Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program
Doktori (PhD) tézisek
Az endoplazmatikus retikulum redox állapotának változásai és ennek funkcionális következményei stressz folyamán Papp Eszter Témavezető: Prof. Csermely Péter
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Ligeti Erzsébet Tagjai: Dr. Tretter László, Dr. Váradi András Opponenesek: Dr. Mócsai Attila, Dr. Magócsi Mária
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest 2006
Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................................................................2 1
BEVEZETÉS ......................................................................................................................................4
2
IRODALMI ÁTTEKINTÉS..............................................................................................................6
2.1 STRESSZVÁLASZ AZ ER-BEN ÉS A CITOPLAZMÁBAN .....................................................................................6 2.1.1 Az ER stresszfehérjéi, stresszválasz az endoplazmás retikulumban: rövid távú hatások......6 2.1.1.1
Az endoplazmás retikulum közege.................................................................................................. 6
2.1.2
Citoplazmatikus stresszválasz, a citoplazma stresszfehérjéi: rövid távú hatások...............18 2.2 REDOX SZABÁLYOZÁS ÉS STRESSZ AZ ER-BEN ÉS A CITOPLAZMÁBAN ........................................................20 2.2.1 Redox rendszerek és redox stressz az ER-ben: rövid távú hatások.....................................21 2.2.2 Kis molekulák szerepe a redox fehérje tekeredésben..........................................................22 2.2.3 Redox rendszerek és oxidatív stressz a citoplazmában: rövid távú hatások .......................23 2.2.4 Stresszfehérjék és redox változások krónikus megbetegedésekben: hosszú távú hatások...26 2.2.4.1
Az alfa-1-antitripszin deficiencia mint a krónikus stressz egyik modellje .................................... 27
3
CÉLKITŰZÉSEK ............................................................................................................................31
4
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................................32
4.1 ANYAGOK ...................................................................................................................................................32 4.2 MÓDSZEREK ................................................................................................................................................33 5
EREDMÉNYEK ...............................................................................................................................38
5.1 A FAD SZEREPE AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUM REDOX FEHÉRJE TEKERÉSÉBEN ........................................38 5.1.1 Kis molekulák hatása a mikroszómális tiolok redox állapotára .........................................38 5.1.2 A FAD hatása a mikroszómális tiolok oxidálására ............................................................39 5.1.3 A FAD hatása az oxidatív fehérjetekerő apparátus elemeire .............................................43 5.1.4 A PDI gátlásának hatása a FAD előidézte tiol-oxidációra ................................................45 5.2 AZ ALFA1-ANTITRIPSZIN AGGREGÁCIÓ OKOZTA VÁLTOZÁSOK AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMBAN ............49 5.2.1 A PiZ egerek .......................................................................................................................49 5.2.2 A PiZ egerek stresszfehérje szintjei ....................................................................................51 5.2.3 A PiZ egerek redox viszonyai .............................................................................................55 5.2.4 Chaperon komplexek PiZ egerekben ..................................................................................58 5.2.5 A PDI funkciója PiZ egerekben ..........................................................................................65 6
EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE..............................................................................................67
6.1 A FAD SZEREPE AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUM REDOX FEHÉRJE TEKERÉSÉBEN ........................................67 6.2 AZ ALFA1-ANTITRIPSZIN AGGREGÁCIÓ OKOZTA VÁLTOZÁSOK AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMBAN ............71 7
TÉZISEK ..........................................................................................................................................77
8
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..........................................................................................................78
9
IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................................................79
9.1 A DOKTORI ÉRTEKEZÉSHEZ KÖZVETLENÜL KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE..................................96 9.1.1 Első szerzős közlemények ...................................................................................................96 9.1.2 Társszerzős közlemények ....................................................................................................96 9.2 A DOKTORI ÉRTEKEZÉSHEZ KÖZVETVE KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK: .......................................................96 9.3 KÖNYVFEJEZETEK .......................................................................................................................................97
1
Rövidítések jegyzéke AAT
alfa1-antitripszin
A-beta
amiloid béta fehérje
ADP
adenozin-difoszfát
AGE
advanced glycation endproduct - fehérjeglikációs végtermék
AMS
4-acetamido-4’-maleimidilstilbén-2,2’-diszulfonsav
Apaf-1
apoptózis aktiváló fehérje 1
AT
antitest
ATF
activating transcription factor – aktiváló transzkripciós faktor
ATP
adenozin-trifoszfát
bZIP
endoplazmás retikulum stressz esetén indukált transzkripciós faktor
BiP
immunoglobulin nehézlánckötő fehérje, Grp78
cAMP
ciklikus adenozin-monofoszfát
CHOP
DNA damage inducible protein – proapoptotikus protein
CFTR
cisztás fibrózis konduktancia regulátor
CLN
calnexin: glikoprotein kötő endopazmás retikulum chaperon
DEAE
dietil-amino-etán
DHA
dehidroaszkorbinsav
DIDS
4,4'-Diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate
di-FiTC-inzulin fluoreszcein-tiokarbamil-csoportokkal jelölt inzulin DsbA
E. coli protein diszulfid izomeráz
DsbB
E. coli DsbA oxidáló fehérje
DTT
D,L-ditiotreitol
EDEM
ER degradation enhancing alpha mannosidase-like protein – ER degradációt segítő alfa mannozidáz szerű fehérje
EDTA
etiléndiamin-tetraecetsav, kelátor
eIF-2α
eukarióta iniciációs faktor 2α alegysége
ER
endoplazmás retikulum
ERAD
endoplasmic reticulum associated degradation – endoplazmás retikulumhoz kötött fehérje degradáció
ERO1(-L)
endoplazmás retikulum oxidáló fehérje (emlős)
ERp
endoplazmás retikulum fehérje
ERSE
endoplazmás retikulum stresszválasz elem
2
FAD
flavin adenin dinukleotid
GFP
zöld fluoreszcens fehérje
Grp
glukóz regulált fehérje
GSH
redukált glutation
GSH
glutation
GSSG
oxidált glutation
HSBP1
hősokkfaktor kötő fehérje
Hsc
konstitutívan expresszálódó hősokkfehérje
HSE
hősokk-elem
HSF
hősokkfaktor
Hsp
hősokkfehérje
IL-2
interleukin-2
IRE1
inositol requiring protein 1, ER stressz transzdukciós faktor
KDEL
endoplazmás retikulum retenciós szignál (Lys-Asp-Glu-Leu)
NAD(P)H
nikotinamid adenin dinukleotid (foszfát)
NF-kappaB
nukleáris faktor kappaB, stressz indukálta transzkripciós faktor
NF-Y
nukleáris faktor-Y, transzkripciós faktorok kötődését elősegítő általános transzkripciós faktor
MsrA
metionin szulfoxid reduktáz A
PCR
polimeráz láncreakció, DNS szakasz felszaporítására szolgáló eljárás
PDI
protein diszulfid izomeráz
PERK
kétszálú RNS aktiválta protein kináz-szerű ER kináz
PIM
M-típusú, egészséges alfa1-antitripszin
PIZ
Z típusú, mutáns alfa1-antitripszin
PMSF
fenil-metil-szulfonil-fluorid, proteázgátló
PVDF
polivinilidén-difluorid
ROS
reaktív oxigén szabadgyök
Sec61
endoplazmás retikulum transzlokon
SDS-PAGE
nátrium dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis
SOD
szuperoxid diszmutáz
TRX
tioredoxin
UGGT
UDP–glükóz glikoprotein transzferáz, ER stresszfehérje
UPR
unfolded protein response – betekeretlen fehérje válasz
XBP
X-domén kötő fehérje, stressz idukálta transzkripciós faktor
3
1 Bevezetés Laboratóriumunk Prof. Csermely Péter vezetésével sok éve vizsgálja a stresszfehérjék, illetve a chaperonok tulajdonságait és jelentőségét különböző élettani folyamatok során. A chaperon funkciójú fehérjék köre a kutatások nyomán szinte napról napra bővül, és a már ismert stresszfehérjék illetve chaperonok is mindig újabb tulajdonságokat mutatnak. Bár a stresszfehérjék és a molekuláris chaperonok (vagy más néven dajkafehérjék) családjai jócskán átfednek, mégis szükséges, hogy e két típusú fehérjét megkülönböztessük egymástól. A molekuláris chaperonok általában konstitutívan expresszálódó fehérjék, amelyek a sejt számos funkciójának ellátásában nyújtanak segítséget. A chaperonok az újonnan szintetizált fehérjék betekerése mellett bizonyos fehérjék (pl. receptorok) szerkezetének megtartásában, a szignalizációban és a fehérjék lebontásában is részt vesznek (33). A stresszfehérjék különböző stresszhatásokra indukálódnak. Például a leggyakrabban vizsgált stressz, a hősokk hatására termelődnek a hősokkfehérjék, a Hsp-k (63). A glükóz megvonás hatására egy másik csoport, a glükóz regulálta fehérjék, a Grp-k szintje emelkedik (90, 91). Egy egészen másik csoportja a stresszfehérjéknek az, amely az endoplazmás retikulumban felhalmozódó betekeretlen fehérjék hatására fejeződik ki jobban. A stresszfehérjék és a molekuláris chaperonok funkciója tehát átfed, azonban mégsem egyezik. Molekuláris chaperon lehet olyan fehérje is, amelynek szintje nem változik a beavatkozások hatására, míg a stresszre indukálódó fehérjék nem mindegyike rendelkezik dajkafehérje tulajdonságokkal (101). Ezek a fehérjék azonban mind közösek abban, hogy alkalmasak a stressz okozta károsodásokat megakadályozni, orvosolni vagy legalábbis a következmények súlyosságát enyhíteni. A különböző stressz típusok hatására bekövetkező akut választ számos kutatócsoport vizsgálja, azonban kevés szó esik arról, miként reagál a sejt a krónikusan fennálló stresszre, azaz arról, hogy ha a sejt a stressz ellenére a túlélés mellett dönt, milyen módon kell a rendszerét átállítania, hogy a zavar ellenére a funkcióit minél jobb hatásfokkal elvégezhesse.
4
Doktori munkám során elsősorban az endoplazmás retikulum chaperonjaival foglalkoztam. Mivel az endoplazmás retikulum a redox fehérjetekeredés helyszíne, és emiatt igen érzékeny a redox egyensúlyok fenntartására, kikerülhetetlen, hogy ezen organellum redox tulajdonságait is vizsgáljuk. Így munkám egy részében a redox tekeredést befolyásoló, a redox egyensúlyra ható kis molekulákkal foglakoztam, másrészt arra kerestem a választ, hogy a krónikus megbetegedésekben, amelyek modelljeként a mutáns alfa1-antitripszint hordozó transzgén egereket választottuk, milyen szerepe lehet a chaperonoknak, köztük a redox tekeredés résztvevőinek a betegségek tüneteinek kialakulásában. Laboratóriumunkban ezeknek a kutatásoknak már hagyománya van, hiszen Dr. Nardai Gábor munkatársam egy másik krónikus betegség, a diabétesz állatmodelljein bizonyította be, hogy a redox tekeredést szabályozó fehérjéknek komoly szerepe lehet a cukorbetegség patomechanizmusában. A kismolekulák szerepének vizsgálatát a redox tekeredésben Prof. Mandl József és Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közösen végeztük. Ebből a gyümölcsöző együttműködésből igen sokat tanultam. Azok az eredmények, amelyeket e dolgozatban összefoglalok, több, nemzetközi folyóiratban megjelent közlemény alapját alkotják. A kísérletek egy részét laboratóriumunk diákkörösével, Korcsmáros Tamással végeztük közösen. E kísérletekből Tamásnak helyezést érdemlő diákköri munkája született. A kísérletek egy másik csoportja pedig Száraz Péter szakdolgozatának a része volt. Az eredmények ismertetésénél megemlítem majd azokat, akik az adott kísérletcsoport elvégzésében részt vettek.
5
2 Irodalmi áttekintés 2.1 2.1.1
Stresszválasz az ER-ben és a citoplazmában Az ER stresszfehérjéi, stresszválasz az endoplazmás retikulumban: rövid távú hatások
2.1.1.1 Az endoplazmás retikulum közege Annak érdekében, hogy az endopazmás retikulumot érintő stressz jelentősége érthetővé váljon, az endoplazmás retikulum sajátosságairól és szerepéről is szeretnék említést tenni. Az endoplazmás retikulum (ER) membránnal határolt sejtorganellum. Határoló membránja
a
sejtmag
membránjával
és
a
mitokondriális
membránnal
is
összeköttetésben van, lumene pedig sok szempontból az extracelluláris térrel mutat rokonságot. Az endoplazmás retikulum eukarióta sejtekben a szekréciós útvonal első kompartimentuma (140). Az endoplazmás retikulum lumenének kémhatása a citoszolhoz hasonlóan közel neutrális. Jelentős különbség van azonban a két közeg között a kálcium koncentrációban. A Ca2+ koncentráció az endoplazmás retikulumban 5 mM, míg a citoszolban kb. 50 nM, azaz az ER az egyik kálcium raktára a sejtnek. Az ER chaperonok jelentős része erős Ca2+-kötő, a Ca2+ készletek változása így hatással lehet a ER-ben végbemenő fehérjetekeredésre is. Fehérjekoncentráció szempontjából is nagy eltérés mutatkozik az endoplazmás retikulum és a citoplazma között. Az ER lumene rendkívül zsúfolt, 100 mg/ml feletti fehérje koncentrációval. Az ER egy gélszerű protein mátrix, amelyben molekuláris chaperonok és a fehérje tekeredést segítő más enzimek igen jelentős, az újonnan szintetizált szubsztrátokét meghaladó mennyiségben találhatók (84). 2.1.1.1.1 Fehérjetekeredés az endoplazmás retikulumban Az újonnan szintetizált polipeptidek közül azok, amelyek lánca N-terminálisan egy szignál peptidet (ún. ER targeting signal-t) hordoz, az endoplazmás retikulum lumenébe kerül. Emlős szekréciós és membránproteinek esetében a szintézissel egy
6
időben zajlik a transzlokáció az ER membránján keresztül. Ez a riboszóma és a Sec61 transzmembrán–pórus-fehérje
alkotta
transzlációs/transzlokációs
komplex
segítségével valósul meg. A szintetizálódó polipeptid már a transzláció alatt tekeredni kezd (84). Már a szintézis alatt szükség van a chaperonok általi védelemre, hogy azok a polipeptidlánc már elkészült részeinek „önkényes” tekeredését kontrollálják, védjék azt az egyéb fehérjéktől, illetve az aggregációtól. Ennek megfelelően a készülő polipeptidlánc azonnal kölcsönhatásba lép az ER chaperonokkal. Az endoplazmás retikulum legtöbb tekeredést segítő faktora minden testi sejtben expresszálódik, de ismertek szövet- és sejtspecifikus alakok is, pl. PDIp a pankreászban (163). Egy másik jellemző szignálszekvencia is ismert endoplazmás retikulum fehérjék esetében: a KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) szekvencia. Számos olyan fehérje, amely endoplazmás retikulum rezidens, köztük endoplazmás retikulum chaperonok is, Cterminálisukon hordozzák ezt a négy aminosavas egységet. Amennyiben valamely ilyen fehérje vezikuláris transzporttal a Golgi készülékbe jut, ott a KDEL receptorhoz kapcsolódik, receptorával együtt vezikulumba kerül, és retrográd transzporttal visszaszállítódik az endoplazmás retikulumba. Ez folyamatosan zajlik a sejtekben, aminek egyik oka, hogy egyes ER proteinek strukturális éréséhez a Golgi apparátusban zajló átalakulások is elengedhetetlenek (155). 2.1.1.1.2 Az endoplazmás retikulum chaperonjai Az
endoplazmás
retikulumnak,
mint
organellumnak
saját
jellemző
fehérjeállománya van. Ezek közül a kísérleteink szempontjából fontos chaperonokat, folding enzimeket, és azok komplexeit szeretném itt részletesebben bemutatni. A Grp78/BiP Az egyik első eredmény a chaperonok működésével kapcsolatos vizsgálatokban az immunoglobulinok összeállítása kapcsán a Hsp70 családba tartozó Grp78 (gyakran használt elnevezése a BiP, immunoglobulin nehéz lánc kötő fehérje) felfedezése volt (60, 112). Az emlős Grp78/BiP az egyik legnagyobb tömegben előforduló ER chaperon. Bár a kristályszerkezeti vizsgálatok szerint az ER membrán permeabilitását a Sec61
7
transzlokon önmagában szabja meg, korábbi adatok az mutatják, hogy a Grp78 zárja a pórust az ER lumene felől (62). Elhelyezkedéséből következően a Grp78 azonnal kölcsönhatásba kerülhet a tekeredetlen polipeptid lánccal, így közreműködik annak ER-ba történő bejutásában. A tekeredetlen fehérjék felismerésében a Grp78 döntő szerepet játszik. A Grp78-nak egy N-terminális ATP-áz és egy C-terminális szubsztrátkötő doménje van. ADP-kötött formája nagy affinitást mutat protein szubtrátokra. A Grp78-hoz kötött szubsztrátok megtartják konformációjukat, és serkentik a Grp78 ATP-áz aktivitását. Affinitás vizsgálatok azt mutatják, hogy rövid hidrofób peptidek, amelyek natív proteinek esetén béta szálakat képeznek mélyen a fehérjék magjában, preferenciálisan kötődnek a Grp78-hoz (47). Az ADP ATP-re cserélődése felszabadítja a fehérjét a Grp78-ról, majd az ATP elhidrolizálásával a Grp78 újra nagy affinitású formába kerül. A Grp78 ATP-függő működése az egyik oka annak, hogy az ATP szint csökkenése a sejtben a szekréciós proteinek szekréciójának a csökkenését okozza. A Sec61 transzlokációs pórussal való kölcsönhatása is ATP-függő folyamat (2). A Grp78 más Hsp70 családba tartozó chaperonokhoz hasonlóan monomer és oligomer fázis között váltakozik. Csak a monomer, módosítatlan Grp78 asszociál a tekeredetlen fehérjékkel. Ez a felismerés sugallta azt a feltételezést, hogy az oligomer Grp78 raktárat képez az ER-ban, amely a tekeredetlen fehérjékkel kölcsönhatásba lépve, monomer, működő formába kerül (54). Grp94 (gp96, endoplazmin) A Grp94 a 90 kDa-os stresszfehérje család tagja. Kálciumot és ATP-t köt, ennek segítségével autofoszforilálódhat, de a klasszikus kinázok is foszforilálják. A Grp94 a teljes ER fehérjekészlet akár 5-10 %-át is adhatja. Hidrofób fehérje, széles szubsztrátspecificitással
köti
az
instabil
szerkezetű
fehérjéket,
peptideket.
Stresszfehérjékkel alkotott számos komplexében segíti a szekréciós és a plazmamembrán fehérjék érését, a harmad-, negyedleges szerkezetük kialakulását. A Grp94 stressz-indukálható fehérje, és a Grp78-hoz hasonlóan citoprotektív hatású (92). A Grp94 a fehérjetekeredés során a szubsztátfehérjékkel a tekeredés késői fázisában lép kacsolatba (102). A calnexin és a calretikulin E két lektin-típusú chaperonról is említést kell tennem, mivel az olyan
8
glikozilált
fehérjék
tekeredésében,
mint
amilyen
az
alfa1-antitripszin
is,
elengedhetetlen szerepük van. A 65 kDa-os calnexin és a 46 kDa-os calretikulin lektinszerű
kötőhelyekkel
rendelkeznek,
amelyekkel
a
félkész
fehérjék
monoglikozilált részéhez kapcsolódnak (153). E folyamat kálciumot igényel (16). E fehérjék stresszhatásokra szintén indukálódnak. Szubsztrátspecificitásuk eltérő, részben mert kötőhelyük különböző, részben mert lokalizációjuk is eltér: a calnexin a membrán belső oldalához kötött, a calretikulin pedig az ER lumenben szabad formában is megtalálható (39). A calnexin és calretikulin a glikoproteinek ismételt kötésével és elengedésével járulnak hozzá azok tekeredéséhez. Az ún. calnexin-ciklus ATP-t nem igényel, de más stresszfehérjék, például a Grp78 közreműködését igen (105). A calnexin részt vesz az ER minőségellenőrzési funkciójában és transzport folyamataiban is (140). A protein diszulfid izomeráz (PDI) Mint azt már említettem, a szekrécióra kerülő proteineknek az extracelluláris, oxidatív környezetre való felkészítése az ER-ban történik. A fehérjék gyors oxidációja számos inkorrekt diszulfid híd kialakulásához vezethet, amelyek akár intermolekuláris keresztkötéseket is okozhatnak. Ezek kialakulása a fehérjék rossz konformációban történő megrekedéséhez vezethet. Ezért szükséges a fokozatos és kontrollált oxidáció. Az egyik módja ennek a fehérjék redox gradiensen történő átvezetése. A korábbi feltételezést, hogy az ER ilyen közeg, redox szenzitív GFP-vel végzett kísérletek támasztották alá (119). A másik lehetőség a gyorsan, de nem korrektül kialakult diszulfid hidak átalakítása, újraszervezése. Ezen feladat ellátására fejlődtek ki a protein diszulfid izomerázok (PDI-k). E fehérjéket mintegy negyven éve fedezte fel Christian Anfinsen kutatócsoportja (4), és tőlük függetlenül a doktori munkámnak helyt adó intézetben Venetainer Pál és Straub F. Búnó (165). Azóta a PDI család számos tagját azonosították, mint pl. az ERp29, ERp57, ERp59, ERp72 fehérjéket, amelyek szubsztrátspecificitása azonban még csak kevéssé ismert. Az ERp72-ről tudható, hogy főleg glikozilált proteinekkel lép kölcsönhatásba. A diszulfid izomeráz aktivitáson kívül a PDI-k konvencionális chaperonokként is funkcionálnak (55). A PDI két tioredoxin-domént tartalmaz, amelyek a tiol-diszulfid katalízis aktív
9
centrumait is tartalmazzák. Az aktív centrum a hasonló aktivitású fehérjék között meglehetősen konzervált CGHC szekvencia (45). Ez a motívum felelős a PDI izomerizáló aktivitásáért. A PDI a diszulfid hidak kialakulását, izomerizációját és redukcióját, redox állapotától függően katalizálja (165). A fokozott fehérjefelhalmozódás az ER-ban a PDI működésére is hat. Ez is stressz-indukálta fehérje, amelyik közvetlenül érintett a rosszul tekeredett fehérjék javításában és felhalmozódásuk csökkentésében. A PDI-ről kimutatták, hogy denaturált lizozim aggregátumok belsejében is megtalálható (143). Érdekes módon, bizonyos fehérjekoncentráció elérésekor ún. anti-chaperon aktivitást tapasztaltak a PDI-nél. Ekkor, valószínűsíthetően a nagy szubsztrátterhelés miatt, a PDI nemcsak egyes molekulákon belül, hanem molekulák között is kialakít diszulfid hidakat, és így aggregátumok képződését segíti elő. Ez alapján feltehető, hogy a PDI működésének zavarai, például a redukáló ágensek hatása hasonló funkcióváltást eredményezhetnek (130). A diszulfid hidak átszervezésén kívül a PDI a szekréciós fehérjék direkt oxidációjában is részt vesz. Ezekben az esetekben a PDI oxidált formája lép kölcsönhatásba a szubsztrát proteinnel. A fehérje oxidált állapotba kerülésekor redukált PDI szabadul fel. (2.1. ábra). Annak újra működőképes állapotba hozását, visszaoxidálását az ER membránjához kapcsolódó redox rendszer végzi. Citoszol
ER lumen S
Ero1 FAD
FAD
FAD
PDI
S
S
Szubsztrát
S S
SH
Ero1 FAD
S
FAD
SH
SH PDI
SH
Szubsztrát
SH SH
FAD
2.1. ábra: A PDI redox ciklusa A FAD a citoplazmatikus tér felől lép be az ER-be, ahol kovalansen és nem-kovalansen is köt az Ero1-L-hez, amely így képes a PDI felől az elektronokat továbbítani (a végső elektronakceptor még nem ismert). A PDI ezen a módon képes a szubsztrátfehérjék oxidálására. 10
A PDI redox állapota több tényezőtől függ. Faj- és sejtspecifikus eltérések is mutatkoznak, ami a kapcsolódó enzimek különbségeire utalhat, illetve azt jelezheti, hogy a PDI fő funkciója sejttípusonként más és más. Élesztőben főleg oxidált állapotú PDI-t találunk, míg emlős sejtekben a PDI-k többsége inkább redukált. Ez a kisebb méretű oxidált PDI készlet az oxidatív ekvivalensek gyorsabb elszállítását jelentheti, illetve azt, hogy az ER redox gradiens élesztő esetében kevésbé kifejezett, mint magasabb rendű eukariotákban. Saját kísérleteink is azt mutatták, hogy emlős rendszerben a PDI sejttípusonként is eltérő redukáltsági állapotot mutat, feltehetően az adott sejtben betöltött elsődleges szerepétől függően. Több szubsztrát esetében is bizonyították, hogy a PDI redox működéséhez a kitekert állapotú fehérjék felismerésével és szelektív megkötésével a PDI dajkafehérje funkciója is elengedhetetlen. A PDI e működése során a BiP fehérjével áll szoros kölcsönhatásban (100, 178). Amellett, hogy a PDI oxidáló, izomerizáló és redukáló funkciójának aránya a PDI redox állapotával változik, egyre több jel utal arra, hogy a PDI dajkafehérje funkciója is redox szabályozás alatt áll (160). Így pl. a kolera-toxin szubsztrát jobban köt a PDI redukált formájához, és a PDI oxidációja a kolera-toxin disszociációját okozza (159). A PDI specifikus funkciói közé tartozik az is, hogy több enzimkomplexnek (pl. prolil-4-hidroxiláz, triacilglicerol-transzfer fehérjekomplex) tagja, valamint az, hogy hormonokat köt, amelynek jelentősége még nem kellőképpen feltárt (131). Az Ero1 (oxidoreduktin) Az Ero1 (Endoplasmic Reticulum Oxidizing protein 1) fehérje tehát az, amely a PDI-t oxidálva fenntartja annak oxidoreduktáz aktivitását. Ez egy kb. 56 kDa-os, glikozilált, lumenális, az ER membránjával asszociált fehérje, amelynek katalitikus centruma az ER lumene felé tekint. Az Ero1 aktív szekvenciája hasonlít a tioredoxindoménhez (CxxCxxC) és a katalitikus aktivitás mellett a fehérje stabilitásához is elengedhetetlen (17). Az Ero1 ma ismert egyetlen funkciója a PDI oxidációja (49, 162). Az
Ero1
dajkafehérje
tulajdonságot
nem
mutat,
azonban
szorosan
együttműködik a PDI-vel a szubsztrátfehérjék diszulfid hídjainak formálásában. A
11
fehérje a PDI-t oxidált állapotban tartja, azonban az Ero1 más ER oxidoreduktáz stresszfehérjével történő kölcsönhatását nem tudták kimutatni. Emlősben a PDI mellett egyedül az ERp44 kapcsolódik hozzá, amelynek döntő szerepe van az Ero1 visszatartásában az ER-en belül (3). Az Ero1 nem-kovalens módon FAD-ot köt, így feltételezhetően a luminális fehérjék oxidációja során a PDI-re kerülő elektronok az Ero1 FAD-csoportján keresztül érik el a citoplazmát (141, 162). Az Ero1 felfedezése élesztőben történt, de azóta a fehérje emlősökben megtalálható változata is ismertté vált (Ero1-L). Eddig két Ero1-L izoformát azonosítottak, amelyek szöveti megoszlása és indukálhatósága különböző. Az Ero1Lα konstitutív, míg az Ero1-Lβ az endoplazmás retikulum stressz során indukálódik (120). Ez az endoplazmás retikulum chaperon funkcióinak és az ER oxidatív folyamatai szabályozottságának a kapcsolatát mutatja (103). 2.1.1.1.3 A
Chaperon komplexek az endoplazmás retikulumban
chaperonok
az
endoplazmás
retikulumban
nagyrészt
komplexekbe
rendeződve találhatóak meg. Többféle fehérje szintézisét megvizsgálva azt találták, hogy e chaperon komplexek összetétele más és más az alapvető funkciótól és a szubsztrátfehérjétől függően is (85). A szintetizálódó polipeptid lánccal először az ún. foldoszóma (folding komplex) kerül kontaktusba. A tiroglobulin tekerését végző “folding komplex” a Grp78, Grp94, Grp170, PDI és az ERp72 fehérjékből áll össze (86). Az influenza vírus hemagglutinin a vizsgálatok szerint calnexinnel és calretikulinnal is kötésben volt, a Grp78-at viszont kisebb mértékben kötötte. Fehérje szintézis hiányában is szerveződik komplex az endoplazmás retikulum chaperonjaiból. Ez a komplexet „pre-folding komplex”-nek szokás nevezni. Ebben a nem működő chaperon komplexben calretikulin, Grp78 és Grp94 vesz rész és a calnexin itt nincs jelen (102, 153). A vizsgált esetek mindegyikére igaz volt, hogy Grp78 és Grp94 megtalálható a folding komplexben, a többi chaperon és folding enzim viszont csak néha fordult elő, ami a Grp78-nak és Grp94-nek az ER-ban történő fehérje tekeredés általános menetében betöltött kulcsfontosságú szerepét hangsúlyozza (104).
