Vidosits András
Hippokampális neuronok dinamikus, térbeli mintázatokkal való stimulálása optogenetikai módszerekkel Molekuláris bionikus mérnöki BSc. Témavezető: Dr. Gulyás Attila Konzulens: Dr. Kalló Imre 2015
1
Alulírott Vidosits András, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai és Bionikai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a szakdolgozatot meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a szakdolgozatban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a Szakdolgozatot más szakon még nem nyújtottam be.
........................................................
2
1 TARTALOMJEGYZÉK 2
Tartalmi összefoglaló ........................................................................................................ 4
3
Summary of contents ........................................................................................................ 5
4
Bevezetés .......................................................................................................................... 6
5
Feladatkiírás ...................................................................................................................... 9
6
Előzmények ..................................................................................................................... 13 6.1
Optogenetika .................................................................................................................. 13
6.2
A stimulátorról ................................................................................................................ 14
6.3
National Instruments - Data Acquisition (DAQ) Board ................................................... 16
6.4
A szakirodalom kritikai elemzése ................................................................................... 16
7
Tervezés részletes leírása ................................................................................................ 21 7.1
A bevetített fény szóródása, a felmerülő háttérfény ellenőrzése .................................. 21
7.2
A lézerdióda válaszideje ................................................................................................. 22
7.3
Az időbeli stimuláció felbontása ..................................................................................... 23
7.4
A Polygon400-as készülék programból való vezérlése ................................................... 25
7.5
A Lézerdióda vezérlése külső csatornával ...................................................................... 26
7.6
A Polygon400-as készülékre feltölthető képek felbontása, a feltöltés menete ............. 27
7.7
A térbeli mintázatok meghatározása.............................................................................. 28
7.7.1
A kamera látómezeje, az Effective Pixel Range (EPR)............................................. 29
7.8
A temporális mintázatok meghatározása: a Timeline control........................................ 31
7.9
Lézervezérlés és megjelenítés ........................................................................................ 34
8
Értékelés.......................................................................................................................... 36 8.1
A mérésvezérlő jelenlegi állapota .................................................................................. 36
8.2
Továbbfejlesztési lehetőségek, távlati tervek ................................................................ 37
8.3
Kritikai elemzés ............................................................................................................... 37
8.4
Kísérleti eredmények ...................................................................................................... 38
9
Összefoglalás ................................................................................................................... 45
10
Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................ 46
11
Irodalomjegyzék .............................................................................................................. 47
3
2 TARTALMI ÖSSZEFOGLALÓ A szakdolgozatom tárgya egy olyan mérésvezérlő program, mely segítségével egy harmadik fél, a Mightex kanadai cég által tervezett eszközt lehet vezérelni. A program segítségével lehetőségünk nyílik arra, hogy eddig korábban nem látott módon tudjunk térben és időben változó mintázatokkal olyan neurobiológiai kísérleteket végezni, melyek során az idegsejtek és idegsejthálózatok finom stimulálására van szükség. A dolgozat során bemutatom a Polygon400-as eszköz képességeit, illetve azokat a kísérleteket, melyeket a gyári megoldásokkal (PolyLite gyártói program) el lehet végezni. Kitérek a szakirodalomban található megoldásokra, valamint arra, hogy ezek a megoldások miért nem kielégítőek számunkra. Az előzmények fejezetben bemutatok egy, az általam készített vezérlővel nagyon nagy hasonlóságot mutató, MatLab környezetben készült programot, a NeuroPG nevű projektet, továbbá bemutatom, hogy az általunk feltett egyes kérdések megválaszolására miért nem alkalmas a jelenleg elérhető vezérlő. A dolgozat első felében kitérek az optogenetika azon tulajdonságaira, melyeknek köszönhetően ez a módszer igen népszerű az in vivo és in vitro kísérleteket végző laboratóriumokban. Jelen dolgozat második szakaszában a biológiai és technikai háttér bemutatása után leírom a tervezés menetét, valamint kitérek arra is, milyen lépéseken keresztül érkeztünk el a mérésvezérlő jelenlegi állapotához. A tervezésről szóló fejezetben bemutatom a Polygon400-as tulajdonságait, az általunk használt lézerdiódát és vezérelhetőségét, kiemelve azokat a megfontolásokat, melyek a térbeli és időbeli mintázatok különválasztásához vezettek. A feljebb említett fejezetet egy alapszintű dokumentációként mutatom be, ugyanis itt ismertetem meg az olvasót a mérésvezérlő alapvető képességeivel és felhasználói felületével. A dolgozat utolsó részében meghatározom, mely, általunk kitűzött célokat értük el, illetve mely hosszú távú tervek megvalósításán dolgozunk. Az értékelés fejezet utolsó részében bemutatom azon egyszerű kísérlet sorozatokat, melyek segítségével aránylag egyszerű módon juthatnunk alapvető ismeretekhez a sejtekre érkező bemenetek (serkentő áramok) térbeli és időbeli integrációjával kapcsolatban.
4
3 SUMMARY OF CONTENTS The subject of this thesis is a measurement control software, with which a special device, the Polygon400 patterned photostimulator can be controlled. With the help of this software the researchers and scientists will be able to conduct experiments which were not possible ever before. These experiments are those that require very precise dynamic and spatially variable patterned illumination. During this thesis I would like to introduce the reader to the possibilities provided by the Polygon400 patterned stimulator and the manufacturer provided software (PolyLite). I will detail the solutions found in the literature and the reasons why these solutions are insufficient. In the chapter containing the preliminaries I will introduce the reader to a software very similar to our own, the NeuroPG, which is a software coded in the MatLab environment. During this chapter I will detail the reasons why are optogenetic tools popular in leading research facilities, both in vitro and in vivo. In the second section of this thesis I would like to explain the necessary biological and technical background. After the basic introduction of the tools used during the development period, I will explain the steps taken and problems tackled so far. The chapter detailing the planning and early development phases will explain the properties of the Polygon400 device, the laser diode used in the experiments and the methods with which one is able to control the aforementioned devices. The chapter will also walk the reader through the thought process which led us to seperate the design of spatial and temporal patterns. The chapter will also serve as a basic documentation for the measurement control software as this is the chapter that will introduce the user to the basic functionality, control and user interface of the software. Finally, in the last third of this thesis I aim to demonstrate the achieved goals that were set out during the development and those goals the realization of we are still a work in process (such as online data processing). In the final chapter I will demonstrate a series of experiments which, in our opinion, whose execution is quite simple with the software. These experiments will also provide us with basic and not so basic experimental data regarding the integration of inputs on the recorded cell.
5
4 BEVEZETÉS A dolgozat során bemutatom azt az általam készített számítógépes programot, mellyel egy mikroszkóphoz csatlakoztatható stimulátor működését lehet vezérelni. Ezen eszköz, melyet a gyártó Mightex cég Polygon400 névre keresztelt, illetve az általam készített program segítségével végeztem in vitro méréseket egérből származó hippokampális szeletekben. A kísérletekkel elsősorban arra kerestük a választ, hogy milyen az idegsejtek integrációja az agyban. További releváns (bár jelenleg nem a leghangsúlyosabb) kérdés, hogy a hippokampuszban található neurális hálózatok működése hogyan változik a hálózat egyes elemeinek térben és időben is változó stimulálásával.
Az általam készített programra azért volt szükség, mert bár az eszközhöz jár egy gyárilag készített vezérlőprogram, mely alapvető kísérletek elvégzésére alkalmas, de nem használható bonyolultabb (az általunk elvárt) mintázatok tervezésére és futtatására. Hogy az általunk feltett kérdésekre kielégítő választ kapjunk, a stimulátort mind időben, mind térben finoman és gyorsan kívánjuk vezérelni, azonban egy ilyen mintázat megtervezése az eszközhöz tartozó gyári vezérlőprogrammal túlságosan bonyolult és lassú. A programot, mely az MTA KOKI-ban, a Dr. Gulyás Attila által vezetett kutatócsoport közreműködésével készült, a csoport tagjai közösen találták ki és tervezték meg, valamint az in vitro elektrofiziológiai kísérletek is itt zajlottak
Ahhoz, hogy ezek a kísérletek létrejöhessenek, az optogenetika eszközeire van szükségünk. Az optogenetika egy olyan módszer, melynek alkalmazása során transzgénikus állatokban célzottan tudunk idegsejteket fényérzékennyé tenni - a rájuk vetülő fénnyel a sejtekben membránpotenciál változást előidézni. A fény -> ingerület mechanizmus sokat tanulmányozott, és bár nem ismert minden paramétere, mégis elég ismerettel rendelkezünk ahhoz, hogy segítségével tanulmányozhassuk az idegsejt hálózatokat. Az optogenetikáról, illetve a fény -> ingerület mechanizmusról a 6.1-es fejezetben írok részletesebben. A program segítségével gazdag ismeretet nyerhetünk egy neuronhálózatról, illetve annak kisebb egységeiről, továbbá elektrofiziológiai módszerekkel (patch clamp módszer) egy üvegkapilláris mikroelektróda segítségével monitorozni tudjuk a sejtre érkező, más sejtek által 6
generált bemeneteket, valamint azok integrációját kimenetekké. Feltérképezhetjük egy adott sejt környezetét, megvizsgálhatjuk, hogy az általunk patch clamp technikával elvezetett sejt milyen bemeneteket kap a környezetében lévő sejtektől. Ennek különösen nagy szerepe lehet például neokortikális agyszeletben, ahol igen nehéz feladat sejtpárokat keresni az elektrofiziológusok számára. Ezeket a kérdéseket figyelembe véve a feladatom az volt, hogy a Polygon400-as eszközt közvetlenül a saját fejlesztői környezetén keresztül vezéreljem egy programból. Alapvető elvárás volt, hogy a programmal gyorsan és pontosan lehessen térbeli mintázatokat meghatározni az eszköz számára, valamint a program a megvilágítást szolgáltató lézer diódát akár mikroszekundumos (μs) időskálán is vezérelni tudja. További követelmény volt, hogy a későbbi vizsgálatokhoz a mintázatokat el lehessen menteni, illetve tetszés szerint betölteni a programba. A feladat kétrétű; adott két eszköz, mindkettőt vezérelni kell: egy Polygon400-as térbeli stimulátor, mely egy előre meghatározott területre fényt tud vetíteni a mikroszkóp tárgylencséje alatt (akár 96 mintázatot egymás után, μs-os váltással); , illetve adott egy lézerdióda, mely egy analóg módon változtatható feszültségértéket fogadva maximális teljesítményének általunk megadott százalékát képes egy üvegszálon kiadni magából. A Polygon400 eszköz ezt a lézerfényt használja fel a térbeli stimulus tárgylemezre vetítésére a mikroszkóp tárgylencséjén keresztül. Ahhoz, hogy ezt a két feladatot megfelelő módon összehangoljuk, elengedhetetlen az olyan kalibrációs mérések elvégzése, melyek segítségével az optikai stimulálás természetét megértjük. A kalibrációs feladatokhoz nagyon sok segítséget nyújt az általunk készített program, hiszen képes olyan mintázatok egyszerű és gyors legyártására, melyekkel ezek a mérések elvégezhetőek. Ilyen mintázat például az egyes, általunk meghatározott területek növekvő fényintenzitással való vetítése, valamint különböző méretű mintázatok általunk időzített szekvenciáinak tesztelése. Terveink között szerepel, hogy a programot tovább bővítjük és fejlesztjük, melynek köszönhetően egy mintázat beolvasásával vagy egyszerű legenerálásával képesek leszünk a patch clamp módszerrel elvezett sejt típusát, valamint annak bement/kimenet görbéjét (I/O függvény) meghatározni. További célunk, hogy a program segítségével a sejtből elvezetett bemeneteket/kimeneteket (sejtre érkező áramokat/sejt által generált potenciálok) élőben (online) feldolgozzuk. Az online elemzés segítségével meg szeretnénk határozni a sejt aktív környezetét, mely meghatározza a kísérlet további kimenetét. Amennyiben sikerül releváns 7
mintázatokat találnunk és generálnunk, úgy a tér-és időbeli stimulációs mintázatokra adott válaszok a tudományterület eddig meg nem válaszolt kérdéseire adhat választ a program segítségével. További kísérletek, illetve a program bővítése utána azt reméljük, hogy képesek leszünk egy gomb megnyomásával meghatározni egy patch clamp felvétel alatt, hogy az általunk vizsgált sejt milyen típusú, milyen bemenet/kimenet görbével rendelkezik. A program a jövőben képes lesz arra, hogy a patch clamp felvételt közvetlenül, élőben feldolgozza. Ennek segítségével például meg tudjuk találni egy sejt aktív környezetét és összességében a patch clamp mérések nagyon nagy részében óriási segítséget nyújtana a program. Ezeken az eredményeken kívül természetesen a közvetlen eredmények, a tér- és időbeli stimulációs mintázatokra adott válaszok kiértékelésével is előrébb lehetne jutni a tudományterületen, amennyiben sikerül releváns mintázatokat találnunk. A dolgozat során vázolom a kísérleti eljárás sejtbiológiai, neurobiológiai hátterét, a korábbi eredményeket a stimulátorral kapcsolatban, mérnöki szempontokat a tervezés során, az akadályokat, melyekkel találkoztam, valamint a megoldásokat. Leírok néhányat a legfontosabb protokollok, eljárások és kísérletek közül. A dolgozat végén bemutatom eredményeinket, melyeket a stimulátor segítségével értünk el, illetve a távlati terveket, melyek irányába az eszközt és az eljárást kívánjuk fejleszteni.
