Teaflavanolok hatása az endoplazmás retikulum fehérjeérési és minőségellenőrzési folyamataira Doktori értekezés
Magyar Éva Judit Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Csala Miklós egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Ifj. Gallyas Ferenc egyetemi docens, Ph.D. Dr. Lotz Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár, D.Sc. tagjai: Dr. Monostory Katalin tudományos főmunkatárs, kandidátus Dr. Csanády László egyetemi docens, Ph.D.
Budapest 2010
Tartalomjegyzék Ábrák jegyzéke
4
Táblázatok jegyzéke
5
Rövidítések jegyzéke
6
1.
Bevezetés
7
1.1.
Az endoplazmás retikulum legfontosabb funkciói
8
1.1.1.
Kalciumhomeosztázis
9
1.1.2.
Fehérjeszintézis és -érés
10
1.1.2.1.
Ko- és poszttranszlációs módosítások
10
1.1.2.1.1. Az endoplazmás retikulum chaperon, foldáz és lektin fehérjéi
11
1.1.2.1.2. A diszulfid hidak kialakulása
12
1.1.2.1.3. Fehérjeglikoziláció
12
1.1.2.2.
Minőségellenőrzés
15
1.2.
Az endoplazmás retikulum stressz
18
1.2.1.
Az UPR mechanizmusa
19
1.2.2.
Az endoplazmás retikulum stressz által indukált apoptózis
21
1.3.
A tea mint gyógynövény
23
1.3.1.
A tea hatóanyagai
24
1.3.2.
Az EGCG eddig ismert tumorgátló hatásai
26
2.
Célkitűzések
30
3.
Módszerek
32
3.1.
Az ER stressz és apoptózis vizsgálatához alkalmazott módszerek
32
3.1.1.
Sejtkultúra tenyésztése
32
3.1.2.
Az apoptózis vizsgálata
32
3.1.3.
Sejtlizátum készítése
33
3.1.4.
Western blot analízis
33
3.1.5.
Az endoplazmás retikulum morfológiájának vizsgálata
34
3.1.6.
Az endoplazmás retikulum kalciumtartalmának vizsgálata
34
3.2.
Az enzimaktivitás méréséhez alkalmazott módszerek
35
3.2.1.
Glukozidáz II enzim aktivitásának mérése hepatóma sejteken
35
3.2.2.
Mikroszómapreparálás
36
3.2.3.
Glukozidáz II enzim aktivitásának mérése mikroszómában
36
1
3.2.4.
HPLC („high performance liquid chromatography”)
37
3.3.
Számítási módszerek
38
4.
Eredmények
39
4.1.
EGCG-kezelés hatására aktiválódó, endoplazmás retikulum eredetű proapoptotikus mechanizmusok Hepa1c1c7 sejtekben
39
4.1.1.
Az apoptózis aktiválódása
39
4.1.2.
A CHOP indukciója és a prokaszpáz-12 hasítása
40
4.1.3.
Az endoplazmás retikulum reprezentatív chaperonjainak expressziója
42
4.1.4.
Az eIF2α foszforilációjának fokozódása
44
4.1.5.
Az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak depléciója
45
4.1.6.
Az endoplazmás retikulum morfológiai változásai
46
4.2.
Teaflavanolok hatása az endoplazmás retikulumban zajló fehérjeérési és 45 minőségellenőrzési folyamatokra
4.2.1.
A glukozidáz II enzim gátlása hepatóma sejtekben
45
4.2.2.
A glukozidáz II gátlásának jellemzése máj mikroszómában
49
4.2.2.1
A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált vezikulában
49
4.2.2.2.
Az EGCG-általi gátlás támadáspontja és koncentrációfüggése
53
4.2.2.3.
A gátlás kinetikája
54
4.2.2.4.
Különböző teaflavanolok hatékonyságának összehasonlítása
57
5.
Megbeszélés
60
6.
Következtetések
67
7.
Összefoglalás
69
8.
Summary
71
9.
Irodalomjegyzék
73
10.
Saját közlemények jegyzéke
81
10.1.
A disszertációhoz kapcsolódó közlemények
81
10.2.
A disszertációtól független közlemények
81 82
Köszönetnyilvánítás
2
Ábrák jegyzéke 1. ábra Emlős sejtekben a natív fehérjékre helyezett oligoszacharid (elsődleges
13
glikán) szerkezete 2. ábra Oligoszacharid-érés az endoplazmás retikulumban
14
3. ábra Minőségellenőrzés az endoplazmás retikulumban
16
4. ábra Az UPR-ben aktiválódó legfontosabb jelpályák
20
5. ábra Az endoplazmás retikulum eredetű apoptózis
22
6. ábra A táplálékban található flavonoidok általános szerkezete
25
7. ábra Apoptózis vizsgálata annexinnel hepatóma sejtekben
39
8. ábra Az apoptózis index alakulása EGCG-vel kezelt hepatóma sejtekben
40
9. ábra A CHOP indukciója EGCG-kezelés hatására
41
10. ábra A prokaszpáz-12 hasítása EGCG-kezelés hatására
42
11. ábra Az endoplazmás retikulum reprezentatív chaperonjainak expressziója az
43
EGCG-vel kezelt sejtekben 12. ábra Az eIF2α fokozott foszforilációja EGCG-kezelés hatására
44
13. ábra Az EGCG által az endoplazmás retikulumban kiváltott kalciumdepléció
46
koncentráció- és időfüggése 14. ábra Az endoplazmás retikulum morfológiai változásai az EGCG-vel kezelt
47
sejtekben 15. ábra A glukozidáz II gátlása EGCG-vel intakt és permeabilizált sejtekben
49
16. ábra A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált máj mikroszómában
50
17. ábra A MUG-hidrolízis latenciájának koncentrációfüggése
51
18. ábra A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált máj mikroszómában
52
19. ábra A glukozidáz II gátlása EGCG-vel
54
20. ábra A glukozidáz II gátlásának kinetikája
55
21. ábra A glukozidáz II gátlásának kinetikája Lineweaver-Burk ábrázolással
56
22. ábra A vizsgált teaflavanolok és a propil-gallát szerkezete
57
23. ábra Különböző teaflavanolok és propil-gallát hatása a glukozidáz II
58
aktivitására
3
Táblázatok jegyzéke 1. táblázat A táplálékban található flavonoidok alosztályai és jellegzetességeik
26
2. táblázat EGCG hatása a glukozidáz II kinetikai paramétereire
56
3. táblázat A glukozidáz II különböző gátlószereinek IC50 és Ki értékei
59
4
Rövidítések jegyzéke ASK1
„apoptosis signal-regulating kinase 1”
ATF
„activating transcription factor”
BiP
„binding protein”
Bcl-2
„B-cell lymphoma protein 2” apoptózisszabályozó fehérjecsalád és annak egyik (antiapoptotikus) tagja
BH3
„Bcl-2-homology domain 3”
CHOP
CCAAT-box enhancer binding protein-homologous protein
CRE
cAMP response element
EDEM
„endoplasmic reticulum degradation-enhancing 1,2-mannosidase-like protein”
EDTA
etilén-diamin-tetraacetát
EC
epikatekin
ECG
epikatekin-gallát
EGC
epigallokatekin
EGCG
epigallokatekin-gallát
eIF2
eukarióta iniciációs faktor 2
ER
endoplazmás retikulum
ERAD
endoplazmás retikulum asszociált degradáció
ERP72
endoplazmás retikulum protein 72
FBS
„fetal bovine serum”
FITC
fluoreszcein izotiocianát
GADD
„growth arrest and DNA damage-inducible protein”
GC
gallokatekin
GCG
gallokatekin-gallát
GLO
gulonolakton oxidáz
GRP
„glucose-regulated protein”
HEPES
„4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid”
HIF1
hipoxia által indukált faktor 1
HPLC
„high performance liquid chromatography”
IP3R
IP3-receptor Ca2+-csatorna
5
IRE1
„inositol requiring 1”
JNK
c-Jun N-terminális kináz
MEM
„minimum essential medium”
MHC
„major histocompatibility complex”
MMP
mátrix metalloproteináz
MOPS
„3-(N-morpholino) propanesulfonic acid”
MUG
metil-umbelliferil-α-D-glukozid
NPG
p-nitrofenil-α-D-glukozid
NBDJ
N-butil-deoxi-nojirimicin
pC-12
prokaszpáz-12
PDI
protein-diszulfid izomeráz
PERK
„RNA-dependent protein kinase-like ER-kinase”
PG
propil-gallát
PVDF
polivinilidin-fluorid
RyR
rianodin-receptor Ca2+-csatorna
SDS
„sodium dodecyl sulfate”, Na-lauril-szulfát
UGGT
UDP-glukóz:glikoprotein-glukoziltranszferáz
uORFs
„upstream open reading frames”
uPA
urokináz-típusú plazminogénaktivátor
UPR
„unfolded protein response”
VEGF
„vascular endothelial growth factor”
TFA
trifluorecetsav
TRAF2
„tumor necrosis factor receptor-associated factor 2”
XBP
„cis-acting X-box binding protein”
6
1. Bevezetés Az endoplazmás retikulum folyamatos membránnal határolt sejtorganellum [Baumann O. és Walz B. 2001; Palade G. E. 1956], amely minden eukarióta sejtben megtalálható, bár mérete tág határok között változhat. Az összefüggő membrán teljesen elhatárol egymástól két jól definiált kompartmentet: a citoplazmát és az endoplazmás retikulum lumenét. A membrán összetétele eltér a plazma membránétól vagy más intracelluláris membránokétól, itt ugyanis rendkívül magas a fehérje:lipid arány, és alacsony a koleszterintartalom. A lumenben szintén a citoplazmától karakterisztikusan eltérő miliő alakul
ki,
amelyre
jellemző
a
viszonylag
magas
kalcium-,
proton-
és
aszkorbátkoncentráció, valamint az alacsony [tiol]:[diszulfid] arány. Morfológiai és funkcionális szempontok alapján megkülönböztetjük a durva, illetve a sima felszínű endoplazmás retikulumot [Shibata Y. és mtsai. 2006]. Az előbbi nevét onnan kapta, hogy – jellemzően lemezes, lamellás struktúrában hajtogatott – membránjának külső (citoplazma felőli) oldalához riboszómák tapadnak, amelyek elektronmikroszkópos felvételen jól láthatók. A sima felszínű endoplazmás retikulum nem hordoz riboszómákat, és szerteágazó csőrendszerre emlékeztető tubuláris struktúrát mutat. A morfológiai eltérések funkcionális különbségekkel is együtt járnak. A durva felszínű rész elsődleges feladata a fehérjeszintézis és -érés, míg a sima felszínűnek tulajdonítják a lipid-anyagcserével, biotranszformációval és szekrécióra kerülő kismolekulák előállításával kapcsolatos feladatokat. A funkciók elkülönülésének azonban ellentmond, hogy a transzlokon csatornákon és a hozzájuk kapcsolódó riboszómákon kívül az endoplazmás retikulum fehérjéi nem mutatnak szubkompartmentációt, vagyis az organellum mindkét részében egyaránt megtalálhatók. Fontos, hogy a durva és a sima felszínű részek egy egységbe tartoznak, membránjuk és lumenük folytonos egymással. Ugyanígy tartozik az endoplazmás retikulumhoz a sejtmag burka is, amely persze jellegzetes szerkezeti elemei révén olyan funkciókat lát el, amelyek leginkább a sejtmag funkcióihoz kötődnek, és így az endoplazmás retikulum másik két részétől jobban elkülönül [Voeltz G. K. és mtsai. 2002]. Az endoplazmás retikulum finomabb szerkezetének tanulmányozása rávilágított bizonyos dinamikus „szubdomének” létezésére is. A sejtmaggal való szoros kapcsolata mellett az endoplazmás retikulum közvetlen kapcsolatot létesít a sejt szinte minden
7
organellumával és a plazmamembránnal is. Az így kialakult kapcsolódási régiók sajátos összetétellel és tulajdonságokkal rendelkeznek, azonban – a sejt változó igényeihez való folyamatos alkalmazkodás részeként – állandó átstrukturálódás jellemzi őket [Borgese N. és mtsai. 2006]. Egyes sejtekben az endoplazmás retikulum szinte kizárólag a magburokból áll, máshol (pl. májsejtekben) a sejt összes membránjának akár több mint 95 %-át, illetve a sejt teljes térfogatának nagyjából 10 %-át adja. Előfordul, hogy specializált funkciójának megfelelően morfológiai sajátosságai is kissé megváltoznak, amire jó példa a harántcsíkolt izomrostokban található szarkoplazmás retikulum.
1.1. Az endoplazmás retikulum legfontosabb funkciói A durva és sima felszínű endoplazmás retikulum számos sejtbiológiai és biokémiai folyamatban vesz részt [Csala M. és mtsai. 2006]. Itt található a sejt legjelentősebb belső
kalciumraktára,
amely
alapvető
szerepet
játszik
a
sejt
szabályozási
mechanizmusaiban. Itt szintetizálódnak és érnek azok a fehérjék, amelyek funkciójukat az endoplazmás retikulumban, a Golgi apparátusban, a lizoszómában vagy a plazmamembránban látják el, esetleg szekretálódnak a sejtből. Ide kerülnek és itt kapcsolódnak a „major histocompatibility complex” (MHC) fehérjéihez azok a peptidek, amelyeket a sejt mint antigéneket a felszínen prezentál [Koch J. és Tampe R. 2006]. A szénhidrát-anyagcsere egyik alapvető folyamatát, a glukóz szintézisét az endoplazmás retikulum enzime katalizálja, de a glukóz-6-foszfát oxidálódik is ebben az organellumban, amelynek a lokális redox homeosztázisban van fontos szerepe. A lipidanyagcsere több enzimrendszere az endoplazmás retikulum membránjához kapcsolódik: itt zajlik a koleszterin, a foszfolipidek és a trigliceridek szintézisének legtöbb lépése, itt jönnek létre a koleszterin acil-észterei, itt hosszabbodnak meg, illetve kapnak kettős kötéseket a zsírsavláncok, és itt történik azon módosítások javarésze, amelyek során a koleszterin epesavakká vagy szteroid hormonokká válik. Ez utóbbi folyamatok egyben a biotranszformáció első (ún. előkészítő) fázisához is tartoznak, amelynek legfontosabb enzimei, a citokróm P450 monooxigenázok az endoplazmás retikulum membránjának integráns fehérjéi. Ezek rendkívül változatos endogén, és exogén szubsztrátok (endobiotikumok, illetve xenobiotikumok) átalakítását végzik,
8
melyek közül a koleszterin csak egy – bár igen fontos – példa. A biotranszformáció első fázisához tartoznak a 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz izoenzimek is, amelyek a glukokortikoidok oxidoredukcióját, és ezáltal prereceptoriális aktiválását vagy inaktiválását katalizálják az endoplazmás retikulumban [Csala M. és mtsai. 2006]. A biotranszformáció második (un. konjugációs) fázisának legfontosabb enzimei, az UDPglukuronozil-transzferázok
szintén
az
endoplazmás
retikulum
integráns
membránfehérjéi. Ráadásul az ellentétes, dekonjugációs reakciók egy része is ehhez a kompartmenthez kötődik.
1.1.1. Kalciumhomeosztázis Bár az értekezés téziseihez nem kapcsolódik szorosan, kiemelendő az endoplazmás retikulum funkciói közül a sejtek kalciumhomeosztázisában, és ezen keresztül a külső ingerekre adott sejtszintű válasz kialakításában betöltött szerep. Az endoplazmás retikulum lumenében, az extracelluláris térhez hasonlóan, a citoplazmára jellemzőnél nagyjából
10000-szer
magasabb
a
kalciumion
koncentrációja.
Ez
aktív
transzportfolyamatnak, a kalcium-ATP-áz folyamatos működésének köszönhető. Nem csupán az itt tárolt Ca2+ mennyisége, hanem elsősorban annak szabályozott és gyors mobilizálhatósága teszi az endoplazmás retikulumot a legfontosabb intracelluláris kalciumraktárrá. Amikor a citoplazmában kalcium szignál alakul ki, azaz megemelkedik a szabad Ca2+ ion koncentrációja, ez együtt jár az ellentétes irányú változással az endoplazmás retikulum lumenében, hiszen a kalcium jelentős része innen származik. Az IP3-receptor Ca2+-csatornák (IP3R) a legkülönfélébb sejtek endoplazmás retikulum membránjában megtalálható, és különböző sejtfelszíni receptorokból kiinduló jelátviteli folyamatokban vesznek részt [Mikoshiba K. 2007]. A rianodin-receptor Ca2+-csatornák (RyR) pedig elsősorban a harántcsíkolt és szívizom, valamint a neuronok intracelluláris válaszreakcióinak kialakításában fontosak [Marks A. R. 1997]. Az
utóbbi
években
bizonyítékokat
találtak
az
endoplazmás
retikulum
kalciumhomeosztázisának Bcl-2 fehérjék általi szabályozására is. A proapoptotikus Bax és Bak endoplazmás retikulumba történő transzlokációja kalciumkiáramlást idéz elő [Zong W. X. és mtsai. 2003]. Nem kizárt, hogy a Bax és Bak által képzett csatorna közvetlen szerepet játszhat a folyamatban, de sok megfigyelés az IP3R közreműködését
9
támasztja alá. A Bcl-2 és Bcl-XL antiapoptotikus fehérjék gátolják az IP3R Ca2+csatornát. Ez a gátlás endoplazmás retikulum stressz esetén több okból is megszűnik. Egyrészt a Bcl-2/Bcl-XL és IP3R közti kapcsolatot megbontja az endoplazmás retikulumba lokalizált Bax és Bak, valamint a szintén itt található csak BH3 domént tartalmazó Bcl-2 fehérjék (pl. Bik és Bim). Másrészt a c-Jun N-terminális kináz (JNK) ilyenkor aktiválódik és foszforilálja a Bcl-2, amely nem csupán gátlódik, hanem ubikvitinálódik is, és lebomlik a proteaszómában [Szegezdi E. és mtsai. 2009].
1.1.2. Fehérjeszintézis és -érés A fehérjék egy része az endoplazmás retikulum felszínéhez kötött riboszómák segítségével szintetizálódik és szintézis közben transzlokálódik a lumenbe vagy a membránba. A lumenbe került fehérjék és fehérjedomének itt nyerik el natív konformációjukat, és itt történnek ko-, illetve poszttranszlációs módosulásaik. Végül egy részük itt is marad, többségük azonban vezikuláris transzporttal jut rendeltetési helyére, és útközben még további módosulásokon mehet keresztül.
1.1.2.1. Ko- és poszttranszlációs módosítások A transzlokon peptidcsatornán a lumenbe jutó fehérjét bizonyos enzimek már a szintézis közben átalakítják, és a folyamat addig tart, amíg a fehérje el nem éri végső natív konformációját. •
A szignál szekvenciát egy erre specializált peptidáz hasítja le.
•
A polipeptidláncot chaperonok veszik gondjaikba, és elősegítik a helyes hajtogatást.
•
Ahol a másodlagos szerkezet ezt megkívánja, a peptidil-prolil cisz-transzizomeráz enzim a megfelelő peptid kötéseket cisz konfigurációjúvá alakítja.
•
Egyes fehérjék prolil vagy lizil oldalláncai hidroxilálódnak.
•
Néhány fehérje glutamil oldalláncai γ-karboxilálódnak. A sajátos mechanizmusú karboxiláció a máj endoplazmás retikulumában zajló K-vitamin ciklus részét képezi, és a hemosztázis egyes fehérjéire jellemző.
10
•
Kialakulnak a láncon belüli, illetve láncok közötti diszulfid hidak.
•
A fehérjékhez oligoszacharid csoport kapcsolódik, így glikoproteinek jönnek létre
1.1.2.1.1. Az endoplazmás retikulum chaperon, foldáz és lektin fehérjéi Az intenzív fehérjeszintézis és -érés megkívánja, hogy az endoplazmás retikulumban nagy mennyiségben jelen legyenek
a
molekuláris
chaperonok
(dajkafehérjék), illetve a hajtogatást (foldingot) elősegítő fehérjék (foldázok). Ide tartoznak azok a – következő fejezetben tárgyalt – enzimek is, amelyek a diszulfid hidak kialakítását és izomerizációját katalizálják. Az endoplazmás retikulum számos klasszikus chaperont tartalmaz, amilyen a BiP (GRP78) [Haas I. G. és Wabl M. 1983], a GRP94 [Sorger P. K. és Pelham H. R. 1987] és a GRP170 [Lin H. Y. és mtsai. 1993]. Ezeknek a fehérjéknek és a később bemutatott proteindiszulfid-izomeráznak az expressziója glukózéhezésben vagy endoplazmás retikulum stresszben (amikor hibásan hajtogatott fehérjék halmozódnak fel a lumenben) megemelkedik, ami növeli az organellum fehérjeérlelő kapacitását [Szegezdi E. és mtsai. 2006]. Az endoplazmás retikulum két rendhagyó chaperonja a kalnexin [Bergeron J. J. és mtsai. 1994] és a kalretikulin [Michalak M. és mtsai. 1992]. A kalnexin integráns membránfehérje, amely nagy és kis affinitású Ca2+-kötőhelyekkel rendelkezik [Tjoelker L. W. és mtsai. 1994]. A kalretikulin szabad luminális fehérje hasonló Ca2+-kötő tulajdonságokkal [Ostwald T. J. és MacLennan D. H. 1974]. Mindkét fehérje lektinszerű tulajdonsággal rendelkezik, azaz képesek megkötni a monoglukozilált-Nglikoproteineket [Vassilakos A. és mtsai. 1998] (ld. minőségellenőrzésnél). Kémiai keresztkötéses vizsgálatok azt mutatják, hogy a kalnexin és a kalretikulin egy lazán összekapcsolt heterogén fehérjehálózat része, amelyben a BiP, a GRP94, és néhány egyéb endoplazmás retikulum fehérje is részt vesz [Tatu U. és Helenius A. 1997].