12
A fehérje tekeredésen túlmenően a chaperonok komplexei két másik, alapvető feladatot is ellátnak az ER-ben: a minőségellenőrzést, (quality control, QC), amely a betekert fehérjék “jóságának” vizsgálatát jelenti, illetve a fehérje lebontás segítését, ahol a chaperonok a hibásnak ítélt fehérjéket retrográd transzporttal a citoplazmába, proteaszómális lebontásra irányítják. Ezt a folyamatot a szakirodalomban “ERasszociált degradációnak”, azaz ERAD-nak nevezik. A minőségellenőrzés folyamata során az ER chaperonjai a natív és nem-natív fehérjék között kell, hogy különbséget tegyenek. A károsodott fehérjék felismerése egyrészt a hidrofób felületeik hozzáférhetőségén alapul, ezekhez a fehérje felszínekhez ugyanis a chaperonok nagy affinitással kötnek. Ugyanilyen nagy affinitású kötődés jellemzi a chaperonok asszociációját a párosítatlan ciszteinekhez és a nem teljesen kifejlődött glikán-oldalláncokhoz (85, 144). A hidrofób felszínek detektálásában a Grp78, Grp94 szerepe kiemelkedő, a nem-natív ciszteinpárok a PDI kötődését idézik elő, míg a glikán-oldalláncokat a calnexin, calretikulin és az UGGT (UDP:glükóz-glikoprotein transzferáz) ellenőrzik. A minőségellenőrző rendszer tökéletlen működésének eredményeként előfordul, hogy toxikus fehérjék is kikerülhetnek a rendszerből, ugyanakkor e rendszer túlműködése akadályozza meg, hogy a cisztás fibrózisban érintett pontmutációt hordozó, ám egyébként működőképes CFTR (cisztás fibrózis konduktancia regulátor) nevű kloridcsatorna lebontásra kerüljön (7). Mutáns fehérjék szintézise vagy stressz esetén megnő a tekeredési hibás fehérjék mennyisége az ER-ban. A reménytelenül félretekert fehérjéknek minél előbb lebontásra kell kerülniük. Ekkor az endoplazmás retikulumhoz kötött degradációs útvonal (ERAD) visszairányítja, retrotranszlokálja a rosszul tekeredett fehérjéket a citoszolba, ahol azok proteaszómális lebontásra kerülnek. Az élesztőn végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a Grp78 és PDI kulcsszerepet tölt be az ERAD-ban (84). Az ERAD során a Grp78 valószínűleg a rosszul tekeredett fehérjét reverzibilisen aggregált állapotban tartja, míg a PDI a rosszult tekeredett fehérje irányításában, retrotranszlokációra kerülésében játszik szerepet. (55) Ezen
vizsgálatok
szerint
diszulfid
hidakat
nem
tartalmazó
fehérjék
retrotranszlokációja is a PDI-hez kötött, ami azt mutatja, hogy a PDI specifikusan
13
kötődik a rosszul tekeredett fehérjékhez. Amennyiben a transzlokációs póruson keresztül nem képes távozni a hibás fehérje, akkor a PDI-vel kötésben marad mindaddig, amíg az ER-ban tartózkodik. A kísérletek szerint a PDI és a Grp78 között egyfajta munkamegosztás mutatható ki a rosszul tekerdett fehérje kötését illetően (2.2 ábra). Mutáns, csökkent működőképességű PDI-t tartalmazó sejtek esetében a tekeredetlen fehérje a Grp78-cal marad asszociációban. Ez a működés szoros kapcsolatban lehet a folding mechanizmusánál látott Grp78-PDI kooperációval (100). Mivel a Grp78 és a PDI kapcsolata a fehérjetekeredés és az endoplazmás retikulumhoz kötött degradáció folyamatában is fontos, rajtuk keresztül az ER minőségellenőrzési rendszerének egyik fő lépése valósul meg. A PDI ERAD során mutatkozó szubsztrátkötésére vonatkozóan is vannak már adatok. Egyes kísérletek azt mutatták, hogy a PDI redox karaktere, illetve a hozzá tartozó redox ágensek is Vad típusú fehérje
Tekeredési hibás fehérje
ER lumen Citoszol
2.2 ábra: A PDI és a Grp78 szerepe a fehérjetekeredésben és az ERAD-ban A PDI és a BiP (Grp78) kooperálva tekerik be a fehérjéket, amelyek végül leválnak a chaperonokról és elhagyják az ER lument. Tekeredési hibás fehérjénél a PDI mindvégig kötésben marad a fehérjével, amíg az a lebontó rendszerbe nem kerül.
módosíthatják a PDI fehérjekötését. Az Ero1-L jelenléte, tehát az PDI oxidációja kolera-toxin esetében annak PDI-ről történő felszabadulását idézte elő (159). Fehérje-túltermeltetéses kísérletek azt mutatták, hogy az ERAD kapacitása is
14
véges, könnyen telítődhet ER stressz során, ezért UPR során az ERAD egyes komponenseinek indukciója is szükséges a degradációs aktivitás fenntartásához (52). A fentiekben részletezett fehérjekomplexeket a 2.3 ábra foglalja össze: 2.1.1.1.4 Az endoplazmás retikulum stressz
Monoglikozilált N-glikán
Diszulfid híd
Tekeredési hibás fehérje
Betekert fehérje
Golgi ERAD
Citoszol
ER ER kilépési terület
Gükozidáz I Gükozidáz II
Calnexin
EDEM
Grp78
Grp94
ERp57
UGGT
PDI
Grp170
COPII/Sar1p Riboszóma/Sec61
2.3 ábra: Chaperon komplexek az endoplazmás retikulumban (84 alapján) Fehérje tekerő komplex: Grp78, Grp94, PDI, Grp170, glikozilált proteinek esetében calnexin Irányítás, minőségellenőrzési rendszer (quality control): Grp78, Grp94, PDI, glikozilált proteinek esetében calnexin, ERp57, UGGT ERAD (ER-hoz kötött degradáció): Grp78, PDI, glikozilált proteinek esetében calnexin, EDEM (ER degradation enhancing alpha mannosidase-like protein)
Az endoplazmás retikulumban a legkülönbözőbb stimulusok, mint például a hipoxia, ischaemia, oxidatív stressz, illetve a kálcium depléció a betekeretlen fehérjék aggregációját okozhatja (81). Az endoplazmás retikulum funkciók károsodhatnak ER stressz hatására, de maguknak az ER-ban zajló folyamatoknak a hibás működése, például az egyszerű túlterhelődés szintén káros hatást jelent (140). Ha az endoplazmás retikulum bármely fukciója zavart szenved, az így előállt helyzet további stresszt jelenthet az ER-ra nézve. E funkcionális zavar lehet a glikoziláció inhibíciója, a diszulfidhidak redukálódása, a kálcium kicsurgása a
15
citoplazmába, akadályozott transzport a Golgi-ba, vagy tekeredési hibás fehérjék felhalmozódása az ER-ban. Általánosságban elmondható, hogy a fehérjetekerő és minőségellenőrző rendszer könnyen károsodik ezektől a hatásoktól, így ER stressz alatt tekeredetlen fehérjék halmozódnak fel az ER-ban (52). E fehérjék felhalmozódása megbontja az egyensúlyt a fehérjék szintézise és az ER feldolgozóképessége között, aminek következtében az ER nem képes megbirkózni a fehérjetöbblettel (130). A közelmúlt igen fontos kutatási eredménye volt, hogy mutáns, megfelelően tekeredni nem képes, „folding inkompetens” fehérjék expressziója endoplazmás retikulum stresszt, és stresszválaszt az ún. tekeredetlen fehérje választ (unfolded protein response, UPR) okoz. Ez a biokémiai háttere sok, az ER kapacitását érintő betegségnek, ahol az említett „tekeredés inkompetens” fehérjék felhalmozódnak az ER-ban (135). Az ER homeosztázisának megtartásához arra van szükség, hogy ezeket a fehérjéket az ER vagy betekerje, vagy lebontsa. Az eukarióta sejtek három különböző mechanizmussal is rendelkeznek, amelyek az ER-ben felhalmozódó fehérjék esetén aktiválódnak (107), amelyeket összefoglalóan UPR-nek, azaz betekeretlen fehérje válasznak hívunk. Elsőként, a korai fázisban a transzláció felfüggesztésével csökkenti a sejt az ERre nehezedő nyomást, a következő fázisban az ER chaperonok transzkripciójának aktivációja következik be, amelynek eredményeként ER chaperonok termelődnek, hogy fokozzák az ER fehérjetekerő kapacitását, majd egy későbbi fázisban a fehérje degradáció fokozódik, amelynek segítségével az ER megszabadulhat a felhalmozódott fehérjéktől
(157).
A
fehérjék
sorsát
emlős
ER-ben
időfüggő
tranzíciós
mechanizmusok döntik el (181). A fent felsorolt folyamatokért három, eltérő hatásmechanizmusú transzmembrán fehérje segítségével aktiválódó transzkripciós faktor a felelős: az ATF6α és ATF6β, az IRE1α és IRE1β, és a PERK. E folyamatban a transzmembrán fehérjék érzékelik a betekeretlen fehérjék jelenlétét, és a segítségükkel képződő transzkripciós faktorok továbbítják a jelet a sejtmagba, ahol a transzláció felfüggesztése mellett bizonyos speciális gének indukcióját kezdeményezik (69). A transzkripció aktivációjáért egy
16
cisz-aktív elem is szükséges, amelyet ER stressz válasz elemnek, ERSE-nek neveztek el (188). A PERK egy gyakori transzmembrán faktor, amely aktiválódva foszforilálja az eIF2alfa fehérjét, ezzel leállítva a transzlációt, ugyanakkor bizonyos gének átíródását is fokozza, az ATF4 transzlációjának serkentésével (64). Az IRE1alfa általánosan, míg az IRE1beta a gasztrointesztinális rendszerben lokalizálható. Ezek a membránkötött konzervatív endoribonuklázok képesek spliceoszóma-független mRNA hasítást indukálni ER stressz esetén (121). Az XBP1 mRNS, amely emlősben a bZIP transzkripciós faktort kódolja, az eddig ismert egyetlen szubszrátja ezeknek az endoribonukleázoknak (23). Az XBP1-nek csak a hasított formája aktív transzaktivátor, köt az ERSE-hez az NF-Y általános transzkripciós faktorral közösen, és indukálja a stresszfehérjék szintézisét (183). Az ATF6α és az ATF6β transzmembrán fehérjék olyan transzkripciós faktorokat tartalmaznak, amelyek limitált protelízisüket követően válnak aktívvá: az eredetileg 90 kDa-os fehérje egy 50 kDa-os termékké hasad, amely így a magba vándorol és ott, szintén a NF-Y transzkripciós faktorral kooperálva az ERSE-hez köt (184). Az ATF6ról leírták, hogy stressz esetén hasítatlan formájának szintje is csökken, ezzel feltehetőleg a stresszválasz lecsengését téve lehetővé (70, 71). A
Grp78-nak
fontos
feladata
van
nemcsak
a
tekeredetlen
fehérjék
felismerésében, hanem a probléma jelzésében, és a szignál endoplazmás retikulumból történő kijuttatásában is. Ennek kimutatására már számos módszer létezik (92). Inaktív állapotban az IRE1 és PERK lumenális doménjei Grp78-cal asszociáltak. ER stressz
esetén
a
Grp78
disszociál
IRE1-ről
és
PERK-ről,
és
ez
azok
oligomerizációjához, proximális transzducerként történő aktivációjához vezet (19). Az ATF6 esetében a Grp78 a Golgi-ba történő transzlokációt befolyásolja. Grp78 hiányában ATF6 a Golgiba jut, és ott hasad aktív termékké (142). Ezen felül az ATF6 a calretikulinhoz kötődik, és ezáltal is ER-ban visszatarva marad. Az ER stressz alatt, az ATF6 alulglikozilált, ez rontja a fehérje kölcsönhatását a calretikulinnal, aminek következtében az ATF6 kevésbé lesz visszatarva ER-ban (70). E folyamatok eredményeképpen alakulhat tehát ki az az integrált stresszválasz, amelyet endoplazmás retikulumot érintő stresszes állapotok esetén láthatunk. Ennek
17
komponensei az alábbiakban foglalhatóak össze: •
Az
eIF2alfa
foszforilálásának
következtében
a
transzláció
általános
szupressziója, rövid féléletidejű proteinek eltávolítása az ER-ból, •
Chaperon indukció (elsősorban a Grp78, Grp94, calnexin, PDI, Ero1, de a lista folyamatosan bővül), az ERAD gének indukciója, membrán szintézis, ER expanzió,
•
NRF2 transzkripciós faktor aktiválása, azon keresztül antioxidánsok fokozott expressziója (pl. glutation-S transzferáz) (140).
2.1.2
Citoplazmatikus stresszválasz, a citoplazma stresszfehérjéi: rövid távú hatások Mivel az endoplazmás retikulumot és a citoplazmát érintő stressz nem
választható el egymástól, fontosnak tartom, hogy a citoplazma stressz-válaszát is röviden ismertessem. A citoplazmatikus stressz-válasz során elsőként leállnak azok a folyamatok, amelyek sok energiát igényelnek, mint például a fehérjeszintézis, vagy a replikáció. Igen fontos a nem véglegesen károsodott struktúrák védelme és őrzése, hogy a stressz múltával ezek helyrehozásra kerülhessenek. Mindkét lépésben részt vesznek a stresszfehérjék, részben a szabályozási szinten, részben pedig a fehérjék és más sejtalkotók védelmének szintjén. Hogy a sejt miként érzékeli a stresszt, ami a stresszfehérjék szintézisét beindítja, még nem ismerjük pontosan. Eukarióta szervezetekben két érzékelő létét feltételezik. A leginkább elfogadott elképzelés szerint a maguk a stressz hatására felszaporodott denaturált kliensfehérjék indítják be a stresszfehérjék expresszióját (109). E folyamatban a hősokkfaktor (HSF) szerepét kell kiemelnünk. Emlősökben a HSF család legfontosabb formája a HSF1 míg a család
más
tagjai
a
tartós
stresszválasz, az
embrionális
fejlődés,
és
a
sejtdifferenciálódás folyamataiban játszanak szerepet (109). Normál állapotban a hősokkfaktor a citoplazmában monomerként, a Hsp70-hez illetve Hsp90-hez kötött komplex formájában van jelen. Mivel a stressz hatására a Hsp70 és a Hsp90 a felszaporodó denaturált fehérjéket kötik meg, a hősokkfaktor a komplexből felszabadul, és így beléphet a sejtmagba, ahol trimerizálódik, foszforilálódik és
18
kötődik a DNS megfelelő régiójához, az ún. hősokk elemhez (HSE). Ilyen hősokk elem található a stresszfehérjék génjeinek promóter régiójában is. A stresszhatás elmúltával, illetve az újonnan szintetizált stresszfehérjék révén több szabad Hsp70 és Hsp90 lesz a citoplazmában, amelyek a sejtmagba bejutva a hősokkfaktort újra kötésbe vonják, leállítva ezzel a transzkripciót. E folyamatot számos moduláló fehérje, pl. a HSBP1 befolyásolja, de feltételeznek alternatív aktivációs utakat is (136, 151). A másik stressz-szenzor a feltételezések szerint a sejtmembrán. A membrán fluiditását különböző külső hatások megváltoztatják, ez a változás szolgálhat szignálként a stresszfehérjék szintézisének beindításához (167). A stressz esetén elsőként aktiválódó fehérjéket szeretném egy kicsit részletesebben is bemutatni (170). A 70 kDa-os stresszfehérjék A család legtöbbet vizsgált és talán legjelentősebb tagja a citoplazmatikus illetve részben magi lokalizációjú, indukálható fehérje, a Hsp70 (30). Ennek konstitutívan expresszálódó változata a Hsc70. Szerkezeti, illetve funkcionális hasonlóságuk miatt e család tagja néhány eltérő molekulatömegű fehérje, mint például a Hsp110. A család tagjai
megtalálhatóak
a
mitokondriumban
(mt-Hsp70)
és
az
endoplazmás
retikulumban (e homológ a már ismeretetett Grp78) is. A Hsp/Hsc70 a citoplazmatikus fehérjetartalom 1-3%-át teszi ki. A fehérje N-terminálisán ATP-t köt, ciklusa a Grp78-nál ismertetett mechanizmushoz igen hasonlóan működik. A Hsp70 a stressztolerancia kialakulásának alapvető eleme (14). A Hsp70 e mellett fontos antiapoptotikus protein is. E funkciójában oly módon működik, hogy köti a proapoptotikus Apaf-1 fehérjét, mely így nem képes a kaszpázok aktiválására (13). 90 kDa-os stresszfehérjék A Hsp90 chaperon az emlős sejteken citoplazmatikus fehérjetartalom 1-3 %-át teszi ki. Jelentősége az evolúció során folyamatosan növekedett. Élesztőben csak teljes deléciója, fejlettebb eukariótákban pedig már a szintjének csökkenése is letális. A Hsp90 szubsztrátspecificitása igen széles, újabb megfigyelések szerint azonban aktív szubsztrátjainak döntő többsége a natívhoz közeli, kissé instabil szerkezettel bír (35). E tulajdonságában a Hsp90 eltér a Hsp70-től, ami erősebben denaturált fehérjéket köt (51). A Hsp90 gyakran található fehérjekomplexekben, más
19
dajkafehérjékkel és segédfehérjékkel asszociálódva (134). A Hsp90-re is igaz, hogy primer szerkezete az evolúció során erősen konzervált maradt. Az eukarióta citoszólban két izoformája ismert (α és β), ezek 76 %-ban azonosak (115). A két izoforma közül klasszikus stresszhatások (pl. hősokk) hatására csak az α izoforma indukálódik, a β forma konstitutív, de a gyulladásos folyamatoknál és aktivált immunsejtekben expressziója fokozódhat (25, 101). Amennyiben a Hsp90 által kötött fehérjék renaturációja már nem lehetséges vagy nem gazdaságos, a kötött fehérjék a proteaszómális lebontó rendszerek segítségével degradálódnak. Az elmúlt években kimutatták, hogy eukariótákban a Hsp90 szintjének csökkentésével az addig a Hsp90 által elfedett, „csendes” mutációk a fenotípus szintjén is megjelentek (38). Ezzel összefüggésben a témavezetőm néhány éve közzétett egy elméletet. A chaperon-overload elmélet szerint a chaperonok a felhalmozódó mutációkat elfedik, de ha öregségben az elromlott fehérjék szintjének megnövekedése miatt a kapacitásuk csökken, a sejtekben felhalmozott mutációk aktívakká válnak, és a hirtelen megjelenő fenotípus diverzitás hozzájárulhat a poligenikus betegségek kifejlődéséhez (34).
2.2
Redox szabályozás és stressz az ER-ben és a citoplazmában Az intracelluláris homeosztázis fenntartásához szorosan hozzátartozik az adott
sejtkompartimentum redox egyensúlyának fenntartása is. Ennek felborulása súlyos következményekkel jár a sejt életére vonatkozóan. Az oxidatív károsodás, vagyis az oxidatív stressz egyike a leggyakoribb környezeti terheléseknek, ugyanakkor kísérője más eredű stresszfajtáknak is, és így jelentősége a kutatások előrehaladtával egyre nő. E fejezetben a redox érzékeny elemek két fő típusát szeretném bemutatni. Egyrészt azokkal a rendszerekkel fogok foglalkozni, amelyek a redox homeosztázis fenntartásáért felelősek, másrészt azokkal az elemekkel, amelyek oxidatív károsodás hatására aktiválódnak. Oxidáló ekvivalensek, reaktív oxigén szabadgyökök (ROS) a sejt normális működése során is keletkeznek, például a mitokondriális légzési lánc működése során, vagy a citokróm P450 enzimrendszereken.
20
Oxidatív stresszről akkor beszélünk, ha a termelődő szabadgyökök mennyisége hirtelen megnő, pl. ischaemiás-reperfúziós károsodásban, immunsejtek működésekor, szepszisben vagy diabéteszben (46). Az oxidáló ágensek irreverzibilisen károsíthatják a legtöbb aminosav oldalláncot, ezáltal esetleg megváltoztatva a fehérjék működését (18, 129). A szabadgyökök elleni védekezés egyik módja az antioxidáns természetű kismolekulák, pl. a glutation, aszkorbát, bilirubin, vagy a koenzim Q pufferhatásának kihasználása, ezek fokozott szintézisével kiegészítve (59, 94). Emellett fontos szerep jut az antioxidáns kismolekulák regenerációját végző enzimek termelésének. Itt példaként a tioredoxint, tioredoxin reduktázt, a glutation-reduktázt és a glutationperoxidázt említeném meg (116). 2.2.1
Redox rendszerek és redox stressz az ER-ben: rövid távú hatások Az ER redox potenciálja jelentősen eltér a citoplazmáétól. A redukált glutation
mennyisége a citoplazmában az oxidáltnak (GSSG) 30-100-szorosa. Ez a reduktív környezet nem kedvez a diszulfid hidak kalakulásának. Ezért a citoplazmatikus fehérjék össz-tiolcsoport tartalmának csak mintegy 0,1%-a képez tartósan molekulán belüli, vagy vegyes diszulfid hidat. Ebből következik, hogy a szekrécióra kerülő, valamint membránokban lokalizálódó fehérjék, melyek általában számos diszulfid hidat tartalmaznak annak érdekében, hogy harmad- és negyedleges szerkezetüket megőrizzék, nem tudják natív konformációjukat felvenni a citoplazmában. Az endoplazmás retikulum redox potenciálja -160 mV körüli érték, azaz a citoplazmánál lényegesen oxidálóbb közeg, amely már kedvez ezen fehérjék tekeredésnek. A redox potenciálért ebben a sejtkompartimentumban a GSH/GSSG arány a felelős, ami 1-3 körüli érték. A glutation koncentrációja az endoplazmás retikulumban 1-2 mM. A glutation rendszer a legalapvetőbb résztvevője a redox egyensúly kialakításának emlős sejtekben. Amellett, hogy redukált és oxidált változatának arányával beállítja a redox potenciált az endoplazmás retikulumban és a citoplazmában, vegyes diszulfidok alkotására is képes a legkülönfélébb fehérjékkel (138). A glutation rendszer e tulajdonsága révén képes a kötött fehérjéket megvédeni az oxidatív károsodástól, illetve módosítani azok enzimaktivitását, aktívan befolyásolva ezzel az oxidatív stresszre adott választ. Az oxidatív stressz során
21
glutationilálódott fehérjék között megtaláltak sejtváz fehérjéket, mint például a vimentin, a miozin és az aktin, enzimeket, mint például az enoláz, az ubikvitinkonjugáló
enzim
vagy
az
adenilát
cikláz,
emellett
redox
enzimeket,
peroxiredoxinokat, PDI-t, és végül többféle stresszfehérjét is, például a Hsp70-nek mind a konstitutív, mind pedig az indukálható formáját, valamint a Hsp60-at. Az enzimek aktivitását a glutationiláció különbözőképpen befolyásolta (50). Maga a tioredoxin is glutationilálódik, és ennek következtében inaktiválódik (27). Érdekes megjegyezni, hogy a 20S proteaszóma is rendelkezik redox aktív ciszteinekkel, és funkciója ezeken keresztül glutationiláció által befolyásolható (41). Még kevéssé körvonalazott az, hogy milyen folyamatok játszódnak le az endoplazmás retikulumban oxidatív stressz esetén. Fokozott szabadgyök-termelődés hatására a klasszikus UPR útvonal aktiválódását tapasztalták fibroblasztokon, ugyanakkor ezt nem sikerült kiváltani hidrogénperoxid adásával. Az UPR megelőző indukiója azonban képes volt csökkenteni a ROS indukálta károsodásokat (177). Erős redukáló hatás, DTT kezelés eredményeként a cisztein tartalmú fehérjék tekeredése szelektíven gátlódott mind élesztőben mind humán hepatóma sejtekben (78, 95). Élesztőben a Grp78 komplexet képezett a betekeretlen fehérjékkel (78). DTT hatására megnőtt az endoplazmás retikulumban a Grp78 szintézise, indukálódott a glutatione-S-transzferáz és a citkróm p450 CYP2A5 (56). 2.2.2
Kis molekulák szerepe a redox fehérje tekeredésben A
redox
egyensúly
fenntartásához
a
glutation
rendszer
működése
elengethetetlen, ezen felül azonban még számos kis molekula részt vehet a redox egyensúly kialakításában és a redox fehérjetekredés szabályozásában. Az aszkorbát millimólos koncentrációban van jelen az endoplazmás retikulumban (94), transzportjának részleteit Dr. Bánhegyi Gábor és munkacsoportja tisztázta
(11,
31).
