Endoplazmás retikulum stressz skorbutban

Endoplazmás retikulum stressz skorbutban Doktori értekezés

Dr. Margittai Éva Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola

Témavezető: Készítés helye:

Dr. Csala Miklós egyetemi adjunktus, PhD Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet

Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Machovich Raymund egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Monostory Katalin tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Gróf Pál egyetemi docens, a biológiai tudomány kandidátusa

Budapest 2006

Tartalomjegyzék 1.

Bevezető

5

1.1.

A C-vitamin szerepe az állati szervezetben

5

1.1.1.

Történelmi áttekintés

5

1.1.2.

C-vitamin és oxidatív stressz

6

1.1.2.1.

A C-vitamin mint antioxidáns

6

1.1.2.2.

Más antioxidáns rendszerek

9

1.1.3.

Az aszkorbinsav mint kofaktor

10

1.1.3.1.

Aszkorbátfüggő monooxigenázok

11

1.1.3.2.

Aszkorbátfüggő dioxigenázok

12

1.1.4.

A C-vitamin napi igénye és szerepe egyes betegségekben

15

1.2.

Antioxidánsok szerepe az endoplazmás retikulumban

17

1.2.1.

Az aszkorbát oxidáz aktivitása a mikroszómában

18

1.2.2.

A fehérjék tiolcsoportjainak oxidációja aszkorbát hatására

20

1.2.3.

Az E-vitamin szerepe a fehérje tiolok aszkorbát által kiváltott

21

oxidációjában 1.2.4.

A citokróm b561, egy alternatív transzmembrán elektronszállító molekula

22

1.2.5.

Az antioxidánsok oxidatív foldingban betöltött szerepének összegzése

23

1.3.

Diszulfid kötések keletkezése

24

1.3.1.

A diszulfid hidak kialakulása prokariótákban

25

1.3.2.

A diszulfid hidak kialakulása eukariótákban

26

1.3.2.1.

A protein diszulfid izomeráz

26

1.3.2.2.

Az Ero1 fehérje

26

1.3.2.3.

A FAD szerepe

28

1.3.2.4.

A glutation szerepe

28

1.3.2.5.

Egy alternatív szereplő, az Erv2

29

1.3.3.

A diszulfid híd kialakításához kapcsolt elektrontranszfer összegzése

29

1.4.

„Unfolded protein response” (UPR) és ER-függő apoptózis

31

1.4.1.

Az UPR fogalma és kiváltó okai

31

1

1.4.2.

Az UPR mechanizmusa

32

1.4.3.

Az ER stressz által indukált apoptózis

34

2.

Hipotézis és célkitűzések

36

3.

Módszerek

38

3.1.

Aszkorbáthiány előidézése tengerimalacokban

38

3.2.

E-vitaminhiány előidézése patkányokon

38

3.3.

Sejtfrakciók preparálása májszövetből

38

3.4.

Sima és durva felszínű endoplazmás retikulum frakciók elválasztása

39

3.5.

A májak aszkorbáttartalmának mérése

40

3.6.

E-vitamin mennyiségi meghatározása

40

3.7.

Lipidperoxidáció vizsgálata

41

3.8.

Western blot analízis

41

3.9.

Egyes fehérjék tiol/diszulfid redox állapotának vizsgálata (redox Western

42

blot) 3.10.

Apoptózis vizsgálata májban

42

3.11.

Statisztikai módszerek

42

4.

Eredmények

44

4.1.

Aszkorbát, illetve E-vitamin megvonásának hatása az állatokra

44

4.2.

A lipidperoxidáció változása a diéta során

46

4.3.

Az állatok súlygyarapodása

47

4.4.

Endoplazmás retikulum chaperonok és foldázok indukciója

47

4.5.

Endoplazmás retikulum foldázok redox állapotának vizsgálata

50

4.6.

Apoptózis indukciója a májban

51

4.7.

Citokróm b561 jelenléte az endoplazmás retikulumban

53

5.

Megbeszélés

54

6.

Összefoglalás

59

7.

Summary

60

Köszönetnyilvánítás

61

Saját közlemények jegyzéke

62

Irodalomjegyzék

63

2

Rövidítésjegyzék AMS

4-acetamide-4’-maleimidylstilbene-2,2’-disulfonic acid

ANOVA

analysis of variance

ASK1

apoptosis signal-regulating kinase 1

ATF

activating transcription factor

BiP

binding protein

BH3

Bcl2-homology

CGcytb

kromaffin granulumra jellemző citokróm b561

CHOP

CCAAT-box enhancer binding protein-homologous protein

CRE

cAMP response element

Dcytb

duodenális citokróm b561

DER

durva felszínű endoplazmás retikulum

Dsb

disulfide bond

DTT

ditiotreitol

EDTA

ethylene diamine tetraacetic acid

EGF

epidermal growth factor

eIF2

eukarióta iniciációs faktor 2

ER

endoplazmás retikulum

ERAD

endoplazmás retikulum asszociált degradáció

Ero1

endoplazmás retikulum oxidáz,

ERP72

endoplazmás retikulum protein 72

Erv2

essential for respiration and vegetative growth

FIH-1

factor inhibiting HIF-1

GADD

growth arrest and DNA damage-inducible protein

GLO

gulonolakton oxidáz

GRP

glucose-regulated protein

HEPES

4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid

HIF-1

hipoxia által indukált faktor 1

HPLC

high pressure liquid chromatography

3

IMP

inner membrane potential

IRE1

inositol requiring 1

Lcytb

lizoszómális citokróm b561

MOPS

3-(N-morpholino) propanesulfonic acid

PAGE

poliakrilamid gélelektroforézis

PAL

peptidil-α-hidroxi-glicin α-amidáló liáz

PDI

protein-diszulfid izomeráz

PERK

RNA-dependent protein kinase-like ER-kinase

PHM

peptidil-glicin α-hidroxiláló monooxigenáz

PUFA

polyunsaturated fatty acid (többszörösen telítetlen zsírsav)

PVDF

polyvinylidene fluoride

ROS

reactive oxygene species

SDS

sodium dodecyl sulfate

SEM

standard error of mean

SER

sima felszínű endoplazmás retikulum

S1P

site-1 protease

S2P

site-2 protease

UGGT

UDP-glukóz glikoprotein glukoziltranszferáz

uORFs

upstream open reading frames

UPR

unfolded protein response

UV-VIS

ultra violet-visiable

TBARS

tiobarbiturate reactive substance

TRAF2

tumor necrosis factor receptor-associated factor 2

TUNEL

terminális dezoxinukleotidil transzferáz dUTP „nick-end labeling”

XBP

cis-acting X-box binding protein

4

1.

Bevezető

1.1.

A C-vitamin szerepe az állati szervezetben

1.1.1.

Történelmi áttekintés

Már régtől fogva ismert, hogy friss növények fogyasztása elengedhetetlen az egészség megőrzése szempontjából. Amikor az ember raktározott, konzerv élelmiszereket volt kénytelen fogyasztani, a skorbut felbukkanása mindig veszélyeztette az egészségét. Ez elsősorban a hosszú felfedező hajóutak idején volt jellemző, és gyakran fatális következményekkel járt a hajók személyzete körében, akik sokszor hónapokon keresztül nem jutottak friss élelmiszerhez. Elsőként Krámer János György magyar katonaorvos jött rá a friss élelmiszerek fogyasztásának fontosságára. Ő a török hadjáratok idején savanyúkáposztát osztatott a hadseregnek, amivel sikerült megelőznie a csapatok körében egyébként járványszerűen pusztító skorbutot (Kramer 1739). James Lindt, egy skót hajósebész

végzett

először

kontrollált

kísérleteket

a

skorbut

gyógykezelésével

kapcsolatban, és igazolta a citrusfélék fontosságát a skorbut megelőzésében, majd 1753-ban publikálta megfigyeléseit „A Treatise of the Scurvy” címmel megjelent könyvében (Lind 1753). Az ezekben a növényekben fellelhető rejtélyes hatóanyagot azonban csak jóval később, 1932-ben azonosították, amikor Svirbely és Szent-Györgyi, valamint ezzel párhuzamosan King és Waugh egy hexuronsavat izolált növényi és állati szervezetből, melynek ráismertek skorbutellenes hatásaira, ezért aszkorbinsavnak, illetve C-vitaminnak nevezték el. A C-vitamin molekuláris szerkezetének és bioszintézisének kutatásában Sir Walter Norman Haworth járt az élen, aki munkájáért 1937-ben kémiai Nobel-díjat kapott (King 1953). A C-vitamin hatásmechanizmusa, metabolizmusa és transzportja élő szervezetekben már a kezdetektől nagyfokú érdeklődésre tartott számot és máig intenzív kutatás tárgya. A hosszú évek munkája rengeteg eredményt szült e tárgyban, de számos kérdés ma is megoldásra vár, amelyhez további vizsgálatokra van szükség.

5

1.1.2.

C-vitamin és oxidatív stressz

1.1.2.1.

A C-vitamin mint antioxidáns

A C-vitamin (L-aszkorbát) összes eddig ismert fiziológiás és biokémiai funkcióját redukáló képességének köszönheti. A kettes és hármas szénatomot tartalmazó dienol struktúra hidroxil csoportjai savas disszociációra képesek, pK értékeik 4,17 és 11,57; ezért fiziológiás pH mellett az aszkorbát monovalens anion formában fordul elő (Rose és Bode 1993). Az aszkorbát monoanion formája könnyedén ad le két elektront két egymást követő reverzibilis lépésben (1. ábra). Az első elektron leadása aszkorbil szabadgyök (szemidehidro-aszkorbát vagy monodehidro-aszkorbát) képződéshez vezet.

1. ábra. Az aszkorbinsav redox-metabolizmusa

Az aszkorbil gyök egy erősen delokalizált párosítatlan elektronnal rendelkezik, ezért - a többi szabadgyökkel összevetve - viszonylag stabil (T½ ≈ 10-5 s) és nem reaktív (Padayatty és mtsai 2003). Ezek a tulajdonságok az aszkorbátot hatásos redukáló, vagyis elektrondonor antioxidáns szerré teszik: az aszkorbát ugyanis, miközben a reaktív, és legtöbbször igen

6

veszélyes szabadgyököket redukálja, jóval kevésbé veszélyes aszkorbil gyökké alakul (1. egyenlet). Ezt a folyamatot általában gyökfogásnak nevezik. Az aszkorbil gyök ezután diszproporcionálódhat (2. egyenlet), ami általában jóval gyorsabb (≈ 105 M-1s-1, ha pH = 7,0) (Wells és Xu 1994), ezért gyakoribb, mint az aszkorbil gyök reakciója oxigénnel vagy biológiailag aktív vegyületekkel (3. egyenlet) (Coassin és mtsai 1991). Az aszkorbil gyök tovább-oxidációja, akár diszproporcionálódással, akár egy másik vegyülettel történő reakció során, dehidroaszkorbát képződéséhez vezet, ami hidrolízissel irreverzibilisen bomlik, hacsak alkalmas redukálószer hatására nem alakul vissza aszkorbáttá. AH2 + R· → AH· + RH

(1. egyenlet)

AH· + AH· → AH2 + A

(2. egyenlet)

AH· + R· → A + RH

(3. egyenlet)

A redox reakciók és köztük a szabadgyökös reakciók irányát a termodinamika szabályai szerint a résztvevő vegyületek kulcsfontosságú elektrokémiai paramétere, a redox potenciál határozza meg. Buettner (1993) közzétett egy összefoglalást a szabadgyökök standard egyelektronos redox potenciáljáról élő szervezetben. A biológiai rendszerekben előforduló legerősebben oxidáló gyök a hidroxil gyök, HO·. A hidroxil gyök egyik lehetséges forrása a jól ismert Fenton reakció, vagyis a H2O2 reduktív hasítása egy fémion (pl. Fe2+) által: Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO⎯ + HO· Az aszkorbát azonban termodinamikailag a sor alján helyezkedik el az oxidáló szabadgyökök között. Az összes olyan szabadgyök, amelynek nagyobb a redox potenciálja, beleértve a hidroxil gyököt, továbbá az alifás alkoxil és peroxil gyököket, aszkorbát segítségével eliminálhatók. Ráadásul a glutation gyök, valamint az urátból és αtokoferolból keletkező szabadgyökök az aszkorbát segítségével az antioxidáns glutationná, uráttá, illetve α-tokoferollá regenerálhatók. Továbbá ezek az elektron (hidrogén atom) transzfer reakciók igen gyorsan zajlanak le (Buettner és Jurkiewicz 1996), vagyis az aszkorbát mind termodinamikai, mind kinetikai szempontból kiváló antioxidáns. Rose és

7

Bode 1993-ban felállított egy kritériumrendszert, mely alapján egy molekulát a fiziológiásan hatékony antioxidánsok közé sorolnak, és megállapítást nyert, hogy az aszkorbát számos olyan tulajdonsággal rendelkezik, mely elengedhetetlen a hatékony gyökfogáshoz az emberi szervezetben. A fent említett körülmények (az aszkorbil gyök viszonylagos stabilitása; az aszkorbil gyök / aszkorbát monoanion redox pár kedvező termodinamikai paraméterei, a releváns reakciók kedvező kinetikája) mellett az aszkorbát kiváló antioxidáns szerepét támasztja alá in vivo: 1) a különböző szövetekben lévő magas aszkorbát koncentráció; 2) számos transzport mechanizmus jelenléte, melyek lehetővé teszik az aszkorbát megfelelő eloszlását a szervezetben; 3) a legtöbb állatban fellelhető de novo aszkorbát szintézis, illetve az aszkorbát előfordulása a növényi eredetű táplálékokban és gyors abszorpciója a bélrendszerből, melyek biztosítják az emlős szervezet számára az aszkorbát könnyű hozzáférését; 4) egy olyan recirkulációs mechanizmus létezése, mely lehetővé teszi az aszkorbát számára, hogy oxidált alakja újból visszaalakuljon az antioxidánsként működő redukált formává; 5) a vese C-vitamint konzerváló szerepe renális reabszorpció révén; 6) a C-vitamin redukált formájának minimális toxicitása. Mióta Rose és Bode kritériumrendszerével alátámasztást nyert a C-vitamin ideális fiziológiás antioxidáns volta, a fent felsorolt mechanizmusok kutatásában is jelentős fejlődés ment végbe, különösen a recirkuláció és a transzport területén. Az aszkorbát toxicitásával kapcsolatban röviden meg kell említeni, hogy bizonyos körülmények között, paradox módon a vitamin prooxidáns hatással is rendelkezik. Ez a kiváló redukáló ágens ugyanis képes bizonyos fémionokat is redukálni, pl. Fe3+ és Cu2+ ionokat Fe2+ és Cu+ ionokká, melyek ezután oxidációs láncreakciókat idézhetnek elő (Buettner és Jurkiewicz 1996). Az ilyen katalitikus fémek nagyon alacsony koncentrációja mellett az aszkorbát szinte mindig antioxidánsként működik, azonban ha a hozzáférhető fémionok koncentrációja megemelkedik, az aszkorbát veszélyessé válhat.

8

1.1.2.2.

Más antioxidáns rendszerek

Az aszkorbát mellett az állati sejt számos enzimatikus és nem-enzimatikus faktorral rendelkezik az oxidatív hatások elleni védekezéshez (Chaudiere és Ferrari-Iliou 1999). Az enzimatikus antioxidánsok (szuperoxid-dizmutáz, kataláz, glutation-peroxidáz) főleg a reaktív oxigén származékok intracelluláris hatástalanításában játszanak fontos szerepet. A nem-enzimatikus antioxidánsok direkt módon reagálhatnak a reaktív molekulákkal mind a sejten belül, mind az extracelluláris térben. A vízoldékony (aszkorbát, glutation, urát) és lipidoldékony (tokoferol, karotin) antioxidánsok egymással redox potenciáljuknak megfelelően elektronátvivő láncot alkotnak (2. ábra), melynek fontos szerepe van a membránok lipidperoxidáció elleni védelmében. A rendszerhez kapcsolódnak más, táplálkozással a szervezetbe kerülő, általában növényi eredetű antioxidánsok is (fenolok, flavonoidok, antocianidok stb.).

2. ábra. Az antioxidánsok redox lánca (Halliwell-Asada ciklus)

9

A lipidek (membránlipidek és lipoptoteinek lipid komponensei) hajlamosak a peroxidációra. A folyamat leginkább a többszörösen telítetlen zsírsavakat (PUFA) érinti, mivel a kettős kötések között elhelyezkedő metilén csoportok (-CH2-) hidrogénjei különösen reaktívak. A lipidperoxidáció a (-CH2-) csoport hidrogénjének egy szabadgyök (általában hidroxil gyök) által történő elvonásával kezdődik (Reiter 1995). A keletkező lipidgyök konjugált diénné történő átrendeződés után molekuláris oxigénnel reagál, peroxil gyököt (ROO·) kialakítva. Ez utóbbi szintén képes hidrogén atomot elvonni egy másik PUFA molekulából, mely láncreakciószerűen a membrán valamennyi PUFA molekulájának oxidációjához vezetne. A lipidperoxidáció veszélyes, mivel megváltoztatja a membrán permeabilitását és befolyásolja a membránfehérjék (receptorok, transzporterek) működését. Az aszkorbát gátolja a lipidperoxidációt egyrészt a prooxidánsok szintjének csökkentése révén, másrészt a tokoferil gyök visszaredukálásával. A tokoferil gyök a lipidperoxidáció láncletörő lépésében keletkezik: a tokoferol képes a lipid-peroxil gyök redukálására (Buettner és Schafer 2000). Az interakció a vízoldékony aszkorbinsav és a hidrofób tokoferol között azért lehetséges, mert az E-vitamin fenolos hidroxil csoportja a membránvíz határfelületen található (Buettner 1993). A C- és E-vitamin ilyen kölcsönhatása különösen fontos az endoplazmás retikulum (ER) membránjában, ahol számos enzim (pl. citokróm P450 izoenzimek) termelhet reaktív intermediereket. A fehérjék szintén oxidatív módosulásokat szenvedhetnek, melyek részben fiziológiásak (bizonyos

aminosavak

képződése),

részben

olalláncainak patológiásak,

enzimatikus és

hidroxilációja,

krónikus

diszulfid

degeneratív

hidak

betegségek

patomechanizmusának elemei lehetnek. Érdekes módon az aszkorbát elősegíti a fehérjék fiziológiás oxidációját (pl. hidroxilázok kofaktoraként, ld. később), ugyanakkor véd a patológiás prooxidáns hatások ellen (antioxidánsként).

