint 10 µg/ml koncentrációban
alkalmaztunk,
mindkét
3
vegyület
szignifikánsan
növelte 3
az
idegingerlésre felszabaduló [ H]-noradrenalin (5.5.11. ábra), illetve [ H]-szerotonin (5.5.12. ábra) mennyiségét.
68
DISZKUSSZIÓ
6. MEGBESZÉLÉS Az enhancer hatás felfedezéséhez hosszú út vezetett és a kulcsvegyület, mely a felismerésben döntő szerepet játszott, tulajdonképpen a (-)-deprenil volt, amelynek kidolgozása Knoll nevéhez fűződik.
A ma világszerte használt (-)-deprenil (Selegilin, Jumex) az 1945. utáni magyar gyógyszerkutatás vitathatatlanul eddigi legnagyobb sikere. A kezdetben E-250 kódnévvel jelölt új vegyületről írt első közlemény, magyarul 1964-ben, angolul 1965ben jelent meg [78, 79]. Már az első közlemény rávilágított az E-250 sajátos tulajdonságára. Arra, hogy ez a monoamino-oxidáz (MAO) bénító vegyület paradox módon, nem fokozta, hanem gátolta az amfetamin vérnyomás emelő hatását. Az E-250 unikális viselkedése miatt választották ki ezt a vegyületet gyógyszerré fejlesztésre és ez a paradox viselkedés volt a kiinduló pontja annak a kutatásnak, mely a deprenil későbbi sikeréhez vezetett.
Az 50-es évek végén a MAO bénítók eredményes és sikeres alkalmazása a depresszió kezelésére a pszichofarmakológia történetének egyik legjelentősebb áttörése volt. A terápiás sikert azonban csakhamar elhomályosította és használatukat korlátozta az a mellékhatásuk, hogy a kezeléssel oki összefüggésben álló, jónéhány esetben halálos, hipertóniás krízis jelentkezett. A jelenség okát Blackwell ismerte fel és írta le 1963-ban [17]. Rámutatott arra, hogy mivel MAO bénítóval kezelt betegen a táplálékban lévő tiramin, mely erősen fokozza a noradrenalin kiáramlását a noradrenerg végkészülékek raktáraiból, nem bomlik el a bélben, tiraminban gazdag táplálék (pl. sajt) fogyasztása vérnyomás emelkedéshez, érzékeny betegeken akár végzetes kimenetelű hipertóniás krízishez, vezet. Ez a ’sajt-reakció’ vált komoly gátjává a MAO bénítók klinikai alkalmazásának.
Az amfetamin ugyanazzal a mechanizmussal emeli a vérnyomást, mint a tiramin. Az E-250-et éppen azért választották ki további fejlesztésre, mert a vegyület jelenlétében az amfetamin nem emelte a vérnyomást. Ezzel megnyílt egy új, ’sajt-reakció’ mentes MAO bénító bevezetésének lehetősége. Ennek bizonyítására végezték el azt a
69
DISZKUSSZIÓ kísérletsorozatot, mely bizonyította, hogy az E-250 valóban az első MAO bénító, mely nem fokozza, hanem gátolja a tiramin noradrenalin felszabadító hatását [80, 81]. Ma már történeti érdekességű e cikkek összefoglalásának kulcs-mondata: ’Mivel a MAO bénítók tiramin-hatást fokozó tulajdonsága okozza az un. ’sajt-reakciót’, azt a jelenséget, hogy a sajtfogyasztás betegeken átmeneti jelleggel phaeochromocytomás rohamokhoz hasonló klinikai tüneteket okoz, az E-250 tiramin-gátló hatása terápiás szempontból nagyon előnyös’.
Knoll már 1964-ben felismerte az E-250-nek az amfetamin vérnyomásemelő hatását gátló tulajdonságában rejlő nagy gyakorlati jelentőséget. Varga Ervinnel tájékozódó klinikai vizsgálatokat végeztetett egyfelől az új vegyület anti-depresszív hatásának bizonyítására (a pozitív eredményekre már az első dolgozat diszkussziója utalt), másfelől annak igazolására, hogy E-250 nem fokozza a tiramin vérnyomásemelő hatását (erre vonatkozólag az 1967-ben megjelent dolgozat diszkussziója már utal arra, hogy Varga provokatív sajt-fogyasztással sem észlelt fejfájást, illetve hipertóniás reakciót). A Chinoin azonban a meggyőző eredmények ellenére sem vezette be az új vegyületet.
A (-)-deprenilnek az a tulajdonsága, hogy emberen nem fokozza a tiramin vérnyomásemelő hatását, tehát hogy ez a vegyület valóban az első ’sajt-reakció’ mentes MAO bénító csak 10 évvel később, angol szerzők tollából megjelent cikkel vált nemzetközileg ismertté és elfogadottá [42]. Biztonságos alkalmazhatóságát emberen azonban már korábban bizonyították Birkmayer és munkatársai, amikor (-)-deprenilt adtak először levodopával együtt Parkinsonos betegeknek [16]. Ismeretes volt, hogy levodopát nem szabad MAO-bénítóval kombinálni mert az is veszedelmes hipertóniás reakciók kiváltódásához vezethet [108]. Birkmayer és munkatársai azért merték kombinálni a (-)-deprenilt levodopával, mert figyelembe vették, hogy a vegyület mentes a MAO-bénítók szokványos mellékhatásától. Az eredményes kísérletek igazolták a (-)-deprenil biztonságos alkalmazhatóságát.
70
DISZKUSSZIÓ
A (-)-deprenilre a kutatók figyelmét először Knollnak a MAO enzimmel foglalkozó első nemzetközi szimpóziumon (Cagliari, 1971) tartott előadása hívta föl, mely a (-)-deprenil szelektív MAO-B bénító tulajdonságát bizonyította. Az e hatásról írt első cikk [82] megjelenése után 10 évvel ’Citation classic’ lett és 2000. év végéig több mint 800-an hivatkoztak rá. Minden bizonnyal a citációk számontartása óta ez az originális magyar gyógyszerkutatás legtöbbet idézett cikke.
A (-)-deprenil a MAO-B bénítására használt referens vegyületté vált az irodalomban és minden kézikönyv mindmáig így is kezeli, noha van a vegyületnek mind elméleti, mind gyakorlati szempontból egy lényegesen fontosabb hatása, amelyet ma Knoll nyomán ’enhancer’ hatásnak nevezünk. E hatás tisztázásának hosszú és sajátságos története elemző visszatekintést érdemel.
Már az 1964/65-ben megjelent első dolgozatok [78, 79] az E-250-et olyan komplex hatású új vegyületként írták le, mely egyfelől egy nagyon hatékony MAO bénító (ez a hatás akkoriban az érdeklődés középpontjában állt), de egyben rendelkezik olyan pszichostimuláns hatással, mely független az anyavegyület, a metamfetamin katecholaminokat felszabadító hatásától. Ebben mutatkozott meg tehát az az új típusú hatás, amelynek pontos tisztázására szükség volt, de valójában csak a ’90-es években sikerült a mechanizmus végleges tisztázása. Már a ’90-es évek elejéig írt cikkek sora olyan
kísérletekről
számolt
be,
melyek
bizonyították,
hogy
a
(-)-deprenil
pszichostimuláns hatása független a MAO-B bénító tulajdonságtól [88]. Ezek az eredmények érlelték meg annak a hatás-szerkezet összefüggés kutatásnak megtervezését és ismét a Chinoin vegyészeivel együttműködve azok kivitelezését, melynek célja volt olyan (-)-deprenil analóg előállítása, mely ezt a keresett pszichostimuláns hatást megtartja, de már mentes a MAO gátló tulajdonságtól. A kiválasztott vegyületet, az 1-fenil-2-propilaminopentánt, (-)-PPAP, mely szelektívebb és hatékonyabb enhancer vegyület, mint a (-)-deprenil 1992-ben írták le [91]. Szinte megmagyarázhatatlan, miért nem fejlesztette a Chinoin gyógyszerré legalább ezt az új hatásspektrumú vegyületet, amikor a (-)-deprenil világsikere már nyílvánvalóvá tette, hogy mellőzése a maga idején súlyos hiba volt.
71
DISZKUSSZIÓ
Időközben Európában egyre elfogadottabbá vált a (-)-deprenil (Selegiline, Jumex, Eldepryl, stb.) a Parkinson kór kezelésére, majd Európához képest mintegy 10 éves késéssel, első magyar vegyületként, az USA-ban is törzskönyvezték. A (-)-deprenil bevezetését szolgáló alapvető klinikai tanulmányok a legjelentősebb lapokban, a Lancet-ben [16], a Science-ben [181], a New England Journal of Medicine-ben [138] jelentek meg. A (-)-deprenil hatékonyságát Alzheimer kórban is bizonyították, az ezt bizonyító legfontosabb ’multi center study’ is a New England Journal of Medicine-ben jelent meg [157]. Ma már kétezer körül jár a (-)-deprenilről írt klinikai cikkek száma.