Az
aszkorbát/dehidroaszkorbát
redox
ciklusának
a
fehérjetekeredésre gyakorolt hatása még teljes egészében nem egyértelmű, az azonban bizonyos, hogy aszkorbát jelenlétében az endoplazmás retikulum tioljai oxidálódnak (113). A K-vitamin redox ciklusa is szerepet játszik az endoplazmás retikulum redox rendszerében és bizonyos fehérjék betekerésében (118). Ezek mellett a rendszerek mellett egyre növekvő jelentőségűnek látszik a
22
riboflavin származékok szerepe az oxidatív tekeredés kialakításában. Az Ero1 fehérje, amely a szubsztát-fehérjék oxidációjának iniciátora, FAD-ot köt nem-kovalens módon (141). Riboflavin megvonására az élesztő sejtekben az oxidatív tekeredés gátolt volt (161), ugyanakkor FAD hatására fokozódott a fehérjék oxidációja (162). Jurkat sejtekben a flavin-hiány az IL-2 fehérje csökkent szekrécióját és intracelluláris felhalmozódását idézte elő (24). A legfrissebb eredmények azt mutatják, hogy HepG2 humán hepatóma sejteken a riboflavin megvonás rövid időn belül a szekréciós útvonalak gátlásához és az ER-stresszválasz kialakulásához vezet (172). Mindezek az eredmények azt sugallják, hogy a riboflavin származékok, elsősorban a FAD, szerepet játszanak a szekréciós fehérjék redox tekeredésének szabályozásában. Felmerült a piridin nukleotidok szerepe is a redox tekeredés szabályozásában, minthogy számos enzim, így pl. a 11β-hidroxiszteroid dehidrogenáz-1 (11βHDH1) NADPH-t köt (98). Bakteriális rendszeren az ubiquinont alkalmasnak találták, hogy az eukarióta Ero1/PDI rendszernek megfelelő DsbB/DsbA rendszer elektronakceptoraként viselkedjen (10). 2.2.3
Redox rendszerek és oxidatív stressz a citoplazmában: rövid távú hatások A citoplazmatikus redox potenciál -230 mV körül van, ami nagyrészt a magas
redukált glutation (GSH) szintnek köszönhető. A citoplazma redox egyensúlyának fenntartása több, egymástól többé-kevésbé függetlenül működő rendszer feladata. Az ezekben a rendszerekben található oxidált és redukált állapotú molekulák aránya meghatározza a sejtkompartimentum végső redox potenciálját. A három legfontosabb ilyen redox rendszer a citoplazmában a NADPH/NADP pár, a tioredoxin (TRXred/TRXox) pár és a glutation (GSH/GSSG) pár. A redox állapot meghatározásában a glutation rendszer ezek közül kiemelkedő jelentőséggel bír, hiszen a glutation koncentrációja mintegy 500-1000-szerese a másik két molekuláénak, így a GSH/GSSG pár arányának meghatározása már önmagában is meglehetősen hű képet nyújt az adott sejtkompartimentum redox viszonyairól. A NADPH jelentőségét e rendszerben az adja, hogy amellett, hogy hidrogén anion donorként funkcionál számos enzimatikus reakcióban, mint például a GSSG redukcója, a NADPH közvetlen antioxidáns is, hiszen a molekula gyökfogó
23
képességét bizonyították, igaz, elsősorban a mitokondriumban (125, 83). Ezen túlmenően fontos szerep jut az oxidatív stressz okozta károsodások kivédésében a stresszfehérjéknek. A stresszfehérjék a sérült fehérjékhez asszociálva azok aggregációját megakadályozzák, lehetővé téve renaturációjukat. A két legfontosabb antioxidáns stresszfehérje-család a kis hősokkfehérjék (8, 93) és a 70 kDa-os stresszfehérjék családja, ezek között is kiemelkedő jelentősége van a Hsp70nek. Mindkét család indukálódik oxidatív stressz esetén, termelődésük hatékony oxidatív stressztolerancia kialakulásához vezet (12, 73). A kis hősokkfehérjék családjába tartozó krisztallinok a szemlencse mellett más szövetekben is védenek az oxidatív károsodástól, illetve az oxidatívan károsodott fehérjék jó szubsztrátjai az αkrisztallinnak (72, 79). A glutation-reduktáz és glutation-transzferáz enzimeket, amelyek a GSH regenerációját végzik, a Hsp27 védi és aktiválja (9, 22). A Hsp27 maga is redox szabályozás alatt áll, egyetlen ciszteinjének oxidációja a homooligomer szétesését okozza monomerekké (171, 73). Az élesztő Hsp33 stresszfehérjéjének magasabb eukarióta megfelelője nem ismert, mégis érdemes egy pár szót ejteni róla, mert ez az elsőként megismert olyan stresszfehérje, amelynek dajkafehérje-aktivitása redox szabályozás alatt áll (76). Oxidáló környezetben néhány kitüntetett ciszteinje diszulfid hídban kapcsolódik össze. Kötőfelszínei így válnak hozzáférhetővé, és a fehérje csak ekkor aktív (77). Oxidatív stresszben a legfontosabb citoplazmatikus stresszfehérje a Hsp70 (74). A Hsp70 segédfehérjéjével, a Hsp40-nel együtt köti és stabilizálja a citoplazmatikus NADPH:kinon oxidoreduktázt, amely szükséges ahhoz, hogy ez az antioxidáns fehérje ne kerüljön lebontásra (6). Bizonyították, hogy a Hsp70 expressziója szükséges egy szuperoxid diszmutáz, a Cu/Zn SOD fehérje szintjének fenntartásához is (29). A Hsp90 szintén indukálódik oxidatív stresszben. Legfontosabb szerepe valószinűleg a proteaszóma védelme az oxidatív károsodástól és funkcióvesztéstől (36) ugyanakkor a Hsp90-nek specifikus szerepe van az oxidált fehérjék lebontásában is (173). A stresszfehérjék szintéziséért felelős transzkripciós faktor, a HSF1 is redox
24
reguláció alatt áll. Oxidálószerek gátolják a HSF1 trimerizációját és DNS kötését (75), ugyanakkor azt találták, a HSF1 oxidációja szükséges lehet a stresszválasz kialakításához (1). A citoplazmatikus GSH/GSSG arány változásai is hatnak a HSF1 aktivációjára és így stresszfehérjék transzkripciójára, és viszont: a HSF1 feltehetőleg közvetett módon, de befolyásolja a redox egyensúly kialakulását (177). HSF1 hiányos egerekben a Hsp25 és Hsp90 szintje alacsonyabb, a GSH/GSSG arány csökkent, ugyanakkor a mitokondriális szuperoxid-termelés nőtt (179). A tioredoxin egy 12 kDa-os fehérje, amely oxidoreduktáz aktivitással rendelkezik, számos úton befolyásolja a redox egyensúlyt, és speciális szerepet tölt be oxidatív stressz esetén (68). A tioredoxin család legtöbbet vizsgált tagja, a TRX-1 citoplazmatikus lokalizációt mutat, a TRX-2 a mitokondriumban található, az spTRX névre hallgató izoenzim pedig csak a spermatozoákban van jelen. Közös tulajdonságuk, hogy mindegyikük tartalmazza az igen konzervatív tioredoxinmotívumot, amely Cys-Gly-Pro-Cys aminosavakból épül fel. E fehérjeszakasz a felelős a tioredoxin oxidoreduktáz aktivitásáért. A tioredoxin enzimatikusan redukál számos transzkripciós faktort, például a p53-at, és az NFκB-t is (82). A tioredoxin számos peroxiredoxin elektrondonorja, emellett direkt gyökfogó kapacitását is bizonyították (158). A tioredoxin számos stressztípusban indukálódik, és bizonyos estekben fokozott szekrécióját is megfigyelték (69, 116). A fehérje az extracelluláris térbe kerülve citokinként működik (123). A tioredoxinnak nemcsak oxidatív, de reduktív stresszben is védő szerepe van. A tioredoxin mentes élesztő sejtekben rendre magasabb redukált glutation arányt találtak, amely valószínűleg összefüggésben van azzal, hogy ezen sejtek érzékenyebbek voltak DTT-vel kiváltott reduktív stresszre is (158). Számos aminosav érzékeny az oxidatív reakciókra. Ilyen például a cisztein, a hisztidin, a triptofán, a tirozin és a metionin, amelyek közül ez utóbbi a legérzékenyebb. A metionin oxidáció egyik terméke, a metionin szulfoxid, (MetSO) a metionin szulfoxid reduktázok (Msr-ek) segítségével redukálható vissza (110). E fehérjéknek ma két típusát, az MsrA-t és az MsrB-t különítjük el, amelyek az S és az R metionin szulfoxid enantiomerek redukálásáért felelősek (111). Az Msr fehérjék védenek oxidatív stresszben az oxidált fehérjék felhalmozódásától és ez által a sejthaláltól (146, 148).
25
A metionin szulfoxidáció nemcsak mint oxidatív károsodás, hanem mint poszttranszlációs módosítás is szerepelhet a sejtek életében. Ezen keresztül a Msr fehérjék regulációs szerepet is betöltenek, például a kalmodulin esetében (152, 168). Számos proteáz, közöttük az alfa1-antitripszin fehérje és a HIV-2 proteáz is tartalmaz könnyen
oxidálódó
metioninokat.
E
metioninok
oxidációja
az
enzimek
inaktiválódásához vezet. Emellett a metionin szulfoxidációt felelősnek találták többféle
neurodegenerációs
betegség
kialakulásában,
mivel
a
megváltozott
hidrofobicitású aminosav hajlamosabbá teheti a fehérjéket az aggregációra (111). 2.2.4
Stresszfehérjék és redox változások krónikus megbetegedésekben: hosszú távú hatások A fentiekben részletezett folyamatok mind a stressz akut formájára vonatkoztak.
Mivel az élő szervezetben nem minden, krónikusan fennálló betegség vezet sejthalálhoz, lézetnie kell egy krónikus stresszválasznak is, amely részleteiben, vagy egészében eltér az akut választól, hiszen például a fehérjeszintézis szüneteltetése csak átmeneti megoldást jelenthet, mert hosszabb távon szükség van a stressz-szignál lecsengésére és alternatív útvonalak aktiválódására is. A hosszú távú stressz hatásaival kapcsolatosan azonban még igen kevés és szórványos adat áll csak rendelkezésünkre. Krónikus stressz modellként szolgálhat néhány tartósan fennálló betegség, mint pl. a diabétesz, vagy egyes neurodegenerációs betegségek, mint az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, bizonyos mértékben az öregedés (147) és az általunk is vizsgált alfa1antitripszin deficiencia is. Öregedés során kimutatták az oxidatív stressz fokozódását (117), a tioredoxin aktivitás csökkenését (185) és azt is, hogy az oxidatív károsodásokkal párhuzamosan a proteaszóma aktivitása csökken (126). Az Alzheimer-kórban a normálisan szolubilis béta-amiloid (A-beta) protein tekeredési hibája és aggregációja okozza a betegséget. A béta-lemezekben gazdag oligomerek neurotoxikus hatásúak és felhalmozódnak az agyban, oldhatatlan partikulumokat formálva. Alzheimer-kór modellekben az UPR indukciójának hiányát figyelték meg (80), ugyanakkor a citoplazmatikus antioxidáns enzimek (hem-oxigenáz 1) és Hsp90 aktivációja volt megfigyelhető (5).
26
A Hsp70 szintje is emelkedett Alzheimer-kórban szenvedő betegek agyában (180). A Hsp70 az A-beta aggregátumokkal asszociálódott (48). A tioredoxin és a metionin szulfoxid reduktázok (Msr-ek) szintjének csökkenését is felelősnek találták az Alzheimer-kór kialakulásában (97, 149). Az amiloid lerakódások maguk is szabadgyökök fokozott keletkezését idézték elő (15). A Parkinson-kór esetében a dopaminerg neuronok pusztulásán kívül ubiquitinált fehérjék felhalmozódását figyelték meg a neuronok sejttestjeinek citoplazmájában és protein zárványokat a neuritokban. Ezek alfa-szinuklein aggregátumok, melyek gyakran mutáns fehérjéből állnak össze (135). Drosophila modellben és egérben ezen aggregátumok, illetve az általuk okozott neuronpusztulás is megelőzhető volt Hsp70 túltermeltetéssel (42). Az oxidatív stressz és fokozott metionin-oxidáció ez esetben alapvető jellemzője a megbetegedésnek (57). Diabéteszben az oxidatív stressz kialakulása közismert tény, annak hosszú távú hatásai között szerepel a fehérjék és lipidek fokozott oxidációja, bizonyos antioxidáns fehérjék szintje pedig hosszú távon csökken (124). A Hsp70-nek mind a szintje, mind pedig indukálhatósága csökkent, a PDI és Grp78 esetén viszont indukciót tapasztaltak (154). Diabéteszben az endoplazmás retikulum redox egyensúlya felborul, redukáltabb állapot felé tolódik, és ez a változás a redox tekeredésben részt vevő stresszfehérjék funkcióját is érinti. (114). 2.2.4.1 Az alfa-1-antitripszin deficiencia, mint a krónikus stressz egyik modellje E
dolgozatban
ismertetett
kísérletekben
a
mutáns
alfa1-antitripszin
intracelluláris felhalmozódásán, mint krónikus stressz modellen keresztül vizsgáltam az
endoplazmás
retikulum
chaperonjainak,
illetve
chaperon-komplexeinek
viselkedését, ezért e betegségről részletesebben szeretnék szólni. Az alfa1-antitripszin a májsejtekben szintetizálódó fehérje. A szintézist követően normális esetben szekretálódik, és a véráramba kerül. Funkcióját tekintve az egyik fő szerin-proteáz inhibitor. Számos szerin proteáz gátlásában fontos (tripszin kimotripszin, elasztáz, thrombin), ezáltal védi a tüdő alveolusok elasztikus rostjait a neutrofil elasztáz károsító hatásától. Az alfa1-antitripszin génje emberben a 14-es kromoszómán található, lokuszát Pi-vel jelölik. Az emberben a PiM-mel jelölt allél gyakorisága a legmagasabb, 95%, ez egyben a működő, egészséges fehérje allélja
27
(53). A PiZ allél által kódolt alfa1-antitripszin hibás, tekeredési problémás. A PiZ allélra homozigóta emberekben a plazma alfa1-antitripszin szintje az egészségesre jellemzőnek mindössze 10-15%-a. Az ilyen betegeknél az emfizéma (tüdőtágulat) gyakori tünet. Az alacsony plazmakoncentráció a Z típusú alfa1-antitripszin csökkent szekréciójából adódik. A Z formát érintő mutáció, a 342-es pozíciójú glutaminsav lizinre
cserélődése
konformációváltozáshoz
és
egy
tekeredési
köztitermék
aggregációjához vezet (186). Hidrofób kölcsönhatások következtében, loop-sheet polmerizációval nem kovalens antitripszin dimerek, majd polimerek alakulnak ki (96). Az aggregátumok igen nagy méretűek, fénymikroszkóposan is láthatóak (187). A hepatocitákon belüli antitripszin globulusok önmagukban nem toxikusak. Ennek ellenére már a magzati élet huszadik hetében megjelennek az alfa1-antitripszin felhalmozódás tünetei, az alfa1-antitripszin deficiens újszülöttek pedig általában kisebb súlyúak. Az ilyen újszülöttek felénél alacsonyabb májenzim szinteket mértek, és a májgyulladás is gyakori (43). A korai, szisztémás tünetek is arra utalnak, hogy a máj funkcióját nagyban befolyásolja a felhalmozódó alfa1-antitripszin. Az életkor és a betegség előrehaladtával számos más szisztémás tünet és májzsugorodás is kialakulhat, ezen kívül fontos megemlíteni, hogy tumoros, rákos elváltozásokra is igen hajlamosak a Z típusú alfa1-antitripszin deficienciában szenvedők (53, 187). Arra, hogy ezeket a tüneteket milyen módon váltja ki az alfa1-antitripszin fehalmozódása, még nincs kielégítő magyarázat. Sejtvonalba transzfektált PiZ fehérje aggregációja az NFκB transzkripciós faktor aktivációját idézte elő, azonban az UPR előidézéséhez egy további stresszhatásra is szükség volt. Megfigyelték továbbá, hogy az UPR kombinált stressz esetén erősebb a PiZ sejtvonalakon, mint akár a kontroll, akár az egészséges, PiM alfa1-antitripszinnel transzfektált sejteken (89). Egy másik kutatócsoport szerint a PiZ-génnel transzfektált sejteken végzett kísérletek azt mutatják, hogy a humán alfa1-antitripszin ER-ban visszamaradó mutáns Z formájához számos chaperon kötődik (138). E vizsgálatokban a Grp78, a Grp94, Grp170 és az UDP-glukóz: glikoprotein glükoziltranszferáz (UGGT) chaperonokat találták az antitripszinnel komplexben. A kémiai keresztkötéses és ülepítéses eljárások
28
szerint a mutáns antitripszin 85%-a chaperonokkal közös komplexben található meg az endoplazmás retikulumban. Az idő előrehaladtával a chaperonok, például Grp78 kötődése az antitripszinhez csökkent. Az általunk is használt, PiZ fehérjét hordozó egér törzset régóta alkalmazzák a humán alfa1-antitripszin deficiencia vizsgálatára (53). Ezek az állatok az emberi fehérjét expresszálják a májukban. Az emberi Z, azaz mutáns allél kódolta fehérje felhalmozódik a májsejtek endoplazmás retikulumában, és onnan nem jut ki. Szérumbeli szintje ilyenkor a normálisnak egytizede is lehet az M, nem mutáns allél fehérjetermékéhez képest. Mutáns Z allélt hordozó egereknél alacsonyabb születési súlyt is tapasztaltak (156). A Z allélt magas szinten expresszáló egerek esetében hasonló fenotípusos tüneteket figyeltek meg, mint az embereknél tapasztalható alfa1-antitripszin deficienciánál, például újszülöttkori hepatitiszt (43). A mutáns alfa1-antitripszin a humán
betegekben
tapasztalható
állapothoz
hasonlóan
halmozódik
fel.
A
májkárosodás mértéke korrelál az akkumulálódott Z forma százalékos arányával (26). Ezek az egerek, bár élethosszuk körülbelül azonos vad típusú társaikéval, különböző behatásokra, mint pl. az éhezés (156), vagy tumorindukció (53) sokkal érzékenyebben reagálnak. A sejtes rendszereken talált eredményeknek részben ellentmondó adat, hogy a Grp78-at nem találták emelkedett szintűnek PiZ transzgén egerekben (58), sem pedig PiZ hordozó emberekben (37). Ennek magyarázata az lehet, hogy a sejtes rendszereken a fehérje szintetizálódása után igen rövid idővel, még a stressz akut szakaszában vizsgálták az ER chaperonjait, míg a transzgénikus egértörzsek és a humán minták a krónikussá vált stresszről nyújtanak képet. A legfrissebb kutatások szerint sem transzfektált sejtek, sem pedig a PiZ gént hordozó egerek által szintetizált és felhalmozódott PiZ fehérje nem idézi elő a betekeretlen fehérje választ, azaz az UPR-t, azonban kaszpáz-mediálta apoptózist indukál (67). Ezek az adatok tehát azt valószínűsítik, hogy az alfa1-antitripszin, bár önmagában nem toxikus, mégis kivált olyan reakciókat, amelyek a sejt bizonyos funkcióit gátolják. Mivel a betekeretlen fehérjék a chaperonok kötődését idézik elő,
29
valószínűnek tűnik, hogy a chaperonok tartós AAT-kötöttsége és emiatt kapacitásuk csökkenése, vagyis a chaperon-overload (34) jelenség szerepet játszik a betegség patomechanizmusában. Fontosnak találom megjegyezni, hogy a PiZ egértörzshöz hasonlóan létrehoztak egészséges AAT-t kódoló, azaz a PiM gént hordozó egereket is. Ezek az állatok a PiZ transzgénikus egerekhez hasonlóan magas szinten expresszálják a humánt AAT-t, amely azonban végigjut a szekréciós útvonalon és nem halmozódik fel az endoplazmás retikulumban (43). Ezek az egerek semmilyen, a PiZ transzgén egerekre jellemző tünetet nem mutatnak. Ezek alapján kimondhatjuk, hogy a PiZ transzgénikus egerekben csakúgy, mint az alfa1-antitripszin deficienciában szenvedő betegeknél nem a fokozott fehérjeszintézis, hanem a lumenális aggregáció idézi elő a betegség tüneteit.
30
3
Célkitűzések
Doktori munkám alapját az endoplazmás retikulum stresszfehérjéinek és redox egyensúlyának vizsgálata képezte. 1.
Munkám egyik célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam, mely, fiziológiásan is előforduló kismolekulák játszanak szerepet az endoplazmás retikulum fehérjetekerő rendszerének működtetésében, továbbá, hogy e molekulák hatásmechanizmusát feltárjam.
2.
Tisztázni kívántam továbbá, hogy a mutáns alfa1-antitripszin felhalmozódása transzgénikus egerek májában milyen következményekkel jár. E munkámban elsősorban az endoplazmás retikulum chaperonjainak indukcióját és azok kölcsönhatásait illetve funkcionális aktivitását kívántam megvizsgálni. E mellett, mivel a endoplazmás retikulum redox egyensúlya kardinális kérdés a sejtorganellum működése során, és annak megváltozása más krónikus stresszmodellben is bizonyított, az endoplazmás retikulum redox viszonyait is szükségesnek láttam felmérni.
3.
E méréseket a citoplazma stresszfehérjéinek és redox paramétereinek vizsgálatával
kívántam
kiegészíteni,
hogy
a
patomechanizmusáról kompexebb képet kaphassunk.
31
PiZ
fehérjeaggregáció
4 Anyagok és módszerek 4.1
Anyagok Vegyszerek – A kísérletek során használt vegyszerek a Sigma, illetve Fluka
cégektől származnak, a gélelektroforézishez használt anyagokat a Bio-Rad-tól szereztük be. A Bacitracint a Calbiochem-től, az AMS-t a Molecular Probes-tól szereztük be. A PVDF membránokat és az elektorforézishez használt anyagokat a BioRad-tól vásároltuk. Antitestek – A felhasznált elsődleges antitestek (AT) a következők voltak: PDI – anti-nyúl PDI poliklonális AT (StressGen, SPA-890) illetve anti-egér monoklonális AT (StressGen, SPA-891). ERp72 – anti-egér ERp72 C-terminális poliklonális AT (StressGen, SPA-720). ERO1-Lα – (A29) anti-humán ERO1-L C-terminális monoklonális egér AT (Ineke Braakman ajándéka, 17). Grp94 – anti-patkány Grp94 poliklonális AT (StressGen, SPA-850). Grp78 – poliklonális nyúl anti-humán Grp78 (Stressgen SPA-826). Calnexin – anti-nyúl calnexin C-terminális poliklonális AT (StressGen, SPA-860). KDEL – anti-nyúl KDEL poliklonális antipeptid AT (Affinity BioReagents, PA1-013). Tioredoxin – anti-egér monoklonális AT (StressGen, MSA150E). Hsp90 – anti-egér Hsp90 (Affinity Bioreagents, PA3-012). Hsp70 – (Affinity Bioreagents, MA3-007). MsrA – poliklonális anti-nyúl MsrA AT (Bertand Friguet ajándéka, 127). Alfa1-antitripszin – kecske anti-humán AAT AT (StressGen, SBA155) és peroxidáz-konjugált kecske anti-humán AAT AT (ICN, SKU 0855236). Sejtek – Emberi hepatóma HepG2 sejtvonalakat tenyésztettünk DMEM médiumban, amely 10% fötális szarvasmarha szérumot tartalmazott. A kísérletek elvégzéséhez 90%-os konfluenciájú sejttenyészeteket használtam. Kezelésük során 18 órán keresztül 3 mM-os végkoncentrációjú bacitracinban inkubáltam a sejteket 10 cm átmérőjű petricsészékben, majd mikroszómát izoláltam belőlük a májszövetnél leírt módszer szerint. Fontos megjegyeznem, hogy a mikroszóma izolálás, különös tekintettel a sejtek feltárására (amihez sem detergenst, sem ultrahangos előkezelést nem alkalmazhattam), igen rossz hatásfokú sejttenyészetekből, mivel ilyen enyhe körülmények között a potteres homogenizálás ellenére a sejtek jó része intakt marad.