11
1.1.2.1.2. A diszulfid hidak kialakulása Az endoplazmás retikulum lumenében natív konformációjukat elért fehérjék harmadlagos és negyedleges szerkezetét rendszerint diszulfid hidak stabilizálják [Sevier C. S. és Kaiser C. A. 2002; Tu B. P. és Weissman J. S. 2004]. A diszulfid kötés a ciszteinil oldalláncok tiol csoportjainak oxidációjával (két hidrogén atom elvonásával) keletkezik. A lumenre általában jellemző a tiolok szempontjából oxidatív környezet, amely a fehérje tiol csoportjaihoz hasonlóan a glutationra is érvényes. A [glutation]:[glutationdiszulfid] ([GSH]:[GSSG]) arány itt 1-3:1, szemben a citoplazmára jellemző 30-100:1 értékkel [Bass R. és mtsai. 2004; Dixon B. M. és mtsai. 2008; Hwang C. és mtsai. 1992]. A proteindiszulfid-izomeráz (PDI) negyven évvel ezelőtti izolálása világított rá, hogy a fehérje diszulfidok létrejötte enzimatikus folyamat [Venetianer P. és Straub F. B. 1964; Venetianer P. és Straub F. B. 1965]. Ez az enzim képes katalizálni a tiolok oxidációját (diszulfidképződés), a diszulfidok redukcióját (diszulfidhasítás), valamint átrendeződését (diszulfidizomerizáció); sőt még chaperon funkcióval is bír. A PDI alapvető szerepét nyilvánvalóvá teszi, hogy az egyik legnagyobb mennyiségben előforduló enzim emlős és élesztő sejtek endoplazmás retikulumának lumenében; a sejt teljes fehérjetartalmának mintegy 0,8 %-át teszi ki [Freedman R. B. és mtsai. 1994]. Az 55 kDa-os fehérje C-terminális része típusos „endoplazmás retikulumban tartó” szignál szekvenciát hordoz. A PDI a tioredoxin szupercsalád tagja; az aktív enzim öt doménjéből négy ún. „tioredoxinszerű domén”. Az endoplazmás retikulum lumenében kimutattak más hasonló szerkezetű fehérjéket is, pl. ERp72 [Mazzarella R. A. és mtsai. 1990], P5 [Chaudhuri M. M. és mtsai. 1992], ERp57 (vagy ERp61) [Hirano N. és mtsai. 1994] stb., melyeknek feltehetőleg szintén szerepük van a diszulfid hidak képződésében és izomerizációjában.
1.1.2.1.3. Fehérjeglikoziláció Az endoplazmás retikulumban szintetizálódó fehérjék nagy része kovalensen kötött oligoszacharid láncokkal is kiegészül. A folyamat alapvető tulajdonságait már az 1980-
12
as években ismerték [Kornfeld R. és Kornfeld S. 1985], de valódi jelentőségére teljesen csak az elmúlt években derült fény. A 9-14 monoszacharid alegységből álló terjedelmes és erősen hidrofil jellegű struktúra jellemző módon N-glikozidos kötéssel kapcsolódik a polipeptid kitüntetett aszparaginil oldalláncainak amid csoportjához. Ez egyrészt segít a hajtogatódó fehérjét oldatban tartani, másrészt befolyásolja a natív konformációt azáltal, hogy az aszparagin közelében lévő aminosav-oldalláncokat a glikoprotein-víz határfelületre kényszeríti. Ráadásul az oligoszacharid lánc meghatározza a natív fehérjének az endoplazmás retikulum lektinjeihez való kötődését, ami tovább javítja a hajtogatás hatékonyságát, és lehetővé teszi a fehérjék minőségellenőrzését (ld. később).
1. ábra Emlős sejtekben a natív fehérjékre helyezett oligoszacharid (elsődleges glikán) szerkezete [Parodi A. J. 2000a] Glc: glukóz; Man: mannóz; GlcNac: N-acetil-glukózamin.
Az N-glikoziláció során először a membránban elhelyezkedő dolicholpirofoszfáthoz kötve egy tri-glukozilált Glc3Man9GlcNAc2 összetételű elsődleges glikán szintetizálódik (1. ábra), melynek szerkezete az evolúció során igen konzervatívnak bizonyult: emlős-, növény- és gombasejtekben megegyezik [Hubbard S. C. és Ivatt R. J. 1981]. Ez a csoport egy lépésben helyeződik át a lumenbe kerülő natív fehérjére [Burda P. és Aebi M. 1999] az oligoszacharil-transzferáz által katalizált reakcióban. A glikoziláció mindig olyan Asn-X-Ser/Thr (X: Pro kivételével bármilyen aminosav)
13
konszenzus szekvencián történik, amely 12-14 aminosav távolságra van a membrántól [Nilsson I. M. és von Heijne G. 1993] és lassan veszi fel másodlagos szerkezetét [Holst B. és mtsai. 1996]. Az oligoszacharil-transzferáz membránhoz kötött, nyolc alegységből álló enzim, amely szigorúan specifikus a tri-glukozilált struktúrára, holott a három perifériás glukóz az N-glikoprotein érése során lehasad. Az oligoszacharid lánc átalakítása a transzfer után azonnal megkezdődik (2. ábra). A perifériás glukózt egy membránhoz kötött α1,2-glukozidáz, a glukozidáz I távolítja el [Kornfeld R. és Kornfeld S. 1985], majd a két maradék glukózt egy két alegységből álló, szabad luminális α1,3-glukozidáz, a glukozidáz II hasítja le [Arendt C. W. és Ostergaard H. L. 1997; D'Alessio C. és mtsai. 1999; Trombetta E. S. és mtsai. 1996].
2. ábra Oligoszacharid-érés az endoplazmás retikulumban [Parodi A. J. 2000b] D: dolichol; G: glukóz; GI: glukozidáz I; GII: glukozidáz II; GNA: N-acetilglukózamin; GT: UDP-Glc:glikoprotein glukoziltranszferáz; M: mannóz; MI: mannozidáz I; MII: mannozidáz II; OT: oligoszacharil-transzferáz; Pr: protein.
14
Mindkét glukozidáz gátolható 1-deoxi-nojirimicinnel és az ebből származtatható kasztanosperminnel [Elbein A. D. 1991b]. Ezek a gátlószerek hatékonyan befolyásolják a glikoproteinek érését és minőségellenőrzését, aminek bizonyos esetekben előnyös következményei is lehet, ezért újabban potenciális antivirális és tumorellenes szereknek tekintik őket [Elbein A. D. 1991a], illetve felmerül alkalmazásuk bizonyos genetikai rendellenességek kezelésében is [Asano N. 2003]. A továbbiakban néhány mannóz is lehasadhat a fehérjéről, amit a mannozidáz I és II és egy még azonosítatlan mannozidáz katalizál [Weng S. és Spiro R. G. 1993]. Az említett reakciókon kívül az endoplazmás retikulumban már csupán egy reakció történik az N-glikoproteinek oligoszacharid láncával, mégpedig az átmeneti re-glukozidáció az UDP-Glc:glikoprotein glukozil-transzferáz közreműködésével [Trombetta S. E. és Parodi A. J. 1992] (ld. a minőségellenőrzésnél). Az N-glikoproteinek glikán csoportja további – itt nem részletezendő – változásokon megy keresztül a Golgi apparátusban, ahol további mannozidázok és Nacetil-glukózaminil-transzferázok találhatók [Herscovics A. 1999].
1.1.2.2. Minőségellenőrzés Az endoplazmás retikulumban összetett rendszer ügyel arra, hogy az újonnan szintetizált fehérjék ne haladhassanak tovább végső rendeltetési helyükre, amíg el nem nyerték
natív
konformációjukat.
Az
elsődleges
minőségellenőrzés
árulkodó
tulajdonságaik – mint a hozzáférhető hidrofób szakaszok, a szabad cisztein tiolok vagy az aggregációs tendencia – alapján ismeri fel az éretlen polipeptidláncokat. A Hsp70 család endoplazmás retikulumban működő tagja, a BiP (GRP78) „co-chaperon”-ok („DnaJ-like protein” és a „GRPE-like protein”) segítségével megköti és visszatartja az ilyen fehérjéket, amivel időt és segítséget ad nekik a konformáció kijavításához [Flynn G. C. és mtsai. 1989]. A folyamat során a BiP maga is szerkezeti változásokon megy át és ATP-t hidrolizál [Blond-Elguindi S. és mtsai. 1993]. A BiP dajkafehérje általános minőségellenőrző funkciója mellett számos egyéb protein is részt vesz az endoplazmás retikulum fehérjeérési folyamatainak kontrolljában.
15
3. ábra Minőségellenőrzés az endoplazmás retikulumban [Ellgaard L. és Helenius A. 2003] Az érett fehérjékről a glukozidáz II lehasítja az utolsó glukóz egységet, az éretlenekre az UDP-Glc:glikoprotein glukoziltranszferáz visszahelyezi. A monoglukozilált éretlen fehérjéket a kalretikulin (vagy kalnexin) köti, a deglukozilált érett fehérjék továbbhaladhatnak a szekréciós pályán. A kijavíthatatlan fehérjék a citoplazmában ubikvitinálódnak és lebomlanak. ER: endoplazmás retikulum; EDEM: „endoplasmic reticulum degradation-enhancing 1,2-mannosidase.like protein”; ERAD: „endoplasmic reticulum-associated protein degradation”.
16
Az egyik legjobban feltárt és részleteiben ismert elsődleges minőségellenőrző rendszer legfontosabb szereplői a glukozidáz II, az UDP-glukóz:glikoprotein glukoziltranszferáz, valamint a kalnexin és a kalretikulin (3. ábra) [Ruddock L. W. és Molinari M. 2006]. Az UDP-glukóz:glikoprotein glukoziltranszferáz felismeri és glukozilálja a hibásan hajtogatott fehérjéket, vagyis aktivitása következtében az ilyen visszatartandó és korrigálandó fehérjék mint monoglukozilált glikoproteinek meg vannak jelölve a lumenben. Az endoplazmás retikulum két lektinje, a kalnexin és a kalretikulin éppen az ilyen fehérjék oligoszacharid láncára specifikus, ezért az éretlen fehérjéket megköti. A kötés egyrészt megakadályozza a fehérje célbajuttatását, másrészt a lektinek chaperonként segítik a hajtogatást, harmadrészt a komplexhez társuló ERp57 igyekszik a megfelelő diszulfid hidakat kialakítani. A glukozidáz II azonban nem tesz különbséget
a
primer
glikán
visszamaradt
glukóz
egysége
és
az
UDP-
glukóz:glikoprotein glukoziltranszferáz által utólag felhelyezett glukóz között, tehát a fehérjét idővel megfosztja a jelzéstől. A glukózalegységétől a glukozidáz II által megfosztott (deglukozilált) fehérje leválik a lektinekről, vagyis a ciklus kezdődik elölről. Ha a fehérje már natív konformációjú, kilép a ciklusból, és távozhat az endoplazmás retikulumból is. Ha nem, akkor újra glukozilálódik, és a lektinek megint próbálkozhatnak a kijavításával (3. ábra) [Ellgaard L. és Helenius A. 2003]. Természetesen előfordul, hogy a fehérje hosszú próbálkozás ellenére sem képes helyesen hajtogatódni, és a sejtnek, illetve az endoplazmás retikulumnak le kell mondania róla. Az ilyen reménytelen fehérjéket az α-1,2-mannozidáz I enzim megfosztja az egyik perifériás mannóz egységüktől, ami kitéríti őket a glukozilációsdeglukozilációs ciklustól, mert megnöveli affinitásukat az EDEM („endoplasmic reticulum degradation-enhancing 1,2-mannosidase-like protein”) nevű lektinhez. A kalnexinhez és EDEM-hez egyaránt tartósan kötődő hibás fehérjék retrográd transzlokációval – feltehetőleg a transzlokon csatornán keresztül – visszajutnak a citoplazmába (3. ábra). Ezeket a kifelé jövő fehérjéket azonban rögtön ubikvitinálja az endoplazmás retikulum külső felszínén található ubikvitin-ligáz, így hamarosan a proteaszóma áldozatává esnek és lebomlanak [Meusser B. és mtsai. 2005]. A folyamat, melyet
összefoglalóan
ERAD-nak
(„endoplasmic
reticulum-associated
protein
degradation”) neveznek, nagyon fontos szerepet tölt be az endoplazmás retikulum
17
tehermentesítésében, amikor sok hibás konformációjú fehérje halmozódik fel a lumenben.
1.2. Az endoplazmás retikulum stressz Az endoplazmás retikulum működése szorosan kapcsolódik a sejt egészének tápanyagés oxigénellátásához, energia- és redoxstátuszához; és rendkívül érzékenyen reagál ezek változásaira. Ha valamely tényező akadályozza az organellum optimális működését, kialakul az endoplazmás retikulum stressz, amely közvetve vagy közvetlenül előidézi a fehérjeérés zavarát. A külső és/vagy belső környezet változásai könnyen felborítják a lumenbe kerülő fehérjék mennyisége és az organellum fehérjeérlelő kapacitása közötti dinamikus egyensúlyt. Az endoplazmás retikulumot érő legfontosabb stresszhatások a következők: •
Ca2+-homeosztázis megváltozása A luminális Ca2+-szintet csökkentő szerek például zavart okoznak a hibásan hajtogatott
polipeptideket
felismerő
fehérjék
működésében,
vagyis
a
minőségellenőrzésben. •
redox státusz változása A luminális tiol-diszulfid redox pár oxidáltsági állapotának eltolódása a diszulfid hidak képződését vagy a hibás diszulfid hidak izomerizációját akadályozza meg.
•
szénhidrát-anyagcsere változása A glukóz szintjének csökkenése a glikoproteinek érését gátolja (ráadásul a fehérjeérés és a minőségellenőrzés számos komponense maga is glikoprotein).
•
fehérjetúltermelés pl. vírussal fertőzött sejtben; Az endoplazmás retikulum stressz különböző okokra visszavezethető eseteiben
rendszerint megnő a „magára hagyott”, vagyis dajkafehérjék által nem kísért fehérjemolekulák száma az organellum lumenében. Ez pedig egy speciális adaptív mechanizmus, az „unfolded protein response” (UPR) aktiválódását váltja ki, mely a fehérjeszintézis és a foldingkapacitás felborult egyensúlyát hivatott helyrehozni. Az UPR négy legfontosabb eleme a következő: 1) az endoplazmás retikulum foldázainak és
18
chaperonjainak indukciója; 2) az endoplazmás retikulum méretének megnövelése a foszfolipidek és integráns fehérjék fokozott szintézisével; 3) a proteinszintézis általános gátlása mind transzkripciós, mind transzlációs szinten; 4) az ER-asszociált degradáció (ERAD) stimulálása. Ezek a változások elősegítik, hogy a hibásan hajtogatott fehérjék elérjék natív konformációjukat a lumenben, vagy onnan kijutva megsemmisüljenek.
1.2.1. Az UPR mechanizmusa Azok a fehérjék, amelyek képesek az endoplazmás retikulum stressz érzékelésére és az UPR beindítására, sok hasonlóságot mutatnak a plazma membrán hormon- vagy neurotranszmitter-receptoraival. Ezek is integráns membránfehérjék, melyeknek a citoplazmába nyúló doménje továbbítja azt a jelet, amelyet a luminális (az extracellulárissal analóg) domén érzékel. Fontos különbség azonban a plazmamembrán hormonreceptorai és az endoplazmás retikulum stressz „receptorai” között, hogy jelenlegi ismereteink szerint ez utóbbiak („inositol-requiring enzyme 1”: IRE1, „pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase”: PERK és „activating transcription factor 6”: ATF6) nem egy ligand kötődésekor, hanem egy fehérje leválásakor aktiválódnak. Az IRE1-et, a PERK-et és ATF6-ot a luminális doménjükhöz kötődő BiP (GRP78) chaperon tartja inaktív állapotban [Bertolotti A. és mtsai. 2000], és akkor szabadulnak fel a gátlás alól, ha a lumenben felhalmozódó éretlen vagy hibás konformációjú fehérjék miatt a BiP leválik róluk (4. ábra) [Mandl J. és mtsai. 2009; Szegezdi E. és mtsai. 2006]. Az IRE1 citoplazmai doménje Ser/Thr protein-kináz és RN-áz aktivitással rendelkezik. Ha a luminális dimerizációs doménjéről a BiP leválik, a fehérje dimerizálódik és autofoszforilálódik, majd egy mRNS-t hasít, amely így az sXBP1 („spliced X box-binding protein 1”) transzkripciós faktor szintéziséhez szolgálhat mintául. Az sXBP1 a DNS „UPR elemei”-hez kötődik, és indukálja többek között az endoplazmás retikulum chaperonjait (pl. BiP, PDI), valamint az ERAD és a foszfolipidszintézis komponenseit.
19
4. ábra Az UPR-ben aktiválódó legfontosabb jelpályák [Mandl J. és mtsai. 2009] A Grp78 (BiP) chaperon leválása aktiválja a PERK, ATF6 és IRE1 fehérjéket. Az eIF2α PERK általi foszforilációja csökkenti a fehérjeterhelést, és az ATF4 transzkripciós faktor szintézisének kedvez. Az ATF6 Golgiban történő hasítása aktív transzkripciós faktort szabadít fel. Az IRE1 által végrehajtott RNS-szerkesztés az XBP1 transzkripciós faktor szintézisének feltétele. Mindhárom mechanizmus az endoplazmás retikulum stressz leküzdéséhez vagy apoptózishoz vezető génexpressziós változásokat eredményez. ATF4 és 6: „activating transcription factor 4 and 6”; CHOP: „C/EBP homologous protein”; eIF2α: eukarióta (transzlációs) iniciációs faktor 2 alfa alegység; ER: endoplazmás retikulum; IRE1: „inositol-requiring enzyme 1”; JNK: c-Jun N-terminális kináz; PERK: „pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase”; (s)XBP1: „(spliced) X box-binding protein 1”.
Az ATF6 egyik Golgi-lokalizációs szekvenciáját a BiP takarja, ezért csak a BiP leválásakor jut a Golgi apparátusba, ahol proteolízissel szabadul fel a transzkripciós faktorként működő citoplazmai doménje. Az ATF6 transzkripciós faktor a DNS „ATF/CRE elemei”-hez, illetve „ER stress response” elemeihez kötődik, és ezáltal
20
indukálja az endoplazmás retikulum chaperonjait, a foszfolipidszintézis enzimeit, a CHOP/GADD153 („C/EBP homologous protein”/„growth-arrest- and DNA-damage inducible gene 153”) fehérjét (ld. 2.2.2. fejezet), és fokozza az XBP1 mRNS szintézisét is, amely az UPR felerősítését eredményezheti. A PERK az IRE1-hez hasonlóan dimerizálódik és autofoszforilálódik, amikor luminális doménje felszabadul. Az aktív PERK-dimer a transzláció egyik iniciációs faktorát (eIF2α) foszforilálja, ami – rendszerint az endoplazmás retikulum stresszre leghamarabb (néhány percen belül) kialakuló reakcióként – a fehérjeszintézis általános csökkenését eredményezi. A transzláció általános gátlása együtt jár bizonyos mRNS-ek fokozott transzlációjával, amennyiben azok megfelelő speciális olvasási kereteket („upstream open reading frames”; uORFs) tartalmaznak. Így pl. gyorsabban szintetizálódik
az
ATF4
transzkripciós
faktor,
amely
egyebek
között
a
CHOP/GADD153, a GADD34 („growth-arrest- and DNA-damage inducible gene 34”) és az ATF3 („activating transcription factor 3”) fehérjéket indukálja. Érdekes, hogy a GADD34, mint a protein-foszfatáz-1 szabályozó alegysége az eIF2α defoszforilációját, vagyis az UPR lecsengését segíti elő.