8
5 FELADATKIÍRÁS Alkalmazza a dinamikus, térbeli stimulátort arra, hogy felderítse az adott idegsejtre bemeneteket adó idegsejteket, azaz térképezze fel az idegsejt környezetét! A feladat során az érdekel minket, hogy melyek azok a környezetében levő más idegsejtek, akik szinapszist képezve a sejtünkkel, bemenetként szolgálnak számára. Az program melyet készítek, az eszközt vezérelve kell, hogy lehetőséget nyújtson ennek a kérdésnek a megválaszolására. Erre azért van szükség, mert végső soron az egyik legfontosabb kérdésünk, hogy az eszköz és a program segítségével ki tudjuk-e számolni a sejt I/O függvényét, azaz milyen lesz a sejt átviteli karakterisztikája. A feladat során az elsődleges kérdésünk az volt, hogy az általunk patch clamp módszerrel elvezetett sejt a környezetében lévő további idegsejtektől milyen bemeneteket kap, tehát az általam írt program segítségével (az eszközt vezérelve) ki tudjuk-e a számolni a sejt I/O függvényét, meg tudjuk-e határozni a sejt jelátviteli karakterisztikáját. A feladat e része tehát az, hogy lehetőleg minél kevesebb felhasználói beavatkozással fel tudjuk „térképezni” a vizsgált idegsejt közvetlen és távolabbi környezetét – a sejt környezetében lévő más idegsejtek aktiválásával tudunk-e választ rögzíteni az általunk vizsgált sejten. Erre megoldást nyújt az eszköz használata. Fontos megjegyezni, hogy mekkora a felhasználói beavatkozás mértéke a feltérképezés során. Mik azok a lehetőségek, melyekkel a felhasználó élhet az eszköz „feltérképezés” üzemmódjában? A feladat megoldása során a felhasználónak meg kell határoznia azokat a területeket a sejt környezetében, melyekben intuitívan sejthető olyan sejtek megléte, melyek fénnyel történő stimulálása során választ kapunk az idegsejten. A területek meghatározásához elengedhetetlen a kézi, illetve automatizált eljárás – az eszköznek ezt tudnia kell. Fontos megjegyezni, hogy a feltérképezés során elsősorban nem sejteket (szómákat, sejttesteket) stimulálunk fénnyel, hanem a sejtek axonjait vagy terminálisait. Az eddigi méréseink alapján valószínű, hogy nem az egyes terminálisokat, hanem az általunk vizsgált területen áthaladó axonokat stimuláljuk
9
A területek feltérképezésén kívül a felhasználónak nemcsak a térbeli, hanem az időbeli stimulust is definiálnia kell. Ezalatt azt értem, hogy a program által vezérelt lézerfény be- és kikapcsolási időzítését is pontos meg kell határozni, ugyanis az idegsejtek az eltérő szinkronitással érkező jeleket más-más módon integrálják. Miután a felhasználó meghatározta a tér- és időbeli stimulálási mintázatot, az eszköznek a meghatározott protokollt végre kel hajtania a Polygon400-as készülék és egy vezérelhető lézerdióda (analóg módon változtatható feszültséggel) segítségével. Egy protokoll meghatározásának lépései röviden (bővebben a 7.7-7.8-as fejezetekben):
Térbeli mintázat (pattern) meghatározása o
A térbeli mintázat területekből áll (area)
Temporális mintázat meghatározása (pattern sequence) o
Az egyes képekre eső lézerimpulzusok definiálása
A pattern és a pattern sequence együtt alkotja a protokollt. A protokoll végrehajtása során a felhasználónak a patch clamp módszerrel vizsgált idegsejtről felvételt kell készítenie. A patch clamp pipetta megfelelő behelyezése a felhasználó feladata. Ezt követően a felvételben megjelenő esetleges válaszok (gátló- és serkentő áramok) kiértékelésének két módja van: online és offline feldolgozás. A program tervezése során felkészültem arra, hogy a jövőben az online feldolgozást lehetővé tegyem, azonban jelen pillanatban a feladatnak nem része a válaszok felvétele és kielemzése. Csoportosítsa a bemenetként szolgáló idegsejteket a kiválasztott idegsejtre kifejtett hatásuk szerint! A kísérletek során feltételezzük, hogy lesznek olyan területei az agyszeletnek, melynek megvilágítása, stimulálása valamilyen választ fog kiváltani a patch clamp módszerrel elvezetett sejtben. Azért beszélek feltételezésről, mert előfordulhat, hogy a vírusbeadást követően a kívánt gén kifejeződése nem kielégítő – a szeletben mérhető válaszok igen nagymértékben az expresszió függvényei. A kísérletek során mérhető válaszok alapvetően kétfélék lehetnek: posztszinaptikus gátló-, illetve serkentő áramok (IPSC/EPSC-k). Ezek az áramok, annak függvényében, hogy milyen ioncsatorna (receptor) által közvetítettek, valamint hogy a sejt membránpotenciálja milyen értéken van, megváltoztatják a sejt membránpotenciálját. Például egy whole-cell patch clamp, voltage-clamp konfigurációban elvezetett, -65 mV-os 10
membránfeszültségen tartott sejten a serkentő glutamát által kiváltott áram normál körülmények között posztszinaptikus serkentő áramként fog megjelenni (EPSC, Excitatory PostSynaptic Current), depolarizálni fogja a membránt. Ezzel ellentétben, a GABA (Gammaamino-vajsav) a gátló GABA receptorokon keresztül posztszinaptikus gátlóáramot fog kiváltani (Inhibitory PostSynaptic Current, IPSC), hiperpolarizálja a membránt. A helyzetet tovább bonyolítja, hogy a legpontosabb vetítés során sem egy sejtet fogunk serkenti, hanem többet. Ezt azért fontos megjegyezni, mert a sejten kiváltott válasz nem pusztán egy sejttől származik, hanem gyakran összetett hatást is látni lehet. Ez azzal magyarázható, hogy az idegsejt hálózat tagjainak aktiválása egy aktivitás kaszkádot indíthat el, melynek hatását a sejten is mérhetjük. A fenti meggondolásokat figyelembe véve az általam készített programnak lehetőséget kell nyújtania arra, hogy számon tartsuk az egyes területek fénnyel történő stimulálásának hatását a megfigyelt sejtre. Szintén elengedhetetlen, hogy az adatok későbbi, offline elemzése során egyértelműen lehessen párosítani az adatfeldolgozásból származó esetleges membránpotenciál változásokat, illetve a megvilágított területeket. Ezt a feladatot úgy oldottam meg, hogy a stimuláció során a program egy merevlemezre mentett állományba rögzíti azokat az időpontokat, mely időpillanatokban a megvilágítást adó lézer be volt kapcsolva (milliszekundumban, a stimuláció kezdetétől számolva). Ezen kívül azt is rögzítettem, melyik terület volt megvilágítva az adott időintervallumban. Ezen állományok segítségével, illetve a patch clamp elvezetéssel az offline analízis során összeállítható a megvilágított terület helye és típusa, azaz hogy a megvilágítás gátlást vagy serkentést okozott a megfigyelt idegsejten.
11
Elemezze a vizsgált idegsejt I/O függvényét a bemenetekre adott stimulusok segítségével! A feladat megoldásához olyan pontosan definiált, jól irányított kísérletekre van szükség, melyeket a mérésvezérlő program segítségével végre lehet hajtani. A feladat során azt vizsgáltuk, hogy a feltételezett neuronhálózati modellek melyike az, mely leginkább magyarázza a mérési adatokat. Célunk, hogy az eszköz segítségével olyan kísérleteket végezzünk el, melyek segítenek eldönteni, hogy egy feltételezett neuronhálózati modell által szolgáltatott adatok mennyire felelnek meg a mérési adatoknak. Szintén fontos kérdés, hogy milyen funkcionális modell illeszthető legjobban ezekre az adatokra. A program további feladata, hogy az adott modellekben lévő ismeretlen tényezők (temporális szűrő, linearitás és non-linearitás, additív zaj paraméterei, stb.) meghatározásában is segítséget nyújtson. Célunk, hogy a program segítségével tervezhetőek, illetve még fontosabb: végrehajthatóak legyenek olyan kísérletek, melyek választ adnak néhány, az 5.1. ábrán látható kérdésre, és segítenek az egyes paraméterek meghatározásában.