32
Állatok – A John Rodgers (Baylor College, Houston, Texas) laboratóriumából származó, speciális patogén-mentes C57BL/6J genetikai hátterű, PiZ génre heterozigóta PIZ11.03 jelű állatokat (61) a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Patobiokémiai és Molekuláris Biológiai intézetének steril állatházában tartottuk. Az állatokat 14 napos korukban választottuk el, genetikai analízisüket 4 hetes korukban farok-DNS mintavétellel végeztük el. Az állatokat a Magyarországon érvényes állatvédelmi szabályok betartása mellett a 25-135/3/2002-es engedély alapján tenyészettük és vizsgáltuk. 4.2
Módszerek Fehérjekoncentráció
meghatározásához
Bradford
meghatározása módszerét
–
alkalmaztam
A (20),
fehérjekoncentráció Bio-Rad
reagens
segítségével, marha szérumalbumin (BSA) standard felhasználásával. Fehérje elválasztás – Fehérjék elválasztására diszkontinuus poliakrilamid gélt használtam Laemmli módszere szerint (86), az elektroforézis körülményeit, a minták előkészítését, a gélméretet azonban az adott kísérlet követelményei szerint alakítottam ki. Nem-redukáló SDS-PAGE esetén sem a mintapuffer, sem a futtató közeg nem tartalmazott redukálószert. Western blot – Azokban a kísérletekben, ahol a gélelektroforézissel elválasztott fehérjéket immunoblottal detektáltam, a fehérjéket először félszáraz blotkészülék segítségével nitrocellulóz (Schleicher&Schuell, Protran) vagy PVDF (ImmunBlot, Bio-Rad) membránra transzferáltam (4 °C, 1,5 mA/cm2, 45-120 min, a gélmérettől és pórusnagyságtól függően). A membrán aspecifikus kötőhelyeinek blokkolása TBS-T (20 mM Tris.HCl, 137 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,6) pufferben feloldott 5% zsírmentes tejporral történt 60 percig szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át 4 °Con. Az elsődleges antitesteket a gyártók utasításai szerinti hígításban alkalmaztam 60 percig, majd a membránt 3x10 percig mostam TBS-T pufferben oldott 1 %-os tejporral. A peroxidáz-konjugált másodlagos antitesteket (DAKO) 1:2000 – 1:10000 közötti hígításban 30 percig inkubáltam együtt a membránnal, majd 4x10 percig mostam, és a jelölődő fehérjéket kemilumineszcens eljárással detektáltam betartva a gyártók utasításait (New England Nuclear). DNS izolálás – A transzgén egerek farkából nyert szövetmintákat azonnal
33
jéghideg foszfát pufferbe helyeztem és mostam. A folyékony nitrogénnel történő fagyasztás után a mintákat mozsárban homogenizáltam, majd 1 ml SE (75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 1% SDS, pH 8,0) pufferben oldottam fel. A mintákat proteináz K-val inkubáltam 50 µg/ml végkoncentrációban 55 °C-on 60 percig rázatva a fehérjeszennyezések felszámolására. A mintákhoz NaCl-ot adtam 1,5 M-os végkoncentrációban, majd a mintákat azonos mennyiségű tömény kloroform hozzáadása után centrifugáltam (2000 rpm, 10 perc). A felülúszóhoz azonos térfogatú izopropanolt adtam, majd -20 °C-ra hűtöttem. Centrifugálás után (12000 rpm, 10 perc) a csapadékot kétszer 70% EtOH-ban mostam, majd 25 µl TE8-ban (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) oldottam fel. RNS izolálás és reverz transzkripció – Máj szövet darabkákat (1-3 g) 500 μl TRI reagensben homogenizáltam, majd 200 μl kloroformot adva centrifugáltam 10,000 g-n, 4 °C-on. A felülúszót 500 μl izopropanollal elegyítve 30 percig jégen inkubáltam, majd 12000 g-n, 4 °C-on 10 percig centrifugáltam. Az üledéket 70%-os etanollal mostam, (12000 g-n, 4 °C-on, 5 percig), majd steril desztillált vízben oldottam fel. A reverz transzkripciót MBI Fermentas nagytisztaságú vegyszerek segítségével készítettem, betartva a gyártó utasításait. A termékből 1-2 μl-t használam a PCR-hoz. PCR – A PCR-t J. Rodgers laboratóriumának előírásai szerint végeztem, (95 °C 1 perc után 64,5 °C 2 perc, majd 72 °C 1 perc, 40 cikluson keresztül) a szükséges nagy tisztaságú vegyszerek MBI Fermentas termékek voltak. A primereket J. Rodgers és munkatársai által megadott szekvenciákra készíttettük el. A PCR eljárásnál mindíg humán szérumot, vad típusú (CD1) egeret és DNS mentes mintát is használtam kontrollként. Standardként aktin gén amplifikációt alkalmaztam. DNS elválasztás – A PCR eredményének vizsgálatához 1μl PCR termék és 3 μl TAE puffer (10 mM Tris bázis, 5.7% jégecet 0,5 M EDTA, pH 8,5) és 1 μl 5x tömény DNS futtatópuffer keverékét vittem fel 2%-os agaróz gélre. A futtatás Bio-Rad horizontális futtatókádban és TAE pufferben történt. A megjelenítést etídiumbromidos jelöléssel végeztem. Mikroszóma izolálás – A transzgén, illetve kontroll egerekből a gerincvelő megszakítása után a máj mikroszómális frakcióját Lambert és Freedman eljárásának
34
adaptációjával végeztem (88). A májat jéghideg TKM-pufferben (50 mM Tris.HCl, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,0) ollóval aprítottam, üvegszűrőn mostam, majd 2x-es mennyiségű jéghideg, gáztalanított S-TKM-pufferbe (TKM-puffer + 250 mM szukróz, 10-10 μg/ml aprotinin és leupeptin, 1 mM PMSF, pH 7,0) vettem föl és ötszöri potteres eljárással homogenizáltam. A mintát lecentrifugálva (700xg, 12 perc, 4 °C) a felülúszót jégen tartottam, míg az üledéket potterrel tovább homogenizáltam és centrifugáltam a hatékonyabb kinyerés érdekében. A felülúszót tovább centrifugálva (12000xg, 10 perc, 4 °C) megkaptam a posztmitokondriális felülúszót, melyből ultracentrifugálással (100000xg, 60 perc, 4 °C) választottam el a citoplazmatikus frakciót (felülúszó) és a mikroszómális frakciót (üledék). Ez utóbbit 10x térfogatú STKM-pufferben reszuszpendáltam, leválasztottam a glikogént tartalmazó üledékről és újra ultracentrifugáltam (100000xg, 60 perc, 4 °C). Az így kapott mosott mikroszómát 0,15 M Tris/HCl-pufferbe (pH 7,0) fölvéve -80 °C-on tároltam. A mikroszómák intaktságát mikroszóma impermeábilis szubsztrát (szaharóz) jelenlétében kialakuló fényszórásjel növekedés megtartottságával (21) ellenőriztem. Tiol tartalom meghatározása – A tiol-tartalom meghatározása Ellman módszerével történt 2-300 μg fehérjetartalmú mikroszómális illetve citoplazmatikus minta
felhasználásával.
A
fehérje-tiolok
méréséhez
a
mintákat
5
%-os
végkoncentrációjú triklórecetsavval precipitáltam, 3x70 %-os acetonos mosás után reszuszpendáltam (50 mM Tris.HCl, pH 6.8, 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazó pufferben) és a fehérjekoncentráció ellenőrzése után végeztem el a meghatározást. A méréshez Hitachi U-1500 UV-VIS spektrofotométert használtam, Ellman módszere szerint 412 nm-en, moláris extinkciós koefficiensként 14150-et használtam a 2-nitro5-thiobenzál savhoz. Az összes GSH szint meghatározása – Mivel a szabad tiolcsoportok döntő többsége a kis molekulák mérésénél a glutationból származik, ezért a tiolcsoportok meghatározása gyakorlatilag a glutation-szint meghatározásának felel meg. Ellman módszere szerint (44) csak a redukált tiolok mérhetőek, ezért az össz-glutation meghatározásához a mintákat először redukálni kell GSH-reduktáz segítségével. Ennek érdekében mintánként 100 μg fehérjét inkubáltam 2 µl NADPH-t tartalmazó 240 μl 50 mM Tris.HCl (pH 7.2) pufferben, 1 U aktivitású glutation reduktáz jelenlétében 30 percig 37°C-on. A reakciót 5% triklór ecetsav adásával állítottam meg,
35
majd a centrifugáltam (3,000Xg, 3 perc). A felülúszóból 500 μl-es aliquotot 80 µl 400 mM Tris.HCl (pH 7.2)-lel és 150 μM DTNB-vel kevertem. A GSH meghatározáshoz Hitachi U-1500 UV-VIS spektrofotométert használtam, 412 nm-en, moláris extinkciós koefficiensként 14150-et használtam a 2-nitro-5-thiobenzál savhoz. Redukált glutation meghatározás – 40 µg fehérjét a kívánt mintákból 400 μl 400 mM Tris.HCl (pH 7.2) pufferben vettem fel, 5%-os triklórecetsavval csaptam ki, centrifugáltam 3000xg-n 3 percig. A felülúszókból 200 µl-es aliquotot vettem, és a fent leírt módon végeztem rajta a GSH meghatározást. ER stresszfehérjék oxidatív állapotának meghatározása – A luminális stresszfehérjék redox állapotának meghatározásához a mikroszóma mintát 50 mM Tris.HCl (pH 6,8) pufferben hígítottam, és a fehérjéket 5 % triklórecetsavval precipitáltam. Egyes kísérletekben a mikroszómákat különböző redox reagensekkel inkubáltam
a
kísérletben
meghatározott
ideig,
majd
ezután
precipitáltam.
Centrifugálás után (10000xg, 10 perc) az üledéket 70 % acetonnal kétszer mostam, végül detergens jelenlétében reszuszpendáltam (50 mM Tris.HCl, 2 % SDS, 4 M urea, pH 6,8). A fehérje-tiol csoportokat a reszuszpendáló pufferbe adott 20 mM AMS-sel (4-acetamido-4’-maleimidilstilbén-2,2’-diszulfonsav,
Molecular
Probes,
A-485)
jelöltem 15 perc, 0 °C-on és 15 perc, 37 °C-on végzett inkubációval (49). A mintákat nem-redukáló SDS-PAGE és szekvenciális Western blot segítségével analizáltam. Immunoprecipitáció – Mikroszóma mintákat inkubáltam azonos térfogatú protein-A Sepharose-zal precipitációs pufferben (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40, pH 7,2) 30 percig 40 °C-on a mintában található egér IgG eltávolítására. 20 µl protein-A Sepharose-t és 1-2 µl IgG-t összemértem, inkubáltam precipitációs pufferben, 100 µl össztérfogatban 40 °C-on 60 percig. Az egér IgG-től megtisztított mintából 50 µg fehérjetartalmú adagot a Sepharose-antitest elegy mosott precipitátumával mértem össze, és tovább inkubáltam legalább 2 óráig. A felülúszó eltávolítása után a precipitátumot többször mostam precipitációs pufferrel. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertem, forraltam, majd gélelektroforézisre vittem a fent leírt módon. FiTC-inzulin szintézis – Heuck és Wolosiuk (66) szerint 30 mg fluoreszcein izotiocianátot (FiTC-ot) kevés vízmentes DMSO-ban feloldottam, majd 3 ml NaHCO3
36
pufferbe (pH = 9,0) mértem. Ehhez 21 mg inzulint adtam. A reagáló elegyet 24 órán át inkubáltam 4 °C-on. Kizárásos kromatográfiával Sephadex G25 töltettel 1x48 cm-es oszlopon választottam el a FiTC-inzulint a szabad FiTC-től és a jelöletlen inzulintól. Az elúciós puffer azonos volt a reakciópufferrel. Az elsőként eluálódó színes frakciók tartalmazták a FiTC-cel jelölődött inzulint. A FiTC-inzulin tartalmú frakciókhoz ureát adtam 6M végkoncentrációban. A mintákat desztillált vízzel dializáltam, majd 10 mM-os Tris pufferbe (pH 7,6) vittem át. Protein diszulfid oxidoreduktáz (PDOR) aktivitás mérése FiTC-inzulinnal – A módszer lényege, hogy az inzulin mindkét peptidszála FiTC csoporttal jelölt, ez a csoport vizes közegben alig fluoreszkál, ám a B-lánc aggregációjával az FiTCcsoportok egy része apoláros környezetbe kerül, és így fluoreszcenciája megnő. A kísérletek 25 °C-on, 0,8 ml Tris.HCl (5 mM, pH 7,2) pufferben zajlottak 1:5 arányú GSH:GSSG puffer (összes GSH koncentráció 2 mM) jelenlétében, 1 μM FiTCinzulinnal. A fluoreszcencia-növekedést Hitachi F-4500-as spektrofluoriméteren követtük 495/520 nm-es excitációs/emissziós hullámhosszpárt használva. A pozitív kontroll 50 nM rekombináns tioredoxin (Promega, Z7051) volt. Statisztikai analízis – Az itt bemutatott eredmények mindegyike legalább 3 független kísérlet eredményét reprezentálja. Statisztikai analízishez Student-féle tpróbát alkalmaztam, csak a p<0,05 megbízhatóságú eltéréseket fogadtam el szignifikánsan eltérőnek.
37
5 Eredmények 5.1
A FAD szerepe az endoplazmás retikulum redox fehérje tekerésében
5.1.1
Kis molekulák hatása a mikroszómális tiolok redox állapotára Amint azt az irodalmi áttekintésben bemutattam, a FAD és a piridin nukleotidok
is szerepelhetnek, mint elektronakceptorok a fehérjék oxidatív tekeredése során bekövetkező elektron-áramlásban. Ezt a lehetőséget vizsgáltam meg kísérleteim során. Elsőként nagy mennyiségben adtam FAD-ot, FADH-t, NAD-ot, NADH-t, NADP-t és NADPH-t a mikroszómákhoz, hogy megvizsgálhassam, molekulák milyen hatással vannak a mikroszómális tiolcsoportok redox állapotára.
120
Fehérje tiol oxidáció a kontroll %-ában
100
*
80 60 40 20 0 kontroll
FAD
NAD
NADH
NADP NADPH
5.1.1. ábra. Különböző kis molekulák hatása a fehérje oxidációra 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát inkubáltam 37°C-on, az ábrán jelzett kis molekulákkal, 500μM koncentrációban. A 30 perces inkubálási idő letelte után a fehérjéket kicsaptam 5% perklórsav segítségével, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0.05).
38
A 5.1.1-es ábráról leolvasható, hogy a megvizsgált molekulák közül csak a FAD volt képes a mikroszómális fehérjéket oxidálni. A nikotinsavamid-származékok hatását, illetve hatástalanságát Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportja tovább vizsgálta, ebből közlemény is született (127). 5.1.2
A FAD hatása a mikroszómális tiolok oxidálására Ahogy azt Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közösen kimutattuk, a FAD-
dal való inkubálás eredményeképpen FAD halmozódik föl intraluminális térben (164). Ez a folyamat gátolható anion-csatorna gátlószerekkel, ami az aktív transzporter jelenlétét valószínűsíti. Az én kísérleteim ezután arra irányultak, hogy megtudjam, a FAD felvétele az endoplazmás retikulum lumenébe milyen módon okoz változást a fehérjék oxidatív állapotában. A mikroszómákat növekvő koncentrációjú FAD-dal inkubáltam, majd megvizsgáltam a mikroszómális fehérjék oxidáltsági állapotát. Ennek megvizsgálására az Ellman-reakciót használtam. A 5.1.2. ábrán mutatom be e kísérletek eredményét: 60
(pmol SH/mg fehérje)
Fehérje tiol tartalom Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje
50
* *
*
40 30 20 10 0 0
100
200
300
400
500
F A D k o n c e n tr á c ió (μ M )
5.1.2. ábra. A FAD indukálta fehérje-oxidáció koncentráció függése 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát inkubáltam 37 °C-on, az ábrán jelzett FAD koncentrációkkal. A 30 perces inkubálási idő letelte után a fehérjéket 5% perklórsav segítségével kicsaptam, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. A szabad tiolcsoportok csökkenése a FAD-indukálta oxidáció mértékét jelenti. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0,05).
39
Az ábrán látható, hogy a FAD koncentrációfüggő módon képes a mikroszómális fehérjéket oxidálni, a maximális oxidáló hatást kb. 100 μM-os koncentrációnál éri el. Ezt a FAD koncentrációt választottam a további kísérleteimhez. Először a FAD oxidáló hatásának időbeli lefutását vizsgáltam meg. Ezen kísérletek eredménye látható a 5.1.3. ábrán: 60
Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje
50
* *
*
40
*
30
20
10
0 0
20
40
60
Idő (m in)
5.1.3. ábra. A FAD indukálta fehérje-oxidáció időfüggése 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát 37°C-on, az ábrán jelzett ideig, 100 μM FAD jelenlétében inkubáltam. A megfelelő inkubálási idők letelte után a fehérjéket 5% perklórsav segítségével kicsaptam, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. A szabad tiolcsoportok csökkenése a FAD-indukálta oxidáció mértékét jelenti. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0,05).
100 μM FAD már kb. 15 perc után eloxidálja az összes hozzáférhető tiolcsoportot, az oxidáció mértéke hosszabb idő elteltével sem fokozódik. A kísérletet megismételem 4°C-on, illetve 500 μM FAD jelenlétében, az eredmények egészen hasonló képet mutattak, így ezeket az ábrákat itt nem mutatom be. Miután megvizsgáltam a FAD kiváltotta fehérje oxidáció kinetikáját, kíváncsi voltam, hogy a mikroszóma membrán jelenléte mennyire gátolja a FAD hatását, azaz, ha szabad hozzáférést engedünk a FAD számára, a fehérjék oxidációja tovább
40
fokozódik-e. Ennek érdekében olyan kísérleteket terveztem, amelyben a mikroszómák membránját „kilyukasztottam”, és vizsgáltam, hogy az ER fehérjéinek oxidációja hogyan nő. Ehhez az alábbi módszereket választottam: A mikroszómákat detergens (DOCA) kezelésnek tettem ki, illetve egy pórusképző ágenst, az alamethicint adtam hozzá, amely a membránstuktúra viszonylagos megőrzésével a kismolekulák számára átjárhatóvá teszi a membránokat. A FAD-tól eltérő oxidálószerek jelenlétében is megvizsgáltam az adott kezelések hatását. A 5.1.4. ábrán e kísérletek eredménye látható:
Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje
60
50 *
40
*
*
*
*
*
*
*
*
30
20
10
0
Kontroll
FAD
5 mM GSSG 50mM GSSG
DEH
5.1.4. ábra. Különböző oxidálószerek hatása az ER fehérje oxidációjára 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómákat inkubáltam 15 percig üres pufferben (fehér oszlopok) illetve 10 mM alamethicin (szürke oszlopok) vagy 50 mM DOCA (fekete oszlopok) jelenlétében 37 °C-on. E kezlések után a mintákat inkubáltam üres puffer (kontroll), 100 μM FAD, 5 illetve 50 mM GSSG vagy 50 mM dehidroaszkorbát (DEH) jelenlétében további 30 percig 37°C-on, majd a fehérjéket kicsaptam, és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az ábra három független kísérlet eredményét mutatja, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0.05).
Meglepetésünkre a FAD oxidáló hatása a várakozással ellentétben egyáltalán nem érvényesült, hogyha az ER membrán épségét megzavartuk. Az oxidált glutationnál koncentráció-függő eltéréseket találtam: kis, 5 mM-os mennyiségben a
41
GSSG nem volt képes oxidálni a lumenális fehérjéket, csak akkor, ha a membrán integritását megzavartuk. Igen nagy, 50 mM-os koncentrációban azonban a GSSG minden körülmények között oxidálni képes volt a fehérjék oxidációjára. A továbbiakban ezt a maximálisan oxidált kontrollok előállításához használtam fel. A dehidroaszkorbát oxidáló hatása a membránok épségétől függetlenül érvényesült. Ez után a kísérletsorozat után további méréseket végeztem, amelyekkel tovább vizsgáltam a membránok szerepét a FAD előidézte fehérje oxidációban. Ekkor az anion transzporter gátló szerrel, DIDS-sel, amely a transzportot. Varsányi és mtsai (164) által bizonyított módon gátolja, illetve ultrahangos kezeléssel próbáltam a FAD bejutását a mikroszómákba gátolni illetve előmozdítani. Ahogy az a 5.1.5. ábráról kitűnik, a transzport felfüggesztése, illetve a membrán 70
60
Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje
50
40
30
20
10
0
kontroll
DIDS
ultrahang
5.1.5. ábra. FAD transzport gátlószer illetve ultrahangos kezelés hatása a mikroszómális fehérjék oxidációjára 300 μg fehérjének megfelelő mikroszómát inkubáltam 15 percig 37 °C-on anion transzport inhibitor, DIDS (100 μM) jelenlétében vagy anékül, illetve ultrahangos kezelésnek tettem ki 30 másodpercre (35 W-on Sonic 300 dismembrator Farmingdale NY, USA berendezéssel) jégen. E kezlések után a mintákat üres puffer (fehér oszlopok), 50 mM GSSG (szürke oszlopok) vagy 100 μM FAD (fekete oszlopok) jelenlétében inkubáltam további 30 percig. A kezelés végén a fehérjéket kicsaptam és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az eredmények 3 független kísérlet eredményét mutatják, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0,05).
42
integritás mechanikai megtörése egyaránt a FAD hatásának megszűnését vonta maga után. Felmerült a kérdés, vajon nem az akadályozza-e a fehérjék oxidációját ez esetben, hogy a mikroszómákban esetleg fennmaradó iongrádiensek, amelyek a folyamatok
lejátszódásához
szükségesek,
kiegyenlítődnek
a
membránok
feldarabolódása nyomán. Ennek megvizsgálására különböző ionofórok hatását teszteltem a FAD fehérje-oxidációs képességére vonatkozóan. Az eredményeket táblázatosan foglaltam össze:
kontroll ionomycin, 10 μM valinomycin, 2mM monensin, 50 μM
kontroll FAD 100 μM nmol SH/mg fehérje 52,4±3,2 33,6±2,8(*) 55,5±3,5 32,1±2,8(*) 53,7±3,0 33,2±3,4(*) 46,2±5,3 30,2±2,5(*)
5.1.1. táblázat Különböző ionofórok hatása a FAD fehérje oxidációjára A kálcium ionofór, ionomycin (10 μM), a kálium ionofór, valinomycin, (2 mM) és a protonionofór, monensin (50 μM) jelenétében inkubáltam a mikroszómákat 15 percig, majd 100 μM FAD jelenlétében vagy anélkül további 30 percig. A kezelés végén a fehérjéket kicsaptam, és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az eredmények három független kísérlet eredményét mutatják, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0,05).
Ezek alapján kimondható, hogy a FAD mikroszómális fehérjékre gyakorolt hatása a membrán integritásától függ, annak hiányában az oxidációs folyamat nem megy végbe. Ugyanakkor azt is kimutattam, hogy az oxidáció a mikroszómákban esetlegesen meglévő iongrádiensektől függetlenül zajlik le. 5.1.3
A FAD hatása az oxidatív fehérjetekerő apparátus elemeire
A későbbiekben arra kerestem a választ, mely fehérjék érintettek a korábbi kísérletek során kimért tiol-oxidációban. Az Ero1-L és PDI alkotta redox tekerő komplex tagjai voltak az elsődleges célpontok ebből a szempontból, de megvizsgáltam további, PDI családba tartozó fehérjéket és más ER chaperonokat is, vajon tiolcsoportjaik oxidációt szenvednek-e a FAD hatására. Ennek megvizsgálására a FAD-dal való inkubálás után a fehérjéket egy tiol-specifikus jelölővel,
a
4-acetamido-4’-maleimidilstilbén-2,2’-diszulfonsavval
(AMS-sel)
inkubáltam, amely a szabad tiolcsoportokhoz köt. Ennek a molekulának a kötődése kb.
43
0,5 kDa-nal növeli a molekula látszólagos méretét és így lassítja a fehérje futását az SDS-PAGE során. Így a redukált fehérje “nagyobb”, lassabban futó csíkként jelenik
GSSG
GSH
Alam. +FAD
Alamethicin
DIDS +FAD
DIDS
FAD
kontroll
meg. A 5.1.6. ábrán egy-egy tipikus kísérlet eredménye látható.
Redukált Oxidált Redukált Oxidált
Ero1-L PDI
Redukált Oxidált
ERp72
5.1.6. ábra. FAD hatása az ER fehérjéinek oxidációjára 40 μg fehérjét tartalmazó mikroszómát inkubáltam 15 percig 100 μl 15 mM-os Tris.HCl pufferben (pH 7,2) 37 °C-on üres puffer, 100 μM DIDS, vagy 10 mM alamethicin jelenlétében. Ez után 100 μM FAD-ot adtam a mintákhoz, és további 30 percig inkubáltam őket 37 °C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként olyan mintákat használtam, amelyekhez 50 mM GSH-t vagy GSSG-t adtam, amely képes a fehérjéket maximálisan redukált, illetve oxidált állapotba hozni. Az AMS-jelölést, a gélelektroforézist és a Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A képek öt kísérlet egyik tipikus képét mutatják.
Az ábráról leolvasható, hogy az Ero1-L fehérje a mikroszómákban alapvetően redukált formában található meg. Ezen állapoton 100 μM FAD változtatni képes, az Ero1-L oxidáltabb lesz. Sem az alamethicines, sem a DIDS-sel történő kezelés önmagában nem befolyásolta az Ero1-L oxidációjának mértékét, ugyanakkor a FAD hatását mindkét kezelés felfüggesztette. Hasonló képet láthatunk a PDI esetén is. A PDI családba tartozó ERp72 fehérjére ugyanakkor a FAD kezelés hatástalannak bizonyult. Hasonló képet találtunk calnexinnél, amely egy, a redox tekerésben nem részvevő ER chaperon, amely azonban számos tiolcsoportot tartalmaz. E kísérletekben a kontrollként használt GSHval és GSSG-vel kezelt minták közötti eltérés mutatja a kezelés sikerességét. Ezzel a
44
módszerrel tehát kimutattam, hogy a FAD hatása specifikus, és csak bizonyos fehérjéket érintő módon zajlik. A FAD által oxidálódó fehérjék, az Ero1-L és a PDI a szekréciós fehérjék redox tekerésében résztvevő enzimek. Ezáltal valószínűsíthető volt, hogy a FAD nemcsak mint általános oxidálószer, hanem mint a redox tekeredésben részt vevő elektronakceptor is szerepel. 5.1.4
A PDI gátlásának hatása a FAD előidézte tiol-oxidációra Ennek bebizonyítására olyan kísérleteket terveztem, amelyek a redox tekeredés
gátlása mellett vizsgálják a FAD hatását. Mivel az Ero1-L-re nem ismerünk gátlószert, a PDI gátlásához folyamodtunk. A legismertebb és széles körben használt gátlószer a bacitracin. E sokgyűrűs molekula azonban nem membrán-permeábilis, így kezdeti kísérleteim, amelyek során mikroszómát bacitracinnal inkubáltam, majd a FAD hatását mértem, nem vezettek eredményre. A kísérletek egy következő csoportjában a membránok enyhe ultrahangos kezelésével tettem a membránokat átjárhatóvá a bacitracin számára, majd több órás “hegedés” után FAD-ot adtam a mintákhoz, és vizsgáltam a fehérjék oxidációjának mértékét. A FAD ezúttal is hatott a fehérje oxidációra, ugyanakkor a bacitracinnal kezelt mikroszómákban csökkent mértékű volt a FAD hatása (nem bemutatott adatok). Ezen kísérletek, bár bacitracin hatására csökkent mértékű oxidációt mutattak FAD kezelés után, nem tűntek elég megbízhatónak, lévén az ultrahangos kezelés után nem egyértelmű, hogy a mikroszómák mekkora hányada nyerte vissza eredeti funkcióját. Ezért humán limfóma Jurkat sejteket tenyésztettem, és kezeltem 3 mM bacitracinnal 18 órán keresztül. Ez az időtartam az irodalom szerint elégséges, hogy a sejtek a bacitracint felvegyék, és az eljusson az endoplazmás retikulumig is. Ez után a sejtekből mikroszómát izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetettek szerint. A mikroszómákat ezek után FAD kezelésnek vetettem alá, és megvizsgáltam az érintett fehérjék oxidáltsági állapotát. Eredményeim azt mutatták, hogy a PDI eleve maximálisan oxidált állapotban van jelen a Jurkat sejtekben. Ezen állapoton FAD adásával sem sikerült változtatni (nem bemutatott eredmények) Ezeket a kísérleteket nem folytattam tehát, és egy újabb modellt állítottam fel, amelyben humán hepatóma HepG2 sejteket kezeltem hasonló módon, remélve, hogy eltérő sejttípusoknál eltérő PDI redox állapot fordulhat elő, és
45
hogy a PDI redukáltsági állapota hepatóma sejtekben jobban emlékeztet majd a májsejtben található helyzetre, mint Jurkat limfóma sejtek esetében találtam. A 18 órás bacitracin kezelés hatására a HepG2 sejtek megnyúlt alakot vettek fel, némely sejt felszínen kitüremkedő („bleb”-es) képződmények látszottak, azonban a Trypán-kék kizáráson alapuló életképesség-becsléssel a kezelt és kezeletlen tenyészetek között számottevő eltérés nem volt kimutatható. A HepG2 sejtekből is mikroszómát izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint, és kezeltem őket FAD-dal. E sejtekből már sikerült olyan mennyiségű mikroszómát előállítani, hogy a fehérje tiol mérések is elvégezhetőek voltak belőle. A 5.1.7. ábrán e kísérletek eredménye látható. Ezeknél a kísérleteknél azért tértem el a szokásos kontrolloktól, mert felmerült a lehetősége annak, hogy a bacitracin kezelés esetleg a glutation hatását is befolyásolja, hiszen a redukált glutation, mint az Ero1-L hatását limitáló ágens merült fel (106). Ezért itt a kémiai módosításhoz, a DTT, illetve a tiol specifikus oxidálószer, a diamid használatához folyamodtam. Az eredményekből kitűnik, hogy a bacitracin kezelés önmagában okozott egy 90
(pmol SH/mg fehérje)
Fehérje tiol tartalom
80 70 60 50 40
*
*
*
30 20 10 0 k o n t r o ll
F AD
d ia m id
DTT
5.1.7. ábra. Bacitracin kezelés hatása a FAD okozta tiol oxidációra HepG2 sejteken 200 μg fehérjét tartalmazó, bacitracin nélkül (fehér oszlopok) illetve 3 mM bacitracin jelenlétében (fekete oszlopok) inkubált HepG2 mikroszómát inkubáltam 100 μM FADjelenlétében, vagy anélkül, 30 percig 37 °C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként 5 mM DTT-t vagy 5 mM diamidot adtam. Az inkubáció végén a fehérjéket kicsaptam és a szabad tioltartalmat mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p<0,05). 46
kis eltolódást a redukált tiolcsoportok irányába, (feltehetően a 18 órás inkubáció alatt a szintetizált fehérjék egy része nem tudott betekeredni), illetve, hogy a bacitracin kezelt sejtekből származó mikroszómán a FAD hatástalan maradt. Ez a kísérlet tehát azt mutatja, a FAD az Ero1-L/PDI-komplexen keresztül fejti ki hatását. Mivel a FAD hatását a bacitracinos kezelés teljesen visszaszorította, úgy tűnik, a FAD hatása kizárólag a PDI-n azaz az Ero1-L/PDI rendszeren keresztül érvényesül. Ezután azt szerettem volna látni, mi történik a fent említett redox tekerésben részt vevő fehérjék oxidáltsági állapotával bacitracin és FAD kombinált kezelés hatására. Ennek érdekében a mikroszómális fehérjéket AMS-jelöléssel láttam el az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint, hogy a két legfontosabb redox tekerő fehérjét, az Ero1-L-et és a PDI-t megvizsgáljam, hogyan változott redox állapotuk a
kontroll sejtek
diamid
DTT
DIDS+ FAD
FAD
kontroll
DIDS + FAD
FAD
kontroll
kezelések alatt.
bacitracin kezelt sejtek
Ero1-L
Redukált Oxidált
PDI
Redukált Oxidált
5.1.8. ábra. Bacitracin kezelés hatása a FAD okozta fehérje oxidációra HepG2 sejteken 40 μg fehérjét tartalmazó, bacitracin nélkül, illetve 3 mM bacitracin jelenlétében inkubált HepG2 mikroszómát-inkubáltam 100 μM FAD, 100 μM FAD és DIDS-jelenlétében vagy anélkül, 30 percig 37 °C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként 5 mM DTT-t illetve 5 mM diamidot adtam. Az AMS jelölést, a gélelektroforézist és a Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A anti-Ero1-L, illetve anti-PDI antitesttel jelöltem. A képek három hasonló kísérlet egyikének képét mutatják.