1.1.3.

Az aszkorbinsav mint kofaktor

Az aszkorbinsav egyik sajátos funkciója, hogy kofaktorként működhet fémionfüggő oxigenázok által katalizált reakciókban. Az ide tartozó enzimek Cu+ tartalmú monoxigenázok (1.1.3.1), illetve Fe2+- és α-ketoglutarát-függő dioxigenázok (1.1.3.2). Az

10

enzimek prosztetikus fémionját kell redukált formában tartani, ami kísérletes rendszerekben egyéb antioxidánsokkal is megoldható, de általában az aszkorbát a leghatékonyabb, és fiziológiás körülmények között a feladat rá hárul. Jól mutatja e szerep fontosságát, hogy a skorbutban észlelhető tünetek nagy része összefüggésbe hozható az ilyen aszkorbátfüggő enzimek funkciójának kiesésével.

1.1.3.1.

Aszkorbátfüggő monooxigenázok

Azok a monooxigenázok, melyek aszkorbát jelenlétét igénylik, az aminosav eredetű és peptidhormonok szintézisében vesznek részt. Nevüknek megfelelően a molekuláris oxigénből egy atomot építenek be a szubsztrátba. a) Peptidil-glicin α-amidáló monooxigenáz A bioaktív peptidek több mint felének eredetileg szabad karboxil csoportot tartalmazó vége amiddá módosul, ami biológiai aktivitásukhoz is szükséges. A gerincesek α-amidált peptidjei

között

hormonok

(oxitocin,

vazopresszin,

gasztrin,

kalcitonin)

és

neurotranszmitterek (substance P, neuropeptid Y) egyaránt előfordulnak. A prekurzor peptidek C-terminálisán található glicin amino-nitrogénje és α-szénatomja közötti kötés oxidatívan hasad. Mindezt egy peptidilglicin α-amidáló monooxigenáznak nevezett bifunkcionális enzim katalizálja, mely peptidil-glicin α-hidroxiláló monooxigenáz (PHM) és peptidil-α-hidroxi-glicin α-amidáló liáz (PAL) aktivitásokkal bír (Prigge és mtsai 2000). A PHM aktivitásban van szerepe a réztartalmú enzim aszkorbátfüggésének. Az enzim alapállapotban két oxidált Cu2+ iont tartalmaz, melyeket két aszkorbát molekula redukál. Az aktív enzim Cu+ ionjai aktiválják a molekuláris oxigént a hidroxilációhoz. A katalítikus ciklus végén a rézionok ismét oxidált állapotban vannak, és újabb aszkorbát molekulákra van szükség az aktiválódáshoz. Egy mól amidált termék kialakulásához tehát egy mól aszkorbát használódik fel (Murthy és mtsai 1987). Az aszkorbát a leghatékonyabb reduktáns mind in vitro (Eipper és mtsai 1983), mind sejtkultúrában (May és mtsai 1989). Ezzel függ össze a bioaktív amidált peptideket szintetizáló szövetek (mellékvese, agyalapi mirigy) jellegzetesen magas aszkorbáttartalma (Englard és Seifter 1986).

11

b) Dopamin β-hidroxiláz A dopamin β-hidroxiláz a tirozin-noradrenalin átalakulás utolsó lépését katalizáló réztartalmú monooxigenáz. Az enzim jelen van a központi idegrendszer katekolamintároló vezikuláiban

és

a

mellékvesevelő

kromaffin

sejtjeiben,

melyek

magas

aszkorbáttartalmukról ismertek (Englard és Seifter 1986). Ebben az esetben is az aszkorbát bizonyult az enzim leghatékonyabb reduktánsának (Levin és mtasi 1960).

1.1.3.2.

Aszkorbátfüggő dioxigenázok

Az aszkorbát közreműködését igénylő dioxigenázok a kollagén és a karnitin bioszintézisében, valamint a tirozin katabolizmusában vesznek részt. Jellegzetességük, hogy koszubsztrátként α-ketoglutarátot használnak, amely a molekuláris oxigén egyik atomját felvéve, oxidatív dekarboxileződéssel szukcináttá alakul. a) Prolil- és lizil-hidroxilázok A kollagén-bioszintézis zavara skorbutban nyilvánvaló. Az érett kollagén normális hármas hélix szerkezetének kialakulásához elengedhetetlen a prokollagén prolil- és liziloldalláncainak poszttranszlációs módosítása. A hidroxilált prolil csoportok elsősorban a láncok közötti hidrogénkötésekhez kellenek, míg a hidroxi-lizin feltételezett szerepe a további poszttranszlációs módosítások elősegítése. A folyamatban szerepet játszó enzimek közül legalaposabban a prolil-4-hidroxilázt jellemezték (Myllyharju 2003). Az α2β2 tetramer szerkezetű enzim α alegysége tartalmazza a katalítikus helyet, míg a β alegység a protein diszulfid izomerázzal azonos. Az enzim az endoplazmás retikulum lumenében helyezkedik el. Működése során az α-ketoglutarát dekarboxilálásakor egy vas ion oxidálódik, az aszkorbát pedig azáltal stimulálja az enzim működését, hogy ezt a vas iont visszaredukálja. Ezt a következő megfigyelések támasztják alá: 1) a hidroxiláció során az aszkorbát fogyása nem sztöchiometrikus; 2) aszkorbát hiányában a prolil-4-hidroxiláz enzim aktivitásának elvesztése előtt még számos hidroxiláxiót képes katalizálni (Myllyla és mtsai 1978); 3) a reakció szétkapcsolásakor,

12

amikor

is

az

hidroxilációval,

α-ketoglutarát

dekarboxilációja

az

a

aszkorbát

nem

dekarboxilálással

jár

következményes

sztöchiometrikusan

prolil

megegyező

mennyiségben használódik fel (Myllyla és mtsai 1984). A katalízis során átmenetileg reaktív ferri-oxo komplex képződik, amely a prolil-hidroxilációhoz vezető oxigéntranszfer során keletkező aktív intermedier. Ha a reakció valamilyen okból szétkapcsolódik, és ferrioxo komplex Fe3+ és O- ionokra bomlik, akkor a prolil-4-hidroxiláz inaktiválódása csak úgy kerülhető el, ha az enzimhez kötött Fe3+ ion visszaredukálódik Fe2+ ionná (Kivirikko és Myllyharju 1998). Mivel a reakció gyakran szétkapcsolódik fiziológiás körülmények között is (pl. más hidroxilálódó szubsztrátok jelenléte esetén), a prolil-4-hidroxiláz működése erősen függ egy megfelelő redukálószer jelenlététől, és ezt a protektív szerepet leghatékonyabban az aszkorbát tölti be. A prolil-4-hidroxiláz asszociációja a protein-diszulfid izomerázzal, illetve az a tény, hogy a protein-diszulfid izomeráz képes katalizálni a glutationfüggő dehidroszkorbát-redukciót, arra a következtetésre vezette Meister-t (1994), hogy az aszkorbát és a glutation között valószínűleg kapcsolat áll fenn a prolil-4-hidroxiláz enzim szintjén: a protein-diszulfid izomeráz

szerepe

az

hidroxilációs

reakció

során

keletkező

dehidroaszkorbát

visszaredukálása, vagyis az aszkorbát regenerálása lehetne. Kimutatták, hogy az aszkorbát képes indukálni a kollagén-bioszintézist. Sejtkultúrákban bizonyítást nyert, hogy aszkorbát adása a médiumhoz stimulálta a prokollagén szekrécióját és transzlációját, valamint a prokollagén mRNS transzkripcióját és stabilitását (Schwarz ás mtsai 1987). Ezek a hatások valószínűleg részben az aszkorbát hatására fokozódó kollagénhidroxilációnak tudhatók be. b) Karnitin bioszintézisében szereplő hidroxilázok A karnitin, illetve a belőle képződő az acetil- és más acilkarnitin származékok jelentős szerepet játszanak a zsírsav-metabolizmusban. A karnitinhez való kapcsolódás célja a mitokondriális, illetve – bizonyos esetkben – a peroxiszómális membránon keresztül történő zsírsavtranszport. A karnitin lizinből keletkezik, melynek korai lépése az ε-Ntrimetillizin képződése. A későbbiekben a bioszintézis két hidroxilációs lépést tartalmaz: az ε-N-trimetillizin β-hidroxiláció során β-hidroxi-ε-N-trimetillizinné alakul, a második

13

hidroxilációs lépés a γ-N-trimetil-aminobutirát β-hidroxilációja karnitinné. Ezeket a reakciókat két különböző α-ketoglutarát- és Fe2+-függő dioxigenáz katalizálja, melyek működését redukálószerek – leghatékonyabban az aszkorbát – fokozzák (Hulse és mtsai 1978; Lindstedt és Lindstedt 1970). Skorbutos állatmodellekben kimutatták a karnitinhiányt (Rebouche 1991), és feltételezhető, hogy a skorbut korai stádiumában jelentkező fáradékonyságot a karnitinhiány miatt csökkent zsírsavfelhasználás okozza. c) 4-hidroxi-fenilpiruvát dioxigenáz A

tirozin-katabolizmus

második

lépése

a

4-hidroxi-fenilpiruvát

átalakítása

homogentizinsavvá 4-hidroxi-fenilpiruvát dioxigenáz által. Az enzim abban különbözik más aszkorbát- és Fe2+ függő dioxigenázoktól, hogy nem igényel α-ketoglutarátot, és így az oxigén molekula mindkét atomját ugyanabba a termékbe építi be. Valóban, az enzim által katalizált reakcióban az α-ketosav (piruvát), amely oxidatívan dekarboxilálódik, a hidroxilálódó szubsztrát része (Moran 2005). Az aszkorbát stimulálja ezt a reakciót, de a reduktáns specificitása nem annyira igazolt, mint más aszkorbátfüggő dioxigenázok esetében (Zannoni és La Du 1959). Skorbutos tengerimalacokban tirozin hatására tirozinémia alakul ki és vizeletükben megjelenik a 4-hidroxi-fenilpiruvát és 4-hidroxifenillaktát (Englard és Seifter 1986). d) EGF β-hidroxiláz Egy aszparaginil-β-hidroxilázt tisztítottak marha májból (Gronke és mtsai 1990; Wang és mtsai 1991), mely szintén α-ketoglutarát- és Fe2+-függő, aszkorbátot is igénylő dioxigenáz. β-hidroxilált aszpartil és aszparaginil csoportokat mutattak ki „EGF-like” doméneken számos K-vitamin-dependens fehérjében (pl. VII. IX. X. véralvadási faktorok). Az EGF (epidermal growth factor) hidroxiláció fiziológiás szerepe még feltárandó; a jelátvitelben és a sejtmigráció szabályozásában vehet részt (Dinchuk és mtsai 2002; Maeda és mtsai 2003). e) Aszparaginil és prolil hidroxilázok a HIF-1 szabályozásában A hipoxia által indukált faktor 1 (HIF-1) egy két alegységből (α és β) álló transzkripciós faktor, mely az emlős sejtek hipoxiához való alkalmazkodását biztosítja több gén

14

expressziójának fokozásával. A HIF-1α mennyisége és aktivitása aszparaginil és prolil oldalláncainak hidroxilációján keresztül szabályozódik a lokális oxigénkoncentrációnak megfelelően. Egy specifikus aszparaginil csoportját a FIH-1 (factor inhibiting HIF-1) oxigenálja, ami egy aszparaginil-β-hidroxiláz, mely különbözik az EGF β-hidroxiláztól (Lando és mtsai 2002). A HIF-1α specifikus prolil csoportjait a citoszólban található prolil4-hidroxiláz család tagjai hidroxilálják, melyek különböznek az endoplazmás retikulumban található, a kollagén módosításában résztvevő enzimektől. A két enzimcsalád között nincs homológia, de a katalízisben szerepet játszó fontos csoportok konzerváltak (Myllyharju 2003). Az aszparaginil-hidroxiláció gátolja a HIF-1 kapcsolatát a p300 transzkripciós koaktivátorral, míg a prolil hidroxiláció a transzkripciós faktor proteaszómális lebontásához vezet (Lancaster és mtsai 2004). Hipoxia esetén a HIF-1α nem hidroxilálódik, mert a hidroxilázok csak viszonylag magas oxigéntenzió mellett működnek, így a HIF-1 mennyisége és aktivitása nő. A normoxiás állapot visszaállása után a hidroxilázok inaktiválják a jelpályát. Számos transzformált sejtvonal viszont emelkedett HIF-1 szintet mutat normoxiás körülmények között is. Érdekes, hogy az aszkorbát fiziológiás koncentrációi – különösen ezekben a transzformált sejtvonalakban – csökkentik a HIF-1 proteinszintet és a HIF-1 transzkripciós targetjeinek szintjét (Knowles és mtsai 2003). Az aszkorbát hatása az EGF és HIF-1α hidroxilázaira azt mutatja, hogy a molekula fontos szerepet játszhat a jelátvitelben és a génexpresszióban. Ezekben a folyamatokban való részvételét gyakran pro- vagy antioxidáns hatásainak tulajdonítják (Duarte és Lunec 2005). Valóban jól ismert a reaktív oxigénszármazékok szerepe a jelátvitelben és a génexpresszióban. Az aszkorbát befolyásolhatja ezeket a jelpályákat a sejt redox viszonyainak megváltoztatása révén. A hidroxilázok kofaktoraként betöltött funkciója viszont azt mutatja, hogy az aszkorbátnak a pro- és antioxidáns hatásokon túlmenően specifikus szerepe is lehet a biológiai szabályozásban.

1.1.4.

A C-vitamin napi igénye és szerepe egyes betegségekben

Az aszkorbát a legtöbb állat számára nem vitamin, mivel májsejtjeik képesek az előállítására (Bánhegyi és mtsai 1997). A szintézis UDP-glukózból indul ki; aktivitása a

15

glikogenolízis függvénye, így közvetve a glutation redoxstátusza által is szabályozott (Braun és mtsai 1996). Emellett a gulonolakton oxidáz (GLO), a szintézis utolsó lépését katalizáló enzim, génexpresszió szintjén is szabályozódik (Braun és mtsai 1999; Braun és mtsai 1999). Az endoplazmás retikulum membránjához kötött GLO hidrogén-peroxidot is termel, ezért az aszkorbáttermelést glutationoxidáció kíséri (Bánhegyi és mtsai 1996; Puskás és mtsai 1998). Ám a GLO néhány fajban – pl. az emberben és a tengerimalacokban is – hiányzik, így e szervezeteknek az aszkorbinsav vitamin (C-vitamin), melyet a táplálékkal szükséges felvenniük (Bánhegyi és mtsai 1998). A C-vitaminhiányos táplálkozás az avitaminózis egyik formájához, skorbuthoz vezet, mely egy általános anyagcsere betegség igen széles tünetskálával. Legfontosabb jellemzői a korán jelentkező fáradtság és letargia, amit a fogak kihullása, vérző íny és bőrvérzések követnek. Jellemző továbbá a meglassult sebgyógyulás, csökkent immunvédekező képesség, végtagfájdalmak és enyhe anaemia. A skorbut megelőzéséhez minimális dózisú C-vitamin bevitel elégséges (kb. 10 mg/nap), azonban ha a táplálékkal bejuttatott C-vitamin mennyisége kevesebb, mint 30-60 mg/nap, a klinikai skorbutot megelőző és azt előrejelző fáradtság már jelentkezhet (Padayatty és mtsai 2003). A C-vitamin emberek számára optimális dózisával kapcsolatban máig folyamatos viták folynak. A jelenleg ajánlott napi Cvitamin-fogyasztás a „UK Food Standards Agency” által 40 mg/nap, míg a „US Food and Nutrition Board” 75-90 mg-ot ajánl naponta. Néhány kutató azonban azzal érvel, hogy ha a skorbut megelőzéséhez szükséges C-vitamin mennyisége ilyen nagyságrendű, akkor az optimális közérzet elérése érdekében a C-vitamin ajánlott adagja 1 vagy több gramm kellene, hogy legyen naponta (Pauling 1970). Erre az eredményre különböző megfontolások vezették őket. Bourne érvelése emberszabású majmokon végzett kísérletein alapult, melyek az emberhez hasonlóan nem képesek C-vitamin szintézisére. Stone a patkányok által naponta termelt C-vitamin mennyisége alapján következtetett az emberek szükséges napi vitamindózisára. Pauling kiindulópontja a C-vitamin optimális dózisának (naponta 2,3 g vagy több) megállapítására az a tény volt, hogy az aszkorbát szintézis képessége csak néhány fajban szűnt meg (ami szerinte azt jelenti, hogy az étkezési növények kevesebb C-vitamint tartalmaznak, mint az optimális egészség megőrzéséhez szükséges napi mennyiség). Itt érdemes megjegyezni, hogy naponta 5db zöldség vagy

16

gyümölcs elfogyasztása (amit egy megfelelő étrend egyébként is tartalmaz) kb. 220 mg Cvitamin bevitelt jelent (Lachance és Langseth 1994). Az aszkorbát előnyös volta azonban a különböző betegségekben – különösen rákban – vita tárgya, amint azt a következő példa is mutatja. Cameron és Pauling (1976) kimutatta, hogy naponta 10 g aszkorbát fogyasztása megnöveli a túlélési időt a végső stádiumban lévő rákos betegeknél. Ezt és ehhez hasonló tanulmányokat azonban számtalanszor erős kritikával illettek a megfelelő kontrollok vagy a randomizáció hiánya miatt. Később Creagan és mtsai (1979) végeztek egy randomizált placebo-kontroll vizsgálatot magas dózisú C-vitaminnal, melyben semmilyen előnyös hatást nem sikerült kimutatni az előrehaladott állapotú rákos betegek túlélésében vagy egyéb paramétereiben. Azonban Padayatty és Levine (2001) lényeges különbségre mutatott rá a két kísérlet között: az elsőben a C-vitamint intravénásan adták, míg a másodikban orálisan, mely valószínűleg sokkal alacsonyabb plazmaszintet eredményezett. Így tehát a két vizsgálatot lehetetlen összehasonlítani, és a C-vitamin esetleges rákellenes hatása továbbra is nyitott kérdés maradt. Összegezve tehát, számos állapot van, mely emelkedett oxidatív stresszel és alacsonyabb C-vitamin szinttel jár mind a vérplazmában, mind a szövetekben (pl. rák, diabetes mellitus, cataracta és dohányzás), továbbá számos tanulmány támasztja alá a C viatmin szerepét az érrendszeri betegségekben, magasvérnyomás betegségben, vasfelszívódásban és a gyomorrák megelőzésében. Azonban míg in vitro számos bizonyíték van a C-vitamin hatékony antioxidáns működésére, az emberekben betöltött antioxidáns szerepe még nem nyert közvetlen alátámasztást epidemiológiai tanulmányokkal vagy olyan klinikai tanulmányokkal, melyek az oxidatív károsodás biomarkereit mérik. Nem bizonyított, hogy a zöldségekben és gyümölcsökben lévő C-vitamin védő hatást fejtene ki a kardiovaszkuláris betegségekben és a rákban. Napjainkig a C-vitamin egyetlen előnyös hatásaként a skorbut megelőzését tartják számon.