1.2.2. Az endoplazmás retikulum stressz által indukált apoptózis A programozott sejthalál (apoptózis) lépései szigorúan meghatározott sorrendben történnek, amely során a sejtmag anyagai kondenzálódnak, fragmentálódnak és a citoplazma összezsugorodik. Az organellumok épen maradnak ugyan, de a citoszkeleton lebomlik, és a sejt elveszti kapcsolatát a szomszédos sejtekkel. A sejtmembrán foszfatidil-szerin molekulái az extracelluláris oldalra fordulnak ki, de a membrán megőrzi integritását. Lefűződései során ún. apoptotikus testek jönnek létre, melyeket a környező makrofágok és más fagocita sejtek kebeleznek be. Az apoptózisnak kezdetben csak két lehetséges útvonalát tartották számon, ahonnan kiindulhatnak azok a jelátviteli útvonalak, melyek sejthalált idéznek elő („extrinsic” útvonal a sejtmembrántól és „intrinsic” útvonal a mitokondriumból). Az elmúlt évek kutatásai azonban kiderítették, hogy szinte mindegyik sejtorganellumból kiindulhat
olyan
jelátviteli
mechanizmus,
amely
apoptózishoz
vezethet.
A
sejtorganellumok képesek érzékelni a környezetükben bekövetkező változásokat, és
21
megpróbálnak alkalmazkodni az új helyzethez/stresszhez. Ha a változás elér egy kritikus küszöböt, melyhez az organellum és a sejt már nem képes alkalmazkodni, szükségessé válik a sejt halála.
5. ábra Az endoplazmás retikulum eredetű apoptózis [Schroder M. és Kaufman R. J. 2005] A hasított ATF6 és az ATF4 transzkripciós faktorok a Bcl-2 antiapoptotikus fehérjét gátló CHOP (GADD153) indukciója révén váltanak ki apoptózist. Az endoplazmás retikulumból a különböző Bcl-2 fehérjék közreműködésével – részben az IP3-receptor Ca2+-csatornán keresztül – kiáramló kalcium a mitokondriumra hatva, valamint a kalpain aktiválásával segíti az apoptózis kialakulását. A kalpain rágcsálókban a prokaszpáz-12 (emberben valószínűleg a prokaszpáz-4) hasításával indítja be a kaszpázkaszkádot. Az ASK1 kináz a c-Jun N-terminális kinázt aktiválva fokozza a sejt apoptóziskészségét. ATF4 és 6: „activating transcription factor 4 and 6”; ASK1: „apoptosis signalregulating kinase”; CHOP: „C/EBP homologous protein”; IRE1: „inositol-requiring enzyme 1”; JNK: c-Jun N-terminális kináz; pC-12: prokaszpáz-12; PERK: „pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase”; TRAF2: „TNF-receptor-associated factor 2”.
Az endoplazmás retikulum stressz éppen olyan súlyos működési zavart és vészhelyzetet jelent a sejt számára, mint a DNS halmozott károsodása vagy az ATP-
22
termelés elégtelensége. Nem meglepő tehát, hogy a sejt eltávolítására ilyenkor is szükség lehet, vagyis az endoplazmás retikulum stressz is kiválthatja, illetve támogathatja az apoptózist (5. ábra) [Schroder M. és Kaufman R. J. 2005; Schroder M. és Kaufman R. J. 2006; Szegezdi E. és mtsai. 2006]. Az UPR mechanizmusánál említett CHOP/GADD153 transzkripciós faktor az apoptózis klasszikus „intrinsic” aktiválásában kulcsszerepet játszó Bax és Bak proapoptotikus fehérjék termelését fokozza, míg az ezeket gátló Bcl-2 antiapoptotikus fehérje termelését csökkenti. A Bak és Bax fehérjék az endoplazmás retikulum membránjába transzlokálódnak, és azt átjárhatóvá teszik Ca2+ ionok számára. A citoplazma
tartósan
emelkedett
kalciumkoncentrációja
egyrészt
a
kalpain
aktiválódásához, másrészt a mitokondriális elektrokémiai grádiens összeomlásához vezet. A kalpain közvetlenül a prokaszpáz-12 – illetve emberben valószínűleg a prokaszpáz-4 – hasítása által, míg a mitokondriális stressz az „intrinsic” útvonal révén indítja be az apoptotikus kaszkádot. Emellett az endoplazmás retikulum stresszben aktiválódó IRE1 a TRAF2 („TNF-receptor-associated factor 2”) és az ASK1 („apoptosis signal-regulating kinase”) közreműködésével a JNK-t (c-Jun N-terminális kináz) aktiválja, ami szintén apoptózishoz vezethet.
1.3. A tea mint gyógynövény A tea, különösen a zöld tea, jótékony egészségügyi hatásara az utóbbi 20-30 évben figyeltek fel. A távol-keleti országokban főleg Koreában, Japánban, Kínában meglehetősen alacsony a különböző rákos megbetegedések, valamint szív- és érrendszeri betegségek előfordulási gyakorisága, annak ellenére, hogy ezekben az országokban a dohányzás mértéke nagyon magas. Ezt a jelenséget „Ázsia Paradoxonnak” nevezték el [Sumpio B. E. és mtsai. 2006]. A leginkább elfogadott hipotézis szerint az itteni lakosság a rendszeresen fogyasztott zöld teának köszönheti jó egészségi állapotát. A teakészítés története és az ehhez kapcsolódó hagyományok több évezredre nyúlnak vissza, ezért nem véletlen hogy a tea a víz után a második legkedveltebb és leginkább fogyasztott ital. A tea ital alapanyaga, a magyarul teacserje néven ismert
23
örökzöld növény a Camellia sinensis, amely rendszertanilag a Theaceae családba tartozik. A teanövény szerveiben található anyagok (polifenolok, aminosavak, ásványi anyagok stb.) mennyisége nagymértékben függ attól, hogy a teanövény milyen éghajlattal bíró területről származik (napsugárzás, vízellátottság), mely évszakban szedték, illetve milyen kertművelést alkalmaztak (tápanyagok) [Forrest G. I. 1969; Yao L. és mtsai. 2005]. A feldolgozás első lépéseként fonnyasztják a növényi részeket, majd sodorják, illetve csavarják a leveleket, így a növényi sejtfalak felszakadnak és a nedvek érintkezésbe lépnek a levegővel. Az úgynevezett fermentálás során a tea összetevői nem kerülnek mikrobiális lebontásra, hanem növényi enzimek végzik átalakításukat. Legjelentősebb ezek közül a polifenol-oxidáz, amely a tea polifenolok B gyűrűjét alakítja
át
[Graham
H.
N.
1992].
A
fermentáció
során
az
egyszerű
polifenolokból/katekinekből kinonok keletkeznek és ezek egymással reagálva teaflavinokat és tearubigineket alkotnak. Végül szárítással a víztartalmat 60 %-ról 4 % százalék alá csökkentik, így az enzimek inaktiválódnak. A feldolgozás módjai szerint három fő teatípust különböztethetünk meg: a nem-fermentált (zöld), a részlegesen fermentált (oolong és sárga) és a fermentált (fekete és vörös) teákat.
1.3.1. A tea hatóanyagai A szárított tealevél a növényi rostokon kívül fehérjéket, aminosavakat, szénhidrátokat, lipideket, vitaminokat és pigmenteket is tartalmaz, de ásványi anyagok és nyomelemek, mint például a fluor, az alumínium, a króm, a réz és a szelén is jelentős mennyiségben találhatók benne. Emellett a tea alkotóelemeinek egyik fő csoportját a polifenolok oxidált és redukált formái alkotják. A polifenolok olyan kémiai vegyületek, melyek több mint egy fenol csoporttal rendelkeznek és általában a növények jellegzetes színét adják. Négy csoportra oszthatók fel; flavonoidokra, antocianidokra, proantocianidokra és xantinokra. A teapolifenolok a flavonoidok csoportjába tartoznak, melyekre a C6-C3-C6 alapszénváz jellemző, vagyis a két benzolgyűrűt (A és B gyűrű) egy oxigénatomot is tartalmazó heterociklusos gyűrű (C gyűrű) kapcsolja össze. Az alapváz 3-as 5-ös és 7-es szénatomján leggyakrabban
24
hidroxil csoportok találhatók (6. ábra) [Forrest G. I. és Bendall D. S. 1969; Wang Y. és Ho C. T. 2009].
6. ábra A táplálékban található flavonoidok általános szerkezete Az 1. táblázat mutatja az egyes alosztályokra jellemző szerkezeti sajátosságokat. Az R3’ és R5’ az egyes típusokon belül is változó.
A
flavonoidokon
belül
megkülönböztetünk
flavanolokat,
flavonokat,
flavonolokat, flavanonokat, izoflavonokat és antocianidineket (1. táblázat) [Silva M. M. és mtsai. 2002]. Emellett még meg kell említeni a teaflavinokat, melyek az egyszerű katekinek polimerizált változatai, mint a teaubigin és a teaflavin. Ezen vegyületek nagy része megtalálható a tealevélben is. A teanövény fejlődése és a különböző teafajták készítése során alkalmazott eljárások következtében legnagyobb katekin/epikatekin tartalma a kifejlett, nagyobb és idősebb levelekből készített zöld teának van. Majd ezt követi a fiatalabb levelekből készült zöld tea és a részlegesen fermentált oolong tea [Lin Y. S. és mtsai. 2003; Yang D. J. és mtsai. 2007]. Végül a legalacsonyabb katekin tartalommal a vörös és fekete teák rendelkeznek, de ez a mennyiség még mindig magas a többi élelmiszerhez viszonyítva. A zöld teában a flavonoidok 80 %-a katekin/epikatekin, míg ez a fekete tea esetében csak 20-30 %. A zöld tea számos katekinje közül a legfontosabb, az epigallokatekin-3-gallát (EGCG), ami a teában található összes katekin 59 %-át, az
25
epigallokatekin (EGC) a 19 %-át, az epikatekin-3-gallát (ECG) a 13 %-át és az epikatekin (EC) a 6,5 %-át adja [Graham H. N. 1992].
Flavonoid alosztály
B-gyűrű kötése a C-hez
Funkciós Kettős csoportok kötés a Ca Cgyűrűben gyűrűn 3-hidroxil
Flavanolok
2
Nincs 3-O-gallát
Flavanonok
Flavonok
2
2
Nincs
2-3
4-oxo
4-oxo
Izoflavonok
3
2-3
4-oxo
Flavonolok
2
2-3
3-hidroxil 4-oxo
Antocianidinek
2
1-2, 3-4
3-hidroxil
Legismertebb képviselői katekin gallokatekin epikatekin-gallát epigallokatekin-gallát eriodiktiol hesperetin naringenin apigenin luteolin daidzein genistein glicitein biokanin A formononentin izorhamnetin kaempferol miricetin quercetin cianidin delfinidin malvidin pelargonidin petunidin peonidin
Forrásul szolgáló táplálék tea, kékszőlő, vörösbor citrusfélék zöld leveles fűszernövények, pl. petrezselyem szója, hüvelyesek
szinte minden táplálék
vörös, lila és kék bogyós gyümölcsök
1. táblázat A táplálékban található flavonoidok alosztályai és jellegzetességeik A 6. ábra mutatja a táplálékban található flavonoidok általános szerkezetét.
1.3.2. Az EGCG eddig ismert tumorgátló hatásai A teafogyasztás és a daganatok kialakulásának kockázata közt megfigyelt fordított korreláció, amely a tea hatóanyagainak tumormegelőző hatására utal, ráirányította a kutatók figyelmét a teaflavanolokra. A vizsgálatok számos támadáspontot azonosítottak,
26
ahol a katekinek megelőzhetik a daganatképződést, vagy akár akadályozhatják a tumornövekedést és áttétképződést [Butt M. S. és Sultan M. T. 2009].
Antioxidáns hatás Az EGCG C- és E-vitaminét felülmúló antioxidáns hatása több mechanizmus révén is érvényesül. Polihidroxi-vegyület lévén képes kelátot képezni a szabad fémionokkal, így megakadályozva, hogy azok szabadgyököket generáljanak. Emellett a flavanolok láncmegszakító közvetlen antioxidánsként is funkcionálnak, mivel hatékonyan csapdába ejtik az alkil-peroxil, szuperoxid és hidroperoxil gyököket. A B benzol-gyűrűn található fenolos hidroxil csoportok könnyen oxidálhatók gyökök általi egy-elektronos reakcióval. A második ilyen oxidációs lépés stabil kinont képez, mellyel a gyökös láncreakció terminálódik [Nanjo F. és mtsai. 1999; Pillai S. P. és mtsai. 1999]. Ráadásul az EGCG csökkenti bizonyos prooxidáns enzimek (lipoxigenáz, ciklooxigenáz és xantin-oxidáz) aktivitását, valamint fokozza néhány antioxidáns enzimét (glutation-Stranszferáz és szuperoxid-dizmutáz) [Frei B. és Higdon J. V. 2003; Hong J. és mtsai. 2001].
Sejtvándorlás, migráció gátlása Az extracelluláris mátrix fehérjéinek bontása fontos szerepet játszik a metasztázisok képződésében. A kollagént, elasztint és más kötőszöveti elemeket hasító mátrix metalloproteinázok (MMP) a plazminnal kölcsönösen aktiválni képesek egymást. A tumorsejtek ezt az proteázaktivációs ciklust plazminogénaktivátorok, elsősorban az urokináz típusú plazminogén-aktivátor (uPA), termelésével segítik elő. Az EGCG az uPA aktivitását és a pro-MMP hasítását egyaránt gátolja, így csökkenti a daganatsejtek szóródásának kockázatát [Ho Y. C. és mtsai. 2007; Kim M. H. és mtsai. 2004].
Proliferáció, sejtciklus gátlása Az EGCG akadályozza a receptor tirozin-kináz jelátviteli útvonalak működését, elsősorban
azáltal,
hogy
gátolja
a
tirozinfoszforilációt,
vagy
csökkenti
a
receptorfehérjék termelődését [Shimizu M. és Weinstein I. B. 2005]. Különböző humán sejtvonalakon kimutatták, hogy az EGCG (30-50 µM) növeli a p21 és p27 mennyiségét,
27
így megakadályozva az Rb fehérje hiperfoszforilációját, egyben a sejtproliferációt is [Liang Y. C. és mtsai. 1999]. A hatás korrelált a p53 transzkripciós faktor fokozott aktivitásával. Kimutatták, hogy EGCG hatására csökken a sejtciklus beindulásában kulcsszerepet játszó ciklin D1 és cdk2 termelődése [Liang Y. C. és mtsai. 1999; Nihal M. és mtsai. 2005]. Számos kísérletsorozatban a telomeráz csökkent aktivitását észlelték az EGCG-vel kezelt daganatsejtekben, és ezzel magyarázták a tumornövekedés jelentős gátlását [Mittal A. és mtsai. 2004; Naasani I. és mtsai. 1998; Sadava D. és mtsai. 2007; Wang X. és mtsai. 2009].
Antiangiogenikus hatás Néhány mm-nél nagyobb daganatok esetében elengedhetetlen az új vérerek képzése. A kapillárisoktól távolabb került tumorsejtekben a rossz oxigénellátás hatására csökken a hipoxia által indukált faktor 1 (HIF1) fehérje hidroxilációja és ubikvitinációja, így megnő a mennyisége. Ez transzkripciós szinten fokozza a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) termelődését és szekrécióját. A VEGF pedig tirozin-kináz receptoron keresztül stimulálja az érnövekedést. A teakivonatok és az EGCG antiangiogenikus hatását különböző daganatokban megfigyelték. Humán és egér tumorsejtvonalakat vizsgálva azt találták, hogy az EGCG akadályozza a HIF1 felhalmozódását hipoxiában, és jelentősen csökkenti a VEGF expresszióját [Lin S. K. és mtsai. 2008; Xu H. és mtsai. 2009; Zhang Q. és mtsai. 2006].
Proapoptotikus hatás Különböző humán sejtvonalban az EGCG (80 µM) számos egyéb hatás mellett gátolta az antiapoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL expresszióját, valamint indukálta a proapoptotikus Bax, Bak, Bcl-XS, illetve PUMA fehérjéket [Shankar S. és mtsai. 2007]. Humán prosztata karcinoma sejteken EGCG (40-80 µM) hatására a p53 fehérje szintjének és aktivitásának emelkedését észlelték [Hastak K. és mtsai. 2005; Hastak K. és mtsai. 2003]. A p53 transzkripciós szintű indukcióját támasztották alá a p53promoterrel végzett riporter génes vizsgálatok [Yamauchi R. és mtsai. 2009]. A p53 negatív regulátorának, a HDM2-nek EGCG-kezelés hatására csökkent a mennyisége. Ráadásul a p14ARF (egérben p19ARF) fehérje szintje növekedett, ami HDM2 gátlásán
28
keresztül akadályozza a p53-HDM2 komplex kialakulását, így hozzájárul a p53 mennyiségének és aktivitásának fokozásához [Hastak K. és mtsai. 2003; Vangestel C. és mtsai. 2009; Westwell A. D. 2006]. Emellett EGCG-kezelés serkentette a p53 transzaktivációs doménjében található szerin-oldalláncok foszforilációját, ami a transzkripciós faktor aktiválásában jelentős szerepet játszik [Hastak K. és mtsai. 2003; Qin J. és mtsai. 2008]. A p53 által indukálódó apoptózis-regulátor fehérjék mennyiségét is tanulmányozták, és azt tapasztalták, hogy csökkent a Bcl-2, és nőtt a Bax mennyisége [Hastak K. és mtsai. 2003]. A Bax és Bak kettős KO egérből származó embrionális fibroblaszt sejtek ellenállóbbak voltak az EGCG (40 µM) által indukált apoptózissal szemben, mint a normális és részlegesen génkiütött fibroblaszt sejtek [Shankar S. és mtsai. 2007]. Az EGCG-vel kezelt p53-/- mutáns sejtekben sem a p21, sem a Bax indukciója nem volt számottevő, ami jól mutatja a p53 szerepét ebben a mechanizmusban [Hastak K. és mtsai. 2005]. Az EGCG sokrétű tumorellenes hatásai közül az apoptózis fokozása különösen fontos, hiszen ez a már létrejött daganatsejtek pusztulását idézheti elő. A proapoptotikus aktivitás mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, és nem zárható ki a szubcelluláris organellumokból kiinduló jelpályák meghatározó jelentősége sem. Ennek tisztázása azonban további kutatást igényel.
29
2. Célkitűzések A teaflavanolok tumorellenes hatásai több mechanizmus révén, és feltehetőleg több támadásponton keresztül érvényesülnek. A daganatsejtek fokozott apoptózisának hátterében az endoplazmás retikulum funkciózavara is állhat, amennyiben az éretlen fehérjék luminális akkumulációja aktiválja az UPR-nek nevezett komplex jelátviteli hálózatot. Hipotézisünk szerint a teaflavanolok az endoplazmás retikulum fehérjeérési és minőségellenőrzési folyamatait befolyásolva, endoplazmás retikulum stresszt okoznak, és az organellumból kiinduló proapoptotikus mechanizmusok hozzájárulnak a daganatsejtek pusztulásához. A kutatás célja tehát annak kiderítése volt, hogy az endoplazmás retikulumban zajló fehérjeérés zavara, illetve az UPR szerepet játszhat-e a teaflavanolok tumorellenes hatásában. Miután az alapkérdésre választ kaptunk, további vizsgálatokat folytattunk, hogy azonosítsuk a flavanolok támadáspontját az endoplazmás retikulumban. Az alábbi kérdéseket kívántuk megválaszolni. -
Kimutathatók-e az endoplazmás retikulum stressz és az UPR jelei az EGCG-vel kezelt tumorsejteken? Aktiválódnak-e az UPR stresszválasz proapoptotikus komponensei? Miután
a
tervezett
kísérletekhez
kiválasztott
hepatóma
sejtekben
megbizonyosodtunk az EGCG apoptózisindukáló hatása felől, megvizsgáltuk az endoplazmás retikulum chaperonjainak és foldázainak expresszióját, az eIF2 foszforilációját és az endoplazmás retikulum morfológiai változásait mint az UPR jellegzetes összetevőit. Ezek mellett a proapoptotikus komponenseket, vagyis a CHOP indukcióját, a prokaszpáz-12 hasítását, valamint az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak deplécióját tanulmányoztuk, melyek a hipotézis szempontjából döntő jelentőséggel bírnak. -
Gátolja-e az EGCG – illetve egyéb teaflavanolok – az endoplazmás retikulumban zajló fehérjeérés és minőségellenőrzés kulcsszereplőjét, a glukozidáz II enzimet? A glukozidáz II aktivitását mesterséges szubsztrátok alkalmazásával mértük a hepatóma sejtekben és patkány máj mikroszómán. Miután az EGCG glukozidáz
30
II enzimre gyakorolt gátló hatását hepatóma sejteken kimutattuk, a hatást máj mikroszómában jellemeztük. Megvizsgáltuk annak koncentrációfüggését és a kinetikai paraméterek változása alapján azonosítottuk a gátlás típusát. Végül méréseket végeztünk, hogy kiszámítsuk a legfontosabb teaflavanolok, illetve egy szintetikus gallát-származék glukozidáz II gátló hatásának IC50 és Ki értékeit, majd ezeket összehasonlítottuk a glukozidáz enzimek ismert gátlószerére vonatkozó adatokkal, hogy képet kapjunk a polifenolok hatékonyságáról.
