Az arzén-kezelés indukálta stressz-folyamatok

Az arzén-kezelés indukálta stressz-folyamatok Doktori értekezés Készítette: Czech Viktória ELTE Biológia Doktori Iskola Prof. Dr. Erdei Anna Kísérletes növénybiológia Doktori Program Prof. Dr. Szigeti Zoltán

Témavezető: Dr. Cseh Edit

Dr. Fodor Ferenc

egyetemi docens

egyetemi docens, Ph.D.

Eötvös Lóránd Tudományegyetem Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék

2014 Budapest

1

Rövidítésjegyzék

As(III)

Arzenit

As(V)

Arzenát

MMA

Monometilarzenát

DMA

Dimetilarzenát

AA

Aszkorbinsav

MDHA

Monodehidro-aszkorbát

DHA

Dehidro-aszkorbát

AAO

Aszkorbinsav oxidáz

AR

Arzenát reduktáz

AMT

Arzén metiltranszferáz

MDA

Malondialdehid

MIP

Major Intrinsic Protein

MSI

Membrán stabilitási index

PC

Fitokelatin

ROS

Reaktív oxigén-forma

SAM

S-adenozil-metionin

SAH

S-adenozil-homocisztein

WSD

Víztelítési hiány

XANES

X-ray Absorption Near Edge Structure

2

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke Irodalmi áttekintés ............................................................................................................... 5 1.1 Az arzén ....................................................................................................................... 5 1.2 Az arzén előfordulása a talajban és a talajvízben. ....................................................... 5 1.3 Az arzén felvétele és transzlokációja a növényekben .................................................. 7 1.3.1 Felvétel ................................................................................................................. 7 1.3.2 Transzlokáció ....................................................................................................... 9 1.4 Szenzitivitás és tolerancia .......................................................................................... 12 1.5 Az arzén okozta oxidatív stressz: az aszkorbinsav és az aszkorbinsav-oxidáz szerepe .................................................................................................................................... 13 1.5.1 Az arzén okozta oxidatív stressz ........................................................................ 13 1.5.2 Az aszkorbinsav-oxidáz ..................................................................................... 14 2 A téma aktualitása, a munkánk célja.................................................................................. 16 3 Anyag és módszer .............................................................................................................. 18 3.1 A növények nevelése ................................................................................................. 18 3.2 Arzén-kezelés ............................................................................................................. 19 3.3 Higany-kezelés ........................................................................................................... 20 3.4 Szilícium-kezelés ....................................................................................................... 20 3.5 Friss- és száraztömeg mérés....................................................................................... 20 3.6 Víztelítési hiány (WSD) ............................................................................................. 20 3.7 Sztóma-konduktancia ................................................................................................. 21 3.8 Könnyezési nedv ........................................................................................................ 21 3.9 Vezetőképesség .......................................................................................................... 22 3.10 Uborkalevél gyökereztetés ......................................................................................... 22 3.11 Malondialdehid meghatározás ................................................................................... 23 3.12 Aszkorbinsav-meghatározás ...................................................................................... 23 3.13 Aszkorbinsav oxidáz aktivitásának vizsgálata ........................................................... 24 3.14 Elemanalitikai meghatározás (HPLC-ICP-MS, FIA) ................................................ 24 3.15 Szövettani vizsgálatok ............................................................................................... 24 3.16 Mini-X Ag analízis .................................................................................................... 25 3.17 Röntgenfluoreszcens konfokális leképezés (XRF-CI) ............................................... 25 3.18 XANES (X-ray Absorption Near Edge) .................................................................... 25 3.19 Mintavétel és statisztikai számítások ......................................................................... 26 4 Eredmények ....................................................................................................................... 27 4.1 Az arzén-kezelések hatásai ........................................................................................ 27 4.1.1 Az As(V)- és az As(III)-kezelések összehasonlítása, a foszfát-védő hatása ..... 27 4.1.2 Az As(V)-kezelés hatása a növény vízháztartására ........................................... 29 4.1.3 Az As(V) és a Hg(II) hatásának összehasonlítása ............................................. 30 4.1.4 Az ionleadás mértéke az As(V)-kezelés mellett ................................................ 33 4.1.5 A különböző Fe-komplexek hatása.................................................................... 34 1

3

5

6 7 8 9

4.2 A növény fejlettségi állapota és az As(V)-kezelés hatása ......................................... 36 4.3 Az As(V) és az As(III) toxikus hatásának kivédése .................................................. 42 4.3.1 A Fe(II)-aszkorbát és a szilícium (H2SiO3) hatása ............................................ 42 4.3.2 Az aszkorbinsav-tartalom alakulása .................................................................. 51 4.3.3 Az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása .......................................................... 54 4.4 Az As(V)-kezelés hatásainak szövettani vizsgálata uborka hipokotilban ................. 57 4.5 A felvett arzén koncentrációjának és eloszlásának közvetlen mérése ....................... 58 4.5.1 HPLC-ICP-MS ................................................................................................... 58 4.5.2 XANES .............................................................................................................. 60 4.5.3 Mini X-Ag analízis és XANES .......................................................................... 62 4.5.4 A röntgenfluoreszcens konfokális leképezés eredményei ................................. 65 Az eredmények megvitatása .............................................................................................. 67 5.1 Az arzén felvétele ...................................................................................................... 67 5.2 Az As-kezelés hatása a növény vízháztartására ......................................................... 68 5.3 A növény fejlettségi állapotától függő arzén-hatás .................................................... 70 5.4 Az As(V) és az As(III) okozta oxidatív stressz, a Fe(II)-aszkorbát hatás ................. 72 5.5 Az aszkorbinsav-koncentráció változása ................................................................... 73 5.6 Az aszkorbinsav-oxidáz ............................................................................................. 74 5.7 Szilícium hatása és az As(III)-kezelés ....................................................................... 76 5.8 Az arzén akkumuláció helye a növényben ................................................................. 77 Összefoglalás ..................................................................................................................... 79 Summary ............................................................................................................................ 81 Függelék ............................................................................................................................. 83 Irodalomjegyzék ................................................................................................................ 89

4

1

Irodalmi áttekintés

1.1 Az arzén Az arzén végigkíséri az emberiség történelmét. Mérgező hatását minden korban előszeretettel alkalmazzák, de mindent megpróbálnak megtenni azért is, hogy ezt a hatást el tudják kerülni, elsősorban azokon a területeken, ahol a talaj és a vizek arzénnel szennyezettek. Elnevezését a görög Arsenikon, férfias szóból származtatják. Az arzén az átmeneti fémek csoportjába tartozó elem, relatív atomtömege 74,9216, egy természetes izotópja létezik (75As). Oxidációs száma vegyületeiben +5, +3 és –3 lehet. Az arzén és vegyületei erősen toxikusak. A toxicitása elsősorban kémiai módosulatától függ és csak másodsorban a koncentrációjától.

1.2 Az arzén előfordulása a talajban és a talajvízben. Természetes előfordulása a földkéregben átlagosan 1,8 mg kg-1, így a 20. leggyakrabban előforduló elem. Megtalálható a természetes ásványi anyagokban, például a kőszénben 5–45 g t-1, a kőolajban 0,2–0,3 mg l-1 koncentrációban. Az arzén a természetes vizekben is előfordul: folyóvízben 1,7 µg l-1µg/l, tengervízben 3,7 µg l-1µg/l, ásványvizekben 1–190 µg l-1. A levegő arzén-tartalma (európai átlag): 16 ng / m-3. A környezetünkben megjelenő magas arzén-koncentráció vagy természetes, vagy antropogén eredetű lehet. Természetes eredetű arzénnel a kőzetek fizikai-kémiai és biológiai málása során, vulkáni működések hatására, valamint melegvízforrások mellett találkozhatunk. Az antropogén eredetű arzén a bányászat és érc feldolgozás melléktermékeként, geológiai eredetű arzént tartalmazó talajvizek hasznosítása során, növényvédő szerek, fakonzerváló anyagok használatakor jelenik meg. Irodalmi adatok szerint a természetes : antropogén eredetű arzénszennyezés mértékének aránya kb. 60 : 40, tehát az emberi tevékenység nagymértékben beleavatkozik az arzén környezeti körforgásába (Chilvers, 1987). Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) vizsgálatai alapján az ivóvízben található nagy dózisú arzén rendszeres fogyasztása hiperpigmentációt, szarusodást, bőr- és hólyagrákot, végtagi érrendellenességeket

5

(üszkösödést,

Black

Foot

Disease)

idézhet

elő.

Az

arzén

koraszülést,

születési

rendellenességeket, rákos daganatokat okozhat. Magyarországon az arzénszennyezés fő forrásai: a bányászat és az ércfeldolgozás (Ajkai Timföldgyár), a fölhagyott bányák meddőhányói (Mecsek), a korábban nagy mennyiségben alkalmazott arzéntartalmú növényvédő szerek és a geológiai eredetű arzén tartalmú rétegvizek hasznosítása. Hazánkban sokáig az egészségügyi határérték 50 ppm volt. Először 1981-ben detektáltak természetes eredetű, 50 ppm-nél nagyobb arzén koncentrációt ivóvízben. 2001-ben, az EU-jogharmonizáció következményeként jelentős szigorítás lépett életbe az ivóvíz megengedett arzéntartalma tekintetében: A korábbi 50 ppm határérték 10 ppm-re csökkent (201/2001.(X.25.) Kormányrendelet). Az ivóvíz megengedett maximális arzén-tartalma jelenleg 10 µg dm-3 az Európai Unió területén. Az arzén a talajban és a talaj oldatokban szerves és szervetlen formában is előfordul, és a növények számára könnyen felvehető. Az aerob talajokban az arzenát (As[V]), a hozzá fizikai-kémiai tulajdonságaiban hasonló foszfáttal analóg módon, a vas- és az alumíniumoxidhoz kapcsolódva fordul elő. A talajoldatokban az arzenát disszociált formában van jelen. Savas körülmények között, a H2AsO4- forma dominál, neutrális és lúgos pH mellett a HAsO42forma a jellemző. Az anaerob talajok stabil, szervetlen alakja, az arzenit (As[III]). A talajban főleg disszociálatlan (H3AsO3) formában található meg (Abedin et al., 2002a). Az As(III) mobilisabb, mint az As(V), mivel az ásványi anyagok felszínére kevésbé adszorbeálódik. Ismert az arzenát mikrobiológiai redukciója arzenitté bizonyos baktériumok, algák és gombák közreműködésével, arzén tartalmú üledékekből (Cullen and Reimer 1989, Silver 1993, Diorio 1995). Toxikológiai vizsgálatok bizonyították, hogy a szervetlen arzén-formák könnyen fölszívódó, bioaktív formák, melyek erősen karcinogén (Bertolero et al., 1987), mutagén és teratogén hatásúak (Schoen 2004). Kis mennyiségben szerves arzén-formák (pl. MMA, DMA) is előfordulhatnak a talajban, ezek általában herbicid szennyezésre utalnak. Az új, kis anyagmennyiségeket azonosítani tudó méréstechnikák lehetővé tették a szerves arzénvegyületek meghatározását (mikroorganizmusokban, algákban, mohákban, gombákban és magasabb rendű növényekben egyaránt). Az As(III) és As(V) egyaránt képez szerves vegyületeket, de leggyakrabban öt vegyértékű az arzén. A magasabbrendű növényekben a

6

metilált származékok (monometil-arzenát, dimetil-arzenát) a legelterjedtebbek vagy a legkönnyebben mérhetőek. (Dembitsky and Rezanka, 2003).

1.3 Az arzén felvétele és transzlokációja a növényekben 1.3.1 Felvétel A foszfát-felesleg csökkenti az arzenát felvételét növényekben, mivel az arzenát foszfát-analógként viselkedik (Asher and Reay, 1979, Meharg and Macnair, 1990, 1992, Clark et al., 2000, Pickering et al., 2000, Bleeker et al., 2003, Wang et al., 2002). A foszfát az arzenát-influxot kompetitíve gátolja, mivel az arzenát ugyan azon a felvételi rendszeren vevődik föl, mint a foszfát. A foszfát-elvonás hatására nő a növényben az arzén-influx (Tu et al., 2004). Egyes irodalmi adatok szerint a transzporternek a foszfáthoz nagyobb az affinitása, mint az arzenáthoz (Wang et al., 2002). Azonban Poyton és munkatársai (2004) ennek az ellenkezőjét bizonyították. Ha a transzporternek egyenlő lenne az affinitása az arzenáthoz és a foszfáthoz, akkor az egyenlő koncentrációban adott arzenát és foszfát esetében, a foszfátnak, közel 50%-ra kellene redukálni az arzenát felvételét. Kísérleteik során azonban ez az érték csak körülbelül 30% volt, így arra következtetettek, hogy a transzporternek nagyobb az affinitása az arzenáthoz, mint a foszfáthoz. A foszfát az As(III) felvételét nem befolyásolja (Abedin et al., 2002a,Wang et al., 2002), mivel az arzenit más felvételi rendszeren keresztül vevődik fel (Tu et al., 2004). Az As(V) felvételről, a közös foszfát transzporter miatt régebbről származó (Asher and Reay, 1979) és sokkal részletesebb ismereteink vannak (Ullrich-Eberius, 1989, Meharg et al., 1994, Singh et al., 2006). Az arzenit felvételről, egészen napjainkig sokkal kevesebbet tudunk, annak ellenére, hogy a felvételének mértéke felülmúlhatja az As(V) felvételét (Aberdin et al., 2002b, Meharg and Jardine, 2003). Előre mutató lépést jelentett az aquaporinoknak a transzportban játszott szerepének megismerése, később a Si-felvételében és leadásában szereplő fehérjék azonosítása (Ali et al., 2009). Az aquaporinok felfedezése a mikroorganizmusokban és a magasabbrendű növényekben és annak felismerése, hogy nemcsak a vízmolekulákat, hanem más, töltés nélküli, kisebb molekulákat (pl. glicerin, urea, bórsav) is 7

áteresztenek, elvezetett ahhoz a feltételezéshez, hogy az arzenit is szállítódhat a csatornákon keresztül. Meharg és Jardine (2003) igazolták is a glicerin és az As(III) közötti felvételi kompetíciót. Az As(III) influx- efflux mechanizmusának a megértéséhez a MIP fehérjék (Major Intrinsic Protein) kutatása vezetett. Jelenleg a növényekben négy alcsaládról vannak részletes ismereteink (PIP, TIP, NIP, SIP). Az aquaporinokról a jelenlegi ismereteink részletes leírását Gomes et al. (2009) összefoglalójában találjuk meg. A NIP alcsalád a plazmamembránokban és a belső membránokban is megtalálható, pl. az endoplazmatikus retikulumban. A PIP és a TIP fehérjéktől elsősorban abban különböznek, hogy csak kismértékben vízáteresztők, de permeábilisek a glicerinre, az ureára, a bórsavra és a tejsavra is. A NIP2:1 a rizsben, a NIP7:1 az Arabidopsis-ban a szilíciumot szállítja. A szilíciumot transzportáló csatornák képesek az As(III) transzlokációjára is. A szilícium influx-efflux transzportereket először rizsben (Ma et al., 2006), újabban a kukoricában (Mitani et al., 2009) és az uborkában is vizsgálták. Az uborka szilícium-kumuláló növény (Liang et al., 2005). A szilíciumnak antioxidáns hatása is van, mivel uborkában só stress esetén (Zhu et al., 2004), megnöveli az antioxidáns enzimek aktivitását és csökkenti a lipid peroxidációt az árpa gyökérben (Liang et a., 2003). A szilícium-influxért a rizs gyökérben (Ma and Yamaji, 2006, Ma et al., 2006) és kukorica gyökérben (Mitani et al., 2009) az OsLsi1 és az ZmLsi1 transzporter a felelős. Az influx-transzporterek a rizs exo- és endodermisz sejtjeinek és a kukorica endodermisz és parenchimatikus sejtjeinek a külvilág felé eső oldalán helyezkednek el. Az efflux-transzporter Lsi2 (Ma et al., 2006, 2007, Yamaji et al., 2008) nagy hatásfokkal szállítja az As(III) mellett a szilíciumot is a sztélébe. A szilícium koncentrálódása mérhető volt a rizs xilémnedvében (Yamaji et al., 2008), de az uborkában és a paradicsomban felhalmozódást nem mutattak ki (Mitani és Ma, 2005). Az arzén szerves formái, példáula metilált-formák, szállítódnak a hiperakumuláló Pteris vittata-ban (Wang et al., 2002). A páfrány gyökerében As(III) > MMA > As(V), a frondban As(V) > As(III) ≈ MMA a kimutatható arzén-forma (Li et al., 2009). Rizsben kimutatták, hogy az MMA és a DMA az OsLsi1 aquaporinokon keresztül, disszociálatlan formában jut be a növénybe. (Li et al., 2009).

8

1.3.2 Transzlokáció Feltételezhető, hogy az arzenát a foszfáttal analóg módon szállítódik a növényben. Felmerül azonban az a kérdés, hogy transzlokálódhat-e az As(V) is a xilémbe, vagy csak az As(III)? Nincs egyértelmű válasz, az adatok ellentmondásosak arra vonatkozóan, hogy az As(V) milyen mértékben és hol redukálódik. Arabidopsis mutánsokkal végzett kísérletek azt bizonyították, hogy az As(V)-tel kezelt növények nem As(V)-formájában szállítják az arzént és így nem ugyan azon a módon transzlokálják a hajtásban, mint a foszfátot. A kutatók álláspontja az, hogy a xilémbe főleg az As(III) kerül be (Quaghebeur and Rengel, 2003).Vizsgálták az arzén-formákat a növényi szövetekben Röntgen abszorpciós spektrometriával (XAS). Brassica juncea-ban kimutatták, hogy az As(V) redukálódik As(III)-má és nagy része a gyökérben is marad As(III)-trisz-tiolát komplex formájában. Pisum stivum-ban hasonló eredményeket kaptak, az As(V) redukálódott As(III)-má, valószínűleg a fitokelationok (PC) közvetítésével. A hiperakkumulátor növények kivételével a felvett arzén legnagyobb része a gyökérben marad. Ennek valószínű okát abban találják, hogy az As(III) fitokelatin komplexet képez (1. ábra) és ezt követően a vakuólumba kerül (Dhanker et al., 2006, Raab et al., 2004, Zhao et al., 2009).

1. ábra Arzenit-fitokelatin komplex a növényekben.