1.2.

Antioxidánsok szerepe az endoplazmás retikulumban

Emlőssejtekben számos fehérje (köztük a Golgi-apparátusba, a lizoszómába, a plazmamemránba, illetve a szekrécióra szánt fehérjék) a durva felszínű endoplazmás

17

retikulum riboszómáin szintetizálódik. Ezek a polipeptidláncok az endoplazmás retikulum lumenébe kerülnek, ahol harmadlagos szerkezetük kialakul, valamint átesnek az egyik legfontosabb ko/poszttranszlációs módosuláson, a diszulfidhíd képződésén (Tu és Weissman 2004). A fehérjék tiolcsoportjainak diszulfiddá alakításához, vagyis a citoplazmáénál jóval magasabb tiol-redoxpotenciál kialakításához oxidáló környezetre van szükség (Hwang és mtsai 1992). Ennek kialakulásában és fenntartásában szerepet játszó folyamatok

azonban

teljesen

nem

ismertek.

Egy

feltételezett

mikroszómális

elektrontranszfer-lánc továbbíthatja az újonnan szintetizált fehérjék tiolcsoportjairól az elektronokat a végső elektronfelvevőre, az oxigénre. Ennek az elektrontranszfer-láncnak a fehérje komponenseit már régóta kutatják. Leírták egy FAD-tartalmú enzim (endoplazmás retikulum oxidáz, Ero1) és a protein-diszulfid izomeráz (PDI) funkcionális kapcsolatát, mely szerint az oxigén, mint végső elektronakceptor, oxidálja az Ero1-et, ami oxidálja a PDI-t; a PDI pedig végül az újonnan szintetizált fehérjékben alakítja ki a diszulfidkötéseket (Tu és Weissman 2004). Azonban az Ero1 oxidációjának mechanizmusát részleteiben kevésbé ismerték. Feltételezhető volt, hogy a FAD és a molekuláris oxigén közötti elektronátadásban más, kis molekulatömegű elektronszállítók is részt vesznek. Leginkább a C-vitamin (aszkorbát) és az E-vitamin (tokoferol) résztvételét lehetett valószínűsíteni, ezek lévén a legnagyobb mennyiségben előforduló vízoldékony és zsíroldékony antioxidáns molekulák az endoplazmás retikulumban. Munkacsoportunk az elmúlt években számos kísérletet végzett ezen antioxidánsok szerepének tisztázására az endoplazmás retikulumban.

1.2.1.

Az aszkorbát-oxidáz aktivitása a mikroszómában

Intakt sejtekben az endoplazmás retikulumban lévő oxidatív környezet lehetővé teszi, hogy az újonnan szintetizált fehérjékben diszulfidhidak alakuljanak ki. Ez azonban nincs így az endoplazmás retikulum eredetű izolált mikroszómában, ami arra utal, hogy a folyamat egy citoplazmában lévő faktor vagy egy membránpermeábilis összetevő részvételét igényli, mely a mikroszómák preparálása során elvész. Felvetődött tehát a legnagyobb koncentrációban jelen lévő vízoldékony antioxidáns, az aszkorbát szerepe. Az aszkorbát prooxidáns funkciója a dehidroaszkorbát képződéséhez kapcsolódik. Ez az aszkorbát

18

oxidált formája, amely két elektron leadásával – rendszerint két lépésben – keletkezik (Van der Zee és Van den Broek 1998). Növényekben ismertek aszkorbát oxidáz enzimek, amelyek aszkorbil szabadgyököt képeznek az aszkorbátból (Horemans és mtsai 2000). Ez az intermedier aztán a második elektron leadásával – akár egy másik aszkorbil szabadgyöknek (diszproporcionálódás) – alakul dehidroaszkorbáttá. Állati szervezetben azonban jóval kevésbé volt ismert a folyamat, sőt, általában ezt nem enzimatikus reakcióként tartották számon, amit például fémionok vagy szabadgyökök katalizálhatnak. Patkánymáj mikroszóma jelenlétében az aszkorbát folyamatosan átalakul aszkorbilgyökké majd dehidroaszkorbáttá. A citoszóléval megegyező aszkorbátkoncentrációval (0,1 mM) indulva 37°C-on az aszkorbát koncentrációja egyenletes sebességgel, folyamatosan csökken (Szarka és mtsai 2002). A keletkező dehidroaszkorbát már néhány perc után detektálható, és szintje állandó marad egészen addig, amíg az aszkorbát el nem fogy. Az aszkorbilgyök jelenlétét is kimutattuk elektronspin-rezonancia-spektroszkópia segítségével. Mikroszóma nélküli pufferben inkubálva az aszkorbátot, autooxidáció révén detektálható mennyiségű aszkorbilgyök keletkezik. Mikroszóma jelenlétében azonban lényegesen nagyobb aszkorbilgyökszint mérhető, és ez az inkubáció teljes ideje alatt állandó marad. Mivel mind az aszkorbilgyök, mind a dehidroaszkorbát nagyon instabil, állandó szintjüket csak a folyamatos aszkorbátoxidáció tarthatja fenn. A mikroszóma jelenlétében többszörösére fokozódó aszkorbátoxidáció egy mikroszómális aszkorbát-oxidáz enzim aktivitására utal. A mikroszómák előkezelése akár hővel, akár proteázzal az aszkorbilgyök keletkezését jelentősen csökkenti, s az aszkorbátoxidáz aktivitását akár meg is szünteti, jelezve, hogy valóban enzimatikus, fehérjemediált folyamatról van szó (Szarka és mtsai 2002). Az azonosítatlan mikroszómális aszkorbát-oxidázról további információkat nyertünk gátlószerek felhasználásával. Sem gyökfogók, sem antioxidáns enzimek nem befolyásolják az aszkorbilgyök képződését. Ugyancsak hatástalanok a flavoprotein- és a hemoprotein-gátlószerek is. Ezzel szemben a citokróm inhibitorai jelentősen gátolják az aszkorbilgyök képződését, de az autooxidációt (mikroszóma nélkül) is, így feltehetőleg nem az enzimre hatnak, hanem közvetlenül reagálnak az aszkorbilgyökkel (redukálják azokat). A megvizsgált fémkelátorok (dipiridil, 1,10-fenantrolin, neokuproin) közül a

19

legerősebb gátlást a rézspecifikus neokuproin váltja ki. Ez mikroszóma nélkül, vagy hőinaktivált mikroszóma esetén hatástalan, csak ép mikroszóma jelenlétében hat, és szinte az autooxidáció szintjére csökkenti az aszkorbilgyökök keletkezését (Szarka és mtsai 2002). Ez a megfigyelés különösen azért érdekes, mert a növényi aszkorbát-oxidáz enzim is rezet tartalmaz (Dawson és mtsai 1975).

1.2.2.

A fehérjék tiolcsoportjainak oxidációja aszkorbát hatására

A mikroszómához adott aszkorbát fogyása mellett megfigyeltük a fehérjék tioljainak kifejezett oxidációját is, ami aszkorbát nélkül elhanyagolható volt. Az aszkorbát és a tiol oxidációja korrelál egymással. A citokróm P450 inhibitorai (ekonazol, quercetin) vagy neokuproin jelenlétében mind az aszkorbátfogyás, mind a tioloxidáció csökken (Csala és mtsai 1999). Mivel a tioloxidáció az aszkorbátoxidációhoz kötött, feltételeztük, hogy a dehidroaszkorbát is részt vesz a folyamatban. A dehidroaszkorbát valóban kiváltja a fehérjék tioljainak oxidációját, bár kisebb mértékben, mint az aszkorbát (Csala és mtsai 1999). Ez különösen azért fontos, mert az endoplazmás

retikulum

membránja

nem

egyformán

permeábilis

az

aszkorbát/dehidroaszkorbát redoxpár két tagjára nézve. Míg az oxidált alak jól mérhető sebességgel halad át a membránon, addig a redukált forma transzportja elhanyagolható (Bánhegyi és mtsai 1998). Ennek megfelelően, az aszkorbát transzportját az aszkorbátoxidáz gátlása akadályozza, azaz csak dehidroaszkorbáttá alakulva képes bejutni a lumenbe (Csala és mtsai 2000). A lumenbe jutott dehidroaszkorbát – lévén a protein-diszulfid izomeráz enzim egyik szubsztrátja – mint kis molekulatömegű elektronakceptor, részt tud venni a fehérjéknek ebben a kompartimentumban zajló oxidatív hajtogatódásában („folding”) (Wells és mtsai 1990). A PDI a dehidroaszkorbátot redukálja, miközben az enzimen lévő tiolcsoportok oxidálódnak. Az immár oxidált protein-diszulfid izomeráz reagál a tiolcsoportokat tartalmazó fehérjékkel, azokon diszulfidhidakat hozva létre, miközben az enzim regenerálódik és visszaalakul katalízisre képes állapotába. Ennek az enzimreakciónak az eredményeként aszkorbát keletkezik (és felhalmozódik) a lumenben. A folyamat végbemenetelének bizonyítéka, hogy diabéteszes állat májából készült

20

mikroszómában, amelynek lumenében nem hajtogatott („unfolded”) fehérje – vagyis sok redukált tiolcsoport – halmozódik fel (Nardai és mtsai 2003), az aszkorbát intraluminális akkumulálódása jelentősen megnő (Nardai és mtsai 2001).

1.2.3.

Az E-vitamin szerepe a fehérje tiolok aszkorbát által kiváltott oxidációjában

Az a megfigyelés, hogy az aszkorbát a dehidroaszkorbátnál hatékonyabban fokozta a fehérjék tiolcsoportjainak oxidációját a mikroszómában, arra utalt, hogy az aszkorbát oxidációja valamilyen közvetett módon is kifejtette hatását. Ez egy lipidoldékony, az endoplazmás retikulum membránjában elhelyezkedő molekula jelenlétére utalt, mely a két folyamatot – a membrán külső felszínén lejátszódó aszkorbátoxidációt és a lumenben végbemenő protein-tioloxidációt – összekapcsolja. Az E-vitamin az endoplazmás retikulum legnagyobb mennyiségben előforduló membránhoz kötött antioxidánsa. Szerepe Evitaminhiányos patkányok májából preparált mikroszómákon végzett kísérletekben igazolódott be. Az ilyen mikroszóma α-tokoferol-tartalma rendkívül alacsony, de in vitro körülmények között utólag szinte teljesen visszaállítható (Csala és mtsai 2001). Az Evitamin hiánya részlegesen szétkapcsolja az extra- és intraluminális redoxfolyamatokat, vagyis az aszkorbát- és a fehérjetiolok oxidációját. Ez azt jelenti, hogy az ilyen mikroszómában jelentősen csökken az aszkorbát által kiváltott diszulfidképződés, holott az aszkorbát maga gyorsabban oxidálódik. Ezt a szétkapcsolást a membránlipidek fokozott peroxidációja is kíséri, ami nyilván az aszkorbát oxidációjakor keletkező ROS hatása. A különböző vízoldékony gyökfogók csak nagyon kis mértékben vagy egyáltalán nem védik ki a lipidperoxidációt, ami arra utal, hogy a ROS a membrán közvetlen közelében keletkezik – lipidkörnyezetben – ami leginkább lipofil antioxidánsok számára hozzáférhető. Vagyis feltételezzük, hogy az E-vitamin közvetlenül ennek a ROS-nak az oxidáló hatását közvetíti a lumenbe; ami így nem a membrán lipidjeit, hanem végső soron a fehérjék tiolcsoportjait oxidálja. A tokoferol utólagos pótlására a két folyamat kapcsolata újra helyreáll és a lipidperoxidáció mértéke is lecsökken (Csala és mtsai 2001).

21

1.2.4.

A citokróm b561, egy alternatív transzmembrán elektronszállító molekula

Az elmúlt évek során azonosítottak egy aszkorbát által redukálható, b típusú citokrómot a növényi sejtek plazmamenbránjában. A citokróm abszorpciós spektrumára jellemző az 561 nm fényelnyelési maximumnál megjelenő α hullám, amely alapján a fehérje a citokróm b561 nevet kapta. A citokróm b561 fehérjecsalád jellemzője a magas redoxpotenciál, az aszkorbát hatására való redukció és a membránon keresztüli elektronszállítás képessége. Az igen hidrofób fehérje hat transzmembrán hélixből áll, négy erősen konzervált hisztidint és a membrán két oldalán 1-1 hem prosztetikus csoportot tartalmaz. A membrán egyik felszínén található hem csoport szerepe az elektronok átvétele az aszkorbáttól, míg a membrán másik felszínén található hem csoport az így felvett elektronokat a monodehidroaszkorbátra (aszkorbil gyökre) transzportálja, ezzel regenerálva az aszkorbátot. Az aszkorbát ezután tovább tudja adni a felvett elektronokat az aszkorbát kofaktorral működő enzimek számára, így

a

transzmembrán

elektronszállító

citokróm

képes

fenntartani

egy

állandó

aszkorbátszintet, és ezáltal biztosítani az aszkorbát fiziológiás funkcióinak ellátását (Tsubaki és mtsai 2005). Újabban a citokróm b561 családhoz tartozó fehérjéket számos állati szövetben is leírtak, a plazmamembránban és különböző organellumok membránjában egyaránt. A citokróm b561 eddig azonosított három izoformája: a kromaffin granulumokban található CGcytb, melynek szerepe a katekolamin szintézishez szükséges aszkorbát szint fenntartása a neuroendokrin szövetekben (Fleming és Kent 1991), a duodenális Dcytb, mely a ferri iont a könnyebben felszívódó ferro ionná redukálja (McKie és mtsai 2001), illetve a lizoszómális Lcytb, mely a lebontott hemoproteinek eloxidálódott vas ionjainak visszaredukálásában játszik szerepet (Zhang és mtsai 2006). Citokróm b561 enzimek jelenlétét endoplazmás retikulumban eddig nem vizsgálták, de az E-vitamin mellett ez a fehérje is szerepet játszhat az endoplazmás retikulum membránon keresztül történő elektronszállításban.

1.2.5. A

leírt

Az antioxidánsok oxidatív foldingban betöltött szerepének összegzése megfigyelések

alapján

a

következő

22

modellt

állítottuk

fel

az

aszkorbát/dehidroaszkorbát és az E-vitamin oxidatív fehérje hajtogatódásban betöltött szerepére (3. ábra). A citoplazmában az aszkorbát aszkorbilgyökké alakul enzimatikus folyamat segítségével, ami az endoplazmás retikulum membránjának külső felszínén játszódik le. Ezt a folyamatot reaktív oxigéngyökök keletkezése kíséri. Ezután az aszkorbilgyök oxidációval vagy diszproporcionálódással továbbalakul dehidroaszkorbáttá. A dehidroaszkorbát bejut az endoplazmás retikulum lumenébe, ahol a PDI szubsztrátjaként részt vesz a fehérjék ciszteinjein lévő tiolcsoportok oxidálásában. Ilymódon a dehidroaszkorbát ismét aszkorbáttá alakul, amely nem tud több diszulfidhidat létrehozni, hacsak le nem ad két elektront, és vissza nem alakul dehidroaszkorbáttá. Erre ad lehetőséget a membránban jelen lévő tokoferol, amely összeköttetést teremt a membrán külső felszínén lévő oxigénszabadgyökök és a lumenben lévő aszkorbát között. A membrán közvetlen közelében keletkező reaktív oxigéngyökök oxidálják az E-vitamint Evitamingyökké. Ez pedig képes visszaoxidálni az aszkorbátot dehidroaszkorbáttá a lumenben. Ennek a reakcióláncnak a végső eredménye az elektronok folyamatos áramlása a ciszteincsoportoktól,

mint

primer

elektrondonoroktól

az

oxigénig,

mint

végső

elektronakceptorig (Margittai 2004; Bánhegyi és mtsai 2002; Bánhegyi és mtsai 2003). Az E-vitamin hiányában az elektrontranszfer-lánc egy fontos komponense esik ki, ami azért okoz megnövekedett lipidperoxidációt, mert a ROS E-vitamin helyett a közeli membránban lévő egyéb lipidekkel reagál; azért okoz megnövekedett aszkorbátfogyást, mert hiányzik az E-vitamingyök, amely az aszkorbátot újraoxidálja; és ugyanezért okoz csökkent tioloxidációt. Fontos megjegyezni, hogy az aszkorbát az E-vitaminhiányos mikroszómákban is kivált némi tioloxidációt. Így valószínű, hogy más lipidoldékony antioxidánsok, mint a K-vitamin vagy az ubikinon, hasonló funkciót töltenek be az endoplazmás retikulum membránjában.

23

3. ábra. Antioxidánsok szerepe az oxidatív fehérje foldingban az endoplazmás retikulumban. (Margittai 2005)

1.3.

Diszulfid kötések keletkezése

A protein folding egyik legfontosabb lépése a diszulfid hidak kialakulása. A diszulfid hidak alapvetően szükségesek a szekrécióra kerülő és a membránban elhelyezkedő fehérjék

24

stabilitásához, megfelelő működéséhez mind prokariótákban, mind eukariótákban (Sevier és Kaiser 2002). A diszulfid hidak kialakulása két elektron átvitelével járó folyamat. In vitro megtörténhet spontán, a ciszteinek tiol csoportjainak elektronleadásával egy elektron akceptorra, mint pl. a molekuláris oxigén. In vivo a tiol-diszulfid-kicserélődés révén jönnek létre a fehérjék diszulfid hídjai. Ez a reakció megtörténhet bármely tiol csoportot tartalmazó molekula (pl. glutation) és egy fehérje között. A folyamat során minden esetben kimutatható az átmenetileg jelen lévő kevert diszulfid a két molekula között, majd végeredményként az eredetileg oxidált állapotban lévő tiol csoportok redukálódnak, a redukáltak pedig oxidálódnak. Ezt a kicserélődési reakciót tiol-diszulfid-oxidoreduktázok katalizálják. Ezen enzimek legfontosabb jellemzője, hogy tartalmaznak legalább egy Cys-X-X-Cys motívumot, aminek alapvető szerepe van a diszulfid hidak kialakításában vagy felbontásában a tiol-diszulfid-kicserélődési reakció során.