47
A 5.1.8. ábra azt mutatja be, milyen redox változások történtek a specifikus fehérjék szintjén. Ahogy az ábráról leolvasható, Ero1-L esetén a FAD oxidáló hatása a bacitracin kezelt sejteken éppúgy érvényesült, mint a kontroll sejteken. Ezt a hatást mindkét sejtpopuláción a DIDS felfüggesztette. A PDI esetén már más képet látunk: a bacitracin kezelés hatására felhalmozódott a redukált PDI mennyisége. Itt a bacitracinos kezelés a FAD oxidáló hatását kivédte, így ezeken a sejteken a DIDS-sel való gátlás már további csökkenést nem eredményezett. A bacitracin kezelés tehát nem akadályozza meg, hogy a FAD az Ero1-L-től elektronokat vegyen át, azonban gátolja azt, hogy az elektonok a PDI-ről az Ero1-L-re vándoroljanak, ezen a módon megakadályozva a PDI visszaoxidálódását, és ennek következtében a lumenális fehérjék oxidálódását.
48
5.2
Az
alfa1-antitripszin
aggregáció
okozta
változások
az
endoplazmás
retikulumban 2002 őszén kaptuk meg azt a hat PIZ11.03 egeret Houstonból (John Rodgers laboratóriumából), amelyek leszármazottai későbbi kísérleteink alanyait képezték. Ezek az egerek heterozigóta hordozói voltak a humán Z mutációjú alfa1antitripszinnek, amelyet PiZ néven (Z típusú proteináz inhibitor) is gyakran találunk meg a szakirodalomban. Én is ezt a rövidítést fogom használni, csak abban az esetben térek el ettől, ha a vizsgált fehérje mutáns vagy nem mutáns volta nem tisztázott, ilyenkor a normál fehérjére használt, AAT jelölést fogom használni. 5.2.1
A PiZ egerek A PiZ-expresszáló egerekkel való kísérleteim első lépése az utódok genetikai
jellemzése volt. Ezt 5 hetes korban, farok DNS minta vizsgálatával végeztem, humán AAT-re specifikus primerek használatával. Ez a konstrukció a humán AAT gén egy 300 bázispár hosszúságú szakaszát sokszorosítja. Egy tipikus kísérlet eredményét
Marker
Deszt. víz
Humán
Kontroll
Transzgén
Transzgén
Transzgén
mutatom be a 5.2.1. ábrán.
5.2.1. ábra. hAAT PCR eredménye 1 pg DNS-t tartalmazó mintát amplifikáltunk az Anyagok és módszerek fejezetben feltüntetett módon, majd 2%-os agaróz gélben futtattuk. Etídium-bromidos festés után a láthatóvá vált csíkokat Gel-Doc rendszeren rögzítettük. A Transzgén megjelöléssel a PiZ expresszáló egerekből származó mintákat, Kontrollal a kontroll egerekből származó, Humánnal a humán pozitív kontroll mintát jelöltem. Deszt. víz a DNS mintát nem, csak desztillált vizet tartalmazó kontrollt, Marker a molekulasúly-markert jelöli. A PCR eredményét 2%-os agaróz gélen futtattam meg, és etídium-bromiddal tettem láthatóvá. A kísérletet minden állaton elvégeztem, itt egy tipikus képet mutatok be. 49
Mint látható, az amplifikáció sikeres volt, és a PiZ gént hordozó és nem hordozó állatok elkülöníthetőek voltak, mivel a primerek nem kötöttek az egerek AAT génjéhez. Mivel ez a módszer nem alkalmas arra, hogy a homo-és heterozigóta transzgén egereket elkülönítsük, az mRNS és a fehérjeszinteket is megvizsgáltuk az állatokból. A reverz-transzkripciót követően a mintákat amplifikáltam, és az eredményt
Marker
Vad típus
3. AAT
2. AAT
1. AAT
Deszt.víz
3. aktin
2. aktin
1. aktin
Marker
Southern blot-on tettem láthatóvá. Egy ilyen kísérlet eredménye látható a 5.2.2. ábrán.
5.2.2. ábra. PiZ mRNS szintek meghatározása egerekből Az egerek májából RNS-t izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően, majd reverz transzkripcióval cDNS-t készítettem belőlük. A mintákat PCR segítségével amplifikáltam, és az eredményt 2%-os agaróz gélben megfuttatva etídiumbromidos festéssel tettem láthatóvá. Az ábrán aktin primerrel (2.-4. sáv), illetve AAT primerrel (6.-8. sáv) történő amplifikáció eredménye látható, desztillált víz és vad típusú egér kontrollja mellett. A kísérletet minden állaton elvégeztem, az itt bemutatott kép tipikusnak tekinthető.
Az aktin primerekkel történő amplifikáció mutatta az RNS izolálás, illetve a reverz transzkripció sikerességét. Az itt bemutatott ábrán az 1. számmal jelölt egér nem hordozója, míg a 2 és 3. számmal jelölt egér hordozója a humán AAT génnek. A 2. mintában egy aspecifikus termék is látható 600 bázispár magasságban, amely több mintában is előfordult, magyarázata nem ismert, érdekemes azonban megjegyezni, hogy ez a termék csak transzgénikus állatokban található meg.
50
Az RNS szintekben nem találtam eltérést homo-és heterozigóta állatok között, megvizsgáltam tehát a jelenséget a fehérjék szintjén is Western blottal: e kísérlet
Transzgén
Transzgén
Transzgén
Kontroll
Kontroll
Vad típus
eredménye látható a 5.2.3. ábrán.
AAT
5.2.3. ábra. hAAT fehérje szintje egerekben A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9 %-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. Kontrollként fehér egérből származó mintát és humán szérumot használtam. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A képek 3 hasonló kísérlet egyikének képét mutatják.
Az ábra tanúsága szerint az általunk használt, humán AAT antitest nem specifikus, a normál egerekben is jelet ad. Az ábrán jól látható, hogy transzgén egerekben az AAT mennyisége jóval nagyobb, mint kontroll egerekben. Az ábra szerint az általunk használt antitest (és az általunk kipróbált összes, hAAT-ellen szintetizált elsődleges antitest) felismeri az egerek saját alfa1-antitripszinjét is. Ezt a tényt, hogy a specifikusnak állított antitest mégis felismeri az egérből származó fehérjét is, később az immunprecipitációs kísérleteink során előnyünkre fordítottuk. Az mRNS és fehérje szintekkel végzett kísérleteim azt mutatták, hogy a homoés heterozigóta PiZ hordozó egerek expressziós szintjeiben nincs lényeges eltérés. Ezután minden, PiZ gént hordozó egeret “transzgén”-ként vontam be a kísérletekbe. 5.2.2
A PiZ egerek stresszfehérje szintjei A betegség hátterének feltárásához első lépésben a stresszfehérjék indukciójára
voltam kíváncsi. Mivel a PiZ fehérje az irodalmi adatok tanúsága szerint az endoplazmás retikulumban halmozódik fel, elsősorban az ER stresszfehérjéinek szintjére voltam kíváncsi. Elsőként egy olyan antitestet használtam, amely a KDEL szekvenciára specifikus. Ez a szekvencia az ER fehérjéinek C terminálisán
51
elhelyezkedő szignál, amely a fehérje ER-beli retenciójáért felelős. Az antitest, amelyet használtam, a Grp94, Grp78 és PDI fehérjéket ismeri fel. A kísérletek
PiZ
PiZ
Ktr
Ktr
eredménye a 5.2.4. ábrán látható.
Grp94 Grp78
PDI
5.2.4. ábra. KDEL antitesttel történő Western blot eredménye A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó mikroszóma mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, elsődleges antitestként anti-KDEL antitestet használtam. Ktr: PiZ-n nem expresszáló kontroll egér, PiZ: transzgén egér. A képek 3 hasonló kísérlet egyikének képét mutatják.
Az ábráról leolvasható, hogy a KDEL-antitesttel előhívódó három fehérje (Grp94, Grp78 és PDI) szintjében a kontroll és transzgén egerek között nincs különbség. A meglepő eredmény miatt a kísérleteket megismételtem az egyes fehérjékre specifikus antitestek segítségével is, ennek eredménye a 5.2.5. ábrán látható. A különböző genetikai hátterű egerek alap-szintézise egy-egy fehérjére nagymértékben eltérő lehet, ezért ezekben az ismételt kísérletekben egy eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett CD1 típusú egérből származó mintát is használtam kontrollként. Az ábrán látható, hogy ezek az antitestek is hasonló mintázatot mutatnak, mint a KDEL-el történő előhívás. Az ábráról kitűnik, hogy az általunk vizsgált, beltenyésztett BL/C5 egerek és a kültenyésztett CD1 egerek között nincs eltérés a vizsgált fehérjék szintjét illetően. Az anti-Grp78 antitesttel történő előhívás többszörös sávokat eredményezett. Ezt a jelenséget mások is megfigyelték ennél az antitestnél (68), az aspecifikus
52
CD1
PiZ
PiZ
Ktr
Ktr Grp94
Grp78
PDI
5.2.5. ábra. Endoplazmás retikulum chaperonok szintje A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésére anti-Grp94, anti-Grp78 és anti-PDI antitestet használtam „Ktr” a kontroll, „PiZ” a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a „CD1” az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló, független kísérlet egyikének képét mutatja.
jel beazonosítása további vizsgálatokat igényel. Mivel az AAT tekeredése során glikozilálódik, érdemesnek tűnt megvizsgálni a glikozilált fehérjék tekerésének kulcs-chaperonja, a calnexin szintjét is. A fenti módon elkészített membránt tehát előhívtam calnexin antitesttel is, ennek eredményét mutatja a 5.2.6. ábra. Az ábra azt bizonyítja, hogy calnexin esetén sem tapasztalható indukció PiZ transzgén egerekben a kontroll egerekhez képest, továbbá, hogy az általunk
CD1
PiZ
PiZ
Ktr
Ktr
használt és a CD1 egerek calnexin szintje között észlelhető eltérés nincs.
Calnexin
5.2.6. ábra. A calnexin mennyisége kontroll és PiZ egerekben A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésésre anti-calnexin antitestet használtam. „Ktr” a kontroll, „PiZ” a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a „CD1” az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló de független kísérlet egyikének a képét mutatja.
53
Ezek alapján tehát úgy tűnt, a mutáns AAT felhalmozódása az egerekben nem okoz stresszválaszt az endoplazmás retikulumban. Hogy a fehérje aggregáció mégis befolyásolja a máj működését, nyilvánvaló volt abból, hogy az egerek mája, hasonlóképpen az emberben megjelenő tünetekhez, elfajul, könnyebben válik daganatos elváltozások alanyává (53), illetve, hogy az egerek kevésbé bírják az éhezést, mint vad típusú társaik (156). Ezért tovább kerestük a stressz jeleit a májsejteken. A citoplazmatikus chaperonok vizsgálata volt a következő lépés, lévén, hogy számos, fehérjeaggregációs betegségben ezen chaperonok valamelyike indukáltnak bizonyult (5, 42). Első lépésként megvizsgáltuk a két legfontosabb citoplazmatikus chaperon, a Hsp90 és a Hsp70 szintjét az egerekből származó májhomogenátum mintákon. A
CD1
PiZ
PiZ
Ktr
Ktr
kísérletek eredményét a 5.2.7. ábrán mutatom be.
Hsp90 Hsp70 5.2.7. ábra. Citoplazmatikus chaperonok szintje A vizsgált egerekből származó, 10 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 6%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésésre anti-Hsp90 és anti-Hsp70 antitestet használtam. „Ktr” a kontroll, „PiZ” a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a „CD1” az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló de független kísérlet egyikének képét mutatja.
Vizsgálataim azt bizonyították, hogy az endoplazmás retikulum chaperonjaival szemben, a citoplazma két legfontosabb chaperonja indukálódott PiZ transzgén egerekben. A Hsp90 szintje megemelkedett, és a Hsp70 indukálható formája (Hsp72, alsó sáv az ábrán) is magasabb. A PiZ transzgén egerekben tehát, annak ellenére, hogy a mutáns fehérje az endoplazmás retikulumban halmozódik fel, a stresszfehérjék indukciója a citoplazmában fedezhető fel.
54
5.2.3
A PiZ egerek redox viszonyai Mivel diabéteszben és az AAT-től eltérő fehérjeaggregációs betegségekben is
számos adat mutat arra, hogy oxidatív elváltozások, és oxidatív stressz is közrejátszik a betegségek kialakulásában (114, 135), érdemesnek tűnt megvizsgálni, milyen redox állapotok uralkodnak az adott sejtkompartimentumokban. Ennek vizsgálatára olyan méréseket végeztem, amelyben az endoplazmás retikulum és a citoplazma redox paramétereit
külön-külön
vizsgáltam.
A
mérésekhez
szükséges
módszerek
elsajátításáért Dr. Jakus Juditnak és Dr. Stadler Krisztiánnak tartozom köszönettel. Elsőként a mikroszóma preparátumokat vizsgáltam meg: A redox paraméterek közül a leggyakrabban vizsgált és legegyszerűbben mérhető a szabad tiolcsoportok mennyisége. A redox egyensúly fontos indikátorának tartják továbbá a glutation mennyiségét, amely számos stresszes állapotban megemelkedik. A redukált és oxidált glutation aránya pedig alapvető mutatója az adott sejtkompartimentum redox állapotának. Ezeknek a méréseknek az eredményét a 5.2.1.-es táblázatban foglaltam össze:
fehérje tiol össz GSH
kontroll PiZ nmol/mg protein 122 ± 17,7 156 ± 34,6 16,3 ± 2,5 32 ± 1,5 (*)
GSH/GSSG
1,22 ± 0,07
3.85 ± 0,1 (*)
5.2.1. táblázat. Az ER redox paraméterei A szabad tiol tartalom méréséhez a 300 ug fehérjét tartalmazó mikroszóma mintákat 50 mM Tris.HCl-ben vettem fel, (pH 7,2), majd 10% TCA-val kicsaptam, háromszori acetonos mosás után visszaoldottam 50 mM Tris.HCl pufferben, amely 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazott (pH 6,8). A szabad tiolcsoportok mennyiségét Ellman módszere szerint mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Az összes glutation (GSH) meghatározásához a 100 μg fehérjét tartalmazó mintákat inkubáltam 30 percig 37°C-on 24 µl 50 mM Tris.HCl pufferben (pH 7,2), amely 2 µl NADPH oldatot és 1 U glutation reduktázt tartalmazott. Az inkubáció végén 5% TCA-val kicsaptam a fehérjéket, majd centrifugálás után a felülúszóból Ellman módszere szerint határoztam meg a redukált tiol mennyiségét. GSH/GSSG arányt a redukált és az összes GSH mennyiségéből kalkuláltam. Az adatok 3 független kísérlet eredményének átlagát és szórását mutatják, 3-3 egér felhasználásával. A csillag a szignifikánsan eltérő adatokat jelöli (p < 0,05).
55
Ahogy az a táblázatból kitűnik, annak ellenére, hogy stresszfehérje indukciót nem találtam az endoplazmás retikulumban, a redox paraméterek eltolódást mutatnak PiZ transzgén egerekben a kontroll egerekhez képest. Bár a szabad tiolcsoportok menyisége közötti eltérés nem mutatkozott szignifikánsnak, a megemelkedett glutation mennyiség, és a redukált irányba eltolódott, emelkedett GSH/GSSG arány is azt mutatja, hogy a redox státusza a transzgén egerek májából származó mikroszómáknak megváltozott. Ez hasonló képet mutat a streptozotocin indukálta diabéteszben találtakkal (114). Ez után megvizsgáltam a citoplazma hasonló redox mutatóit, hogy megtudjam, van-e oxidatív stressz, avagy redox eltolódás ebben a sejtkompartimentumban is. A 5.2.2. táblázat foglalja össze a mérések eredményeit:
Protein tiol össz GSH
kontroll PiZ nmol/mg protein 122 ± 12,5 118 ± 19,7 103 ± 17,7 114 ± 34,6
GSH/GSSG
72 ± 22
62 ± 14
5.2.2. táblázat A citoplazma redox paraméterei A szabad tiol tartalom méréséhez a 150 µg fehérjét tartalmazó citoplazma mintákat 50 mM Tris.HCl-ben vettem fel, (pH 7,2), majd 10% TCA-val kicsaptam, háromszori acetonos mosás után visszaoldottam 50 mM Tris.HCl pufferben, amely 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazott (pH 6,8). A szabad tiolcsoportok mennyiségét Ellman módszere szerint mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Az összes glutation (GSH) meghatározásához a 100 μg fehérjét tartalmazó mintákat inkubáltam 30 percig 37°C-on 24 µl 50 mM Tris.HCl pufferben (pH 7,2), amely 2 µl NADPH oldatot és 1 U glutathion reduktázt tartalmazott. Az inkubáció végén 5% TCA-val kicsaptam a fehérjéket, majd centrifugálás után a felülúszóból Ellman módszere szerint határoztam meg a redukált tiol mennyiségét. GSH/GSSG arányt a redukált és az összes GSH mennyiségéből kalkuláltam. Az adatok három független kísérlet eredményének átlagát és szórását mutatják, 3-3 egér felhasználásával.
Mint látható, a redox eltérések nem voltak kimutathatóak a citoplazmatikus környezetből. Ugyanakkor a glutation mennyiségének nem szignifikáns emelkedése és a GSH/GSSG arány nem szignifikáns mértékű, oxidáltabb irányba való elmozdulása arra utal, hogy a citoplazma redox állapota, ha gyengén is, de érintve van az AAT aggregációja által okozott stresszben. Ez a tendencia jellegű változás egybecseng a korábban talált stresszfehérje-indukcióval is.
56
Mivel a redox mérések nem adtak egyértelmű választ a citoplazma redox állapotát illetően, megvizsgáltam néhány, a redox egyensúly kialakításában, illetve helyrehozásában fontos citoplazmatikus enzim szintjét is. A tioredoxin szerepe összetett és kulcsfontosságú mind a redox egyensúly, mind a stresszválasz kialakítása és összehangolása tekintetében, indukciója a legkülönbözőbb stressztípusok esetén észlelhető (68), ezért ezen enzim vizsgálata tűnt a leginkább indokoltnak. A másik enzim, amelyet vizsgálatom tárgyául választottam, a MsrA, a metionin szulfoxid reduktáz A, amely a szulfonsavvá oxidálódott, denaturálódott metioninokat képes visszaalakítani, helyrehozva ezzel az oxidatív stressz okozta károkat (168). Mindkét fehérjét Western blot segítségével azonosítottam. A kísérletek eredményét a 5.2.8.
CD1
PiZ
PiZ
Ktr
Ktr
ábrán mutatom be:
Trx
MsrA
5.2.8. ábra. A citoplazmatikus redox enzimek szintje A vizsgált egerekből származó, 20 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat 12%-os redukáló SDS PAGE-ra vittem fel. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésére anti-tioredoxin és antiMsrA antitestet használtam. „Ktr” a kontroll, „PiZ” a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a „CD1” vad típusú egérből származó mintákat jelzi. „Trx”: tioredoxin, „MsrA”: methionin-szulfoxid reduktáz A fehérje. Az ábra öt hasonló, de független kísérlet egyikének képét mutatja.
Mindkét enzim esetén markáns emelkedést találtunk a PiZ transzgén egerek májából származó citoplazmában a kontroll egerekéhez képest. Ez az indukáltság arra utal, hogy a citoplazma olyan stressznek van kitéve a PiZ egerek májában, amely a redox rendszereket is érinti. Itt szeretném megemlíteni, hogy a citoplazmatikus redox enzimek, illetve redox egyensúlyok mérésében laborunk diákkörös hallgatója, Korcsmáros Tamás is részt vett. Az ő mérései alapján a citoplazmatikus tioredoxin reduktáz aktivitás csökkent mértékű a transzgén állatokban a kontroll állatokhoz képest, hasonlóképpen a diabétesz esetén talált eltérésekhez (nem bemutatott adatok).
57
5.2.4
Chaperon komplexek PiZ egerekben A következőkben arra voltam kíváncsi, hogy a mutáns AAT a chaperonok
szelekív elvonásával, kicsapdázásával idézi-e elő azokat a káros következményeket, amelyek mechanizmusára a választ kerestük. Ennek felderítésére immunprecipitációs módszert állítottunk be Száraz Péter szakdolgozómmal közösen, amelynek segítségével az AAT illetve a chaperonok kölcsönhatásait vizsgáltuk meg. A módszer lényege, hogy különböző antitestek segítségével a mikroszómából “kihalásszuk” a keresett fehérjét és megvizsgáljuk, milyen további fehérjéket hoz magával, tehát melyekkel áll olyan szoros kölcsönhatásban, hogy a precipitáció lépései során sem bomlik fel a kapcsolatuk. Az
első
lépés
a
módszer
beállításában
az
volt,
hogy
lássuk,
az
immunprecipitáció hatékonyan működik-e és szelektív módon emeli ki az AAT-t és a vele kölcsönható fehérjéket. Ennek érdekében az immunprecipitáció eredményét
Ktr sup
Ktr prec
PiZ sup
PiZ prec
AAT-re hívtuk elő. Ezek eredménye látható a 5.2.9 ábrán.
AAT
5.2.9. ábra. Alfa1- antitripszin (AAT) immunprecipitáció hatékonyságának ellenőrzése Az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módon egér IgG-től megtisztított mikroszóma mintákból 50 µg fehérjetartalmú adagot a Sepharose-A gyöngy és anti-AAT antitest elegy mosott precipitátumával mértünk össze, és tovább inkubáltuk 2 órán keresztül. A felülúszót eltávolítottuk, a precipitátumot mostuk, majd a kapott mintákat denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A membránt HRP-vel jelölt anti-humán AAT elsődleges antitesttel hívtuk elő. „PiZ prec”: AAT immunprecipitátum transzgén egerekből, „PiZ sup” az immunprecipitátum felülúszója transzgén egerekből. „Ktr prec”: AAT immunprecipitátum kontroll egerekből, „Ktr sup” az immunprecipitátum felülúszója kontroll egerekből. Az ábra öt hasonló de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 58
Az ábrán megjelenő 55 kDa-os fehérje csík a mutáns AAT-t jelenti, amely markánsan jelentkezik a transzgén állatokból származó mintákban. Kontroll kísérleteink azt is bizonyították, hogy a Sepharose-A önmagában, antitest nélkül nem kötötte az AAT-t, így az általunk kiemelt fehérje specifikus antigén-antitest kölcsönhatás eredménye (nem bemutatott eredmények). További kísérleteinkben a precipitáció eredményeként kapott mintákat minden alkalommal megvizsgáltuk AATre hogy meggyőződjünk, a precipitáció sikeres és specifikus volt-e. Az első kísérletek során arra kerestük a választ, mely chaperonokkal együttesen fordul elő a mutáns AAT. A precipitálás és elektroforézis után ezért különböző antitestekkel végeztünk Western blot vizsgálatot. Kezdetként ismét az ER retenciós szignál ellenes anti-KDEL antitestet választottuk, hogy egyszerre több ER chaperont
PiZ prec
Piz sup
Ktr prec
Ktr sup
tudjuk vizsgálni. Ennek a kísérletnek az eredménye látható a 5.2.10. ábrán.