5.1. ábra: A hGLM modell. Dr. Újfalussy Balázs, BME szeminárium 2014. árpilis 8: Are active dendrites relevant for neuronal computation? A képen egy lineáris, egy nem lineáris, illetve egy kétrétegű nem lineáris neuronhálózati modell látszik. Vajon melyik illeszkedik legjobban az agyi hálózatokon végzett kísérletek adataira?
12
A feladat megoldásához Patch clamp módszerrel elvezetünk egy hippokampális idegsejtből, a program segítségével pedig lefuttatjuk az előre meghatározott protokollokat. A sejtet és környezetét különböző nagyságú, elhelyezkedésű és fényerősségű, négyzet vagy ellipszis alakú területekkel fogjuk fénnyel stimulálni. A protokoll segítségével feltérképezzük a sejt környezetét, és megtaláljuk azokat a területeket, melyek bemeneteket generálnak az általunk mért sejten. A kísérletet a megvilágított területek és stimulusok leírásával együtt elmentjük, majd a továbbiakban számítógépes elemzés alá vetjük. Az analízis célja, hogy meghatározzuk a megfigyelt (elvezetett) sejt bemeneti tulajdonságait, valamint I/O függvényét.
6 ELŐZMÉNYEK 6.1 OPTOGENETIKA Az optogenetika kifejezés a görök optikós (látott, látható) és a genetika szavak szóösszerántása. Az optogenetikai eljárások alapja egy sajátos fehérjecsalád, a rhodopsin fehérjéi. Ezek a fehérjék olyan G-fehérje kapcsolt transzmembrán fehérjék, melyek a rájuk érkező fotonok hatására megváltoztatják konformációjukat, valamint ezt követően egy, vagy akár több jelátviteli útvonalat is képesek bekapcsolni és más fehérjéket szabályozni kis G-fehérjén keresztül. Az optogenetikai kísérletekben központi szerepet kapnak azok a mikrobiális rhodopsinok, melyek prokariótákban fordulnak elő, nincsenek G fehérjével csatolva, azonban fényérzékeny ionpumpaként működnek. Ilyen fehérje például a halorhodopszin, mely egy fény aktivált klorid ion pumpa, valamint a channelrhodopsin-1 (ChR1) és channelrhodopsin-2 (ChR2), melyek nemspecifikus kation csatornák. Ezen csatornák jelentősége azért is óriási, mert fénnyel megvilágítva képesek vagyunk befolyásolni azon sejtek membránpotenciálját (depolarizálni vagy hiperpolarizálni), melyek membránjai rendelkeznek ezekkel a fehérjékkel. Ezt úgy érhetjük el, hogy a sejteket valamilyen eljárással transzfektáljuk, azaz nukleinsavat juttatunk az általunk meghatározott sejtekbe. Az egyik legelterjedtebb módszer a vírusos transzfektálás. Miután a vírusos transzfektálást követően a sejtek membránjában kifejeződik a channelrhodopsin, lehetőségünk van a megfelelő hullámhosszú fénnyel (melyet az adott rhodopszint alkotó aminosavak szabályoznak) aktiválni ezeket az ioncsatornákat. A channelrhodopsin-2 nyitásának hatására kationok (H+, Na+,K+ és Ca2+) 13
áramlanak a sejtbe, tehát a sejt depolarizálódik. Amennyiben a depolarizáció elér egy küszöböt, a sejten akciós potenciál keletkezik, tehát aktiváljuk a sejtet. De miért is használunk optogenetikát elektromos stimuláció helyett? A válasz az optogenetikai módszerek szelektivitásában rejlik. Ez a szelektivitás úgy jöhet létre, hogy a kívánt rhodopszin gén nyílt leolvasási kerete elé berakjuk a kívánt sejttípusra jellemző marker promóter régióját, illetve a kettő közé egy stop kodont, amely egy loxP nevű szekvenciával van közrefogva. A nyitott leolvasási keretet egy riportergén, általában fluoreszcens eGFP (zöld) vagy mCherry (piros) szekvenciája követ. Ez a szerkezet egy olyan egérbe kell, hogy kerüljön (minden sejtjébe legtöbbször), akiben Cre rekombináz enzim működik (szintén minden sejtjében). Azokban a sejtekben, melyekben a Cre rekombináz találkozik a szekvenciával, a stop kodon kimetsződik, ugyanis a Cre rekombináz a loxP helyeken elhasítja a DNS szálat. Az előbb említett sejtekben ilyenkor a sejt képes leolvasni a leolvasási keretet és mivel ez a megfelelő marker promóter régiójával van ellátva, csak azokban a sejtekben lesz aktív a rhodopszin, amelyekre a marker jellemző. Ez a szelektivitás tehát azt eredményezi, hogy az általunk leadott stimulus az elektromos stimulálással szemben nem minden struktúrát hajt a szeletben, hanem csak a szelektíven megjelölteket. Az optogenetika további előnye az elektromos stimulálással szemben, hogy a fényt jóval egyszerűbb célozni, mint egy stimuláló elektródát.
6.2 A STIMULÁTORRÓL Az elmúlt évtizedben, mióta először sikerült optogenetikai módszerekkel aktiválni idegsejteket[1][2], igen sok és változatos tanulmány jelent meg arról, hogy egyes, channelrhodopsinnal ellátott neuron populációk hogyan viselkednek különböző erősségű és frekvenciájú megvilágítás alatt. Ezekben a tanulmányokban azonban nagyrészt kétféle típusú kísérlettel találkozhatunk: azokkal, melyek a neuron populáció megvilágításának frekvenciáját változtatják; illetve azokkal, melyek a megvilágítás helyét mozgatják. A tanulmányokat olvasgatva arra a következtetésre jutottam, hogy nincsenek nagy számban arra vonatkozó tanulmányok, hogy miként változik egy neurális hálózat válasza, viselkedése a stimuláció tér- és időbeli változására. Ennek egyik oka az, hogy in vivo eleve nem lehetséges jelenleg a stimuláció helyét változtatni, hiszen a stimuláló üvegszál, melyen a fény bevetül az állat agyszövetébe, nem mozgatható. Az in vitro mérések során azonban ez nem lehet akadály, hiszen egy preparált szelet 14
felszínén tetszőlegesen mozoghatunk. Az ilyen típusú in vitro mérések végzésére egy kanadai cég, a Mightex kifejlesztette a Polygon400 elnevezésű digitális mikrotükör eszközt (digital micromirror device – DMD), mely segítségével kombinálhatjuk az optogenetika szelektivitását bonyolult megvilágítási mintázatokkal. Azonban fontos megjegyezni, hogy a kísérletek közben a fotostimuláció során nem egy adott pontban, hanem egy fényhengerben stimulálunk, szemben például a 2-photon-uncaging vagy a 2-photon-stimulation módszerekkel. A Polygon400 működése nagyvonalakban a következő: az eszköz olyan tükörmátrixszal rendelkezik a vetítőfejében, mely tükrökre vagy érkezik fény, vagy nem. Az eszköz rendelkezik továbbá belső memóriával, melybe egy USB csatlakozón keresztül számítógépről lehet digitális képállományokat feltölteni. Ezeknek a képeknek meghatározott felbontása van, 684 pixel magasak és 608 pixel szélesek. Az eszköz minden egyes pixelért egy mikrotükörrel felel, azaz egy pixelt egy tükör fog képviselni. Amikor egy képet kivetítünk az eszközből a tárgylemezre, akkor a megfelelő tükröket bekapcsolt állásba állítja a vetítőfej. Ez természetesen csak 1 bites bitmélységű képekre igaz, hiszen itt egy pixel vagy be van kapcsolva, vagy nem. Magasabb bitmélységeken az árnyalatokat úgy oldja meg az eszköz, hogy rendkívül gyorsan (mikroszekundumos tartományban) ki-be kapcsolja a megfelelő tükröket, így azok statisztikusan, egységnyi idő alatt csak az idő annyi százalékában vannak bekapcsolva, ahány százalék az adott képpont fényerőssége. Sajnos ez a jelenség, a tükrök rendkívül gyors kapcsolgatása egy, az elektrofiziológiai méréseinket zavaró mértékű elektromos zajhoz vezet. További akadályt jelentett az eszköz sebessége is, ugyanis az időbeli stimulusok végrehajtásakor a sebesség nem kielégítő, továbbá az időbeli mintázatok meghatározásának terén szegényes az eszköztára (bonyolult időbeli mintázatok nem határozhatóak meg az eszközzel). A felsoroltak, illetve az eszköz belső memóriájának méretének korlátozottsága miatt (maximum 96 képet képes egy adott pillanatban tárolni) úgy döntöttünk, hogy az általam készített programból fogjuk vezérelni a Polygon400 eszköz bemenetéül szolgáló lézerfény fényerősségét. A programnak köszönhetően a felhasználónak lehetősége nyílik tetszőleges mintázatban, fényerősséggel, számban és ideig fénnyel stimulálni az agyszeleteket.
15
6.3 NATIONAL INSTRUMENTS - DATA ACQUISITION (DAQ) BOARD Ahhoz, hogy a programot használni lehessen, több szempontból is szükség van egy National Instruments A/D kártyára (NI-DAQ), mely ahhoz a számítógéphez csatlakozik, melyről a programot futtatjuk: A Polygon400-as készüléket az esetek túlnyomó többségében nem kézi üzemmódban használjuk, nem kézzel váltunk a különböző térbeli mintázatok között, a pontos és előre definiált időzítést a program oldja meg. A térbeli mintázatok időzítése úgy lehetséges, hogy a Polygon400-as fej képes egy TTL jelet fogadni a Trigger In feliratú bemeneti csatlakozóján. Amennyiben a Polygon400-as fej egy legalább 2V amplitúdójú négyszög jelet érzékel a csatornán, léptet egyet az előre meghatározott (és feltöltött) térbeli mintázatok között. Ennek a mechanizmusnak a segítségével vagyunk képesek egy térbeli mintázatot tetszőleges időbeli mintázattal párosítani. A programmal nemcsak a Polygon400-as fejet, hanem az időbeli mintázatot végrehajtó lézerkészüléket (Roithner LaserTechnik RLTMDL-447 1-500 mW, 447 nm Blue laser Diode modul[7]) is vezérelni kell a felhasználó által meghatározott analóg jellel. Ez szintén a NI-DAQ eszköz segítségével történik. Terveink között szerepel, hogy a felhasználónak a NI-DAQ eszköz és a program segítségével lehetősége nyíljon az elektrofiziológiai mérések során az erősítő jelének felvételére és online, valós idejú feldolgozására. A CD-n a mellékletekben található program verziója a National Instruments DAQmx 15.1-es verzióját használja.