31
3. Módszerek
3.1. Az ER stressz és apoptózis vizsgálatához alkalmazott módszerek
3.1.1. Sejtkultúra tenyésztése A
Hepa1c1c7
egér
hepatóma
antibiotikum/antimikotikum
oldatot
sejtvonal és
tenyésztése
2mM
10
L-glutamint
%
FBS-t,
tartalmazó
1
%
α-MEM
médiumban történt 37°C-on, 5 % CO2 koncenráció mellett, 10 cm átmérőjű szövettenyésztő flaskákban. Amikor a sejteket EGCG-vel kezeltük, a hatóanyagot a tenyésztő médiumban oldottuk fel, és 100-szoros hígulással adtuk a 70-80 %-os konfluenciát elért tenyészethez.
3.1.2. Az apoptózis vizsgálata Apoptózis során a foszfatidil-szerin kihelyeződése a plazmamembrán külső felszínére hamarabb bekövetkezik, mint a DNS-károsodás. Az annexin V nagy affinitással kötődik a membrán külső felszínén helyet foglaló foszfatidil-szerinhez. A fluoreszcein izotiocianáttal (FITC) jelzett annexin V (annexin V-FITC) tehát kitűnő indikátor, mellyel az apoptózis már korai szakaszában is jól észlelhető. A nekrózis kimutatására szolgáló propidium-jodid a kettős szálú DNS-t festi meg, ha a sejtmembrán, illetve a magmembrán már megfelelő mértékben károsodott ahhoz, hogy a festék elérje a DNS-t. A Hepa1c1c7 sejtvonalat 6-lyukú sejttenyésztő edényekben, Bürker-kamrára illeszthető steril fedőlemezeken tenyésztettük. 70 %-os konfluencia elérése után a médium leszívása, majd a sejtek PBS-sel történt mosása után a fedőlemezeken lévő sejtekre rámértük a 2 % annexin V-FITC-et és 2 % propidium-jodidot tartalmazó festéket (Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche). 15 perces, szobahőn történt inkubálás után az így megfestett sejteket tartalmazó fedőlemezt Bürker-kamrára illesztettük, és az annexinnel zöldre festődött apoptotikus, valamint a propidiumjodiddal
pirosra
festődött
nekrotikus
sejteket
32
fluoreszcens
mikroszkóp
alatt
megszámoltuk. Az annexinnel és propidium-jodiddal egyaránt festődött sejteket – mely jellemző lehet az apoptózis késői, de a nekrózis korai fázisára is – morfológiai jellegzetességek alapján soroltuk be az apoptotikus vagy a nekrotikus sejtek csoportjába. Miután a különböző színű sejteket a mikroszkóp alatt megszámoltuk, meghatároztuk az apoptózis indexet, vagyis a 100 sejtre jutó apoptotikus sejtek/testek számát.
3.1.3. Sejtlizátum készítése A teljes konfluencia elérése után a sejtekről eltávolítottuk a médiumot, majd egyszeri PBS-sel történő mosást követően a sejteket tartalmazó flaskában 200 µl frissen elkészített lizáló puffert oszlattunk el egyenletesen. (A lizáló puffer összetétele: 250 mM NaCl, 50 mM HEPES-Na pH 7,4, 1 mM EDTA-Na, 1 mM EGTA-Na, 1,5 mM MgCl2, 0,1 % Nonidet-P-40, 1 % proteáz-inhibitor koktél, 1 mM PMSF, 10 mM benzamidin, 20 mM NaF, 1 mM para-nitrofenil-foszfát.) A sejteket a lízis során végig jégen tartottuk. A lizáló pufferrel történt 1-2 perces inkubációt követően a sejteket „scraper”-rel begyűjtöttük a flaska aljáról, majd intenzív szuszpendálás és ultrahangos sejtfeltárás után az így nyert lizátumot centrifugáltuk (10 perc, 10000 x g, 4 °C). A felülúszót felhasználásig fagyasztóban tároltuk. A sejtlizátumok fehérjekoncentrációját Bio-Rad reagenssel, marha-szérumalbumin „standard”-del határoztuk meg.
3.1.4. Western blot analízis Az egyes stresszfehérjék expresszióját Western blottal vizsgáltuk. A Western blot mérésekhez szükséges mintákat β-merkaptoetanolt tartalmazó mintapufferben 10 perces 95°C-on történő inkubálással állítottuk elő. Az analízishez egyenlő mennyiségű (20 μg) fehérjét vittünk fel a gélre. A polipeptid láncok méret szerinti elválasztása 9 %-os redukáló SDS poliakrilamid gélen történt. Ezután a fehérjéket elektro-blot készülékkel transzferáltuk nitrocellulóz vagy PVDF membránra (60 perc, 100 V). Az egyes minták fehérjemennyiségét – ellenőrzésképpen – Ponceau-vörös festés után denzitometriás analízissel hasonlítottuk össze. Az egyes fehérjék immun-detektálásához felhasznált elsődleges antitestek: kaszpáz12 – kaszpáz12 elleni monoklonális patkány antitest;
33
CHOP – CHOP elleni monoklonális egér antitest; GRP94 – GRP94 elleni poliklonális nyúl antitest; GRP78 – GRP78 elleni poliklonális kecske antitest; PDI – PDI elleni poliklonális nyúl antitest; ERP72 – ERP72 elleni poliklonális nyúl antitest; kalnexin – kalnexin elleni poliklonális nyúl antitest; eIF2α – eIF2α elleni polilklonális nyúl antitest; eIF2αP – eIF2αP elleni poliklonális nyúl antitest. A felhasznált másodlagos antitestek tormaperoxidáz-konjugált nyúl és kecske Ig elleni antitestek voltak. Mindegyik fehérje esetében az elvárt molekulasúlynál kaptunk jelet.
3.1.5. Az endoplazmás retikulum morfológiájának vizsgálata A hepatóma sejtek endoplazmás retikulumának morfológiáját Nikon S Fluor40X vagy Planapo100X objektívvel, a FITC-szűrőkészlettel és Photometrics Cool SNAP HQ CCD kamerával felszerelt Nikon Eclipse TE300 mikroszkóppal tanulmányoztuk. A készüléket MetaMorph, Meta Imaging SeriesTM program segítségével vezéreltük. Az endoplazmás retikulumot fluoreszcens jelöléssel tettük láthatóvá; ehhez 0,1 μM BODIPY® FL tapszigargint [Ong H. L. és mtsai. 2007] használtunk. A tapszigargin specifikusan kötődik a szarko/endoplazmás retikulum kalcium-ATP-ázához, és gátolja az aktív kalciumtranszportot. A képeket a BODIPY® FL tapszigargin hozzáadása után két percen belül rögzítettük, hogy megelőzzük a jelölés hatására kialakuló kalciumdepléció indukálta esetleges morfológiai változásokat.
3.1.6. Az endoplazmás retikulum kalciumtartalmának vizsgálata Az endoplazmás retikulumban tárolt kalcium mennyiségét indirekt módon, a citoplazma szabad kalciumkoncentrációjának változását detektálva tanulmányoztuk. Azt vizsgáltuk, mennyi kalciumot tudunk felszabadítani tapszigarginnal az endoplazmás retikulumból. Ehhez fluoreszcens kalcium-indikátort és mikroszkópot használtunk. A kontroll és EGCG-vel kezelt hepatóma sejteket 3 µM Fluo-3 acetoximetil észterrel inkubáltuk 30 percig 37 °C-on [Gamberucci A. és mtsai. 2004]. Az így Fluo-3-mal feltöltött sejteket 25 °C-on Krebs pufferben (140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 15 mM HEPES pH 7,4) tartottuk. Az intracelluláris Fluo-3 kiszivárgásának megelőzésére
34
100 µM szulfinpirazont adtunk az oldathoz [Di Virgilio F. és mtsai. 1988], miután ellenőriztük, hogy a szulfinpirazon nem befolyásolja a mérési eredményeket. A sejtekhez tapszigargint (1 μM) vagy EGCG-t (10-100 μM) adtunk, majd fluoreszcens mikroszkópiával (készülék leírását ld. az előző fejezetben) MetaFluor, Meta Imaging SeriesTM program felhasználásával követtük a citoplazmatikus kalciumszintek változását. Minden mérés végén a legnagyobb és legkisebb fluoreszcencia kalibrálásához ionomicint (10 μM) és CaCl2-t (10 mM), majd EGTA-t (20 mM) adtunk az elegyhez.
3.2. Az enzimaktivitás méréséhez alkalmazott módszerek
3.2.1. Glukozidáz II enzim aktivitásának mérése hepatóma sejteken Az intakt és permeabilizált Hepa1c1c7 sejtekhez a glukozidáz II mesterséges szubsztrátját, metilumbelliferil-glukozidot (MUG) adtunk, és az enzimaktivitást a hidrolízis során felszabaduló metil-umbelliferon mennyisége alapján határoztuk meg. A konfluens sejteket tripszinnel választottuk le a flaskáról, majd sejtszámlálással 107 sejt/ml „koncentrációjú” szuszpenziót hoztunk létre, és azt két aliquotra osztottuk. Az egyiket pórusképző antibiotikummal, alameticinnel [He K. és mtsai. 1995; Woolley G. A. és Wallace B. A. 1992] inkubáltuk (0,2 mg/ml, 37 ºC, 5 perc), így permeabilizálva a sejtek membránjait. A másikat ugyanilyen körülmények között alameticin nélkül tartottuk. Ezután centrifugáltuk (250 x g, 4 perc) és PBS-sel mostuk a sejteket. Végül szérummentes α-MEM médiumban 5 x 106 sejt/ml sejtsűrűségű szuszpenziókat hoztunk létre, melyeket 0-12 óráig előinkubáltunk EGCG (100 μM) jelenlétében vagy anélkül. A reakciót 50 μM koncentrációjú MUG hozzáadásával indítottuk, és a 0, 15, 30, illetve 45 perc elteltével levett mintákat kétszeres térfogatnyi jéghideg metanolhoz kevertük, majd -20 ºC-on tároltuk. Később a mintákat felolvasztottuk, majd lecentrifugáltuk (10 percig 4°C-on 20000 × g) és a fehérjementes felülúszó metil-umbelliferon-tartalmát HPLC-vel határoztuk meg.
35
3.2.2. Mikroszómapreparálás A mikroszómát egy éjszakán át éheztetett hím Wistar patkányok (180-230 g) májából preparáltuk. A frissen kivett májat apró darabokra vágtuk és 0,3 M szaharózt és 20 mM HEPES-t (pH 7,0) tartalmazó szaharóz-HEPES pufferbe tettük és Potter-Elvehjem homogenizátorral egyenletes szuszpenziót készítettünk. Majd a szuszpenziót szacharózHEPES pufferrel 20 %-os „koncentrációig” hígítottuk, centrifugacsövekbe töltöttük és lecentrifugáltuk (1000 x g, 10 perc, 4 °C). A felülúszót tovább centrifugáltuk (11000 × g, 20 perc, 4 °C). Az így nyert üledék a mitokondriális frakciót tartalmazta, a keletkezett felülúszó pedig a sejtek citoplazmáját. Az üledéket ezután MOPS pufferben (100 mM KCl, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 20 mM MOPS, pH 7,20) szuszpendáltuk, majd újból lecentrifugáltuk (100000 × g, 60 perc, 4 °C). Végül az üledéket MOPS pufferben reszuszpendáltuk a fehérjekoncentrációt kb. 60 mg/ml-re beállítva. Az elkészült mikroszómát ezután rögtön lefagyasztottuk és felhasználásig (max. 6 hónap) folyékony nitrogénben tároltuk. A mikroszomális fehérjekoncentrációt Bio-Rad reagenssel, marhaszérumalbumin „standard”-del határoztuk meg. A mikroszomális preparátum „tisztaságáról”, vagyis endoplazmás retikulum eredetéről marker enzimek (mitokondrium: citokróm-c-oxidáz, endoplazmás retikulum: glukóz-6-foszfatáz és citoplazma: 5’-nukleotidáz) segítségével bizonyosodtunk meg [Benedetti A. és mtsai. 1988; Brattin W. J., Jr. és mtsai. 1982]. A mikroszomális membrán integritásának ellenőrzésére a mannóz-6-foszfát latencia tesztet alkalmaztuk [Burchell A. és mtsai. 1988]. A latencia minden esetben 95 %-os, vagy annál nagyobb volt.
3.2.3. Glukozidáz II enzim aktivitásának mérése mikroszómában Az enzimaktivitás méréséhez a glukozidáz II enzim két specifikus mesterséges szubsztrátját használtuk: metilumbelliferil-glukozidot (MUG) és 4-nitrofenil-glukozidot (NPG). Az enzim hatására keletkező fluoreszcens metilumbelliferont Cary-Varian spektrofluoriméterrel detektáltuk. A mérés során a mikroszómát (MOPS-KCl pufferben 0,1 mg protein/ml) a küvettában 37°C-on tartottuk. Miután a MUG-ot hozzáadtuk a
36
mikroszómához egy percig detektáltuk a fluoreszcencia változását 360 nm excitációs és 440 nm emissziós hullámhossz mellett. Ezután minden mintához ismert mennyiségű (0,5 vagy 0,1 nmol/ml) metil-umbelliferont adtunk kalibráció céljából. Egyes méréseknél a mikroszóma membránját pórus-képző antibiotikummal, alameticinnel (0,1 mg/mg mikroszomális fehérje) permeabilizáltuk. A glukozidáz II enzim hatására keletkező 4-nitrofenol mennyiségét HPLC-s méréssel határoztuk meg. A mikroszómákat (0,5 mg protein/ml) MOPS-KCl pufferben 37°C-on 10 percig inkubáltuk az NPG szubsztrát jelenlétében. A mikroszomális membránt alameticinnel (0,1 mg/mg mikroszomális fehérje) permeabilizáltuk. A reakciót jéghideg metanol hozzáadásával állítottuk le és a mintákat azonnal lefagyasztottuk további kiértékelésig. Később a mintákat felolvasztottuk, majd lecentrifugáltuk (10 percig 4°C-on 20000 × g) és a fehérjementes felülúszót HPLC-vel vizsgáltuk. Az inhibitort mindegyik kísérletnél 1-2 perccel a szubsztrát (MUG vagy NPG) előtt hozzáadtuk a mikroszóma-szuszpenzióhoz.
3.2.4. HPLC („high performance liquid chromatography”) A proteinmenetes minták metil-umbelliferon-, illetve 4-nitrofenoltartalmát HPLC-vel (Waters Alliance 2690) mértük. Mindkét esetben Nucleosil 100 C18 oszlopot (5 μm 25×0,46) (Teknokroma) használtunk. A gradiensek előállításához használt eluensek: „A” oldat 0,1 %-os trifluorecetsav (TFA), „B” oldat 0,1 %-os TFA metanolban. A metil-umbelliferon mérésekor a gradiens kezdetben (30 sec) 80 % A és 20 % B oldat volt, amit lineárisan 7 perc alatt 40 % A és 60 % B-re változattunk, ezután 2 percig maradt ez az arány, majd visszaállt a 80 % A és 20 % B arány. Az oszlopban az áramlás sebessége 0,9 ml/perc volt. A fluoreszcencia méréséhez (Waters Multi λ Fluorescence Detector 2475) 325 nm excitációs és 455 nm emissziós hullámhosszakat állítottunk be. A 4-nitrofenol esetében fél percig tartó 100 % A után a B komponens arányát folyamatosan emeltük 0 %-ról 60 %-ra 8 percen át, majd 2 percig tartottuk a 40 % A – 60 % B összetételt, végül visszaállítottuk a 100 % A eluenst. Az áramlás sebessége itt is
37
0,9 ml/perc volt. A fényelnyelést 316 nm hullámhossznál detektáltuk (Waters Dual λ Absorbance Detector 2487). A metil-umbelliferon, illetve 4-nitrofenol elúciós idejét standard oldatok segítségével határoztuk meg.
3.3. Számítási módszerek A enzimaktivitást pmol/perc/millió sejt, illetve nmol/perc/mg egységben fejeztük ki, vagyis a 106 sejt, illetve 1 mg mikroszomális fehérje által 1 perc alatt termelt metilumbelliferon vagy 4-nitrofenol mennyiségére vonatkoztattuk. A mikroszomális glukozidáz aktivitásmérés MUG szubsztráttal folyamatos detektálással történt; itt a sebességet a fluoreszcencia intezitásának egy perc alatti változásából határoztuk meg. A hepatóma sejtekben a MUG hidrolízisének sebességét, illetve a mikroszomális glukozidáz aktivitást PNG szubsztráttal technikai okokból végpontméréssel végeztük. Ezekben az esetekben az inkubáció során keletkezett metil-umbelliferon vagy 4nitrofenol mennyiségét a minták végső és kezdeti (kevesebb mint a végső 5 %-a) HPLC-vel meghatározott koncentrációjának különbségéből számítottuk. A kapott adatok alapján a diagramok készítéséhez és a derivált paraméterek (Km, vmax, IC50 és Ki) számításához GraphPad Prism 4.01 programot használtunk.
38
4. Eredmények
4.1. EGCG-kezelés hatására aktiválódó, endoplazmás retikulum eredetű proapoptotikus mechanizmusok Hepa1c1c7 sejtekben
4.1.1. Az apoptózis aktiválódása Az endoplazmás retikulum szerepének tanulmányozásához olyan sejtvonalat kívántunk felhasználni, amelyben az organellum viszonylag nagy mennyiségben jelen van, és szintetizál szekréciós fehérjéket. A hepatóma sejtek általában megfelelnek e kritériumoknak, ezért döntöttünk a Hepa1c1c7 egér hepatóma sejtek mellett, amelyekkel a munkacsoportnak már voltak tapasztalatai. Bár a teaflavanolok apoptózist előidéző hatását több különböző sejtvonalon leírták korábban, elsőként megvizsgáltuk, hogy az EGCG-kezelés kiváltja-e az apoptózis fokozódását az általunk választott Hepa1c1c7 sejtekben is. EGCG (100 µM) adása után különböző időpontokban fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk az annexinnel (apoptotikus) (7. ábra) és propidium jodiddal festődő (nekrotizáló) sejteket, és kiszámítottuk az apoptózis indexet.
7. ábra Apoptózis vizsgálata annexinnel hepatóma sejtekben A Hepa1c1c7 tenyészethez 70-80 %-os konfluenciánál 100 µM EGCG-t adtunk, majd különböző időpontokban (az ábrán 24 óra elteltével) az apoptotikus sejteket annexinnel festettük és fluoreszcens mikroszkópia segítségével számoltuk. Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra.
39
Az apoptózis mértéke az EGCG-kezelés első 6 órájában nem változott, de 12, valamint 24 óra elteltével már az apoptózis index progresszív emelkedését észleltük (8. ábra). Az apoptotizáló sejtek aránya a 24 órás kezelés hatására nagyjából a kiindulási alapérték ötszörösére nőtt. A propidium-jodiddal festődő nekrotikus sejteket számolva azt tapasztaltuk, hogy a nekrózis intenzitása nem változott jelentős mértékben EGCG-
Apoptózis index (apoptózis/100 sejt)
kezelés hatására (be nem mutatott adatok).
25
20
15
10
5
0 0
3
6
9
12 15 18 21 24 Idő (óra)
8. ábra Az apoptózis index alakulása EGCG-vel kezelt hepatóma sejtekben A Hepa1c1c7 tenyészethez 70-80 %-os konfluenciánál 100 µM EGCG-t adtunk, majd annexin-festés és fluoreszcens mikroszkópia segítségével a jelzett időpontokban meghatároztuk az apoptózis indexet (apoptózis / 100 sejt). Átlag ± szórás; n = 3.