Knoll 1992-től a Pharmacology & Toxicology ’Annotations & Reflections’ rovatában a szerkesztőség felkérésére írt két alapvető fontosságú elvi cikkben bizonyította [92, 95], hogy a (-)-deprenil klinikai hatékonysága szempontjából egy sajátos, végérvényesen még tisztázandó, agytörzsi stimuláns hatás felelős, mellyel ismert gyógyszerek nem rendelkeznek. További kutatások tisztázták a (-)-deprenilnek az agytörzsi neuronokat ingerlő hatásának pontos mechanizmusát.
A mechanizmus lényegét már az 1994-ben megjelent elvi cikk tulajdonképpen leírta [95]. A mechanizmus kísérletes elemzése két 1996-ban megjelent cikkben került közlésre [97, 98]. A megoldáshoz az a felismerés vezetett, hogy a (-)-deprenil endogén anyavegyülete, a feniletilamin (PEA) egy addig ismeretlen hatással rendelkezik, specifikus módon fokozza az agytörzsi neuronok ingerlékenységét, ezzel serkenti az ingerületre adott választ. A lényeg tehát az, hogy a PEA kettős hatású: egyfelől, ismert módon, serkenti a katecholaminok kiáramlását az agytörzsi neuronok végkészülékeiből (’releasing’ hatás), másfelől megnöveli az idegingerület hatására kiáramló transzmitter mennyiséget, az exocitózist (’enhancer’ hatás). Az amfetamin és metamfetamin ugyanúgy hat, mint a PEA, de mivel ezeket a vegyületeket a MAO nem bontja, hatásuk tartósabb, mint az anyavegyületé, a PEA-é.
Ma már pontosan megtudjuk fogalmazni, miért volt a (-)-deprenil kiválasztása a fejlesztésre telitalálat. Ez a vegyület azzal, hogy megtartotta ’enhancer’ hatását, de elvesztette ’releasing’ hatását [98], szerencsés változatává lett anyavegyületeinek, a
72
DISZKUSSZIÓ PEA-nak, illetve metamfetaminnak: biztonsággossá vált. Annak ellenére, hogy metamfetamin származék, mentes volt az amfetamin ’releasing’ hatásával összefüggő mellékhatásaitól, így a dependencia kapacitástól is. A (-)-deprenil ma az egyetlen klinikailag világszerte használt, ’releasing’ hatástól mentes ’enhancer’ vegyület (5.1.1.1, 5.1.1.2., 5.1.1.3., 5.1.1.4. ábra) [99]. Az enhancer hatás felismerése, az enhancer reguláció élettani szerepének elemzése és annak felfedezése, hogy nemcsak a PEA (5.1.3.1. ábra), de a triptamin is endogén enhancer anyag (5.4.1.ábra) [95], a (-)-depreniltől eltérő szerkezetű, annál szelektívebben ható és sokkal hatékonyabb enhancer vegyület, a (-)-BPAP kidolgozásához vezetett [100].
Az enhancer reguláció és annak gyógyszeres befolyásolása új kutatási út, melynek legfőbb célkitűzése az agy kor-függő hanyatlásának enhancer vegyületek profilaktikus adagolásával történő lassítása, ezúton az öregkori életminőség javítása és az élettartam megnyújtása [101, 102, 103].
A bemutatott kísérletek egyértelműen bizonyítják, hogy az izolált patkány agyrészleteken (5.5.4., 5.5.5. ábra) és az izolált patkány agytörzsön, jelzett transzmitterek segítségével, pontosan mérni tudjuk (-)-BPAP szelektív enhancer hatását Megfelelő koncentrációk alkalmazása esetén az enhancer hatást el tudjuk különíteni katecholaminerg illetve szerotonerg neuronok működését serkentő más hatásmódú, ismert pszichofarmakonok hatásától (5.5.6., 5.5.7., 5.5.8., 5.5.9., 5.5.10., 5.5.11., 5.5.12. ábrák).
Mivel az enhancer hatás eddig ismeretlen volt, szükséges e hatásmechanizmussal kissé részletesebben foglalkozni. Vegyük példaképpen a (-)-BPAP-nek az 5.5.6. ábrán bemutatott hatását. Látjuk, hogy a vegyület már 50 nanogram/ml koncentrációban alkalmazva rendkívül hatékony volt. Míg a noradrenerg neuronokból idegingerlés 3
hatására átlagosan 2.86 pikomol [ H]-noradrenalin szabadult fel, 50 nanogram/ml (-)-BPAP jelenlétében ez az érték 6.84 pikomol-ra, tehát 2,39-szeresére növekedett. Mivel 50 nanogram/ml valóban mikrokoncentráció, a kísérlet az anyag rendkívüli hatékonyságát és a hatás szelektivitását igazolja.
73
DISZKUSSZIÓ
Az enhancer hatás értelmezését a mechanizmus felfedezője adta meg [103]. Értelmezésének hitelét az támasztja alá, hogy a (-)-BPAP az enhancer mechanizmus felismeréséből
fakadóan
tudatosan
megtervezett
hatás-szerkezet
összefüggés
kutatásának volt eredménye. A 65 szintetikus anyagból kiválasztott vegyület rendkívüli hatékonysága és szelektívitása az enhancer regulációról alkotott munkahipotézis eddigi legmeggyőzőbb bizonyítéka.
Az enhancer regulációról alkotott elmélet alapján a (-)-BPAP-nek, a jelenleg ismert leghatékonyabb és legszelektívebb enhancer vegyületnek, az izolált patkány agytörzsén bemutatott hatását a következő módon magyarázhatjuk. A frissen kivett, túlélő, egy ideig
még
működőképes
agytörzs
noradrenerg
neuronjai
ingerlékenységük
függvényében reagálnak a külvilágból és belvilágból érkező ingerekre. Mivel minden neuron “igen-nem” reakcióra képes, csak nagyon kevés neuron jut ingerületbe. Ennek megfelelően a “nyugalmi” noradrenalin felszabadulás 3 perc alatt átlagosan csak 1.94 pikomol volt. Amikor elektromos ingerlést alkalmaztunk, megnőtt az ingerületbe jutó katecholaminerg neuronok száma és szignifikánsan, 2.86 pikomol-ra nőtt a 3
felszabaduló [ H]-noradrenalin mennyisége.
Knoll szerint minden enhancer érzékeny neuron az enhancer koncentrációtól függően egy minimális ingerlékenységi állapottól egy maximális ingerlékenységi állapotig terjedően változtatni tudja az inger iránti érzékenységét, ebben áll az enhancer reguláció lényege. Ugyanakkor egy neuron populációban minden egyednek megvan a veleszületett individuális érzékenysége. Így a populáción belül az ingerületbe jutáshoz szükséges minimális ingerintenzitás szempontjából igen nagy a szórás. A jelentős individuális érzékenység különbségekből adódik, hogy amikor a nyugalmi 3 perc alatt az
3
5.5.6. ábrán bemutatott kísérletben átlagosan 1.94 pikomol [ H]-noradrenalin
szabadult fel, a populáció azon, veleszületetten legingerlékenyebb neuronjainak működését követtük, melyek az izolált patkány agytörzs művi körülményei között ható gyenge impulzusokra is képesek voltak ingerületbe jutni. Amikor elektromosan ingereltük az agytörzset, szignifikánsan megnöveltük az ingerületbe jutó neuronok 3
számát, ennek megfelelően nőtt 2.86 pikomol-ra a felszabaduló [ H]-noradrenalin
74
DISZKUSSZIÓ mennyisége. De még mindig csak a neuronok egy hányada, bár a négyszögingerlés előttihez képest szignifikánsan nagyobb hányada, jutott ingerületbe. Feltételezhetjük, hogy amikor az agytörzset izoláljuk, az endogén enhancer anyag(ok) egy bizonyos mennyisége jelen van a szövetben és a neuron populáció minden tagjára kifejti hatását. Ehhez képest változtatjuk meg drámaian a neuronok ingerlékenységét, amikor a szövetfürdőbe endogén enhancer anyagot, pl. PEA-t vagy triptamin-t, illetve olyan szintetikus enhancer vegyületet adunk, mint amilyen a (-)-deprenil, (-)-PPAP vagy (-)-BPAP. Az 5.5.6. ábrán bemutatott kísérletünkben, 50 nanogram/ml (-)-BPAP az idegingerlés
hatására
felszabaduló
3
[ H]-noradrenalin
mennyiségét
2.86-ról
6.84 pikomol-ra, azaz 2.39-szeresére növelte.
Az enhancer reguláció felfedezésével és a (-)-BPAP kidolgozásával megnyílik az út e mechanizmus élettani szerepének vizsgálatára és klinikai kutatás tárgyává válhat egy a (-)-deprenilnél több mint 100-szor hatékonyabb, szelektív enhancer vegyület.
Knoll az enhancer regulációnak a hajtóerőn alapuló, komplex, célorientált viselkedési formákban játszott élettani szerepét a következő példával szokta összefoglaló tanulmányaiban [95, 101, 102, 103] illusztrálni:
Egy nyúl ernyedt nyugalomban eszi káposztáját a réten, amikor feltűnik egy sas és lecsapni készül a nyúlra. Mind a sasnak, mind a nyúlnak egy másodperc tört része áll a rendelkezésére ahhoz, hogy célt érjen. A nyúlnak ezalatt a pillanatnyi idő alatt kell az ernyedt nyugalom állapotából átállnia a maximális erőkifejtést ingerlő menekülés állapotába, tehát robbanás szerűen kell a neuronoknak nyugalmi állapotból maximális ingerlékenységi állapotba jutni, mert az élet a tét. És a nyúl a felismerés pillanatában erejét
maximálisan
megfeszítve
menekül.