6.4 A SZAKIRODALOM KRITIKAI ELEMZÉSE A fejezet során két publikációt fogok kiemelni a Polygon400-as készülékkel kapcsolatban. A két cikk jól szemlélteti a készülék felhasználásának két végletét. A két cikk értékelése után a szakirodalomból kiemelt alkalmazási területeket fogom bemutatni. Az első cikk Natalia V De Marco García, Rashi Priya, Sebnem N Tuncdemir, Gord Fishell & Theofanis Karayannis 2015. feburár 5-én, a Nature Neuroscience című lapban megjelent cikke, "Sensory inputs control the integration of neurogliaform interneurons into cortical circuits” 16
címmel [3], (magyar fordításban: „Az érzékszervi bemenetek segítik a neurogliaform interneuronok kortikális hálózatokká alakulását”). A cikkben a Polygon400 segítségével arra keresték a választ, a szomatoszenzoros kéregben lévő Reelin-kifejező neurogliaform sejteken anatómiai módszerrel kimutatott talamikus serkentő kapcsolatok egyben funkcionális kapcsolatok-e. Ennek érdekében egy VGlut2 promóter + loxp.stop.loxp + channelrhodopsin-2 vektort tartalmazó virális injekciót adtak a talamuszba, így szelektíven megjelölték a talamikus serkentő idegsejteket. A talamikus serkentő sejtek (afferensek) megvilágítás hatására serkentő bemenetet váltottak ki a velük összeköttetésben lévő Reelin-kifejező kortikális sejteken. A munkacsoport ezzel a kísérlettel verifikálta, hogy az általuk talált anatómiai kapcsolatot egyben funkcionális kapcsolat is. A fenti kísérletben a Polygon400-as szerepe egyszerűen az volt, hogy kék fényt bocsásson a szeletre. A kutatók nem használtak sem térbeli, sem időbeli stimulálást. A fenti cikk tükrözi, hogy a Polygon400-as eszköz aránylag egyszerű műveletek kivitelezésére alkalmas, azonban arra is rámutat, hogy a Polygon400 irodalomban fellelhető alkalmazási módjai mennyire felszínesen érintik az eszköz egyébként rendkívül változatos felhasználását. A második publikáció Benjamin W. Avants, Daniel B. Murphy, Joel A. Dapello and Jacob T. Robinson szerzőktől származik, melynek címe: "NeuroPG: Open source software for optical pattern generation and data acquisition"[4] (magyar fordításban: „NeuroPG: Nyílt forráskódú szoftver, optikai mintázatok generálására és adatrögzítésre”). A cikk szintén 2015. február 9-én jelent meg a Frontiers in Neuroengineering című lapban. A szerzők felismerték, hogy a neurális tevékenység szelektív, optogenetikán alapuló tanulmányozásához a kutatóknak egyre növekvő szükségük van specializált szoftverre, mely hozzásegíti őket ahhoz, hogy elektrofiziológiai kísérleteiket össze tudják hangolni optikai stimulációs mintázatokkal[4]. Ezen igény kielégítésére kifejlesztettek egy NeuroPG nevű, nyílt forráskódú szoftvert MATLAB környezetben. A szoftver vezérli a Polygon400 típusú készülékeket, megjeleníti a kísérletben használt mikroszkóp kameraképét, továbbá képes adatrögzítésre (például egy erősítőből érkező adatok), illetve mintázatok generálására a készülék számára. Felmerül a kérdés, hogy számunkra miért nem kielégítő a NeuroPG funkcionalitása? Miben tud az általam készített program többet nyújtani? 17
A NeuroPG fejlesztése során a tervezők és kísérletezők sejtkultúrákon dolgoztak, melyben a látási viszonyok messze nem olyanok, mint egy valós in vitro mérés során használt szeletben. A program fejlesztése során ezt figyelembe kellett vennem. Az MTA KOKI Agykéreg Kutatócsoportjában elvégzett kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy miután whole-cell patch clamp elvezetés során megfigyeltük a sejtre érkező bemeneteket és az általuk generált kimeneteket, gyorsan és térben pontosan meghatározott területeken kell feltérképezni a sejt környezetét (fénystimulálással). Ehhez elengedhetetlen, hogy a kamera képét, illetve a felületet, melyen a mintázatokat meghatározzuk, egymás fölé lehessen illeszteni, bizonyos áttűnési százalék mellett. Ennek köszönhetően úgy tudunk rajzolni és megvilágítandó területet tervezni (melyre a NeuroPG szoftverben nincs mód), hogy közben látjuk a sejtünk környezetét, hiszen ez fog minket vizuálisan vezetni a különböző mintázatok létrehozásában. A NeuroPG program további, számunkra jelentős hiányossága, hogy nem lehetséges vele időbeli mintázatokat meghatározni. Ráadásul ennek a térbeli mintázatnak a komplexitását a Polygon400 kapacitásbeli paraméterei is korlátozzák (maximum 96 darab 1 bites képet tud meghatározott váltási idővel kivetíteni), ráadásul a térbeli mintázatok heterogén időzítése nem lehetséges. Ezért az találtuk ki, hogy mind a Polygon400-at, mind a külső lézerdiódát az általam megírt programmal fogjuk vezérelni. Ennek köszönhetően függetlenítettük a térbeli mintázatokat (Polygon400) az időbeli mintázatoktól (lézerdióda), tovább elértük, hogy a Polygon400 fejben tárolt mintázatokat tetszés szerint, pontosan meghatározott módon tudjuk váltogatni. A program segítségével heterogén időzítés mellett a lézerdiódából kijövő fény erősségét is dinamikusan tudjuk változtatni. A NeuroPG tehát nem tudja ellátni azokat a feladatokat, melyekre összetettebb kísérletek során elengedhetetlen szüksége van egy Polygon400-assal dolgozó elektrofiziológusnak. Ezek a feladatok a teljesség igénye nélkül:
MATLAB környezettől független kísérleti felállás szolgáltatása
Automatizált mintázat generálási lehetőségek
Külső lézer vezérlése
A továbbiakban bemutatok néhány alapvető kísérletet, melyet a Polygon400 készülékkel végeztek kutatók[5].
18
6.1. ábra: Transzfektált hippokampális neuronok optogenetikai aktiválása Polygon400-assal. A) kép: Patch clamp felvétele a channelrhodopsin generálta áramnak, mely a Polygon400-asból kiadott kék LED fény hatására aktiválódott. B) kép: Egy akciós potenciál kialakulása, illetve a hozzá tartozó voltage clamp felvétel, melyet egy 0.5ms hosszú kék LED fény stimulációval váltottak ki, szintén Polygon400assal. Dr. Hans van Hooft, University of Amsterdam
6.2. ábra: Szinaptikus bemenetek optogenetikai stimulációja Polygon400-assal Fény által kiváltott gátló posztszinaptikus áramok felvétele, transzgénikus egérből. Az állat GABAerg idegsejtjei tartalmazták a ChR2-t. A posztszinaptikus sejt nem GABAerg, azaz nem tartalmaz ChR2-t sem. A kék vonalak a megvilágítás színét és időtartamát jelzik. A Spot 2 terület megvilágítása nem váltott ki gátló áramokat a sejten. Dr. Wataru Inoue, University of Western Ontario, Canada
19
6.3. ábra: Transzgénikus egér Gyrus Dentatusának stimulációja Polygon400-assal A felső ábrán a Gyrus Dentatus ismétlődő stimulációját látjuk, egyre növekvő kör alakú mintával. A mintákat addig növelték, amíg akciós potenciált nem sikerült kiváltani a megfigyelt sejten (alsó ábra). Dr. Geoffrey G. Murphy, Molecular & Behavioral Neuroscience Institute, Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan
6.4. ábra: Channelrhodopsin-2 kifejező hippokampális idegsejtek depolarizációjának feltérképezése Polygon400-assal Patkány neuronokat transzfektáltak CamKII-ChR2-GFP lentivírussal. A sejt szómáján mérték whole cell patch clamp módszerrel az aktivitást, melyet a négyzet alakú mezők megvilágításával váltottak ki. A rózsaszín négyzetek erősségge jelzi, hogy a nyugalmi membránpotenciálhoz képest mennyit változott a sejt membránjának potenciálja az adott terület megvilágításának hatására. Dr. Jacob T. Robinson, Departments of ECE and BioE, Rice University, Houston, Texas
A kísérletekből megállapíthatjuk, hogy bár a szakirodalomban található alkalmazások változatosak, kutatócsoportunk igényeit nem elégítik ki, és szükségszerű egy olyan rugalmasabb, kezelhető eszköz, szoftver kifejlesztése (elsősorban neurobiológusok és elektrofiziológusok számára), mellyel a bonyolultabb optogenetikai kísérletek is könnyen kivitelezhetőek.
20
7 TERVEZÉS RÉSZLETES LEÍRÁSA A tervezés első lépéseiben igen sok bevezető kísérletet végeztük a Polygon400-as eszköz használatával kapcsolatban. Ezek a kísérletek leginkább az eszköz olyan tulajdonságait voltak hivatottak felfedni, melyek leginkább befolyásolhatják egy sikeres kísérlet kimenetét. A továbbiakban ezeket a (számunkra) releváns tulajdonságokat sorolom fel.