4.1.2. A CHOP indukciója és a prokaszpáz-12 hasítása Miután megbizonyosodtunk róla, hogy az EGCG a Hepa1c1c7 sejteken is hatékonyan indukálja az apoptózist, megvizsgáltuk, hogy a jelenség hátterében kimutathatók-e az
40
endoplazmás retikulum működési zavarával összefüggésbe hozható proapoptotikus mechanizmusok. Az endoplazmás retikulum stressz által kiváltott apoptózis két fő komponense a CHOP és a kaszpáz-12. Az UPR részeként indukálódó CHOP mennyiségének változását, illetve a prokaszpáz-12 hasítását egyaránt Western blot módszerrel tanulmányoztuk az EGCG-vel kezelt hepatóma sejtekben. A kapott eredmények alátámasztották az endoplazmás retikulum érintettségét, ugyanis mindkét vizsgált fehérje esetében a feltételezett változást észleltük. Bár kissé eltérő időbeni lefutással, de mind a CHOP indukciója (9. ábra), mind a prokaszpáz-12 hasítása (10. ábra) bekövetkezett EGCG hatására. A CHOP fehérje mennyisége 6 órás kezelés alatt elérte maximumát, amely 6-7-szerese volt a kiinduló értéknek, és ez az indukált állapot fennmaradt még legalább 24 órával az EGCG-kezelés megkezdése után is (9. ábra).
9. ábra A CHOP indukciója EGCG-kezelés hatására A Hepa1c1c7 sejteket EGCG-vel (100 μM) kezeltük, majd teljes sejtlizátumot készítettünk a jelzett időpontokban. Western blottal detektáltuk a CHOP proapoptotikus fehérjét, illetve a β-aktint (kontroll). Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra. A diagramon a denzitometrálással számszerűsített eredmények vannak feltüntetve a 0 órás mintában mérthez képest relatív értékekként, három mérésből számolt átlag ± szórás alakban; *P < 0,05.
41
A prokaszpáz-12 fehérje mennyisége enyhén (nem szignifikáns mértékben) emelkedett, ugyanakkor az aktiválódást jelző hasítási termékek szintje az apoptózis index-szel párhuzamosan emelkedett: 12 óra elteltével a változás szignifikáns volt, és tovább folytatódott a következő 12 órában is (10. ábra).
10. ábra A prokaszpáz-12 hasítása EGCG-kezelés hatására A Hepa1c1c7 sejteket EGCG-vel (100 μM) kezeltük, majd teljes sejtlizátumot készítettünk a jelzett időpontokban. Western blottal detektáltuk a prokaszpáz-12 fehérjét, annak hasítási termékeit, illetve a β-aktint (kontroll). Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra. A diagramon a denzitometrálással számszerűsített eredmények vannak feltüntetve a 0 órás mintában mérthez képest relatív értékekként, három mérésből számolt átlag ± szórás alakban; *P < 0,05.
4.1.3. Az endoplazmás retikulum reprezentatív chaperonjainak expressziója A CHOP indukciója és a prokaszpáz-12 hasítása az endoplazmás retikulum érintettségét bizonyítja az EGCG-vel kezelt sejtekben. Mivel az UPR részjelenségeként rendszerint megfigyelhető az endoplazmás retikulum legfontosabb chaperonjainak indukciója, megnéztük e fehérjék expresszióját az általunk tanulmányozott rendszerben is. A
42
klasszikus dajkafehérjék (GRP94 és BiP) mellett egy lektin chaperon (kalnexin), valamint két foldáz (PDI és ERP72) mennyiségének változását követtük nyomon a hepatóma sejtek EGCG-kezelése során Western blot módszerrel. Az eredmények azt mutatták, hogy – várakozásunkkal ellentétben – az öt vizsgált fehérje egyikének sem változott a mennyisége (11. ábra), vagyis a kialakuló stresszválasz nem volt teljes.
11. ábra Az endoplazmás retikulum reprezentatív chaperonjainak expressziója az EGCG-vel kezelt sejtekben A Hepa1c1c7 sejteket EGCG-vel (100 μM) kezeltük, majd teljes sejtlizátumot készítettünk a jelzett időpontokban. Western blottal detektáltunk két klasszikus dajkafehérjét (GRP94 és BiP), egy lektin chaperont (kalnexin), valamint két foldázt (PDI és ERP72), illetve a β-aktint (kontroll). Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra.
43
4.1.4.
Az eIF2α foszforilációjának fokozódása
A transzláció gátlása az eIF2α PERK általi foszforilációja révén az UPR egyik fontos részjelensége, amely a stressz kiváltásakor rendszerint igen hamar bekövetkezik. Ezért az endoplazmás retikulum stressz szerepének további megerősítése céljából megvizsgáltuk a transzlációs iniciációs faktor foszforilációjának alakulását az EGCGvel kezelt hepatóma sejtekben. Ehhez azonos mintákból kétféle antitesttel végeztünk Western blot analízist: az egyik a foszforilált eIF2α fehérjére specifikus, a másik viszont foszforilációtól
függetlenül
kötődik
az
eIF2α
fehérjéhez,
vagyis
a
fehérje
összmennyiségének meghatározásához használható.
12. ábra Az eIF2α fokozott foszforilációja EGCG-kezelés hatására A Hepa1c1c7 sejteket EGCG-vel (100 μM) kezeltük, majd teljes sejtlizátumot készítettünk a jelzett időpontokban, és azokat Western blot módszerrel tanulmányoztuk. Az eIF2α fehérje foszforilációjának és expressziójának mértékét a foszforilált eIF2α (eIF2α-P) elleni, illetve a foszforilációtól független eIF2α elleni antitestek felhasználásával tanulmányoztuk. Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra. A diagramon a denzitometrálással számszerűsített eredmények vannak feltüntetve a 0 órás mintában mérthez képest relatív értékekként, három mérésből számolt átlag ± szórás alakban; *P < 0,05.
44
Azt tapasztaltuk, hogy az utóbbi antitest a kezelés különböző időpontjaiban vett mintákban azonos – a kezeletlen mintánál észlelttel megegyező – intenzitású jelet adott, vagyis az eIF2α mennyisége nem változott. Ugyanakkor a foszforilált eIF2α mennyisége nagyon rövid időn belül jelentős emelkedést mutatott (12. ábra). Egy órával az EGCG adása után a mért denzitás már mintegy ötszöröse volt a kiindulási értéknek. A foszforiláltság mértéke tovább emelkedett, és a 12 órás mintákban érte el maximumát (nagyjából a kiindulási érték 12-szeresét), majd a kezelés 24. órájára visszaesett a kontroll 3-4-szeresére.
4.1.5.
Az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak depléciója
A hepatóma sejtek citoplazmatikus szabad Ca2+-szintjének alakulását fluoreszcens mikroszkópiával követtük nyomon. Mivel a sejteket kalciummentes médiumban tartottuk, a beáramlás hiányában, Ca2+-szint-emelkedést csak a belső raktárak kiürülése okozhatott. Fontos megjegyezni, hogy EGCG (100 µM) adása nem váltott ki azonnali kalciumkiáramlást a hepatóma sejtekben, vagyis a citoplazmatikus szabad Ca2+-szint emelkedése nem volt észlelhető a vizsgált 5 perces periódusban (be nem mutatott eredmények). Az EGCG-kezelés által az endoplazmás retikulum kalciumraktáraira kifejtett hosszabb távú hatás vizsgálatához a tapszigarginnal kiüríthető Ca2+ mennyiségét hasonlítottuk össze a kezelt és kontroll sejtekben. Különböző koncentrációjú EGCG (10 - 100 µM) hatásának (18 órán át) kitett sejteken kapott eredményeink (13. ábra A) azt mutatják, hogy a hatóanyag koncentrációfüggő módon depletálja az endoplazmás retikulumban tárolt kalciumot. A kiüríthető kalciumraktár szinte teljesen eltűnt 50 µMos dózis esetén, és gyakorlatilag egyáltalán nem lehetett kiáramlást detektálni a 100 µM EGCG-vel előinkubált sejtekben (13. ábra A). A hatás időfüggését 100 µM-os koncentráció alkalmazásával tanulmányoztuk. Bár a raktár depléciója már az első mérési időpontban (1 óra elteltével) szignifikánsnak bizonyult, a csökkenés kezdetben viszonylag lassú volt, és 2 óra elteltével észleltük a folyamat gyorsabbodását (13. ábra B). Említésre méltó, hogy az alkalmazott kezelés esetén a tapszigarginnal kiüríthető kalcium mennyisége már 4 óra alatt elhanyagolható mértékűre csökkent (13. ábra B).
45
13. ábra Az EGCG által az endoplazmás retikulumban kiváltott kalciumdepléció koncentráció- és időfüggése A tapszigarginnal felszabadítható Ca2+ mennyiségét fluoreszcens indikátor és mikroszkóp segítségével detektáltuk az EGCG-vel előkezelt hepatóma sejtekben. (A) A koncentrációfüggést 18 órás előkezelés után mértük a jelzett koncentrációkat alkalmazva. (B) Az időfüggést 100 µM EGCG alkalmazása után a jelzett időpontokban vizsgáltuk. Az kapott adatokat a kontrollhoz viszonyított %-os alakban fejeztük ki, és három mérésből számolt átlag ± szórás alakban tüntettük fel az ábrán; *P < 0,05.
4.1.6.
Az endoplazmás retikulum morfológiai változásai
Az endoplazmás retikulum BODIPY® FL tapszigarginnal végzett fluoreszcens jelölését követő mikroszkópos vizsgálataink eredményei azt mutatják, hogy az EGCG – a kalciumraktárak lassú kiürítése mellett – az endoplazmás retikulum morfológiájának jelentős változását is kiváltja. A kontroll sejtekről készült (14. ábra A), valamint a 18órás EGCG-kezelést követően regisztrált (14. ábra B) felvételek összehasonlítása jól szemlélteti a retikuláris struktúra egyértelmű felbomlását. Módszerünkkel detektálható legnyilvánvalóbb változások között említendő az endoplazmás retikulum membránjából képződő vakólumok megjelenése, valamint az organellum hálózatának visszahúzódása a plazma membrántól (14. ábra). Hasonló módosulások már négyórás EGCG-kezelés után is megfigyelhetők voltak (be nem mutatott eredmények).
46
14. ábra Az endoplazmás retikulum morfológiai változásai az EGCG-vel kezelt sejtekben Az endoplazmás retikulum morfológiáját fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk. A képek fluoreszcens tapszigargin adása után 2 percen belül készültek. (A) Kezeletlen (kontroll) Hepa1c1c7 hepatóma sejtek; (B) 18 órán át 100 µM koncentrációjú EGCG-vel kezelt sejtek. Három független kísérletből egy tipikus eredményt mutat az ábra.
47
4.2.
Teaflavanolok hatása az endoplazmás retikulumban zajló fehérjeérési és minőségellenőrzési folyamatokra
Az endoplazmás retikulum stressz rendszerint az éretlen fehérjék felhalmozódását idézi elő az organellumban, és ezáltal aktiválja az UPR jelátviteli mechanizmusait. Eredményeink tehát azt valószínűsítik, hogy a hepatóma sejtekben EGCG-kezelés hatására kialakult a fehérjeérés zavara, és hibásan hajtogatott – vagy ilyennek ítélt – fehérjék rekedtek az endoplazmás retikulum lumenében. Mivel a glikoproteinek érésének és minőségellenőrzésének központi szereplője a glukozidáz II enzim, és ennek ismert gátlószerei – a flavanolokhoz hasonlóan – polihidroxilált vegyületek, feltételeztük, hogy az EGCG által kiváltott endoplazmás retikulum stressz ezen enzim gátlása révén alakulhat ki.
4.2.1.
A glukozidáz II enzim gátlása hepatóma sejtekben
Megvizsgáltuk tehát, hogy hogyan változik a glukozidáz II enzim aktivitása EGCG hatására a Hepa1c1c7 sejtekben. Ehhez az enzim mesterséges szubsztrátját metilumbelliferil-glukozidot (MUG) alkalmaztunk, és ennek hidrolízisét mértük a flavanol jelenlétében, illetve hiányában. A glukozidáz általi hasítás sebességét az EGCG-kezelés szignifikánsan (több mint 80 %-kal) csökkentette (15. ábra). Mivel a glukozidáz II enzim az endoplazmás retikulum lumenében helyezkedik el, a MUG, illetve egyéb exogén glukozidok hozzáférését két membránon (plazma membránon és az endoplazmás retikulum membránján) keresztüli transzport is limitálhatja. A mesterséges glukozidok membránon keresztüli transzportjáról, valamint annak gátlószereiről nem állt rendelkezésre adat, így számításba kellett venni annak lehetőségét is, hogy az EGCG a szubsztrát bejutását akadályozva fejti ki gátló hatását. Éppen ezért méréseinket alameticinnel kezelt sejteken is megismételtük, ahol a permeabilizált membránok nem képeztek akadályt, így megfigyelhetők az enzimre gyakorolt közvetlen hatások. A permeabilizálás mintegy 5-szörösére fokozta a mért aktivitást az intakt sejtekben mérthez képest. Ez azt jelenti, hogy a glukozidáz aktivitásának latenciája 80 % körül volt a hepatóma sejtekben. Ugyanakkor a
48
membránok átjárhatósága nem befolyásolta az EGCG által kiváltott gátlás mértékét, amely 81 % és 83 % volt az intakt, illetve permeabilizált sejtekeben (15. ábra A).
15. ábra A glukozidáz II gátlása EGCG-vel intakt és permeabilizált sejtekben (A) Intakt és alameticinnel permeabilizált Hepa1c1c7 sejtszuszpenziót 100 μM EGCG jelenlétében, illetve a nélkül (Kontroll) inkubáltunk 37 ºC-on, majd metil-umbelliferilglukozidot (50 μM) adtunk hozzájuk. A hidrolízis sebességét a metil-umbelliferon koncentrációjának lineáris növekedéséből számítottuk, melyet HPLC-vel mértünk. (B) Az aktivitásmérést a diagramon jelzett időtartamú előinkubálás (EGCG-vel vagy nélküle) előzte meg. Három független mérésből számolt átlag ± szórás alakban tüntettük fel az eredményeket az ábrán; *P < 0,05 (a kontroll értékhez viszonyítva).
Ez egyben azt is jelenti, hogy az enzimaktivitás latenciáját az EGCG-kezelés nem változtatta meg (77 % a kezelt és 79 % a kontroll sejtekben), amely arra utal, hogy a gátló hatás közvetlenül a glukozidáz enzimen – és nem a membránokon keresztüli transzportnál – érvényesül. A gátló hatás időtartamának megállapításához az enzimaktivitás-mérés elvégzése előtt az intakt sejteket hosszabb ideig előinkubáltuk EGCG-vel. Megfigyeléseink szerint a vizsgált körülmények között a glukozidáz gátlása legalább 12 órán át folyamatosan fennállt (15. ábra B).
49
4.2.2.
A glukozidáz II gátlásának jellemzése máj mikroszómában
4.2.2.1.
A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált vezikulában
A hepatóma sejtekben megfigyelt gátlás alaposabb jellemzéséhez patkány májból izolált mikroszómán végeztünk további méréseket. A glukozidáz II enzim hidrolítikus aktivitását MUG mesterséges szubsztrát felhasználásával mértük. A meghatározást intakt és pórusképző alameticinnel permeabilizált mikroszómán egyaránt elvégeztük; a szubsztrát koncentrációját pedig 5 és 300 μM között változtattuk (16. ábra).
Glukozidáz II aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
35
30
25
20
15
10
5
0 0
50
100
150
200
250
300
[MUG] (μM) 16. ábra A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált máj mikroszómában Intakt (○) és alameticinnel permeabilizált (●) patkány máj mikroszómát (0,1 mg fehérje/ml) inkubáltunk 37°C-on különböző koncentrációjú MUG jelenlétében, és fluoreszcens módszerrel meghatároztuk a metil-umbelliferon keletkezésének kezdeti sebességét. Átlag ± S.E.M.; n = 3. MUG: metil-umbelliferil-glukozid.
50
A permeabilizált mikroszomális vezikulában mért kezdeti aktivitások MichaelisMenten kinetikát mutatnak; a számított Km 55,2 ± 3,1 μM, a Vmax pedig 39,0 ± 0,7 nmol/perc/mg fehérje. A membránon keresztüli transzport limitáló hatása – a hepatóma sejtekhez hasonlóan – itt is megfigyelhető volt, ugyanis az intakt mikroszómában minden alkalmazott szubsztrátkoncentráció esetén alacsonyabb enzimaktivitást mértünk, mint az alameticinnel permeabilizáltban (16. ábra). Érdekes, hogy a MUG-hidrolízis latenciája alacsonyabb szubsztrátszintek alkalmazásakor volt a legkifejezettebb (pl. 5 μM esetén 60 %), és inverz korrelációt mutatott a szubsztrát koncentrációjával (17. ábra).
latencia(%) =
60
MUG-hidrolízis latenciája (%)
55
v permeabilizált − v intakt × 100 v permeabilizált
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
5
10
25
50
75
100 150 200 250 300
[MUG] (μM) 17. ábra A MUG-hidrolízis latenciájának koncentrációfüggése A latenciát az intakt és permeabilizált patkány máj mikroszómában mért enzimaktivitásokból (ld. előző ábra adatai) az ábrán feltüntetett képlet segítségével számítottuk MUG: metil-umbelliferil-glukozid.
51
A latencia koncentrációfüggése feltehetőleg a glukozid transzportját mediáló fehérje és a glukozidáz enzim kinetikai jellemzőinek eltéréséből adódik – vagyis az enzim a transzporternél nagyobb affinitással és kisebb kapacitással rendelkezik. Ennek azonban a vizsgált hatások szempontjából nincs jelentősége, és fiziológiás relevanciája is csekély, ezért alaposabban nem foglalkoztunk a kérdéssel, és további méréseket ez
Glukozidáz II aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
irányban nem végeztünk.
14 12 10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
[NPG] (mM) 18. ábra A glukozidáz II aktivitása intakt és permeabilizált máj mikroszómában Intakt (○) és alameticinnel permeabilizált (●) patkány máj mikroszómát (0,5 mg fehérje/ml) inkubáltunk 37°C-on különböző koncentrációjú NPG jelenlétében, és HPLC alkalmazásával meghatároztuk a p-nitrofenol keletkezésének kezdeti sebességét. Átlag ± S.E.M.; n = 3. NPG: p-nitrofenil-glukozid.
A glukozidáz II enzim működését egy másik specifikus szubsztrát, a p-nitrofenilglukozid (NPG) felhasználásával is tanulmányoztuk. A kinetika vizsgálatához ennek koncentrációját 50 μM és 10 mM között változtattuk. A permeabilizált mikroszómában
52
mért enzimaktivitások (18. ábra) ez estben is konzisztensek a Michaelis-Menten kinetikával. A kiszámított kinetikai paraméterek (Km = 2,2 ± 0,1 mM; Vmax = 15,3 ± 0,2 nmol/perc/mg fehérje) persze eltérnek a MUG esetén kapottaktól, és mutatják, hogy az enzim NPG iránti affinitása lényegesen alacsonyabb. A NPG hidrolízisének sebessége minden vizsgált koncentráció esetén lényegében megegyezett az intakt és permeabilizált mikroszómában (18. ábra), vagyis latencia jelensége itt nem volt észlelhető.
4.2.2.2.
Az EGCG-általi gátlás támadáspontja és koncentrációfüggése
Az EGCG glukozidáz II aktivitására gyakorolt hatását MUG (40 μM koncentrációban) felhasználásával tanulmányoztuk patkány máj mikroszomális preparátumban. EGCG jelenlétében (10-300 μM tartományban) koncentrációfüggő gátlást észleltünk mind intakt, mind permeabilizált mikroszóma esetén (19. ábra alsó, illetve felső görbéje). Fontos, hogy 50 μM-os koncentrációban az EGCG már jelentős (50 % körüli) gátló hatást fejtett ki. A legnagyobb általunk mért gátlás közel 90 %-os volt a permeabilizált mikroszómában; a kapott adatokból végzett számítással 50,9 μM IC50 és 29,5 μM Ki értékeket kaptunk. Megjegyzésre érdemes, hogy az emelkedő EGCG-koncentrációval (és gátló hatással) a MUG hidrolízisének latenciája egyre csökkent; sőt, 150 µM gátlószerkoncentráció felett latencia gyakorlatilag nem volt kimutatható (19. ábra, oszlopdiagram). Mindez arra utal, hogy a jelentősen csökkent enzimaktivitás mellett a membránon keresztüli transzport már nem sebességmeghatározó lépés, így az intakt membrán jelenléte nem befolyásolja jelentős mértékben a hidrolízis sebességét. Ez a megfigyelés egyben további bizonyítékul szolgál amellett, hogy az EGCG valóban közvetlenül a glukozidáz II enzim aktivitását gátolja, és nem befolyásolja számottevően a glukozidtranszportot.
53
45
Latencia (%)
16 14 12
35 25 15 5
10
0 10 25 50 7 105 15 0 20 0 25 0 300 0
Glukozidáz II aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
18
[EGCG] (μM) 8 6 4 2 0 0
50
100
150
200
250
300
[EGCG] (μM) 19. ábra A glukozidáz II gátlása EGCG-vel A glukozidáz II aktivitását intakt (○) és alameticinnel permeabilizált (●) patkány máj mikroszómában (0,1 mg fehérje/ml) mértük 40 μM metil-umbelliferil-glukozid alkalmazásával. Az EGCG-t 1-2 perccel a szubsztrát előtt adtuk a mikroszómához. Átlag ± S.E.M., n = 3. Az oszlopdiagram a metil-umbelliferil-glukozid hidrolízisének számított latenciáját mutatja az EGCG koncentrációjának függvényében. EGCG: epigallokatekin-gallát.