Mi
történik
ekkor
az
agytörzs
katecholaminerg neuronjaiban?
Knoll szerint a pillanat tört része elég ahhoz, hogy az enhancer reguláció maximális ingerületbe hozza azokat a neuronokat, melyek a menekülést biztosítják. Az enhancer regulációról alkotott munkahipotézis kidolgozásához a (-)-deprenil hatásmódjának
75
DISZKUSSZIÓ elemzése, a PEA enhancer hatásának felismerése, majd a triptamin enhancer hatásának felfedezése vezetett. Az új szemlélet első összefoglalására egy speciális tanulmányban került sor [93]. A (-)-deprenil enhancer hatásának ismertetéséhez vezető úton az első részletes adatokra támaszkodó tanulmánynak egy 1994-ben megjelent cikk [94] tekinthető. Ezt követte a PEA enhancer hatásának [98] és a deprenilnek, mint egy PEAszármazékú szintetikus enhancer vegyületnek leírása [97].
Knollt a triptamin enhancer hatásának felfedezése ösztönözte arra, hogy olyan hatásszerkezet összefüggés kutatásba kezdjen, melynek célja volt, egyfelől a (-)-deprenilnél szelektívebb és hatékonyabb enhancer hatású vegyület kidolgozása (hiszen a (-)-deprenil már lassan 40 éves vegyület), másfelől annak bizonyítása, hogy a triptamin, mint endogén enhancer anyag, alkalmas kiindulási szerkezet egy új enhancer vegyület kidolgozására, csakúgy ahogy, ma már tudjuk, a PEA-ból, mint endogén enhancerből származott le tulajdonképpen a (-)-deprenil. Japán kémikusok (Yoneda és mt.) bevonásával
végeztük
el
a
hatás-szerkezet
összefüggés
kutatást,
melynek
eredményeként 1999-ben került sor a kiválasztott (-)-BPAP, az első triptaminszármazékú, új szelektív és nagyon hatékony enhancer vegyület farmakológiájának első közlésére [100]. További fontos cikkek elemezték ezután az új vegyületet kémiai aspektusból illetve erősítették meg sajátos enhancer hatását [136, 165]. A (-)-BPAP e tanulmányban bemutatott, mind in vivo és ex vivo kísérletekben tanusított rendkívüli hatékonysága további gyakorlati bizonyságot szolgáltat arra, hogy enhancer hatású vegyülettel pillanatszerűen maximális ingerlékenységűvé tehetjük a katecholaminerg és szerotonerg neuronokat az agyban. Azt várjuk, hogy a (-)-BPAP, mely szelektív és rendkívül hatékony enhancer vegyület, egyfelöl az enhancer reguláció vizsgálatának különösen alkalmas eszköz lesz, másfelől a (-)-deprenil terápiás hatékonyságát túlszárnyaló gyógyszerré, az agy öregedését lassító és profilaktikumként alkalmazható specifikus anti-aging vegyületté fog fejlődni.
76
DISZKUSSZIÓ
6.1. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A (-)-deprenil jellegzetes dózis-hatás függéssel fejti ki enhancer hatását, mind az in vivo mind az ex vivo végzett kísérletekben a nanomoláris és a mikromoláris koncentrációs tartományokban. Ezzel az enhancer hatással az endogén
β-feniletilamin (PEA) és a tiramin is rendelkezik, de ezeket a MAO enzim gyorsan elbontja így gyógyszerként nem használhatóak. 2. Az enhancer hatást a (-)-deprenil egyik fő metabolitja is, a (-)-metamfetamin is létrehozza, de sokkal nagyobb adagban. Hatáserősségükben preparátumoktól függően 10-25-szörös különbségeket kapunk. 3. A (-)-PPAP, egy olyan (-)-deprenil származékú vegyület, mely már nem rendelkezik szelektív, irreverzibilis MAO-B bénító hatással, szintén enhancer hatású vegyület, mely igazolja, hogy az enhancer hatása a (-)-deprenilnek nem a MAO-B enzim bénító hatásának köszönhető. 4. További kutatásaink bizonyították, hogy az endogén indol-analóg triptamin is hatékony enhancer vegyület. 5. A triptamin enhancer hatásából kiindulva, 65 szintetikusan előállított triptamin analóg vegyületből, a hatás-szerkezet összefüggés analízisek alapján kiválasztott (-)-BPAP, hatékonyabb enhancer vegyület, mint a (-)-deprenil. Szelektivitását igazolják azok a kísérletek, melyekben a MAO gátlók, re-uptake gátlók és a dopamin receptor agonisták enhancer hatása a (-)-BPAP mellett nem volt kimutatható.
77
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
7. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Szeretném hálámat kifejezni mindazért, amiért kevés a szó.
•
Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Knoll József akadémikus úrnak, hogy 20 évvel ezelőtt munkatársául fogadott és mindig mindenben támogatott. Köszönöm, hogy nap mint nap nem mindennapi szellemi magasságba vezetett és önzetlenül megosztotta gazdag tudását. Szórta tárt karokkal, hogy körülötte mindenki részesüljön benne és ráérezzen a tudás gyönyörére. Tiszteletreméltó, fáradhatatlan, lelkes munkájával pedig példát mutatott arra, hogy bármit is érjünk el, mindig csak az előttünk álló feladat, az új kutatása, az alkotás a fontos.
•
Sosem felejtem el, hogy az évekig tartó intenzív kutatásban Dr. Rácz Dániel
Kovács Katalin
Balogh Jenő
Loránd Anna
Gáborházi Károlyné
Nagy Mariann
Kecskeméti Ildikó
Tímár Imréné
jókedvükkel, odaadó, lelkiismeretes munkájukkal, értékes ötleteikkel segítettek.
•
Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiás
Intézet vezetőjének Dr. Fürst Zsuzsanna professzor asszonynak, hogy támogatta munkámat és az intézet azon dolgozóinak, akik bármilyen módon is hozzájárultak ahhoz, hogy ez a munka elkészüljön.
•
Végezetül, de legfőképpen köszönöm drága szüleimnek, Miklya Pálnak és
Miklya Pálnénak, hogy egész életemben, még ma is türelmükkel, szerető gondoskodásukkal megteremtik az elmélyült munkához szükséges nyugalmas, biztos családi hátteret.
78
IRODALOMJEGYZÉK
8. IRODALOMJEGYZÉK
1. Allain H, Gougnard J, Naukirek HC, Selegiline in de novo parkinsonian patients: the French selegiline multicenter trial (FSMP). Acta Neurol Scand 136:73-78, 1991 2. Andrew R, Watsin DG, Best SA, Midgley JM, Wenlong H, Petty RK: The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochem Res 18:1175-1177, 1993 3. Ansari KS, Yu PH, Kruck TP, Tatton WG: Rescue of axotomized immature rat facial motoneurons by R-(-)-deprenyl: stereospecificity and independence from monoamine oxidase inhibition. J Neurosci 13:4042-4053, 1993 4. Antelman SM, Edwards DJ, Lin M: Phenylethylamine: Evidence for direct, postsynaptic dopamine-receptor stimulating action. Brain Res 127:317-322, 1977 5. Anton AH, Sayre DF: Distribution of metanephrine and normetanephrine in various animals and their analysis in diverse biologic material. J Pharmacol Exp Ther 153:15-29, 1966 6. Bach AWJ, Lan NC, Johnson DL: cDNA cloning of human liver monoamine oxidase A
and
B:
molecular
basis
of
differences
in
enzymatic
properties.