9

Nem tudjuk, hogy a komplexek hogyan transzportálódnak. A fitokelatin komplexről alkotott elképzelést igazolja, hogy a glutation- ill. a fitokelatin szintézist gátló L-butioninszulfoximin (BSO) hatására az Arabidopsis hiperszenzitivvé válik az As(III) kezelésre és több arzént effluál a külső közegbe és transzlokál a hajtásba (Liu et al., 2010). A xilémnedvben főként nem komplexált As(III)-t találtak (Mihucz et al., 2005, Xu et al., 2007, Zhao et al., 2009). A fitokelatin-As(III) komplex stabilitását a pH jelentősen befolyásolta (Liu et al., 2010). Pteris excizált gyökerei és levél szövetei, az intakt növényhez hasonlóan veszik fel az arzén-formákat. Az As(III) és az As(V) felvétele után is a szövetekben túlnyomórészt As(III)at találtak. A toleráns pelyhes selyemperje (Holcus lanatus) és a hiperakkumulátor szalagpáfrány (Pteris cretica) esetében is megtalálták a glutation-As(III) különböző lánchosszúsága fitokelatin komplexeit. A toleráns selyemperjében a fitokelatin szintézis jóval kifejezettebb, mint a hiperakkumuláló páfrányban. Mindkettőre igaz azonban, hogy az arzén legnagyobb része nincs kötött formában, különösen a hiperakkumuláló növénynél, ahol 1%-ot találtak kötött formában. Feltételezik, hogy a vakuólumokban történő raktározás védi meg a növényt a mérgezéstől (Raab et al., 2004). A komplexképzők szerepe feltehetően az arzénformák toxicitásának csökkentése a citoplazmában. Bár az arzén-formák szállítására vonatkozó irodalmi adatok néha ellentmondásosak, a közelmúltban megismert folyamatok ezek közül néhányat feloldanak. Wojas és munkatársai (2008, 2010) transzgénikus dohány növényeket állítottak elő, amelyekben két fitokelatin szintáz gént expresszáltattak. Az AtPCS1 az Arabidopsis-ból, a CePCS pedig a Caenorhabditis elegans-ból. A dohány csíranövények mindkét fitokelatin szintáz gén expresszálódása után toleránsabbak voltak az As(V)-tel szemben, mint a vad típus egészen 75 µM külső koncentrációig. Magasabb As(V) koncentrációnál a CePCS sokkal nagyobb toleranciát biztosított. Az AtPCS1 növény Cd-mérgezésre hiperszenzitiv volt, de As(V)-re nem. A CePCS expresszáló növények gyökér növekedése még 100 µM As(V)-kezelés mellett is megközelítette a vad típusú növény gyökér hosszát. A másik elgondolkoztató eredmény, hogy a PC(III) komplex pH függése eltérő Cd és As esetében (Liu et al., 2010). A PC-Cd komplex sokkal kevésbé stabil alacsony pH-n. Tehát a vakuólumban és a xilém nedvben, amelyeknek savas a pH-ja, a Cd kiszabadulhat a komplexből és ezért effluálódhat a vakuólumból a külső közegbe, vagy a xilémbe. Fayiga et al. (2008)

10

szerint a Pteris vittáta-nál a pH befolyásolja a frond arzén-felvételét és -felhalmozódását. Eredményei szerint a savanyú pH csökkenti, a lúgos növeli az arzén felhalmozódást. A molekuláris genetikai vizsgálatok új lehetőségeket vetnek föl az arzén toxikus hatásának kivédésére: rizsben megtalálták az arzén toleranciáért felelős gént. Szerepe a növényben az arzenát és a foszfát felvételének csökkentése (Dasgupta et al., 2004). A baktériumoknál és az élesztőnél egy reduktáz enzim működik, így az arzenátot arzenitté alakítja, majd a toxikusabb As(III) leadódik, kizáródik, a sejtből (Mukhopadhyay et al., 2002, Dhankher, 2005). Hasonlóan a mikrorganizmusokhoz, a magasabbrendű növényekben is találtak As-reduktázt (Pickering et al., 2000, Dhankher et al., 2006). A keletkező As(III) a vakuólumokba transzportálódik. Az arzenát redukciójának helyéről elég eltérő adatokat találunk. Duan et al (2005) szerint a hiperakkumulátor páfrányokban a redukció a gyökérben történik, mivel As-reduktázt (AsV→AsIII) a növényi frondban nem tudtak kimutatni. Poynton et al., (2004) munkái is ezt támasztják alá. A Pteris cretica gyökérben az As(V) legnagyobb része gyorsan redukálódik As(III)-má. Kertulis et al. (2005) szerint a xilém nedvben a Pteris vittata-ban As(V) szállítódik. Szerintük az As(III)-at felvevő gyökérben az arzén 84% -a As(V) formájában volt jelen, amit úgy értelmeztek, hogy a gyökérben oxidáció történt (As[III]→As[V]) (Kertulis et al., 2005). Az arzén-érzékeny növényekben is, mint például a Brassica juncea-ban megtörténik az As(V) redukciója a gyökérben (Pickering et al., 2000, Castillo-Michel et al. 2007). A borsó gyökerében XAS technikávan kimutatták As(V) → As(III) redukciót. A paradicsom és a rizs gyökérben és a xilém nedvben, főként As(III) –at mutattak ki (Xu et al., 2007), ami aktívan effluállódott a külső közegbe. Uborka gyökérben is redukálódik az As(V) - As(III)-má, amit a könnyezési nedv analízisével mutattak ki (Mihucz et al., 2005, Meirer et al., 2007).

11

2. ábra Az arzén felvétele és metabolizmusa a növényben. AR: arzenát reduktáz; R: reduktáz; AMT: arzén metiltranszferáz; GSH; redukált glutation; GSSG: oxidált glutation; SAM: S-adenozil-metionin; SAH: S-adenozil-homocisztein Forrás: Zhao et al., 2010 (módosítva)

1.4 Szenzitivitás és tolerancia A mezőgazdasági növényeknél az arzén fitotoxicitása már akkor kimutatható, ha a hajtásban eléri az As koncentrációja az 5 - 20 µg g–1 száraz tömeg értéket (Lombi et al., 2002). Vannak azonban arzénre kevésbé érzékeny, sőt hiperakkumuláló növények is. Míg árpa gyökérben 120 g kg-1 száraz tömeg As-t találtak (Asher and Reay, 1979), addig Holcus lanatus levélben 1300 g g-1 száraz tömeg (Hartley-Whitaker et al.,2002), Agrostis tenuis levélben 3470 µg g-1 száraz tömeg arzén mennyiséget mértek. Uborka (Cucumis sativus)

12

gyökérben általunk mért legnagyobb arzén koncentráció 975 g g-1 száraz tömeg volt. A levélben ennek mindössze csak 5%-át találtuk. A szenzitivitás és a tolerancia fajtafüggő, egyik oka lehet a különböző genotípusú növények, különböző arzén-akkumulációs képessége. Meharg és Macnair (1992) kutatásai szerint az ellenálló-fajok gyökerének kisebb a foszfát felvevő képessége. Mivel kevesebb arzén jut be a szövetekbe, ezért a növény lassabban nő, hamarabb és sokkal dúsabban virágzik, mint a nem toleráns növény. A tolerancia másik mechanizmusa, az intenzív foszfát felvétel, és a sejtben emiatt kialakuló magas foszfát tartalom, ami az arzenát toxicitását csökkenti. Wright és munkatársai (2000) és Dasgupta és munkatársai (2004) szerint is a foszfát influx gátlás a rezisztencia egyik oka. A másik különbség a genotípusok között a fitokelatin képződésben kereshető. Szoros korrelációt találtak az As(V) influx és a PC szintézis mértéke között (Hartley-Whitaker et al., 2002) A glutation-defficiens Arabidopsis mutánsok (Liu et al., 2010) sokkal érzékenyebbek az As(V)-kezelésre, mint a vad típus. A selyemperje (Holcus lanatus) arzén toleráns vonalával bizonyították, a fitokelatinok (PC) szerepét a védekezésben. A fitokelatin képződést gátló BSO jelenlétében a zanót (Cytisus striatus) gyökerének növekedése megállt, még 1μM As(V) jelenlétében is (Bleeker et al., 2003).

1.5 Az arzén okozta oxidatív stressz: az aszkorbinsav és az aszkorbinsav-oxidáz szerepe 1.5.1 Az arzén okozta oxidatív stressz Reaktív oxigén-formákat (ROS) az egészséges növényi sejtek is termelnek. A ROS harmonikus egyensúlya, a termelődés és a diszmutáció, elengedhetetlenül szükséges a növény túléléséhez, növekedéséhez és a stresszválaszokhoz. A keletkező ROS-t a sejt antioxidáns (enzimatikus és nem enzimatikus) rendszere képes semlegesíteni. Bár az arzén nem egy redoxaktív fém, de az arzénnek kitett növények reaktív oxigén gyököket (pl. a szuperoxid aniongyök, hidroxil-gyök) generálnak az As(V) → As(III) átalakulás során (Singh and Ma, 2006). Az arzén kitettség tehát oxidatív stresszhez vezet, a fokozottan magas ROS szintje miatt (Stoeva et al., 2003/4, 2005). A növényi sejtek több antioxidáns tulajdonságú molekulával

13

rendelkeznek,

amelyek

a

ROS-t

termelő

folyamatok

szabályozására

és

a

ROS

méregtelenítésére alkalmasak.

1.5.1.1 Az aszkorbinsav Az aszkorbinsav a növényi sejtben nagy mennyiségben előforduló antioxidáns molekula, amely közvetlenül redukálni képes a szuperoxid anion-gyököt, a szinglet oxigént, a hidroxil-gyököket. Szubsztrátja az aszkorbát peroxidáznak, ami a hidrogén-peroxidot vizzé redukálja. Az aszkorbinsav oxidáz az apoplasztban az aszkorbinsavat monodehidroaszkorbinsavvá (MDHA) oxidálja, ami instabil és gyorsan átalakul dehidro-aszkorbinsavvá (DHA) és aszkorbinsavvá (AA). A DHA specifikus transzporteren keresztül a citoplazmába jut és kicserélődik a citoszólban a különböző reakció utakon keresztül létrejövő aszkorbinsavval, vagyis ez a folyamatos molekula csere biztosítja a sejtfalban a redukáló képességet (Horemans et al., 2000). Az aszkorbinsav-„mentes” növényi rész elpusztul, ami érthető, ha szem előtt tartjuk, hogy a szabad gyökök a membránok dezorganizációját váltják ki. Az aszkorbinsav amellett, hogy redox-pufferként és a ROS detoxifikációjában szerepel (Foyer and Noctor, 2005a, 2005b), még számos, a növény életében essszenciális folyamatra is hatással van. A sejtfalban keletkező MDHA, stimulálja a növekedést, a vakuólizációt (Hidalgo et al., 1989) és a plazmalemma depolarizációján keresztül az ion felvételt. A fényen tartott Arabidopsis levélben sokkal több aszkorbinsavat találtak, mint árnyékban. A 72 órás elsötétítés után az AA értéke 91%-ra csökkent, folyamatos megvilágításban 171%-ra nőtt, míg a DHA szint nem változott (Bartoli et al., 2006, 2009). Az aszkorbinsav-képződés közvetlenül a fotoszintetikus elektrontranszporttól függ, a plasztokinon pool redox állapota befolyásolja. A DCMU és az atrazin gátolja a plasztokinon redukcióját és meggátolja az aszkorbinsav-képződés fény hatására történő fokozódását (Bartoli et al., 2006, 2009, Yabuta et al., 2007).

1.5.2 Az aszkorbinsav-oxidáz Az aszkorbinsav-oxidáz (AAO) a sejtfalban található, (Honda, 1955, Vines és Oberbacher, 1963) 4 Cu-atomot tartalmazó glikoprotein. Sejtkulturában leadódik a külső közegbe (Esaka et al., 1989). A Ca- és a Mg-ionok jelentősen megnövelik az AAO leadását 14

(Esaka et al., 1989). Az AAO elektrondonora az aszkorbinsav. Főként a tökfélékben és az uborkában található meg (De Tullio et al., 2007). Az enzim működésének pH-optimuma 5,6 (Vines és Oberbacher, 1963). Meghatározásának módszerét először Oberbacher és Vines (l963) írták le. Az AAO meghatározó szerepet játszik a növényi sejtek növekedésében, hiszen kemoreológiai folyamatot indít el: a sejtfal lazulását („loosening”) idézi elő, míg a sejtosztódásra nem hat (Takahama and Oniki, 1994). Az AAO az irodalmi adatok szerint a MDHA képződésén keresztül hat. A keletkező DHA teszi nyújthatóvá a sejtfalat (Kato és Esaka, 2000). Takahama és Oniki (1994) szerint az AAO az O2-t vízzé alakítja, és ezért gátolja a falban lévő peroxidázokat, amelyek a lignifikációban játszanak szerepet. A DHAA oxálsavvá alakulhat, ami a Ca-ionokat kivonja a sejtfalból, a makromolekulák közötti kötések megszünnek (Guo et al., 2005). Aktivitásának növekedése megnöveli a biomasszát (Pignocchi et al., 2003). Ezt a fény jelentősen befolyásolja, 10-12 óra alatt aktivitása a kétszeresére nő, sötétben a felére csökken. Fényen tartott növénynél 12 óra után aktivitása már nem változik, sötétben 24 óra alatt a fényen mért érték negyedére csökken. A sejtfalból könnyen kinyerhető.

15

2

A téma aktualitása, a munkánk célja A természetes (pl.: Dél-Alföld) és az antropogén eredetű arzén-szennyezések (pl.: a

tiszai ciánszennyezés és az ajkai vörösiszap-tározó átszakadása) mellett, az Európai Unióhoz történt csatlakozással együtt életbe lépett szigorítások teszik aktuálissá kutatásainkat. Egyre több tanulmány születik az arzéntartalmú vizek és talajok tisztításának lehetőségeiről, az arzén növényekre gyakorolt hatásáról, illetve a táplálékláncba kerülésének következményeiről. A gyakorlat szempontjaira tekintettel meg kívántuk ismerni, hogy az arzén tartalmú talajvízben, öntözővízben előforduló alacsony (2-10 M) arzén-koncentráció milyen változásokat okozhat a növényekben, hol található az elsődleges támadási pontja, a mérgezés tünetei hol és hogyan jelentkeznek. Kérdés volt, hogy az arzén milyen formában (As(V) vagy As(III)) van jelen a gyökérben, szállítódik-e a hajtásba és a hajtásban, milyen formában jelenik meg? Feltételeztük, hogy az arzén-mérgező hatásának egyik oka lehet az As(V)→As(III) redukció során fellépő oxidatív stressz. Figyelemmel kísértük a gyökerek és a hipokotil aszkorbinsav-tartalmának, és a sejtfalban található aszkorbinsav-oxidáz enzim aktivitásának a növény fejlődésétől függő változását. Ellenőriztük a szilícium hatását As(V) és As(III) mellett: a növekedésre, a gyökképződés eliminálására és annak bizonyítására, hogy a szilícium és az As(III) az uborkában is ugyanazon csatornán keresztül jut be a növénybe.

16

A munkánk során a következő kérdésekre kerestük a választ:  Az arzenát és az arzenit milyen hatással van a szenzitív uborka modell növényre?  Hol és hogyan alakul át az arzén és az átalakulás milyen hatással van a növényre?  A toxikus hatás kivédésének milyen lehetőségei vannak? A foszfát, a szilícium és az aszkorbinsav hatása.  Milyen módszerekkel és hol lehet megtalálni a különböző arzén-formákat a növényben?

17

3

Anyag és módszer

3.1 A növények nevelése A kísérleteink megkezdése előtt – munkatársaink és saját mérési eredményeink alapján, már birtokunkban volt az uborka (Cucumis sativus L. cv. Joker1), mint hidrokultúrában jól nevelhető kísérleti növény. A modell-növény az esszenciális elemek hiányára (Fe: Cseh és Fodor 1997, Kovács et al. 2005, 2008), valamint a mérgező nehézfémekre (Pb: Záray et al. 1995, Záray et al., 1997, Tatár et al. 1998, Fodor et al., 1998, Cseh et al. 2000; Cd: Fodor et al.,1996, Varga et al. 2002, Kovács et al., 2010) rendkívül érzékenyen reagál. Az uborka magokat Petri-csészében, két réteg megnedvesített szűrőpapíron, 30-32 órán át sötét termosztátban 27-29°C-on csíráztattuk. Egy Petri-csészébe 50 darab magot helyeztünk, amelyből a gyököcske hossza alapján, az egyforma növekedésű csíranövényeket választottunk ki. Három-három növényt két Hungarocell karika közé, rozsdamentes acéltűkkel rögzített, Netlon hálóra ültettük. Az elültetett növényeket 500 ml térfogatú műanyag poharakba 150 ml, 5·10ˉ4 M koncentrációjú CaSO4 oldatra helyeztük és 48 órán át, növénynevelő kamrában, 26 °C-on elsötétítve neveltük. Ezt követő napon a növényeket 400 ml kísérleti tápoldatra vittük, majd fényre tettük (0. nap). A fényintenzitás 120 μE m-² s-¹ periódusa 14/10 óra fény/sötét volt. A hőmérséklet 26/22 °C volt nappal/éjszaka. A páratartalmat a kamrában 70-80%-on tartottuk. A hidrokultúrás növényneveléshez négyszeresére hígított, módosított (Cseh et al., 1982) Hoagland oldatot használtunk. A tápoldat kémiai összetétele: 1.25 mM KNO3, 1.25 mM Ca(NO3)2, 0.5 mM MgSO4, 0,25 mM KH2PO4, 11.6 µM H3BO3, 4.6 µM MnCl2 × 4H2O, 0.19 µM ZnSO4 × 7H2O, 0.12 µM Na2MoO4 × 2H2O, 0.08 µM CuSO4 × 5H2O. A kísérleti beállításoktól függően az eredeti tápoldat 250 M foszfát koncentrációját lecsökkentettük 100, 10 illetve 2 M-ra. A vasat FeCl3 (10-5 M) vagy Fe(II)-aszkorbát (10-5 M) formájában adtuk a növényeknek. Az aszkorbinsavat (30 M) FeCl3-ban (10 M) oldottunk föl, amit a tápoldatok cseréjekor frissen készítettünk. A tápoldatokat 2-3 naponta cseréltük, hogy kiküszöböljük az oldat tápanyag összetételének, oxigéntartalmának, pH-jának megváltozását. A tápoldat készítéséhez ioncserélt 18

desztillált vizet használtunk, melynek vezetőképessége nem haladta meg a 2 μS értéket. A sziklevelek megzöldülése és az első levélkezdemény megjelenésekor, edényenként két-két növényt kiemeltünk, biztosítva az azonos fejlődési állapotot. 1. Táblázat. A növény fejlődési állapota a kísérlet során napokra lebontva. A növény fejlődési állapota Növények fényre helyezése szikleveles állapot 1. levél megjelenése 1. levél 1. levél mellett megjelenik a 2. levél 2. levél 3. levél megjelenése 4. levél megjelenése 5. levél megjelenése

napok száma 0. 2. 5. 7. 9. 12. 14. 16. 20.