4.2.2.3.
A gátlás kinetikája
Az EGCG glukozidáz II enzimre gyakorolt hatását tovább tanulmányoztuk, és megállapítottuk, hogyan változik az enzim kinetikája a gátlószer jelenlétében. Az enzim közvetlen vizsgálatához alameticinnel permeabilizált mikroszómát használtunk, és a méréseket mindkét mesterséges szubsztráttal elvégeztük. A mikroszómát 100 μM
54
EGCG-vel kezeltük, majd MUG (5-300 μM), illetve NPG (0,05-10 mM) adása után detektáltuk az enzimatikus hidrolízis kezdeti sebességét. Az EGCG jelentős mértékben csökkentette a glukozidáz II aktivitását mindkét szubsztrát és minden vizsgált
35
Glukozidáz II aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
Glukozidáz II aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
szubsztrátkoncentráció esetén (20. ábra).
30
25
20
15
10
5
0 0
50
100
150
200
250
12
10
8
6
4
2
0
300
0
[MUG] (μM)
2
4
6
8
10
[NPG] (mM)
20. ábra A glukozidáz II gátlásának kinetikája A glukozidáz II aktivitását különböző koncentrációjú MUG (bal oldali diagram), illetve NPG (jobb oldali diagram) alkalmazásával mértük EGCG nélkül (●) és 100 μM EGCG jelenlétében (▲) permeabilizált patkány máj mikroszómában (0,1 mg fehérje/ml). Az EGCG-t 1-2 perccel a szubsztrát előtt adtuk a mikroszómához. Átlag ± S.E.M., n = 3. EGCG: epigallokatekin-gallát; MUG: metil-umbelliferil-glukozid; NPG: p-nitrofenilglukozid.
Az eredmények kettős reciprok (Lineweaver-Burk szerinti) ábrázolása (21. ábra) jól mutatja, hogy EGCG-kezelés a Vmax mintegy 4-szeres csökkenését eredményezi, miközben a Km értékek nem változtak számottevő mértékben (2. táblázat).
55
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
-0.025
1.5
11
1 / glukozidáz II aktivitás (perc x mg / nmol)
1 / glukozidáz II aktivitás (perc x mg / nmol)
1.2
0.025
0.075
0.125
0.175
10
-2
-1
1.0
9 0.5
8 7
0
1
2
6 5 4 3 2 1 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
1 / [NPG] (mM -1)
1 / [MUG] (μM )
21. ábra A glukozidáz II gátlásának kinetikája Lineweaver-Burk ábrázolással A glukozidáz II aktivitását különböző koncentrációjú MUG (bal oldali diagram), illetve NPG (jobb oldali diagram) alkalmazásával mértük EGCG nélkül (●) és 100 μM EGCG jelenlétében (▲) permeabilizált patkány máj mikroszómában (0,1 mg fehérje/ml). Az EGCG-t 1-2 perccel a szubsztrát előtt adtuk a mikroszómához. Az alkalmazott szubsztrátkoncentrációk és a három kísérletben mért aktivitások átlagainak reciprok értékeit tüntettük fel az ábrán. Az eredeti értékek az előző ábrán láthatók. EGCG: epigallokatekin-gallát; MUG: metil-umbelliferil-glukozid; NPG: p-nitrofenilglukozid.
MUG-áz Vmax (nmol/perc/mg fehérje) Km (μM)
kontroll 100 μM EGCG kontroll 100 μM EGCG
39,0 ± 0,7 9,2 ± 0,4 55,2 ± 3,1 54,4 ± 8,0
NPG-áz 15,3 ± 0,2 4,1 ± 0,1 2,2 ± 0,1 2,4 ± 0,1
2. táblázat EGCG hatása a glukozidáz II kinetikai paramétereire A glukozidáz II aktivitását permeabilizált máj mikroszómában mértük két szubsztrát (MUG és NPG) különböző koncentrációjú alkalmazásával, EGCG hiányában (kontroll), illteve jelenlétében (100 μM). A kinetikai paramétereket a 20. és 21. ábrán bemutatott adatokból számítottuk ki. EGCG: epigallokatekin-gallát; MUG: metil-umbelliferil-glukozid; NPG: p-nitrofenilglukozid.
56
4.2.2.4.
Különböző teaflavanolok hatékonyságának összehasonlítása
22. ábra A vizsgált teaflavanolok és a propil-gallát szerkezete
Miután jellemeztük az EGCG glukozidáz II aktivitására kifejtett hatását, megvizsgáltuk, hogy az enzim gátolható-e más természetes teakatekinnel is. Kísérleteinkhez a tea növényben és főzetében nagy mennyiségben előforduló flavanolokat, epikatekingallátot (ECG), gallokatekint (GC), epigallokatekint (EGC), valamint gallokatekin-
57
gallátot (GCG) használtunk (22. ábra). E mellett méréseket végeztünk propil-galláttal (PG) is, amely a – néhány teaflavanolban (pl. EGCG és GCG) előforduló – gallát csoport mesterségesen előállított származéka (22. ábra). A feltételezett gátlószerek esetében megfigyelt hatásokat összehasonlítottuk a glukozidáz II ismert és legelterjedtebben használt gátlószere, az N-butil-dezoxinojirimicin (NBDJ) hatékonyságával. Minden tanulmányozott hatóanyagot 10 és 300 μM között változó koncentrációban adtuk a permeabilizált mikroszómához, és a MUG hidrolízisének sebességét mértük 40 μM szubsztrát jelenlétében. Az összes vizsgált vegyület gátolta az enzim aktivitását, de jelentősen eltérő mértékben (23. ábra A).
A
B
5
14 12 10 EGC GC
8 6 4
PG 2
EGCG
0
ECG NBDJ GCG 0
50
100
150
200
250
300
NPG-áz aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
MUG-áz aktivitás (nmol/perc/mg fehérje)
16
4
3
2
1
0 0
50
100
150
200
[gátlószer] (μM)
[gátlószer] (μM)
23. ábra Különböző teaflavanolok és propil-gallát hatása a glukozidáz II aktivitására Alameticinnel permeabilizált máj mikroszómák MUG-áz (A diagram; 40 μM MUG és 0,1 mg fehérje/ml), valamint NPG-áz (B diagram; 1 mM NPG és 0,5 mg fehérje/ml) aktivitását mértük. Az ábrán feltüntetett vegyületeket (■: EGC, ▲: GC, ▼: PG, ●: EGCG, •: ECG, ×: GCG) 1-2 perccel a szubsztrát előtt adtuk a mikroszómához. Mindkét diagramon szerepel az NBDJ (csillag és szaggatott vonal) hatása összehasonlítás céljából. Átlag ± S.E.M., n = 3. ECG: epikatekin-gallát; EGC: epigallokatekin; EGCG: epigallokatekin-gallát; GC: gallokatekin; GCG: gallokatekin-gallát; MUG: metil-umbelliferil-glukozid; NBDJ: Nbutil-dezoxi-nojirimicin; NPG: p-nitrofenil-glukozid; PG: propil-gallát.
58
Hasonló eredményeket kaptunk, amikor a glukozidáz II enzim NPG-áz aktivitását mértük 1 mM szubsztrát alkalmazásával, azonos feltételezett gátlószerek jelenlétében (23. ábra B). A GCG és az ECG magasabb koncentrációkban alkalmazva – az NBDJhez hasonlóan – szinte teljesen blokkolta az enzimaktivitást. Még a legkevésbé hatékony teaflavanolok (GC és EGC) is közel 30 %-kal csökkentették az aktivitást 200 μM-os koncentráció esetén. A többi vizsgált vegyülettel összehasonlítva az EGCG hatékonysága közepesnek minősíthető, és a PG-éhez, az egyetlen nem-katekin gallátéhoz, hasonló. A 23. ábrán feltüntetett adatokból minden tanulmányozott gátlószer esetében kiszámítottuk a gátlás hatékonyságát jellemző IC50 és Ki értékeket (3. táblázat).
MUG-áz gátlószer
NPG-áz
IC50 (μM)
Ki (μM)
IC50 (μM)
Ki (μM)
GCG
3,502
2,027
3,702
2,545
ECG
15,14
8,763
19,06
13,10
EGCG
50,92
29,48
47,72
32,81
PG
62,67
36,28
62,73
43,12
EGC
117,7
68,15
110,5
75,99
GC
136,3
78,93
102,7
70,62
NBDJ
8,965
5,190
3,268
2,247
3. táblázat A glukozidáz II különböző gátlószereinek IC50 és Ki értékei Az egyes vegyületeket különböző koncentrációkban adtuk a permeabilizált máj mikroszómákhoz 37 ºC-on. A MUG hidrolízisének sebességét 0,1 mg/ml fehérjekoncentráció és 40 μM-os szubsztrátszint alkalmazásával 2 perces inkubációval mértük. Az NPG-áz aktivitást pedig 0,5 mg/ml fehérjekoncentráció és 1 mM-os szubsztrátszint alkalmazásával 25 perces inkubációval határoztuk meg. Az IC50 és Ki értékeket a GraphPad Prism 4.01 program segítségével számítottuk ki három-három párhuzamos mérés eredményeiből, melyeket a 23. ábra mutat. ECG: epikatekin-gallát; EGC: epigallokatekin; EGCG: epigallokatekin-gallát; GC: gallokatekin; GCG: gallokatekin-gallát; MUG: metil-umbelliferil-glukozid; NBDJ: Nbutil-dezoxi-nojirimicin; NPG: p-nitrofenil-glukozid; PG: propil-gallát.
59
5. Megbeszélés Az endoplazmás retikulum működési zavarai proliferációt gátló és apoptózist elősegítő mechanizmusokat indíthatnak be [Ferri K. F. és Kroemer G. 2001]. Az endoplazmás retikulum stressz – bármely okból jön is létre – rendszerint a luminális fehérjeérés elégtelenségéhez vezet, amely aktiválja a “selejtfehérje választ”, az UPR-t; és ez által apoptózist indukál, valamint gátolja a fehérjeszintézist [Schroder M. és Kaufman R. J. 2005]. Mivel a daganatos sejtek általában fokozottan érzékenyek a stresszre, várhatóan még enyhébb endoplazmás retikulum stresszt kiváltó ágensek is jelentős mértékben akadályozzák a tumornövekedést. Az a lehetőség, hogy a kemoterápiás kezelés hatékonyságát endoplazmás retikulum stressz kiváltásával vagy módosításával lehet fokozni, az endoplazmás retikulumot ígéretes, új rákellenes terápiás célponttá tette [Boelens J. és mtsai. 2007]. A glukozidáz II enzim gátlószerei enyhe endoplazmás retikulum stresszoroknak tekinthetők, mivel meglehetősen specifikusan befolyásolják a glikoproteinek érését és minőségellenőrzését, anélkül, hogy az endoplazmás retikulum általános állapotát vagy egyéb funkcióit megzavarnák. Az ismertté vált minőségellenőrzési mechanizmusok szerint a monoglukozilált (egy glukóz egységet tartalmazó) N-glikoproteineket éretlenként kezeli az endoplazmás retikulum, és bizonyos lektin chaperonok – elsősorban kalnexin és kalretikulin – segítségével visszatartja az organellum lumenében. Az oligoszacharid csoport cimkeként szolgáló utolsó glukóz egységének eltávolítását a glukozidáz II enzim végzi, és ez által felkínálja a glikoproteint a soron következő minőség-újraellenőrzésre. Ennek alapján, a glukozidáz II csökkent aktivitása várhatóan megzavarja a rendszer működését, a nem teljesen érett fehérjék felhalmozódásához vezet, ami telíti a minőségellenőrzési és fehérjeérési gépezet kapacitását, és végső soron elhasználja a szabad GRP78 chaperonokat. Ez utóbbi pedig az UPR legfőbb aktiváló tényezője, ugyanis a legfontosabb UPR-receptorok felszabadulnak a GRP78 általi gátlás alól. Aktiválódnak azok a jelátviteli útvonalak, amelyek alapvetően az endoplazmás retikulum működését hivatottak helyreállítani, de a sejt halálához is vezethetnek. Mindezt jól alátámasztja, hogy az N-butil-dezoxi-nojirimycin, a glukozidáz I és II hatékony inhibitora, a kezelt sejtek osztódását redukálja és bennük az apoptózis kialakulását serkenti, így az endoplazmás retikulumban zajló glikoprotein-érés
60
gátlószereit potenciális rákellenes hatóanyagoknak tekintik [Elbein A. D. 1991a; Elbein A. D. 1991b]. Az apoptózis indukciója a polifenolos teakatekinek tumorellenes hatásához is hozzájárul [Khan N. és mtsai. 2006; Nihal M. és mtsai. 2005]. Nem vizsgálták azonban, hogy a katekinek által kiváltott apoptózisban szerepet játszik-e az endoplazmás retikulum stressz és az UPR. Az értekezésben bemutatott kutatás fő célja e kérdés megválaszolása volt. Miután bizonyítottuk, hogy az EGCG hatására pusztuló sejtekben az UPR proapoptotikus elemei aktiválódnak, igyekeztünk a hatóanyag közvetlen támadáspontját is azonosítani az endoplazmás retikulumban. Bár a klasszikus UPR néhány túlélést elősegítő („pro-survival”) elemét (azaz a legfontosabb endoplazmás retikulum chaperonok és foldázok indukcióját) hiába kerestük
az
EGCG-vel
kezelt
sejtekben,
a
legfontosabb
„proapoptotikus”
komponenseket sikerült kimutatnunk. A CHOP/GADD153 fehérje indukciója és a prokaszpáz-12 aktiválódása mellett, ráadásul, az eIF2α transzlációs iniciációs faktor foszforilációját is észleltük, így többszörösen bizonyítottuk az endoplazmás retikulum stressz részvételét, vagyis alátámasztottuk kiinduló hipotézisünket. A GRP78 leválása a PERK, IRE1 és ATF6 fehérjék luminális doménjéről az UPR beindításának kulcslépése [Schroder M. és Kaufman R. J. 2005]. A három „UPRreceptor” által beindított divergáló és konvergáló jelátviteli kaszkádok egyaránt szolgálják a sejt adaptációját és az életképtelen sejt pusztulását [Wu J. és Kaufman R. J. 2006]. Az endoplazmás retikulum chaperonjainak és foldázainak indukciója például nyilvánvalóan adaptív, túlélést elősegítő komponense a stresszválasznak, hiszen a fehérjeérési kapacitást növelve próbálja képessé tenni az organellumot a fokozott kihívás leküzdésére. Ugyanakkor a CHOP indukciója és a prokaszpáz-12 hasítása proapoptotikus elemek, amelyek végső soron a súlyosan sérült sejtek eltakarítását szolgálják. Az eIF2α iniciációs faktor foszforilációja egyrészt a túlélést szolgálja azáltal, hogy segít helyreállítani a transzláció és fehérjeérés egyensúlyát; másrészt viszont a fehérjeszintézis általános gátlása a sejt működésének beszűküléséhez vezet, és végső soron hozzájárulhat a sejt pusztulásához is. Az endoplazmás retikulum stressz nem jár feltétlenül az összes válaszelem egyidejű és azonos mértékű aktiválódásával. Különféle krónikus stresszhelyzetekhez
61
alkalmazkodó sejtekben gyakran megfigyelhető az UPR proapoptotikus útvonalainak szelektív gátlása [Rutkowski D. T. és Kaufman R. J. 2007]. Hasonló módon, az endoplazmás retikulum eredetű apoptózis kialakulása jelentős chaperonindukció nélkül sem példa nélküli jelenség [Wang H. Q. és mtsai. 2007]. Ma még nem tudjuk azonban megválaszolni a kérdést, hogy mitől függ, és hogyan szabályozza a sejt, hogy az UPR melyik aspektusa domináljon éppen. Nem kérdéses, hogy a résztvevő jelátviteli útvonalak közti bonyolult interakciók és az őket befolyásoló szabályozási mechanizmusok még további kutatásra szorulnak. Az EGCG nem váltott ki azonnali kalcium-szignált, mégis hatékonyan depletálta az endoplazmás retikulum luminális Ca2+-raktárait a hepatóma sejtekben. Ez a lassú kalcium-kiáramlás az UPR egyik pozitív visszacsatolását jelenti, és ez által a túlélés vagy halál egyensúlyának eltolódásában is lényeges faktor lehet. A fokozott kalciumcsorgás a folyamtban lévő UPR lényegi eleme, és leginkább a proapoptotikus Bcl-2 fehérjék aktiválódásának tudható be az endoplazmás retikulum membránjában. A citoplazmatikus kalciumkoncentráció tartós emelkedése a proapoptotikus folyamatokat erősíti (pl. a prokaszpáz-12-t hasítással aktiváló kalpain stimulálása révén). Ezzel egyidejűleg az endoplazmás retikulum lumenében a kalciumkoncentráció csökkenése akadályozza a kalciumfüggő chaperonok működését, és ez által csökkenti az organellum fehérjeérlelő kapacitását, amely felerősíti az UPR-t. Az endoplazmás retikulum membránján keresztüli lassú Ca2+-csorgásban a transzlokon peptidcsatorna is szerepet játszhat [Lizak B. és mtsai. 2008]. Amikor ugyanis a szintetizálódó polipeptidlánc nem tölti ki a pórust, annak luminális végét az ADP-t kötő GRP78 zárja le [Alder N. N. és mtsai. 2005]. Az EGCG – bármely mechanizmussal váltja is ki az endoplazmás retikulum stresszt – feltehetőleg szekvesztrálja a GRP78-at, és ez által megzavarja a transzlokon permeabilitásának szabályozását. Nem zárható ki tehát az a lehetőség, hogy az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak észlelt kiürülése oka, és nem következménye az endoplazmás retikulum stressz kialakulásának. Az EGCG-kezelés következtében kialakuló morfológiai változások nyilvánvalóvá teszik az endoplazmás retikulum érintettségét, és további bizonyítékként támasztják alá az endoplazmás retikulum stressz jelenlétét. Az általunk leírtakhoz hasonló morfológiai
62