Proc Natl Acad Sci USA 85:4934-4938, 1988 7. Ballard PA, Tetrud JW, Langston JW: Permanent human parkinsonism due to 1-methyl-4-phenyl-1,2,36-tetrahydropyridine (MPTP). Neurology 35:949-956, 1985 8. Balin AK, Allen RG: Mechanism of biologic aging. Dermatol Clin 4:347-358, 1986 9. Ball MJ: Neuronal loss, neurofibrillary tangles and granulovacuolar degeneration in the hippocampus with ageing and dementia. A quantitative study. Acta Neuropathol 37:111-118, 1977
79
IRODALOMJEGYZÉK 10. Baud P, Arbilla S, Cantrill RC, Scatton B, Langer SZ: Trace amines inhibit the electrically evoked release of 3H-acetylcholine from slices of rat striatum in the presence of pargiline: similarities between β-phenylethylamine and amphetamine. J Pharmacol Exp Ther 235:220-229, 1985 11. Beasley CM, Masica DN, Potvin JH: Fluoxetine: a review of receptor and functional effect and their clinical implications. Psychopharmacology 107:1-10, 1992 12. Berger PA, Ginsburg RA, Barchas JD, Murphy DL, Wyatt RJ: Platelet monoamine oxidase in chronic schizophrenic patients. Am J Psychiatry 135:95-99, 1978 13. Berry MD, Juorio AV, Paterson IA: Possible mechanisms of action of (-)-deprenyl and other MAO-B inhibitors in some neurologic and psychiatric disorders. Progress in Neurobiology 44:141-161, 1994 14. Bertocci B, Gill G, Da Prada M: Prevention of the DSP-4 induced noradrenergic neurotoxicity by irreversible, not by reversible MAO-B inhibitors. Pharmacol Res Comm Suppl 20:131-132, 1988 15. Birkmayer W, Riederer P, Youdim MB, Linauer W: The potentiation of the anti akinetic effect after L-dopa treatment by an inhibitor of MAO-B, Deprenil. J Neural Transm 36:303-326, 1975 16. BirkmayerW, Riederer P, Ambrozi L, Youdim MBH: Implications of combined treatment with ’Madopar’ and L-deprenyl in Parkinson’s disease. Lancet 1:439-443, 1977 17. Blackwell B: Hypertensive crisis due to monoamine oxidase inhibitors. Lancet I:849-851, 1963
80
IRODALOMJEGYZÉK 18. Blackwell B, Marley E, Price J, Taylor D: Hypertensive interactions between monoamine oxidase inhibitors and foodstuffs. Br J Psychiatry 113:349-365, 1967 19. Bloem BR, Irwin I, Buruma OJ, Haan J, Roos RA, Tetrud JW, Langston JW: The MPTP model: versatile contributions to the treatment of idiopathic Parkinson's disease. J Neurol Sci 97:273-293, 1990 20. Borowsky B, Adham N, Jones KA, Raddatz R, Artymyshyn R, Ogozalek KL, Durkin MM, Lakhlani PP, Bonini JA, Pathirana S, Byle N, Pu X, Kouranova E, Lichtblau H, Ochoa FY, Brancheck TA, Gerald C: Trace amines: Identification of a family of mammalian G-protein coupled receptors. Proc Natl Acad Sci USA 98:8966-8971, 2001 21. Boulton AA: Cerebral aryl alkyl aminergic mechanisms. In: Trace amines and the brain, Eds.: Usdin E, Sandler M, pp:21-39, Marcel Dekker, New York, 1976 22. Boulton AA: The tyramines: Functionally significant amines or metabolic accidents? Life Sciences 23:659-672, 1978 23. Boulton AA, Juorio AV: Brain trace amines. In: Chemical and cellular Architecture, Handbook of Neurochemistry, Ed.: Lajtha A, pp 189-222, Plenum Press, New York and London, 1982 24. Bowles JT: The evolution of aging: a new approch to an old problem of biology. Medical Hypotheses 51:179-221, 1998 25. Burns RS, LeWitt PA, Ebert MH, Pakkenberg H, Kopin IJ: The clinical syndrome of striatal dopamine deficiency. New Engl J Med 312:1418-1421, 1985 26. Buys YM, Trope GE, Tatton WG: (-)-Deprenyl increases the survival of rat retinal ganglion cells after optic nerve crush. Curr Eye Res 14:119-26, 1995
81
IRODALOMJEGYZÉK 27. Calne DB, McGeer E, Eisen A, Spencer P: Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, and motoneurone disease: abiotropic interaction between aging and environmental? Lancet 2:1067-1070, 1986 28. Carillo MC, Kanai S, Nokubo M, Kitani K: (-)Deprenyl induces activities of both superoxide dismutase and catalase but not of glutatione peroxidase in the striatum of young male rats. Life Sciences 48:517-521, 1991 29. Chiba K, Trevor A, Castagnoli NJr: Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochem Biophys Res Commun 120:574-578, 1984 30. Cohen G, Pasik P, Cohen B, Leist A, Mitileneou C, Yahr MD: Pargyline and (-)deprenyl
prevent
the
neurotoxicity
of
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6,-
tetrahydropyridine (MPTP) in monkeys. Eur J Pharmacol 106:209-210, 1984 31. Dao WP, Walker RJ: Octopamine responses of neurones in the rat thalamus. Br J Pharmacol 132P, 1979 32. Da Prada M, Zürcher G, Wüthrich I, Heafely WE: On tyramine, food, beverages and reversible MAO inhibitor moclobemid. J Neural Transm Suppl 26:31-56, 1988 33. Davis GC, Williams AC, Markey SP, Ebert MH, Caine ED, Reichert CM, Kopin IJ: Chronic parkinsonism secondary to intravenious injection of meperidine analogues. Psychiatry Res 1:249-254, 1979 34. Delacour J, Guenaire C: Octopamine and locomotor activity of rats. Psychopharmacology 80:50-52, 1983 35. Del Maestro RF: An approach to free radicals in medicine and biology. Acta Psysiol Scand Suppl 492:153-168, 1980
82
IRODALOMJEGYZÉK 36. Demopoulos HB: The basis of free radical pathology. Fed Proc 32:1859-1861, 1973 37. Dourish CT: A pharmacological analysis of the hyperactivity syndrome induced by
β-phenylethylamine in the mouse. Br J Pharmacol 77:129-139, 1982 38. Ebadi M, Srinivasan SK, Baxi MD: Oxidative stress and antioxidant therapy in Parkinson’s disease. Prog Neurobiol 48:1-19, 1996 39. Ehringer H, Hornykiewitz O: Verteilung von Noradrenalin und Dopamin (3-hydroxytryptamin) im Gehirn des Menschen und ihr Verhalten bei Erkrankungen des extrapyramidalen Systems. Klin Wochenschr 38:1336-1339, 1960 40. Ekblom J, Zhu QS, Chen K, Shih JC: Monoamine oxidase gene transcription in human cell lines: treatment with psychoactive drugs and ethanol. J Neural Transm Gen Sect 103:681-692, 1996 41. Ekstedt B, Magyar K, Knoll J: Does the B form of selective monoamine oxidase inhibitor lose selectivity by long term treatment? Biochem Pharmacol 28:919, 1979 42. Elsworth JD, Glover V, Reynolds GP, Sandler M, Lees AJ, Phuapradit P, Shaw KM, Stern GM, Kumar P: Deprenyl administration in man: a selective monoamine oxidase B inhibitor without the ’chese effect’. Psychopharmacology 57:33-38, 1978 43. Endo T, Starke K, Bangerter A, Taube HD: Presynaptic receptor systems on the noradrenergic neurones of the rabbit pulmonary artery. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 296:229, 1977 44. Finnegan KT, Skratt JJ, Irvin I, DeLanney LE, Langston JW: Protection against DSP-4 induced neurotoxicity by deprenyl is not related to its inhibition of MAO-B. Eur J Pharmacol 184:119-126, 1990
83
IRODALOMJEGYZÉK 45. Finnegan KT, Irwin I, Delanney LE, Langston JW: Age-dependent effects of the 2’-methyl analog of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine: prevention by inhibitors of monoamine oxidase Br J Pharmacol Exp Ther 273:716-720, 1995 46. Fowler CJ, Wiberg A, Oreland L, Marcusson J, Winblad B: The effect of age on the activity and molecular properties of human brain monoamine oxidase. J Neural Transm 49:1-20, 1980 47. Fuller RW, Clemens JA: Pergolide a dopamine agonist at both D1 and D2 receptors. Life Sciences 49:925-931, 1991 48. Fuxe K, Ungerstedt U: Histochemical, biochemical and functional studies on central monoamine neurons after acute and chronic amphetamine administration. In: Amphetamine and Related Compounds, Eds.: Costa E, Garattini S, pp:257-288, Raven Press, New York, 1970 49. Gaszner P: On cognition-enhancing properties of antidepressants (including selegiline). In: Biological Psychiatry Vol 2, pp:169-171, Eds.: Racagni G et.al., Elsevier Science Publishers B V, 1991 50. Glover V, Gibb C, Sandler M: Monoamine oxidase B (MAO-B) is the major catalyst for 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) oxidation in human brain and other tissues. Neurosci Lett 64:216-220, 1986 51. Glover V, Clow A, Sandler M: Effects of dopaminergic drugs on superoxid dismutase: implication for senescence. J Neural Transm Suppl 40:37-45, 1993 52. Glover V, Sandler M: Neurotoxins and monoamine oxidase B inhibitors: Possible mechanism for the neuroprotective effect of (-)-deprenyl. In: Inhibitors of Monoamine oxidase. Ed.: Szelényi I, pp:169-182, Birkhauser Verlag, Basel, 1993
84