7.1 A BEVETÍTETT FÉNY SZÓRÓDÁSA, A FELMERÜLŐ HÁTTÉRFÉNY ELLENŐRZÉSE Az egyik legalapvetőbb paraméter, melyet ismernünk kellett a Polygon400 eszközről, az a szeletre érkező fény szóródásának mértéke. Ennek ellenőrzésére a következő kísérletet végeztük el: Lokális vírusbeadással Channelrhodopsin-2 fehérjét fejeztettünk ki Bl6 egerek hippokampuszában található piramissejtekben (olyan vektort juttattunk az egér hippokampuszának piramissejt rétegébe, melyben a ChR2 gén CamKIIα promóterrel van kapcsolva). Ezt követően az egér agyából nyert in vitro hippokampális szeletekben, whole-cell patch clamp current clamp konfigurációban rögzítettük egy piramissejt által generált kimeneteket a hippokampusz piramissejt rétegében (stratum pyramidale). Ezt követően megvilágítottuk a sejt közvetlen környezetét és azt tapasztaltuk, hogy a sejtre serkentő áramok érkeznek a környező, megvilágított piramissejtekből. A következő lépésben a megvilágítással elindultuk a piramissejt rétegre merőlegesen kifelé, az alveus felé. Abban a pillanatban, hogy a megvilágított területtel átléptük a hippokampusz legkülső rétegét, az alveus határát, a sejtünkre érkező aktivitás megszűnt, nem észleltünk további serkentést. Ez azt mutatja, hogy a megvilágítás annyira kis távolságra szóródik, olyan alacsony fényerősséggel, hogy még ilyen rövid távolságban (alveus egyik oldaláról a másikra) sem képes környező sejteket aktiválni. A kísérletből azt a következtetést vontuk le, hogy a szeletre érkező fény szóródása nem jelentős, így a szóródó fény ugyan létező jelenség, de nem túl magas lézerintenzitás mellett nem fog gondot okozni a mérésekben, illetve a megvilágításunk kellően lokális, nem kell a szóródó fény okozta hálózati stimulációval számolnunk. A kísérlet során észrevettük, hogy amennyiben a Polygon400 eszköz, illetve a bemenő lézerfény is be van kapcsolva (azaz a megvilágítás állandó), még a térbeli mintázat hiányában is (a 21
szeletre vetített fekete kép) van háttérfény. A Polygon400 eszköz bekapcsolt állapotban, fekete kép megjelenítésekor is világítja a szeletet. Ez a hatás nem megengedhető a kísérletekben, ugyanis jelentősen befolyásolhatja a sejtre érkező bemeneteket és az általa generált kimeneteket. Annak érdekében, hogy kijavítsuk a hibát, úgy döntöttünk, a lézerfény kezelését nem a Polygon400 eszközre bízzuk, hanem a program maga fogja külön vezérelni a külső lézerdiódát. Ezzel megszüntettük a „háttérfényt”, továbbá elértük, hogy a Polygon400 vezérelje a térbeli, a külső lézerdióda pedig az időbeli mintázatokat.
7.2 A LÉZERDIÓDA VÁLASZIDEJE A program tervezésekor szükségünk volt arra az ismeretre, hogy mégis milyen sebességet, milyen felbontást várhatunk a temporális (időbeli) mintázatok meghatározásakor. Ez egyrészt azt foglalja magában, hogy a lézert milyen gyorsan tudjuk vezérelni, másrészt azt, hogy mi az a legkisebb értelmes időegység, amellyel még érdemes stimulálni, alatta viszont nem. Az első kísérlet tehát az volt, hogy a mikroszkóp tárgylencséje alá behelyeztünk egy fotodetektort, melynek jelét rögzíteni tudtuk. Ezután a lézert egy 0-5 V amplitúdójú, 50 Hz-es négyszög jellel vezéreltük 3 percig. A négyszögjel hatására a lézerdióda rendre 0 és 100%-os teljesítménnyel adott ki magából fényt. A kijövő fény a fotodetektorba vetült, ennek jelét, valamint a lézerdiódára csatlakoztatott vezérlőjelet rögzítettük (mielőtt még a lézerdiódába érkezett volna) két különböző csatornán. A mérést követően a kétcsatornás felvételt offline elemeztük, és arra kerestük a választ, hogy a lézer az 5V-os jel felszálló ágának észlelése után milyen késleltetéssel adja ki magából a 100%-os teljesítményt. Az elemzés során azt találtuk, hogy ez a válaszidő vagy késleltetés várható értéke 30 μs, tehát elfogadhatóan alacsony. Ez az érték természetesen lézerdiódáról lézerdiódára eltérhet.
22
7.3 AZ IDŐBELI STIMULÁCIÓ FELBONTÁSA További feladat volt meghatározni, hogy mi az az időbeli felbontás, mellyel lehetőségünk van stimulációs mintázatokat létrehozni. A válasz abban rejlik, ahogyan a lézervezérlés történik. A következő lépésben arra kerestük a választ, hogy milyen időbeli felbontással tudjuk a stimulációs mintázatokat meghatározni. Az időbeli felbontás minél nagyobb, annál pontosabban tudunk időbeli mintázatokat definiálni, illetve a meghatározható legkisebb időtartam is kisebb. Ennek a legrövidebb időtartamnak, mellyel stimulálni tudunk különböző tények szabnak alsó korlátot. Az egyik a biológiai rendszerek válaszideje, a mi esetünkben a channelrhodopsin kinetikájából adódó sebesség. További határt szab az időbeli mintázatok felbontásának az eszközeink sebessége, mind a NI-DAQ kártyán tárolható adatpontok mennyisége, mind pedig a lézerdiódánk felfutási ideje. 7.1. ábra: A channelrhodopsin fehérje fotociklusa. A P0-P4 fázis létezését spektroszkópiával nyert adatok támasztják alá. A P4 fázisból a P0-ba való átmenet, az reizomerizáció nagyjából 5 másodpercet vesz igénybe. Ez azt jelenti, hogy ha egy in vitro szeletet elég gyorsan stimulálunk és az összes rendelkezésre álló channelrhodopsin fehérjét kinyitjuk, akkor egy átmeneti, sötét szakaszba érünk. A fentiek további okot szolgáltatnak a tapasztalataink mellett arra, hogy miért nem érdemes 100 μs-os időegység alatt többször stimulálni. Kép: Bamann et al (2008), J. Mol. Biol. vol. 375, pp 686-
Tekintsük tehát a biológiai korlátait a kísérleteinknek. Tudjuk, hogy a channelrhodopsin 694.
kinetikája miatt a csatorna nem képes ennél gyorsabban helyreállni a nyugalmi állapotába (7.1. ábra). A leggyorsabban záródó channelrhodopsin-okat sincs értelme 200 Hz-nél gyorsabban hajtani [9], léteznek azonban úgynevezett ultragyors channelrhodopsin-ok, melyek akár 200 Hzcel is képesek kisütni az idegsejteket[10] [11] [12]. Tudjuk továbbá, hogy a channelrhodopsin fehérjének nyílása is körülbelül 100-150 μs ideig tart. Az eszközeink sebességét is figyelembe kellett vennünk. Tudjuk, hogy mivel a lézerdiódánk maximum teljesítményre való felfutási ideje kb. 30 μs, ezért ezzel az értékkel megegyező
23
nagyságrendben nincs is értelme dolgozni, hiszen nem lehetnénk benne biztosak, hogy a lézer ténylegesen a meghatározott teljesítménnyel dolgozik. Végezetül pedig tekintsük az A/D kártyánk memória kapacitását. A kártyára a következő módszerrel töltöm az adatokat: kezdetben a felhasználó egy szöveges kifejezés segítségével meghatározza az úgynevezett Pulse Traint, mely lényegében a kimenő jel alakja. Ezt a szöveges kifejezést feldolgozom úgy, hogy minden egyes időpillanat után egy adatpontot írok a NI-DAQ eszköz bufferébe, mely lényegében megmondja, hogy az adott csatornán, az adott pont által képviselt időpillanatban milyen érték kerüljön a kimenetre. Miután ezeket az adatpontokat felsoroltam az eszköz számára, azt is megmondom, hogy mekkora foutput frekvenciával olvassa ki a bufferből ezeket a pontokat. Amennyiben ez a frekvencia foutput = 106 Hz, ez azt jelenti, hogy egy másodperc alatt egymillió adatpontot olvasson ki a bufferből. Mivel a kiolvasás frekvenciája időben állandó, ez azt jelenti, hogy egy adatpont a bufferben egy mikroszekundumot fog képviselni. Mivel az foutput frekvenciával közvetlenül állítható az időbeli felbontás, ezért elég a lézerkezelési algoritmust egyszer megírni, a frekvencia pedig paraméterezhető. Az általunk használt USB X 6353[8] típusú készülék maximális, hardveresen generált órajele 100 MHz (foutput = 108 Hz), ami százmillió adatpontnak felel meg másodpercenként, amelyek mindegyike ilyen módon 10 nanoszekundum hosszú időintervallumot képvisel. Láthatjuk tehát, hogy az időbeli felbontásnak a legszigorúbb korlátja a channelrhodopsin kinetikájából származó 100-150 μs volt, ezért az elvégzett kísérletek során a kutatócsoport foutput = 104 Hz frekvenciát használt, azaz az időbeli felbontás 100 μs volt.
24
7.4 A POLYGON400-AS KÉSZÜLÉK PROGRAMBÓL VALÓ VEZÉRLÉSE Amikor egy kutatócsoport megvásárol egy Polygon400 készüléket a Mightex cégtől, akkor a készüléken és a kézikönyvön kívül egy PolyLite nevű programot is kap, mellyel vezérelni lehet a készüléket. A gond a PolyLite-tal az, hogy csakúgy, mint a NeuroPG, nem képes bizonyos korlátokon (maximum 96 db. vetített kép, meghatározott időzítéssel) túl időbeli stimulációs mintázatok megalkotására. Ezért tehát nagyjából 4 hónappal a dolgozat írása előtt úgy döntöttünk, hogy megvásároljuk a Mightex cégtől azt a 400 eurós árú szoftver fejlesztői csomagot (SDK), mellyel saját készítésű programból tudjuk vezérelni a készüléket.
7.2. ábra. A mérésvezérlő program. A képen a programot láthatjuk működés közben. Az egyes ablak a program vezérlője, innen indítható a protokoll. A kettes ablak a térbeli mintázatok rajzolásának helye. A hármas ablak az időbeli mintázatok meghatározására szolgál. A négyes ablak a felhasználó felé jelzi a futási üzeneteket.
Ez az SDK egy C++ nyelven íródott DLL (dynamic link library), melyben a Polygon400 fejnek kiadható utasítások találhatóak. Az SDK-hoz tartozott természetesen egy dokumentáció is (a dolgozathoz tartozó CD-n a Mellékletek könyvtárban található Mightex Polygon400 SDK Manual.pdf néven). A program tervezésével kapcsolatban az egyik legfontosabb döntés az volt, hogy milyen nyelven íródjon, C++, esetleg magasabb szintű nyelven, például C#.Net, VB.Net vagy Java. A programot végül C#.Net és Visual Basic.Net nyelveken írtam, kihasználva a .Net keretrendszer óriási előnyeit grafikus felhasználói felületek tervezésének terén. Azért döntöttem a .Net nyelvek mellett, mert ezek nem sokkal lassabbak a számunkra fontos területeken, mint a C/C++, viszont
25
lényegesen gyorsabban lehet velük felhasználói felületet tervezni, melyre nekünk nagy szükségünk van. A másik megfontolás az volt, hogy nekünk leginkább olyan felületre lesz szükségünk, amin rajzolni lehet, ezek a rajzolt területek pedig objektumokként foghatóak fel, így a .Net nyelvek objektum orientáltsága nagyon nagy előnyt nyújtott. A programot a .Net keretrendszer 4-es verziójával készítettem.