eltéréseket – vakuolizációt és az endoplazmás retikulum visszahúzódását – észleltek korábban olyan sejtekben, melyeket „klasszikus” endoplazmás retikulum stresszorokkal kezeltek, mint pl. a Ca2+-ionofór ionomicinnel, a kalciumpumpa-gátló tapszigarginnal vagy zsírsav-túlterheléssel [Karaskov E. és mtsai. 2006; Subramanian K. és Meyer T. 1997]. Az eredmények tehát azt mutatják, hogy EGCG hatására valóban endoplazmás retikulum stressz, és részleges UPR alakul ki az általunk vizsgált hepatóma sejtekben. Ezután célul tűztük ki, hogy azonosítsuk a hatóanyag támadáspontját az organellumban. Mivel az endoplazmás retikulum stressz érzékelésében az éretlen fehérjék felhalmozódása központi szerepet játszik, feltételeztük, hogy a hatás hátterében a fehérjeérés és minőség-ellenőrzés valamelyik komponensének gátlása állhat. Az érésben lévő fehérjéket újabb ellenőrzés felé irányító glukozidáz II enzim ismert gátlószerei (pl. a nojirimicin-származékok) polihidroxilált vegyületek. Felvetődött tehát, hogy a polifenolok szintén ezt az enzimet gátolhatják. Mindenek előtt megvizsgáltuk a glukozidáz II működését patkány máj mikroszómában. Kísérleteinket két mesterséges szubsztrát felhasználásával végeztük, melyekből a hidrolitikus hasítás során színes (p-nitrofenol), illetve fluoreszcens (metilumbelliferon) termék keletkezik, és így a reakció sebessége könnyen meghatározható. Az enzim kinetikáját alameticinnel permeabilizált mikroszómában jellemeztük, mert itt a szubsztrát szabadon hozzáfér az aktív centrumhoz. Mindkét szubsztrát esetén Michaelis-Menten kinetikát észleltünk, így meghatároztuk a Vmax és Km értékeket. Ahogy ez várható volt, a kinetikai paraméterek a két alkalmazott szubsztrát esetében eltérőek voltak. Az enzim nagyobb affinitást mutatott MUG iránt. Intakt mikroszómában az enzimet már csak egy membrán választja el a hozzáadott szubsztrátoktól, de a latencia jelenségére itt is – mint luminális elhelyezkedésű enzimek esetében rendszerint – számítani lehetett. Szemben a hepatóma sejtekkel, ahol a MUG esetében észlelt latencia 80 % körül volt, a mikroszómában – a szubsztrát koncentrációjától függően – 10 és 60 % közötti latenciát figyeltünk meg. Ez azt mutatja, hogy a MUG membránon keresztüli transzportja (vagyis hozzáférése az aktív centrumhoz) korlátozza a hidrolízis sebességét. Ráadásul a MUG-hidrolízis latenciája fordítottan korrelált a szubsztrátkoncentrációval. A jelenség magyarázatául szolgálhat, hogy amikor az enzim telítődik, a transzport még gyorsul, és egyre inkább lépést tud
63
tartani az aktivitással. Ebből arra következtethetünk, hogy a MUG-transzport kisebb affinitással és nagyobb kapacitással rendelkezik, mint a glukozidáz II enzim. PNG alkalmazásakor a mikroszomális glukozidáz II aktivitás nem volt látens, vagyis a membránon keresztüli transzport lépést tudott tartani a luminális hasítás sebességével, ami összefügghet az enzim lényegesen kisebb affinitásával e szubsztrát iránt. Mindezek a megfontolások csupán elméleti szempontból érdekesek, illetve a további kísérletek körülményeinek beállítása vonatkozásában van jelentőségük, hiszen a mesterséges szubsztrátok
transzportja
és
hasítási
sebessége
nem
rendelkezik
fiziológiás
relevanciával. Enzimgátlásra irányuló méréseink igazolták eredeti feltételezésünket, ugyanis mindkét szubsztráttal végzett kísérletek eredményei szerint az EGCG hatékonyan gátolta a glukozidáz II aktivitását. A hatás koncentrációfüggő volt, és nem-kompetitív kinetikájú. A gátlást intakt és permeabilizált mikroszómában egyaránt kimutattuk. Magasabb EGCG-koncentrációk alkalmazásakor a MUG esetében észlelt latencia szinte teljesen megszűnt. Más szavakkal, amikor az enzimet nagymértékben gátoltuk, a MUGtranszport már nem volt sebességmeghatározó. Mindez azt támasztja alá, hogy az EGCG tisztán a glukozidáz II enzimet gátolja, és nem befolyásolja a szubsztrát transzportját intakt mikroszómában. Fontos, hogy a mikroszómán részletesen vizsgált enzimgátlást az általunk használt hepatóma sejteken is sikerült kimutatni. Vizsgálatainkba bevontunk más teaflavanolokat, valamint a mesterséges propilgallátot is, hogy a hatás-szerkezet összefüggésről is információhoz juthassunk. E vegyületek hatásának koncentrációfüggését összehasonlítva azt találtuk, hogy a gallát molekularész jelenléte szükséges a glukozidáz II hatékony gátlásához. Az EGC és a GC, melyekből hiányzik a gallát, lényegesen kevésbé voltak hatásosak, mint a többi vizsgált molekula. Említésre méltó még, hogy a gallo-csoport konfigurációja szintén jelentősen befolyásolta a gátló hatást: a GCG IC50 és Ki értékei az NBDJ-éhez hasonlók voltak, míg az EGCG kevésbé hatékony gátlószernek bizonyult. A 80-90 %-os gátló hatás eléréséhez 100 μM feletti EGCG-koncentrációkat kellett alkalmaznunk. A glukozidáz II ilyen nagy mértékű gátlása tehát csak a hatóanyag farmakológiás adagolásával lenne elérhető. Ugyanakkor figyelembe kell venni, hogy más teaflavanolok sokkal hatékonyabbak voltak, így pl. a GCG közel 80 %
64
aktivitáscsökkenést okozott már 10 μM-os koncentrációban. Bár a rendszeres teafogyasztás esetén mért legmagasabb EGCG-szint az emberi plazmában 4 μM körül volt [Chow H. H. és mtsai. 2003; Miyazawa T. 2000], a teaflavanolok szervezeten belüli megoszlásáról és esetleges szöveti akkumulációjáról jelenleg nem áll rendelkezésre adat. Így nem kizárható, hogy a flavanolok szöveti koncentrációja az általunk hatékonynak talált szinteket is elérheti, vagyis a teafogyasztás jelentősen gátolhatja a glukozidáz II enzimet. Tisztított zöldteakatekinek i.p. injekciója [Kao Y. H. és mtsai. 2000], illetve zöldtea vagy EGCG orális adagolása [Koyama Y. és mtsai. 2004; Wolfram S. és mtsai. 2006] esetén olyan hatásokat észleltek in vivo, melyeket in vitro 10-100 μM EGCG-koncentrációkkal lehetett kiváltani [Anton S. és mtsai. 2007; Waltner-Law M. E. és mtsai. 2002]. Ez alátámasztja annak valószínűségét, hogy a szövetekben a flavanolkoncentráció a plazmában mértnél lényegesen magasabb is lehet. Ennek megfelelően, a teaflavanolokat rendszerint 10-100 μM koncentrációban alkalmazzák a különböző sejtes kísérleti modellekben [Demeule M. és mtsai. 2002; Khan N. és mtsai. 2006; Lambert J. D. és Yang C. S. 2003], és a sejt jelátviteli folyamataira, valamint apoptózis-szabályozási elemeire gyakorolt specifikus hatásait ilyen körülmények között szokás vizsgálni. A glukozidáz II gátlása, valamint a proliferáció- és érképzés-gátló, illetve apoptózisfokozó hatások közötti összefüggés további vizsgálatokat igényel. Az EGCG közvetlenül is képes befolyásolni a GRP78 (BiP) működését azáltal, hogy kompetitíven gátolja annak ATP-áz aktivitását [Ermakova S. P. és mtsai. 2006]. Ez a mechanizmus szintén hozzájárulhat az endoplazmás retikulum lumenében zajló fehérjeérés zavarához. A flavanolok tumorellenes hatásai tehát sokrétűek, és nyilvánvalóan nem egy támadásponton keresztül érvényesülnek. Minden esetre, megfigyeléseink alapján a glikoprotein-érés és -minőségellenőrzés zavarát, az endoplazmás retikulum stressz kialakulását és a következményes apoptotikus stimulusokat figyelembe kell venni a polifenolok hatásmechanizmusának tanulmányozásakor. Semmilyen adat nem utal arra, hogy az EGCG nagyobb koncentrációban halmozódna fel a daganatsejtekben, mint a szervezet egészséges sejtjeiben. Az EGCG azon hatásai, melyeket tumorsejtekben, illetve transzformált sejtvonalakban észleltek (pl. a glukozidáz II gátlása), in vivo alkalmazás esetén feltehetőleg az egészséges sejtekben is kialakulnak. Tény azonban, hogy az EGCG jelentős proapoptotikus hatását
65
eddig csak tumorsejtekben mutatták ki, és hogy az EGCG a jelek szerint anélkül csökkenti a daganatnövekedést, hogy nyilvánvaló károsodásokat okozna a normális szövetekben, és ezáltal súlyos mellékhatásokat idézne elő. Mindez leginkább a folyamatosan magyarázható.
osztódó
transzformált
Természetesen
a
sejtek
fokozott
tumorszelektivitásra
stresszérzékenységével vonatkozó
kérdések
megválaszolása további kutatásokat igényel. Összefoglalva, kimutattuk, hogy EGCG hatására endoplazmás retikulum stressz és részleges UPR alakul ki hepatóma sejtekben. A jelenség hátterében lévő mechanizmusok még tisztázásra várnak. Korábbi megfigyelések a GRP78/BiP chaperon közvetlen gátlásának lehetőségét vetik fel, saját eredményeink pedig a glukozidáz II szerepét valószínűsítik, de az endoplazmás retikulum funkciózavara más célfehérjéken keresztül is kialakulhat. A közvetlen támadásponttól függetlenül azonban az UPR apoptózist indukáló elemeinek aktiválódása hozzájárulhat a katekinek in vitro és in vivo megfigyelt tumorellenes aktivitásához. Eredményeink alapján felvetődik a fehérjeérési és minőségellenőrzési rendszert befolyásoló szerek terápiás alkalmazásának lehetősége is.
66
6. Következtetések Munkánk során a teaflavanolok – elsősorban az EGCG – tumorellenes aktivitásnak egyik legfontosabb elemét, az apoptózis-indukáló hatást tanulmányoztuk. Arra a kérdésre kerestük a választ, hogy az EGCG kivált-e proapoptotikus szignálokat az endoplazmás retikulumból, és ha igen, milyen támadásponton keresztül váltja ki az organellum
stresszreakcióját.
Eredményeinkből
a
következő
következtetésekre
jutottunk: 1.
EGCG hatására a Hepa1c1c7 hepatóma sejtek apoptózisa fokozódik. A programozott sejtpusztulás aktiválódásával szinkronban az endoplazmás retikulumból kiinduló proapoptotikus szignálok (CHOP-indukció, kaszpáz12 hasítása, az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak lassú kiürülése) észlelhetők, tehát az apoptózis – legalább részben – endoplazmás retikulum eredetűnek tekinthető.
2.
A tanulmányozott sejtekben az EGCG-kezelés endoplazmás retikulum stresszt vált ki, amit az organellum morfológiai változásai is jól mutatnak. Ennek következtében részleges UPR mechanizmus indul be, amely nem foglalja ugyan magában az endoplazmás retikulum chaperonjainak és foldázainak indukcióját, de a fent említett jellegzetes proapoptotikus elemek mellett kimutatható az eIF2α foszforilációja is.
3.
Az
észlelt
organellum-stresszt
kiváltó
funkciózavar
magyarázatául
szolgálhat, hogy az EGCG (és egyéb teaflavanolok) hatására hatékonyan gátlódik az endoplazmás retikulum lumenében elhelyezkedő glukozidáz II enzim,
amely
kulcsszerepet
játszik
a
glikoproteinek
érésében
és
minőségellenőrzésében. 4.
A glukozidáz II gátlása hepatóma sejteken és máj mikroszómán egyaránt kimutatható. Az enzimre gyakorolt gátló hatáshoz szükséges a gallát molekularész jelenléte és a gallo-csoport megfelelő konfigurációja. A leghatékonyabb teaflavanol (GCG) IC50 és Ki értékei az ismert glukozidázgátló NBDJ-éhez hasonlók.
67
Összességében tehát arra utalnak eredményeink, hogy az EGCG a glukozidáz II enzim gátlásával megzavarja az endoplazmás retikulum lumenében zajló fehérjeérést és minőségellenőrzést, ami az organellumban stresszt okoz, és az ennek hatására aktiválódó részleges UPR hozzájárul a sejtek apoptotikus pusztulásához. Az általunk észlelt jelenség egyrészt jelentős szerepet játszhat a polifenolok ismert daganatellenes hatásaiban, másrészt felveti a tumorterápia újszerű lehetőségét, és támadáspontként kínálja az endoplazmás retikulumot, illetve az itt zajló „fehérje-processzálásban” résztvevő komponenseket.
68
7. Összefoglalás A teafogyasztás jótékony egészségügyi hatásait elsősorban a teában lévő polifenoloknak tulajdonítják. E vegyületek legtöbbet kutatott képviselőjéről, az EGCG-ről kimutatták, hogy
csökkenti
daganatnövekedést.
a
daganatok
kialakulásának
Antioxidáns
tulajdonsága
kockázatát, mellett
és
akadályozza
a
ebben
közrejátszik
a
sejtproliferáció és vaszkularizáció gátlása, valamint az apotózis fokozása. Az EGCG tumorellenes aktivitása orvosi szempontból rendkívül érdekes, és hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott. Mivel proapoptotikus szignálok az endoplazmás retikulumból is kiindulhatnak, célul tűztük ki annak kiderítését, hogy szerepet játszik-e az organellum működésének befolyásolása az EGCG által kiváltott apoptózis létrejöttében. Vizsgálatainkhoz Hepa1c1c7 hepatóma sejteket és máj mikroszómát használtunk. Az endoplazmás retikulum morfológiáját, valamint kalciumraktárainak állapotát fluoreszcens
mikroszkópiával
tanulmányoztuk.
Az
UPR
aktiválódására
utaló
fehérjeszint-változásokat Western blot technikával detektáltuk. A glukozidáz II aktivitását
fotometriás
és
fluorimetriás
módszerrel
mértük.
A
membrán
permeabilizálásához pórusképző alameticint használtunk. A hepatóma sejtekben az EGCG-kezelés endoplazmás retikulum stresszt váltott ki, amit az organellum morfológiai változásai is jól mutattak. A beinduló részleges UPR nem foglalta ugyan magában az endoplazmás retikulum chaperonjainak és foldázainak indukcióját, de a proapoptotikus elemek (CHOP-indukció, kaszpáz-12 hasítása, az endoplazmás retikulum kalciumraktárainak lassú kiürülése) mellett kimutatható volt az eIF2α foszforilációja is. A kezelés hatására fokozódott a sejtek apoptózisa, ami tehát – legalább részben – endoplazmás retikulum eredetűnek tekinthető. Az organellum-stressz magyarázatául szolgálhat, hogy az EGCG gátolta a glukozidáz II enzimet, amely kulcsszerepet játszik a glikoproteinek érésében és minőségellenőrzésében. Az enzimre gyakorolt gátló hatáshoz szükséges a gallát molekularész jelenléte és a gallo-csoport megfelelő konfigurációja. A leghatékonyabb teaflavanol (GCG) IC50 és Ki értékei az ismert glukozidázgátló NBDJ-éhez hasonlók. Megfigyeléseinkből arra következtettünk, hogy az EGCG a glukozidáz II enzim gátlásával megzavarja az endoplazmás retikulum lumenében zajló fehérjeérést és
69
minőségellenőrzést, ami az organellumban stresszt okoz, és az ennek hatására aktiválódó részleges UPR hozzájárul a sejtek apoptotikus pusztulásához. Az általunk észlelt jelenség egyrészt jelentős szerepet játszhat a polifenolok ismert daganatellenes hatásaiban, másrészt felveti a tumorterápia újszerű lehetőségét, és támadáspontként kínálja az endoplazmás retikulumot, illetve az itt zajló „fehérje-processzálásban” résztvevő komponenseket.
70
8. Summary The advantageous health effects of tea consumption are primarily attributed to the polyphenols abundant in tea. EGCG, the most widely studied representative of these compounds, has been shown to reduce the risk of tumor development and hinder tumor growth. This is due to remarkable antioxidant properties, inhibition of cell prolipheration and vascularization as well as stimulation of apoptosis. The antitumor activity of EGCG is particularly interesting from medical point of view, and its mechanism has not been fully elucidated. Since proapoptotic signals can also be initiated in the endoplasmic reticulum, we hypothesized that altered function of this organelle might play a role in the enhancement of apoptosis by EGCG. Hepa1c1c7 hepatoma cells and liver microsomes were used in this study. Morphology of the endoplasmic reticulum and the state of its calcium store were investigated by using fluorescent microscopy. Alterations in the protein levels indicating the activation of UPR were detected by Western blot technique. Activity of glucosidase II was measured by photometric and fluorimetric methods. The biological membranes were permeabilized by pore-forming antibiotic alamethicin. EGCG treatment induced endoplasmic reticulum stress in the hepatoma cells, which was well indicated by the morphological changes of the organelle. Although the activated partial UPR did not involve the induction of major endoplasmic reticulum chaperones and foldases but the most important proapoptotic elements (CHOPinduction, caspase-12 cleavage, slow depletion of endoplasmic reticulum calcium stores) as well as the enhanced phosphorylation of eIF2α were all detectable. The treatment also induced apoptosis in the hepatoma cells, which therefore was – at least partly – of endoplasmic reticulum origin. It can serve as an explanation for the organelle stress that EGCG inhibited glucosidase II enzyme, which plays a key role in glycoprotein processing and quality control. The presence of gallate moiety and an appropriate configuration of the gallo group were shown to be necessary for the inhibitory effect on glucosidase II. The IC50 and Ki values of the most efficient tea flavanol (GCG) were similar to those of the known glucosidase inhibitor, NBDJ.
71
Our results collectively lead us to the conclusion that EGCG interferes with protein maturation and quality control in the endoplasmic reticulum lumen by inhibiting glucosidase II enzyme. This causes a stress in the organelle, and the consequently triggered partial UPR contributes to the apoptotic cell death. The phenomenon described in this study has a dual importance. On the one hand, it may play a significant role in the well-known antitumor effect of polyphenols. On the other hand, it raises a novel approach in tumor therapy, i.e. it provides endoplasmic reticulum and the components of the local protein processing machinery as potential drug-targets.