IRODALOMJEGYZÉK 53. Godfraind JM: Microionophoretic study with milacemide, a glycine precursor, on mammalian central nervous system cells. Br J Pharmacol 100:119-25, 1990 54. Graham DC, Tiffany SM, Bell WR Jr, Gutknecht WF: Autooxidation versus covalent binding of quinones as the mechanism of toxicity of dopamine, 6-hydroxydopamine, and related compounds toward C1300 neuroblastoma cells in vitro. Mol Pharmacol 14:644-653, 1978 55. Gupta S, Droney T, Kyser A, Keller P: Selegiline augmentation of antipsychotics for the treatment of negative symptoms in schizophrenia. Comp Psychiatry 40:148150, 1999 56. Gupta M, Kulkarni SK: Studies on anticonvulsant actions of L-deprenyl. Indian J Exp Biol 38:332337, 2000 57. Gyarmati L, Plachy J, Sátory É, Rácz I, Tamás J:Metabolism of deprenil. Acta Pharm Hung 45:139-144, 1975 58. Harman D: The biological clock, the mitochondria? J Am Geriatr Soc 20:145-147, 1972 59. Haefely WE, Kettler R, Keller HH, Da Prada M: Ro 19-6327 a reversible highly selective monoamine oxidase B inhibitor: a novel tool to explore the MAO B function in humans. Advances in Neurology 53:501-512, 1990 60. Hauger RL, Skolnick P, Paul SM: Specific 3H-β-phenylethylamine binding sites in rat brain. Eur J Pharmacol 83:147-148, 1982 61. Hayflick L: How and why we age. Experimental Gerontology 33:639-653, 1998
85
IRODALOMJEGYZÉK 62. Hársing LG, Magyar K, Tekes K, Vizi ES, Knoll J: Inhibition by deprenyl of dopamine uptake in rat striatum: a possible correlation between dopamine uptake and acetylcholine. Pol J Pharmacol Pharm 31:297-307, 1979 63. Heikkila RE, Cohen G: Further studies on generation of hydrogen peroxidase by 6-hydroxidopamine: potentiation by ascorbic acid. Mol Pharmacol 8:241-8, 1972 64. Heikkila RE, Manzino L, Cabbat FS, Duvoisin RC: Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature 311:467-469, 1984 65. Heinonnen EH, Lammintausta R: A review of the pharmacology of selegiline. Acta Neurol Scand Suppl 136, 84:44-59, 1991 66. Hicks TP, McLennan H: Comparison of the actions of octopamine and catecholamines on single neurones of the rat cerebral cortex. Br J Pharmacol 64:485-491, 1978 67. Ho SC, Woo J, Lee CM: Epidemiologic study of Parkinson’s disease in Hong Kong. Neurology 39:1314-1318, 1989 68. Horn AS, Snyder SH: Steric requirements for catecholamine uptake by rat brain synaptosomes: Studies with rigid analogs of amphetamine. J Pharmacol ExpTher 180:523-530, 1972 69. Igaue I, Gomes B, Yasunobu KT: Beef mitochondrial monoamine oxidase, a flavin dinucleotid enzyme. Biochem Biophys Res Commun 29:562-570, 1967 70. Jankovic J: Deprenyl in attention deficit associated with Tourette’s syndrome. Arch Neurol 50:268-288, 1993
86
IRODALOMJEGYZÉK 71. Javitch JA, D’Amato RJ, Strittmatter SM, Snyder SH: Parkinsonism-inducing neorotoxin,
N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropyiridine:
Uptake
of
the
metabolite N-methyl-4-phenylpyridine by dopamine neurons explains selective toxicity. Proc Natl Acad Sci USA 82:2173-2177, 1985 72. Jiminez- Jiminez FJ, Garcia-Ruiz PJ: Pharmacological options for the treatment of Tourette’s disorder. Drugs 61:2207-2220, 2001 73. Johnston JP: Some observation upon a new inhibitor of monoamine oxidase in brain tissue. Biochem Pharmacol 17:1285-97, 1968 74. Kalász H, Kerecsen L, Knoll J, Pucsok J: Chromatographic studies on the binding, action and metabolism of (-)-deprenyl. J Chromatogr 499:589-599, 1990 75. Kerecsen L, Kalász H, Knoll J: (-)Deprenyl enhances dopamine release from isolated striatal preparations of the rat following chronic pretreatment. In: Dopamine, Aging and Diseases. Eds.: Borsy J, Kerecsen L, György L, pp:27-33, Pergamon Press, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1985 76. Kitani K, Kanai S, Sato Y, Ohta M, Ivy GO, Carillo MC: Chronic treatment of (-)deprenyl prolongs the lifespan of male Fischer 344 rats. Further evidence. Life Sciences 52:281-288, 1992 77. Knoll B, Held Gy, Gyarmati Zs: The effect of selective MAO inhibitors on the conditioned avoidance response of Wistar rats. Pol J Pharmacol Pharm 29:291-296, 1977 78. Knoll J, Ecsery Z, Nievel J, Knoll B: Phenylisopropylmethyl-propinylamine HCL (E-250) egy új hatásspektrumú pszichoenergetikum. MTA V. Oszt Közl 15: 231-238, 1964
87
IRODALOMJEGYZÉK 79. Knoll J, Ecsery Z, Kelemen K, Nievel J, Knoll B: Phenylisopropylmethylpropinylamine (E-250) a new psychic energizer. Arch int Pharmacodyn Thér 155:154-164, 1965 80. Knoll J: A phenylisopropyl-methylpropynylamin (E250) tyraminantagonista hatása. MTA V. Oszt. Közl. XVIII:31-37, 1967 81. Knoll J: The theory of active reflexes. An analysis of some fundamental mechanisms of higher nervous activity. Hafner Publishing Company, New York, Akadémiai Kiadó, Budapest, pp:1-131, 1969 82. Knoll J, Magyar K: Some puzzling effects of monoamine oxidase inhibitors, In: Monoamine Oxidase-New Vistas. Advances in Biochemical Psychopharmacology. Vol.5, Eds.: Costa E, Sandler M, pp 393-408, Raven Press, New York, 1972 83. Knoll J: The possible mechanism of action of (-)deprenyl in Parkinson’s disease. J Neural Transm 43:177-198, 1978 84. Knoll J: Can the suicide inactivation of MAO by deprenyl explain its pharmacological effects? Molecular Basis of Drug Action, Eds.: Singer TP, Ondarza RN, pp:185-201, Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam, Oxford, 1981 85. Knoll J: Selective inhibition of B type monoamine oxidase in the brain: a drug strategy to improve the quality of life in senescence. In: Strategy in drug research. Ed.: Keverling Buisman JA, pp:107-135, Elsevier, Amsterdam, 1982 86. Knoll J: R-(-)-deprenyl (Selegiline, Movergan) facilitates the activity of the nigrostriatal dopaminergic neuron. J Neural Transm Suppl 25:45-66, 1987 87. Knoll J: The striatal dopamine dependency of lifespan in male rats. longevity study with (-)deprenyl. Mech Ageing Dev 46:237-262, 1988
88
IRODALOMJEGYZÉK 88. Knoll J: The pharmacology of selegiline ((-)deprenyl). New aspects. Acta Neurol Scand 126:83-91, 1989 89. Knoll J, Dalló J, Yen TT: Striatal dopamine, sexual activity and lifespan. Longevity of rats treated with (-)deprenyl. Life Sciences 45:525-531, 1989 90. Knoll J: The enantioselective pharmacological spectrum of levo-deprenyl. In: Problems and Wonders of Chiral Molecules, Ed. Simonyi M, pp.255-265, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1990 91. Knoll J: The pharmacological profile of (-)deprenyl (selegiline) and its relevance for humans: A personal view. Pharmacol Toxicol 70: 317-321, 1992 92. Knoll J, Knoll B, Török Z, Tímár J, Yasar S: The pharmacology of 1-phenyl-2propylaminopentane (PPAP), a deprenyl-derived new spectrum psychostimulant. Arch int Pharmacodyn Thér 316:5-29, 1992 93. Knoll J.: Memories of my 45 years in research. Pharmacol & Toxicol 75:65-72, 1994 94. Knoll J, Yen TT, Miklya I: Sexually low performing male rats die earlier than their high performing peers and (-)deprenyl treatment eliminates this difference. Life Sciences 54:1047-1057, 1994 95. Knoll J, Miklya I: Multiple, small dose administration of (-)deprenyl enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain and these effects are unrelated to MAO-B inhibition. Arch int Pharmacodyn Thér 328:1-15, 1994 96. Knoll J, Miklya I: Enhanced catecholamineregic and serotoninergic activity in rat brain from weaning to sexual maturity: rationale for preventive (-)deprenyl medication. Life Sciences 56:611-620, 1995
89
IRODALOMJEGYZÉK 97. Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Kelemen K: (-)Deprenyl and (-)1-phenyl-2propylaminopentane, (-)PPAP, act primarily as potent stimulants of action potentialtransmitter release coupling in the catecholaminergic neurons. Life Sciences 58:817827, 1996 98. Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Rácz D: Phenylethylamine and tyramine are mixed-acting sympathomimetic amines in the brain. Life Sciences 58:2101-2114, 1996 99. Knoll J: (-)Deprenyl (Selegiline), a catecholaminergic activity enhancer (CAE) substance acting in the brain. Pharmacol & Toxicol 82:57-66, 1998. 100. Knoll J, Yoneda F, Knoll B, Ohde H, Miklya I: (-)1-(Benzofuran-2-yl)-2propylaminopentane, (-)BPAP, a selective enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamines and serotonin in the brain. Brit J Pharmacol 128:1723-1732, 1999 101.
Knoll
J:
Outlines
of
a
drug
strategy
to
slow
brain
aging.
Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:151-170, 2000 102.
Knoll
J:
The
psychopharmacology
of
life
and
death.