7.5 A LÉZERDIÓDA VEZÉRLÉSE KÜLSŐ CSATORNÁVAL A feladat megoldása során tehát megállapítottuk, hogy szükséges egy olyan eszköz, mely segítségével a lézerkészülékünket tudjuk vezérelni. Az MTA KOKI Agykéreg Kutatócsoportjában, melyben a program készült, egy Roithner RLTMDL-447 [7] kék lézer dióda lézerkészülék van, melyet egy [0-5] V tartományban elhelyezkedő jellel lehet a [0-100] % teljesítmény (maximális teljesítménye 100mW) leadására beállítani. Ennek a lézervezérlő (és más analóg) jelnek a leadására egy National Instruments USB X 6353[8] típusú analóg és digitális jelek generálására alkalmas eszközt használtunk. Ennek előnye, hogy mivel USB-n keresztül szinte bármilyen számítógépre csatlakoztatható, felhasználható olyan számítógépeken is, melyeken a patch clamp felvétel történik anélkül, hogy megakadályozná az erősítőből bejövő jelek más programmal való rögzítését.
26
7.6 A POLYGON400-AS KÉSZÜLÉKRE FELTÖLTHETŐ KÉPEK FELBONTÁSA, A FELTÖLTÉS MENETE A Polygon400-as készüléket USB csatlakozón keresztül kapcsolhatjuk a számítógépünkhöz, így utasításokat és vetíteni való képeket küldünk az eszköznek. A feltölthető képek felbontása: pontosan 684 pixeles magasság és 608 pixeles szélesség. A képek formátuma bitmap, bitmélysége 1, 4, 8 és 24 bites lehet. A feltölthető képek száma 96/bitmélység, tehát ennek megfelelően 96, 24, 12, illetve 4 db lehet. A képeket egy gyárilag beállított korrekciós függvénnyel torzítja az eszköz. A feltöltés kétféleképpen történhet:
Color Image módban, mely során 24 bit bitmélységű képet kell feltöltenünk, melyet állandó lézerfény mellett az eszköz bevetít a tárgylencse alá a tárgylemezre.
Pattern Sequence módban, melynek során a kivetíteni kívánt képeket egy állandó bitmélység mellett fel kell töltenünk az eszköz saját memóriájába, illetve fel kell töltenünk a vetítés paramétereit.
A vetítés paraméterei pedig a következőek:
A feltöltött képek bitmélysége
A feltöltött képek száma
A képek közötti váltási parancs típusa (kézi, automatikus időzítés, külső jel)
A képek váltása közt eltelő idő
Egy képre való váltás és annak megjelenítése között eltelő idő (késleltetés)
A képek vetítésének időtartama
Mivel a kivetített képeket csak azonos ideig tudja megjeleníteni az eszköz, ezért mi azt a lehetőséget választottuk, hogy a program a National Instruments USB eszközön keresztül küldje ki a képváltásra felszólító TTL jelet. Ennek segítségével minden képet annyi ideig mutat és olyan temporális mintázatban hajthatja a lézert a lézervezérlő csatornával, ahogy azt a felhasználó kívánja.
27
7.7 A TÉRBELI MINTÁZATOK MEGHATÁROZÁSA A térbeli mintázatok meghatározásához szükség van egy ablakra, melyben rajzeszközök, illetve automatizált eljárások segítségével létre lehet hozni a kívánt, vetíteni szánt képet. Ennek megoldására egy nyílt forráskódú rajzasztal projektből, a KLONK DrawingBoard [6] projektből indultam ki. Ez a projekt egy vektorgrafikus rajzolóprogramot valósít meg, mely alapvető exportálási mechanizmusokkal rendelkezik. Ezt a projektet úgy módosítottam a továbbiakban, hogy minél jobban illeszkedjen az igényeinkhez, valamint egy széleskörű hibajavítást is végeztem a kódon. Az ablak (7.3. ábra) tehát tartalmaz egy rajzasztalt, egy menüsort, egy státuszsort és a rajzasztalon megjelenő areák tulajdonságait megjelenítő hálót.
7.3. ábra: A Drawing Board vagyis rajzasztal, melynek segítségével a térbeli mintázatok határozhatóak meg.
28
Az ablak áttetszősége százalékban állítható a jobb felső sarokban. Erre azért van szükség, hogy a felhasználó a mikroszkóp kameraképét a rajzasztal alá tudja helyezni, így biztosítva a kézzel való rajzolás pontosságát. A rajzasztalon minden esetben látható két szaggatott vonallal jelzett terület. A kék szaggatott vonallal jelzett terület mutatja a felhasználónak a Polygon400 eszközre feltöltött kép határait. Ezen a határon kívülre is lehet rajzolni, azonban a kék szaggatott vonalnál levágom a kimeneti képet. A rózsaszín szaggatott vonal jelzi a kameraképen látható terület határait. Ennek a rózsaszín területnek a mérete és elhelyezkedése a kék vonallal jelzett területen belül kameráról kamerára változó, így ennek az Effective Pixel Range (EPR) beállításnak a Tools->Options menüpont ad otthont. A rajzasztal rendelkezik még egy gyors elérésű eszköztárral is, mely a leggyakoribb műveletek (téglalap, ellipszis, háromszög, vonal rajzolása, stb.) számára biztosít helyet az ablakban. Az ablak menüsorában foglal többek között helyet a Pattern Generation menüpont, melynek segítségével automatizált módon tudunk mintázatokat generálni, mint például egy NxN-es rács generálása az EPR-en belül, egy terület megadott idő alatt való növelése, egy terület mozgatása trajektórián és más egyéb eljárások. A felhasználónak lehetősége nyílik arra is, hogy egyes területeket vagy akár egész térbeli mintázatokat is elmentsen, illetve betöltsön a programba. 7.7.1
A kamera látómezeje, az Effective Pixel Range (EPR)
Mint említettem, a Polygon400-as készülék képének vetítésekor figyelembe kell venni, hogy a különböző típusú kamerák különböző méretű területeket képesek a számítógép számára közvetíteni. Ezt legjobban a 7.4. ábra mutatja be. Tovább bonyolítja a helyzetet, hogy az EPR megjelenítése a számítógépen futtatott programtól és annak megjelenítő ablakától függően más és más torzításokkal jelenhet meg. Ahhoz, hogy a felhasználó úgy tudjon rajzolni a kamerakép megjelenítő szoftver felé helyezett ablakon, hogy az ténylegesen úgy jelenjen meg, ahogyan terveztük, ezeket a torzításokat ellensúlyoznom kell.
29
7.4. ábra. A zöld téglalap jelöli azt a területet, melyről fotonok érkezhetnek a mikroszkóp tárgylencséjébe. A kék téglalap azt a területet jelöli, amelyet a Polygon400-as DMD mátrixa lefed, más szóval ahova az eszköz fényt tud vetíteni. A rózsaszín téglalap azt a területet jelöli, melyet a mikroszkópra csatlakoztatott kamera képes felvenni és a számítógép felé közvetíteni. Az utóbbi területet nevezik Effective Pixel Range-nek. A három téglalap mérete és egymáshoz viszonyított helyzete kameráról kamerára változó.
A feladat megoldásához két ismeretre volt szükségem: 1) pontosan mekkora a kék téglalapból látott terület, azaz a rózsaszín téglalap. Ennek az ismeretnek a meghatározásához a Polygon400 készülék kézikönyvének függeléke nyújt segítséget (a dolgozat hátuljában található CD-s mellékleten a Mellékletek könyvtárban a Mightex Polygon400 DSI Software User Manual_v1.2.0.pdf néven található). Lényegében a készülék egy vonalzót vetít a kék téglalap teljes területére, majd a felhasználó leolvassa a monitorról a képernyőn látható vonalzó legnagyobb értékeit, melyek a rózsaszín téglalapot fogják meghatározni. 2) Miután a fenti ismeretet a felhasználó a Tools->Options menüpontban megadta, szükségem lesz arra is, hogy pontosan ezt az X:Y oldalarányú rózsaszín téglalapot a képernyőn milyen arányban jeleníti meg. Ennek meghatározásához szintén az előbb említett menüpontban található Set Camera Image Viewport gomb nyújt segítséget, melynek megnyomása után bekövetkező két bal egérgomb kattintással adhatjuk meg a megjelenítő szoftver ablakának bal felső, illetve jobb alsó sarkait. Amennyiben ezek az ismeretek rendelkezésre állnak, a program kiszámolja, hogy pontosan mekkora a torzítás mértéke a valós EPR és a harmadik fél megjelenítő szoftverének ablaka között,
30
melynek inverzével a Polygon400 eszközre való feltöltés előtt transzformálni kell a kimenő képeket.
7.8 A TEMPORÁLIS MINTÁZATOK MEGHATÁROZÁSA: A TIMELINE CONTROL Az időbeli mintázatok meghatározásához szükség volt kifejlesztenünk egy olyan felületet, mely egyrészt felhasználóbarát és rugalmas, másrészt szinte bármilyen időbeli mintázat meghatározására alkalmas. A feladat megoldására azt találtuk ki, hogy olyan „időszalagot” hozunk létre (7.5. ábra), melyen a területeket (melyek a térbeli mintázatot alkotják) és a képek (melyek az időbeli egységei a mintázatnak) egyszerre kezelhetőek.
7.5. ábra: Az idővonal ablak. Ezen a felületen láthatja a felhasználó a jelenleg beállított stimulációs protokollt.
A felületen található tehát egy menüsor, egy táblázat, illetve a jelenleg beállított kimenő lézervezérlő jel. A menüsorban találhatóak a legfontosabb opciók:
Új protokoll létrehozása, jelenlegi mentése, korábbi betöltése.
Új időbeli mintázat létrehozása, jelenlegi mentése, korábbi betöltése, mintázat betöltése egy eseményfájlból (ld. később), vetítés beállítása
Mintázatok automatikus generálása (pl. véletlenszerű keverés)
Kimenő lézerimpulzusra vonatkozó beállítások (pl. paraméterezésük)
31
Az idővonalon egy oszlop egy képet jelképez. Egy képhez tartozó beállításokat az oszlop fejlécére kattintva érhetjük el (7.6. ábra).
7.6. ábra: Kép beállítások. A kép állapotát, illetve hozzá tartozó lézervezérlő jelét láthatjuk.
A képhez tartozó beállítások:
Kép neve
Feltöltésre kerüljön-e a kép vagy sem
A képhez tartozó lézervezérlő jelet leíró szöveg
A lézervezérléshez tartozó kezelők: törlés, mentés, beillesztés, generálás, másolás
A képhez tartozó kimenő lézerjel
A kép univerzális mintaként való beállítása
Minden képhez tartozhat egy analóg jel, melyet az előre beállított kimeneti csatornán keresztül küld ki a program. Ez a jel fogja a lézerdióda tápegységét vezérelni. Ennek az analóg jelnek az alakját egy egyszerű szöveges utasítással lehet meghatározni, melyet Reguláris Kifejezések segítségével átalakítok az NI-DAQmx meghajtószoftver számára értelmezhető adattá. Az idővonalon megjelenő minden sor egy, a jelenlegi protokollban már meghatározott területet jelöl. A sorok és oszlopok metszeteiben egy téglalap található, melynek színe jelzi, hogy az adott képen (melyet az oszlop jelöl), megjelenik-e az adott sor által jelzett terület (zöld szín – megjelenik, piros szín – nem jelenik meg). Mielőtt a felhasználó feltölti a térbeli mintázatokat a Polygon400 eszközre, a program legyártja a megfelelő kimeneti képeket ennek a táblázatnak a segítségével, elmenti azokat a merevlemezre, végezetül felölti őket USB csatlakozáson keresztül az eszköz belső memóriájába. 32
A képek megjelenítéséhez szükséges korrekciója az eszköz belső processzorával történik, a felhasználó számára nem látható. A létrehozott térbeli és időbeli mintázatok mellé a Polygon400 eszköznek meg kell adnunk, hogy milyen módon kívánunk váltogatni a képek között. Az erre alkalmas ablakot a 7.7. ábra mutatja.