3.2 Arzén-kezelés A kísérletekben az arzenitet (As[III]) és az arzenátot (As[V]) kálium-só formájában használtuk, hogy kiküszöböljük a Na+ esetleges növényekre gyakorolt mellékhatását. Az arzenátot KH2AsO4 vegyület formájában, az arzenitet As2O3 vegyületként, a dimetil-arzinitet (C2H7AsO2) kakodilsav formájában vásároltuk (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). Az arzenit kálium sóját a következők szerint állítottuk elő: a szükséges mennyiségű As2O3-at, enyhe melegítés mellett, 1N KOH hozzáadásával oldottuk (K3AsO3). Ezt követően 1 N sósavval savanyítottuk, így az As(III)-mat tartalamzó oldat stabilan eltartható (Quaghebeur et al., 2003). A kísérletek céljainak megfelelően az arzén-formákat a következő koncentrációkban mértük be: 2 µM, 10 µM, 100 µM.

19

3.3 Higany-kezelés A higanyt HgCl2 (Reanal Finomvegyszergyár RT.) vizes oldatát használtuk. Kisérleteinkben 1, 10, 50 M-os Hg-kezelést alkalmaztunk. A növényeket kontroll tápoldatban 22 napig neveltük, majd a növékedés, transpiráció és a víztelítési hiány (WSD) mérések előtt 5 napig, a megfelelő koncentrációjú Hg-tartalmú oldatokban tartottuk. Az exudáció mérése előtt 27 napig neveltük kontroll tápoldaton a növényeket, majd 2 órás Hg-kezelést alkalmaztunk.

3.4 Szilícium-kezelés A szilícium-kezeléshez metakovasavat (H2SiO3) állítottunk elő Na2SiO3 × H2O-ból (Sigma) Ma et al. (2001) módszere szerint. A Na2SiO3 oldatot Amberlit 120B H+-forma ioncserélő gyantán engedtük át, a Na-ionoktól megszabadított oldat vezetőképességét ellenőriztük. A kísérleti oldat, miközben a pH-ja semleges maradt, 500 µM metakovasavat (H2SiO3) tartalmazott.

3.5 Friss- és száraztömeg mérés A kísérlet céljától függően a friss- és száraztömeg meghatározásához külön mértük a gyökeret, a hajtást (hajtástengely+levélnyelek), a hipokotilt, a szikleveleket és a levéllemezeket. A levéllemezt azért választottuk el a levélnyéltől, mert élesen eltér a hipokotil és a levélnyél szárazanyag-tartalma (3,5%) a levéllemezétől (12%) (Cseh et al, 2000). Száraztömegük leméréséhez a növényi részeket szárítószekrénybe helyeztük és 80 oC-on tömegállandóságig (légszáraz állapot) szárítottuk, majd tömegüket analitikai mérlegen lemértük.

3.6 Víztelítési hiány (WSD) A növényi minta levéllemezeiből 12 mm átmérőjű, 113,04 mm2 felületű korongokat vágtunk ki, ügyelve arra, hogy vágáskor ne keresztezzünk fő ereket. Levéllemezenként 5-5 20

korongot vágtunk ki a fő ér jobb- és bal oldaláról. A korongokat a mintavétel után közvetlenül lemértük (kiindulási tömeg), ezután Petri-csészékbe desztillált vízzel átitatott szűrőpapírra helyeztük, figyelve arra, hogy a levél korongok fonáka érintkezzen a szűrőpapírral. Három óra elteltével a korongokat kivettük a Petri-csészéből, egy pillanatra szűrőpapírra helyeztük, hogy a levélen megtalálható szőrökről leitassuk a vizet, majd lemértük (turgeszcens tömeg). Végül a mintákat a szárítószekrénybe raktuk, 80°C-on tömegállandóságig szárítottuk, és lemértük (száraztömeg) (Slatyer 1967). A WSD kiszámításának módja: RT= (kiindulási tömeg-száraztömeg) / (turgeszcens tömeg-száraztömeg) × 100 WSD=100-RT

3.7 Sztóma-konduktancia Porométer (DELTA-T Devices Ltd.) segítségével mértük a levelek sztóma konduktanciáját, amely a sztómák nyitottságát a transpirációs víz átengedésének időtartama alapján határozza meg. Méréseket végeztünk a különböző levél-emeleteken, a levél színén és fonákán egyaránt. Kiértékeléskor a kapott értékek mértékegysége mmol víz m-2 s-1.

3.8 Könnyezési nedv A könnyezési nedv vizsgálathoz 5 levél-emelettel rendelkező, jól fejlett gyökerű növényeket neveltünk, annak érdekében, hogy a kontroll növényeknél egy órán át a gyökérnyomás változatlan maradjon. A növényeket, a megfelelő ásványi anyag- és oxigénellátás érdekében, a kísérlet előtt 800 ml tápoldatba helyeztük. A könnyeztetést minden alkalommal azonos időpontban, a délelőtti órákban kezdtük el, mivel a gyökérnyomásnak endogén napi ritmusa van, maximumát a déli órákban éri el (Lundegard et al., 1946). A könnyeztetés megkezdése előtt két órával a növényeket friss tápoldatba helyeztük, ami a Hoagland-oldatnak csak a makro elemeit tartalmazta. A KNO3 koncentrációját kétszeresére emeltük (2,5*10–3 M), mivel a nitrát-ionok meggyorsítják a könnyezés sebességét (Andel, 1953).

21

A növények hajtását 4–5 mm-rel a gyökérnyak fölött vágtuk el. A vágás felületen megjelenő nedvet, ami az átvágott szövetekből származhatott, leitattuk. A könnyezési nedvet hélium atmoszférában gyűjtöttük, az előre lemért, 0°C alá hűtött és jégben tartott edényekbe. Az összegyűlt nedv tömegét 10 percenként mértük. Ion-tartalmának meghatározásáig -18°C-on tároltuk. A könnyezés mértékét µg h-1 g-1 gyökér frisstömegre számoltuk.

3.9 Vezetőképesség A kísérletek első lépésében meggyőződtünk arról, hogy az alkalmazott desztillált víz vezetőképessége nem haladja meg a 2 µS-t (Radelkis Conductometer OK-112). Ezután a kontroll és a kezelt növények gyökerének friss tömegét lemértük, majd 15 ml desztillált vízbe helyeztük. Összerázás után újra megmértük a vezetőképességet (indulási érték) Ezután az első mérési sort 40ºC-on 30 percig, a második mérési sort 90ºC-on 2 óráig hőkezeltük, ezután mértük az oldatok vezetőképességét. Végül forralás után megmértük a gyökerek teljes ion tartalmát. A hőkezelések után az indulási tömeg értékekre kiegészítettük az oldatokat. A vezetőképességet szobahőmérsékleten mértük (22ºC). A mérési eredményeinket µS g-1 friss tömegben és membrán stabilitási indexben adtuk meg. (Singh et al., 2006) A Membrán Stabilitási Index kiszámításának módja: MSI=[1-(c1/c2)*100] c1 a 40ºC-on 30 percig hőkezelt gyöker oldatok vezetőképessége (µS g-1) c2 a 90ºC-on 2 óráig hőkezelt gyöker oldatok vezetőképessége (µS g-1)

3.10 Uborkalevél gyökereztetés A növényeket négyleveles állapotig neveltünk. A 2. levelet levágtuk, 10 M FeCl3-ot és 10 M KH2PO4-ot tartalmazó ¼-es töménységű Hoagland-oldatba tettük úgy, hogy a levélnyél az oldatba merült. A levágott levelek első csoportját levágáskor, a második csoportját a 7. naptól (az első járulékos gyökerek megjelenése után) helyeztük 10 M As(V)-öt tartalmazó oldatba.

22

A leveleket műanyag zacskóval borítottuk be, vigyázva arra, hogy a levél a műanyaggal lehetőleg ne érintkezzen. Az így előkészített leveleket fényre helyeztük. A gyökereztetés ideje alatt (1 hétig) tápoldatot nem cseréltük. Meggyökeresedés után eltávolítottuk a műanyag zacskót és 3 naponként oldatot cseréltünk.

3.11 Malondialdehid meghatározás A kezelt és a kontroll hipokotilok alsó, középső és felső harmadának 50 mg-jához 250 l 0,1%-os triklór-ecetsavat (TCA) adtunk és homogenizáltuk. A mintákat jégben tartottuk, majd 10000g-n 4ºC-on 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó 250 ml-éhez 1 ml MDA-reagenst adtunk. A reagens összetétele a következő: 1% tiobarbitursav (TBA), 20%-os triklórecetsav (TCA) oldat. A reagensben a feleslegben lévő TBA a kivonatokban jelenlevő MDA-val reagál, és sárga elszíneződést okoz. A színes végtermék elnyelési maximuma 532 nm. A reakcióelegyet 100ºC-on 30 percig inkubáltuk. A reakció lezajlását követően az oldatokat lehűtöttük és szobahőmérsékleten mértünk. A minták MDA-tartalmát spektrofotométerben (Shimadzu UV 2101PC) határoztuk meg (Gosset et al., 1994).

3.12 Aszkorbinsav-meghatározás A növényi

mintákat 5%-os metafoszforsav oldatban, 1:5 arányban, hűtött

dörzsmozsárban (0–4ºC) homogenizáltuk. A kezelt és a kontroll gyökerekből és a hipokotilokból (alsó- és fölső rész) minimum 50 mg mintát vettünk. A homogenátumot 4ºC-on, 19000 g, 20 percig centrifugáltuk. A 125 l felülúszót 25 l 1,5 M trietanol-aminban (TEA) semlegesítettük, majd 150 l 150 mM-os Na-foszfát (Na2HPO4 és NaH2PO4 pH 7,4) pufferrel összekevertük. Hozzáadtunk 75 l 10 mM ditiotreitolt (DTT), majd 15 percig szobahőmérsékleten tartottuk. A szobahőmérsékletű kvarcküvettában 2 ml 0,1 M-os Na-foszfát (Na2HPO4 és NaH2PO4 pH 5,6) pufferhez 200 l növényi mintát, valamint aszkorbinsav oxidáz enzimet (Ascorbate oxidase from Cucurbita sp. Sigma A0157) tettünk. A minták aszkorbinsavtartalmát spektrofotométerben (Shimadzu UV 2101PC) határoztuk meg 265 nm-en (Knörzer et al., 1996).

23

3.13 Aszkorbinsav oxidáz aktivitásának vizsgálata A kontroll és a kezelt növények gyökerét és hipokotillját 1:5 arányban hűtött dörzsmozsárban (0–4ºC), 0,1 M-os, pH 6,5 foszfát (KH2PO4 és Na2HPO4) pufferben homogenizáltuk. A mintákat 15000 g-n, 10 percig centrifugáltuk. A meghatározás kvarc küvettában történt. A 3 ml 0,1 M-os foszfát (NaH2PO4 és Na2HPO4) pufferhez (pH 5,6) 100 l felülúszót és 10 l (0,003 M) aszkorbinsavat mértünk. A mintát 265 nm-en, a reakció végéig (kb. 5 perc) mértük (Shimadzu UV 2101PC) (Oberbacher and Vines, 1963).

3.14 Elemanalitikai meghatározás (HPLC-ICP-MS, FIA) Az arzenit- [As(III)], arzenát- [As(V)] és dimetilarzinát-ion (DMA) tartalmú tápoldatokban, kontrollált körülmények között nevelt uborka könnyezési nedvét (3.8 Könnyezési

nedv)

kettősfókuszálású

közvetlenül

induktív

csatolt

csatolású

nagyhatékonyságú

plazma

folyadékkromatográfiás

tömegspektrométerrel

(HPLC-ICP-MS)

vizsgáltuk. A minták teljes arzéntartalmát áramlásos technikával (FIA-ICP-MS) határoztuk meg. A friss xilémnedvmintákat Millex-GV (Millipore, USA) 0,22 m átmérőjű PVDF szűrtük közvetlenül az elemzések elvégzése előtt. A vizsgálatokat a MTA-ELTE Környezetkémiai Kutatócsoport és az UNESCO-ELTE Nyomelem Szatellit Központ végezte (Mihucz at al., 2000, 2005).

3.15 Szövettani vizsgálatok A fénymikroszkópos vizsgálatokhoz a kontroll és kezelt uborka hipokotil mintákat 4% formaldehid és 2% glutáraldehid keverékében fixáltuk (0,1 M Na-foszfátpuffer, pH 7,2) majd etanolos víztelenítés után műgyantába ágyaztuk. Az 1 m vastag metszeteket toluidinkékkel festettük meg.

24

3.16 Mini-X Ag analízis A mérésekhez AMPTEK (http://www.amptek.com/minix.html) gyártmányú Mini-X Ag-anóddal ellátott, maximálisan 4 W elektromos teljesítménnyel üzemelő transzmissziós röntgencsövet használtunk. A liofilizált hipokotil mintákat 200 s-ig mértük, a nyalábátmérő kb. 2 mm volt. A Mini-X Ag vizsgálatokat a Budapesti Műszaki Egyetem, Nukleáris Technikai Intézet, Atomenergetikai Tanszékén végeztük (http://www.reak.bme.hu).

3.17 Röntgenfluoreszcens konfokális leképezés (XRF-CI) Az XRF-CI (konfokális) vizsgálatokat a HASYLAB L nyalábcsatornájánál végeztük (http://hasylab.desy.de/). A

röntgenfluoreszenciára

alapozott

vizsgálati

eljárások

során

egy

intenzív

szinkrotronnyaláb gerjeszti a minta elemeit. A gerjesztődés során az egyes kémiai elemek karakterisztikus röntgenfotonokat emittálnak (röntgenfluoreszcencia), amelyek energiája egyértelműen azonosítja az adott elemet. A konfokális (XRF-CI) méréstechnikával a minta megfelelő helyzetű, kis térfogatú darabjából emittált sugárzás érzékelhető, a mért adatokból háromdimenziós térfogati analízis végezhető (De Samber 2010a., 2010b.). A növényi mintákat liofilizáltuk, a méréseket szobahőmérsékleten végeztük.

3.18 XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure) A XANES analitikai technikával a mintában az arzén kémiai állapotát határozták meg. A XANES vizsgálatokat Grenobleben, a European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) (http://www.esrf.eu) nyalábcsatornájánál és Hamburgban a HASYLAB L nyalábcsatornájánál végezték (http://hasylab.desy.de/). A xilemnedv analízise mellett, a hipokotilt liofilizálás után, szobahőmérsékleten és az élő hipokotilt, cseppfolyós mitrogén gőzében történő hűtés mellett mértük.

25

3.19 Mintavétel és statisztikai számítások A munkánk során 2-3 független kísérletet végeztünk minden esetben, és egy kísérlet során 5-10 párhuzamos mérésére került sor. A mérések értékeléséhez kiszámítottuk az átlagot és a szórást (Microsoft Office Exel). Ahol az adatok értékelése szükségessé tette, a statisztikai kiértékelést az Instat 3.0 (GraphPad, Inc.) programmal, egy-utas ANOVA-val, Tukey-Kramer post-hoc teszt segítségével végeztük.

26

4

Eredmények

4.1 Az arzén-kezelések hatásai

4.1.1 Az As(V)- és az As(III)-kezelések összehasonlítása, a foszfát-védő hatása A különböző toxikus kezelésekre igen érzékeny uborkánál, a foszfát (PO4-3) és az arzenát [As(V)] felvételének versengése miatt, meg kellett határoznunk a foszfát- és arzénkezelési arányokat. Kísérleteink során különböző arzén és foszfát koncentrációkat használtunk. Összehasonlítottuk a módosított Hoagland-tápoldatban használt 250, és a csökkentett, 100, 10 és 2 M foszfátnak a 100, 10 és 2 M arzén felvételére és a növény növekedésére gyakorolt hatását. A 10 μM foszfát a növények növekedését csak kis mértékben lassította. A növények 20 napos korukban elérték az öt leveles állapotot és morfológiájuk, fenológiai fejlődésük sem tért el a 250 M foszfáton nőtt növényekétől. A továbbiakban a 10 M foszfátot tartalmazó módosított Hoagland-tápoldaton nőtt növényeket tekintjük kontroll növényeknek. A kísérleteink többségénél alkalmazott alacsony arzén-koncentráció (10 M arzén) mellett nyomon tudtuk követni a növények fiziológiai változásait, és a legtöbb esetben, el tudtuk kerülni a növények pusztulását is. A 3. ábrán látható, hogy függetlenül attól, hogy melyik szervetlen arzén-formát használtuk, As(III)-at vagy As(V)-öt, és függetlenül attól, hogy a foszfát és az arzén koncentrációt azonos szintre emeltük (10 és 100 M), jelentős, közel 50%-os, gátlást kaptunk mind a gyökér, mind a hajtás száraz tömegénél. A nagy, 100 M-os külső As(V) és As(III) koncentrációnál a foszfát-védő hatását nem tapasztaltuk.

27

800

kontroll

700

As(V)

c

As(III)

600 száraz tömeg (mg)

e hajtás

500

d d

gyökér

400

d

d

300 200

a b b

a

b b

100 0 10

100

10

100

foszfát koncentráció (M)

3. ábra A 100 M As(V) és As (III) hatása, a 10 M és 100 M foszfátot tartalmazó, módosított Hoagland-tápoldaton nevelt növények gyökér és hajtás növekedésére. A 20 napos növények, 12. naptól 5 napig arzéntartalmú, majd ezután 4 napig arzén-mentes tápoldatban nőttek. Átlag±szórás (n=10) Az eltérő betűkkel jelzett oszlopok szignifikánsan különböznek, P < 0,001 (egy-utas ANOVA)

A közel virágzásig nevelt növényeknél, amelyek két hétig ¼-es töménységű Hoagland-tápoldatban, majd két hétig, 2 M foszfátot és 2-2 M As(V) vagy As(III)-mat tartalmazó tápoldatban nőttek, kimutattuk, hogy az azonos koncentrációban alkalmazott kétféle arzén-forma hatása között különbség van. Az As(III)-kezelés növekedés gátló hatása, az alkalmazott kísérleti beállítások mellett nagyobb volt, mint az As(V)-kezelésé (4. ábra). A gyökér száraz tömege az As(V) hatására 38%-kal, az As(III) hatására 63%-kal csökkent a kontrollal összehasonlítva. A hajtás növekedése As(V) mellett nem mutatott szignifikáns különbséget (a gátlás 4%-os volt), míg az As(III) 40%-kal gátolt (4. ábra).