Grp94 Grp78 PDI 5.2.10. ábra. Anti humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-KDEL antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a 5.2.9. ábra aláírásában leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-KDEL antitesttel jelöltük. „sup” a szupernatánst, „prec” az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be.
59
Az ábráról kitűnik, hogy a KDEL antitesttel csak egyetlen fehérje, a PDI volt kimutatható a precipitátumból. Sem a Grp94, sem a Grp78 nem mutatott kötődést az AAT fehérjékhez. A PDI viszont mindkét mintában, a kontroll és a transzgén egerekből származó mikroszómák precipitátumából is kimutatható volt. A transzgén egerekből nagyobb mennyiségben lehetett PDI-t találni az AAT-vel közös komplexben. Ez arra utal, hogy a PDI az egészséges egér AAT fehérjéjének betekerésében is részt vesz. Ez érdekes megfigyelés, hiszen a PDI elsődleges funkciója az oxidoreduktáz aktivitás, viszont az AAT fehérjében nincsenek diszulfidhidak. Tudjuk azonban, hogy a PDI chaperon funkciója is igen jelentős az endoplazmás retikulumban, a monomerek oldható formában tartása és a tekeredési hibás fehérjék retrográd transzportra majd proteaszómális lebontásra kerülése is a feladatai közé tartozik (55). A kísérletet megismételtük anti-PDI antitesttel is, ennek az eredményét mutatom
Ktr sup
Ktr prec
PiZ prec
PiZ sup
be a 5.2.11. ábrán.
PDI
5.2.11 ábra. Anti-humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-PDI antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a 5.2.9 ábra aláírásában leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-PDI antitesttel jelöltük. „sup” a szupernatánst, „prec” az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be.
Amint az az ábrán látható, a specifikus, PDI antitesttel történő előhívás is hasonló eredményt produkált. A precipitátumokban itt is (2. és 3. sáv) megjelenik a
60
PDI. Itt az előző kísérletnél még sokkal markánsabban megmutatkozik, hogy a PDI jóval nagyobb mértékben van jelen a PiZ transzgén egérből származó minták precipitátumában. Ez tehát azt jelentheti, hogy a PDI, mivel indukciója nem volt kimutatható PiZ transzgén egerekben, kisebb arányban köt a normál fehérjékhez PiZ transzgén egerekben, mint kontroll társaikban. A 5.2.11. ábrán látható, hogy a PDI futásában eltérés mutatkozott a szupernatáns és a precipitátum esetén. Ez több kísérletben is megmutatkozott. Az eltérés magyarázata talán a nagyban eltérő fehérjekoncentráció lehet, hiszen a szupernatáns majdnem a teljes mikroszóma tartalmát jelenti, míg a precipitátum csak néhány fehérjét tartalmaz. Hasonló kísérleteket végeztünk specifikus Grp78 és Grp94 antitestek felhasználásával is, amelyek, a KDEL antitesttel előhívott képekhez hasonlóan, nem mutattak kötődést a minták precipitátumában (nem bemutatott eredmények). Megvizsgáltuk a PDI családba tartozó ERp72-t és a glikozilált fehérjék tekeredésében
részt
vevő
calnexin-t
is,
hogy
kimutathatóak-e
a
PiZ
fehérjeaggregátumokkal kölcsönhatásban. E kísérletek eredménye látható a 5.2.12.
Ktr Prec
Ktr Sup
PiZ Prec
PiZ Sup
ábrán.
calnexin ERp72 5.2.12. ábra. Anti humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-ERp72 illetve anti-calnexin antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a fent leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket antiErp72 illetve anti-calnexin antitesttel jelöltük. „sup” a szupernatánst, „prec” az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének az eredményét mutatja be.
61
Sem az ERp72, sem a calnexin nem volt kimutatható a precipitátumokból, akár a PiZ transzgén, akár a kontroll mintákat tekintve. Mivel az AAT fehérjével kötésben csak a PDI-t tudtuk kimutatni (megjegyzendő azonban, ez nem jelenti azt, hogy a többi chaperon nem köt hozzá, csupán a kötés esetleg nem elég erős affinitású ahhoz, hogy ezen a módon kimutatható legyen), továbbléptünk, és azt vizsgáltuk, hogyan érinti ez a kötődés a PDI más fehérjékkel való kapcsolatát. Mivel a PDI szubsztrátspecificitása nagyon széles, ugyanakkor affinitása az egyes fehérjékhez alacsony, annak vizsgálata, hogy milyen mértékben kötődik egyegy fehérjéhez egyelőre megoldatlan probléma. Ezért azt vizsgáltuk meg, hogy a más chaperonokkal való kölcsönhatása hogyan alakul. Tudvalevő, hogy a chaperonok komplexeket alkotnak, amelyek összetétele eltérő annak funkciójától függően. A Sepharose-A gyöngyöket ezért ezúttal anti-PDI antitesttel dekoráltuk, és az immunprecipitációt így végeztük el. A 5.2.13. ábrán azt mutatom be, hogy milyen
PiZ prec
PiZ sup
Ktr prec
Ktr sup
fehérjék kötődtek a PDI-hez:
AAT
Grp94
5.2.13. ábra. Anti-PDI antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-AAT és anti-Grp94 antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a 5.2.9. ábra aláírásában leírt módon kezeltük, egér PDI elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-Grp94 illetve anti-AAT antitesttel jelöltük. „sup” a szupernatánst, „prec” az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra 3 hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be.
62
Először ellenőrzésként azt néztük meg, ha PDI antitestet használunk a precipitációra,
kimutatható-e
az
alfa1-antitripszin
vele
kölcsönhatásban.
A
precipitátumokban, a várakozásnak megfelelően, nagy mennyiségben találtunk a PDIhez kötött AAT fehérjét. Ez tehát azt jelentette, hogy a PDI valóban köt az AAT-hez, továbbá azt is, hogy legalább részben úgy helyezkedik el az AAT-vel alkotott komplexben, hogy a PDI antitest számára hozzáférhető marad. E megfigyelés azért fontos, mert az AAT jelentős része aggregált formában lehet jelen, ahol a PDI felszíni megjelenése nem nyilvánvaló. A második előhívás Grp94 antitesttel történt, amely mind a felülúszóban, mind a precipitátumban kimutatható volt. Ez tehát azt mutatja, hogy a Grp94 egy része a PDI-hez kötött állapotban van. Azonban nem mutatkozott különbség a kontroll és a transzgén egerek Grp94 eloszlása között, ami azt sugallja, hogy a PDI-vel kiemelhető Grp94, tehát a PDI-Grp94 komplex csak az egér saját alfa1-antitripszinjével van kölcsönhatásban. Ezért újabb szemszögből vettük vizsgálat alá a mintáinkat: Grp94 fehérjére immunoprecipitáltunk, hogy a Grp94 kölcsönhatásait és partnereit vizsgáljuk meg. A
Ktr prec
Ktr sup
PiZ prec
PiZ sup
chaperonok detektálására elsőként ismét az anti-KDEL antitestet használtunk.
Grp94 Grp78
PDI
5.2.14. ábra. Anti -Grp94 antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye antiKDEL antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a 5.2.9. ábra aláírásában leírt módon kezeltük, egér Grp94 elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-AAT antitesttel jelöltük. „sup” a felülúszót, „prec” a precipitált mintákat jelöli. Az ábra 3 hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 63
Az ábrából kitűnik, hogy a Grp94-ellenes antitesttel a kontroll egerekből származó mintákból a PiZ egereknél jóval nagyobb mennyiségű PDI volt kihalászható. Ez az eredmény arra utal, hogy transzgén egerekben kevesebb olyan komplex van, amely a PDI-Grp94 kapcsolaton alapszik. Második lépésben a Grp94-re történő immunprecipitációból származó mintákat
Ktr prec
Ktr sup
PiZ prec
PiZ sup
anti-humán alfa1-antitripszin antitesttel hívtuk elő.
AAT
5.2.15. ábra. Anti-Grp94 antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye antiAAT antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a 5.2.9. ábra aláírásában leírt módon kezeltük, egér Grp94 elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket kecske HRP konjugáns anti-humán AAT antitesttel jelöltük. „sup” a szupernatánst, „prec” az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be.
Transzgén és kontroll állatokban, mind a Grp94-precipitátumban mind a szupernatánsban egyaránt kaptunk AAT jelenlétére utaló jelet. Ez az észlelet a korábbi eredményekkel egybevág. A Grp94-precipitátum mintákban a szupernatánsokhoz képest rendre kisebb mennyiségű antitripszin mutatható ki, azonban a megfelelő kontroll és transzgén minták között nem látható a koprecipitálódott alfa1-antitripszinben mennyiségi különbség. Jelenlegi tudásunk szerint a Grp94 csak a fehérjék tekeredésében vesz részt, és sem a minőségellenőrző, sem pedig az ERAD-ot végző chaperon komplexben nincs benne, eszerint a Grp94 valószínűleg csak az egér AAThez, azaz a monomer formához köt, annak betekeredésében vesz részt. Ez tehát elképzelhetővé teszi, hogy a transzgén egerekben, a Grp94-PDI komplexek csökkent működése miatt a fehérjék betekeredése alacsonyabb hatásfokkal működik, mint egészséges társaikban.
64
5.2.5
A PDI funkciója PiZ egerekben Ez indokolttá tette, hogy funkcionális vizsgálatokat végezzünk annak
megállapítására, hogy a fehérjetekerő rendszer hatásfoka milyen mértékben csökkent, illetve csökkent-e egyáltalán a PiZ fehérjét hordozó transzgén egerekben. A chaperon funkció vizsgálatára számos módszer használatos, ám ezek egyikét sem sikerült eddig sejtes illetve szubcelluláris rendszeren alkalmazni. A kliensfehérjék vizsgálata sem vezet célra, mert nagy számuk miatt az egyes fehérjéknél tapasztalható eltérések nem lennének elég markánsak ahhoz, hogy detektálni tudjuk őket. Kihasználtuk azonban a PDI-nek azt a sajátosságát, hogy a fehérjék betekeredése során elsősorban a diszulfidhidak kialakításában vesz részt. Ezt a tulajdonságát vizsgáltuk egy fluoreszcens szubsztrát segítségével. Ez a szubsztát nem kapható kereskedelmi forgalomban, így magunk állítottuk elő a két FITC-el jelölt inzulint, Heuck és Wolosiuk (66) útmutatásai szerint. Ennek a szubsztrátnak az a sajátossága, hogy ha az inzulin két szála a diszulfid hidak redukciója következtében elválik egymástól, a szálak (elsősorban a béta-szál) aggregálnak. Az aggregáció következtében a FiTC hidrofób közegbe kerül, és fluoreszcenciája megnövekszik. Hasonló reakció játszódik le akkor is, ha a diszulfidhidak átrendeződése következik be, tehát a PDI izomerizáló aktivitását is méri ez a módszer. Ezért az eljárás a PDOR, vagyis protein diszulfid oxidoreduktáz aktivitás mérésére alkalmas. Ez a módszer eredetileg a citoplazma PDOR aktivitásának mérésére szolgált, amelyet elsősorban a tioredoxin szolgáltat. Az endoplazmás retikulumban a PDI család tagjai, és azon belül is elsősorban maga a PDI végzi ezt a funkciót. A 5.2.16. ábra számos kísérlet eredményét összegzi. Ezek során kontroll és PiZ transzgén egerekből származó mintákat hasonlítottunk össze a PDOR aktivitás kinetikájának vizsgálatára.
65
PDOR aktivitás (mesterséges egység)
95
70
*
45
**
**
**
**
20
-5 0
100
200
300
400
500
600
Idő (mp) 5.2.16. ábra. Mikroszóma protein diszulfid oxidoreduktáz (PDOR) aktivitása 75 μg fehérjének megfelelő mikroszómát elegyítettünk 1 μM diFiTC-inzulin oldathoz (5 mM-os Tris.HCl puffer, pH 7,2, 5:1 arányú GSH/GSSG redox puffer, összes GSH koncentráció: 2 mM). A fluoreszcencia növekedés mérése az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módszer szerint történt. Az üres jelek a kontroll, a fekete jelek a PiZ transzgén egerekből származó mintákat jelölik. Szaggatott vonallal a módszer kontrolljaként mért adatok szerepelnek: a pozitív kontroll a tioredoxin jelenlétében mért fluoreszcencia, a pontozott vonal pedig a puffer jelenlétében mért fluoreszcencia növekedés. Az adatokat a tioredoxin által elért fluoreszcencia-növekedés százalékában fejeztem ki. Az adatok 12 független kísérlet eredményét jelenítik meg. A csillag szignifikáns különbséget jelöl p < 0,05-nél. A két csillag szignifikáns különbséget jelöl p < 0,01-nél.
A 5.2.16. ábráról leolvasható, hogy a transzgénikus egerekből származó mikroszómák PDOR aktivitása jelentősen csökkent mértékű a kontroll állatokban mértekhez képest. 600 másodpercnél a PiZ mikroszóma minták a tioredoxin által elérhető redukciónak csupán a 45%-át, a kontroll állatokból származó mikroszómák PDOR aktivitásának pedig a 63%-át produkálták. Ez a különbség a PDI oxidoreduktáz aktivitásának csökkenésére utal PiZ transzgén egereknél.
66
6 Eredmények megbeszélése 6.1
A FAD szerepe az endoplazmás retikulum redox fehérje tekerésében A diszulfid-hidak kialakulása a szekréciós- és membránfehérjék kialakulásának
kulcsmozzanata, amelyben a kis molekulák szerepe még nem elég jól ismert. Kísérleteim során rámutattam, hogy a FAD hatékony oxidálószere az Ero1-L-PDI rendszernek, és más mikroszómális proteinek oxidációjában is részt vesz. A mikroszómális össz-tiol tartalom 30%-a volt oxidálható az általam alkalmazott különböző oxidálószerekkel, mint a FAD, oxidált glutation (GSSG), vagy a dehidroaszkorbát. A FAD tűnt a leghatékonyabbnak ezek között az oxidálószerek között, lévén, hogy már 100 μM FAD maximális oxidációt váltott ki, míg a többi oxidálószer csak a millimólos koncentrációtartományban érte el a maximális hatékonyságát. A FAD fiziológiás koncentrációja emlős sejtekben nem ismert, élesztőben 0,1 és 1 μM közötti koncentráció-tartományban mozog, ám az Ero1 maximális aktivitását 50 μM FAD mellett érte el (162). Ekkora eltérés az emlős és az élesztő rendszer között nem szokatlan, magyarázatul szolgálhat a rendszerünk és az élesztő rendszer között talált eltérésekre. Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közösen kimutattuk, hogy a FAD, belépve az endoplazmás retikulum lumenébe, elősegíti az ottani fehérjék oxidációját (164). A saját kísérleteimben igazoltam azt is, hogy a belépés előfeltétele az oxidáló hatásnak, mivel a transzport inhibitora, a DIDS, képes volt gátolni a fehérjék oxidációját. A DIDS okozta oxidáció gátlás kiterjedt az általam vizsgált oxidoreduktázokra, az Ero1-L-re és a PDI-re is. Élesztőben Tu és munkatársai (162) azt találták, hogy az Ero1 redox státusza befolyásolható a sejt szabad FAD tartalmával. Ez a munkacsoport regulációs szerepet tulajdonított a FAD-nak élesztő sejtekben, amely kapcsolatot teremthet a sejt metabolikus állapota és a fehérjeszintézis mértéke között. Egy másik munkacsoport azt találta, hogy az interleukin-2 betekeredése zavart szenved flavin-hiányos sejtekben (24), ami szintén arra mutat, hogy a FAD fontos szerepet tölt be a redox tekeredés folyamatában emlős sejtekben. Minthogy az Ero1-L membrán-asszociált, az ER lumenébe nyúló fehérje emlősben, valószínű volt, hogy a FAD-nak át kell lépnie a membránon, hogy az Ero1-L által
67
végzett fehérje oxidációt előmozdítsa. Kimutatták továbbá, hogy riboflavin hiányos médiumban tenyésztett sejtekben a fehérjetekeredés gátolt (172). Ezzel a képpel egyezően, a FAD transzport felfüggesztése DIDS-sel megakadályozta azt is, hogy az Ero1-L oxidálódjon. Hogy a FAD indukálta oxidáció specifikus a redox tekerő rendszerre, azáltal bizonyított, hogy a FAD sem a PDI családba tartozó ERp72-re, sem pedig a calnexinre, vagy a Grp94-re nem gyakorolt oxidáló hatást, holott e fehérjék számos tiolcsoportot tartalmaznak. E kísérletsorozatomnak talán a legfontosabb eredménye az a megfigyelés, hogy a FAD okozta oxidáció előfeltétele az endoplazmás retikulum, azaz ez esetben a mikroszómális membrán integritása. Nagy mennyiségű GSSG és dehidroaszkorbát a lumenális fehérjéket közvetlenül képes oxidálni. Ezzel ellentétben, a FAD hatása felfüggeszthető a legkülönbözőbb membrán-integritást megzavaró ágensekkel, mint például a pórus-képző alameticin, a detergens DOCA, és a mechanikus roncsolás (ultrahangos kezelés) is. E megfigyelések hátterében húzódó molekuláris mechanizmusokra még nincs magyarázat, de néhány lehetőség felvethető. Ismert, hogy az elektron transzferben résztvevő, többkomponensű rendszerek gyakran membrán-közeli elhelyezkedésűek, hogy biztosítsák a szegregációt és az elektronáramlást komponenseik között. A permeabilizáló szerek, amelyeket használtunk, megzavarhatják a lipid-fehérje kölcsönhatásokat, az elekton-transzfer defektjét vonva maguk után. Az alameticin, amelyet kísérleteinkben használtunk viszont nem zavarja meg a membrán-fehérjék szerkezetét (65). Az alameticines kezelés kis molekulák szelektív kiszabadulását idézi elő (32), amely a jelenség alternatív magyarázatát teszi lehetővé: e szerint pl. a glutation redox puffer elemeinek megszökése a lumen redox állapotának megváltozását okozhatja. Itt érdemes azonban megjegyezni, hogy a glutation nem volt esszenciális eleme az oxidatív tekeredésnek élesztő rendszerben (161). Más redox hatású kis molekulák szökése azonban felelős lehet az általunk tapasztalt hatástalanságért. Mivel úgy tűnik, az ER membrán szerkezetének zavara az Ero1-L és a FAD közötti elektrontranszfert gátolja, e feltételezett kis molekulatömegű redox komponensek az Ero1-L és FAD
68
közötti elektronáramlást segíthetik elő, vagy még valószínűbb módon az Ero1-L regulátoraként funkcionálhatnak. Felmerült ezzel kapcsolatban az ionok szerepe is, azonban kálcium, kálium és proton ionofórokkal folytatott kísérleteim azt bizonyították, e gradienseknek nincs szerepük a FAD hatásának kifejtésében. Ez egybevág azokkal a megfigyelésekkel, amelyek szerint kálcium nem szükséges a PDI izomeráz aktivitásának kifejtéséhez (130), valamint, hogy gyakorlatilag nincs pH különbség és citoplazma és az endoplazmás retikulum között (139). A PDI gátlószere, a bacitracin is felfüggesztette a FAD hatását, méghozzá közel 100 %-osan. Ez az eredmény arra utal, hogy a FAD kizárólagosan az Ero1-L/PDI útvonalon keresztül fejti ki hatását. A PDI család több tagjának is van diszulfidizomeráz aktivitása. Sajnos nem tudjuk, hogy a bacitracin a PDI fehérjecsalád mely tagjait gátolja még. Nem tudjuk kizárni, hogy akár a PDIR, PP5, ERp57 vagy az ERp72 is gátlódott ezekben a kísérletekben. Másrészt viszont, kísérleteim specificitása mellett szól, hogy ezek közül a fehérjék közül eddig csak a PDI-t találták meg az Ero1-L-hez kapcsoltan (103), ami támogatja azt az elméletet, miszerint a FAD hatása kizárólag az Ero1-L/PDI útvonalon keresztül érvényesül. HepG2 sejtekben a PDI gátlása nem indukálta az oxidált formájú Ero1-L felhalmozódását, ahogyan azt vártuk volna. Amennyiben elektron-akceptort, ez esetben FAD-ot adtunk a rendszerhez, a kép azonnal megváltozott, és oxidált Ero1-Let találtunk a rendszerben. Ennek magyarázata az lehet, hogy HepG2 sejtek ER-je szűkölködik elektron akceptorokban, emiatt az Ero1-L nem képes továbbadni elektronjait, így redukált marad. Ez egybevág azokkal a megfigyelésekkel, amelyek szerint az Ero1 nem volt képes a fehérjék oxidációját előmozdítani, ha a közeg nem tartalmazott FAD-ot (162). Összefoglalva tehát elmondhatjuk, hogy kísérleteim eredményeként sikerült egy igen specifikus oxidálószer, a FAD hatását karakterizálni emlős mikroszómális rendszeren. A FAD-ról elmondható, hogy a többi, ismert oxidálószernél akár 1 nagyságrenddel kisebb koncentrációban is maximálisan hatékony oxidálószere az ER fehérjéinek. Ez a hatás ugyanakkor specifikus, ha az Ero1-L/PDI rendszert gátoljuk a
69
PDI gátlószer, bacitracin segítségével. A membrán-integritás megzavarásával a FAD hatása elmarad, szemben pl. a GSSG-vel vagy a dehidroaszkorbáttal. Mivel a mai napig úgy tudjuk, hogy az Ero1-L/PDI rendszer a kizárólagos forrása az endoplazmás retikulum fehérje tiol oxidáz aktivitásának, fontos kérdésnek tűnik, hogy az ER membrán integritása milyen módon mozdítja elő az Ero1-L-PDI kapcsolatot. Ez a terület további kutatások tárgyát kell, hogy képezze.