1.3.1.

A diszulfid hidak kialakulása prokariótákban

A prokariótákban a diszulfid hidak a periplazmában jönnek létre (Collet és Bardwell 2002; Ritz és Beckwith 2001), ahol a DsbA („disulfide bond A”) nevű tiol-diszulfidoxidoreduktáz található. A DsbA tioljainak visszaoxidálódását a belső membránban elhelyezkedő DsbB biztosítja. Ez a fehérje az elektronokat aerob körülmények között egy ubikinon kofaktoron keresztül szállítja a molekuláris oxigénre, míg anaerob viszonyoknál a menakinon közreműködésével juttatja különböző szubsztrátokra, mint a nitrát vagy a fumarát. A prokariótákban a fent leírt DsbA-DsbB rendszer mellett létezik egy másik útvonal, amely a helytelenül kialakult diszulfid hidak izomerizációját katalizálja. Itt a periplazmában található DsbC (ami szintén egy tiol-diszulfid-oxidoreduktáz) vesz részt közvetlenül a fehérjében lévő diszulfidok átrendezésében. A DsbC redukált állapotát egy DsbD nevű fehérje tartja fenn, amely szintén a belső membránban elhelyezkedő integráns protein. Ezt pedig egy citoplazmában elhelyezkedő tioredoxin redukálja, mely a NADPH-ról vesz fel elektronokat a tioredoxin reduktáz segítségével.

25

1.3.2.

A diszulfid hidak kialakulása eukariótákban

Az eukariótákban a diszulfid hidak kialakulásának helyszíne az endoplazmás retikulum lumene. Ezt a sejtorganellumot oxidatív környezet, egyben a citoplazmáénál negatívabb redox potenciál jellemzi, mely a redukált és oxidált glutation arányában (GSH/GSSG) is megmutatkozik. Ez az arány a citoplazmában 30-100:1, míg az endoplazmás retikulum lumenében 1-3:1. Feltételezték, hogy ez az arány egy szelektív GSSG transzportnak köszönhető, és ezáltal a GSSG biztosítja az endoplazmás retikulumban a fehérjék diszulfid hídjainak kialakulásához szükséges oxidatív környezetet (Hwang és mtsai 1992).

1.3.2.1.

A protein diszulfid izomeráz

A PDI negyven évvel ezelőtti izolálása rávilágított, hogy a fehérjékben előforduló diszulfid kötések létrejötte enzimatikus folyamat (Venetianer és Straub 1964; Venetianer és Straub 1965). A PDI alapvető szerepét nyilvánvalóvá teszi, hogy az egyik legnagyobb mennyiségben előforduló enzim emlős és élesztő sejtek endoplazmás retikulumának lumenében; a sejt teljes fehérjetartalmának mintegy 0,8 %-át teszi ki (Freedman és mtsai 1994). Funkciója nélkülözhetetlen, így nem véletlen, hogy különböző fajokban leírt változatai nagyfokú konzervativitást mutatnak (Ferrari és Söling 1999). Az 55 kDa-os fehérjelánc tipikus C-terminális „endoplazmás retikulumban tartó” szekvenciát hordoz. A PDI a diszulfid kötések kialakulását, izomerizációját, továbbá redukcióját katalizálja, s emellett chaperon aktivitással is bír. Az aktív enzim négy tioredoxin-szerű doménből (a, b, b’ és a’), valamint egy c részből áll, így a PDI a tioredoxin szupercsalád tagja. Az oxidált állapotú PDI közvetlen tiol-diszulfid kicserélődési reakcióba léphet a szubsztrátfehérjékkel, melynek köztiterméke a két fehérje között kialakuló diszulfid.

1.3.2.2.

Az Ero1 fehérje

Élesztőben megtalálták az Ero1 gént, amelyről bebizonyosodott, hogy kulcsszerepet játszik a diszulfid hidak kialakulásában, így a megfelelő fehérje-tekeredésben (Frand és Kaiser 1998; Pollard és mtsai 1998). Szerepét alátámasztják az Ero1-1 mutánsokkal végzett

26

kísérletek; ilyen sejtek endoplazmás retikulumában felhalmozódnak azok a fehérjék, melyekben az „esszenciális diszulfid hidak” kialakulása és így a megfelelő tekeredés elmarad, ugyanakkor az esszenciális diszulfidot nem tartalmazó fehérjék megfelelő időben elhagyják az endoplazmás retikulumot és betöltik funkciójukat. Ez hasonlít ahhoz a folding-zavarhoz, amit vad típusú sejtek redukálószeres (DTT) kezelése után lehet megfigyelni. A mutáns sejtek tioloxidálószer diamiddal való kezelése a foldingot és a sejtek életképességét helyreállítja. Ez arra utal, hogy az Ero1 gén termékének legfontosabb szerepe az endoplazmás retikulumban lévő oxidatív környezet fenntartása. Az a megfigyelés, hogy a hibásan feltekeredett fehérjék által kiváltott endoplazmás retikulum stressz fokozza az Ero1 gén expresszióját, jól mutatja, hogy az endoplazmás retikulum stressz válasz egyik legfontosabb feladata a fehérjefolding helyreállítása. Az Ero1-1 mutáns sejtek életképességét nem sikerült visszaállítani a PDI gén túlexpresszáltatásával (Frand és Kaiser 1998), tehát ez Ero1 és a PDI funkciója egyaránt szükséges, de önmagában egyik sem elégséges a diszulfid hidak helyes kialakulásához. Ma már az is ismert, hogy az Ero1 és a PDI között funkcionális kapcsolat áll fenn, amennyiben az elektronok a PDI-től az Ero1 felé vándorolnak, így biztosítva a PDI oxidált állapotát, ami szubsztrát fehérjékben diszulfidképződéshez vezet (Frand és Kaiser 1999). Ezt a vegyes PDI-Ero1 diszulfid izolálásával bizonyították, amely a direkt tiol-diszulfid kicserélődés obligát köztiterméke. Az emlősökben is megtalálhatók az Ero1 szerepét betöltő fehérjék, az Ero1-Lα és az Ero1Lβ (Cabibbo és mtsai 2000; Pagani és mtsai 2000; Mezghrani és mtsai 2001). Normál körülmények között az Ero1-Lα katalizálja a diszulfid képződés sebesség-meghatározó lépését. Az Ero1-Lβ PDI oxidáló hatása nagyobbnak tűnik, de normál körülmények között nem expresszálódik. Szerepe elsősorban a nagy fehérjeterhelés következményeként kialakuló endoplazmás retikulum stresszben jelentős, ugyanis ekkor ez a molekula veszi át az irányítást az Ero1-Lα-tól, így hatékonyabbá válik a proteinfolding.

27

1.3.2.3.

A FAD szerepe

Az Ero1 szerepének tisztázásával felvetődött a kérdés, vajon mi biztosítja e fehérje oxidált állapotát és így működőképességét (Tu és mtsai 2000). In vivo kísérletekkel igazolták a FAD kulcsszerepét a folyamatban: FAD-hiányos sejtekben redukált állapotban lévő (tehát funkcióképtelen) Ero1 fehérje halmozódik fel, és a szekréciós fehérjék tiol csoportjai is redukált állapotban maradnak. A FAD szerepére utaló direktebb bizonyíték a tisztított Ero1 FAD-kötése, továbbá, hogy az Ero1 által katalizált fehérjeoxidációt jelentősen befolyásolja a FAD citoplazmatikus koncentrációjának fiziológiás változása. (A magas FAD koncentráció fokozza, az alacsony pedig csökkenti az Ero1 által mediált tioloxidációt.) Ezt a hatást egy endoplazmás retikulum membránban elhelyezkedő, nagy kapacitású FAD-transzporter teszi lehetővé, ami a lumenben lévő illetve citoplazmatikus szabad FAD-koncentráció gyors kiegyenlítődését biztosítja (Tu és Weissman 2002). A FAD szerepét megvizsgálták in vitro is az Rnáz-A segítségével. A molekula natív konformációjában négy diszulfid kötés található, melyek szükségesek az aktivitásához. Azt találták, hogy megfelelő mennyiségű PDI, Ero1 és FAD hozzáadására kialakult a natív szerkezetű és funkcióképes Rnáz-A. FAD helyett FMN hozzáadása ugyanakkor hatástalannak bizonyult. Tehát az Ero1, miközben „átadja” diszulfid kötését a PDI-nak, a kapott elektronokkal a FAD molekulát FADH2-vé redukálja. A végső elektronakceptor még pontosan nem ismert. Ezt a szerepet aerob körülmények között betöltheti az oxigén, de kell lennie egy másik fiziológiás elektronakceptornak is, mivel a folyamat akkor is működőképes, ha csak limitált mennyiségű oxigén áll rendelkezésre.

1.3.2.4.

A glutation szerepe

Mint azt már korábban említettem, a glutation oxidált formájának kezdetben igen fontos szerepet tulajdonítottak a fehérje diszulfid hidak kialakításában. Azonban a GSH1 mutáns (tehát glutation szintézisére képtelen) sejtekben azt találták, hogy a diszulfid híd képződése nem szenvedett károsodást (Frand és Kaiser 1998). Sőt, az Ero1-1 mutánsokban kialakított

28

GSH1 mutáció a fehérjeoxidáló aktivitás jelentős fokozódását okozza (Cuozzo és Kaiser 1999). Ez valószínűsíti, hogy a fehérje tiolcsoportok illetve a glutation tiolcsoportjai valójában kompetálnak egymással az oxidáló enzimekért, a glutation tehát redukáló ágensként van jelen az endoplazmás retikulum lumenében. In vitro kísérletekben a glutation oxidálását mind a PDI-ben, mind a szekrécióra kerülő proteinekben található diszulfid hidak redukálása eredményezheti. Tehát a glutation részt vesz a PDI izomeráz aktivitásának előtérbe kerülésében, vagyis a hibás diszulfid hidak redukálásában és így a megfelelő fehérjefolding elősegítésében, illetve az oxidatív stressz kivédésében.

1.3.2.5.

Egy alternatív szereplő, az Erv2

Az Ero1-hez kapcsolt fehérjeoxidáció mellett kimutattak egy másik, az előbbitől függetlenül működő útvonalat élesztőben (Sevier és mtsai 2001; Gerber és mtsai 2001). Ennek főszereplője egy Erv2 („essential for respiration and vegetative growth 2”) nevű protein. Ero1-1 mutánsokban az Erv2 gén túlexpresszáltatása a sejtek diszulfidképző aktivitását és életképességét visszaállítja, valamint növeli DTT iránti toleranciájukat. Az Erv2 eltávolítható (nem kovalensen kötött) FAD-ot tartalmaz. A tiolok oxidációja FADH2 termelődésével jár, amit molekuláris oxigén alakít vissza FAD-dá. Az Erv2-PDI vegyes diszulfidok kimutatásával világossá vált, hogy az Erv2 fehérje is képes a tiolok oxidálására a PDI-on keresztül. Normális körülmények között azonban ennek az útvonalnak a szerepe elhanyagolható. Az Erv2 gén deléciója nem okozott károsodást a fehérje diszulfidok kialakulásában. Az emlős sejtekben ilyen Erv2-höz hasonló lokalizációjú és funkciójú fehérjét még nem sikerült kimutatni.

1.3.3.

A diszulfid híd kialakításához kapcsolt elektrontranszfer összegzése

A 4. ábrán láthatók azok az útvonalak, melyekről ismert, hogy Saccharomyces cerevisiaeben a protein tiolok oxidációját katalizálják. A diszulfidképzéshez szükséges „oxidáló ekvivalensek” két úton kerülhetnek az endoplazmás retikulum-ba. Az egyik az Ero1

29

mediálta útvonal, ahol ez a fehérje veszi át az elektronokat a PDI-ról, amely enzim aztán a szekrécióra kerülő fehérjék oxidálásában közvetlenül vesz részt. Az „oxidáló ekvivalensek” végső forrása ismeretlen, de azt már kimutatták, hogy az elektronáramlás az Ero1-hez kapcsolt FAD-on keresztül történik. Ez a folyamat mind aerob, mind anaerob körülmények között lejátszódhat. Emellett azonban létezik egy másik, alternatív útvonal is, amely azonban csak aerob körülmények között képes a működésre. Ezt az endoplazmás retikulumhoz horgonyzott molekula, az Erv2 katalizálja, ez juttatja az „oxidáló ekvivalenseket” a PDI-ra. Az Erv2 szorosan köti kofaktorát, a FAD-ot, amelyen keresztül áramlanak az elektronok a végső elektronakceptorra, a molekuláris oxigénre.

4. ábra. Az oxidatív folding lehetséges útvonalai eukariótákban

30

1.4.

„Unfolded protein response” (UPR) és ER-függő apoptózis

1.4.1.

Az UPR fogalma és kiváltó okai

Az endoplazmás retikulum „fehérjeprocesszáló” kapacitása korlátozott, ezért a sejt homeosztázisa szempontjából lényeges, hogy a lumenbe kerülő fehérjemennyiség (fehérje töltés) ezt ne haladja meg. Az endoplazmás retikulum fehérje-túlterheléséhez vezető legfontosabb tényezők a következők: 1) Ca2+-homeosztázis megváltozása pl. intraluminális Ca2+ szintet csökkentő szerek hatására, ami azon Ca2+-függő fehérjék működését gátolja, melyek a félretekeredett fehérjéket felismernék; 2) a luminális tiolok redox státuszának megváltozása, ami a diszulfid hidak képződését vagy a kóros diszulfid hidak izomerizációját akadályozza meg; 3) integráns fehérjék, membránfehérjék túltermelése pl. virális fertőzésben; 4) a szervezet – és ezáltal az endoplazmás retikulum lumen – glukózszintjének csökkenése, ami a glikoproteinek érését gátolja (ráadásul számos glikoprotei vesz részt az unfolded proteinek felismerésében és feldolgozásában). Ha a feldolgozandó fehérjemennyiség és az ER foldingkapacitása közötti kényes egyensúly felborul – azaz a fehérje töltés tartósan meghaladja a feldolgozó kapacitást – veszélyesen megnő a „magára hagyott” (vagyis dajkafehérjék által nem támogatott) fehérjemolekulák száma. Ez pedig félretekeredett fehérjék megjelenéséhez és felszaporodásához vezet, ami az endoplazmás retikulum eredetű stressz megjelenését vonhatja maga után. Az ER stressz egy speciális adaptív mechanizmus, az unfolded protein response aktiválódását váltja ki, mely a lumenben felborult egyensúlyt hivatott helyrehozni. Az UPR három legfontosabb eleme a következő: 1) az endoplazmás retikulum foldingkapacitásának helyreállítása az ER foldázok és chaperonok szintézisének fokozásával; 2) az endoplazmás retikulum méretének megnövelése a foszfolipidek és integráns fehérjék fokozott szintézisével; 3) a proteinszintézis gátlása transzkripció és transzláció szintjén egyaránt, ezéltal a fehérje töltés csökkentése 4) az ER-asszociált degradáció (ERAD) stimulálása révén a félretekert fehérjék lumenből való kijutását és lebomlását serkenti. Ezek a változások tehát elősegítik

31

azt, hogy a félretekert fehérjék mindaddig a lumenben maradjanak, míg el nem érik natív konformációjukat, vagy pedig kijutva a citoszólba lebontásra kerüljenek.

1.4.2.

Az UPR mechanizmusa

Az endoplazmás retikulum lumenében több minőségellenőrző rendszer található (Ellgaard és mtsai 1999). Ezek hivatottak eldönteni, hogy a fehérje elérte-e natív konformációját, és így elhagyhatja-e a lument a Golgi felé. Ha a fehérjék nem érték el natív konformációjukat, visszatartja azokat a lumenben, vagy lebontásra küldi az ERAD-on keresztül. Közös vonás ezeknek a rendszereknek, hogy az éretlen vagy félretekeredett fehérjéket a felszínükön megjelenő hidrofób csoportok alapján ismeri fel. Az egyik ilyen rendszer a kalnexin/kalretikulin ciklus (Ellgaard és mtsai 1999). Ebben a ciklusban az éretlen fehérjéket az UDP-glukóz glikoprotein glukoziltranszferáz (UGGT) enzim ismeri fel és glikozilálja, a kalnexin pedig a monoglikozilált formát visszatartja a lumenben. A körből egy mannóz lehasadása révén kerülhetnek ki a fehérjék. Ha ezután megfelelően tekeredettnek találja a rendszer a proteint, az elhagyhatja a lument a Golgi felé, ha pedig továbbra is félretekeredett állapotban van, az UGGT reglikozilálja azt, és a kalnexin rendszeren keresztül retrográd transzlokációja történik meg a citoszólba, ahol a proteaszóma rendszer lebontja. A másik kiemelt minőségellenőrző rendszer (Flynn és mtsai 1989) főszereplője a BiP (vagy GRP78) dajkafehérje. Ez a félretekeredett fehérjéket ATP hasítása mellett köti meg és tartja fogva a lumenben, időt adva nekik a helyes foldingra, majd ADP – ATP cserét követően elengedi a már helyesen tekert fehérjéket. A folyamat működését számos „co-chaperon” segíti, pl. „DnaJ-like protein” és a „GRPE-like protein”. Az UPR fő regulátora az endoplazmás retikulumban elhelyezkedő három transzmembrán fehérje: IRE1, PERK és ATF6, melyeket a hozzájuk kötött BiP tart inaktív állapotban (Bertolotti és mtsai 2000). A felhalmozódó félretekeredett fehérjék magukhoz kötik a BiPet, így az IRE1, PERK és ATF6 gátlás alóli felszabadulása kiváltja az UPR-t (5. ábra). IRE1: A citoszól felé néző doménjein Ser/Thr protein kináz és RNáz aktivitással rendelkezik. A BiP a lumen felé néző oligomerizációs doménjéhez kapcsolódik, leválása után az IRE1 dimerizálódik és autofoszforilálódik, majd ennek hatására életbe lép RNáz