28

1000 900

száraz tömeg (mg)

800

d

kontroll As(V)

d

As(III)

700

e

600 500

a

400 300

b

c

200 100 0 gyökér

hajtás

4. ábra A 2 M As(V) és As(III) hatása a 2 M foszfátot tartalmazó, módosított Hoagland-tápoldaton nevelt növények gyökér és a hajtás növekedésére. Átlag±szórás (n=10) Az eltérő betűkkel jelzett oszlopok szignifikánsan különböznek, P < 0,001 (egy-utas ANOVA)

4.1.2 Az As(V)-kezelés hatása a növény vízháztartására A 100 M arzén-kezelés növekedés gátló hatása mellett, a növények teljes turgorvesztését tapasztaltuk (5. ábra).

100M foszfát + 100M As(V)

100M foszfát + 100M As(III)

5. ábra 100 M As(V) és As(III) hatására bekövetkező turgorvesztés a kezelést követő 5 óra elteltével.

29

Ha az 5 napos kezelést követően, a növényeket újra arzénmentes, Hoaglandtápoldatra helyeztük, a turgoruk helyreállt. Mivel az arzén a növény vízmegtartó képességét befolyásolta, indokoltnak láttuk, hogy összehasonlítsuk a kontroll és az arzén-kezelt növények transpirációját. Az uborka leveleinek színén és fonákán is találhatóak sztómák, de a levél színén jóval kisebb számban, ezért a méréseket a sziklevelek fölötti, második levél fonákán végeztük. Mind az As(V), mind az As(III) nagymértékben gátolta a transpirációt (6. ábra). Az As(V)-kezelés mellett kimutattuk a foszfát-védő hatását. 10 M PO4-3 mellett As(V)-tel kezelt uborka transpirációja közel 70%-ban gátlódott, míg 100 M PO4-3 mellett csak 50%-ban. Az As(III)kezelés mellett függetlenül a foszfát koncentrációjának változtatásától, a gátlás 57% volt (6.

transpiráció (mmol H2O m-2s-1)

ábra).

6. ábra A második levélen mért 10 M és 100 M foszfátot tartalmazó, módosított Hoagland-tápoldaton nőtt, 12 napos növények transpirációja a kontroll, és a 100 M As(V)- és As(III)-kezelést követően. Átlag±szórás (n=10) Az eltérő betűkkel jelzett oszlopok szignifikánsan különböznek, P < 0,01 (egy-utas ANOVA)

4.1.3 Az As(V) és a Hg(II) hatásának összehasonlítása Összehasonlítottuk az As(V) és az aquaporinok működését gátló Hg(II) hatását. Feltételeztük, 30

hogy az arzenát a vízcsatornákra is hatással lehet, mivel a foszfátot az anyagcsere folyamatokban is helyettesíteni képes, ugyanis a csatornák nyitása - zárása során a foszforiláció szerepet játszhat (Azad et al., 2004; Horie et al., 2011; Johansson et al., 1998; Maurel et al., 1995). Meghatároztuk a növekedésre, (7. ábra), a transpirációra (2. táblázat), a víz telítettségi hiányra (WSD) (2. táblázat) és az exudációra (8. ábra) gyakorolt hatásukat. A 7. ábran látható, hogy a gyökér és a hajtás száraztömeg gyarapodását hasonlóan gátolta a kétféle kezelés, szignifikáns különbséget csak a gyökér esetében láttunk. c

száraz tömeg (mg)

kontroll 1000

As(V)

900 800 700 600

Hg(II)

500 400 300 200 100 0

d

a b

e

b

gyökér

hajtás

7. ábra A 10 M As(V) és 10 M Hg(II) hatása 10M foszfátot tartalmazó, módosított Hoagland-tápoldaton nevelt növények gyökér és hajtás növekedésére. A növények 27 naposak voltak, a kezeléseket a 23. napon kezdtük. Átlag±szórás (n=10) Az eltérő betűkkel jelzett oszlopok szignifikánsan különböznek, P < 0,01 (egy-utas ANOVA)

A 2. táblázat mutatja a második levél transpirációját, illetve a második levélből kivágott levélkorongok víztelítettségi hiányát 10 M As(V), 1- és 10 M Hg(II) mellett.

31

2. Táblázat A 10 M As(V), 1 és 10 M Hg(II)-kezelés hatása a transpirációra és a WSDre a második levélen, módosított, 10 M foszfátot tartalamzó Hoagland-tápoldaton nevelt uborkánál. A növények 27-naposak voltak, a kezeléseket a 23. napon kezdtük. Az eltérő betűkkel jelzett WSD és transpirációs értékek szignifikánsan különböznek. Átlag±szórás (n=5) P < 0,01 (one-way ANOVA)

Kezelés

transpiració (mmol H2O m-2 s-1)

WSD (%)

kontroll

450±72

a

5,00±1,10

a

10µM As(V)

212±95

b

10,76±0,25

b

1 µM Hg(II)

448±165

a

6,48±1,30

a

10 µM Hg(II)

140±40

b

8,96±0,47

b

A transpirációt 1 M Hg(II) nem gátolta, a 10 M Hg(II) és a 10 M As(V) azonban jelentősen csökkentette (a Hg kissé nagyobb mértékben, de a különbség nem szignifikáns). Az 1 M Hg-kezelés mellett a WSD alig növekszik, szignifikánsan nem különbözik a kontrolltól. A nagyobb koncentrációban adott (10 M) Hg(II) akkora vízhiányt okoz, mint a 10 M As(V) (2. Táblázat). Az uborkának, mint valamennyi Cucurbitaceae családba tartozó növénynek, jelentős a gyökérnyomása. A kifejlett növények xilém-edényeiből, gyakran napokon keresztül, napi ritmust követve, könnyen gyűjthető, exudációs nedv választódik ki. A könnyeztetés megkezdése előtt 2 órával a növényeket mikroelem-mentes és kétszeres koncentrációjú KNO3-tartalmú oldatba helyeztük. A hajtás levágása előtt a kísérleti oldathoz adtuk a 100 M As(V)-öt illetve az 50 M Hg(II)-t. A könnyezés mértéke As(V)-kezelés hatására 40 perc után, a Hg(II)-kezelés hatására 50 perc után rohamosan csökkent, majd 60 perc után a kontroll érték 1/5-e maradt meg. Az utolsó szakaszban a két kezelés hatása azonos (8. ábra) volt.

32

kontroll As(V) Hg(II)

140

mg h-1 g-1 friss tömeg

120 100 80 60 40 20 0 10

20

30

40 50 idő (perc)

60

70

80

90

8. ábra Az exudáció mértéke 100 M As(V)- és az 50 M Hg(II)-kezelést követő 90 percen keresztül. A növények 27 naposak voltak. (n=5)

4.1.4 Az ionleadás mértéke az As(V)-kezelés mellett A gyökérben megtörténik az As(V) → As(III) átalakulás, amely befolyásolhatja a gyökér membrán struktúráját, ezért mértük a gyökér ionleadásának mértékét az As(V)-kezelés hatására a Fe(III)-klorid tartalmú tápoldaton nőtt növényeknél. Az As(V) koncentrációjának a növelése (10, 30, 100 M) az ion leadás mértékét 18%-ról (kontroll) 67%-ra (100 µM As(V)kezelés) növelte (3. Táblázat).

33

3. Táblázat A gyökér ionleadásának mértéke Fe(III)-klorid kontroll és 10, 30, 100 M As(V)-kezelés mellett. A növények 6 napos korukban kapták a 48 órás As(V)-kezelést. Átlag±szórás (n=5)

Vezető képesség (S g-1 frt)

40°C

90°C

MSI (%)

Kontroll

109,6±9

604,7±22

18

10 M As(V)

76,1±10

233,9±

12

32

30 M As(V)

73,7±11

147,3±

2

50

100 M As(V)

66,4±11

98,2±20

67

MSI = Membránstabilitási index (3.9)

4.1.5 A különböző Fe-komplexek hatása A növények vasfelvételét, így a kísérletek kimenetelét befolyásolhatják a tápoldatban lévő vas-komplexek. A vasat komplexáló vegyületek jelentős hatást gyakorolhatnak magának a vasnak a felvételére, de visszamaradva a külső oldatban, vagy bejutva a növénybe, befolyásolhatják más ionok (pl. az arzenát) felvételét és a sejt anyagcseréjét is. Ezért összehasonlítottuk a 10 M Fe(III)-klorid (kontroll), a 10 M Fe(III)-EDTA, a 10 M Fe(III)-citrát és a 10 M Fe(II)-aszkorbát komplexek hatását az uborka növekedésére (9. ábra és 4. Táblázat). A kontroll és a különböző Fe-komplexek mellett nevelt növények tömege között nem volt szignifikáns a különbség. A kontroll és a különböző Fe-komplexek mellett, a növények a fényre helyezést követő 9. naptól, 120 órán át, 10 M As(V)-kezelést kaptak. A gyökerek friss tömegei között nem tudtunk kimutatni szignifikáns különbséget. Ennek oka, hogy az arzén gátló hatása a Fe(III)kloridtól és a vas-komplextől függetlenül, rendkívül jelentős volt. A gyökér esetében, Fe(III)kloridnál 86%, Fe(III)-EDTA-nál 85%, Fe(III)-citrátnál 81% és Fe(II)-aszkorbátnál 80% volt. A hipokotilnál az As(V)-kezelés növekedés gátló hatása Fe(III)-kloridnál 76%, Fe(III)-EDTA-

34

nal 45%, Fe(III)-citránál 51% és Fe(II)-aszkorbátnál 42% volt (9. ábra). Száraz tömegre számolva a gátlás %-a fenti sorrendnek megfelelően rendre 71, 33, 43, és 30% volt.

600

arzén mentes

a

As(V)

500

a

frisstömeg (mg)

a 400

c** b

300 200

a

c**

b

100 0 Fe-klorid

FeEDTA

Fe-citrat

Fe-aszkorbát

9. ábra A 14 napos hipokotil friss tömeg értékei. A növények a 10 M As(V)-kezelést a 9. naptól 5 napon keresztül kapták. Az eltérő betűkkel jelzett friss tömeg értékek szignifikánsan különböznek Átlag±szórás (n=5) P < 0,01 (egyutas ANOVA)

Az 1. levél növekedés gátlása Fe(III)-kloridnál 36%, Fe(III)-EDTA-nal 52%, Fe(III)citránál 46% és Fe(II)-aszkorbátnál 42% volt. A 2. levél növekedés gátlása Fe(III)-klorid, Fe(III)-EDTA és Fe(III)-citrát mellett 88%, Fe(II)-aszkorbát mellett 74% volt. A kezeletlen növényekkel ellentétben, az As(V)-kezelés hatására a 3. levél egyik vas-forma mellett sem fejlődött ki. A vizsgált vas-vegyületek nem befolyásolták, míg az As(V)-kezelés csökkentette a hipokotil és a gyökér ion-koncentrációját. A membrán stabilitási index Fe(III)-klorid mellett volt a legmagasabb és Fe(II)-aszkorbát mellet a legalacsonyabb (4. Táblázat).

35

4. Táblázat Kontroll és különböző Fe-komplexek Membrán Stabilitási Indexe hipokotilban és gyökérben As(V) mentes és 10 µM As(V)-kezelés mellett. A növények 14 naposak voltak, a kezelést a 9. naptól a 14. napig kapták. (n=5) Hipokotil MSI (%)

Gyökér MSI (%)

Fe(III)-klorid / +10 M As(V)

8,3 / 5,9

19,3 / 44,0

Fe(III)-EDTA / +10 M As(V)

8,2 / 6,6

16,5 / 41,4

Fe(III)-citrát / +10 M As(V)

8,5 / 7,4

19,8 / 38,2

Fe(II)-aszkorbát / +10M As(V)

9,4 / 9,1

17,2 / 33,1

MSI = Membránstabilitási index (3.9)

4.2 A növény fejlettségi állapota és az As(V)-kezelés hatása A kísérleteink során minden egyes kezelés megkezdése előtt megmértük a növényi részek friss- és száraz tömegét (indulási kontroll 10. ábra), így pontos képet kaptunk arról, hogyan változott a növények tömege az arzén-kezelések hatására fejlődésük során (10. ábra).

36

Hajtás 700

friss tömeg (mg)

600 500 400 300 200 100 0 0

2

5

7

9

12

14

16

a növények kora (nap)

a. Gyökér

friss tömeg (mg)

2500 2000 1500 1000 500 0 0

2

5

7

9

12

14

16

a növények kora (nap)

b.

10. ábra A kontroll (Fe(III)-klorid) a., hajtás és b., gyökér frisstömeg változása. A növények korát az x tengelyen tüntettem fel. Hajtás = hajtás tengely + levélnyelek Átlag±szórás (n=10)

37

A kontroll (Fe(III)-klorid) uborka növekedését nyomon követve, felfedeztük, hogy a 7. és a 9. napon a hajtás növekedése nagymértékben lelassult. A növényeknek ezt a speciális növekedési jellegét csak a Fe(III)-klorid mellett tapasztaltuk (10. ábra). Az As(V)-kezelés a csírázást nem gátolta. Az arzén mellett csírázott növényeket elültetve, gátoltan ugyan, de képesek voltak tovább növekedni arzén-tartalmú tápoldaton. Ha a növényeket a fényre helyezéskor (0 napos), vagy 2 napos koruktól kezdtük kezelni és a tápoldat a kísérlet végéig 10 M As(V)-öt tartalmazott, azaz 16 és 14 napig, a növények növekedésének gátlása jelentős volt, de a hajtás és a gyökér turgeszcens maradt. A fényre helyezés utáni 5. naptól kezelt növények gyökere (amelyek 11 napig voltak As(V)-tartalmú oldatban) elveszítette a turgorát, de a hajtás még turgeszcens maradt. A 7. és a 9. naptól kezelt növények gyökere és a hajtásrészeik (amelyek 9 illetve 7 napig voltak As(V)-tartalmú oldatban) turgor vesztettek voltak, a hipokotil középső része átlátszóvá vált, néha el is száradt. A növekedés gátlás mellett a hipokotil veszített az indulási tömegéből. A 12. naptól kezelt növények gyökere (amelyek 4 napig voltak As(V)-tartalmú oldatban) elvesztette a turgorát, de a hajtásuk már épen maradt (11. ábra).

38

a.

friss tömeg (mg)

Hajtás 700 600 500 400 300 200 100 0 0

2

5

7

9

12

14

16

idő (kezelés megkezdésének napja)

b. Gyökér

friss tömeg (mg)

2500 2000 1500 1000 500 0 0

2

5

7

9

12

14

16

idő (kezelés megkezdésének napja)

11. ábra A kontroll és a 10 M As(V)-tel kezelt 16 napos uborka hajtásának és gyökerének frisstömeg változása. A kezelés megkezdésének ideje 0., 2., 5., 7., 9., 12., 14. nap volt. A növények 16 naposak. (n=10) ○ Az indulási kontroll növények hajtásának és gyökérének friss tömege a 10. ábra alapján Átlag±szórás (n=10)

39

Az uborka hajlamos hajtás eredetű járulékos gyökerek képzésére. Kontroll körülmények között 3–4 leveles állapotban válnak láthatóvá a gyökérkezdemények a hipokotil alsó részén. Az arzenát-kezelés hatására, a fényre helyezés után (0. nap) és a 2. naptól kezelt növények hipokotilján az első levél kifejlődésével jelennek meg a járulékos gyökerek (12. ábra / a.), amelyek a kísérlet végéig (14–16 nap) nem veszítik el a turgorukat. Az uborka 2. levelének gyökereztetésekor (3.10) hasonló eredményeket kaptunk. A 10 M As(V)-tartalmú tápoldatban kialakultak és turgeszcensek maradtak a levél nyelén megjelenő járulékos gyökerek (12. ábra / b.).

a.

b.

12. ábra Az uborka járulékos gyökerei. a. A fiatal növények hipokotilján As(V)-kezelés mellett megjelenő turgeszcens, járulékos gyökerek (a kísérlet során a primer gyökér nagy részét levágtuk). b. A második levél levélnyelén As(V)-kezelés mellett kifejlődő turgeszcens járulékos gyökerek. Annak érdekében, hogy tovább tudjuk vizsgálni a fejlődési állapottól függő turgorvesztés okait, összehasonlítottuk a különböző korú növények hosszantartó (11. ábra) és 48 órás (13. ábra) kezeléseit, azok növekedésre gyakorolt hatását.

40

Hipokotil Fe(III)-klorid kontroll

300

As(V)

friss tömeg (mg)

250 200 150 100 50 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

a növények kora (napok)

a. Gyökér Fe(III)-klorid kontroll As(V)

800

friss tömeg (mg)

700 600 500 400 300 200 100 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

a növények kora (napok)

b. 13. ábra A hipokotil (a.) és a gyökér (b.) friss tömeg változása a 48 órás, 10 M As(V)kezelés hatására. Átlag±szórás (n=5) A hosszan tartó és a 48 órás kezelés hatására egyaránt (11. ábra és 13. ábra) megjelent az érzékeny periódus, amikor a növények veszíthetnek indulási tömegükből. Az érzékeny periódus alatt, a 48 órás kezelés, a gyökér és a levelek turgorvesztését idézte elő, a hipokotil gyakran elvékonyodott. (14. ábra).

41

a.

b.

c.

14. ábra Különböző korú, kontroll és As(V)-tel kezelt uborka a. 7 napos indulási kontroll növény b. 14 napos növény, amely a 7. naptól a 14. napig, 7 napon keresztül 10 M As(V)kezelést kapott c. 9 napos növény, amely a 7. naptól 48 óráig 10 M As(V)-kezelést kapott Az ismétléseink azonos eredményei alapján megállapítottuk, hogy a növény fejlettségi állapota befolyásolja az arzén-kezelés növényre gyakorolt hatását. A további kísérleteink során ennek a fejlettségi állapottól függő toxikus hatásnak az okait és kivédésének lehetőségeit kerestük. Valamennyi kísérletben a növénynevelés teljes azonosságára törekedtünk.