70
6.2
Az
alfa1-antitripszin
aggregáció
okozta
változások
az
endoplazmás
retikulumban A Z-típusú alfa1-antitripszin deficiencia egy ismert “tekeredési betegség”, amely során a mutáns PiZ fehérje akkumulálódik a májsejtek endoplazmás retikulumának lumenében. A felhalmozódás következményei igen súlyosak lehetnek, amelyek között a hepatitis, májcirrózis és a gyakoribb daganatképződés szerepelnek. Hogy a mutáns fehérje felhalmozódása miért és hogyan vezet el e tünetek kialakulásáig, mind a mai napig nem ismert. Mivel a PiZ fehérje az endoplazmás retikulum lumenében aggregál, felvetődik a kérdés, hogyan érinti ez az endoplazmás retikulum funkcióit? Az endoplazmás retikulum, különösen szekréciós sejtek esetén, mint amilyen a májsejt is, központi szereplője a fehérjetekeredésnek. A szekrécióra kerülő fehérjék, illetve számos membránfehérje is itt nyeri el végső konformációját. Mivel az extracelluláris környezet igen oxidáló, e fehérjék számos stabilizáló diszulfid híddal rendelkeznek, amelyek korrekt kialakulása kulcsmomentum a fehérjék natív struktúrájának elnyerésében. Kísérleteim során arra kerestem a választ, hogy hogyan érinti az endoplazmás retikulum fehérjetekerő rendszereit a mutáns PiZ fehérje felhalmozódása. A nem-natív konformációjú fehérjék megjelenése az ER-ben egy speciális válaszreakciót, a tekeretlen fehérje választ (unfolded protein respose, UPR) vált ki. Ennek legmarkánsabb következménye az ER stresszfehérjéinek indukciója. Ezért elsőként azt vizsgáltam meg, mennyire indukálódtak az ER stresszfehérjéi a PiZ hordozó transzgénikus egereken. E kérdésre azt a választ kaptuk, hogy az általunk vizsgált stresszfehérjék egyike sem mutatott indukciót PiZ transzgén egerekben. Ez azonban egybevág a korábbi, szintén egereken folytatott kísérletek eredményével (58), valamint a humán betegek vizsgálatából (37) származó adatokkal is. Hasonló adatokat kaptak PiZ-vel transzfektált sejtvonalakon is (89, 67). Az AAT fehérje kölcsönhatásait vizsgálva azt találtuk, hogy transzgén egerekben csak a PDI köt hozzá szignifikáns mennyiségben. Sem a calnexin, sem a Grp78 sem pedig a Grp94 nem volt az immunprecipitációs eljárással kimutatható az AAT-hez kapcsolódva. Ez némileg ellentmondásban áll a PiZ expresszáló sejtvonalon nemrég elvégzett kísérletek eredményeivel (138, 67). Az ellentmondás azonban
71
feloldható azzal, ha figyelembe vesszük, hogy a transzfektált sejteken a transzfekciót követő rövid időszakon belül végezték a vizsgálatokat, míg esetünkben az egerek több hónapja adaptálódtak a fehérje felhalmozódáshoz. Sejtkultúrában végzett vizsgálatok szerint először a calnexin köti a fehérjét, amely 3-4 óra után teljesen leválik róla (89). Ezután a Grp78/BiP lép színre, de e chaperon kötődése is csökken az idő előrehaladtával (138, 37). Az általunk vizsgált, krónikusan PiZ hordozó egerekben e stresszfehérjék már egyáltalán nem kapcsolódtak a fehérjéhez, így nagyon valószínű, hogy a stressz kezdeti fázisa után a betekerés helyett a lebontás vagy az aggregátumképzés felé terelődnek a mutáns PiZ fehérjék. Fontosnak tartom itt megjegyezni, hogy a dolgozatomban bemutatott kísérletek nem tesznek különbséget az esetlegesen létező mono- és oligomer formák, illetve a nagyméretű aggregátumok között. Sejtes rendszereken végzett tanulmányok alapján azonban az aggregáció olyan nagy mértékű, hogy gyakorlatilag a bemutatott eredményeim a PiZ aggregátumokra vonatkoztathatóak (37). Immunprecipitációs
kísérleteim
során
kimutattam,
hogy
a
PDI
igen
nagymértékben kapcsolódik a mutáns PiZ fehérjéhez. Ennek magyarázata az lehet, hogy a PDI az endoplazmás retikulumhoz kötött fehérje degradációban, az ERAD-ban is kulcsszerepet játszik, mivel ez a fehérje tartja a lebontásra és retrográd transzportra szánt fehérjéket kitekert állapotukban, amíg a lebontási folyamat le nem játszódik (160, 55). Ezzel párhuzamosan, a Grp94 antitest által elérhető Grp94/PDI komplex mennyisége nagyban csökkent a PiZ transzgén állatokban. A Grp94/PDI chaperon páros a fehérjetekerő rendszer központi struktúrája. Tudjuk, hogy a Grp94 a már jócskán betekert, majdnem natív konformációjú fehérjéket köti az AAT szintézise során is (138). Magyarázatra szorul az a jelenség, hogy amikor a PDI volt az elsődleges célpontja az immunprecipitációnak, az AAT és a Grp94 egyenlő mértékben precipitálódott ki PiZ transzgén és kontroll állatokból, amikor pedig Grp94 volt a precipitáló antitest, rendre jelentős eltérés mutatkozott a transzgén és a kontroll állatokból kiemelt PDI mennyiségében. Ezt a meglepő eredményt azzal magyarázzuk, hogy a PDI antitest számára csak azok a fehérjék hozzáférhetőek, amelyek szabadon állnak, illetve az aggregátumokban felszínesen helyezkednek el. E szolubilis PDI-k a fehérjetekerésben vesznek részt, és a Grp94-gyel állnak kölcsönhatásban. A PDI
72
tartalom eme hányadával az egér saját szintetizálódó AAT fehérjéje is kölcsönhatásban áll, így a mutáns AAT a kicsapdázódott PDI-vel a felülúszókban marad. A PDI ilyen kicsapdázódása és fehérje aggregátumok belsejébe kerülése más rendszereken is bizonyított (143). Ezt kiegészíti azt az eredmény, hogy a PiZ transzgén egerek mikroszómája sokkal kevésbé hatékonyan tudta a di-FiTC inzulint redukálni, mint kontroll társaiké. Ez a funkció az endoplazmás retikulumban elsősorban a PDI-hez köthető, amely, bár egy nagy család tagja, az egyetlen, amelyiknek oxidoreduktáz aktivitása ismert. Ezért igen valószínű, hogy az előbbiekben körvonalazott kicsapdázódási jelenség következtében a PDI nem képes ellátni az oxidoreduktáz funkcióját teljes hatásfokkal PiZ transzgén egerekben. Mivel a redox státusz az endoplazmás retikulumban igen fontos tényező a fehérjék betekeredése szempontjából, külön jelentősége van annak, hogy mind a fehérje tiolok, mind a glutation szintjén egy reduktív irányba való eltolódást detektáltam a transzgén állatok májából származó mikroszómákon. Ez az eltolódás más krónikus betegségekben, pl. diabéteszben is kimutatható volt (114). Valószínűnek tartom, hogy ez a jelenség nem káros következmény, hanem inkább adaptációs mechanizmus, amelyet támogat az a tény, hogy a CHOP-kiütött sejtvonalon, amely az endoplazmás retikulumból induló apoptotikus jelpálya aktiválódását kivédi, redukálóbb környezetet, és fokozott rezisztenciát tapasztaltak az apoptózissal szemben. (99). Egyre több bizonyíték szól amellett is, hogy a PDI redukált állapotában inkább chaperonként funkcionál, mint oxidoreduktázként (145). Mindezek az eredmények felvázolhatják a képét egy olyan mechanizmusnak, amelyben a hosszú távú stressz eredményeképpen az endoplazmás retikulumban egy új egyensúly áll be, amely egy kisebb szintetikus hatásfokkal működő, de erősebb stabilizáló-védő kapacitással rendelkező állapotot jelent, amelyben a megváltozott chaperon aktivitás és a redukálóbb környezet a PDI funkciójának regulálását és az apoptózis elkerülését célozza. Redox méréseim alapján úgy tűnhet, hogy az endoplazmás retikulum nincs érintve a stressz által PiZ transzgénikus egerekben. Ennek ellenére a citoplazmatikus chaperonok, illetve antioxidáns enzimek megemelkedett szintjét detektáltam a PiZ felhalmozódás következményeként. A Hsp90 és a Hsp70 is rendre indukálódott,
73
ahogyan ez tapasztalható volt humán betegekből származó máj-biopszia mintákon is (191). Feltételezésem szerint ez összefüggésben állhat azzal, hogy a proteaszómális rendszer túlterhelt lehet a PiZ szintézis miatt, hiszen a PiZ fehérje lebontásában a proteaszóma is részt vesz, ám igen rossz hatásfokkal, emiatt alakul ki az aggregáció (175). Ezen túlmenően, a minőségellenőrző és a glikoprotein betekerő rendszerben a különböző szubsztrátok kompetícióban állnak egymással, ahogyan azt AAT és egy másik glikoprotein, a transzferrin betekeredése kinetikájának vizsgálatával bizonyították (175). Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy a PiZ transzgénikus egerekben a betekeredés hatásfoka rosszabb és ez további terhet ró a lebontó rendszerekre, a chaperonok pedig az ERAD komplexeivé állnak össze a fehérjetekerő rendszerek helyett. A proteaszóma működésének csökkenése a Hsp90 indukcióját idézi elő, (36) ez hozzájárulhat az esetünkben tapasztalt Hsp90 indukcióhoz is. Amennyiben a proteaszómális aktivitás sérül, kontrollálatlanul oxidálódott fehérjetermékek halmozódnak fel a citoplazmában (126, 40). Emellett a sérült mitokondriumok jelenéte, amely igen valószínű a PiZ fehérje felhalmozódása során (156), tovább fokozhatja az oxidáció mértékét a citoplazmában. Minthogy az oxidatív stressznek, mind az általános, mind pedig mitokondrium-indukálta formája a Hsp70 indukciójához vezet (12), nem meglepő, hogy a PiZ transzgén egerekben is emelkedett Hsp70 szintet találtunk. Oxidatív károsodások esetén az MsrA szintje rendszerint megemelkedik (148), továbbá a tioredoxin és a redukált glutation-szint is komoly szerepet játszik az oxidatív stressz következményeinek kivédésében (82). Ezen adatok fényében úgy tűnik, a megemelkedett Hsp70, tioredoxin és MsrA szintek, valamint a magasabb glutation szint PiZ egerekben egy fokozott antioxidáns kapacitást eredményez. Valószínűleg ennek köszönhető, hogy a citoplazma redox állapota gyakorlatilag változatlan maradt, annak ellenére, hogy az oxidatív stressznek számos jele tapasztalható. PiZ transzgénikus egerekben tehát a mutáns alfa1-antitripszin felhalmozódása következtében, csakúgy, mint diabéteszben, az endoplazmás retikulum redukálóbbá válik és chaperonjai a lebontást, illetve az aggregáció elleni védelmet végzik elsődlegesen. Ez valószínűleg szükséges ahhoz, hogy a legfontosabb funkciói ne sérüljenek, egy alacsonyabb hatásfokú, ám stabilan működő endoplazmás retikulum rendszer jöjjön létre. A redukálóbb közeg valószínűleg csökkenti a kontrollálatlanul
74
oxidálódó fehérjék mennyiségét, ugyanakkor szerepet játszat abban is, hogy a kettős funkcióval bíró PDI az oxidáz és izomeráz funkciók helyett, mint reduktáz és chaperon vehessen részt a retrográd transzportban és az aggregáció elleni védelemben. Ez a következtetés egybecseng azzal az eredménnyel, hogy a PDI-t nagy mennyiségben találtam a betekereten mutáns AAT fehérjével kölcsönhatásban, valamint, hogy a fehérjetekerő komplexre oly jellemző Grp94/PDI komplex szintje csökkent volt PiZ transzgénikus egerekben. Ezek a folyamatok áthelyezik a stresszt a citoplazmára, ahol viszont a jobban indukálható stresszfehérjék, és a nagyobb redox kapacitás könnyebben feldolgozza a megnövekedett terhelést, mint az érzékeny és zsúfolt endoplazmás retikulum. A fent részletezett folyamatokat az alábbi ábrán foglaltam össze. Kiemeléssel jeleztem azokat a megállapításokat, amelyeket bizonyítottunk kísérletsorozatunkban, normál betűtípusúak a még nem bizonyított lépések.
mutáns alfa-1 antitripszin (PiZ) diszulfid izomeráz aktivitása csökken
PDI
chaperon aktivitása nő
? kevebb Grp94/PDI komplex
Hsp70 Hsp90 indukció
Proteaszóma terhelése nő
Oxidatív stressz
tt zo o D k Fo RA E
Redox eltolódás GSH indukció
Tioredoxin MsrA GSH szint emelkedés
Kevésbé hatékony fehérjetekerés ER
Citoplazma
Hogy az ezen kísérletek során tapasztalt ER változások, a citoplazmatikus stressz, a mitokondriális károsodások hogyan állnak összefüggésben a PiZ aggregátumok létével, még nem teljesen tisztázott és további kutatásokat igényel.
75
A két, eddig külön kezelt kutatási területem eredményei és az abból levont következtetések további, átfogóbb gondolatokat is ébresztettek bennem. A krónikus stresszmodell, a PiZ aggregáció tanulmányozása során azt tapasztaltam, hogy a PDI nagy mennyiségben kötődött a betekeretlen fehérjékhez, ugyanakkor, fehérje diszulfid reduktáz aktivitása csökkent mértékű volt, amihez hasonló eredmények születtek diabéteszes modellen is (114). Diabéteszes mintákban azt találtuk, hogy a FAD, ellentétben más, szintén bizonyítottan hatásos oxidálószerekkel, mint a GSSG vagy a dehidroaszkorbát, nem volt képes ugyanolyan mértékben oxidálni a lumenális fehérjéket, mint az egészséges állatokban. Mivel kísérleteim azt bizonyítják, hogy a FAD az eddig ismert oxidálószereknél specifikusabb, kizárólagosan az Ero1-L/PDI rendszer ép működésekor oxidálja a fehérjéket, felvetődik a lehetősége annak, hogy diabéteszben is, ahogyan azt a PiZ modellen láthattuk, egy PDI-funkcióváltozást, azaz az Ero1-L/PDI rendszer szétesését és más chaperonkomplexek kialakulását eredményezheti, amely magyarázatul szolgálhat az ott tapasztalt PDOR aktivitás csökkenésre, amely a PDI indukciója ellenére bekövetkezik. Ezek az adatok tovább erősítik azt az elképzelést, hogy krónikus stressz esetén a PDI funkcióváltáson megy keresztül és fehérje tiol oxidoreduktáz aktivitását elhagyva chaperonként funkcionál. A kisebb kapacitású oxidatív tekeredés a szintetizálódó fehérjék szabályozatlan oxidációjához vezet, ennek kivédését teheti lehetővé a redukálóbb közeg, amely megtalálható volt mind PiZ, mind pedig diabéteszes modellen. Mivel úgy tűnik, a PDI és az Ero1-L nem csak ciszteinjeiken keresztül, de hidrofób kölcsönhatással is kapcsolódnak (R. Sitia, személyes közlés) és ez a kapcsolat pl. PiZ transzgénikus egerekben fokozottabbnak tűnik (Száraz Péter nem publikált adatai), a puszta Ero1-L/PDI kapcsolat megléte nem bizonyítja annak funkcióját. Ezek alapján fontos eszköz lehet a FAD mikroszómális tiol-oxidáló hatásának vizsgálata, amely a funkcionális Ero1-L/PDI kapcsolat meglétének, és hatékonyságának vizsgálatát teszi lehetővé a legkülönbözőbb patológiás állapotokban. A krónikus stresszre adott sejtszintű válasz érdekes és meglehetősen felfedezetlen területe a tudománynak. További kísérletekkel lehet csak tisztázni, hogy a fent felvázolt folyamat speciális-e avagy esetleg általánosan jellemző képet ad a krónikus stresszben kialakuló új egyensúlyokról, amelyek lehetővé teszik a sejt számára, hogy alapvető funkcióit megőrizze és elkerülje az apoptózist.
76
7 Tézisek 1. Kísérleteim során kimutattam, hogy a FAD-nak kiemelkedő szerepe van az endoplazmás retikulum redox egyensúlyának fenntartásában: bebizonyítottam, hogy a FAD oxidáló hatása kizárólagosan az Ero1-L/PDI redox fehérjetekerő rendszeren keresztül valósul meg, és ez a hatás specifikusan gátolható a PDI funkcionális gátlásával. Bebizonyítottam, hogy a FAD fehérje-oxidáló hatásához az endoplazmás membrán integritására van szükség, és hogy a membrán integritása nagy valószínűséggel az Ero1-L és a PDI közötti kölcsönhatás létrejöttéhez szükséges. 2. Kimutattam, hogy a PiZ fehérjeaggregációs betegségben az endoplazmás retikulum chaperonjai nem indukáltak, továbbá, hogy legtöbbjük nem található meg az AAT fehérjével kölcsönhatásban. A PDI-t azonban nagymértékben az AAT-hez kötve találtam, ugyanakkor a PDI reduktáz aktivitása e mintákban radikálisan csökkent. A Grp94/PDI komplex mennyisége a PiZ felhalmozódás következtében csökkent, ami a fehérjetekerés hatékonyságának csökkenését jelentheti. Endoplazmás retikulumban azt találtam, hogy a redox egyensúly egy, az egészséges esetben mérhetőnél redukálóbb állapotban van, amelyet emelkedett glutation-szint kísér. E redox változás kihat a PDI redox státuszára is. 3. A citoplazmatikus chaperonok indukciója, továbbá egyes antioxidáns enzimek emelkedett szintje PiZ transzgén egerekben azt jelzi, hogy az endoplazmás retikulumot érintő stressz kihat a citoplazmára is, feltehetően egy, a krónikus stresszhez való adaptációs mechanizmus aktiválásával.
77
8 Köszönetnyilvánítás Doktori értekezésem végén szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik e munka elkészítésében segítségemre voltak. Szeretném megköszönni szüleimnek és testvéremnek, hogy a tanulás évei alatt türelemmel voltak hozzám, támogattak és bíztattak. Hálával tartozom barátaimnak, Gáspárné Zelenik Viktóriának, Gyuricza Veronikának és Harsányi Ildikónak, amiért ez alatt az idő alatt is mellettem álltak. Segítségük nélkül ez a munka nem készülhetett volna el. Szeretném megköszönni az intézet és a Doktori Iskola igazgatójának, Prof. Mandl József akadémikusnak, hogy lehetővé tette, hogy a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Patobiokémiai és Molekuláris Biológiai intézetében készíthessem el doktori munkámat. Köszönöm Prof. Csermely Péternek, témavezetőmnek, hogy laboratóriumába befogadott, munkámat figyelemmel kísérte és abban mind szakmailag, mind emberileg támogatott. Köszönetet szeretnék mondani laboratóriumunk tagjainak; Száraz Péternek és Korcsmáros Tamásnak a munkában nyújtott segítségért; Kalmár Évának, dr. Amere Subbarao Sreedharnak, dr. Sőti Csabának a tanácsokért és Mihály Katalinnak mindenkori gondoskodásáért. Külön köszönet illeti dr. Nardai Gábort, aki az itt bemutatott
munka
minden
fázisában
nélkülözhetetlen
segítséget
nyújtott.
Mindnyájuknak hálával tartozom a laborban eltöltött vidám órákért. Végezetül köszönetet szeretnék mondani az Orvosi Vegytani Intézet és Motorpresse lapkiadó minden kedves munkatársának az évek alatt tanúsított barátságukért.
78
9 Irodalomjegyzék 1. Ahn SG, és Thiele DJ. (2003) Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress. Genes Dev. 17, 516528. 2. Alder NN, Shen Y, Brodsky JL, Hendershot LM, és Johnson AE. (2005) The molecular mechanisms underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 168, 389-399. 3. Anelli T, Alessio M, Mezghrani A, Simmen T, Talamo F, Bachi A, és Sitia R. (2002) ERp44, a novel endoplasmic reticulum folding assistant of the thioredoxin family. EMBO J. 21, 835-844. 4. Anfinsen CB. (1973) Principles that govern folding of protein chains. Science 181, 223-230. 5. Anthony SG, Schipper HM, Tavares R, Hovanesian V, Cortez SC, Stopa EG, és Johanson CE. (2003) Stress protein expression in the Alzheimer-diseased choroid plexus. J. Alzheimer Dis. 5, 171-177. 6. Anwar A, Siegel D, Kepa JK, és Ross D. (2002) Interaction of the molecular chaperone Hsp70 with human NADPH:quinone oxidoreductase 1. J. Biol. Chem. 277, 14060-14067. 7. Amaral MD. (2004) CFTR and chaperones: processing and degradation. J. Mol. Neurosci. 23, 41-48. 8. Arrigo AP. (1998) Small stress proteins: chaperones that act as regulators of intracellular redox state and programmed cell death. J. Biol. Chem. 379, 19-26. 9. Arrigo AP, Virot S, Chaufour S, Firdaus W, Kretz-Remy C, és Diaz-Latoud C. (2005) Hsp27 consolidates intracellular redox homeostasis by upholding glutathione in its reduced form and by decreasing iron intracellular levels. Antioxid. Redox Signal. 7, 414-422. 10. Bader MW, Xie T, Yu CA, és Bardwell JC. (2000) Disulfide bonds are generated by quinone reduction. J. Biol. Chem. 275, 26082-26088. 11. Bánhegyi G, Marcolongo P, Puskas F, Fulceri R, Mandl J, és Benedetti A. (1998) Dehydroascorbate and ascorbate transport in rat liver microsomal vesicles. J. Biol. Chem. 273, 2758-2762.
79
12. Barrett MJ, Alones V, Wang KX, Phan L, és Swerdlow RH. (2004) Mitochondriaderived oxidative stress induces a heat shock protein response. J. Neurosci. Res. 79, 420-429. 13. Beere HM, Wolf BB, Cain K, Mosser DD, Mahboubi A, Kuwana T, Tailor P, Morimoto RI, Cohen GM, és Green DR. (2000) Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nat. Cell Biol. 2, 469-475. 14. Beere HM, és Douglas RG. (2001) Stress management – heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends Cell Biol. 11, 6-10. 15. Behl C. (2005) Oxidative stress in Alzheimer's disease: implications for prevention and therapy. Subcell. Biochem. 38, 65-78. 16. Benham AM, és Braakman I. (2000) Glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 35, 433-473. 17. Benham AM, Cabibbo A, Fassio A, Bulleid N, Sitia R, és Braakman I. (2000) The CXXCXXC motif determines the folding, structure and stability of human Ero1-Lα. EMBO J. 19, 4493-4502. 18. Berlett BS, és Stadtman ER. (1997) Protein oxidation in ageing, disease and oxidative stress. J. Biol. Chem. 272, 20313-20316. 19. Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot, LM, Harding HP, és Ron D. (2000) Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat. Cell Biol. 2, 326-332. 20. Bradford MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254. 21. Burchell A, Hume R, és Burchell B. (1988) A new microtechnique for the analysis of the human hepatic microsomal glucose-6-phosphatase system. Clin. Chim. Acta 173, 183-192. 22. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, és Garrido C. (2000) Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat. Cell. Biol. 2, 645-652. 23. Calfon M, Zeng H, Urano F, Till JH, Hubbard SR, Harding HP, Clark SG, és Ron
80
D. (2002) IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature 415, 92-96. 24. Camporeale G, és Zempleni J. (2003) Oxidative folding of interleukin-2 is impaired in flavin-deficient jurkat cells, causing intracellular accumulation of interleukin-2 and increased expression of stress response genes. J. Nutr. 133, 668-672. 25. Caplan AJ. (1999) Hsp90’s secrets unfold: new insights from structural and functional studies. Trends Cell Biol. 9, 262-268. 26. Carlson JA, Rogers BB, Sifers RN, Finegold MJ, Clift SM, DeMayo FJ, Bullock DW, és Woo SL. (1989) Accumulation of PiZ alpha1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J. Clin. Invest. 83, 1183-1190 27. Casagrande S, Bonetto V, Fratelli M, Gianazza E, Eberini I, Massignan T, Salmona M, Chang G, Holmgren A, és Ghezzi P. (2002) Glutathionilation of human thioredoxin: a possible crosstalk between the glutathion and thioredoxin system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9745-9749. 28. Cherian-Shaw M, Smith JB, Jiang XY, és Abraham EC. (1999) Intrapolypeptide disulfides in human alphaA-crystallin and their effect on chaperone-like function. Mol. Cell. Biochem. 199, 163-167. 29. Choi S, Park KA, Lee HJ, Park MS, Kim M, Lee Sh, Seo JS, és Yoon BW. (2005) Expression of Cu/Zn SOD protein is suppressed in Hsp 70,1 knockout mice J. Biochem. Mol. Biol. 38, 111-114. 30. Chow K-C. (2000) Hsp70 (DnaK) – an evolution facilitator? Trends Genet. 16, 484485. 31. Csala M, Szarka A, Margittai É, Mile V, Kardon T, Braun L, Mandl J, és Bánhegyi G. (2001) Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch. Biochem. Biophys. 388, 55-59. 32. Csala M, Banhegyi G, Braun L, Szirmai R, Burchell A, Burchell B, Benedetti A, és Mandl J. (2000) Beta-glucuronidase latency in isolated murine hepatocytes. Biochem. Pharmacol. 59, 801-805. 33. Csermely P. (2001) Stresszfehérjék. Tudomány-Egyetem sorozat, Vince kiadó, Budapest 34. Csermely P. (2001) Chaperone-overload as a possible contributor to “civilization diseases”: atherosclerosis, diabetes, cancer. Trends Genet. 17, 701-704.
81
35. Csermely P, Schnaider T, Sőti Cs, Prohászka Z, és Nardai G. (1998) The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol. Ther. 79, 129-168. 36. Conconi M, Petropoulos I, Emod I, Turlin E, Biville F, és Friguet B. (1998) Protection from oxidative inactivation of the 20 S proteasome by heat-shock protein 90. Biochem J. 333, 407-415. 37. Cresteil D, Ciccarelli E, Soni T, Alonso MA, Jacobs P, Bollen A, és Alvarez F. (1990) BiP expression is not increased by the accumulation of PiZ alpha 1antitrypsin in the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 267, 277-280. 38. Cowen LE, és Lindquist S. (2005) Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits: drug resistance in diverse fungi. Science 309, 2185-2189. 39. Danilczyk UG, Cohen-Doyle MF, és Williams DB. (2000) Functional relationship between calreticulin, calnexin, and the endoplasmic reticulum luminal domain of calnexin. J. Biol. Chem. 275, 13089-13097. 40. Demasi M, and Davies KJ. (2003) Proteasome inhibitors induce intracellular protein aggregation and cell death by an oxygen-dependent mechanism. FEBS Lett. 542, 8994. 41. Demasi M, Silva GM, és Netto LES. (2002) 20 S Proteasome from Saccharomyces Cerevisiae is responsive to redox modifications and is S-Glutahtionylated. J. Biol. Chem. 278, 679-685. 42. Dong Z, Wolfer DP, Lipp HP, és Bueler H. (2005) Hsp70 gene transfer by adenoassociated virus inhibits MPTP-induced nigrostriatal degeneration in the mouse model of Parkinson disease. Mol Ther. 11, 80-88. 43. Dycaico M J, Grant SG, Felts K, Nichols WS, Geller SA, Hager JH, Pollard AJ, Kohler SW, Short HP, és Jirik FR. (1988) Neonatal hepatitis induced by alpha 1antitrypsin: a transgenic mouse model. Science 242, 1409-1412. 44. Ellman G, Courtney D, Andres V Jr, és Featherstone RM. (1961) A new and rapid colorometric determination of acetylcholinesterase acitivity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95. 45. Ferrari DM, és Söling HD. (1999) The protein disulfide-isomerase family: unravelling a string of folds. Biochem. J. 339, 1-10. 46. Fiers W, Beyaert R, Declercq W, és Vandenabeck P. (1999) More than one way to
82
die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene 18, 7719-7730. 47. Flynn GC, Pohl J, Flocco MT, és Rothman JE. (1991) Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. Nature 353, 726-730. 48. Fonte V, Kapulkin V, Taft A, Fluet A, Friedman D, és Link CD. (2002) Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9439-9444. 49. Frand AR, és Kaiser CA. (1999) Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell 4, 469-477. 50. Fratelli M, Demol H, Puype M, Casagrande S, Villa P, Eberini I, Vandekerckhove J, Gianazza E, és Ghezzi P. (2003) Identification of proteins undergoing glutathionylation in oxidatively stressed hepatocytes and hepatoma cells. Proteomics 3, 1154-1161. 51. Freeman BC, és Morimoto RI. (1996) The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 15, 2969-2979. 52. Friedlander R, Jarosch E, Urban J, Volkwein C, és Sommer T. (2000) A regulatory link between ER-associated protein degradation and the unfolded-protein response. Nat. Cell. Biol. 2, 379-384. 53. Geller SA, Nichols WS, Kim S, Tolmachoff T, Lee S, Dycaico MJ, Felts K, és Sorge JA. (1994) Hepatocarcinogenesis is the sequel to hepatitis in Z#2 alpha 1antitrypsin transgenic mice: histopathological and DNA ploidity studies. Hepatology 19, 389-397. 54. Gething MJ. (1999) Role and regulation of the ER chaperone BiP. Semin. Cell. Dev. Biol. 10, 465-472. 55. Gillece P, Luz JM, Lennarz WJ, de La Cruz, FJ, és Romisch K. (1999) Export of a cysteine-free misfolded secretory protein from the endoplasmic reticulum for degradation requires interaction with protein disulfide isomerase. J. Cell Biol. 147, 1443-1456. 56. Gilmore WJ, és Kirby GM. (2004) Endoplasmic reticulum stress due to altered cellular redox status positively regulates murine hepatic CYP2A5 expression. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 600-608.