In:
The
Psychopharmacologists III, Interviews by Dr. David Healy, Ed. Healy D, pp:81-110, Arnold, London; Oxford University Press, New York, 2000 103. Knoll J: Antiaging compounds: (-)Deprenyl (Selegiline) and (-)-(benzofuran-2-yl)2-propylaminopentane, (-)BPAP, a selctive highly potent enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamines and serotonin in the brain. CNS Drug Reviews 7:317-345, 2001
90
IRODALOMJEGYZÉK 104. Konrádi C, Svoma E, Jellinger K, Riederer P, Denney R, Thibault J: Topographic immunocytochemical mapping of monoamine oxidase-A, monoamine oxidase-B and tyrosine hydroxilase in human post mortem brain stem. Neuroscience 26:791-802, 1988 105. Kopin IJ, Markey SP: MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Ann Rev Neurosci 11:81-96, 1988 106. Kostrzewa RM, Jakobwitz DM: Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev 26:199-288, 1974 107. Krantz A, Kokel B, Sachdeva YP, Salach J, Detmer K, Claesson A, Sahlberg C: Inactivation of mitochondrial monoamine oxidase by β,α,δ-allenic acid. in: Monoamine oxidase: structure function and altered functions, Eds.: Singer TP, Von Korff RW, Murphy DL, pp:51-70, Academic Press, New York, 1979 108. Lader MH, Sakalis G, Tansella M: Interactions between sympathomimetic amines and a new monoamine oxidase inhibitor. Psychopharmacologia 18:118-123, 1970 109. Lan NC, Chan C, Shih J: Expression of functional human monoamine oxidase A and B cDNAs in mammalian cells. J Neurochem 52:1652-1654, 1989 110. Lange KW, Riederer P, Youdim MBH: Biochemical actions of l-deprenyl (selegiline). Clin Pharmacol Ther 56:734-741, 1994 111. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I: Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science 219:979-980, 1983 112. Langston JW, Forno LS, Rebert CS, Irwin I: Selective nigral toxocity after systemic administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in the squirrel monkey. Brain Res 292:390-394, 1984
91
IRODALOMJEGYZÉK 113. Larsen JP, Boas J, Erdal JE: Does selegiline modify the progression of early Parkinson’s disease? Results from a five-year study. the Norwegian-Danish Study Group. Eur J Neurol 6:539-547, 1999 114. Louge MP, Growdon JH, Coviella IL, Wurtman RJ: Differential effects of DSP-4 administration on regional brain norepinephrine turnover in rats. Life Sciences 37:403-409, 1985 115. Löscher W, Lehmann H: L-Deprenyl (selegiline) exerts anticonvulsant effects against different seizure types in mice. J Pharmacol Exp Ther 227:1410-1417, 1996 116. Magyar K, Tóthfalusi L: Pharmacokinetic aspects of deprenyl effects. Pol J Pharmacol Pharm 36:373-384, 1984 117. Magyar K: Neuroprotective effect of deprenyl and p-fluor-deprenyl. Second Congress Paneuropean Society of Neurology, Vienna p26, 1991 118. Mann JJ, Aarons SF, Wilner PJ, Keilp JG, Sweeney JA, Pearlstein T, Frances AJ, Kocsis JH, Brown RP: A controlled study of the antidepressant efficacy and side-effects of l-deprenyl. Arch Gen Psychiatry 46:45-50, 1989 119. Mantegazza P, Riva MJ: Amphetamine-like activity of β-phenylethylamine. J Pharm Pharmacol 15:472-478, 1963 120. Mantle TJ, Garrett NJ, Tipton KF: The development of monoamine oxidase in rat liver and brain. FEBS Lett 64:227-230, 1976 121. Markey SP, Johanssen JN, Chiueh CC, Burns RS, Herkenham MA: Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature 311:464-467, 1984
92
IRODALOMJEGYZÉK 122. Martini E, Pataky I, Szilágyi K, Venter V: Brief information on an early phase-II study with (-)deprenyl in demented patients. Pharmacopsychiatry 20:256-257, 1987 123. McGeer EG, McGeer PL, Wada JA: Distribution of tyrosine hydroxilase in human and animal brain. J Neurochem 18:1647-1658, 1971 124. McQuade PS: Analysis and the effects of some drugs on the metabolism of
phenylethylamine
and
phenylacetic
acid.
Prog
Neuropsychopharmacol
Biol Psychiatry 8:607-614, 1984 125. Melamed E, Rosenthal J, Globus M: Effect of pharmacological manipulations of dopamine metabolism on the dopaminergic neurotoxicity of MPTP in mice: In: A neurotoxin producing a parkinsonian syndrome. Eds.:Markey SP, Castagnoli NJr, Trevor AJ, pp:431-435, Academic Press Inc, 1986 126. Mendlewicz J, Youdim MBH: L-deprenyl, a selective monoamine oxidase-type B inhibitor, in the treatment of depression: a double-blind evaulation. Br J Psychiatry 142:508-11, 1983 127. Milgram MW, Racine RJ, Nellis P, Mendoca A, Ivy GO: Maintenance on L-(-)deprenyl prolongs life in aged male rats. Life Sciences 47:415-420, 1990 128. Miquel J, Economos AC, Fleming J, Johnston JE Jr: Mitochondrial role in cell aging. Exp Gerontol 15:575-591, 1980 129. Miklya I, Rácz D, Knoll J: CNS effect of (-)deprenyl unrelated to MAO-B inhibition. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology Suppl. 1, 72:360, 1994
93
IRODALOMJEGYZÉK 130. Mizuno Y, Satoh T, Sone N: Inhibition of mitochondrial NADH-ubiqunone oxidoreductase activity by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion. Biochem Biophys Res Commun 143:294-299, 1987 131. Morgenthaler J: Smart drug update. Mondo 2000 5:36-37, 1992 132. Moja EA, Stoff DM, Gillin JC, Wyatt RJ: Dose-response effects of
β-phenylethylamine
on
stereotyped
behavior
in
pargiline-retreated
rats.
Biol Psychiatry 11:731-742, 1976 133. Myttyla VV, Sotaniemi KA, Vourinen JA, Heinonen EH: Selegiline as initial treatment in de novo parkinsonian patients. Neurology 42:339-343, 1992 134. Nickel B, Schulze G, Szelényi I: Effect of enantiomers of deprenyl (selegiline) and amphetamine on physical abuse liability and cortical electrical activity in rats. Neuropharmacology 29:983-992, 1990 135. Nicklas WJ, Vyas I, Heikkila RE: Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropyiridine. Life Sciences 36:2503-2508, 1985 136. Oka T, Yasusa T, Watanebe M, Yoneda F, Ishida T, Knoll J: Enantioselective synthesis
and
absolute
configuration
of
(-)1-(benzofuran-2-yl)-2-
propylaminopentane, (-)-BPAP, a highly potent and selective catecholaminergic activity enhancer. Bioorg & Med Chem 9:1213-1219, 2001 137. Oreland L, Arai Y, Stenström A: The effect of deprenyl (selegiline) on intra- and extraneuronal dopamine oxidation. Acta Neurol Scand Suppl 95:81-85, 1983 138. Parkinson Study Group: Effect of (-)deprenyl on the progression disability in early Parkinson’s disease. New Engl J Med 321:1364-1371, 1989
94
IRODALOMJEGYZÉK 139. Parkinson Study Group: Effect of tocopherol and (-)deprenyl on the progression of disability in early Parkinson’s disease. New Engl J Med 328:176-183, 1993 140. Parkinson Study Group: Impact of deprenyl and tocopherol treatment of Parkinson’s disease in DATATOP patients requiring levodopa. Ann Neurol 39:3745, 1996 141. Parnetti L: Clinical pharmacokinetics of drugs for Alzheimer’s disease. Clin Pharmakokinet 29:110-129, 1995 142. Quitkin FM, Liebowitz MR, Stewart JW, McGrath PJ, Harrison W, Rabkin JG, Markowitz J, Davies SO: L-Deprenyl in atypical depressives. Arch Gen Psychiatry 41:777-781, 1984 143. Ragaiey T, Ma JX, Jiang WJ, Greene W, Seigel GM, Stewart WC: L-deprenyl protects injured retinal precursor cells in vitro. J Ocular Pharmacol Ther 13: 479-488, 1997 144. Raiteri M, Del Carmine R, Bettollini A, Levi G: Effects of sympathomimetic amines
on
the
synaptosomal
transport
of
noradrenaline,
dopamine
and
5-hydroxytryptamine. Eur J Pharmacol 41:133-143, 1977 145. Ramsay RR, Salach JI, Singer TP: Uptake of neurotoxin 1-methyl-4phenylpyridine (MPP+) by mitochondria and its relation to the inhibition of the mitochondrial oxidation of NAD+-linked substrates by MPP+. Biochem Biophys Res Commun 134:743-748, 1986 146. Rao ML, Moller HJ: Biochemical findings of negative symptoms in schizophrenia and their putative relevance to pharmacologic treatment. Neuropsychobiology 30:160-172, 1994
95
IRODALOMJEGYZÉK 147. Rapaport A, Stein D, Schwartz M, Levin J, Stier S, Elizur A, Rabey JM: A trial of L-deprenyl for the treatment of neuroleptic-induced parkinsonism. J Neural Transm 106:911-918, 1999 148. Reynolds GP, Riederer P, Sandler M, Jellinger K, Seemann D: Amphetamine and 2-phenylethylamine
in
post-mortem
parkinsonaian
brain
after
(-)deprenyl
administration. J Neural Transm 43:271-277, 1978 149. Ricci A, Mancini M, Strocchi P, Bongrani S, Bronzetti E: Deficits in cholinergic neurotransmission markers induced by ethylcholine mustard aziridium (AF64A) in the rat hippocampus: sensitivity to treatment with the monoamine oxidase-B inhibitor L-deprenyl. Drug Exp Clin Res 18:163-171, 1992 150. Riederer P, Wuketich S: Time course of nigrostriatal degeneration in Parkinson’s disease. A detailed study of influential factors in human brain amine analysis. J Neural Transm 38:277-301, 1976 151. Riederer P, Youdim MBH, Rausch WD, Birkmayer W, Jellinger K, Seeman D: On the mode of action of L-deprenyl in the human central nervous system. J Neural Transm 43:217-226, 1978 152. Robinson DS, Davis JM, Nies A, Ravaris CL, Sylwester D: Relation of sex and aging to monoamine oxidase activity of human brain, plasma and platelets. Arch Gen Psychiatry 24:536-539, 1971 153. Ruehl WW, Entriken TL, Muggenberg BA, Bruyette DS, Griffith WG, Hahn FF: Treatment with L-deprenyl prolongs life in elderly dogs. Life Sciences 61:10371044, 1997 154. Sachs CH, Jonsson G: Mechanism of action of 6-hydroxidopamine. Pharmacology 24:1-8, 1975
96
IRODALOMJEGYZÉK 155. Sandler M, Reynold GP: Does phenylethylamine cause schizophrenia? Lancet I:70, 1976 156. Salo PT, Tatton WG: Deprenyl reduces the death of motoneurons caused by axotomy. J Neurosci Res 31:394-400, 1992 157. Sano M, Ernesto C, Thomas RG, Klauber MR, Schafer K, Grundman M, Woodbury P, Growdon
J, Cotman CW, Pfeiffer E, Schneider LS, Thal LJ: A
controlled trial of selegiline, alpha-tocopherol, or both as treatment for Alzheimer’s disease. New Engl J Med 336:1216-1222, 1997 158. Satoh N, Yonezawa A, Tadano T, Kisara K, Arai Y, Kinemuchi H: Acute effects of a parkinsonism-inducing neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,36-tetrahydropyridine (MPTP) on mouse body temperature. Life Sciences 41:1415-1424, 1987 159. Satoh N, Yonezawa A, Tadano T, Kisara K, Arai Y, Kinemuchi H: Central hypothermic
effects
tetrahydropyridine
of
some
(MPTP)
and
analogues
of
1-methyl-4-phenyl-1,2,36-
1-methyl-4-phenylpyridinium
ion
(MPP+).