4.3 Az As(V) és az As(III) toxikus hatásának kivédése 4.3.1 A Fe(II)-aszkorbát és a szilícium (H2SiO3) hatása Újra meg kellett mérnünk, a Fe(II)-aszkorbát és a szilícium tartalmú tápoldaton nőtt növények növekedését a fényre helyezést követő 2., 5., 7., 9., 12. és 14. napon (15. ábra), hogy az As(V) és az As(III) toxicitását reálisan tudjuk értékelni. A kontroll tápoldaton nőtt növényekkel összehasonlítva, a Fe(II)-aszkorbát a 9. naptól, mind a gyökér, mind pedig a hipokotil növekedését serkentette, a szilícium hatása viszont jelentéktelennek tűnt. A szilícium jelenléte mellett szignifikáns eltérést csak a 9. napon láttunk, ahol a gyökér növekedését enyhén gátolta, a hipokotil növekedését enyhén serkentette.(15. ábra). A hipokotil növekedésének stagnálását a 7. és a 9. napon csak Fe(III)-klorid mellett tapasztaltuk (10. ábra és 15. ábra).

42

Hipokotil Fe(III)-klorid

400

Fe(II)-aszkorbát

350

Fe(III)-klorid és Si

friss tömeg (mg)

300 250 200 150 100 50 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

9

10

11

12

13

14

idő (napok)

a. Gyökér

Fe(III)-klorid

2500

Fe(II)-aszkorbát friss tömeg (mg)

2000

Fe(III)-klorid és Si

1500

1000

500

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

idő (napok)

b. 15. ábra Az indulási kontroll növények hipokotiljának (a.) és gyökérének (b.) friss tömege. Az x-tengelyen a növények korát tüntettem fel. Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek. Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek. Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-kloridot és 500 M szilíciumot tartalmazó tápoldatban nőttek. Átlag±szórás (n=10)

43

4.3.1.1 A Fe(II)-aszkorbát és az As(V)-hatása A 4.1.5. fejezetben láttuk, hogy a 14 napos, 3–4 leveles növényeknél a Fe(III)-klorid + As(V)-tartalmú tápoldatban a növények növekedése jobban gátolt, mint az Fe(II)-aszkorbát + As(V)-tartalmú tápoldatban (9. ábra). Kérdésünk a következő volt: A Fe(II)-aszkorbát képes-e csökkenteni az As(V)-toxikus hatását a növény érzékeny periódusában? A 16. ábran feltüntettük az indulási kontroll (Fe(III)-klorid:

○

és Fe(II)-aszkorbát:

●) értékeket is a 15. ábra alapján. Hipokotil

350 As(V) és Fe(III)-klorid

300

As(V) és Fe(II)-aszkorbát

friss tömeg (mg)

250 200 150 100 50 0 2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (kezelés megkezdésének a napja)

16. ábra Az As(V)-tel kezelt 14 napos növények hipokotiljának frisstömeg változása. █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 µM As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. A○ Fe(III)-klorid és a ● Fe(II)-aszkorbát indulási kontroll növények hipokotiljának friss tömege a 15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

44

Fe(III)-klorid mellett az As(V)-kezelés jelentősen gátolta a növény növekedését. A hipokotil tömege csak a 2., és 5. napon kezelt növényeknél tudta fölülmúlni az indulási kontroll értékeit. A 7. és 9. naptól kezelt növények veszítettek az indulási tömegükből. A 12. naptól kezelt növények növekedése megállt. A Fe(II)-aszkorbát mellett az As(V)-kezelés bizonyos mértékben gátolta ugyan a növény növekedését, de az érzékeny periódusban nem csökkent a hipokotil friss tömege az indulási kontrollhoz képest (16. ábra). A fényre helyezést követő 2. naptól kezelt növények gyökerei Fe(II)-aszkorbát és Fe(III)-klorid mellett egyaránt turgeszcensek maradtak. Az 5. naptól kezelt növények gyökerei Fe(III)-klorid mellett elveszítették a turgorukat, Fe(II)-aszkorbát mellett még turgeszcensek voltak, a növekedésük már mindkét esetben gátolt volt. A 7., 9. és 12. naptól kezelt növényeknél a két féle vas-forma hatása között nem volt különbség, a növények gyökerei turgorvesztettek voltak (17. ábra). Gyökér

2000 1800

As(V) és Fe(III)-klorid

1600

friss tömeg (mg)

1400 1200 1000 800 600

400 200 0 2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (a kezelés megkezdésének a napja)

17. ábra Az As(V)-tel kezelt 14 napos növények gyökerének friss tömeg változása. █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. A○ Fe(III)-klorid és a ● Fe(II)-aszkorbát indulási kontroll növények hipokotiljának friss tömege a 15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

45

A következő kísérletben 7 napig neveltünk növényeket Fe(III)-klorid és Fe(II)aszkorbát tartalmú tápoldaton. A hipokotil különböző részein vizsgáltuk a membránok struktúrájának változásait, a lipidperoxidáció mértékét. A mérések előtt 3 órával 10 M As(V)tartalmú tápoldatba helyeztük a növényeket. A három részre osztott hipokotilban ezután mértük meg az MDA-tartalmat. A 18. ábran jól látható, hogy Fe(II)-aszkorbát jelenlétében, a kontrollhoz hasonló értékeket mértünk, míg Fe(III)-klorid mellett jelentősen, közel 50%-kal

□ Fe(II)-aszkorbát + As(V) ■ Fe(III)-klorid + As(V)

MDA tartalom

a kontroll %-ában

megnövekedett az MDA tartalom: a középső (2.) és a felső (3.) hipokotil darabban.

alsó

középső

felső

18. ábra A három részre osztott hipokotil (alsó, középső, felső) MDA tartalma a saját kontrolljának (Fe(III)-klorid/Fe(II)-aszkorbát) a %-ban. A növények 7 naposak voltak, a 10 M As(V)-kezelést a kísérlet megkezdése előtt 3 órával kapták. MDA koncentrációja a kontroll hipokotil 3 szegmensében Fe(III)-klorid mellett: 1. 5,1 nmol/g (fr.t.) ± 0,044; 2. 3,63 nmol/g (fr.t.) ± 0,04; 3. 2,87 nmol/g (fr.t.) ± 0,031 MDA koncentrációja a kontroll hipokotil 3 szegmensében Fe(II)-aszkorbát mellett: alsó: 5,59 nmol/g (fr.t.) ± 0,021; középső: 5,16 nmol/g (fr.t.) ± 0,025; felső: 3,73 nmol/g (fr.t.)± 0,04 Átlag±szórás (n=5)

46

4.3.1.2 A Fe(II)-aszkorbát és az As(III)-hatása Összehasonlítottuk a Fe(III)-klorid és a Fe(II)-aszkorbát mellett az As(III)-kezelés hatását. Az As(III)-tartalmú tápoldaton nőtt növények hipokotilja gátoltan ugyan, de képes volt növekedni mindkét vas-forma mellett, szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk, az érzékeny periódus hiányzott (19. ábra).

Hipokotil

350 300

As(III) és Fe(III)-klorid As(III) és Fe(II)-aszkorbát

friss tömeg (mg)

250 200 150 100 50 0 2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (kezelés megkezdésének napja)

19. ábra Az As(III)-mal kezelt 14 napos növények hiopokotiljának friss tömeg változása. █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 µM As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(III) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 µM As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. A○ Fe(III)-klorid és a ● Fe(II)-aszkorbát indulási kontroll növények hipokotiljának friss tömege a 15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

Az As(III)-tartalmú tápoldaton nőtt növények gyökerének növekedése erősen gátolt, turgorvesztést Fe(III)-klorid mellett az 5., a 7. és 9. naptól kezelt növényeknél tapasztaltunk. Fe(II)-aszkorbát jelenlétében a 7. és 9. naptól kezelt gyökér veszítette el a turgorát. As(III)kezelés hatására, szignifikáns különbséget a kétféle vas-forma hatása között, csak a 2. és 5. naptól kezelt növényeknél láttunk (20. ábra).

47

Gyökér

friss tömeg (mg)

2000 1800

As(III) és Fe(III)-klorid

1600

As(III) és Fe(II)-aszkorbát

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (kezelés megkezdésének napja)

20. ábra Az As(III)-mal kezelt 14 napos növények gyökerének friss tömeg változása. █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 µM As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem fel. █ As(III) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 µM As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem fel. A○ Fe(III)-klorid és a ● Fe(II)-aszkorbát indulási kontroll növények hipokotiljának friss tömege a 15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

4.3.1.3 A szilícium-kezelés (H2SiO3) hatása A szilícium-hatás értékelésénél figyelembe kellett vennünk a kezelés időtartamát, a növény korát és a növényi részt egyaránt, ezért a szilícium hatását a túl sok változó miatt nehéz értékelni. Egyrészt a szilícium hatott a kontroll növények növekedésére, kis mértékben gátolta a gyökér és serkentette, vagy gátolta a hipokotil növekedését (21. ábra és 22. ábra). A levelek fejlődését pozitívan befolyásolta. A 2. levél a 2. naptól induló 10 M As(III)-kezelésnél csak szilícium mellett jelent meg. Ha az As(III)-kezelés hatását a hipokotil friss tömegének a függvényében vizsgáljuk, nem találunk szignifikáns különbséget a Fe(III)-klorid és a Fe(III)-klorid + szilícium tartalmú tápoldaton nőtt növények között (21. ábra).

48

Hipokotil 350

friss tömeg (mg)

300

As(III) és Fe(III)-klorid As(III) és Fe(III)-klorid és Si

250 200 150 100 50 0 2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (kezelés megkezdésének napja)

21. ábra Az As(III)-mal kezelt 14 napos növények hiopokotiljának friss tömeg változása Si-kezelés mellett. █ As(III) és Fe(III-)klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem fel. █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid + 500 M Si tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl.

● Fe(III)-klorid és ● Fe(III)-klorid és Si indulási kontroll növények hipokotiljának friss tömege a 15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

A növényeket vizuálisan megfigyelve, a szilícium pozitív hatása nyilvánvaló volt (22. ábra). A Fe(III)-kloridon nőtt növények As(III)-kezelés hatására gyakran, de nem minden esetben, a kezelést követő néhány óra elteltével időlegesen elvesztették a turgorukat. Ezt a jelenséget szilícium jelenlétében nem tapasztaltuk (22. ábra).

49

22. ábra A 12 napos uborkák 3 órával az As(III)-kezelést, illetve a Si+As(III)-kezelést követően. A gyökerek az 5. és 7. naptól kezelt növényeknél szilícium mellett és hiányában is turgeszcensek maradtak, de a növekedésük gátolt volt. A 9. naptól kezelt növények gyökerei elvesztették a turgorukat. A 12. naptól kezelt növények gyökerei turgeszcensek maradtak, a növekedésük szilícium mellett gátolt volt (23. ábra).

50

friss tömeg (mg)

Gyökér 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

As(III) és Fe(III)-klorid As(III) és Fe(III)-klorid és Si

2. nap

5. nap

7. nap

9. nap

12. nap

14. nap

idő (kezelés megkezdésének napja)

23. ábra Az As(III)-mal kezelt 14 napos növények gyökérének friss tömeg változása Sikezelés mellett. █ As(III) és Fe(III-)klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid + 500 M Si tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl.

●

Fe(III)-klorid és

●

Fe(III)-klorid és Si indulási kontroll növények gyökerének friss tömege a

15. ábra alapján. (Az x tengely ebben az esetben a növények korát mutatja.) Átlag±szórás (n=10)

4.3.2 Az aszkorbinsav-tartalom alakulása Az arzén-formáknak a növény fejlődésétől függő hatása és a külső oldatba adott aszkorbinsav (Fe(II)-aszkorbát) növekedést és membrán stabilitást biztosító hatása indokolttá tette a növényben található aszkorbinsav mennyiségének meghatározását.

51

Követve a korábbi növénynevelési protokollt, meghatároztuk az aszkorbinsav koncentrációját a hipokotilban Fe(III)-klorid, Fe(II)-aszkorbát, Fe(III)-klorid + szilícium és a két féle arzén-kezelés mellett. A kontroll (Fe(III)-klorid) növényekkel összehasonlítva a 2. és 5. naptól, As(V)-tel kezelt, erősen gátolt növekedésű 14 napos növények hipokotiljában magas volt az aszkorbinsav koncentrációja. A 7. és 9. naptól kezelt, turgorvesztett 14 napos növények hipokotiljában (érzékeny periódus) az aszkorbinsav koncentrációja alacsony (a 7. naptól kezelt növényben a kimutathatóság szintje alatt) volt. A 12. naptól kezelt 14 napos növényeknél az aszkorbinsav koncentrációja a kontroll értékével közel azonos volt (24. ábra). Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a Fe(III)-klorid és a Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldaton nőtt 14 napos növények hipokotiljának aszkorbinsav-tartalmában. A Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldaton, a 2. naptól, As(V)-tel kezelt 14 napos növények hipokotiljának aszkorbinsav tartalma volt a legmagasabb. Az 5., 7. és 9. naptól kezelt 14 napos növényekben szignifikáns különbég nincs az aszkorbinsav koncentrációjában, mind a három esetben a kontroll értékek ~3,5-szeresét mértük, nem volt érzékeny periódus. A 12. naptól kezelt 14 napos növények esetében a kontroll értékek 2-szeresét kaptuk (24. ábra). A kétféle kezelést összehasonlítva elmondhatjuk, hogy a növények Fe(III)-klorid mellett mutatott érzékeny periódusában az aszkorbinsav koncentrációja a növények teljes turgorvesztése következtében a hipokotilban a kimutathatóság szintje alá csökkent. Ez az érzékeny periódus Fe(II)-aszkorbát hozzáadásával kivédhető (24. ábra).

52

As(V) és Fe(III)-klorid

Hipokotil

As(V) és Fe(II)-aszkorbát 6

[AA] mM g-1 frt

5 4 3 2 1 0 2

5

7

9

12

kontroll

a kezelés megkezdésének az ideje (nap)

24. ábra A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát:a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Átlag±szórás (n=10)

A Fe(III)-klorid és az As(III)-kezelés mellett, érzékeny periódust nem tapasztaltuk. A 14 napos növények aszkorbinsav koncentrációja a kezelés megkezdésétől és a kezelt napok számától függött (25. ábra). A Fe(III)-klorid + szilícium mellett az As(III)-kezelés hatására a 2. naptól kezelt, 14 napos növények hipokotiljában az aszkorbinsav koncentrációja azonosnak tekinthető a Simentes tápoldaton nevelt növényekével, az 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos növényeknél a felére csökkent, megközelítve a kontroll hipokotil aszkorbinsav koncentrációját (25. ábra).

53

Hipokotil As(III) és Fe(III)-klorid 6

As(III) és Fe(III)-klorid és Si

[AA] mM g-1 frt

5 4 3 2 1 0 2

5

7

9

12

kontroll

a kezelés megkezdésének az ideje (nap)

25. ábra A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Átlag±szórás (n=10)

Az arzén-kezelés mellett jól látható, hogy a növény kora, a kezelés megkezdésének ideje, a tápoldat aszkorbát és szilícium tartalma egyaránt befolyásolta a növény növekedését (19. ábra, 20. ábra, 21. ábra, 23. ábra) és az aszkorbinsav koncentrációját a hipokotilban (24. ábra, 25. ábra).

4.3.3 Az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása Az enzim aktivitása a kontroll növény hipokotiljában, a Fe(II)-aszkorbát és a Fe(III)klorid + szilícium mellett alacsony volt (0,2 unit g-1 fr.t.) és a növények fejlődése során (14. nap), alig változott (0,2-0,15 unit g-1 fr.t.). Az enzim aktivitásának nagymértékű változása valamennyi arzénes kezelésnél megfigyelhető volt (26. ábra, 27. ábra). A hipokotilban, a Fe(III)-klorid mellett nevelt, 2. és 5. naptól As(V)-tel kezelt 14 napos növényeknél, az enzim aktivitása jól mérhető volt, majd az érzékeny periódusban, a 7. és 9.

54

naptól kezelt 14 napos növényeknél jelentősen csökkent. A 12. naptól kezelt 14 napos növények enzim aktivitása a kontroll értékével azonos volt. (26. ábra). Ezzel szemben a Fe(II)-aszkorbát mellett nőtt növényeknél, az enzim aktivitása a 7. és 9. naptól kezelt 14 napos növényeknél tovább emelkedett, majd a Fe(III)-klorid mellett nevelt növényekhez hasonlóan, a 12. naptól kezelt 14 napos növényekben a kontroll értékére csökkent (26. ábra). Hipokotil

aszkorbinsav oxidáz aktivitása (unit g-1 frt.)

0,9 As(V) és Fe(III)-klorid

0,8

As(V) és Fe(II)-aszkorbát

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2.

5.

7.

9.

12.

14.

a kezelés megkezdésének az ideje (nap)

26. ábra Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel. █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel. Átlag±szórás (n=10)

A hipokotilban a Fe(III)-klorid mellett, az As(III)-kezelés, amely a 2., 5. naptól kezdődött, a 14 napos növényben magas enzim aktivitáshoz vezett. A 7. napon kezdődő kezelés a 14 napos növényekben a legmagasabb enzimaktivitást eredményezte, majd csökkent

55

a 9. naptól kezelt 14 napos növényekben és a 12. naptól kezelt 14 napos növényekben a kontroll növény enzimaktivitásával volt egyenlő (27. ábra). A Fe(III)-klorid + szilícium és As(III)-kezelés mellett, az enzim aktivitása hasonlóan változott, mint Fe(III)-klorid + As(III) mellett. A 7. naptól kezdett kezelések hatására tapasztaltunk enzim aktivitási csúcsot (27. ábra). Megállapítható hogy szilícium mellett kis mértékben, de következetesen magasabb az enzim aktivitása. Kivételt képeznek a 12. naptól kezelt 14 napos növények, ahol az enzim aktivitása a kontroll növényekével megegyezik (27. ábra).

Hipokotil As(III) és Fe(III)-klorid As(III) és Fe(III)-klorid és Si

aszkorbinsav oxidáz aktivitása (unit g-1 frt.)

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2.

5.

7.

9.

12.

14.

a kezelés megkezdésének az ideje (nap)

27. ábra Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel. (n=10) █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid és 500 M szilícium tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkezdésének idejét az xtengelyen tüntettem fel. (n=10) Átlag±szórás (n=10)

56

Mind a négy kísérleti beállításban, megfigyelhető egy enzimaktivitási csúcs (26. ábra, 27. ábra). Ha a tápoldat Fe(III)-klorid mellett As(V)-öt tartalmazott akkor a csúcs az 5. naptól kezelt növényekben jelent meg. Ha Fe(II)-aszkorbát mellett As(V)-öt, Fe(III)-klorid mellett As(III)-at vagy Fe(III)-klorid mellett szilíciumot és As(III)-at tartalmazott a csúcs a 7. naptól kezelt 14 napos növényekben volt mérhető (26. ábra, 27. ábra).