72
9. Irodalomjegyzék Alder N. N., Shen Y., Brodsky J. L., Hendershot L. M. és Johnson A. E.: The molecular mechanisms underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol 168: 389-399, 2005 Anton S., Melville L. és Rena G.: Epigallocatechin gallate (EGCG) mimics insulin action on the transcription factor FOXO1a and elicits cellular responses in the presence and absence of insulin. Cell Signal 19: 378-383, 2007 Arendt C. W. és Ostergaard H. L.: Identification of the CD45-associated 116-kDa and 80-kDa proteins as the alpha- and beta-subunits of alpha-glucosidase II. J Biol Chem 272: 13117-13125, 1997 Asano N.: Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology 13: 93R-104R, 2003 Bass R., Ruddock L. W., Klappa P. és Freedman R. B.: A major fraction of endoplasmic reticulum-located glutathione is present as mixed disulfides with protein. J Biol Chem 279: 5257-5262, 2004 Baumann O. és Walz B.: Endoplasmic reticulum of animal cells and its organization into structural and functional domains. Int Rev Cytol 205: 149-214, 2001 Benedetti A., Fulceri R., Romani A. és Comporti M.: MgATP-dependent glucose 6phosphate-stimulated Ca2+ accumulation in liver microsomal fractions. Effects of inositol 1,4,5-trisphosphate and GTP. J Biol Chem 263: 3466, 1988 Bergeron J. J., Brenner M. B., Thomas D. Y. és Williams D. B.: Calnexin: a membranebound chaperone of the endoplasmic reticulum. Trends Biochem Sci 19: 124128, 1994 Bertolotti A., Zhang Y., Hendershot L. M., Harding H. P. és Ron D.: Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol 2: 326-332, 2000 Blond-Elguindi S., Fourie A. M., Sambrook J. F. és Gething M. J.: Peptide-dependent stimulation of the ATPase activity of the molecular chaperone BiP is the result of conversion of oligomers to active monomers. J Biol Chem 268: 12730-12735, 1993 Boelens J., Lust S., Offner F., Bracke M. E. és Vanhoecke B. W.: Review. The endoplasmic reticulum: a target for new anticancer drugs. In Vivo 21: 215-226, 2007 Borgese N., Francolini M. és Snapp E.: Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr Opin Cell Biol 18: 358-364, 2006 Brattin W. J., Jr., Waller R. L. és Recknagel R. O.: Analysis of microsomal calcium sequestration by steady state isotope exchange. Enzyme kinetics and role of membrane permeability. J Biol Chem 257: 10044, 1982 Burchell A., Hume R. és Burchell B.: A new microtechnique for the analysis of the human hepatic microsomal glucose-6-phosphatase system. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry 173: 183, 1988
73
Burda P. és Aebi M.: The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426: 239-257, 1999 Butt M. S. és Sultan M. T.: Green tea: nature's defense against malignancies. Crit Rev Food Sci Nutr 49: 463-473, 2009 Chaudhuri M. M., Tonin P. N., Lewis W. H. és Srinivasan P. R.: The gene for a novel protein, a member of the protein disulphide isomerase/form I phosphoinositidespecific phospholipase C family, is amplified in hydroxyurea-resistant cells. Biochem J 281 ( Pt 3): 645-650, 1992 Chow H. H., Cai Y., Hakim I. A., Crowell J. A., Shahi F., Brooks C. A., Dorr R. T., Hara Y. és Alberts D. S.: Pharmacokinetics and safety of green tea polyphenols after multiple-dose administration of epigallocatechin gallate and polyphenon E in healthy individuals. Clin Cancer Res 9: 3312-3319, 2003 Csala M., Banhegyi G. és Benedetti A.: Endoplasmic reticulum: a metabolic compartment. FEBS Lett 580: 2160-2165, 2006 D'Alessio C., Fernandez F., Trombetta E. S. és Parodi A. J.: Genetic evidence for the heterodimeric structure of glucosidase II. The effect of disrupting the subunitencoding genes on glycoprotein folding. J Biol Chem 274: 25899-25905, 1999 Demeule M., Michaud-Levesque J., Annabi B., Gingras D., Boivin D., Jodoin J., Lamy S., Bertrand Y. és Beliveau R.: Green tea catechins as novel antitumor and antiangiogenic compounds. Curr Med Chem Anticancer Agents 2: 441-463, 2002 Di Virgilio F., Fasolato C. és Steinberg T. H.: Inhibitors of membrane transport system for organic anions block fura-2 excretion from PC12 and N2A cells. Biochem J 256: 959-963, 1988 Dixon B. M., Heath S. H., Kim R., Suh J. H. és Hagen T. M.: Assessment of endoplasmic reticulum glutathione redox status is confounded by extensive ex vivo oxidation. Antioxid Redox Signal 10: 963-972, 2008 Elbein A. D.: Glycosidase inhibitors as antiviral and/or antitumor agents. Semin Cell Biol 2: 309-317, 1991a Elbein A. D.: Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. Faseb J 5: 3055-3063, 1991b Ellgaard L. és Helenius A.: Quality control in the endoplasmic reticulum. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 181-191, 2003 Ermakova S. P., Kang B. S., Choi B. Y., Choi H. S., Schuster T. F., Ma W. Y., Bode A. M. és Dong Z.: (-)-Epigallocatechin gallate overcomes resistance to etoposideinduced cell death by targeting the molecular chaperone glucose-regulated protein 78. Cancer Res 66: 9260-9269, 2006 Ferri K. F. és Kroemer G.: Organelle-specific initiation of cell death pathways. Nat Cell Biol 3: E255-263, 2001 Flynn G. C., Chappell T. G. és Rothman J. E.: Peptide binding and release by proteins implicated as catalysts of protein assembly. Science 245: 385-390, 1989 Forrest G. I.: Effects of light and darkness on polyphenol distribution in the tea plant (Camellia sinensis L.). Biochem J 113: 773-781, 1969
74
Forrest G. I. és Bendall D. S.: The distribution of polyphenols in the tea plant (Camellia sinensis L.). Biochem J 113: 741-755, 1969 Freedman R. B., Hirst T. R. és Tuite M. F.: Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci 19: 331-336, 1994 Frei B. és Higdon J. V.: Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: evidence from animal studies. J Nutr 133: 3275S-3284S, 2003 Gamberucci A., Giunti R. és Benedetti A.: Progesterone inhibits capacitative Ca2+ entry in Jurkat T lymphocytes by a membrane delimited mechanism, independently of plasma membrane depolarization. Cell Calcium 36: 175-180, 2004 Graham H. N.: Green tea composition, consumption, and polyphenol chemistry. Prev Med 21: 334-350, 1992 Haas I. G. és Wabl M.: Immunoglobulin heavy chain binding protein. Nature 306: 387389, 1983 Hastak K., Agarwal M. K., Mukhtar H. és Agarwal M. L.: Ablation of either p21 or Bax prevents p53-dependent apoptosis induced by green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate. Faseb J 19: 789-791, 2005 Hastak K., Gupta S., Ahmad N., Agarwal M. K., Agarwal M. L. és Mukhtar H.: Role of p53 and NF-kappaB in epigallocatechin-3-gallate-induced apoptosis of LNCaP cells. Oncogene 22: 4851-4859, 2003 He K., Ludtke S. J., Huang H. W. és Worcester D. L.: Antimicrobial peptide pores in membranes detected by neutron in-plane scattering. Biochemistry 34: 15614, 1995 Herscovics A.: Importance of glycosidases in mammalian glycoprotein biosynthesis. Biochim Biophys Acta 1473: 96-107, 1999 Hirano N., Shibasaki F., Kato H., Sakai R., Tanaka T., Nishida J., Yazaki Y., Takenawa T. és Hirai H.: Molecular cloning and characterization of a cDNA for bovine phospholipase C-alpha: proposal of redesignation of phospholipase C-alpha. Biochem Biophys Res Commun 204: 375-382, 1994 Ho Y. C., Yang S. F., Peng C. Y., Chou M. Y. és Chang Y. C.: Epigallocatechin-3gallate inhibits the invasion of human oral cancer cells and decreases the productions of matrix metalloproteinases and urokinase-plasminogen activator. J Oral Pathol Med 36: 588-593, 2007 Holst B., Bruun A. W., Kielland-Brandt M. C. és Winther J. R.: Competition between folding and glycosylation in the endoplasmic reticulum. Embo J 15: 3538-3546, 1996 Hong J., Smith T. J., Ho C. T., August D. A. és Yang C. S.: Effects of purified green and black tea polyphenols on cyclooxygenase- and lipoxygenase-dependent metabolism of arachidonic acid in human colon mucosa and colon tumor tissues. Biochem Pharmacol 62: 1175-1183, 2001 Hubbard S. C. és Ivatt R. J.: Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rev Biochem 50: 555-583, 1981
75
Hwang C., Sinskey A. J. és Lodish H. F.: Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257: 1496-1502, 1992 Kao Y. H., Hiipakka R. A. és Liao S.: Modulation of endocrine systems and food intake by green tea epigallocatechin gallate. Endocrinology 141: 980-987, 2000 Karaskov E., Scott C., Zhang L., Teodoro T., Ravazzola M. és Volchuk A.: Chronic palmitate but not oleate exposure induces endoplasmic reticulum stress, which may contribute to INS-1 pancreatic beta-cell apoptosis. Endocrinology 147: 3398-3407, 2006 Khan N., Afaq F., Saleem M., Ahmad N. és Mukhtar H.: Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate. Cancer Res 66: 2500-2505, 2006 Kim M. H., Jung M. A., Hwang Y. S., Jeong M., Kim S. M., Ahn S. J., Shin B. A., Ahn B. W. és Jung Y. D.: Regulation of urokinase plasminogen activator by epigallocatechin-3-gallate in human fibrosarcoma cells. Eur J Pharmacol 487: 16, 2004 Koch J. és Tampe R.: The macromolecular peptide-loading complex in MHC class Idependent antigen presentation. Cell Mol Life Sci 63: 653-662, 2006 Kornfeld R. és Kornfeld S.: Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rev Biochem 54: 631-664, 1985 Koyama Y., Abe K., Sano Y., Ishizaki Y., Njelekela M., Shoji Y., Hara Y. és Isemura M.: Effects of green tea on gene expression of hepatic gluconeogenic enzymes in vivo. Planta Med 70: 1100-1102, 2004 Lambert J. D. és Yang C. S.: Mechanisms of cancer prevention by tea constituents. J Nutr 133: 3262S-3267S, 2003 Liang Y. C., Lin-Shiau S. Y., Chen C. F. és Lin J. K.: Inhibition of cyclin-dependent kinases 2 and 4 activities as well as induction of Cdk inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast carcinoma cells by (-)-epigallocatechin-3gallate. J Cell Biochem 75: 1-12, 1999 Lin H. Y., Masso-Welch P., Di Y. P., Cai J. W., Shen J. W. és Subjeck J. R.: The 170kDa glucose-regulated stress protein is an endoplasmic reticulum protein that binds immunoglobulin. Mol Biol Cell 4: 1109-1119, 1993 Lin S. K., Shun C. T., Kok S. H., Wang C. C., Hsiao T. Y. és Liu C. M.: Hypoxiastimulated vascular endothelial growth factor production in human nasal polyp fibroblasts: effect of epigallocatechin-3-gallate on hypoxia-inducible factor-1 alpha synthesis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 134: 522-527, 2008 Lin Y. S., Tsai Y. J., Tsay J. S. és Lin J. K.: Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves. J Agric Food Chem 51: 1864-1873, 2003 Lizak B., Csala M., Benedetti A. és Banhegyi G.: The translocon and the non-specific transport of small molecules in the endoplasmic reticulum (Review). Mol Membr Biol 25: 95-101, 2008
76
Mandl J., Meszaros T., Banhegyi G., Hunyady L. és Csala M.: Endoplasmic reticulum: nutrient sensor in physiology and pathology. Trends Endocrinol Metab 20: 194201, 2009 Marks A. R.: Intracellular calcium-release channels: regulators of cell life and death. Am J Physiol 272: H597-605, 1997 Mazzarella R. A., Srinivasan M., Haugejorden S. M. és Green M.: ERp72, an abundant luminal endoplasmic reticulum protein, contains three copies of the active site sequences of protein disulfide isomerase. J Biol Chem 265: 1094-1101, 1990 Meusser B., Hirsch C., Jarosch E. és Sommer T.: ERAD: the long road to destruction. Nat Cell Biol 7: 766-772, 2005 Michalak M., Milner R. E., Burns K. és Opas M.: Calreticulin. Biochem J 285 ( Pt 3): 681-692, 1992 Mikoshiba K.: IP3 receptor/Ca2+ channel: from discovery to new signaling concepts. J Neurochem 102: 1426-1446, 2007 Mittal A., Pate M. S., Wylie R. C., Tollefsbol T. O. és Katiyar S. K.: EGCG downregulates telomerase in human breast carcinoma MCF-7 cells, leading to suppression of cell viability and induction of apoptosis. Int J Oncol 24: 703-710, 2004 Miyazawa T.: Absorption, metabolism and antioxidative effects of tea catechin in humans. Biofactors 13: 55-59, 2000 Naasani I., Seimiya H. és Tsuruo T.: Telomerase inhibition, telomere shortening, and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochem Biophys Res Commun 249: 391-396, 1998 Nanjo F., Mori M., Goto K. és Hara Y.: Radical scavenging activity of tea catechins and their related compounds. Biosci Biotechnol Biochem 63: 1621-1623, 1999 Nihal M., Ahmad N., Mukhtar H. és Wood G. S.: Anti-proliferative and proapoptotic effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on human melanoma: possible implications for the chemoprevention of melanoma. Int J Cancer 114: 513-521, 2005 Nilsson I. M. és von Heijne G.: Determination of the distance between the oligosaccharyltransferase active site and the endoplasmic reticulum membrane. J Biol Chem 268: 5798-5801, 1993 Ong H. L., Liu X., Tsaneva-Atanasova K., Singh B. B., Bandyopadhyay B. C., Swaim W. D., Russell J. T., Hegde R. S., Sherman A. és Ambudkar I. S.: Relocalization of STIM1 for activation of store-operated Ca(2+) entry is determined by the depletion of subplasma membrane endoplasmic reticulum Ca(2+) store. J Biol Chem 282: 12176-12185, 2007 Ostwald T. J. és MacLennan D. H.: Isolation of a high affinity calcium-binding protein from sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem 249: 974-979, 1974 Palade G. E.: The endoplasmic reticulum. J Biophys Biochem Cytol 2: 85-98, 1956 Parodi A. J.: Protein glucosylation and its role in protein folding. Annu Rev Biochem 69: 69-93, 2000a
77
Parodi A. J.: Role of N-oligosaccharide endoplasmic reticulum processing reactions in glycoprotein folding and degradation. Biochem J 348 Pt 1: 1-13, 2000b Pillai S. P., Mitscher L. A., Menon S. R., Pillai C. A. és Shankel D. M.: Antimutagenic/antioxidant activity of green tea components and related compounds. J Environ Pathol Toxicol Oncol 18: 147-158, 1999 Qin J., Chen H. G., Yan Q., Deng M., Liu J., Doerge S., Ma W., Dong Z. és Li D. W.: Protein phosphatase-2A is a target of epigallocatechin-3-gallate and modulates p53-Bak apoptotic pathway. Cancer Res 68: 4150-4162, 2008 Ruddock L. W. és Molinari M.: N-glycan processing in ER quality control. J Cell Sci 119: 4373-4380, 2006 Rutkowski D. T. és Kaufman R. J.: That which does not kill me makes me stronger: adapting to chronic ER stress. Trends Biochem Sci 32: 469-476, 2007 Sadava D., Whitlock E. és Kane S. E.: The green tea polyphenol, epigallocatechin-3gallate inhibits telomerase and induces apoptosis in drug-resistant lung cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 360: 233-237, 2007 Schroder M. és Kaufman R. J.: The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem 74: 739-789, 2005 Schroder M. és Kaufman R. J.: Divergent roles of IRE1alpha and PERK in the unfolded protein response. Curr Mol Med 6: 5-36, 2006 Sevier C. S. és Kaiser C. A.: Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 836-847, 2002 Shankar S., Suthakar G. és Srivastava R. K.: Epigallocatechin-3-gallate inhibits cell cycle and induces apoptosis in pancreatic cancer. Front Biosci 12: 5039-5051, 2007 Shibata Y., Voeltz G. K. és Rapoport T. A.: Rough sheets and smooth tubules. Cell 126: 435-439, 2006 Shimizu M. és Weinstein I. B.: Modulation of signal transduction by tea catechins and related phytochemicals. Mutat Res 591: 147-160, 2005 Silva M. M., Santos M. R., Caroco G., Rocha R., Justino G. és Mira L.: Structureantioxidant activity relationships of flavonoids: a re-examination. Free Radic Res 36: 1219-1227, 2002 Sorger P. K. és Pelham H. R.: The glucose-regulated protein grp94 is related to heat shock protein hsp90. J Mol Biol 194: 341-344, 1987 Subramanian K. és Meyer T.: Calcium-induced restructuring of nuclear envelope and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell 89: 963-971, 1997 Sumpio B. E., Cordova A. C., Berke-Schlessel D. W., Qin F. és Chen Q. H.: Green tea, the "Asian paradox," and cardiovascular disease. J Am Coll Surg 202: 813-825, 2006 Szegezdi E., Logue S. E., Gorman A. M. és Samali A.: Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. EMBO Rep 7: 880-885, 2006
78
Szegezdi E., Macdonald D. C., Ni Chonghaile T., Gupta S. és Samali A.: Bcl-2 family on guard at the ER. Am J Physiol Cell Physiol 296: C941-953, 2009 Tatu U. és Helenius A.: Interactions between newly synthesized glycoproteins, calnexin and a network of resident chaperones in the endoplasmic reticulum. J Cell Biol 136: 555-565, 1997 Tjoelker L. W., Seyfried C. E., Eddy R. L., Jr., Byers M. G., Shows T. B., Calderon J., Schreiber R. B. és Gray P. W.: Human, mouse, and rat calnexin cDNA cloning: identification of potential calcium binding motifs and gene localization to human chromosome 5. Biochemistry 33: 3229-3236, 1994 Trombetta E. S., Simons J. F. és Helenius A.: Endoplasmic reticulum glucosidase II is composed of a catalytic subunit, conserved from yeast to mammals, and a tightly bound noncatalytic HDEL-containing subunit. J Biol Chem 271: 27509-27516, 1996 Trombetta S. E. és Parodi A. J.: Purification to apparent homogeneity and partial characterization of rat liver UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase. J Biol Chem 267: 9236-9240, 1992 Tu B. P. és Weissman J. S.: Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J Cell Biol 164: 341-346, 2004 Vangestel C., Van de Wiele C., Mees G. és Peeters M.: Forcing cancer cells to commit suicide. Cancer Biother Radiopharm 24: 395-407, 2009 Vassilakos A., Michalak M., Lehrman M. A. és Williams D. B.: Oligosaccharide binding characteristics of the molecular chaperones calnexin and calreticulin. Biochemistry 37: 3480-3490, 1998 Venetianer P. és Straub F. B.: The Mechanism of Action of the RibonucleaseReactivating Enzyme. Biochim Biophys Acta 89: 189-190, 1964 Venetianer P. és Straub F. B.: Studies on the Mechanism of Action of the RibonucleaseReactivating Enzyme. Acta Physiol Acad Sci Hung 27: 303-315, 1965 Voeltz G. K., Rolls M. M. és Rapoport T. A.: Structural organization of the endoplasmic reticulum. EMBO Rep 3: 944-950, 2002 Waltner-Law M. E., Wang X. L., Law B. K., Hall R. K., Nawano M. és Granner D. K.: Epigallocatechin gallate, a constituent of green tea, represses hepatic glucose production. J Biol Chem 277: 34933-34940, 2002 Wang H. Q., Du Z. X., Zhang H. Y. és Gao D. X.: Different induction of GRP78 and CHOP as a predictor of sensitivity to proteasome inhibitors in thyroid cancer cells. Endocrinology 148: 3258-3270, 2007 Wang X., Hao M. W., Dong K., Lin F., Ren J. H. és Zhang H. Z.: Apoptosis induction effects of EGCG in laryngeal squamous cell carcinoma cells through telomerase repression. Arch Pharm Res 32: 1263-1269, 2009 Wang Y. és Ho C. T.: Polyphenolic chemistry of tea and coffee: a century of progress. J Agric Food Chem 57: 8109-8114, 2009
79
Weng S. és Spiro R. G.: Demonstration that a kifunensine-resistant alpha-mannosidase with a unique processing action on N-linked oligosaccharides occurs in rat liver endoplasmic reticulum and various cultured cells. J Biol Chem 268: 2565625663, 1993 Westwell A. D.: Inhibitors of the Hdm2:p53 complex as antitumour agents. Drug Discovery Today 11: 371-371, 2006 Wolfram S., Wang Y. és Thielecke F.: Anti-obesity effects of green tea: from bedside to bench. Mol Nutr Food Res 50: 176-187, 2006 Woolley G. A. és Wallace B. A.: Model ion channels: gramicidin and alamethicin. J Membr Biol 129: 109-136, 1992 Wu J. és Kaufman R. J.: From acute ER stress to physiological roles of the Unfolded Protein Response. Cell Death Differ 13: 374-384, 2006 Xu H., Lui W. T., Chu C. Y., Ng P. S., Wang C. C. és Rogers M. S.: Anti-angiogenic effects of green tea catechin on an experimental endometriosis mouse model. Hum Reprod 24: 608-618, 2009 Yamauchi R., Sasaki K. és Yoshida K.: Identification of epigallocatechin-3-gallate in green tea polyphenols as a potent inducer of p53-dependent apoptosis in the human lung cancer cell line A549. Toxicol In Vitro 23: 834-839, 2009 Yang D. J., Hwang L. S. és Lin J. T.: Effects of different steeping methods and storage on caffeine, catechins and gallic acid in bag tea infusions. J Chromatogr A 1156: 312-320, 2007 Yao L., Caffin N., D'Arcy B., Jiang Y., Shi J., Singanusong R., Liu X., Datta N., Kakuda Y. és Xu Y.: Seasonal variations of phenolic compounds in Australiagrown tea (Camellia sinensis). J Agric Food Chem 53: 6477-6483, 2005 Zhang Q., Tang X., Lu Q., Zhang Z., Rao J. és Le A. D.: Green tea extract and (-)epigallocatechin-3-gallate inhibit hypoxia- and serum-induced HIF-1alpha protein accumulation and VEGF expression in human cervical carcinoma and hepatoma cells. Mol Cancer Ther 5: 1227-1238, 2006 Zong W. X., Li C., Hatzivassiliou G., Lindsten T., Yu Q. C., Yuan J. és Thompson C. B.: Bax and Bak can localize to the endoplasmic reticulum to initiate apoptosis. J Cell Biol 162: 59-69, 2003
80
10. Saját közlemények jegyzéke
10.1. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények 1.
Gamberucci A., Konta L., Colucci A., Giunti R., Magyar J.É., Mandl J., Bánhegyi G., Benedetti A., Csala M.: Green tea flavonols inhibit glucosidase II. Biochem. Pharmacol. 72, 640-646, 2006; IF: 3,581
2.
Magyar J.É., Gamberucci A., Konta L., Margittai É., Mandl J., Bánhegyi G., Benedetti A., Csala M.: Endoplasmic reticulum stress underlying the pro-apoptotic effect of epigallocatechin gallate in mouse hepatoma cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41, 694-700, 2009; IF: 4,887
3.
Magyar J.É., Konta L., Bánhegyi G., Mandl J., Csala M.: Zöldtea-flavonolok hatása a glukozidáz II enzim aktivitására. (absztrakt) Biokémia 3, 74, 2006
10.2. A disszertációtól független közlemények 1.
Révész K., Tüttő A., Margittai É., Bánhegyi G., Magyar J.É., Mandl J., Csala M.: Glucuronide transport across the endoplasmic reticulum membrane is inhibited by epigallocatechin gallate and other green tea polyphenols. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39, 922-930, 2007; IF: 4,009
2.
Csala M., Marcolongo P., Lizák B., Senesi S., Margittai É, Fulceri R, Magyar J.É., Benedetti A., Bánhegyi G.: Transport and transporters in the endoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes) 1768, 1325-1341, 2007; IF: 3,640
81
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet Patobiokémiai Kutatócsoportja munkatársainak, ahol doktorandusz hallgatóként folytattam tanulmányaimat és kutatómunkámat 2005-2008 között. Külön köszönettel tartozom témavezetőmnek Dr. Csala Miklósnak, aki szakmai tanácsaival, és kritikai észrevételeivel nagyban segítette munkámat. Köszönettel tartozom még Dr. Mandl József professzor úrnak, aki lehetővé tette, hogy kutatócsoportjában dolgozhassak. Emellett köszönet illeti a kísérletekhez nyújtott elméleti és gyakorlati hozzájárulásáért Dr. Wunderlich Líviust, Dr. Lizák Beátát, Dr. Margittai Évát és Mile Valériát; valamint az értekezés hibáinak kijavításában nyújtott segítségéért Kereszturi Évát. A kísérletek egy része Olaszországban (Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica, Università di Siena, Siena) készült, és ezért külön köszönet illeti Angelo Benedetti professzort, Angela Coluccit, Alessandra Gamberuccit és Roberta Giuntit.
82