32

aktivitása; elhasítja egy transzkripciós faktor, az XBP-1 mRNS-ét. A hasított mRNS által kódolt protein adott DNS szekvenciákhoz, „UPR element”-ekhez képes kötődni, és indukálja az UPR-hez kapcsolódó fehérjéket, pl. számos ER-rezidens chaperont (pl. BiP, PDI), illetve az ERAD és a foszfolipidszintézis komponenseit. ATF6: Két Golgi-lokalizációs szekvenciát tartalmaz, melyek egyikéhez kapcsolódik a BiP. A BiP leválásakor az ATF6 a Golgiba transzportálódik, ahol különböző proteázok szubsztrátjaként (S1P, S2P) egy citoszólikus fragmentum keletkezik belőle, mely transzkripciós faktorként működik. Az ATF6 transzkripciós faktor ezután ATF/CRE elemekhez, illetve „ER stress response” elemekhez képes kapcsolódni és ezáltal fokozni az ER chaperononk és foldázok szintézisét (pl. BiP, CHOP), a lipogenezist, valamint az XBP1 szintézisét, mellyel az IRE1-nek szolgáltat szubsztrátot és biztosítja az UPR pozitív visszacsatolását. PERK: Leválása a BiP-ről dimerizációt és autofoszforilációt eredményez. Az így aktiválódott PERK képes az eukarióta iniciációs faktor 2α alegységének (eIF2α) foszforilálására. Ez egy GTP-kötő fehérje; normálisan a GDP eltávolításához és új GTP kötéséhez egy segítő fehérje, az eIF2B szükséges. Az eIF2α foszforilálása azonban meggátolja az eIF2B GDP/GTP cserélő funkcióját. Tehát a növekvő fehérjeterheléssel párhuzamosan csökken a fehérjék szintézise. Ez a transzlációs kontroll mechanizmus az ER stressz érzékelése után néhány perccel kifejti hatását, míg az IRE1 és ATF6 molekula által regulált transzkripciós szabályozás csak néhány óra után jelentkezik. Az eIF2α foszforilálása az általános transzlációgátlás mellett néhány mRNS lefordításához kedvező körülményeket teremt, és expressziójukat szelektíven fokozza (pl. az ATF4 transzkripciós faktor mRNS-ének transzlációját). Ez a molekula szintén a DNS „UPR element”-jeihez képes kötődni és különböző gének transzkripcióját fokozni (pl. CHOP, GADD34, ATF3). Számos sejtválaszhoz hasonlóan a transzláció UPR során kialakuló gátlása is felfüggeszthető folyamat; lényeges, hogy létezzenek olyan mechanizmusok, amelyek újraindítják a traszlációt. A gátlás lecseng, amikor az eIF2α defoszforilálódik, pl. protein foszfatáz-1 hatására. Az UPR során indukálódó gének egyike, a GADD34 gén kódolja a protein foszfatáz-1 egy regulációs alegységét. Hasonlóan az ATF4-hez, a GADD34 mRNSe is tartalmaz speciális olvasási kereteket („upstream open reading frames”; uORFs),

33

5. ábra. Az UPR-ben aktiválódó legfontosabb jelpályák. (Szegezdi és mtsai 2006)

melyek lehetővé teszik ezen mRNS lefordítását az általános transzláció gátlás során is. Az ER stressz tehát olyan géneket is indukálhat, melyek az ER stressz lecsengését készítik elő.

1.4.3.

Az ER stressz által indukált apoptózis

Ha az UPR során indukálódó adaptív mechanizmusok nem képesek megmenteni az adott sejtet az őt ért stressztől, ER stressz eredetű apoptózis indukálódik, ami a kóros sejt eliminációját segíti. Az apoptózis folyamatát intrinsic és extrinsic pályák irányítják (Schroder és Kaufman 2005; 6. ábra). Mivel az endoplazmás retikulum lumene az extracelluláris térrel ekvivalens, nem meglepő, hogy az endoplazmás retikulum stressz mind az intrinsic, mind az extrinsic mechanizmusra jellemző vonásokat mutat. Az intrinsic jelpályára jellemző, hogy stressz hatására az endoplazmás retikulum membránban a Bak és Bax proapoptotikus fehérjék konformációváltozáson vagy oligomerizáción mennek át, melynek eredményeképpen a lumenben raktározott Ca2+ felszabadul. Az emelkedett citoszól [Ca2+] aktiválja a kalpaint, mely az endoplazmás retikulumban található prokaszpáz-12-ből aktív kaszpáz-12-t hasít le. Az aktivált kaszpáz-

34

12 beindítja a kaszpáz kaszkádot (kaszpáz-9 és kaszpáz-3 szekvenciális aktiválódása). A felszabadult kalciumot a mitokondrium veszi fel, ahol a kalcium túlterhelés a membránpotenciál összeomlásához és a mitokondriális apoptotikus útvonal másodlagos aktiválódásához vezet. Az UPR valamennyi jelpályája kiválthatja a CHOP/GADD153 transzkripciós faktor indukcióját. A CHOP/GADD153 a Bcl-2 antiapoptotikus fehérje szintjének csökkenését, a proapoptotikus Bax és Bak fehérjék szintjének emelkedését váltja ki. A sejt redox státusza is változik, a glutation koncentrációja csökken. Az extrinsic jelpálya aktiválódása esetén endoplazmás retikulum stresszben az IRE1 heterotrimert képezhet a TRAF2 és az ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase) fehérjékkel, mely a c-Jun N-terminális kináz aktiválásán keresztül apoptózishoz vezet.

6. ábra. Az ER-függő apoptózis mechanizmusa (Schröder és Kaufman 2005)

35

2.

Hipotézis és célkitűzések

Munkacsoportunk korábbi in vitro eredményei szerint egyes antioxidánsok szerepet játszhatnak a szekréciós fehérjék oxidatív foldingjához kapcsolódó elektronátvivő láncolatban. Amint azt a Bevezető fejezetben részletesen ismertettem, patkány máj mikroszómában az aszkorbát enzimatikus oxidációja a fehérje tiolok diszulfiddá történő oxidációját eredményezi, és ebben a folyamatban az E-vitamin is részt vesz. A kérdés az volt, hogy van-e ezen megfigyeléseknek in vivo relevanciája, vagyis aszkorbát- és tokoferolhiányos kísérleti állatokban károsodik-e az oxidatív folding mechanizmusa. Ennek megválaszolásához abból idhultunk ki, hogy amennyiben – hipotézisünknek megfelelően – a két vitamin hiányában az oxidatív folding jelentős mértékben károsodik, akkor ennek következményei (UPR, ER stressz, és apoptózis) is várhatóan kialakulnak a sejtekben. Tehát az UPR, az ER stressz és az általa kiváltott apoptózis kimutatása aszkorbát- vagy tokoferolhiány esetén a fehérjeérés zavarára utalna, és egyben jól mutatná e két vegyület szerepét az oxidatív foldingban. Vizsgálatainkat a kísérleti állatok májszövetén végeztük, mert a májsejtek bőséges endoplazmás retikulummal rendelkeznek, ami intenzív fehérjeszintézist, illetve fehérjetioloxidációt folytat, vagyis várhatóan érzékenyek a folyamatot érintő bármely hatásra. A kísérleti munka fő célkitűzései az alábbiak voltak: -

Az in vivo vizsgálatokhoz alkalmas aszkorbát- és tokoferolhiányos állatmodellek beállítása és jellemzése. Tokoferolhiányt patkányokban, míg aszkorbáthiányt a vegyület szintézisére (az emberhez hasonlóan) képtelen tengerimalacokban terveztük előidézni. A diéták hatékonyságának ellenőrzéséhez a vitaminhiányt analítikai módszerekkel kívántuk bizonyítani. Emellett az állatok általános állapotát, testsúlygyarapodását stb. is regisztrálni akartuk.

-

Az

endoplazmás

retikulum

fehérjéinek

tiol-redox-státuszában

bekövetkező

változások kimutatása a beállított modellekben. Egyes endoplazmás retikulum

36

foldázok tiol csoportjainak redukált vagy oxidált állapota jól detektálható, ezért ilyen vizsgálatokat terveztünk az elsődleges hatás tanulmányozására. -

Skorbutos és E-vitaminhiányos állatokban az UPR és az ER stressz legfontosabb elemeinek kimutatása. Olyan fehérjék mennyiségi meghatározását terveztük, amelyekről ismert, hogy az UPR részeként indukálódnak.

-

Az ER stressz által kiváltott apoptózis vizsgálata. A tartósan fennálló vitaminhiány leküzdhetetlen ER stresszt okozhat, amely a sejtek apoptózisát eredményezi, ezért az apoptózis számszerű kimutatását is terveztük.

-

Amennyiben a vizsgált antioxidánsok hiányában nem tapasztalunk ER stresszt, az esetleges alternatív mechanizmusok feltárása. Ilyen alternatív elektronszállító molekula lehet pl. a citokróm b561, amelynek jelenlétét endoplazmás retikulumban eddig nem vizsgálták. Terveink között szerepelt ezért a molekula jelenlétének és esetleges szerepének vizsgálata az endoplazmás retikulumban.

37

3.

Módszerek

3.1.

Aszkorbáthiány előidézése tengerimalacokban

Kísérleteinket hím Hartley tengerimalacokon végeztük, melyeket megérkezésük után egy hétig normál (0,1 g/100 g aszkorbátot tartalmazó) tengerimalac tápon tartottunk. Az egy hét letelte után véletlenszerű besorolással hét, egyenként négy-négy tagú csoportra osztottuk az állatokat. Az egyik csoportba tartozó állatokat ekkor megöltük és feldolgoztuk („0 hét”). Egy másik csoport (kontroll) további négy héten keresztül kapta a normál, aszkorbátot is tartalmazó tengerimalac tápot. Az összes többi állatot aszkorbátmentes diétára állítottuk át, majd 1, 2, 3, ill. 4 hét elteltével megöltük és feldolgoztuk őket. A hetedik csoport tagjai két hétig fogyasztották az aszkorbátmentes táplálékot, majd további két hétre visszakapták a normál tengerimalac tápot aszkorbáttal, és kiegészítésül 1g/l aszkorbátot az ivóvízükbe.

3.2.

E-vitaminhiány előidézése patkányokon

Hím Wistar patkányokat két 6-6 tagú csoportra osztottunk. A kezelt csoportot 12 héten keresztül E-vitaminmentes diétán tartottunk, ami az irodalmi adatok alapján Evitaminhiányossá teszi őket (Murphy és mtsai 1992), a kontroll állatcsoport pedig normál diétát kapott. A 12 hét elteltével az állatokat levágtuk, és a májukat feldolgoztuk.

3.3.

Sejtfrakciók preparálása májszövetből

A hím Hartley tengerimalacok (500-600 g) és a hím Wistar patkányok (180-230 g) májából mikroszómát preparáltunk (Henne és Söling 1986). A frissen kivett májat apró darabokra vágva 0,3 M szaharózt, 20 mM HEPES-t (pH = 7,0) tartalmazó szaharóz-HEPES pufferbe tettük, majd Potter-Elvehjem homogenizátorral egyenletes szuszpenziót készítettünk. A szuszpenziót szaharóz-HEPES pufferrel 20%-os „koncentrációig” hígitottuk, majd centrifugacsövekbe töltöttük és lecentrifugáltuk (1000 x g, 10 perc, 4 ºC). A sejttörmeléket tartalmazó üledéket eldobtuk, a felülúszót pedig tovább centrifugáltuk (11 000 x g, 20 perc,

38

4 ºC). Az így nyert üledék a mitokondriális frakció. A citoszólt és mikroszómát tartalmazó felülúszót ultracentrifugával újra lecentrifugáltuk (100 000 x g, 60 perc, 4 ºC). A keletkezett felülúszó tartalmazza a sejtek citoplazmáját, az üledék pedig a mikroszóma frakció. Ezt MOPS pufferben (100 mM KCl-ot, 20 mM NaCl-ot, 1 mM MgCl2-ot és 20 mM MOPS-ot tartalmazó, pH 7,2-es puffer) szuszpendáltuk és újfent lecentrifugáltuk (100 000 x g, 60 perc, 4 ºC), majd végül megint MOPS pufferben reszuszpendáltuk a fehérjekoncentrációt kb. 60 mg/ml-re beállítva. A mikroszómát gyorsan lefagyasztottuk és felhasználásig folyékony nitrogénben tartottuk. A mikroszómális vezikulumok épségét, a szaharóz adására bekövetkező ozmotikus változások alapján fényszórás méréssel ellenőriztük.

Vizsgálatainkban

csak

szaharóz

adására

fenntartott

zsugorodású

mikroszómákat használtunk. A mikroszómális fehérje koncentrációt Bio-Rad kit segítségével határoztuk meg, amelyhez standardként marha szérum albumint használtunk.

3.4.

Sima és durva felszínű endoplazmás retikulum frakciók elválasztása

Kísérleteinkhez sima és durva felszínű endoplazmás retikulum mikroszómákat (SER és DER) is használtunk. A Wistar patkányok máját in situ 0,25 mM –os szacharóz oldattal perfundáltuk, majd gyorsan eltávolítottuk. Az eltávolított májakat apró darabokra vágtuk, majd Potter-Elvehjem homogenizátorban homogenizáltuk A homogenizátumot 1:1 arányban 0,25 mM –os szacharóz oldattal hígitotuk, majd lecentrifugáltuk (10 000 x g, 20 percig). Az így kapott felülúszóból 5 ml-t 15 mM CsCl-t tartalmazó 0,6 M-os szacharóz (0,7 ml) és 1,3 M-os szacharóz (3 ml) oldatra rétegeztük 10 ml-es Nalgene polikarbonát centrifuga csövekben. Ezt 80 000 x g-n, 120 percig centrifugáltuk. A centrifugálás után különválasztottuk a sima felszínű endoplazmás retikulum mikrozsóma frakciót (ez a 0,6 M és 1,3 M szacharóz oldatok határfelületén van) és a durva felszínű endoplazmás retikulum mikroszóma frakciót. Mindkettőt 10 ml végtérfogatban reszuszpendáltuk 100 mM KCl-t, 20 mM NaCl-t, 5 mM MgCl2-t, 1 mM KH2PO4-et és 10 mM MOPS-ot tartalmazó, pH=7,2 oldatban. Ezután ismét lecentrifugáltuk (80 000 x g, 45 percig). A kapott csapadékot KClMOPS pufferben reszuszpendáltuk, a fehérjekoncenrációt kb. 5 mg/ml-re beállítva. Az

39

elkészült mikroszómákat azonnal folyékon nitrogénben lefagyasztotuk és felhasználásukig ott tároltuk.

3.5.

A májak aszkorbáttartalmának mérése

A májszövet aszkorbáttartalmát fordított fázisú HPLC segítségével határoztuk meg (Harapanhalli és mtsai 1993). Ehhez a májat egy 0,05 M metafoszforsavat, 0,005 M Na2EDTA-t és 1,7 g/l K2O5S2-t tartalmazó oldatban homogenizáltuk. Ezután a homogenátumot lecentrifugáltuk (20 000 x g, 10 perc) és a felülúszót cellulóz-acetát filteren (0,2 μm pórusméret, Schleicher & Schuell) leszűrtük. Az így fehérjementesített felülúszóból vett mintát Jones Chromatography APEX Octadecyl (átlagos részecskeméret 5 μm, 15 cm X 4,6 mm) oszlopon futtattuk (Waters 2690 szeparációs egység) 0,1 M NaH2PO4, 0,2 mM Na2EDTA, pH=3,1 izokratikus mobil fázissal. Az aszkorbátot 254 nmen mért fényelnyelés alapján (Waters 2487 dual absorbance detektor) detektáltuk.

3.6.

E-vitamin mennyiségi meghatározása

E-vitamin extrakciója: 1 ml máj mikroszóma-szuszpenzióhoz vele egyező térfogatú 100 mM-os SDS oldatot adtunk és alaposan összekevertük, majd kétszeres mennyiségű (2ml) absz. etanolt adtunk hozzá, és ismét összekevertük. Ezt követően 1ml n-hexánt adtunk az elegyhez, amit alapos (30-60 sec időtartamú) keverés (vortex) követett. A vizes és szerves fázist rövid centrifugálással elválasztottuk (1000 x g, 4 perc, 4 ºC), és a szerves fázist Pasteur pipettával óvatosan leszedtük. A szerves fázisból kivettünk 500 μl-t és N2 áramoltatással bepároltuk, majd 300 μl acetonitrilben visszaoldottuk. E-vitamin mérése: A bepárolt szárazanyag E-vitamintartalmát fordított fázisú HPLC segítségével határoztuk meg (Murphy és mtsai 1992; Burton és mtsai 1985). Az izokratikus elválasztást (Waters 2690 szeparációs egység) követően az E-vitamin mennyiségét 290 nmen mutatott fényelnyelése alapján UV-VIS detektorral (Waters 2487 dual absorbance detektor) mértük. Az elválasztást Teknokroma Nucleosil 100 C18 (átlagos részecskeméret

40

5 μm, 25 cm X 4,6 mm) állófázison, metanol:hexán:acetonitril (60:20:20 V/V%) mobil fázissal végeztük.

3.7.

Lipidperoxidáció vizsgálata

A lipidperoxidációt – mint a keletkező reaktív oxidáló ágensek keletkezésének érzékeny indikátorát – máj mikroszómákon vizsgáltuk a tiobarbiturát-reaktív anyagok (TBARS) koncentrációjának mérésével. (Wills 1987)

3.8.

Western blot analízis

Az egyes stresszfehérjék expresszióját Western blottal vizsgáltuk meg. A Western blot mérésekhez egyenlő mennyiségű (20 μg) mikroszómális fehérjét vittünk fel a gélre. A polipeptid láncok méret szerinti elválasztása 9 %-os redukáló SDS poliakrilamid gélen történt (Laemmli 1970). Ezután a fehérjéket elektro-blot készülékkel transzferáltuk nitrocellulóz

vagy

PVDF

membránra

(60

perc,

100

V).

Az

egyes

minták

fehérjemennyiségét - ellenőrzésképpen - Ponceau-vörös festés után denzitometriás analízissel hasonlítottuk össze. Az egyes fehérjék immun-detektálásához felhasznált elsődleges antitestek: ERP72 – ERP72 elleni poliklonális nyúl antitest (Calbiochem); GRP94 – GRP94 elleni poliklonális nyúl antitest (Santa Cruz Biotechnology); GRP78 – GRP78 elleni poliklonális kecske antitest (Santa Cruz Biotechnology); PDI – PDI elleni poliklonális nyúl antitest (Santa Cruz Biotechnology); D-, L-, CG citokróm b561 poliklonális nyúl antitest, melyeket Han Asard laboratóriumában készítettek és ajándékként kaptunk tőle. A felhasznált másodlagos antitestek tormaperoxidáz-konjugált nyúl és kecske Ig elleni antitestek (Santa Cruz Biotechnology) voltak. Mindegyik fehérje esetében az elvárt molekulasúlynál kaptunk jelet.