4.4 Az As(V)-kezelés hatásainak szövettani vizsgálata uborka hipokotilban A hipokotil alsó-, középső- és felső részének szöveti felépítése a szállítónyalábok változó száma miatt, jelentősen különbözik. A gyökérnyak fölött négy, míg a középső és felső részen a sziklevelek kialakulása miatt, 6 szállítónyalábot találunk. Az As(V)-kezelés hatására, az 5 napos, 48 óráig kezelt növény hipokotiljának középső bélszövetében megjelenik egy rhexigén/skizogén üreg. Ez a jelenség a gyökérnyak fölött a legkifejezettebb (28. ábra). Az arzén-kezelés hatására végbemenő intenzív öregedési folyamatok és a stressz hatására megjelenő üreg a kontroll növényeknél csak jóval később, az intenzív növekedés hatására jelenik meg, a növény 2 hetes, 2-3 leveles állapotában. A fixálási, beágyazási folyamatok során a kontroll növényeknél a zsugorodott parenchima szövet sejthatárai „ráncosak” az intenzív vízvesztés miatt, míg az arzén-kezelt növény hipokotiljának a sejtei nem deformálódtak. Ennek egyik oka lehet, hogy az arzénkezelés hatására a membránok dezorganizálódtak, így lehetővé vált a víz gyors kiáramlása a sejtekből a fixálási, beágyazási folyamatok során.

57

hipokotil felső harmada

hipokotil középső harmada

hipokotil alsó harmada

5 napos kontroll hipokotil

5 napos hipokotil

48

h

AsV-kezelt

28. ábra Az 5 napos kontroll és a 48 óráig 10 M As(V)-tel kezelt uborka hipokotilja (alsó-, középső-, felső harmadának) keresztmetszeti képei. A kék kör rhexigén/skizogén üreget jelöl.

4.5 A felvett arzén koncentrációjának és eloszlásának közvetlen mérése Kísérleti eredményeinkből és az irodalmi adatokból tudjuk, hogy az arzén kémiai állapota nagymértékben befolyásolja a növényekre gyakorolt hatását. Ezért olyan vizsgálati eljárásokat kerestünk majd alakítottunk ki, amelyek lehetővé tették az arzén-formák kimutatását és lokalizálását a növényben.

4.5.1 HPLC-ICP-MS A HPLC-ICP-MS-módszerrel a xilemnedvben vizsgáltuk az arzén megjelenési formáit.

58

A növényeket 14 napos korukig 250 M foszfát tartalmú ¼ Hoagland oldaton neveltünk, majd 120 órán át 2 M arzén (As(III), As(V), DMA) tartalmú tápoldatba helyeztük. A kezelés idejére a foszfát koncentrációját 2 M-ra csökkentettük. Kísérleteink első, szembeszökő eredménye volt, hogy az As(V)-tel kezelt növények intenzívebben könnyeztek (34,5 g h-1 g-1frisstömeg), mint az As(III)-mal kezelt növények (19,8 g h-1 g-1frisstömeg). A gyűjtött könnyezési nedvben, függetlenül az alkalmazott arzénformától, As(III)-at>As(V)-öt>DMA-t mutattunk ki. Az uralkodó arzén-forma a könnyezési nedvben, As(V)- vagy As(III)-kezelés mellett, az As(III) volt. A 2 M DMA-kezelés esetén a DMA változatlan formában és mennyiségben jutott be a tápoldatból a növénybe. A növényben mobilis volt, nem alakult át és nem volt növekedés gátló hatása (5. táblázat).

5. Táblázat A xilemnedv vizsgálata HPLC-ICP-MS és FIA módszerrel. A 14 napos növények, 120 órás 2 M As(V)-, As(III)-, DMA-kezelést kaptak. A xilemnedv arzén koncentrációját ng cm-3-ben adjuk meg. Átlág±szórás (n=5) (n.d. = nem detektálható)

cAs / ng cm-3

2 M As(V)

2 M As(III)

2 M DMA

As(III)

22,78 ± 1,1

38,46 ± 1,5

n.d.

As(V)

2,53 ± 0,2

4,59 ± 0,4

n.d.

DMA

0,99 ± 0,1

1,51 ± 0,2

24,65 ± 1,22

Σ As

26,30

44,56

24,65

Total As (FIA)

29,05 ± 1,0

45,7 ± 2,6

21,79 ± 0,8

Ellenőriztük, hogy az alkalmazott tápoldatokban, megtörténik-e az arzén-formák átalakulása. Kontrollált körülmények között (növénynevelő kamra), növény mentes 2 M As(V)-tartalmú tápoldatokban csak nyomokban lehetett kimutatni az As(III)-at. A 2 M As(III)-tartalmú tápoldatokban, az As(III) → As(V) átalakulás kimutatható volt (6. táblázat).

59

6. Táblázat A 2  foszfátot, As(III)-at, vagy As(V)-öt tartalmazó tápoldat vizsgálatának eredményei a bemérés után azonnal és 48 h elteltével, növények nélkül és növények jelenlétében HPLC-ICP-MS-módszerrel. A tápoldat arzén koncentrációját ng cm-3-ben adjuk meg. (n=3)

Tápoldat / mintavétel

Total As

c As(III)

c As(V)

ng cm-3

ng cm-3

ng cm-3

2·M As(V) / 0 min

123

−

123

2·M As(V) / 48 h

92

2

90

2·M As(V) / 0 min növénnyel

125

−

125

2·M As(V) / 48 h növénnyel

26

4

22

2 M As(III) / 0 min

148

148

−

2·M As(III) / 48 h

148

131

18

2 M As(III) / 0 min növénnyel

149

149

−

2·M As(III) / 48 h növénnyel

40

26

14

c a tápoldat elméleti As =149,84 ng cm-3

4.5.2 XANES A HPLC mérésekkel kapott eredményeinket megerősítették a XANES vizsgálatok, melyeket

Grenobleben,

a

European

Synchrotron

Radiation

Facility

(ESRF)

(http://www.esrf.eu) nyalábcsatornájánál végeztük. A xilemnedv analízishez a növényeket 21 napig neveltük 250 M foszátot tartalamzó ¼ Hoagland oldaton, majd 168 órán át 2M arzénnel (As[V], As[III]) kezeltük. A kezelés ideje alatt a foszfát koncentrációját 2 M-ra csökkentettük. A xilemnedvben az uralkodó arzén-forma az As(III) volt. Az As(III)–tartalmú tápoldatokban, 48 óra elteltével, az oxidációs folyamatok következtében megjelent az As(V) is (7. táblázat).

60

7. Táblázat A táblázat adatai az alábbi minták mérései alapján készültek: As(V) és As(III) standardok, As(III)- és As(V)-tartalmú tápoldatok és As(III)-al és As(V)-el kezelt növények xilemnedve. Az eredmények egy-egy mérésből származnak.

Minta

As(III) %

As(III)-tartalmú tápoldat

As(V) %

100

0

As(III)-tartalmú tápoldat 48h múlva

71

29

As(V)-tartalmú tápoldat

2

98

Xilemnedv As(III)-kezelés mellett

88

12

Xilemnedv As(V)-kezelés mellett

83

17

A fentiek alapján tehát több oldalról bizonyítottuk, hogy az As(V) a gyökérben As(III)-má redukálódik, így As(III) formában jut be a xilembe. Kérdés, hogy a növény szöveteiben az As(III) változatlanul marad-e. További, szobahőmérsékleten történt XANES mérésekkel kimutatták az uborka gyökerében az As(V)-öt, és a hipokotilban az As(III) mellett As(V)-öt is. A szobahőmérsékleten történő hosszú idejű mérések során megfigyeltük, hogy a hipokotil a röntgen nyaláb hatására sugárkárosodást szenved. A hamburgi (http://hasylab.desy.de/)] XANES mérések alapján bizonyítottuk, hogy a szobahaőmérsékleten vizsgálat uborka hipokotil szöveteiben a mérés közel 40 perce alatt az As(III) átalakul As(V)-é (29. ábra).

61

As(III) és As(V) aránya

1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

As(III) As(V)

t1

t2

t3

t4

t5

mérés száma

29. ábra A 7 napos, Fe(II)-aszkorbát + 24 óráig 60 M As(V)-tel kezelt élő uborka hipokotil XANES mérése szobahőmérsékleten, közel 40 perc össz mérés idővel. Az eredmények egy-egy mérésből származnak.

4.5.3 Mini X-Ag analízis és XANES A Budapesti Műszaki Egyetem, Nukleáris Technikai Intézet, Atomenergetika Tanszékkel közösen kialakítottunk egy növényi mintákra alkalmazható mérési eljárást, amelynek segítségével meghatároztuk a liofilizált uborka hipokotil arzén tartalmát. A növényeket 5 napig neveltük kontroll (Fe(III)-klorid) vagy Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldaton, majd 48 órán keresztül kezeltük különböző (20, 40, 60, 80 és 100 M) koncentrációjú As(V)-oldattal. A röntgen spektrométerrel kapott eredmények alapján a 80 M-os As(V) koncentráció mellett találtunk legnagyobb mennyiségben arzént a hipokotilban. A 100 M-os As-kezelésnél a hipokotil As-tartalma már alacsonyabb volt, mint a 60- és 80 M-os kezelés esetén (30. ábra). Fe(II)-aszkorbát mellett, a tápoldat arzén koncentrációjának növelésével, a hipokotil arzén tartalma is nőtt (30. ábra).

62

As Ka intenzitás (counts/200s)

5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20

40

60

80

100

As koncentráció (M)

a. 5000

As Ka intenzitás (counts/200s)

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20

40

60

80

100

As koncentrációja (M)

b. 30. ábra. ábra Az arzén mennyiségének változása liofilizált hipokotilban Mini-X Ag analízissel. Az 5 napos növényeket 48 órán keresztül kezeltük 20-, 40-, 60-, 80-, 100 M As(V) –tel, majd ezután mértük az össz arzén mennyiségét. a. A Fe(III)-kloridon nőtt és különböző koncentrációjú As(V)-tel kezelt uborka liofilizált hipokotiljának arzén tartalma Mini-X Ag analízissel (n=4) b. A Fe(II)-aszkorbáton nőtt és különböző koncentrációjú As(V)-tel kezelt uborka liofilizált hipokotiljának arzén tartalma Mini-X Ag analízissel (n=4) 63

A BME, Atomenergetika Tanszék Mini X-Ag méréseinek eredményeit felhasználva folyékony nitrogén gözében, élő hipokotilon végeztünk XANES méréseket Hamburgban. Ezzel a mérési technikával elkerültük a mérés hatására történő As(III) → As(V) átalakulást (31. ábra).

As tartalom

0,9

As(III) és az As(V) aránya (XANES)

5000

As(III)

4500

As(V)

0,8

4000

0,7

3500

0,6

3000

0,5

2500

0,4

2000

0,3

1500

0,2

1000

0,1

500

0

As-Ka intenzitása (counts/200s) Mini X-Ag analízis alapján

1

0 10

40

60

80

100

As(V)-kezelés koncentrációja (mM)

31. ábra Az arzén-formák arányának változása élő, folyékony nitrogén gőzében hűtött hipokotilban 48 órás 20-, 40-, 60-, 80-, 100 M As(V)-kezelések után XANES –analízissel. A tápoldat Fe(III)-koridot tartalmazott. Az eredmények egy-egy mérésből származnak.

Az ábrán a Mini X-Ag analízissel nyert össz-arzén mennyiségét □ is feltüntettem a 30. ábra alapján. A növénynevelés hasonlóan zajlott, mint a Mini X-Ag analízisek során. A növényeket 5 napos korukban 48 órán át kezeltük 20-, 40, 60, 80 és 100 M As(V)-el. Méréseink során a folyékony nitrogén gőzében hűtött élő hipokotilban túlnyomórészt As(III)-at találtunk.

64

A Fe(II)-aszkorbát és Fe(III)-klorid mellett nevelt és 48 órán át 60 M arzénnel-kezelt növények hipokotiljában a XANES mérések alapján az As(III) és As(V) arányában kismértékű különbséget találtunk ( 32. ábra).

3500

0,9 0,8

As tartalom

0,7

As(III)

0,6

As(V)

3000 2500 2000

0,5 1500

0,4 0,3

1000

0,2 500

0,1 0

As-Ka intenzitása (counts/200s) Mini-X-Ag analízis alapján

As(III) és As(V) aránya (XANES)

1

0 Fe(II)-aszk

Fe(III)-klorid

32. ábra Az arzén-formák arányának változása élő, folyékony nitrogén gőzében hűtött hipokotilban 48 órás Fe(II)-aszkorbát + 60 M As(V) és Fe(III)-klorid + 60 M As(V) kezelések után XANES analízissel. Az eredmények egy-egy mérésből származnak

Az ábrán a Mini X-Ag analízissel nyert össz arzén mennyiségét □ is feltüntettem a 30. ábra alapján.

4.5.4 A röntgenfluoreszcens konfokális leképezés eredményei A konfokális (XRF-CI) leképezés során a gerjesztő szinkrotronnyalábot fókuszáltuk a minta megfelelő térfogat-darabjára és a detektor és a minta közé beiktattunk egy másik, fókuszáló röntgenlencsét. Ennek segítségével a detektor a minta megfelelő helyzetű, kis térfogatú darabjából emittált sugárzást érzékelte. A mérési beállítás lehetővé tette, hogy elkészítsük az uborka hipokotil arzén-térképét. A beiktatott fókuszáló röntgenlencse miatt a mintákat csak szobahőmérsékleten tudtuk mérni.

65

Munkánk első fázisában 48 óráig, 10 M As(V)-tel kezelt, liofilizált hipokotil mintákat használtunk, de a kiértékelésük nehézségekbe ütközött, mivel a jel intenzitása, azaz az arzén mennyisége a hipokotilban alacsony volt. A hipokotilban növelnünk kellett az arzén koncentrációját úgy, hogy a növény a mérés ideje alatt, a toxikus hatás következtében, ne veszítse el a turgorát. A Mini-X Ag analízissel nyert eredmények alapján a 60 és 80 M As-kezelés mellett döntöttünk. Elkészítettük a hipokotil arzén-térképét 80 M As(V)-kezelésnél Fe(III)-klorid mellett és 60 M As(V)kezelésnél Fe(II)-aszkorbát mellett. Mindkét vas-forma mellett kimutattuk az arzén jelenlétét az epidermiszben, az alatta elhelyezkedő kisméretű, vastagabb sejtfalú, parenchimatikus sejtekben és a szállító pályákban. A Fe(III)-klorid és a Fe(II)-aszkorbát mellett As(V)-el kezelt növények hipokotiljai között szembetűnő különbséget nem tapasztaltunk (33. ábra).

1100 m

910 m

μm b. Fe(II)-aszkorbát + 60M As(V)

a. Fe(III)-klorid + 80M As(V)

33. ábra Röntgenfluoreszcens konfokális leképezés módszerével készített liofilizált uborka hipokotil arzén-térképe.

a. Fe(III)-klorid + 80M As(V) b. Fe(II)-aszkorbát + 80M As(V) A színek mélysége a koncentrációnövekedéssel van összefüggésben. Az eredmények egy-egy mérésből származnak.

66

5

Az eredmények megvitatása Az arzén a növényi és az állati szervezetek számára különösen mérgező elem, a

növények arzés-felvétele ezért mezőgazdasági és humán élelmezési szempontból jelentőséggel bír. A szárazföldi és a vízi növények képesek felvenni az arzént. A szerves arzén-formák mellett, mindkét szervetlen arzén-forma jelen lehet a növényekben, de arányuk eltérő, mind a különböző növényfajokban, mind a különböző növényi részekben. Ha az arzén-formák hatását vizsgáljuk, figyelembe kell venni, hogy az arzenát gyorsan redukálódhat arzenitté a növényi szövetekben (Bertolero et al., 1987), és a különböző minta előkészítési és mérési folyamatok során. Kísérleteinkhez, a gyakorlati célokat szolgáló, laboratóriumi körülmények között, vízkultúrában jól termeszthető zöldségfélét, az uborkát (Cucumis sativus cv. Joker 1) választottunk. Az irodalomban eddig vizsgált növényekhez hasonlóan az uborka is fölvette a tápoldatból az arzenátot, arzenitet és a dimetil-arzenátot. Szöveteiben megtörtént az arzenát redukciója arzenitté (Mihucz et al., 2005 Meirer et al., 2007). Az arzén az uborkában is gátolta a növekedést, a transpirációt (Czech et al., 2011) és az arzenát → arzenit redukció következtében oxidatív stresszt okozott. Jó tesztnövénynek bizonyult, mert az alacsony koncentrációban adott arzén-kezelésekre érzékenyen reagált, így ki tudtuk mutatni, hogy az arzén elsősorban a növény vízháztartását befolyásolja, amely hatás függ az uborka fejlettségi állapotától.