Neurosci Lett 80:100-105, 1987 160. Saura J, Kettler R, Da Prada M, Richards JG: Quantitative enzyme radiography with 3H-Ro 41-1049 and 3H-Ro 19-6327 in vitro: localization and abundance of MAO-A and MAO-B in rat CNS, peripheral organs, and human brain. J Neurosci 12:1977-1999, 1992 161. Schnaitman C, Erwin VG, Greenwelt JW: The submitochondrial localization of monoamine oxidase. An enzymatic marker for the outer membrane of rat liver mitochondria. J Cell Biol 34,719, 1967 162. Schneider EL, Reed JD: Life extension. New Engl J Med 321:1159, 1985
97
IRODALOMJEGYZÉK 163. Schneider LS, Tariot PN, Goldstein B: Therapy with l-deprenyl (selegiline) and relation to abuse liability. Clin Pharmacol Ther 56:750-756, 1994 164. Seccombe JF, Schaff VH: Vasoactive Factors Produced by the endothelium. RG Landes Company, Austin, pp.:1-137, 1994 165. Shimazu S, Takahata K, Katsuki H, Tsunekawa H, Tanigawa A, Yoneda F, Knoll J, Akaike A: (-)-1-(Benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane enhances locomotor activity in rats due to its ability to induce dopamine release. Eur J Pharmacol 421:181-189, 2001 166. Singer TP: Suicide inhibitors: an overview. Molecular Basis of Drug Action, Eds.: Singer TP, Ondarza RN, pp:185-201, Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam, Oxford, 1981 167. South J: Deprenyl: The anti-aging Psychoenergizer. Anti-Aging Bulletin 4:3-19, 2001 168. Snyder SH, D’Amato RJ: MPTP: A neurotoxin relevant to the pathophysiology of Parkinson’s disease. Neurology 36:250-258, 1986 169. Stoll S, Hafner U, Kranzlin B, Muller WE: Chronic treatment of Syrian hamsters with low-dose selegiline increases lifespan in females but not males. Neurobiol Aging 18:205-211, 1997 170. Sulser F, Mobley PL: Biochemical effects of antidepressants in animals. In: Psychotropic Agents: Antipsychotics and Antidepressants. Eds.: Hoffmeister F, Stille G, Vol. 55, Pt.I, pp:471-490, Handbook of Experimental Pharmacology, Springer Verlag, Berlin, 1980
98
IRODALOMJEGYZÉK 171. Sunderland T, Cohen R, Molchan S, Lawlor BA, Mellow AM, Newhopuse PA, Tariot PN, Mueller EA, Murphy DL: High-dose selegiline in treatment-resistant older depressive patient. Arch Gen Psychiatry 51:607-615, 1994 172. Szende B, Magyar K, Szegedi Zs: Apoptotic and antiapoptotic effect of (-)-deprenyl and (-)-desmethyl-deprenyl on human cell lines. Neurobiology 8:249255, 2000 173. Szökő É, Magyar K: Enantiomer identification of the major metabolites of (-)-deprenil in rat urine by capillary electrophoresis. Int J Pharm Advances 1:320-328, 1996 174. Tanner CM, Chen B, Wang W, Peng M, Liu Z, Liang X, Kao LC, Gilley DW, Goetz CG, Schonberg BS: Environmental factors and Parkinson’s disease: a casecontrolled study in China. Neurology 39:660-664, 1989 175. Tariot PN, Cohen RM, Sunderland T, Newhouse PA, Yount D, Mellow AM: L-(-)Deprenyl in Alzheimer’s disease. Arch Gen Psychiatry 44:427-433, 1987 176. Tatton WG, Greenwood CE: Rescue of dying neurons: a new action for deprenyl in MPTP parkinsonism. J Neurosci Res 30:666-672, 1991 177. Tatton WG, Ju WY, Holland DP, Tai C, Kwan M: (-)-Deprenyl reduces PC12 cell apoptosis by inducing new protein synthesis. J Neurochem 63:1572-1575, 1994 178. Tatton WG, Chalmers-Redman RM: Modulation of gene expression rather than monoamine oxidase inhibition: (-)-deprenyl-related compounds in controlling neurodegenaration. Neurology Suppl 3:S171-183, 1996
99
IRODALOMJEGYZÉK 179. Tatton WG, Wadia JS, Ju WY, Chalmers-Redman RM, Tatton NA: (-)-Deprenyl reduces neuronal apoptosis and facilitates neuronal outgrowth by altering protein synthesis without inhibiting monoamine oxidase. J Neural Transm Suppl 48:45-59, 1996 180. Tekes K, Magyar K: Effect of MAO inhibitors on the high-affinity reuptake of biogenic amines in rat subcortical regions. Neurobiology 8:257-264, 2000 181. Tetrud JW, Langston JW: The effect of (-)deprenyl (selegiline) on the natural history of Parkinson’s disease. Science 245:519-522, 1989 182. Tímár J, Knoll J: The effect of repeated administration of (-)-deprenil on the phenylethylamine-induced stereotypy in rats. Arch int Pharmacodyn Thér 279:50-60, 1986 183. Tímár J, Knoll B, Knoll J: (-)Deprenyl (selegiline) is devoid of amphetamine-like behavioural effects in rats. Acta Physiol Hung 79:131-137, 1992 184. Tipton KF: The sub-mitochondrial localization of monoamine oxidase in rat liver and brain. Biochim Biophys Acta 135:910-920, 1967 185. Traub M, Wagner HR, Hassan M, Jackson-Lewis V, Fahn S: The effects of chronic bromocriptine treatment on behaviour and dopamine receptor binding in the rat striatum. Eur J Pharmacol 118:147-154, 1985 186. Varga E, Tringer L: Clinical trial of a new type of promptly acting psychoenergetic agent (phenyl-isopropylmethyl-propinylamine HCl, E-250). Acta Med Acad Sci Hung 23:289-295, 1965
100
IRODALOMJEGYZÉK 187. Wyatt RJ, Gillin JC, Stoff DM, Moja EA, Tinkleberg JR: β-Phenylethylamine and the neuropsychiatric disturbances. In: Neurotransmitters and Hypothesis of Psychiatric Disorders, Eds.: Usdin E, Barchas J, Hamburg D, pp 31-45, Oxford University Press, London, 1977 188. Yasar S, Tímár J, Knoll B, Knoll J: Comparison of the dependence capacity of amphetamine, MK-306 and (-)-deprenyl. Acta Physiologica Hungarica Suppl. 75:299-300, 1990. 189. Yasar S, Goldberg JP, Goldberg SR: Are metabolites of l-deprenyl (selegiline) useful or harmful? Indications from preclinical research. J Neural Trans Suppl 48:6173, 1996 190. Yoneda F, Moto T, Sakae M, Ohde H, Knoll B, Miklya I, Knoll J: Structureactivity studies leading to (-)1-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane, ((-)BPAP), a highly potent, selective enhancer of the impulse propagation mediated relese of catecholamines and serotonin in the brain. Bioorg & Med Chem 9:1197-1212, 2001 191. Yoshida T, Yamada Y, Yamamoto T, Kuroiwa Y: Metabolism of deprenyl, a selective monoamine oxidase (MAO) B inhibitor in rat: relationship of metabolism to MAO-B inhibitory potency. Xenobiotica 16:129-36, 1986 192. Yoshida T, Oguro T, Kuroiwa Y: Hepatic and extrahepatic metabolism of deprenyl, a selective monoamine oxidase (MAO) B inhibitor, of amphetamines in rats: sex and strain differences. Xenobiotica 17:957-63, 1987 193. Zeller EA: Über den enzymatischen Abbau von Histamin und Diaminen. Helv Chim Acta 21:881-890, 1938 194. Zs-Nagy I: On the role of intracellular cross-linking of cellular proteins in aging. Mech Age Dev 14:245-251, 1980
101
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK
9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK I.