7.7. ábra: Az időbeli mintázat beállításának ablaka. Segítségével a Polygon400 készüléken beállíthatjuk, hogy hogyan akarunk a képek között váltogatni, milyen bitmélységű képeket fogunk használni, illetve ha az automatikus váltást használjuk, akkor a váltás paramétereit is itt tudjuk állítani.
33
7.9 LÉZERVEZÉRLÉS ÉS MEGJELENÍTÉS A teljes időbeli stimuláció meghatározásához arra van szükségünk, hogy a legfeljebb 96 db különböző mintázat mindegyikéhez egyenként lehessen időbeli mintázatot rendelni. Ezt úgy érhetjük el, hogy a korábban megtárgyalt módon a kívánt kép beállításai között átállítjuk a Pulse Train Definition nevű szövegdoboz tartalmát. A szövegdoboz tartalmát a következő két részből álló reguláris kifejezéssel értelmezem: (1|0|0[\.,]\d+)\((\d+|\d+[\.,]\d+)\) Ez a kifejezés a következő szöveges mintázatot képes felismerni:
A mintázat kezdődhet 1-essel, 0-val vagy 0-val, amit egy pont vagy egy vessző után számok követnek
Ezután pontosan egy darab nyitó zárójel következik
A zárójelet követhetik: számok vagy számok, melyek között tizedespont vagy vessző van
Ezután pontosan egy darab záró zárójel következik
A zárójel előtti számok tehát a kimenő csatorna teljesítményét jelölik: 0: 0% - 1:100%-ig. A zárójelben megadott szám a pulzus időtartamát jelöli milliszekundumban. A felhasználó a program beállításai között beállíthatja a National Instruments A/D konverter kártyájának fizikai csatornái közül azt a kettőt, melyeken a lézervezérlő jel, illetve a Polygon400 eszköz számára kiküldött, képek között váltogató TTL jel kimegy. Amennyiben a felhasználó a 7.7. ábrán feltüntetett ablakban nem külső (external) triggerelést választ ki, a Polygon400 eszköz nem fog reagálni a kimenő TTL jelre. Az előzményekben megtárgyalt okok indokolják azt, hogy a legkisebb pulzusszélesség, melyet a felhasználó választhat, 100 μs. A továbbiakban a 7.8. és 7.9. ábrán bemutatok két egyszerű, de hasznos példát az időbeli mintázatok meghatározására. A 7.10. ábrán egy bonyolultabb időbeli mintázatot láthatunk.
34
7.8. ábra: Egy felhasználó által meghatározott Pulse Train. A fekete szaggatott vonalak jelzik a képek közötti váltást. A zöld trace mutatja a kimenő jel alakját és időzítését. A felhasználó által (egy képre beállított, majd kiterjesztett) beállított szöveg: 3*[0(20)1(20)]. A fenti string hatására a kimenő csatornán 0 V, 20ms-ig, majd 5V (100%) 20ms-ig háromszor ismétlődik.
7.9. ábra: Szintén egy felhasználói Pulse Train. Egy pulzus szélessége itt 200 μs. A felhasználói string: 3*[0(19.8)1(0.2)]0(19.8).
7.10. ábra Egy bonyolultabb mintázat. Sem a frekvencia, sem a pulzusszélesség nem állandó. A különböző térbeli mintázatokat lehetőség van különböző időbeli mintázattal társítani. A felhasználói stringek: a) b) c) d) e)
0.2(10) 0.4(10) 0.5(10) 0(2) 0.6(10) 0.8(10) 1(10) 0.2(10) 0.4(10) 0.5(10) 0(2) 10*[1(1) 0(9)] 0.2(10) 0.4(10) 0.5(10) 0(2) 0.6(10) 0.8(10) 1(10) 0.2(10) 0.4(10) 0.5(10) 0(2) 0.2(10) 0.4(10) 0.5(10) 0(2) 0.6(10) 0.8(10) 1(10)
A jövőben a fenti kifejezések mérete a jelenlegi töredékére csökkenne.
35
8 ÉRTÉKELÉS Az elmúlt félév során tehát sikerült egy olyan mérésvezérlő programot létrehozni, mellyel gyorsan, pontosan és a gyári megoldásokhoz képest egyszerűbben tudunk térben és időben változó mintázatokkal optikai stimulációt végrehajtani. A dolgozat előkészületeit már az önálló laboratóriumi feladatom során elkezdtem, ez alatt az idő alatt ismerkedtem meg a Polygon400-as eszközzel. A program fejlesztését a kutatócsoporttal együttműködve, Dr. Gulyás Attila felügyelete alatt kezdtem meg 2015 augusztusában.
8.1 A MÉRÉSVEZÉRLŐ JELENLEGI ÁLLAPOTA A program jelenlegi állapotában képes:
tetszőleges térbeli mintázatok tervezésére, melyek maximális mérete 608x648 pixelre korlátozott
nagyon változatos időbeli mintázatok tervezésére, ennek továbbfejlesztése rövidtávú prioritás
A tér- és időbeli optikai stimulációs mintázatokat külön-külön kezelni, párosítani, elmenteni, betölteni
segítségével már nem csak az alapkísérletek (6.4. fejezet) hajthatóak végre, hanem olyanok is, melyek bonyolult mintázatokat igényelnek
a mintázatok időzítése akár 100 μs nagyságrendű is lehet, igény szerint az időbeli felbontás egészen 10 nanoszekundum nagyságrendig növelhető megbízhatóan (100 MHz-es írási sebességig)
tetszőleges mikroszkóphoz, kamerához és megjelenítőhöz illeszkedni, így bármilyen laborkörnyezetben pontos térbeli mintázatok előállítására alkalmas
36
8.2 TOVÁBBFEJLESZTÉSI LEHETŐSÉGEK, TÁVLATI TERVEK Habár a program a jelenleg igen sokféle kísérlet elvégzésére alkalmas, sok területen szeretnénk további fejlesztéseket tenni. Ezek a fejleszteni kívánt területek a következőek:
Egyelőre a program két kimenő analóg csatornát tud vezérelni, az egyiket a Polygon400 eszköz léptetési jelére használjuk fel. Szeretnénk, ha nem csak egy lézerdiódát tudnánk vezérelni, hanem legalább kettőt
Az időbeli mintázatok megadásánál nincsen lehetőség nem pulzusszerű stimulus megadására
Szükség van a térbeli mintázatok csoportosíthatóságára az idővonalon
Szükséges egy (közel) valós idejű adatmegjelenítő modul, mely a patch clamp mérés során az erősítőből kijövő adatokat jeleníti meg. Ez a modul az online (futás idejű) adatfeldolgozás első lépése.
Sokkal több automatizált protokollra van szükség
8.3 KRITIKAI ELEMZÉS Az elmúlt hónapokban megfogalmazódott néhány kritika, melyeket kísérletek segítségével tisztáznunk kell a készülékkel kapcsolatban. Ezek közül a kritikák közül emelek ki néhányat a következőkben, majd bemutatom egy általunk végzett kísérleten keresztül, hogy meddig terjed a vezérlőprogram felhasználhatósága. Mint azt korábban tisztáztam, kísérleteink során optogenetikai módszereket használunk fel ahhoz, hogy a szeleteink fénnyel stimulálhatóak legyenek. Az előkészületek során olyan transzgenikus állatokat állítunk elő, melyek a megfelelő sejtjeinek membránjában channelrhodopsin fejeződik ki. Az egyik kritika a kísérletekkel kapcsolatban az, hogy ez a channelrhodopsin fehérje kifejeződés nem homogén sejtről sejtre, szeletről szeletre, állatról állatra. Ebből adódik az a nehézség, hogy nincsenek olyan univerzális értékek, melyek átfogóak lennének a kísérleteink során. A fentiekkel szemben sajnos nem tudunk addig lépéseket tenni addig, amíg az optogenetikai módszerek nem fejlődnek tovább. Ennek ellenére feltételezzük, hogy az adatfeldolgozás során, amennyiben szem előtt tartjuk azt a tényt, hogy a channelrhodopsin fehérje nem egyenletesen 37
fejeződik ki (melynek köszönhetően univerzális stimulusra eltérő nagyságú válaszokat kap(hat)unk), képesek vagyunk valós következtetéseket levonni. További kritika, hogy két különböző területet megvilágítva nem feltétlen egymástól független válaszokat mérhetünk a sejten. Ez például úgy fordulhat elő, hogyha a megvilágított területeken egy axon halad át. Amennyiben ezt az axont egyszerre több különböző, egymástól függetlennek gondolt területen is megvilágítjuk, előfordulhat, hogy hamis következtetéseket vonunk le. Egyelőre kísérletileg nem tisztázott, hogy sejttesteket, axonokat vagy axon terminálisokat tudunk-e kisütni, vagy pedig ezek valamilyen kombinációját. Végezetül fontosnak tartjuk megjegyezni, hogy nincs pontos ismeretünk arról, hogy a szelet Z tengely irányú stimulációja mennyire érzékeny, milyen mélyre hatol a fény, és milyen mélységig képes választ kiváltani.
8.4 KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK Ebben a fejezetben egy olyan kísérletet mutatok be, melyet az általam fejlesztett vezérlővel végeztünk. Ebben a kísérletben egy CamKIIα promóter + ChR2 állat CA3 régiójában található gátlósejtjéből vezettünk el whole cell patch clamp technikával current clamp konfigurációban. A kísérletek során végig 40-szeres nagyítású tárgylencsét használtunk. Az első szakaszban arra voltunk kíváncsiak, hogy a gátlósejt környezetét megvilágítva mekkora serkentő válaszokat (EPSP, Excytatory PostSynaptic Potential) tapasztalunk whole-cell patch clamp current-clamp konfigurációban a gátlósejten. Ehhez generáltunk egy 5x5-ös rácsot, minden celláját 2 milliszekundum időtartamig megvilágítva. A teljes választ a 8.1. ábrán, illetve az
8.1. ábra: A kísérletben használt 5x5-ös térbeli mintázat mellett leadott 10 Hz-es (2ms pulzus szélesség) stimulációra adott teljes válasz.