5.1 Az arzén felvétele Az As(V) a foszfát transzporteren keresztül vevődik föl. A gyökérben a foszfátfelesleg csökkenti az As(V) felvételét (Asher and Reay, 1979, Meharg and Macnair, 1990, 1992, Clark et al., 2000, Pickering et al., 2000, Bleeker et al., 2003, Wang et al., 2002). A foszfát az As(III)-felvételét nem befolyásolja, mivel az As(III) az aquaporin csatornákon keresztül jut be a növénybe (Meharg and Jardine 2003). A vízkultúrában nevelt, 3 leveles uborkában a 100 M As(V) és As(III)-kezelés a gyökér és a hajtás növekedésében közel 50% gátlást okozott, amit a tápoldat foszfát

67

koncentrációjának az arzén koncentrációval azonos szintre emelése sem tudott megváltoztatni. A kétfajta kezelés toxikus hatása között a magas koncentráció miatt nem találtunk különbséget. A 10 M As- és 100 M foszfát-kezelés mellett az As(V)-hatás védhető, de As(III)hatás nem, ami arra utalhat, hogy az uborkában is működik a két eltérő felvételi rendszer. Az As(III)-nak a nagyobb toxicitását az As(V)-tel szemben (Quaghebeur and Rengel, 2003), csak alacsony, 2 M arzén és 2 M foszfát tartalmú tápoldaton, közel virágzásig nevelt uborkában tudtuk kimutatni. Az As(V) a gyökér növekedését jelentősen a hajtás növekedését alig befolyásolta. A tápoldatból felvett As(V) nagy része az uborka gyökerében maradt, ott redukálódott As(III)-á (Mihucz et al., 2005), ami magyarázatot ad a gyökér növekedésének jelentős gátlására. Az arzén kis mennyiségben As(III)-formában transzlokálódott a hajtásba (Mihucz et al., 2005), és annak növekedését alig befolyásolta. Az irodalmi ismereteink alapján nem volt meglepő, hogy az As(III)-kezelés az uborkában mind a gyökér, mind a hajtás növekedését nagyobb mértékben gátolta, mint az As(V)-kezelés. Meharg és munkatársainak munkái alapján tudjuk, hogy az arzenit gyorsabban vevődik föl a növényekbe, mint az arzenát (Meharg and Jardine 2003). Az arzenit nagy affinitással kötődik a szulfhidril csoportokhoz, elsősorban a ciszteinhez. Megakadályozza a fehérje-fehérje kölcsönhatást, a sejt alapvető anyagcsere folyamatait és a glutation mennyiségi csökkenése a reaktív oxigén-formák felszaporodásához vezet (Ali et al., 2009, Mandal and Suzuki 2002 irodalom). Közvetlenül bizonyította az As(III)-kezelés toxikusabb hatását a gyökér exudáció mértékének

jelentős

gátlása. Hosszabb idejű

arzén-előkezelés után a

gyökérnyak

vágásfelületén a xilem elemekből nem választódott ki nedv As(III)-kezelés után, míg az As(V)kezelés ilyen mértékű víztaranszport gátlást nem okozott.

5.2 Az As-kezelés hatása a növény vízháztartására Az irodalomból ismert, hogy számos nehézfém befolyásolja a növények vízháztartását (Cd, Pb, Hg). Ismert, hogy a nehézfém kezelések hatására csökkenhet a fotoszintetikus aktivitás, amivel együtt jár a sztóma konduktancia és a transpiráció csökkenés, például ólom kezelt kukoricában. A friss tömeg csökkenés együtt járhat a gyökér és a hajtás víztartalmának a csökkenésével is. Az arzén-kezelés növények vízháztartását komplex módon vizsgáló

68

munkákat nem találtunk. Ennek egyik oka lehet, hogy a kezeléseket legtöbbször a nálunk alkalmazottnál jóval magasabb arzén-koncentrációkkal végezték (Fitz és Wenzel 2002), és az arzén nátrium-sóját alkalmazták. A magas Na+ koncentráció (pl. 1 mM) az anyagcsere szempontjából már nem elhanyagolható. Az arzén-kezelés hatására bekövetkező növekedés gátlás igazolása mellett egy új, az irodalomban nem közölt eredményt kaptunk. Megfigyeltük, hogy a három leveles uborka gyökere a 10 M arzén tartalmú oldatban, rövid időn belül, elveszítette a turgorát, majd a levelek is turgor vesztetté váltak, de nem száradtak ki. Az arzén-mentes tápoldatban 2-3 nap alatt a levelek visszanyerték a turgorukat, a gyökerek azonban nem. Az arzén-kezelés és a vízháztartás zavara közötti nyilvánvaló kapcsolat indokolttá tette a transpiráció, a WSD és a gyökérnyomás vizsgálatát. Mindkét arzén-forma mellett, rendkívül rövid idő alatt bekövetkezett a sztómák záródása. Mivel a levelek arzén tartalma nem érte el a gyökér arzén tartalmának 5%-át sem, ezért nem tartjuk valószínűnek, hogy ilyen rövid idő alatt az arzén hatékony koncentrációban eljuthat a sztóma zárósejtekig. Sokkal valószínűbb, hogy az arzén-kezelés hatására rövid időn belül fellépő vízháztartási zavarok oka a gyökerek gyors turgorvesztése, a gyökérmembrán dezorganizációja és a gyökér vízszállító képességének megváltozása. Ezt igazolja az ionleadás mértékének a megváltozása is. Az As(V)-kezelés hatására a gyökér membránok áteresztő képessége, így ionleadásuk jelentősen megnőtt. A fellépő víztelítettségi hiány (WSD) a kontroll érték kétszeresére nőtt, ami ugyan csak a jelentős vízhiányra utal. Az As(V) és az As(III) közvetve vagy közvetlenül hatást gyakorolnak az aquaporinokra és a Nip családba tartozó csatornákra. A vízcsatornák nyitása és zárása során foszforiláció történik. Feltételezhető hogy a foszforiláció ↔ defoszforiláció során az As(V) helyettesítheti a foszfátot (Azad et al., 2004; Johansson et. al., 1998; Maurel et al., 1995). Mivel az arzén elsősorban az uborka vízháztartását befolyásolja, a turgorvesztés hátterében az arzén aquaporinokra gyakorolt hatása is állhat. Az aquaporinok működését gátló higany (Maggio and Joly, 1995; Maurel, 1997; Martinez-Ballester, 2003) az As(V)-kezeléssel összehasonlítva közel azonos mértékben gátolta a gyökér és a hajtás növekedését, a víztelítettségi hiány növekedését és a transpirációt. Az As(V) aquaporinokra gyakorolt hatását igazolhatják a közel virágzásig nevelt uborkán végzett könnyezési kísérleteink is. A kontroll növények hajtásának eltávolítása után a

69

gyökér 90 percig egyenletes sebességgel könnyezett. A Hg(II)-kezelés hatására, a kezdeti serkentés után 40 perc múlva, az As(V)-kezelés hatására a levágás után 50 perc múlva gyorsan csökkent a kiválasztott nedv mennyisége, 60 perc után mindkét elem egyformán gátolt, végül a kontroll érték 1/5-de maradt meg. A higanynak, a levágás után észlelhető serkentő hatása, a nehézfémeknek, a nagyon alacsony külső koncentrációkban mérhető, kation-felvételt serkentő hatására emlékeztetnek. A tanszéken végzett korábbi kísérletekben bizonyították, hogy a cink, az ólom és a higany serkenti a kálium ionok felvételét (Cseh és munkatársai, közöletlen adatok). A fent leírt méréseink alapján feltételezhetjük, hogy az arzén mellett tapasztalt gyors turgorvesztés egyik oka lehet, az arzénnek aquaporinokra gyakorolt hatása.

5.3 A növény fejlettségi állapotától függő arzén-hatás Az arzén hatását különböző növényeken régóta vizsgálják (Asher and Reay 1979, Wang et al., 2002, Poyton et al., 2004, Raab et al., 2004, Bleeker et al., 2006, Isayenkov et al., 2008, stb), de annak leírását, hogy az arzén a növény fejlődési fázisaitól függő turgor vesztést okoz, még nem találtuk meg az irodalomban. A magok 10 M As(V) jelenlétében kicsíráztak. A csíranövények az As(V) tartalmú tápoldatban, 14-16 napig tartó kísérleti periódus alatt erősen gátoltan, de képesek voltak növekedni, a növények nem veszítették el a turgorukat. Ugyanezt a jelenséget figyeltük meg, ha a növényeket a fényre helyezés után a 2. napon kezdtük As(V)-tel kezelni. Az arzén-kezelés hatása először a fényre helyezést követő 5. napon kezelt növényeknél jelentkezett. A gyökerek elveszítették a turgorukat. Ekkor a növények első levele kb. 3 cm átmérőjű. Lehetséges, hogy a transpiráció lehetősége megnöveli az arzén szállítás mértékét a hipokotilban, és valószínűbb, hogy a gyökérsejt membránok féligáteresztő képességének elvesztésében is keresni kell a közvetlen okot. Ha a kezelést a fényre helyezést követő 7. és 9. napon kezdtük, amikor az első levél már elég fejlett volt, nemcsak a gyökér, hanem a levelek is elveszítették a turgorukat, a hipokotil transzlucenssé “áttetszővé” vált, a növény kollapszált “összeroskadt”. A sérült növényeknél jelentős anyagveszteség mérhető, mivel a kísérlet végén a hajtás indulási tömegének alig 20%-a maradt meg. A 12–14. naptól kezelt, 3–4 leveles, nagyobb növények

70

gyökerei turgorvesztettek voltak, azonban a levelek épek maradtak vagy csak átmeneti ideig váltak turgorvesztetté. A fent leírt jelenségeket nemcsak a hosszú ideig tartó, maximálisan 16 napig kezelt növényeknél tapasztaltuk, hanem a megfelelő fejlettségi állapotban, 48 óráig kezelt növényeknél is. Kísérleteink eredményeit látva a legfontosabb kérdésünk az volt, hogy mi védi meg a csíranövényt az As(V)-toxikus hatásától? Miért maradnak turgeszcensek azok a növények, amelyeket a fényre helyezésüktől (a 0. vagy a 2. naptól, csíranövény koruktól) 14 napon keresztül kezelünk? Miért veszítik el a turgorukat 2-3 óra alatt azok a növények, amelyek a kezelés megkezdésekor egy levéllel már rendelkeznek (érzékeny periódus)? A 14 napon keresztül kezelt növények túlélésének egyik oka lehet a járulékos gyökerek képződése. A növényekre általánosan jellemző, idősebb, 4-5 leveles állapotban, vagy stressz hatására, hogy járulékos gyökereket képeznek (Láng et al., 1996). A 14 napos arzén-kezelés alatt mi is megfigyeltük, hogy a növény hipokotilján járulékos gyökerek jelentek meg. Az arzén eltérő módon hatott a primer és a járulékos gyökerek növekedésére. A stressz a primer gyökér növekedését megállította, míg a járulékos gyökerét nem. Sikerült igazolnunk, hogy As(V) jelenlétében az uborka levélnyelén megjelenő járulékos gyökerek turgoszcensek maradnak és növekedésre képesek. Ma et al. (2001) megállapították, hogy a gyökérszőr nélküli és oldal gyökér nélküli járulékos gyökér és a primér gyökér szilícium felvételében jelentős eltérések mérhetőek. A fokozott szilícium felvételért a periciklusból eredő oldalgyökerek és gyökérszőrök a felelősek. Az uborka járulékos gyökerének „alakja” eltér a primer gyökerétől. A járulékos gyökér vastagabb, mentes a gyökérszőröktől és a gyökér csúcstól sokkal távolabb jelennek meg rajta az oldalgyökerek. Az irodalomban közölt adatok alapján (Peterson 1992, Peterson és Enstone 1996) feltételezzük, hogy a gyors növekedésű járulékos gyökérben az endodermisz a gyökércsúcstól távolabb (néhány cm-re) fejlődik ki, mint a primér gyökérnél. A stressz-hatással együtt járó öregedés és az endodermisz kialakulása az ionfelvételi zónában a hajtás irányába megnehezítheti az ion-szállítást. Feltehetően ez lehet a magyarázata annak, hogy arzén jelenlétében az oldalgyökér- és a gyökérszőr mentes járulékos gyökér élő és turgeszcens maradhat.

71

A hipokotilból készült metszeteken jól láttuk, hogy az As(V)-kezelés mellett, az egy levéllel rendelkező fiatal növény hipokotiljának közepén, egy rhexigén / skizigén üreg alakult ki, amely a sterssz- és a korai öregedési folyamatokra utalhat. Ez az üreg a kontroll növényeknél a növekedés későbbi szakaszában az 5. levél megjelenésével jelenik csak meg. A fiatal, 0. és 2. napon As(V)-kezelt növények épségének másik oka a gyökképződést megakadályozó, elimináló tényező/k/ lehet/nek/. Ezt az elképzelést igazolta a Fe(II)-aszkorbát mellett, As(V)-tel kezelt növények viselkedése.

5.4 Az As(V) és az As(III) okozta oxidatív stressz, a Fe(II)-aszkorbát hatás Jól ismert tény, hogy a nehézfémek hatására a membránok összetétele, permeabilitása megváltozhat. A változás egyik oka, hogy a kezelések hatására reaktív oxigén gyökök keletkeznek, amelyek membrándezorganizációhoz vezethetnek. Bizonyítottuk, hogy a gyökérben az As(V) → As(III)-má alakult (Mihucz et al., 2005). Az As(V)-kezelés mellett a könnyezési nedvben 90%-ban As(III)-at mutattunk ki. A növényi sejtekben az As(V) redukciója során szabad gyökök keletkezhetnek (Singh és Ma, 2006), ami turgor vesztéshez vezet (Gosset et al., 1994). A növényi sejtben nagy mennyiségben előforduló aszkorbinsav képes csökkenteni a reaktív oxigén-formák káros hatásait, befolyásolni a növekedést és az ionfelvételt (Foyer és Noctor, 2005a és 2005b). Ezért kézenfekvő megoldásnak tűnt, hogy a növény védekező rendszerét aszkorbinsavval segítjük, ezért a növény vas ellátását Fe(III)-klorid helyett Fe(II)aszkorbáttal biztosítottuk. Tudjuk, hogy a növények az aszkorbinsavat képesek fölvenni a tápoldatból és azt transzlokálni a hajtásba (Mozafar és Oertli, 1993, Franceschi és Tarlyn, 2002). Feltételezésünket igazolta, hogy a Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőtt növények hipokotiljának alsó-, középső- és felső részében a MDA tartalom a kontrollhoz közeli érték maradt, míg Fe(III)-klorid mellett a hipokotil középső és felső részén a malondialdehid tartalom közel 50%-kal nőtt. Igazoltuk, hogy a hipokotil a Fe(II)-aszkorbát és az As(V)-kezelés mellett, nem veszíti el turgorát sőt további növekedésre képes. 72

Az As(III)-kezelés mindkét vas-forma mellett jelentősen gátolta a gyökér és a hajtás növekedését, turgorvesztést csak a gyökereken figyeltünk meg. Különbséget az As(III)-kezelés mellett nem tapsztaltunk a két vas-formán nevelt növény között. Az érzékeny periódus hiányzott. Eredményeinkből arra következtetünk, hogy nem az As(III) a turgor vesztés oka, hanem az arzenát redukciója során keletkező reaktív gyökök. Válaszolnunk kellett arra a kérdésre, hogy a növényi sejtek aszkorbinsav koncentrációja hogyan változik az arzén-kezelések hatására? Befolyásolja-e a növények kora, fejlettségi állapota a sejtek aszkorbinsav koncentrációját?

5.5 Az aszkorbinsav-koncentráció változása A legmagasabb aszkorbinsav koncentrációt a Fe(III)-klorid és a Fe(II)-aszkorbát mellett nőtt fiatal csíranövények gyökerében mértünk. Az aszkorbinsav koncentrációja az arzénmentes tápoldatban fejlődő 0 napos csíranövények gyökerében volt a legnagyobb, majd ez a magas, kezdeti aszkorbinsav koncentráció csökkent és a növény növekedése során, már nem változott. A Fe(III)-klorid és a Fe(II)-aszkorbát mellett nőtt növények hipokotiljában az aszkorbinsav koncentrációját a növény kora / fejlettségi állapota befolyásolta. A fiatal növények hipokotiljában (szikleveles és az egy levélkezdeménnyel rendelkező növények) az aszkorbinsav koncentrációja jóval nagyobb volt, mint az idősebb, már 1-2-3 levéllel rendelkező növények hipokotiljában mért aszkorbinsav koncentrációjának, függetlenül a kezelési módoktól. A Fe(III)-kloridon a fényre helyezéstől (0. nap) 14 napig As(V)-tel kezelt növények épen maradó gyökerében és hipokotiljában jóval magasabb volt az aszkorbinsav koncentrációja, mint a 14 napos kontroll növényben. A csírázó növénynél a hipkotil és a gyökér magas aszkorbinsav tartalma képes kivédeni az arzén okozta oxidatív stresszt (Singh et al., 2006). Az érzékeny periódusban kezelt és turgor vesztett növények hipokotiljából nem sikerült kimutatni az astkorbinsavat. Ennek oka, hogy a hipokotil sejtjeinek féligáteresztő-képessége a szabad gyök-képződés miatt, rövid időn belül megszűnt. A vízvesztés következtében, a 73

kiindulási tömeg jelentősen csökkent. Az oldott anyag, így az aszkorbinsav is, a diffundáló vízzel együtt elvándorolt. A Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldaton, különböző időpontokban megkezdett As(V)kezelések mellett, ahol a növények növekedése „védett” a kezelések alatt, a hipokotil aszkorbinsav koncentrációja magas volt, a hajtás turgeszcens maradt. Az aszkorbinsav tehát véd az arzén okozta oxidatív stressztől (Singh et al., 2006). Mind a Fe(III)-klorid, mind a Fe(II)-aszkorbát mellett nőtt, 12. naptól 48 óráig kezelt, enyhén stresszelt növények hipokotiljában az aszkorbinsav koncentrációja a kontroll értékekhez közelít. Ennek oka, hogy a 12 napos növénynek már a gyökere és a hajtása is nagy, a hatás időtartama viszonylag rövid (48 óra), a felvett arzén mennyisége nem éri el a toxikus koncentrációt. Az enyhe oxidatív stresszre a kontroll értéknél kicsit magasabb aszkorbinsav tartalomból következtethetünk. Az As(III)-kezelés mellett a hipokotil aszkorbinsav koncentrációja magas a 2. és 5. naptól kezelt 14 napos növényeknél, hasonlóan a Fe(II)-aszkorbát + As(V) mellett nőtt növényekéhez, majd fokozatosan csökkent. Érzékeny periódust nem tapasztaltunk. A magas aszkorbinsav koncentráció hátterében az As(V) ↔ As(III) jelenlétét sejtjük. Azonban bizonyításra vár még, hogy az As(III) a növényi szövetekben oxidálódhat-e, és hogy az As(III)kezelés toxikus hatása hogyan befolyásolja a növény enzimatikus és nem enzimatikus védekező rendszerét. A kisérleti eredményeink alapján nem állíthatjuk, hogy a szilícium- és az As(III)felvétel között kialakul kompetíció. A kontroll növényben mért aszkorbinsav koncentrációt meghaladó értékek oxidatív stresszre, azaz az arzén jelenlétére utalnak a hipokotilban. A szilícium jelenléte a tápoldatban nem okozott szignifikáns különbséget az As(III)-kezelések között, így feltételezzük, hogy a hipokotil arzén tartalmát sem befolyásolta a szilícium jelenléte a tápoldatban.

5.6 Az aszkorbinsav-oxidáz A növény növekedését elsősorban a sejtfal pillanatnyi állapota határozza meg. A növényi sejt vizet és anyagokat csak akkor képes felvenni, ha a sejtfala tágulásra képes.