83
57. Glaser CB, Yamin G, Uversky VN, és Fink AL. (2005) Methionine oxidation, alpha-synuclein and Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta 1703, 157-169. 58. Graham KS, Le A, és Sifers RN. (1990) Accumulation of the insoluble PiZ variant of human alpha1-antitrypsin within the hepatic endoplasmic reticulum does not elevate the steady state level of grp78/BiP. J. Biol. Chem. 265, 20463-20468. 59. Gutteridge JM, és Halliwell B. (2000) Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. Ann. NY Acad. Sci. 899, 136-147. 60. Haas IG, és Wabl M. (1983) Immunoglobulin heavy chain binding protein. Nature 306, 387-389. 61. Hagerty DT, és Allen PM. (1995) Intermolecular mimicry. Identification and analysis of two cross-reactive T cell epitopes within a single protein. J. Immunol. 155, 2993-3001. 62. Hamman BD, Hendershot LM, és Johnson AE. (1998) BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell 92, 747-758 63. Hartl FU. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381, 571580. 64. Harding HP, Zhang Y, és Ron D. (1999) Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 397, 271-274. 65. He K, Ludtke SJ, Worcester DL, és Huang HW. (1996) Neutron scattering in the plane of membranes: structure of alamethicin pores. Biophys. J. 70, 2659-2666. 66. Heuck AP, Wolosiuk RA. (1997) Fluoresceinthiocarbamyl-insulin: a potential analytical tool for the assay of disulfide bond reduction. J.. Biochem. Biophys. Methods 34, 213-225 67. Hidvegi T, Schmidt BZ, Hale P, és Perlmutter DH. (2005) Accumulation of mutant alpha 1 antitrypsin Z in the ER activates caspases-4 and -12, NFkappa B and BAP31 but not the unfolded protein response. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt 68. Hirota K, Nakamura H, Masutani H, és Yodoi J. (2002) Thioredoxin superfamily and thioredoxin-inducing agents. Ann. N.Y. Acad. Sci. 957:189-199 69. Hisae H, Kadowaki H, és Ichijo H. (2004) Survival and apoptosis signals in ER stress: the role of protein kinases. J. Chem. Neuroanat. 28, 93-100. 70. Hong M, Li M, Mao C, és Lee AS. (2004) Endoplasmic reticulum stress triggers an
84
acute proteasome-dependent degradation of ATF6. J. Cell. Biochem. 92, 723-732. 71. Hong M, Luo S, Baumeister P, Huang JM, Gogia RK, Li M, és Lee AS. (2004) Underglycosylation of ATF6 as a novel sensing mechanism for activation of the unfolded protein response. J. Biol. Chem. 279, 11354-11363. 72. Horwitz J. (1992) α-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-10453. 73. Huot J, Houle F, Spitz DR, és Landry J. (1996) HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res. 56, 273-279. 74. Jaattela M, és Wissing D. (1993) Heat-shock proteins protect cells from monocyte cytotoxicity: possible mechanism of self-protection. J. Exp. Med. 177, 231-236. 75. Jacquier-Sarlin MR, és Polla B. (1996) Dual regulation of heat shock transcription factor (HSF) activation and DNA-binding activity by H2O2: role of thioredoxin. Biochem. J. 318, 187-193. 76. Jakob U, Eser M, és Bardwell JC. (2000) Redox switch of hsp33 has a novel zincbinding motif. J. Biol. Chem. 275, 38302-38310. 77. Jakob U, Muse W, Eser M, és Bardwell JC. (1999) A chaperone acitvity with a redox switch. Cell 96, 341-352. 78. Jamsa E, Simonen M, és Makarow M. (1994) Selective retention of secretory proteins in the yeast endoplasmic reticulum by treatment of cells with a reducing agent. Yeast 10, 355-370. 79. Kantorow M, Horwitz J, van Boekel MA, deJong WW, és Piatigorsky J. (1995) Conversion of oligomers to tetramers enhances autophosphorylation by αAcrystallin. J. Biol. Chem. 270, 17215-17220. 80. Katayama T, Imaizumi K, Manabe T, Hitomi J, Kudo T, és Tohyama M. (2004) Induction of neuronal death by ER stress in Alzheimer's disease. J. Chem. Neuroanat. 28, 67-78. 81. Kaufman RJ. (2002) Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 1389-1398. 82. Kern JC, és Kehrer JP. (2005) Free radicals and apoptosis: relationships with glutathione, thioredoxin, and the BCL family of proteins. Front. Biosci. 10, 17271738.
85
83. Kirsgh M., és DE Grooth H. (2001) NAD(P)H, a directly operating antioxidant? FASEB J. 15, 1569-1574. 84. Kleizen B, és Braakman I. (2004) Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 343-349. 85. Kuznetsov G, Chen LB, és Nigam SK. (1997) Multiple molecular chaperones complex with misfolded large oligomeric glycoproteins in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 272, 3057-3063. 86. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-686. 87. Lambert M, és Freedman RB. (1985) The latency of rat liver microsomal protein disulfide-isomerase. Biochem. J. 228, 635-645. 88. Lavoie JN, Lambert H, Hickey E, Weber LA, és Landry J. (1995) Modulation of cellular thermoresistance and actin filament stability accompanies phosporylationinduced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27. Mol. Cell. Biol. 15, 505-516. 89. Lawless MW, Greene CM, Mulgrew A, Taggart CC, O'Neill SJ, és McElvaney NG. (2004) Activation of endoplasmic reticulum-specific stress responses associated with the conformational disease Z alpha 1-antitrypsin deficiency. J. Immunol. 172, 5722-5726. 90. Lee AS. (1992) Mammalian stress response: induction of the glucose-regulated protein family. Curr. Opin. Cell Biol. 4, 267-273. 91. Lee AS. (2001) The glucose-regulated proteins: stress induction and clinical applications. Trends Biochem. Sci. 26, 504-510. 92. Lee, AS. (2005) The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods 35, 373-381. 93. Lee GJ, Roseman AM, Saibil HR, és Vierling E. (1997) A small heat shock protein stabily binds heat-denatured model substrates and can mantain a substrate in folding competent state. EMBO J. 16, 659-671. 94. Levine M. (1986) New concepts in the biology and biochemistry of ascorbic acid. N. Engl. J. Med. 314, 892-902. 95. Lodish HF, és Kong N. (1993) The secretory pathway is normal in dithiothreitoltreated cells, but disulfide-bonded proteins are reduced and reversibly retained in the
86
endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 268, 20598-20605. 96. Lomas DA. (2000) Loop-sheet polymerization: the mechanism of alpha1-antitrypsin deficiency. Respir Med. 94, Suppl. C, 3-6. 97. Lovell MA, Xie C, Gabbita SP, és Markesbery WR. (2000) Decreased thioredoxin and increased thioredoxin reductase levels in Alzheimer's disease brain. Free Radic. Biol. Med. 28, 418-427. 98. Mai K, Kullmann V, Bobbert T, Maser-Gluth C, Mohlig M, Bahr V, Pfeiffer AF, Spranger J, és Diederich S. (2005) In vivo activity of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and free fatty acid-induced insulin resistance. Clin. Endocrinol. 63, 442-449. 99. Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S, Novoa I, Zhang Y, Jungreis R, Nagata K, Harding HP, és Ron D. (2004) CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum. Genes Dev 18, 3066-3077. 100.
Mayer M, Kies U, Kammermeier R, és Buchner J. (2000) BiP and PDI
cooperate in the oxidative folding of antibodies in vitro. J. Biol. Chem. 275, 2942129425. 101.
McLaren A. (1999) Too late for the midlife toad. Stress, variability and Hsp90.
Trends Genet. 15, 169-171. 102.
Melnick J, Dul JL, és Argon Y. (1994) Sequential interaction of the chaperones
BiP and GRP94 with immunoglobulin chains in the endoplasmic reticulum. Nature 370, 373-375. 103.
Mezghrani A, Fassio A, Benham A, Simmen T, Braakman I, és Sitia R. (2001)
Manipulation of oxidative protein folding and PDI redox state in mammalian cells. EMBO J. 20, 6288-6296. 104.
Molecular chaperones and folding catalysts. Regulation, cellular function and
mechanisms. (1999) Szerk.: Bukau B., Harwood Academic Publishers 105.
Molinari M, és Helenius A. (2000) Chaperone selection during glycoprotein
translocation into the endoplasmic reticulum. Science 288, 331-333. 106.
Molteni SN, Fassio A, Ciriolo MR, Filomeni G, Pasqualetto E, Fagioli C, és
Sitia R (2004) Glutathione limits Ero1-dependent oxidation in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 279, 32667-32673 107.
Mori K. (2000) Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic
87
reticulum. Cell 101, 451-454. 108.
Morimoto RI. (1999) Regulation of the heat shock transcriptional response:
cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones and negative regulators. Genes Dev. 12, 3788-3796. 109.
Morimoto RI, Sarge KD, és Abravaya K. (1992) Transcriptional regulation of
heat shock genes. A paradigm of inducible genomic response. J. Biol. Chem. 267, 21987-21990. 110.
Moskovitz J. (2005) Methionione sulfoxide reductases: ubiquitous enzymes
involved in antioxidant defense, protein regulation, and prevention of agingassociated diseases. Biochem. Biophys. Acta 1073, 213-219. 111.
Moskowitz J, Weissbach H, és Brot N. (1996) Cloning and expression of a
mammalian gene that is involved in methionine sulphoxide reduction in proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2095-2099. 112.
Munro S, és Pelham HR. (1986) An Hsp70-like protein in the ER: identity with
the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. Cell 46, 291-300. 113.
Nardai G, Braun L, Csala M, Mile V, Csermely P, Benedetti A, Mandl J, és
Banhegyi G. (2001) Protein disulphate isomerase and protein thiol dependent dehydroascorbate reduction and ascorbate accumulation in the lumen of the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 276, 8825-8828. 114.
Nardai G, Stadler K, Papp E, Korcsmaros T, Jakus J, és Csermely P. (2005)
Diabetic changes in the redox status of the microsomal protein folding machinery. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 787-795. 115.
Neckers L, Mimnaugh E, és Schulte TW. (1999) The Hsp90 chaperone family.
Stress proteins. In: Handbook of Experimental Pharmacology (szerk: D.S. Latchman) 136, 9-42; Springer. 116.
Nordberg J, és Arner ES. (2001) Reactive oxygen species, antioxidants, and the
mammalian thioredoxin system. Free Radic. Biol. Med. 31, 1287-1312. 117.
Oliver CN, Ahn B, Moerman EJ, Goldstein S, és Stadtman ER. (1987) Age-
related changes in oxidized proteins. J. Biol. Chem. 262, 5488-5491. 118.
Olson RE. (1984) The function and metabolism of vitamin K. Annu. Rev. Nutr.
4, 281-337.
88
119.
Ostergaard H, Henriksen A, Hansen FG, és Winther JR. (2001) Shedding light
on disulfide bond formation: engineering a redox switch in green fluorescent protein. EMBO J. 20, 5853-5862. 120.
Pagani M, Fabbri M, Benedetti C, Fassio A, Pilati S, Bulleid NJ, Cabibbo A, és
Sitia R. (2000) Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-Lβ (ERO1-Lβ), a human gene induced in the course of the unfolded protein response. J. Biol. Chem. 275, 23685-23692. 121.
Patil C, és Walter P. (2001) Intracellular signaling from the endoplasmic
reticulum to the nucleus: the unfolded protein response in yeast and mammals. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 349-356. 122.
Papp E, Nardai G, Soti C, és Csermely P. (2003) Molecular chaperones, stress
proteins and redox homeostasis. Biofactors 17, 249-257. 123.
Pekkari K, és Holmgren A. (2004) Truncated thioredoxin: physiological
functions and mechanism. Antioxid. Redox Signal. 6, 53-61. 124.
Pereira B, Rosa LF, Safi DA, Bechara EJ, és Curi R. (1994) Superoxide
dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in the lymphoid organs of diabetic rats. J. Endocrinol. 142, 161-165. 125.
Petrat F, Pindiur S, Kirsch M, és de Groot H. (2003) NAD(P)H, a primary target
of 1O2 in mitochondria of intact cells. J. Biol. Chem. 278, 3298-3307. 126.
Petropulos I, Conconi M, Wang X, Hoenel B, Bregegere F, Milner Y, és
Friguet B. (2000) Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of proteasome activity and content in aging epidermal cells. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 220-227. 127.
Piccirella S, Czegle I, Lizák B, Margittai E, Senesi S, Papp E, Csala M, Fulceri
R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, és Bánhegyi G. (2006) Uncoupled redox systems in the lumen of the endoplasmic reticulum: Pyridine nucleotides stay reduced in an oxidative environment. J. Biol. Chem. nyomtatás alatt (doi: 10.1074/jbc.M509406200) 128.
Preville X, Salvemini F, Giraud S, Chaufor S, Paul C, Stepien G, Ursini MV,
és Arrigo AP. (2002) Mammalian small stress proteins protect against oxidative stress through their ability to increase glucose-6-phoshate dehydrogenase activity and by maintaining optimal cellular detoxifying machinery. Exp. Cell. Res. 247, 61-
89
78. 129.
Poli G, Leonarduzzi G, Biasi F, és Chiarpotto E. (2004) Oxidative stress and cell
signalling. Curr. Med. Chem. 11, 1163-1182. 130.
Primm TP, Walker KW, és Gilbert HF. (1996) Facilitated protein aggregation.
Effects of calcium on the chaperone and anti-chaperone activity of protein disulfideisomerase. J. Biol. Chem. 271, 33664-33669. 131.
Primm TP, és Gilbert HF. (2001) Hormone binding by protein disulfide
isomerase, a high capacity hormone reservoir of the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 276, 281-286. 132.
Puig A, és Gilbert HF. (1994) Protein disulfide isomerase exhibits chaperone
and anti-chaperone activity in the oxidative refolding of lysozyme. J. Biol. Chem. 269, 7764-7771. 133.
Rao RV, és Bredesen DE. (2004) Misfolded proteins, endoplasmic reticulum
stress and neurodegradation Curr. Opin. Cell Biol. 16, 653-662. 134.
Richter K, és Buchner J. (2001) Hsp90: chaperoning signal transduction. J.
Cell Physiol. 188, 281-290. 135.
Rutishauser J, és Spiess M. (2002) Endoplasmic reticulum storage diseases.
Swiss Med. Wkly. 132, 211-222. 136.
Satyal S, Chen D, Fox SG, Kramer JM, és Morimoto RI. (1998) Negative
regulation of the heat shock transcriptional response by HSBP1. Genes Dev. 12, 1262-1274. 137.
Shaefer FQ, és Buettner GR. (2001) Redox environment of the cell as viewed
through the redox state of the glutathion disulfide/glutathion couple. Free Rad. Biol. Med. 30, 1191-1212. 138.
Schmidt BZ, és Perlmutter DH. (2005) Grp78, Grp94 and Grp170 interact with
alpha-1-antitrypsin mutants that are retained in the endoplasmic reticulum. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 444-455. 139.
Schoonderwoert VThG, és Martens GJM. (2000) Inhibition of the vacuolar H+-
ATPase perturbs the transport, sorting, processing and release of regulated secretory proteins J. Membrane Biol. 182, 159-169. 140.
Schröder M, és Kaufman RJ. (2005) ER stress and the unfolded protein
response. Mutat. Res. 569, 29-63.
90
141.
Sevier CS, Couzzo JW, Vala A, Aslund F, és Kaiser CA. (2001) A flavoprotein
oxidase defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulfide bond formation. Nat. Cell Biol. 3, 874-882. 142.
Shen J, és Prywes R. (2005) ER stress signaling by regulated proteolysis of
ATF6. Methods 35, 382-389. 143.
Sideraki V, és Gilbert HF. (2000) Mechanism of the antichaperone activity of
protein disulfide isomerase: facilitated assembly of large, insoluble aggregates of denatured lysozyme and PDI. Biochemistry 39, 1180-1188. 144.
Sitia R, és Braakman I. (2003) Quality control in the endoplasmic reticulum
protein factory. Nature 426, 891-894. 145.
Sitia R, és Molteni SN. (2004) Stress, protein (mis)folding, and signaling: the
redox connection. Sci. STKE. 239, 27 146.
Skaar EP, Tobiason DM, Quick J, Judd RC, Weisbach H, Etienne F, Brot N, és
Seifert HS. (2002) The outer membrane localisation of the Neisseria Gonorroeae MsrA/B is involved in survival against reactive oxigen species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10108-10113. 147.
Sőti Cs, és Csermely P. (2002) Chaperones and ageing: role in
neurodegeneration and in other civilizational diseases. Neurochem. Internat. 41, 383-389. 148.
Sreekumar PG, Kannan R, Yaung J, Spee C K, Ryan SJ, és Hinton DR. (2005)
Protection from oxidative stress by methionine sulfoxide reductases in RPE cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 245-253. 149.
Stadtman ER, Moskovitz J, és Levine RL. (2003) Oxidation of methionine
residues of proteins: biological consequences. Antioxid. Redox. Signal. 5, 577-582. 150.
Stevenson MA, Calderwood SK, és Hahn GM. (1981) Rapid increases in
inositol triphosphate and intracellular Ca++ after heat shock. Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 826-833. 151.
Storz G. (1999) An RNA thermometer. Genes Dev. 13, 633-636.
152.
Sun H, Gao J, Ferrington DA, Biesiada H, Williams TD, és Squier TC. (1999)
Repair of oxidised calmodulin by methionine sufoxide reductase restores ability to activate plasma membrane Ca-ATPase. Biochem J. 23, 105-112. 153.
Tatu U, és Helenius A. (1997) Interactions between newly synthesized
91
glycoproteins, calnexin and a network of resident chaperones in the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 136, 555-565. 154.
Taylor CA, és Varandani PT. (1981) Immunocytochemical localization of
glutathione-insulin transhydrogenase in the pancreas, kidney and liver of normal and streptozotocin-diabetic rats and of lean and obese (ob/ob) mice. Diabetologia 21, 464-469. 155.
Teasdale RD, és Jackson MR. (1996) Signal-mediated sorting of membrane
proteins between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 27-54. 156.
Teckman HJ, An J-K, Blomenkamp K, Schmidt B, és Perlmutter D. (2003)
Mitochondrial autophagy and injury in the liver in alpha1-antitripsine deficiency. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 286, 815-862. 157.
Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ, Weissman JS, és Walter P.
(2000) Functional and genomic analyses reveal an essential coordination between the unfolded protein response and ER-associated degradation. Cell 101, 249-258. 158.
Trotter EM, és Grant CM. (2002) Thioredoxins are required for protection
against a reductive stress in yeast. Mol. Microbiol. 46, 869-878. 159.
Tsai B, és Rapoport TA. (2002) Unfolded cholera toxin is transferred to the ER
membrane and released from protein disulphide isomerase upon oxidation by Ero-1. J. Cell Biol. 159, 207-216. 160.
Tsai B, Rodighiero C, Lencer WI, és Rapoport TA. (2001) Protein disulfide
isomerase acts as a redox-dependent chaperone to unfold cholera toxin. Cell 104, 937-948. 161.
Tu BP, Ho-Schleyer SC, Travers KJ, és Weissman JS. (2000) Biochemical basis
of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science 290, 1571-1574. 162.
Tu BP, és Weismann JS. (2002) The FAD- and O(2)-dependent reaction cycle of
Ero1-mediated oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell 10, 983-994. 163.
Turano C, Coppari S, Altieri F, és Ferraro A. (2002) Proteins of the PDI
family: unpredicted non-ER locations and functions. J. Cell. Physiol. 193, 154-163. 164.
Varsanyi, M., Szarka, A., Papp, E., Makai, D., Nardai, G., Fulceri, R.,
Csermely, P., Mandl, J., Benedetti, A., és Banhegyi, G. (2004) FAD transport and
92
FAD-dependent protein thiol oxidation in rat liver microsomes. J. Biol. Chem. 279, 3370-3374. 165.
Venetianer P, és Straub FB. (1963). The enzymic reactivation of reduced
ribonuclease. Biochim. Biophys. Acta 67, 166-167. 166.
Verbeke P, Clark BF, és Rattan SI. (2001) Reduced levels of oxidized and
glycoxidized proteins in human fibroblasts exposed to repeated mild heat shock during serial passaging in vitro. Free Radic. Biol. Med. 31, 1593-1602. 167.
Vígh L, Maresca B, és Harwood JL. (1998) Does the membrane’s physical
state control the expression of heat shock and other genes. Trends Biochem. Sci. 23, 369-374. 168.
Weissbach H, Resnick L, és Brot N. (2005) Methionine sulfoxide reductases:
history and cellular role in protecting against oxidative damage. Biochim. Biophys. Acta 1703, 203-212. 169.
Weitzel G, Pilatus U, és Rensing L. (1987) The cytoplasmic pH, ATP content
and total protein synthesis rate during heat-shock protein inducing treatment in yeast. Exp. Cell Res. 170, 64-79. 170.
Welch WJ, és Suhan JP. (1985) Morphological study of the mammalian stress
response: caracterisation of changes in cytoplasmic organelles, cytoskeleton and nucleoli, and appareance of intracellular actin filaments in rat fibroblast after heat shock treatment. J. Cell Biol. 101, 1198-1211. 171.
Welsh MJ, és Gaestel M. (1998) Small heat-shock protein family: function in
health and disease. Ann N Y Acad Sci. 851, 28-35. 172.
Werner R, Manthey KC, Griffin JB, és Zempleni J. (2005) HepG2 cells develop
signs of riboflavin deficiency within 4 days of culture in riboflavin-deficient medium. J Nutr Biochem. 16, 617-624. 173.
Whittier JE, Xiong Y, Rechsteiner MC, és Squier TC. (2004) Hsp90 enhances
degradation of oxidized calmodulin by the 20 S proteasome. J. Biol. Chem. 279, 46135-46142. 174.
Winter J, és Jakob U. (2004) Beyond transcription--new mechanisms for the
regulation of molecular chaperones. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39, 297-317. 175.
Wu Y, Swulius MT, Moremen KW, Sifers RN. (2003) Elucidation of the
molecular logic by which misfolded alpha 1-antitrypsin is preferentially selected for
93
degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 8229-8234 176.
Xue X, Piao JH, Nakajima A, Sakon-Komazawa S, Kojima Y, Mori K, Yagita
H, Okumura K, Harding H, és Nakano H. (2005) Tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induces the unfolded protein response (UPR) in a reactive oxygen species (ROS)-dependent fashion, and the UPR counteracts ROS accumulation by TNFalpha. J. Biol. Chem. 280, 33917-33925. 177.
Yan Lj, Rajasekaran NS, Sathyanarayan S, és Benjamin IJ. (2005) Mouse
HSF1 disruption perturbs redox state and increases mitochondrial oxidative stress in kidney. Antiox. Redox Signal. 7, 465-471. 178.
Yao Y, Zhou Y, és Wang C. (1997) Both the isomerase and chaperone activities
of protein disulfide isomerase are required for the reactivation of reduced and denatured acidic phospholipase A2. EMBO J. 16, 651-658. 179.
Yan LJ, Christians ES, Liu L, Xiao X, Sohal RS, és Benjamin IJ. (2002) Mouse
heat shock trancription factor 1 deficiency alters cardiac redox homeostasis and increases mitochondrial oxidative damage. EMBO J. 21, 5164-5172. 180.
Yoo BC, Seidl R, Cairns N, és Lubec G. (1999) Heat-shock protein 70 levels in
brain of patients with Down syndrome and Alzheimer's disease. J. Neural Transm. Suppl. 57, 315-322. 181.
Yoshida H, Matsui T, Hosokawa N, Kaufman RJ, Nagata K, és Mori K. (2003)
A time-dependent phase shift in the mammalian unfolded protein response. Dev. Cell 4, 265-271. 182.
Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A, Okada T, és Mori K. (2001) XBP1 mRNA
is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 107, 881-891. 183.
Yoshida H. Okada T, Haze K, Yanagi H, Yura T, és Mori K. (2000) ATF6
activated by proteolysis directly binds in the presence of NF-Y (CBF) to the cisacting element responsible for the mammalian unfolded protein response. Mol. Cell. Biol. 20, 6755-6767. 184.
Yoshida H, Okada T, Haze K, Yanagi H, Yura T, Negishi M. és Mori K, (2001)
Endoplasmic reticulum stress-induced formation of transcription factor complex ERSF including NF-Y (CBF) and activating transcription factors 6α and 6β that activates the mammalian unfolded protein response. Mol. Cell. Biol. 21, 1239-1248.
94
185.
Yoshida T, Oka S, Masutani H, Nakamura H, és Yodoi J. (2003) The role of
thioredoxin in the aging process: involvement of oxidative stress. Antioxid. Redox. Signal. 5, 563-570. 186.
Yu MH, Lee KN, és Kim J. (1995) The Z type variation of human alpha 1-
antitrypsin causes a protein folding defect. Nat. Struct. Biol. 2, 363-367. 187.
Zhou H, Ortiz-Pallardo ME, Ko Y, és Fischer HP. (2000) Is heterozygous
alpha-1-antitrypsin deficiency type PIZ a risk factor for primary liver carcinoma? Cancer 88, 2668-2676
95
10 Saját közlemények jegyzéke 10.1 A doktori értekezéshez közvetlenül kapcsolódó közlemények jegyzéke 10.1.1 Első szerzős közlemények 1. Papp E, Nardai G, Sreedhar AS, Korcsmaros T, és Csermely P. (2005) Effects of unfolded protein accumulation on the redox state of the endoplasmic reticulum, In: Endoplasmic reticulum: a Metabolic Compartment (szerk.: Benedetti A, Banhegyi G, és Burchell A) NATO Science Ser. 363, 111-120. IF: 0 2. Papp E, Nardai G, Mandl J, Banhegyi G, és Csermely P. (2005) FAD oxidizes the ERO1-PDI electron transfer chain: The role of membrane integrity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 938-945. IF: 2,9 3. Papp E, Száraz P, Korcsmáros T, és Csermely P. (2006) Changes of endoplasmic reticulum chaperone complexes, redox state and impaired protein disulfide oxidoreductase activity in misfolding α1-antitrypsin transgenic mice. FASEB J. nyomtatás alatt IF: 6,8 10.1.2 Társszerzős közlemények 4. Varsanyi M, Szarka A, Papp E, Makai D, Nardai G, Fulceri R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, és Banhegyi G. (2004) FAD transport and FAD-dependent protein thiol oxidation in rat liver microsomes. J. Biol. Chem. 279, 3370-3374. IF: 6,9 10.2 A doktori értekezéshez közvetve kapcsolódó közlemények: 1. Papp E, Nardai G, Soti C, és Csermely P. (2003) Molecular chaperones, stress proteins and redox homeostasis. Biofactors 17, 249-257. IF: 1,8, id.: 7 2. Nardai G, Korcsmaros T, Papp E, és Csermely P. (2003) Reduction of the endoplasmic reticulum accompanies the oxidative damage of diabetes mellitus. Biofactors 17, 259-267. IF: 1,8, id.: 1 3. Csermely P, Sőti Cs, Kalmar E, Papp E, Pato B, Vermes A, és Sreedhar AS. (2003) Molecular chaperones, evolution and medicine. J. Mol. Struct. Theochem 666-667, 373-380. IF: 1,0, id.: 1 4. Nardai G, Stadler K, Papp E, Korcsmaros T, Jakus J, és Csermely P. (2005)
96
Diabetic changes in the redox status of the microsomal protein folding machinery. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 787-795. IF: 2,9 5. Piccirella S, Czegle I, Lizák B, Margittai E, Senesi S, Papp E, Csala M, Fulceri R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, és Bánhegyi G. Uncoupled redox systems in the lumen of the endoplasmic reticulum: Pyridine nucleotides stay reduced in an oxidative
environment.
J.
Biol.
Chem.
nyomtatás
alatt
(doi:
10.1074/jbc.M509406200). IF: 6,9 10.3 Könyvfejezetek 1. Nardai G, Papp E, Korcsmaros T, Stadler K, Jakus J, és Csermely P. (2005) Possible links between metabolism and oxidative protein folding. Conseqences of a diabetes study. In: Endoplasmic reticulum: a Metabolic Compartment (szerk.: Benedetti A, Banhegyi G, és Burchell A) NATO Science Ser. 363, 101-110. 2. Papp E, Nardai G, és Csermely P. (2005) Changes of cellular redox homeostasis and protein folding in diabetes, In: Cellular dysfunction in atherosclerosis and diabetes – Reports from bench to bedside (szerk.: Simionescu M, Sima A, és Popov D.) Plenum Press, Románia, Bukarest pp. 227-235 3. Papp E, és Csermely P. (2005) Chemical, pharmacological and other smallmolecule chaperones – Mechanism of action and potential use. In: Molecular Chaperones in Health and Disease (szerk.: Gaestel M). Springer Verlag, Handbook of Experimental Pharmacology 172, 405-416. Teljes impakt faktor: 31,0 Idézettség: 8
97