38
egyes cellákra adott választ a 8.2. ábrán láthatjuk. Az egyes cellákra adott választ utólagosan, offline értékeltük ki. A kísérlet során a protokollt összesen 30-szor futtattuk le, 3 darab 10 futtatásból álló csomagban. A csomagban lévő futtatások között 5 másodperc telt.
8.2. ábra: A kísérletben patch clamp felvétel alatt tartott gátlósejt sárgával látható a kameraképen. Az egyes cellákra adott válasz átlagos nagysága piros vonallal jelölt. A válaszok közös skálája a jobb alsó sarokban található.
Miután a protokollt 30 alkalommal megismételtük, a válaszokat figyelemmel tartva, kiválasztottunk két pár területet, melyeket külön-külön, majd egyszerre megvilágítva szintén current clamp módban felvételt készítettünk a sejtről. A fenti mérések eredményét kiértékeltük, ezeken keresztül mutatok egy-egy példát a sejten mérhető válaszok sublineáris, illetve supralineáris összegződéséről.
39
8.3. ábra: A két terület, illetve a megvilágításukkal kiváltott válasz a sárga körvonalú sejten. A két terület együttes megvilágításával megnézhetjük a szummációjuk természetét.
A 8.3. ábrán, illetve 8.4. ábrán látható területek összegződése sublineáris, azaz a két terület együtt történő megvilágítása nem vált ki a kettő összegével egyenlő választ a sejtből.
8.4. ábra. A korábban bemutatott területek együttes megvilágítása 2 milliszekundumos időtartamig, szublineáris szummációt eredményez a felvétel alatt tartott sejten. A legnagyobb téglalapban a teljes válasz látható.
40
8.5. ábra: A két terület, illetve a megvilágításukkal kiváltott válasz a sárga körvonalú sejten.
A 8.5. ábrán látható két terület szummációja supralineáris, azaz válaszként nagyobb amplitúdójú jelet mérünk, mintha a két eredeti jelet összeadnánk (8.6. ábra).
8.6. ábra. Az ábrán látható két terület szummációja szupralineáris, azaz nagyobb a sejten mérhető válasz, mint a két komponensének egyszerű összege. A legnagyobb téglalapban a teljes válasz látható.
41
Végezetül pedig bemutatok egy, a sejt rövidtávú plaszticitásáról szóló kísérleti eredményt. A következő ábrák a korábban mutatott sejten történtek, azonban ezúttal a megvilágítást egy másik területen végeztük (8.7. ábra). Itt arra voltunk kíváncsiak, hogy vajon tudunk-e a sejt rövidtávú plaszticitásáról mondani valamit a kísérlet során. A protokoll a következő volt: a kijelölt területen kétféle időbeli stimulációt adtunk le: egy 10 Hz-eset, illetve egy 40 Hz-eset. Mindkét alkalommal a leadott lézer pulzusok szélessége 2 milliszekundum volt. A sejtet current clamp módban tartva, felvettük a rá érkező válaszokat.
8.7. ábra. A korábban említett sejten lefuttatott második protokoll vetítési helye a hippokampusz piramisrétegében, távol a felvétel alatt tartott sejttől.
Amennyiben a megfelelő területet stimuláljuk, illetve elég gyorsan stimuláljuk, rövid távú depressziót kéne tapasztalnunk a sejtre érkező serkentő áramokban. Ez azt jelenti, hogy a stimulálás hatására egymás után kiváltott válaszok amplitúdója csökken az első válasz amplitúdójához képest. Először tehát megnéztük a sejt egy térben nem változó, időben 10 Hz-es stimulálást megvalósító protokollra adott válaszát (8.8. ábra).
42
8.8. ábra: A sejtre adott stimuláció ugyan kezdetben csökkenti a további válaszok amplitúdóját, azonban a harmadik tüskétől kezdve nem csökken a válasz nagysága számottevően.
Miután azt találtuk, hogy a 10 Hz-es időbeli stimulációra nem történik számottevő rövidtávú plaszticitás beli változás, kipróbáltuk, hogy hogyan változik a válasz minősége az időbeli mintázat frekvenciájának növelésére (8.9. ábra).
8.9. ábra: A sejt 40 Hz-es időbeli stimulációra adott válasza. A jobb oldali ábrán, ugyanezen válasz nagyobb nagyításban. Jól látható, hogy rövidtávú depresszión esik át a sejt transzmissziója, a kiváltott válasz amplitúdója folyamatosan csökken.
43
A fenti kísérletekkel tehát bizonyítani kívánjuk, hogy az általunk tervezett vezérlőprogrammal ugyanazokat a jelenségeket és kísérleteket el lehet végezni, melyeket hagyományos optogenetikai kísérletek közben vizsgálnánk. Ezeken a jelenségeken kívül azonban azt reméljük, hogy az eszköz paramétereinek verifikálása és az alap, illetve kalibráló kísérletek elvégzése után olyan kísérleteket is tudunk majd tervezni, melyek a dinamikus, térbeli stimulátor, illetve a hozzá fejlesztett mérésvezérlő nélkül nem lennének lehetségesek.
44
9 ÖSSZEFOGLALÁS A dolgozat során tehát bemutattam, hogy az általam készített mérésvezérlő program segítségével hogyan lehetséges olyan optogenetikai kísérleteket megvalósítani, melyek térbeli vagy időbeli mintázata eddig nem volt megvalósítható. Kísérletet tettem annak a bemutatására is, hogy jelenleg milyen kísérleteket tudunk elvégezni a program segítségével, valamint milyen fejlesztések szükségesek a jövőbeli terveink kivitelezéséhez. A feladatok közül az idegsejtek környezetének felderítése egyértelműen és gyorsan megoldható. Természetesen mivel a mérésvezérlő kísérleti szakaszban van (sok kalibráló kísérletet kell még elvégeznünk), csak egyfajta vírust juttattunk az állatainkba, így csak egyféle sejttípust (piramissejtek, akik serkentő bemeneteket adnak) tudtunk fénnyel serkenteni, ezért nem volt szükség a bemenetek csoportosítására. A jövőben egyszerre több lézerdiódát kívánunk vezérelni a programból, melyek különböző színű fényt juttatnak a szelet felszínére, így akár több különböző rhodopsin fehérjével ellátott állatból származó szeleteken is tudunk stimulálni. Amennyiben ez sikerül, a program már a mostani állapotában is lehetőséget nyújt arra, hogy osztályozzuk az egyes területeket a felvétel alatt tartott sejtre kifejtett hatásuk szerint. A 8.4. fejezetben bemutattam egy kísérletet, melynek során egy gátlósejtről alapkövetkeztetéseket lehetett levonni a sejtre érkező bemenetek integrációjáról. A kísérlet igen egyszerű, a mérésvezérlővel 4-5 perc alatt beállítható és lefuttatható, azonban a belőlük levonható következtetések nem messzemenők. A vezérlőtől azt reméljük, hogy segítségével a jövőben olyan kísérletek is megvalósíthatóak lesznek, melyek a sejtek integrációjáról, I/O függvényéről, átviteli karakterisztikájáról minőségi ismeretet nyújtanak. A feladatkiírásban megfogalmazott terveink tehát igencsak távlatiak, azonban úgy látjuk, hogy a legtöbb kísérlet elvégzése már most lehetséges.
45
10 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretnék név szerint köszönetet nyilvánítani az alábbi embereknek (ABC sorrendben):
Gulyás Attilának, aki a mérésvezérlő fejlesztése során a tervezés lépéseiben nagyon sok részt vállalt, illetve lehetőséget nyújtott a labor erőforrásainak használatára
Homonnay Csillának, akinek logikája és matematikai hozzáértése nélkül nem jött volna létre a vezérlő
Kohuš Zsoltnak, aki a kísérletek elvégzését végezte, adatot elemzett és ábrákat készített belőlük, a program tesztelését végezte, illetve jelen dolgozat elkészültéhez is elengedhetetlen részt vállalt
Schlingloff Dánielnek, aki a kísérletek elvégzését végezte (akár hétvégén is), illetve a vezérlő tervezésében vett óriási részt, a kezdetektől tesztelve is azt.
46
11 IRODALOMJEGYZÉK [1]
E. Boyden, F. Zhang, E. Bamberg, G. Nagel and K. Deisseroth, 'Millisecond-timescale,
genetically targeted optical control of neural activity', Nature Neuroscience, vol. 8, no. 9, pp. 1263-1268, 2005. [2]
X. Li, D. Gutierrez, M. Hanson, J. Han, M. Mark, H. Chiel, P. Hegemann, L. Landmesser
and S. Herlitze, 'Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin', Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 102, no. 49, pp. 17816-17821, 2005. [3]
N. De Marco García, R. Priya, S. Tuncdemir, G. Fishell and T. Karayannis, 'Sensory
inputs control the integration of neurogliaform interneurons into cortical circuits', Nature Neuroscience, vol. 18, no. 3, pp. 393-401, 2015. [4]
B. Avants, D. Murphy, J. Dapello and J. Robinson, 'NeuroPG: open source software for
optical pattern generation and data acquisition', Front. Neuroeng., vol. 8, 2015. [5]
Mightexsystems.com, 'Mightex Systems', 2015. [Online]. Available:
http://www.mightexsystems.com/family_info.php?cPath=245_243&categories_id=243. [Accessed: 04- Nov- 2015]. [6]
A. Christian, 'KLONK Drawing Board', CodePlex, 2015. [Online]. Available:
https://drawingboard.codeplex.com/. [Accessed: 04- Nov- 2015]. [7]
RLTMDL-447 1-500 mW, 1st ed. Vienna, Austria: Roithner Lasertechnik, 2015.
[8]
Sine.ni.com, 'NI USB-6353 - National Instruments', 2015. [Online]. Available:
http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/hu/nid/209072. [Accessed: 04- Nov- 2015]. [9]
J. Lin, 'A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future
developments', Experimental Physiology, vol. 96, no. 1, pp. 19-25, 2010. [10]
L. Gunaydin, O. Yizhar, A. Berndt, V. Sohal, K. Deisseroth and P. Hegemann, 'Ultrafast
optogenetic control', Nature Neuroscience, vol. 13, no. 3, pp. 387-392, 2010.
47
[11]
J. Lin, M. Lin, P. Steinbach and R. Tsien, 'Characterization of Engineered
Channelrhodopsin Variants with Improved Properties and Kinetics', Biophysical Journal, vol. 96, no. 5, pp. 1803-1814, 2009. [12]
A. Berndt, P. Schoenenberger, J. Mattis, K. Tye, K. Deisseroth, P. Hegemann and T.
Oertner, 'High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels', Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 108, no. 18, pp. 7595-7600, 2011.
48