Miklya I, Knoll J: Small-dose administration of (-)deprenyl, (-)PPAP and (-)metaphetamine enhances catecholaminergic and diminishes serotoninergic tone in the brain. Polish Journal of Pharmacology 46:313, 1994
II.
Miklya I, Rácz D, Knoll J: CNS effect of (-)deprenyl unrelated to MAO-B inhibition. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology Suppl. 1, 72:360, 1994
III.
Knoll J, Yen TT, Miklya I: Sexually low perfoming male rats die earlier than their high performing peers and (-)deprenyl treatment eliminates this difference Life Sciences 54 (15):1047-1057, 1994
IV.
Knoll J, Miklya I: Multiple, small dose administration of (-)deprenyl enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain and these effects are unrelated to MAO-B inhibition. Arch Int Pharmacodyn Ther. 328:1-15, 1994
V.
Knoll J, Miklya I: Enhanced catecholaminergic and serotoninergic activity in rat brain from weaning to sexual maturity: rationale for preventive (-)deprenyl medication. Life Sciences 56:611-620, 1995
VI.
Miklya I, Knoll J: Single, small dose administration of (-)metamphetamine (MA) and (-)deprenyl (D), in contrast to (+)MA enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain stem of rats. Pharmacological Research Suppl 31: 351, 1995
VII.
Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Kelemen K: (-)Deprenyl and (-)PPAP act primarily as potent stimulants of action protential - transmitter release coupling in the catecholaminergic neurons. Life Sciences 58:817-827, 1996
102
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK VIII. Knoll J, Knoll B, Miklya I: High performing rats possess significantly higher brain noradrenergic and serotoninergic activity and are more sensitive toward (-)PPAP, a catecholaminergic activity enhancer compound , than their low performing peers. Life Sciences 58:945-952, 1996 IX.
Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Rácz.D: PEA and tyramine are mixed-acting sympatomimetic amines in the brain. Life Sciences 58:2101-2114, 1996
X.
Miklya I, Knoll B, Knoll J: Bretylium enhances vasoconstrictor responses of the rabbit ear artery to field stimulation of intramural sympathetic nerves. Archives of Pharmacology Suppl. 2, 358:591, 1998
XI.
Miklya I, Knoll B, Knoll J: Catecholaminergic and serotoninergic activity enhancer (CAE/SAE) substances. Fundamental & Clinical Pharmacology Suppl.1, 13:49S, 1999
XII
Knoll J, Yoneda F, Knoll B, Ohde H, Miklya I: (-)1-(Benzofuran-2-yl)-2propylaminopentane, (-)BPAP, a selective enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamins and serotonin in the brain. British Journal of Pharmacology 128:1723-1732, 1999
XIII. Knoll J, Miklya I, Knoll B, Dalló J: Sexual hormones terminate in the rat the significantly enhanced catecholaminergic/serotoninergic tone in the brain characteristic to the post-weaning period. Life Sciences 67:765-773, 2000 XIV. Yoneda F, Moto T, Sakae M, Ohde H, Knoll B, Miklya I, Knoll J: Structure
activity
studies
leading
to
(-)1-(Benzofuran-2-yl)-2-
propylaminopentane, (-)BPAP, a highly potent, selective enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamines and serotonin in the brain. Bioorganic & Medicinal Chemistry 9:1197-1212, 2001
103
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK XV.
Miklya I, Knoll B: Analysis of the catecholaminergic/serotoninergic activity enhancer effect of (-)BPAP. Neuropsychopharmacologia Hungarica Suppl. 3: 40, 2001
XVI. Knoll J, Miklya I, Knoll B: Stimulation of the catecholaminergic and serotoninergic
neurons
in
the
brain
by
R-(-)-1-(benzofuran-2-yl)-2-
propylaminopentane, (-)-BPAP. Life Sciences 71:2137-2144, 2002 XVII. Knoll J, Miklya I, Knoll B, Yasusa T, Shimazu S, Yoneda F: 1-(Benzofuran-2-yl)-2-(3,3,3-trifluoropropyl)aminopentane HCL, 3-F-BPAP, antagonizes the enhancer effect of (-)-BPAP in the shuttle box and leaves the effect of (-)-deprenyl unchanged. Life Sciences 71:1975-1984, 2002 XVIII. Magyar K, Lengyel J, Bolehovszky A, Knoll B, Miklya I, Knoll J: Tha fate of (-)1-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminomentane HCl, (-)-BPAP, in rats, a potent enhancer of the impulse-evoked release of catecholamines and serotonin in the brain. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics 27:157161, 2002
XIX. Miklya I: A (-)deprenilnél hatékonyabb új enhancer vegyület, a (-)BPAP szelektív hatásának bizonyítása. Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:84-90, 2002
XX. Miklya I: A (-)deprenyl és a (-)BPAP enhancer hatásáról és e hatás jellegzetes dózis-függéséről. Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:91-98, 2002
104
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK XXI. Miklya I, Knoll B, Knoll J: Miért volt a (-)-deprenil (Selegilin, Jumex) hatékony és
az
α-tokoferol
hatástalan
a
DATATOP
vizsgálatban?
Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:168-172, 2002
XXII. Miklya I, Knoll J: Evidence for the selectivity of the effect of (-)-BPAP, the newly developed more specific and more potent enhancer substance than (-)-deprenyl (Selegiline). Life Sciences 2003 (in press)
XXIII. Miklya I, Knoll B, Knoll J: A pharmacological analysis elucidating why, in contrast to (-)-deprenyl (Selegiline), α-tocopherol was ineffective in the DATATOP study. Life Sciences 2003 (in press)
XXIV. Miklya I, Knoll B, Knoll J: An HPLC tracing of the enhancer regulation in selected discrete brain areas of food deprived rats. Life Sciences 2003 (in press)
105
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK
ELŐADÁSOK, POSZTERBEMUTATÓK
I.
Miklya I, Knoll J: Small-dose administration of (-)deprenyl, (-)PPAP and (-)metaphetamine enhances catecholaminergic and diminishes serotoninergic tone in the brain 4th Joint Meeting of Hungarian, Italian and Polish Pharmacological Societies Poznan, Poland, September 19-21, 1994.
II.
Miklya I, Rácz D, Knoll J: CNS effect of (-)deprenyl unrelated to MAO-B inhibition. 12th International Congress of Pharmacology Montreal, Canada, July 24-29, 1994.
III.
Miklya I, Knoll J: Single, small dose administration of (-)metamphetamine (MA) and (-)deprenyl (D), in contrast to (+)MA enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain stem of rats. First
European
Congress
of
Pharmacology
(EPHAR)
Milan,
Italy,
June 16-19, 1995. IV.
Miklya I, Knoll B, Knoll J: An anomalous effect of bretylium. 6th Joint Meeting of the Italian, Hungarian and Polish Pharmacological Societies Pisa, Italy, May 14-16, 1998.
V.
Rácz
D,
Miklya
I,
Knoll
J:
Comparison
of
(-)methamphetamine,
(+)methampetamine and (-)deprenyl catecholaminergic and serotoninergic activity in the brain stem of rats. 6th Joint Meeting of the Italian, Hungarian and Polish Pharmacological societies. Pisa, Italy, May 14-16, 1998. VI.
Miklya I, Knoll B, Knoll J: Bretylium enhances vasoconstrictor responses of the rabbit ear artery to field stimulation of intramural sympathetic nerves. 13th International Congress of Pharmacology (IUPHAR) München, Germany, July 26-31, 1998.
106
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK VII.
Miklya I, Knoll B, Knoll J: Catecholaminergic and serotoninergic activity enhancer (CAE/SAE) substances. 2nd European Congress of Pharmacology (EPHAR) Budapest, Hungary, July 3-7, 1999.
VIII. Miklya I, Knoll B: Analysis of the catecholaminergic/serotoninergic activity enhancer
effect
of
(-)BPAP.
Collegium
Internationale
Neuro-
psychopharmacologia (CINP), Hungarian Regional Congress jointly with the 4th Hungarian
Neuropsyhopharmacologic
Hungary, September 20-23, 2001.
107
Congress,
Symposium,
Budapest,