41

3.9.

Egyes fehérjék tiol/diszulfid redox állapotának vizsgálata (redox Western blot)

Az ER foldázok redox állapotának meghatározásához a mikroszómát 50 mM Tris/HCl (pH 6,8) pufferben hígítottuk, és a fehérjéket 10 % triklórecetsavval precipitáltuk (Frand és Kaiser 2000). A redukált és oxidált kontroll elkészítéséhez a mikroszómákat a precipitáció előtt 0,05 M ditiotreitol vagy 0,025 M diamid jelenlétében 37 °C-on, 15 percig inkubáltuk. Centrifugálás után (10000 x g, 10 perc) az üledéket 70 % acetonnal kétszer mostuk, majd detergens jelenlétében reszuszpendáltuk (50 mM Tris/HCl, 2 % SDS, 4 M urea, pH 7,0). A fehérje-tiol csoportokat a reszuszpendáló pufferhez adott 15 mM AMS-sel (4-acetamido-4’maleimidilstilbén-2,2’-diszulfonsav) jelöltük 15 percig 0 ºC-on, majd 15 percig 37ºC-on végzett inkubációval. A mintákat nem-redukáló SDS-PAGE és Western blot segítségével analizáltuk.

3.10.

Apoptózis vizsgálata májban

Az apoptózist a tengerimalacok májának azonos lebenyében szövettani morfológia alapján vizsgáltuk. A parffinba ágyazott lebenyekből készült metszeteket hematoxilin-eozinnal festettünk meg. A zsugorodott vagy fragmentált magvú apoptotikus sejtek, illetve testek számlálását két megfigyelő végezte egymástól függetlenül. A kapott eredményeket a terminális dezoxinukleotidil transzferáz dUTP „nick-end labeling” (TUNEL) módszerrel, ApopTag Peroxidáz Kit (Chemicon, California, USA) felhasználásával is ellenőriztük, a gyártó instrukcióinak megfelelően. Az apoptózis indexet az 1000 sejtre jutó apoptotikus sejtek/testek számaként határoztuk meg.

3.11.

Statisztikai módszerek

A különböző csoportokba osztott állatokból preparált mintákban három parallellel független méréseket végeztünk. A számszerűsített eredményeket átlag ± standard hiba (SEM) alakban mutattuk be. A csoportokhoz tartozó adatokat variancia-analízis (ANOVA) módszerrel, majd Tukey többszörös összehasonlító „post hoc” analízissel, valamint

42

esetenként kétmintás Student t-próbával hasonlítottuk össze. Szignifikánsnak akkor tekintettük a különbséget, ha a számított p érték alacsonyabb volt 0,05-nél.

43

4.

Eredmények

4.1.

Aszkorbát, illetve E-vitamin megvonásának hatása az állatokra

A C-vitaminmentes diéta aszkorbát-depletáló hatását a kísérleti állatok májában HPLC-vel követtük nyomon (1. táblázat). Azoknak a tengerimalacoknak a májszövetében, amelyeket a négy hetes diéta megkezdése előtt vizsgáltunk, az irodalmi adatok alapján várt magas (közel

2

μmol/g

szövet)

aszkorbátszint

volt

mérhető.

Ugyanilyen

magas

aszkorbátmennyiséget találtunk a „kontroll” álatok májában is, amelyek 4 hétig normál, azaz aszkorbátot is tartalmazó, tengerimalac tápot kaptak. Az C-vitaminmentes diétán tartott állatokban az aszkorbát szintje gyorsan csökkent, 1 hét alatt kb. a kiindulási érték felére, a második héttől pedig már nem volt kimutatható mennyiségű aszkorbát a májban, vagyis szintje 10 nmol/g szövet alá csökkent. A diéta aszkorbát-depletáló hatása – a várakozásnak megfelelően – visszafordítható volt. Azoknak a tengerimalacoknak a májszövetében, amelyek 2 hetes aszkorbátmentes diéta után visszakapták a C-vitamint, és további két hétig fogyasztották, szintén magas aszkorbátszint volt mérhető (40%-kal magasabb, mint a kontroll, illetve a diéta megkezdése előtt vizsgált csoportokban). E-vitaminhiányt 12 héten keresztül fenntartott E-vitaminmentes diétával alakítottunk ki patkányokban. A „kontroll” állatokat ugyanennyi ideig normál patkánytápon tartottuk. Mindkét csoport tagjainak májából mikroszómát preparáltunk, és megmértük azok αtokoferol-tartalmát. Azt találtuk, hogy az E-vitaminmentes diéta az α-tokoferol mennyiségét a kontroll állatok máj mikroszómájában mérhetőhöz (0,4 nmol/mg fehérje) képest szinte nullára (6 pmol/mg fehérje) csökkentette. A két csoport állatai között nem volt jelentős különbség testsúlyuk, illetve májuk súlya tekintetében. Az E-vitaminmentes diéta által kiváltott egyetlen megfigyelhető változás az állatok szőrzetének megsárgulása volt.

44

A skorbutizáló diéta időtartama (hét) kontroll

0

1

2

3

4

2+2

1,91 ± 0,08

1,86 ± 0,05

1,07 ± 0,07*

N.D.*

N.D.*

N.D.*

2,69 ± 0,01*

TBARS, μmol/g fehérje

119 ± 14

114 ± 11

128 ± 11

121 ± 15

117 ± 9

194 ± 9*

83 ± 6

testtömeg, g

728 ± 32

550 ± 40

588 ± 25

627 ± 22

670 ± 17

612 ± 78

725 ± 21

máj tömege, g

25,8 ± 0,9

19,8 ± 1,0

23,5 ± 2,4

21,1 ± 0,8

21,2 ± 0,4

20,5 ± 1,1

26,1 ± 0,7

máj aszkorbát, μmol/g szövet

1. táblázat. A skorbutizáló diéta hatásai A májak aszkorbátkoncentrációja, a máj mikroszómákban mért lipidperoxidáció, testtömeg és a májak tömege négy hétig normál (C-vitamint tartalmazó) tengerimalac táppal etetett (kontroll), 0-4 hétig aszkorbátmentes diétán tartott vagy két hétig aszkorbátmentes, majd két hétig normál tápon tartott (2+2) tengerimalacok esetében. n=4, átlag ± SEM, *szignifikánsan különbözik a kontrolltól, p < 0,001. N.D.: nem detektálható (10 nmol/g szövet alatt).

45

4.2.

A lipidperoxidáció változása a diéta során

Mivel az E-vitamin a legfontosabb lipidoldékony antioxidáns, amelynek oxidált származékát a C-vitamin képes az eredeti állapotba visszaredukálni, C-, illetve Evitaminhiányos állapotban a biológiai membránok lipid összetevői jobban ki vannak téve az oxidatív károsodások veszélyének. Ezért a kísérleti állatok májából készített mikroszómális preparátumokon megvizsgáltuk a membránlipidek legjellemzőbb oxidatív károsodását, a lipidperoxidációt. A lipidperoxidáció számszerű jellemzése azon alapul, hogy a keletkező malondialdehid és hasonló termékek megfelelő körülmények között tiobarbituráttal színes terméket adnak (thiobarbituric acid reactive substances; TBARS), így mennyiségük fotometriásan meghatározható. A tengerimalacok esetében az in vivo bekövetkezett „bazális”, azaz stimuláció nélküli lipidperoxidációt mértük ezzel a módszerrel. Az aszkorbátmentes diétán tartott állatokban a lipidperoxidáció a diéta első 3 hete alatt nem változott (vagyis megegyezett a kontroll állatokban mérttel) (1. táblázat). A negyedik héten azonban a lipidperoxidáció jelentős emelkedését észleltük. Az a tengerimalac csoport, amelyik két hetes diéta után visszakapta az aszkorbátot a kezelés negyedik hetén a kontroll, illetve a kezeletlen állatokéval azonos normál TBARS szintet mutatott. Az E-vitaminhiányos állatok esetében a máj mikroszóma membrán antioxidáns védekező képességét vizsgáltuk. Kísérleteinkben – paradox módon – az aszkorbátot mint prooxidánst használtuk, és azzal provokáltuk az in vitro lipidperoxidációt. Korábban kimutattuk ugyanis, hogy a patkány máj mikroszóma aszkorbát-oxidáz aktivitással rendelkezik, és a dehidroaszkorbát keletkezését ROS-termelődés kíséri. Ezért a mikroszómát (1 mg fehérje/ml) 37 °C-on 60 percig 0,1 mM aszkorbát jelenlétében inkubáltuk, majd megmértük a keletkezett TBARS mennyiségét. Ilyen körülmények között az E-vitaminhiányos állatok májából készült mikroszómában a kontrollhoz képest fokozott lipidperoxidációt találtunk Az E-vitaminhiányos mikroszómák csökkent antioxidáns védekezését helyre tudtuk állítani azzal, hogy előzőleg in vitro E-vitamint adtunk hozzájuk, ami azt mutatja, hogy a jelenség valóban a vitaminhiány közvetlen hatásának volt tekinthető.

46

4.3.

Az állatok súlygyarapodása

Mivel a kialakult skorbut rendszerint az állatok (vagy ember) étvágyának csökkenésével, és – részben ezáltal – testsúlyának csökkenésével is jár, nyomon követtük ezt a hatást a kísérlet során, hogy képet kapjunk a hiánybetegség kialakulásának időbeli lefolyásáról (1. táblázat). Az aszkorbátmentes diéta az első három héten nem befolyásolta lényegesen a tengerimalacok testsúlygyarapodását, az állatok tömege ugyanabban az ütemben nőtt, mint a normál tápon tartottaké. Azoknál az állatoknál azonban, ahol az aszkorbátmegvonás négy hétig tartott – a klinikai skorbut kialakulásának jeleként – szignifikáns súlycsökkenést tapasztaltunk, mely az irodalmi adatok alapján is várható volt. Külön megmértük a tengerimalacok májának súlyát (1. táblázat), ami azonban egyformán változott az aszkorbátmentes, illetve normál diéta során. A manifeszt E-vitaminhiány tünettana szegényes; az állapotot általában nem jelzik szemmel látható vagy könnyen mérhető elváltozások. Ennek megfelelően az E-vitaminmentes táplálás sem az állatok testsúlyát, sem azok májának súlyát nem befolyásolta; a kétféle diétán tartott állatok esetében lényegében megegyeztek az erre vonatkozó adatok.

4.4.

Endoplazmás retikulum chaperonok és foldázok indukciója

Miután igazoltuk, hogy az alkalmazott diéták valóban hatékonyak voltak, és mindkét esetben sikerült gyakorlatilag nullára csökkenteni a májszövetben az adott vitamin szintjét, megkezdtük a mintákban az endoplazmás retikulum stressz vizsgálatát. A májakból készített mikroszómákban Western blottal vizsgáltuk az ER stressz legfontosabb „marker fehérjéinek” (endoplazmás retikulum chaperonok és foldázok) szintjét. Az ER stresszben rendszerint indukálódó két fő chaperon (GRP78 és GRP94) expressziója fokozatosan emelkedett a skorbutizáló diéta négy hete során. A harmadik héttől – azaz a teljes aszkorbát hiány kialakulását követően, de még a testsúlycsökkenés előtt – vált az emelkedés szignifikánssá. A GRP78 és GRP94 indukciója nem volt megfigyelhető azokban a tengerimalacokban, melyek a 2 hetes aszkorbátmentes diétát követően egy ugyanolyan hosszú, aszkorbátot is tartalmazó táplálásban részesültek. A két chaperon szintje ilyen kezelés után hasonló volt a kontroll állatokban találthoz.

47

7. ábra. A GRP94 és GRP78 indukciója skorbutban A vízszintes tengelyen a C-vitaminmentes diéta időtartama látható hetekben; K: kontroll, 4 hetes aszkorbáttartalmú diéta; 2+2: két hét aszkorbátmentes diétát követő két hetes aszkorbáttartalmú diéta. Tipikus Western blotok, illetve azok denzitometriás értékelése, n = 4, átlag ± SEM, *szignifikánsan különbözik a kontrolltól, p<0,05.

A GRP családhoz tartozó endoplazmás retikulum chaperonok mellett néhány foldáz indukciója is gyakran megfigyelhető ER stresszben. Ilyen endoplazmás retikulum foldáz a PDI és az ERP72. Megvizsgáltuk tehát e két fehérje esetleges indukcióját is az aszkorbátmentes diéta során, és – várakozásunktól eltérően – azt találtuk, hogy

48

expressziójuk nem egyformán változott. Míg a PDI szintje – az endoplazmás retikulum chaperonokéhoz hasonlóan – a diéta során egyre fokozódott, addig az ERP72 szintjében az aszkorbátmegvonás nem váltott ki lényeges emelkedést.

8. ábra. Endoplazmás retikulum foldázok expressziója skorbutban A vízszintes tengelyen a C-vitaminmentes diéta időtartama látható hetekben; K: kontroll, 4 hetes aszkorbáttartalmú diéta; 2+2: két hét aszkorbátmentes diétát követő két hetes aszkorbáttartalmú diéta. Tipikus Western blotok, illetve azok denzitometriás értékelése, n = 4, átlag ± SEM, *szignifikánsan különbözik a kontrolltól, p<0,05.

49

Ugyanezeknek az endoplazmás retikulum chaperonoknak és foldázoknak a szintjét hasonló módon, Western blottal megmértük az E-vitaminhiányos és kontroll patkányok májának mikroszómális frakciójában is (9. ábra). Az aszkorbáthiánnyal szemben, itt nem észleltünk semmilyen eltérést, tehát egyik vizsgált fehérje sem indukálódott. A patkány modellben lehetőség volt a kaszpáz-12 aktiválódásának és az eIF-2 foszforilációjának vizsgálatára is; ezek a kísérletek sem mutattak különbséget a kontroll és a tokoferol-hiányos állatok között.

9. ábra. Endoplazmás retikulum foldázok és chaperonok expressziója E-vitaminhiányban (Tipikus Western blotok, n = 4)

4.5.

Endoplazmás retikulum foldázok redox állapotának vizsgálata

Mivel a megfigyelt chaperon- és foldázindukciók hátterében – hipotézisünk szerint – az endoplazmás retikulum oxidatív folding rendszerének zavara áll, megvizsgáltuk a két említett foldáz tiol redox állapotának alakulását is. AMS reagenssel történő kezelés után gél-elektroforézissel különítettük el a redukált és oxidált tiolokat tartalmazó fehérjéket,

50

majd PDI és ERP72 elleni antitestekkel mutattuk ki a megfelelő foldázokat („redox Western blot” módszer).

10. ábra. Endoplazmás retikulum foldázok redox állapota skorbutban A redukált és oxidált tiolokat tartalmazó fehérjéket AMS reagenssel történő kezelés után gél-elektroforézissel különítettük el, majd PDI és ERP72 elleni antitestekkel mutattuk ki a megfelelő foldázokat; ox: oxidált kontroll, red: redukált kontroll, 0, ill.4: az aszkorbátmentes diéta időtartama hetekben.

Összehasonlítás céljából az in vitro oxidált, illetve redukált fehérjéket is párhuzamosan megfuttattuk. Ezzel a módszerrel nem találtunk különbséget a kontroll és a négy hétig aszkorbátmentes diétán tartott tengerimalacok májából készített fehérje minták között a foldázok redox állapotát illetően (10. ábra).

4.6.

Apoptózis indukciója a májban

Az ER stressz apoptózis kiváltója is lehet, különösen akkor, ha a stresszválasz (pl. UPR) nem képes helyreállítani az endoplazmás retikulum kiegyensúlyozott működését. Ezért megvizsgáltuk az apoptózis mértékét a májakból készített szövettani metszeteken. A diéta elkezdése előtt vizsgált tengerimalacok májában, a várakozásoknak megfelelően, igen kevés apoptotikus testet találtunk. Ugyanilyen alacsony maradt az apoptózis index (1000 sejtre jutó apoptotikus sejtek/testek száma) az aszkorbátmentes diéta első két hetében is. A diéta harmadik hetében azonban kétszeresére, a negyedik héten pedig háromszorosára

51

emelkedett az apoptózis index a kontrollhoz viszonyítva. Azokban a tengerimalacokban, melyek két hét aszkorbátmegvonás után további két hétig újra kaptak aszkorbátot, nem fokozódott az apoptózis – az apoptózis index a kontrolléval megegyező volt (11. ábra).

K

4

2+2

a)

b) 11. ábra. Az apoptózis indukciója skorbutban

Az a) ábrán három szövettani metszet látható a kontroll (K), a 4 hétig skorbutizált (4) és 2 hétig skorbutizált, majd normál diétára visszaállított (2+2) tengerimalacok májából. Az apoptotikus testek nyilakkal vannak megjelölve. A b) ábrán az apoptotikus index (1000 sejtre jutó apoptotikus testek/sejtek száma) látható az aszkorbátmentes diéta időtartamának függvényében; K: kontroll; 2+2: két hét aszkorbátmentes diétát követő két heti aszkorbáttartalmú diéta; n = 4, átlag ± SEM, *szignifikánsan különbözik a kontrolltól, p<0,05.

52

4.7.

Citokróm b561 jelenléte az endoplazmás retikulumban

Miután az E-vitaminhiányos állatokban nem alakult ki a fehérje folding súlyos károsodását jelző ER stressz, feltételeztük, hogy alternatív mechanizmusok és léteznek az endoplazmás retikulum

membránon

keresztül

történő

elektronszállításban.

Kísérleteink

során

megvizsgáltuk a citokróm b561, egy alternatív elektronszállító molekula jelenlétét az endoplazmás retikulumban Western blot technikával. A Western blot-ot patkány máj homogenátumból, posztmitokondriális felülúszóból, citoszólból, mitokondriumból, illetve mikroszómából készített mintákon végeztük el. A kromaffin granulumra (CG) és a lizoszómára (L) jellemző citokróm b561 molekula esetében nem kaptuk meg a molekulasúlynak megfelelő jelet az endoplazmás retikulumból készített mintákban, a D (duodenális) típusú citokróm b561 esetében azonban pozitív jelet kaptunk, a D típusú citokróm tehát jelen van az endoplazmás retikulumban. Ezután szerettük volna megtudni, hogy a mikroszóma melyik frakciójára jellemző az elektronszállító fehérje jelenléte. Ennek kiderítésére sima ill. durva felszínű endoplazmás retikulumból álló mikroszóma frakciókat készítettünk el, majd a frakciókból készített mintákon végeztük a Western blotot. Azt az eredményt kaptuk, hogy a D citokróm elsősorban a fehérje szintézis színteréül szolgáló DER-ban helyezkedik el, míg a SER-ban elhanyagolható mennyiségben van jelen (12. ábra).

SER

D cit b561

DER

28 kDa

12. ábra. A D citokróm b561 fehérje jelenléte a DER-ban

53

5.

Megbeszélés

Az endoplazmás retikulum egyik legfontosabb funkciója a szekréciós és membránfehérjék poszttranszlációs módosítása és oxidatív foldingja. A diszulfidhidak kialakulása az endoplazmás retikulum intraluminális fehérjéinek specifikus ciszteinil tiol csoportjai között az egyik legjellegzetesebb poszttranszlációs változás. Jelentős különbség figyelhető meg a citoszól és az endoplazmás retikulum lumen fehérjéinek [fehérje tiol] / [fehérje diszulfid] aránya között (kb. 100:1 a citoszólban, 1:1 a lumenben, illetve a szekretált fehérjékben). A különbség világosan mutatja, hogy a lumenben oxidatív környezetnek kell lennie, melynek létrehozására és fenntartására az endoplazmás retikulum transzport- és enzimrendszereinek összehangolt működése szükséges (Hwang és mtsai 1992). Minden

olyan

változás,

mely

az

endoplazmás

retikulum

intraluminális

kompartimentumának összetételét megváltoztatja, nyilvánvalóan érinti a szekréciós fehérjék oxidatív foldingját is. A lumen redox állapotának változása például gátolhatja a diszulfidhidak kialakulását, vagy éppen a szükségesnél több, nem-fiziológiás, diszulfid kötés

kialakulását

okozhatja.

A

hibás

fehérjéket

az

endoplazmás

retikulum

minőségellenőrzési rendszerei visszatartják a lumenben, a fehérjeszintézis és -folding egyensúlya megbomlik, a foldinghibás fehérjék felhalmozódnak. A fehérje-felhalmozódás stresszt jelent az organellum számára (ER stressz), melyet különböző jelpályák aktiválásával próbál a sejt megoldani. A selejtfehérje válasz („unfolded protein response”, UPR) során beinduló jelátviteli mechanizmusok végső soron az intraluminális dajkafehérjék indukciójához és a fehérjeszintézis gátlásához vezet, mely hatások együttesen visszaállíthatják a megbomlott egyensúlyt. Amennyiben a válasz elégtelen, a tartósan fennálló ER stressz végül az apoptotikus kaszkád aktiválásával programozott sejthalálhoz vezethet. Munkacsoportunk korábbi kísérletei in vitro rendszereken azt mutatták, hogy két fontos antioxidáns, az aszkorbinsav és a tokoferol, befolyásolhatja a szekréciós fehérjék oxidatív foldingját. A C-vitamin oxidált formája, a dehidroaszkorbát, elektronakceptorként vehet részt a folyamatban, melynek során a protein diszulfid izomeráz a szubsztrát fehérje tiol

54

csoportjairól elektronokat vihet át a dehidroaszkorbátra. Az aszkorbinsav és a dehidroaszkorbát valóban előmozdítja a fehérje tiol oxidációt mikroszómális rendszerben. A tokoferol a mikroszómális membrán fontos alkotórésze. Tokoferolhiányos állatok máj mikroszómájában a fehérje tiolok aszkorbátfüggő oxidációja lassul, feltételezésünk szerint azért, mert az E-vitamin transzmembrán elektronátvivőként egészíti ki a rendszert. A jelen munka legfontosabb célja az volt, hogy in vivo rendszerben is bizonyítékot találjunk a C- és E-vitamin szerepére az oxidatív fehérje foldingban. Feltételeztük, hogy a C- és Evitamin hiánya ER stresszt, UPR-t, illetve ER eredetű apoptózist okozhat. Mind az aszkorbát, mind a tokoferol hiánya elméletileg egyaránt okozhat elégtelen, illetve túlzott oxidációt az intraluminális fehérjékben. Egyrészt az antioxidáns hiány általános oxidatív túlsúlyhoz vezethet a sejten belül. Az aszkorbát prooxidánsként működve viszont – korábbi kísérleteink tanúsága szerint – résztvehet az intraluminális oxidatív környezet létrehozásában. A tokoferol hiánya pedig konzerválhatja az oxidatív túlsúlyt. Hipotézisünket igazolandó, kísérleti állatainkat hosszantartó C-, illetve E-vitaminmentes diétán tartottuk. Mivel a kísérleteinkben általánosan használt patkány aszkorbát szintézisére képes, a C-vitaminhiányt tengerimalacokon váltottuk ki. Vizsgálatainkban az állatok máját használtuk fel, mely endoplazmás retikulumban gazdag és nagymennyiségű szekréciós fehérjét szintetizál. A skorbutos tengerimalacokban az aszkorbáthiány kifejlődésével párhuzamosan számos endoplazmás retikulum stresszfehérje (GRP94, GRP78 és PDI) expressziójának fokozódását észleltük. Az indukció némi késéssel követte az aszkorbáthiány kialakulását, ami azt mutatja, hogy az aszkorbát szintje valószínűleg nem közvetlenül szabályozza az endoplazmás retikulum dajkafehérjék és foldázok indukcióját, hanem egy másodlagos mechanizmus, vagyis a foldinghibás fehérjék intraluminális felhalmozódása révén. A skorbutos májakban az apoptózis gyakorisága is növekedett a harmadik héttől kezdve. A hatás feltehetőleg az ER-függő kaszpázok (elsősorban a kaszpáz-12) aktiválódása miatt jön létre. Mivel a tengerimalac kaszpáz-12 elleni antitest kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhető, az ER-függő kaszpázaktiválódást nem tudtuk kísérletesen igazolni. Mind az endoplazmás retikulum stresszfehérjék indukcióját, mind az emelkedett apoptózist ki lehetett védeni az aszkorbinsav visszapótlásával. Amennyiben a C-vitaminhiányos

55

állatok visszakapták normál tápjukat a második héttől, a negyedik hét végére nem különböztek szignifikánsan egyik paraméter tekintetében sem a kontroll állatoktól. Tehát az ER stresszt kiváltó hatás a korai stádiumban még visszafordítható volt, és teljes kifejlődéséhez több mint két hétre volt szükség. Kísérleti eredményeink tehát igazolni látszanak azt a feltételezésünket, miszerint az aszkorbáthiány csökkenti a fehérjék tiol csoportjainak oxidációját az endoplazmás retikulum lumenben, mely érintheti az endoplazmás retikulum foldázokat (PDI, ERP72), melyek működésében a tiol-diszulfid átalakulás alapvető fontosságú. Ennek ellenére nem sikerült ezen fehérjék tioljainak redox eltolódását kimutatni a skorbutos állatok májában. Ennek egyik oka lehet, hogy a redox eltolódás átmeneti jelenség, melyet később kompenzációs mechanizmusok (mint például az UPR maga) elfedhetnek. Feltételezhető, hogy a redox eltolódás megjelenik az aszkorbáthiány egy bizonyos fokán, de az általunk vizsgált időpontokban nem volt észlelhető. Mivel a foldázok redox változását nem tudtuk kimutatni, nem mondhatjuk egyértelműen, hogy az aszkorbát antioxidáns vagy prooxidáns hatásának hiánya vezet ER stresszhez skorbutban. A patológiás történések időrendje (2. táblázat) alapján azonban inkább az utóbbi lehetőség a valószínű. A kieső antioxidáns hatás csak négy hét múlva váltott ki fokozott lipidperoxidációt, míg az UPR egyes elemei, illetve az apoptózis ennél korábban jelentkeztek.

kontroll

0 hét

1 hét

2 hét

3 hét

4 hét

2+2 hét

aszkorbáthiány

-

-

+

+++

+++

+++

-

chaperon- és foldázindukció

-

-

-

+

++

+++

-

apoptózis

-

-

-

-

+

++

-

testsúlycsökkenés

-

-

-

-

-

++

-

lipidperoxidáció

-

-

-

-

-

++

-

2. táblázat. A patológiás történések időrendje a skorbutizált tengerimalacokban.

56

Az aszkorbát ismert koszubsztrátja a prokollagén lizil- és prolil-csoportjait hidroxiláló enzimeknek. Ennélfogva fibroblasztokban, illetve prokollagént overexpresszáló sejtekben az aszkorbáthiány által kiváltott ER stressz megjelenése nem meglepő (Sitia és Braakman 2003). Eredményeink azt mutatják, hogy az aszkorbát szerepe a fehérjék oxidatív módosításában nem szorítkozik a prokollagén szintézisre, hanem általános érvényű. Az ER stressz kifejlődése aszkorbáthiány esetén a skorbut új, eddig le nem írt eleme, melyet számításba kell venni a skorbut mindmáig kevéssé ismert patomechanizmusának vizsgálatában. In vitro eredményeink és a skorbutos tengerimalacban észlelt változások alapján feltételeztük, hogy az ER stressz E-vitaminhiányos állapotban is kialakul. Ezért a fentiekhez hasonló vizsgálatokat tokoferolmentes diétán tartott patkányok máján is elvégeztük. A kísérletek teljesen negatív eredménnyel zárultak. Nem tudtunk chaperonvagy foldázindukciót kimutatni, nem fokozódott az apoptózis, nem találtunk redox eltolódást a vizsgált foldázokban. A patkány modellben lehetőség volt a kaszpáz-12 aktiválódásának és az eIF-2 foszforilációjának vizsgálatára is; ezek a kísérletek sem mutattak különbséget a kontroll és a tokoferol-hiányos állatok között. Az in vivo eredmények tehát azt sugallják, hogy az aszkorbát valóban fontos szerepet játszik az oxidatív foldingban, míg a tokoferol nélkülözhető. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy (i) az eredményeket különböző fajokban kaptuk, (ii) illetve hogy a skorbutos állatokban az aszkorbát szintje mérhetetlenül alacsony volt, a tokoferol-mentes diétával viszont csak közel teljes E-vitaminhiányt tudtunk előidézni. A tokoferol szerepét in vitro mikroszómális kísérleteink alapján abban láttuk, hogy transzmembrán elektrontranszfert közvetít: a membránban található tokoferol hozzáférhető mind a citoszól, mind az endoplazmás retikulum lumen felől a pro- és antioxidánsok számára. Amennyiben ebben a funkcióban szerepe nem kizárólagos, felvetődik a kérdés, hogy milyen más transzmembrán elektronszállító helyettesítheti. Az egyik lehetséges jelölt erre a szerepre a citokróm b561 fehérjecsalád. Tagjait először növényi sejtek plazmamembránjában mutatták ki. A fehérje két citokrómot tartalmaz a membrán két oldala felé tekintve, melyek között elektrontranszfer lehetséges. A citokrómokat aszkorbát redukálhatja, a redukált citokróm pedig monodehidroaszkorbátnak

57

adhatja át az elektront. A rendszer működése során tehát elektronok áramlanak a negatívabb

redox

potenciállal

jellemezhető

kompartimentumból

a

pozitívabb

redoxpotenciálú felé. A család tagjait később állati sejtek plazmamembránjában (például a duodenumban, ahol a vasfelszívódásban lehet szerepe), sőt intracelluláris membránokban (például a kromaffin granulumban) is kimutatták. Az endoplazmás retikulumban való előfordulásáról azonban nem számoltak be. Ezért megvizsgáltuk, hogy azon citokróm b561 fehérjék, melyek elleni antitesttel rendelkeztünk, előfordulnak-e a májsejt endoplazmás retikulumában. Western blot vizsgálataink azt mutatták, hogy a kromaffin granulumra, illetve a lizoszómára jellemző citokróm b561 izoformák nincsenek jelen a máj mikroszómális frakciójában, de a duodenum plazmamembránra specifikus fehérje kimutatható. Bár a fehérje mennyisége ebben a frakcióban elég alacsony, az elektrontranszfer direkt mérése nem is volt lehetséges, a citokróm b561mégis egy alternatív útvonalat jelenthet az oxidatív folding során felszabaduló elektronok endoplazmás retikulum lumenből való eltávolítására.

Legfontosabb új megállapításaink a következők: •

Skorbutos tengerimalacok májában kimutattuk az ER stressz elemeit (chaperon- és foldázindukció).

•

Az ER stressz megelőzte az aszkorbát mint antioxidáns hiánya által kiváltott fokozott lipidperoxidációt.

•

Skorbutos tengerimalacok májában az ER stressz mellett fokozott apoptózist is észleltünk.

•

Az aszkorbáthiánnyal kiváltott ER stressz és apoptózis aszkorbátkezeléssel kivédhető volt.

•

Tokoferolhiányos állatokban sem ER stresszt, sem fokozott apoptózist nem észleltünk.

•

Kimutattuk a citokróm b561 duodenális izoenzimének jelenlétét a máj endoplazmás retikulumában.

58

6.

Összefoglalás

Emlős sejtekben az endoplazmás retikulum (ER) lumenében játszódik le a szekréciós fehérjék egyik legfontosabb ko/poszttranszlációs módosítása, a diszulfid hidak képződése. A fehérjék tiol csoportjainak diszulfiddá alakításához oxidáló környezetre van szükség az ER lumenében, melynek jelenléte jól ismert, a kialakításáért és fenntartásáért felelős folyamatok azonban még tisztázásra várnak. Korábbi in vitro kísérleteinkben sikerült igazolnunk az aszkorbát (C-vitamin) és a tokoferol (E-vitamin) szerepét az oxidatív fehérje foldingban. Jelen kísérleteink célja a jelenség in vivo relevanciájának tisztázása volt. Ezt a C-, illetve E-vitamin hiányában esetlegesen kialakuló ER stressz, és ER stressz által indukált apoptózis vizsgálatával kívántuk ellenőrizni. Hosszantartó C- és E-vitaminmentes diétával skorbutot, illetve tokoferolhiányos állapotot hoztunk létre tengerimalacokban, illetve patkányokban. A skorbutos tengerimalacok májában sikerült kimutatnunk az ER stressz elemeit, chaperonok és foldázok indukcióját. Az ER stressz megjelenése időben megelőzte az aszkorbát mint antioxidáns hiánya által kiváltott fokozott lipidperoxidációt. A májban az ER stressz mellett fokozott apoptózist is észleltünk. Mind az aszkorbáthiánnyal kiváltott ER stressz, mind az apoptózis aszkorbátkezeléssel kivédhető volt. Tokoferolhiányos állatokban azonban sem ER stresszt, sem fokozott apoptózist nem észleltünk. Eredményeink megerősítik korábbi in vitro megfigyeléseinket, és azt mutatják, hogy az aszkorbát in vivo is fontos az oxidatív folding mechanizmusában. Ugyanakkor azt a következtetést is levonhatjuk, hogy a tokoferolt alternatív transzmembrán elektronszállítók helyettesíthetik az ER membránjában, így jelenléte az oxidatív folding szempontjából nélkülözhető.

59

7.

Summary

Disulfide bond formation, a major co-/posttranslational modification of secretory proteins, takes place in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) in mammalian cells. Oxidation of thiol groups to disulfide bonds in nascent proteins is heavily dependent on the oxidative environment in the lumen of the ER. This oxidative environment is also reflected by the thiol redox potential, which is significantly higher in the ER lumen than in the cytoplasm. However, the particulars of the generation and maintenance of this environment are still unknown. Our in vitro experiments provided with convincing evidence for the participation of ascorbate (vitamin C) and tocopherol (vitamin E) in the oxidative protein folding. The aim of the present study was to investigate the role of these antioxidant molecules in the oxidative protein folding in vivo. We wanted to verify the hypothesis by investigating the appearance of ER stress and apoptosis in ascorbate- or tocopherol-deficient animals. Vitamin E deficiency and scurvy was induced with a long-term vitamin E- and ascorbatefree diet in rats and guinea pigs. The elements of the ER stress, the induction of chaperones and foldases, were demonstrated in the liver of scorbutic guinea pigs. The ER stress anticipated the appearance of the increased lipid peroxidation caused by absent antioxidant action of ascorbate. Besides the ER stress, an increased apoptosis was also observed in the liver. Both ER stress and apoptosis provoked by ascorbate deficiency could be reversed by ascorbate readdition. Neither the ER stress, nor the increased apoptosis was observed in tocopherol deficient rats. The present results confirm our previous in vitro observations and show that ascorbate is important in the oxidative protein folding also in vivo. It is also concluded that tocopherol can be substituted by alternative electron carriers in the ER membrane; therefore this antioxidant is dispensable with regards to the oxidative protein folding.

60

Köszönetnyilvánítás Az értekezés alapját képező kísérletek a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében 2000 – 2005 között készültek, ahol 2003-ig tudományos diákkörösként, majd a Pathobiokémia Ph.D. program ösztöndíjas hallgatójaként tevékenykedtem. Munkám irányítója Dr. Csala Miklós, akinek baráti támogatásáért, szakmai, emberi tanácsaiért, kritikai megjegyzéseiért ezúton fejezem ki köszönetemet. Külön köszönöm Dr. Mandl József professzor úrnak, hogy alkalmat adott arra, hogy munkacsoportjában kutathassak. Köszönettel tartozom Dr. Bánhegyi Gábornak, Dr. Wunderlich Líviusznak és Nagy Gábornak a kutatáshoz nyújtott elméleti és gyakorlati hozzájárulásukért. Köszönöm Dr. Kiss Andrásnak és Dr. Schaff Zsuzsának az apoptózis vizsgálatában nyújtott segítségüket. Tisztelettel köszönöm Mile Valéria kísérletek során végzett munkáját.

61

Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájában publikált saját közlemények Csala M., Szarka A., Margittai É., Mile V., Kardon T., Braun L., Mandl J., Bánhegyi G.: Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch. Biochem. Biophys. 388, 55-59, 2001 Szarka A., Stadler K., Jenei V., Margittai É., Csala M., Jakus J., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 34, 317-323, 2002 Margittai É.: Participation of ascorbate and vitamin E in microsomal electron transfer chain between protein thiols and oxygen. Endoplasmic Reticulum: A Metabolic Compartment, NATO Science Series, Life and Behavioural Sciences (G. Bánhegyi, A. Burchell, A. Benedetti eds.) 363, 137-142, 2004 Margittai É.: Az aszkorbát és a tokoferol szerepe a fehérjék diszulfid hídjainak kialakulásában. Biokémia 29, 2-6, 2005 Margittai É., Bánhegyi G., Kiss A., Nagy G., Mandl J., Schaff Zs., Csala M.: Scurvy leads to endoplasmic reticulum stress and apoptosis in the liver of guinea pigs. J. Nutrition 135, 25304, 2005

Egyéb saját közlemények Piccirella S.1, Czegle I.1, Lizak B.1, Margittai E.1, Senesi S., Papp E., Csala M., Fulceri R., Csermely P., Mandl J., Benedetti A., Banhegyi G.: Uncoupled redox systems in the lumen of the endoplasmic reticulum: Pyridine nucleotides stay reduced in an oxidative environment. J. Biol. Chem. 281, 4671-7, 2006 (1 megosztott első szerzőség)

62

Irodalomjegyzék Bánhegyi G, Braun L, Csala M, Puskás F, Mandl J. (1997) Ascorbate metabolism and its regulation in animals. Free Radic Biol Med 23: 793-803 Bánhegyi, G., Braun, L., Csala, M., Puskás, F., Somogyi, A., Kardon, T., Mandl, J. (1998) Ascorbate and environmental stress Ann N Y Acad Sci 851: 292-303 Bánhegyi, G., Csala, M., Benedetti, A., Mandl, J. (2002) Role of ascorbate in oxidative protein folding. Thiol Metabolism and Redox Regulation of Cellular Functions. NATO Science Series, Life and Behavioural Sciences (Pompella A, Bánhegyi G, WellmannRousseau M, eds.) 347: 38-47 Bánhegyi G, Csala M, Braun L, Garzó T, Mandl J. (1996) Ascorbate synthesis-dependent glutathione consumption in mouse liver. FEBS Lett 381: 39-41 Bánhegyi G, Csala M, Szarka A, Varsányi M, Benedetti A, Mandl J. (2003) Role of ascorbate in oxidative protein folding. Biofactors 17: 37-46 Bánhegyi G, Marcolongo P, Puskás F, Fulceri R, Mandl J, Benedetti A. (1998) Dehydroascorbate and ascorbate transport in rat liver microsomal vesicles. J Biol Chem 273: 2758-62 Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. (2000) Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol 2: 32632 Braun L, Csala M, Poussu A, Garzó T, Mandl J, Bánhegyi G. (1996) Glutathione depletion induces glycogenolysis dependent ascorbate synthesis in isolated murine hepatocytes. FEBS Lett 388: 173-6 Braun L, Kardon T, El Koulali K, Csala M, Mandl J, Banhegyi G. (1999) Different induction of gulonolactone oxidase in aromatic hydrocarbon-responsiveor unresponsive mouse strains. FEBS Lett 463: 345-9

63

Braun L, Mile V, Schaff Z, Csala M, Kardon T, Mandl J, Banhegyi G. (1999) Induction and peroxisomal appearance of gulonolactone oxidase upon clofibrate treatment in mouse liver. FEBS Lett 458: 359-62. Buettner GR. (1993) The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, alpha-tocopherol, and ascorbate. Arch Biochem Biophys 300: 535-43 Buettner GR, Jurkiewicz BA. (1996) Catalytic metals, ascorbate and free radicals: combinations to avoid. Radiat Res 145: 532-41 Buettner GR, Schafer FQ. (2000) Free radicals, oxidants, and antioxidants. Teratology 62: 234 Burton GW, Webb A, Ingold KU. (1985) A mild, rapid, and efficient method of lipid extraction for use in determining vitamin E/lipid ratios. Lipids 20: 29-39 Cabibbo A, Pagani M, Fabbri M, Rocchi M, Farmery MR, Bulleid NJ, Sitia R. (2000) ERO1-L, a human protein that favors disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 275: 4827-33 Cameron E, Pauling L. (1976) Supplemental ascorbate in the supportive treatment of cancer: Prolongation of survival times in terminal human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 73: 3685-9 Chaudiere J, Ferrari-Iliou R. (1999) Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food Chem Toxicol 37: 949-62 Coassin M, Tomasi A, Vannini V, Ursini F. (1991) Enzymatic recycling of oxidized ascorbate in pig heart: one-electron vs two-electron pathway. Arch Biochem Biophys 290: 458-62 Collet JF, Bardwell JC. (2002) Oxidative protein folding in bacteria. Mol Microbiol 44: 1-8 Creagan ET, Moertel CG, O'Fallon JR, Schutt AJ, O'Connell MJ, Rubin J, Frytak S. (1979) Failure of high-dose vitamin C (ascorbic acid) therapy to benefit patients with advanced cancer. A controlled trial. N Engl J Med 301: 687-90

64

Csala M, Braun L, Mile V, Kardon T, Szarka A, Kupcsulik P, Mandl J, Bánhegyi G. (1999) Ascorbate-mediated electron transfer in protein thiol oxidation in the endoplasmic reticulum. FEBS Lett 460: 539-43 Csala M, Mile V, Benedetti A, Mandl J, Banhegyi G. (2000) Ascorbate oxidation is a prerequisite for its transport into rat liver microsomal vesicles. Biochem J 349: 413-5 Csala M, Szarka A, Margittai E, Mile V, Kardon T, Braun L, Mandl J, Bánhegyi G. (2001) Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch Biochem Biophys 388: 55-9 Cuozzo JW, Kaiser CA. (1999) Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation. Nat Cell Biol 1: 130-5 Dawson CR, Strothkamp KG, Krul KG. (1975) Ascorbate oxidase and related copper proteins. Ann N Y Acad Sci 258: 209-20 Dinchuk JE, Focht RJ, Kelley JA, Henderson NL, Zolotarjova NI, Wynn R, Neff NT, Link J, Huber RM, Burn TC, Rupar MJ, Cunningham MR, Selling BH, Ma J, Stern AA, Hollis GF, Stein RB, Friedman PA. (2002) Absence of post-translational aspartyl betahydroxylation of epidermal growth factor domains in mice leads to developmental defects and an increased incidence of intestinal neoplasia. J Biol Chem 277: 12970-7 Duarte TL, Lunec J (2005) Review: When is an antioxidant not an antioxidant? A review of novel actions andreactions of vitamin C. Free Radic Res 39: 671-86 Eipper BA, Mains RE, Glembotski CC. (1983) Identification in pituitary tissue of a peptide alpha-amidation activity that acts on glycine-extended peptides and requires molecular oxygen, copper, and ascorbic acid. Proc Natl Acad Sci U S A 80: 5144-8 Ellgaard L, Molinari M, Helenius A. (1999) Setting the standards: quality control in the secretory pathway Science 286: 1882-8 Englard S, Seifter S. (1986) The biochemical functions of ascorbic acid. Annu Rev Nutr 6: 365-406

65

Ferrari DM, Soling HD. (1999) The protein disulphide-isomerase family: unravelling a string of folds. Biochem J 339: 1-10 Fleming PJ, Kent UM. (1991) Cytochrome b561, ascorbic acid, and transmembrane electron transfer. Am J Clin Nutr 54: 1173S-1178S Flynn GC, Chappell TG, Rothman JE. (1989) Peptide binding and release by proteins implicated as catalysts of protein assembly. Science 245: 385-90 Frand AR, Kaiser CA. (1998) The ERO1 gene of yeast is required for oxidation of protein dithiols in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 1: 161-70 Frand AR, Kaiser CA. (1999) Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 4: 469-77 Frand AR, Kaiser CA. (2000) Two pairs of conserved cysteines are required for the oxidative activity of Ero1p in protein disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell 11: 2833-43 Freedman RB, Hirst TR, Tuite MF. (1994) Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci 19: 331-6 Gerber J, Muhlenhoff U, Hofhaus G, Lill R, Lisowsky T. (2001) Yeast ERV2p is the first microsomal FAD-linked sulfhydryl oxidase of the Erv1p/Alrp protein family. J Biol Chem 276: 23486-91 Gronke RS, Welsch DJ, VanDusen WJ, Garsky VM, Sardana MK, Stern AM, Friedman PA. (1990) Partial purification and characterization of bovine liver aspartyl betahydroxylase. J Biol Chem 265: 8558-65 Harapanhalli RS, Howell RW, Rao DV. (1993) Testicular and plasma ascorbic acid levels in mice following dietary intake: a high-performance liquid chromatographic analysis. J Chromatogr 614: 233-43

66

Henne V, Söling HD. (1986) Guanosine 5'-triphosphate releases calcium from rat liver and guinea pig parotidgland endoplasmic reticulum independently of inositol 1,4,5trisphosphate. FEBS Lett 202: 267–273 Horemans N, Foyer CH, Asard H. (2000) Transport and action of ascorbate at the plant plasma membrane. Trends Plant Sci 5: 263-7 Hulse JD, Ellis SR, Henderson LM. (1978) Carnitine biosynthesis. beta-Hydroxylation of trimethyllysine by an alpha-ketoglutarate-dependent mitochondrial dioxygenase. J Biol Chem 253: 1654-9 Hwang C, Sinskey AJ, Lodish HF. (1992) Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257: 1496-502 King, CG (1953) The discovery and chemistry of vitamin C. Proc Nutr Soc, 12: 219-227 Kivirikko KI, Myllyharju J. (1998) Prolyl 4-hydroxylases and their protein disulfide isomerase subunit. Matrix Biol 16: 357-68 Knowles HJ, Raval RR, Harris AL, Ratcliffe PJ. (2003) Effect of ascorbate on the activity of hypoxia-inducible factor in cancer cells. Cancer Res 63: 1764-8 Kramer J.G.H. (1739) Medicina castrensis. Wien, Austria. Kurtzböck Lachance P, Langseth L. (1994) The RDA concept: time for a change? Nutr Rev 52: 266-70 Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-5 Lancaster DE, McDonough MA, Schofield CJ. (2004) Factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) and other asparaginyl hydroxylases. Biochem Soc Trans 32: 943-5 Lando D, Peet DJ, Gorman JJ, Whelan DA, Whitelaw ML, Bruick RK. (2002) FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxiainducible factor. Genes Dev 16: 1466-71

67

Levin EY, Levenberg B, Kaufman S. (1960) The enzymatic conversion of 3,4dihydroxyphenylethylamine to norepinephrine. J Biol Chem 235: 2080-6 Lind J. (1753) A Treatise of the Scurvy. Edinburgh, UK. Sands, Murray & Cochran Lindstedt G, Lindstedt S. (1970) Cofactor requirements of gamma-butyrobetaine hydroxylase from rat liver. J Biol Chem 245: 4178-86 Maeda T, Sepe P, Lahousse S, Tamaki S, Enjoji M, Wands JR, de la Monte SM. (2003) Antisense oligodeoxynucleotides directed against aspartyl (asparaginyl) betahydroxylase suppress migration of cholangiocarcinoma cells. J Hepatol 38: 615-22 Margittai É. (2004) Participation of ascorbate and vitamin E in microsomal elektron transfer chain between protein thiols and oxygen. Endoplasmic Reticulum: A Metabolic Compartment, NATO Science Series, Life and Behavioural Sciences (Bánhegyi G, Burchell A, Benedetti A. eds.) 363: 137-142 May V, Mains RE, Eipper BA. (1989) Ability of cofactors to support peptide amidation is cell-type specific. Horm Res 32: 18-21 McKie AT, Barrow D, Latunde-Dada GO, Rolfs A, Sager G, Mudaly E, Mudaly M, Richardson C, Barlow D, Bomford A, Peters TJ, Raja KB, Shirali S, Hediger MA, Farzaneh F, Simpson RJ. (2001) An iron-regulated ferric reductase associated with the absorption of dietary iron. Science 291: 1755-9 Meister A. (1994) Glutathione-ascorbic acid antioxidant system in animals. J Biol Chem.269: 9397-400 Mezghrani A, Fassio A, Benham A, Simmen T, Braakman I, Sitia R. (2001) Manipulation of oxidative protein folding and PDI redox state in mammalian cells. EMBO J 20: 6288-96 Moran GR. (2005) 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase. Arch Biochem Biophys 433: 117-28

68

Murphy ME, Scholich H, Sies H. (1992) Protection by glutathione and other thiol compounds against the loss of protein thiols and tocopherol homologs during microsomal lipid peroxidation. Eur J Biochem 210: 139-46 Murthy AS, Keutmann HT, Eipper BA. (1987) Further characterization of peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase from bovine neurointermediate pituitary. Mol Endocrinol 1: 290-9 Myllyharju J (2003) Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes of collagen biosynthesis. Matrix Biol 22: 15-24 Myllyla R, Kuutti-Savolainen ER, Kivirikko KI. (1978) The role of ascorbate in the prolyl hydroxylase reaction. Biochem Biophys Res Commun 83: 441-8 Myllyla R, Majamaa K, Gunzler V, Hanauske-Abel HM, Kivirikko KI. (1984) Ascorbate is consumed stoichiometrically in the uncoupled reactions catalyzed by prolyl 4hydroxylase and lysyl hydroxylase. J Biol Chem 259: 5403-5 Nardai G, Braun L, Csala M, Mile V, Csermely P, Benedetti A, Mandl J, Bánhegyi G. (2001) Protein-disulfide isomerase- and protein thiol-dependent dehydroascorbate reduction and ascorbate accumulation in the lumen of the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 276: 8825-8 Nardai G, Korcsmáros T, Papp E, Csermely P. (2003) Reduction of the endoplasmic reticulum accompanies the oxidative damage of diabetes mellitus. Biofactors 17: 25967 Padayatty SJ, Katz A, Wang Y, Eck P, Kwon O, Lee JH, Chen S, Corpe C, Dutta A, Dutta SK, Levine M. (2003) Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention. J Am Coll Nutr, 22: 18-35 Padayatty SJ, Levine M. (2001) Vitamin C and coronary microcirculation. Circulation, 103: E117

69

Pagani M, Fabbri M, Benedetti C, Fassio A, Pilati S, Bulleid NJ, Cabibbo A, Sitia R. (2000) Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-lbeta (ERO1-Lbeta), a human gene induced in the course of the unfolded protein response. J Biol Chem 275: 23685-92 Pauling L. (1970) Evolution and the need for ascorbic acid. Proc Natl Acad Sci U S A 67: 1643-8 Pollard MG, Travers KJ, Weissman JS. (1998) Ero1p: a novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 1: 171-82 Prigge ST, Mains RE, Eipper BA, Amzel LM. (2000) New insights into copper monooxygenases and peptide amidation: structure, mechanism and function. Cell Mol Life Sci 57: 1236-59 Puskás F, Braun L, Csala M, Kardon T, Marcolongo P, Benedetti A, Mandl J, Bánhegyi G. (1998) Gulonolactone oxidase activity-dependent intravesicular glutathione oxidation in rat liver microsomes. FEBS Lett 430: 293-6 Rebouche CJ. (1991) Ascorbic acid and carnitine biosynthesis. Am J Clin Nutr 54: 1147S1152S Reiter RJ. (1995) Oxidative processes and antioxidative defense mechanisms in the aging brain. Faseb J. 9: 526-33 Ritz D, Beckwith J. Roles of thiol-redox pathways in bacteria. (2001) Annu Rev Microbiol 55: 21-48 Rose RC, Bode AM. (1993) Biology of free radical scavengers: an evaluation of ascorbate. Faseb J, 7: 1135-1142 Schroder M, Kaufman RJ. (2005) ER stress and the unfolded protein response. Mutat Res 569: 29-63 Schwarz RI, Kleinman P, Owens N. (1987) Ascorbate can act as an inducer of the collagen pathway because most steps are tightly coupled. Ann N Y Acad Sci 498: 172-85

70

Sevier CS, Cuozzo JW, Vala A, Aslund F, Kaiser CA. (2001) A flavoprotein oxidase defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulphide bond formation. Nat Cell Biol 3: 874-82 Sevier CS, Kaiser CA. (2002) Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 836-47 Sitia R, Braakman I. (2003) Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature 426: 891-4 Szarka A, Stadler K, Jenei V, Margittai E, Csala M, Jakus J, Mandl J, Bánhegyi G. (2002) Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J Bioenerg Biomembr 34: 317-23 Tsubaki M, Takeuchi F, Nakanishi N. (2005) Cytochrome b561 protein family: expanding roles and versatile transmembrane electron transfer abilities as predicted by a new classification system and protein sequence motif analyses. Biochim Biophys Acta 1753: 174-90 Tu BP, Ho-Schleyer SC, Travers KJ, Weissman JS. (2000) Biochemical basis of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science 290: 1571-4 Tu BP, Weissman JS. (2002) The FAD- and O(2)-dependent reaction cycle of Ero1mediated oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 10: 983-94 Tu BP, Weissman JS. (2004) Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J Cell Biol 164: 341-6 Van der Zee J, Van den Broek PJ. (1998) Determination of the ascorbate free radical concentration in mixtures of ascorbate and dehydroascorbate. Free Radic Biol Med 25: 282-6 Venetianer P, Straub FB. (1964) The mechanism of action of the ribonuclease-reactivating enzyme. Biochim Biophys Acta 89: 189-90

71

Venetianer P, Straub FB. (1965) Studies on the mechanism of action of the ribonucleasereactivating enzyme. Acta Physiol Acad Sci Hung 27: 303-15 Wang QP, VanDusen WJ, Petroski CJ, Garsky VM, Stern AM, Friedman PA. (1991) Bovine liver aspartyl beta-hydroxylase. Purification and characterization. J Biol Chem 266: 14004-10 Wells WW, Xu DP. (1994) Dehydroascorbate reduction. J Bioenerg Biomembr 26: 369-77. Wells WW, Xu DP, Yang YF, Rocque PA. (1990) Mammalian thioltransferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity. J Biol Chem 265: 15361-4 Wills ED. (1987) Evaluation of lipid peroxidation in lipids and biological membranes. Biochemical toxicology, a practical approach Oxford, UK (Snell K, Mullock B. eds.) 127-52 Zannoni VG, La Du BN. (1959) The tyrosine oxidation system of liver. IV. Studies on the inhibition of p-hydroxyphenylpyruvic acid oxidase by excess substrate. J Biol Chem 234: 2925-31 Zhang DL, Su D, Berczi A, Vargas A, Asard H. (2006) An ascorbate-reducible cytochrome b561 is localized in macrophage lysosomes. Biochim Biophys Acta doi: 10.1016/j.bbagen.2006.1007.1019

72