74

Feltételezzük, hogy az arzén-kezelés hatással lehet a sejtfal összetételére, befolyásolhatja a sejtfal enzimeinek működését is. Az aszkorbinsav-oxidáz a sejtfalban lokalizált enzim. Leglényegesebb tulajdonsága, hogy a sejtfal lazulását idézi elő, és ezen keresztül lehetővé teszi a növekedést (Pignocchi et al., 2003). Aktivitását jelentősen befolyásolja a fény, feltételezhetően a szubsztrátjának, az aszkorbinsavnak, megvilágítástól függő képződése miatt. Az aszkorbinsav-oxidáz az uborka sejtfalban nagy mennyiségben fordul elő, így a kereskedelemben forgalmazott enzimet belőle állítják elő. Az uborka hipokotiljában az aszkorbinsav-oxidáz enzim aktivitását a felhasználható aszkorbinsav mennyisége határozza meg. Az arzén-kezelés nélküli, Fe(III)-klorid és Fe(II)aszkorbát mellett nőtt növényekben az aszkorbinsav koncentrációja, így az aszkorbinsavoxidáz enzim aktivitása is elsősorban a növény fejlettségi állapotától függött. Az arzén-mentes tápoldatban nőtt, 0 napos növényekben az aszkorbinsav, így az aszkorbinsav oxidáz aktivitása is magas volt, majd a 2 napos növényeknél csökkent az aszkorbinsav koncentrációja, így az enzim aktivitása is, és a további növekedés során már nem változott, még a 7, 9 napos növényeknél sem, amikor a levelek intenzíven növekedtek Ha a Fe(III)-kloridon nőtt növényt az érzékeny periódusában kezeltük As(V)-tel, a hipokotil elvesztítette a turgorát, nem találtunk benne kimutatható mennyiségű aszkorbinsavat, ezért minimálisra csökkent az aszkorbinsav-oxidáz aktivitása is (függelék 34. ábra és 35. ábra). Ezzel szemben a Fe(II)-aszkorbát jelenléte lehetővé tette a hajtás növekedését, amit a magas aszkorbinsav koncentráció és feltűnően magas aszkorbinsav-oxidáz aktivitás biztosított (függelék 34. ábra és 35. ábra). Az As(III)-kezelés mellett a hipokotil aszkorbinsav koncentrációja magas, így az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása is, hasonlóan a Fe(II)-aszkorbát + As(V) mellett nőtt növényekéhez. Az azonos hatás hátterében az As(V) jelenlétét gondoljuk a hipokotilban (függelék 34. ábra és 37. ábra). Érdekes számba vennünk az aszkorbinsav koncentráció és az aszkorbinsav oxidáz változásának irányait a különböző fejlődési állapotban kezelt növényeknél. Kontroll növényeknél és a 12. napon kezelt növények hipkotiljában az aszkorbinsav az enzim szubsztrátjaként viselkedik. A 2. naptól kezelt növényeknél, az As(V) + Fe(II)-aszkorbát

75

kivételével, magas aszkorbinsav koncentráció mellett, az aszkorbinsav-oxidáz aktivitása kicsi. A növénykék hipokotilja ép marad. Az 5.,7., 9.-naptól kezelt hipokotiloknál az aszkorbinsav és az aszkorbinsav-oxidáz arányai megváltoztak, a legfeltünőbb az aszkorbinsav-oxidáz aktivitási csúcs a 7 napon kezelt növények hipokotiljánál (függelék 34. ábra, 35. ábra, 36. ábra és 37. ábra).

5.7 Szilícium hatása és az As(III)-kezelés Az As(III) felvételéért a rizsben, a kukoricában és az uborkában a szilícium transzporterek a felelősek. Ma és munkatársainak (2006) kutatásai szerint az Lsi2 transzporter nagy hatásfokkal szállítja a szilícium mellett az As(III)-at a sztélébe. Az általunk alkalmazott 500 M-os szilícium-kezelés csak kismértékben, hol pozitívan, hol negatívan, befolyásolta az As(III)-hatását. Az uborkával kapott eredményeink alapján nem állíthatjuk, hogy van kompetíció a szilícium és az As(III) felvétele között. Meg kell jegyeznünk, hogy Ma és munkatársainak (2001) a módszere szerint szilícium-savat állítottunk elő, tehát az oldatok pH-ja semleges maradt. Problémának tartjuk a sokak által használt Nátrium-szilikátot, mert felhasználása során az oldatokat pH 9-ről pH 6-ra kell állítani és a Na+-felesleg zavaró hatását sem lehet figyelmen kívül hagyni. A Fe(III)-klorid + Si és As(III)-mal kezelt növényeknél, hasonlóan a Fe(II)-aszkorbát mellett alkalmazott As(V)-kezeléshez, nem tapasztaltuk az aszkorbinsav koncentrációjának ingadozását, az érzékeny periódus hiányzott. Az aszkorbinsav : aszkorbinsav-oxidáz aktivitás arány közötti eltérés Si mellett a 2. és a 7. napon történt As(III) kezelésnél volt a legnagyobb ( Függelék 36. ábra és 37. ábra). A Fe(III)-klorid és a Fe(III)-klorid + Si mellett nőtt és As(III)-kezelt növényekben egy enzimaktivitási csúcsot figyeltünk meg. Ha feltételezzük, hogy az uborkára jellemző a fejlődése során egy érzékeny periódus, ami alatt érzékenyen reagál az arzén-kezelésre, akkor indokolt, hogy a 7. naptól kezelt növényben felugrik az aszkorbinsav-oxidáz enzim aktivitása. Ez a védekezési folyamat biztosíthatja az első levél megjelenését és növekedését a stresszhatás mellett.

76

5.8 Az arzén akkumuláció helye a növényben Munkánk során sikeresen alkalmaztuk biológiai mintákon a röntgenfluoreszcens mikrotomográfiát, a röntgensugaras konfokális leképezés módszerét és a XANES technikát. Méréseinket liofilizált és élő növényi mintákon végeztük. Kiküszöböltük a kémiai minta feltárási folyamatok során fellépő oxido − redukciós (As(V) ↔ As(III)) folyamatokat, így reális képet kaphattunk az arzén lokalizációjáról és az arzén oxidációs állapotáról a növényben. Az uborka az arzén vegyületeit felveszi, átalakítja és transzlokálja. Az As(V)-kezelt növényekben a XANES vizsgálatok bizonyították, hogy az arzén oxidációs állapota a különböző növényi részekben változik. A spektrumok alapján a Fe(III)-kloridon vagy Fe(II)aszkorbáton nevelt és As(V)-tel kezelt növények gyökerében As(V), a hipokotilban As(V) és As(III) jelenlétét detektáltuk (Silversmit et al., 2009). A xilemnedvben a HPLC-ICP-MS módszerrel kimutatott uralkodó arzén-forma az As(III) volt (Mihucz et al., 2005). Röntgenfluoreszcens mikro-tomográfiával a hipokotilban feltérképeztük az arzén elhelyezkedését. A hipokotilban, függetlenül attól, hogy a növény Fe(III)-kloridon vagy Fe(II)aszkorbáton fejlődött, az arzén elsősorban az epidermiszben, a vastagabb sejtfalú parenchimatikus sejtekben és a szállítópályákban halmozódik fel. Az epidermiszben megjelenő magas arzén koncentráció a védekezés egyik módja lehet. Kérdés, hogy a turgor vesztett gyökerű növény hajtásában kimutatott arzén (As(V) és As(III)) honnan származik? Knipfer és Fricke (2011) eredményei szerint a fiatal árpa a primer gyökereinek eltávolítása után is transpirál. Ennek ismeretében feltételezhetjük, hogy az arzenát tartalmú tápoldatból a turgorvesztett gyökér és a gyökér nyak szövetein keresztül az arzenát feljuthat a hipokotil szöveteibe. Az arzén szállítódhat a parenchimatikus sejtekben, amit igazolnak a konfokális leképezés (XRF-CI) módszere alapján készített képek. A hipokotilban kimutatott arzén-formákból (As(V) és As(III)) következik, hogy nem csak a gyökérben, hanem a hipokotilban is megtörténhet az arzén átalakulása, amely oxidatív stresszt okozhat. Különbséget tapasztaltunk az arzén-formák arányában a hipokotilban, ha Fe(II)aszkorbáton illetve Fe(III)-kloridon neveltük a növényeket. Fe(II)-aszkorbát mellett kevesebb arzén jutott föl a hipokotilba, mint Fe(III)-klorid mellett. Az uralkodó arzén-forma mind két

77

esetben az As(III) volt, de Fe(II)-aszkorbát mellett a teljes arzén mennyiségének a 88%-a volt As(III), addig Fe(III)-klorid mellett csak a 72% volt As(III). A Fe(II)-aszkorbát befolyásolhatja az arzén felvételét az uborkában és megakadályozhatja az As(V) redukcióját és a szabad gyökök képződését a hipokotilban.

78

6

Összefoglalás A vízkultúrában, kontrollált körülmények között nevelt uborka felveszi és a hajtásba

transzlokálja a vizsgált arzén-formákat (As(III), As(V), DMA). A DMA, az As(V) és az As(III) felvételének, transzlokációjának módja és az anyagcserére gyakorolt hatása különbözik. Az uborka a DMA-t felveszi és a felvett mennyiség 100%-át transzlokálja a hajtásba. A növény növekedésére nincs gátló hatása. Az arzenát az uborkában a foszfát transzportereken keresztül vevődik fel, a foszfát felesleg csökkenteni képes az arzenát toxikus hatását. Az uborka gyökerében az As(V) → As(III)-má redukálódik, szabad gyökök keletkeznek, oxidatív stressz alakul ki, amely lipidperoxidációhoz és a membránok károsodáshoz vezet. Az As(V) toxicitásának mértékét azonban a növény fejlettségi állapota is befolyásolja. A fiatal növényben növekedés gátlást és öregedési folyamatokat indukál. A stresszor hatására járulékos gyökerek képződnek. A hipokotilban megnöveli az aszkorbinsav koncentrációját és az aszkorbinsav-oxidáz enzim aktivitását, amely biztosítja a fiatal növény túlélését. Az 1 levéllel rendelkező növényben (érzékeny periódus) az As(V)-kezelés a gyökér és a hajtás turgorvesztését, a vízháztartás felborulását, a membránok dezorganizációját okozza. Az érzékeny periódusban − a levelek intenzív növekedése során − az oxidatív károsodásokkal szemben az antioxidáns védekező rendszer nem tud lépést tartani. Az aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása alig mérhető. A kezelés hatására a növény a kimerülés fázisába kerül. A 2-3 levéllel és fejlett gyökérrel rendelkező növényekben az As(V)-kezelés a kismértékű növekedés gátlás mellett, a gyökér részleges turgorvesztését okozza, a hajtás vízmegtartó képességét azonban nem befolyásolja. A kezelt növények aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása a kontroll értékekéhez közelít. A tápoldathoz adott Fe(II)-aszkorbát mellett a növényeknél nem mutatható ki az érzékeny periódus, a hipokotil turgerszcens marad, az As(V) ↔ As(III) átalakulás közben képződő szabadgyökök eliminálódnak. Az As(V) és a Hg(II) megközelítően azonos mértékben gátolja a gyökér és a hajtás növekedését, a transpirációt, a víztelítettségi hiányt és a gyökérnyomás kialakulását. Az eredmények az aquaporinok szerepére utalnak. Az arzenitkezelés jelentősen gátolja az uborka növekedését, transpirációját, de a hatások és a növény fejlettségi állapota között összefüggést nem találtunk. Az aszkorbinsav koncentrációja és az

79

aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása meghaladja a kontroll növényét. Egyértelmű, hogy a vízháztartás zavarát és az oxidatív stresszt az uborkában közvetlenül nem az As(III) váltja ki. A szilícium pozitív hatását, a gyökképződés eliminálását, versengését az As(III) szállításában nem tudtuk igazolni. A HPLC-ICP-MS technikával a xilemnedvet analizáltuk, amelyben az As(V)-kezelés mellett az uralkodó arzén-forma az As(III) volt, tehát a gyökérben megtörténik az arzén redukciója. A Mini X Ag analízis segítségével meghatároztuk a liofilizált uborka hipokotil maximális arzén terhelhetőségét. Röntgenfluoreszcens mikro-tomográfiával a hipokotilban feltérképeztük az arzén elhelyezkedését. A XANES vizsgálatok alátámasztották a közvetett méréseinket, azaz a hipokotilban az As(V) és az As(III) is jelen van, tehát megtörténik a hipokotilban az As(V) ↔ As(III) átalakulás, amely oxidatív stresszt okoz.

80

7

Summary

Cucumber plants grown in hydroponic culture in controlled conditions take up and translocate to the shoot the arsenic species (As(III), As(V), DMA). The way of uptake and translocation of DMA, As(V) and As(III) and their effect on the metabolism is different. Cucumber takes up DMA and 100% of the amount taken up is translocated into the shoot without any inhibitory effect on growth. Arsenate is taken up through the phosphate transporters in cucumber so the excess of phosphate may reduce the toxic effect of arsenate. As(V) is reduced to As(III) in the roots, and during this process free radicals are formed, oxidative stress occcurs leading to lipid peroxidation and membrane damage. But the extent of As(V) toxicity is modified by the stage of development of the plant. In young plants it induces growth inhibition and ageing processes. Adventious roots are formed. As(V) increases the concentration of ascorbic acid and the activity of ascorbic acid oxidase in the hypocotyl that facilitates the survival of the young plants. In the plants bearing one leaf (sensitive stage) As(V) treatment causes the loss of turgor in the shoot, damage of the water household and membrane disorganisation. In the sensitive period – during the intensive growth of the leaves – the antioxidative defence system cannot balance the oxidative damages. The concentration of ascorbic acid and the activity of the ascorbic acid oxidase is close to the detection limit. The plants reach the exhaustion level upon As(V) treatment. The As(V) treatment causes partial turgor loss in the roots besides the slight growth inhibition but does not influence the water saturation of the shoot in the plants bearing 2-3 leaves and well developed root system. In these treated plants, the concentration of ascorbic acid and the activity of the ascorbic acid oxidase is close to the control level. When Fe(II)-ascorbate is added to the nutrient solution the plants have no detectable sensitive stage, the hypocotyl remains turgescent and the free radicals formed during the As(V)  As(III) conversion are eliminated. As(V) inhibits the growth of roots and shoots, the transpiration and formation of the root pressure and causes water saturation deficit to a similar extent as Hg(II). The measurements refer to the role of aquaporins in As transport. Arsenite treatment severely inhibits the growth and traspiration of cucumber but we could not find connection between the effects and the developmental stage of the plants. The concentration of ascorbic acid and the activity of the ascorbic acid oxidase exceed those in the

81

control plants. It is demonstrated that the disorder in the water household and the oxidative stress is not caused directly by the As(III). The positive effect of silicon in the elimination of free radical formation and the competition between Si and As(III) in the transport could not be justified. The analysis of xylem sap by HPLC-ICP-MS technique showed that the main arsenic species under As(V) treatment was As(III) so the reduction of As(III) occurs in the roots. We have determined the maximal arsenic load in the lyophilised hypocotyls of cucumber by mini X Ag analysis. We have mapped the distribution of As in the hypocotyl using XANES. These observations have supported our indirect measurements showing that both As(III) and As(V) is present in the hypocotyl, so As(V)  As(III) conversion occurs in the hypocotyl that causes oxidative stress.

82

Függelék

6

0,9

As(V) és Fe(III)-klorid AAO As(V) és Fe(III)-klorid AA

0,8

5

[AA] mM g-1 frt

0,7 4

0,6 0,5

3 0,4 2

0,3 0,2

AAO aktivitása (unit / g frt.)

8

1 0,1 0

0 2

5

7

9

12

14

a kezelés megkezdésének az ideje (napok)

34. ábra Az aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása uborka hipokotilban As(V)-kezelés mellett a 24. ábra és a 26. ábra alapján. A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel.

83

0,9

As(V) és Fe(II)-aszkorbát AAO As(V) és Fe(II)-aszkorbát AA

0,8

5

[AA] mM g-1 frt

0,7 4

0,6 0,5

3 0,4 2

0,3 0,2

AAO aktivitása (unit / g frt.)

6

1 0,1 0

0 2

5

7

9

12

14

a kezelés megkezdésének az ideje (napok)

35. ábra Az aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása uborka hipokotilban As(V)-kezelés mellett a 24. ábra és a 26. ábra alapján. A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát:a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(V) és Fe(II)-aszkorbát: a növények 10 M Fe(II)-aszkorbát tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(V)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel.

84

6

0,9 As(III) és Fe(III)-klorid és Si AAO

[AA] mM g-1 frt

As(III) és Fe(III)-klorid és Si AA

0,7

4

0,6 0,5

3 0,4 2

0,3 0,2

AAO aktivitása (unit / g frt.)

0,8 5

1 0,1 0

0 2

5

7

9

12

14

a kezelés megkezdésének az ideje (napok)

36. ábra Az aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása uborka hipokotilban As(V)-kezelés mellett a 25. ábra és a 27. ábraalapján. A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid és Si: a növények 10 M Fe(III)-klorid és 500 M szilícium tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel. (n=10)

85

0,9

As(III) és Fe(III)-klorid AAO As(III) és Fe(III)-klorid AA

0,8

5

[AA] mM g-1 frt

0,7 4

0,6 0,5

3 0,4 2

0,3 0,2

AAO aktivitása (unit / g frt.)

6

1 0,1 0

0 2

5

7

9

12

14

a kezelés megkezdésének az ideje (napok)

37. ábra Az aszkorbinsav koncentrációja és az aszkorbinsav oxidáz enzim aktivitása uborka hipokotilban As(V)-kezelés mellett a 25. ábra és a 27. ábra alapján. A hipokotil aszkorbinsav koncentrációjának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkézdésének az idejét az x-tengelyen tüntettem föl. Az aszkorbinsav oxidáz aktivitásának változása a 2., 5., 7., 9., 12. naptól kezelt 14 napos és a kontroll 14 napos növények hipokotiljában: █ As(III) és Fe(III)-klorid: a növények 10 M Fe(III)-klorid tartalmú tápoldatban nőttek, a 10 M As(III)-kezelések megkezdésének idejét az x-tengelyen tüntettem fel. (n=10)

86

38. ábra Az uborka arzén(As(III) As(V) DMA) felvétele és szállítása.

87

39. ábra Az uborka szövettani felépítése és az arzén-kezelés hatása A. Az arzén-kezelt növény hipokotiljának sziklevél alatti része, megfigyelhető a szállító pályák kialakulása a sziklevelek felé B. Az arzén-kezelt növény hipokotiljának középső, érzékeny része, a központi üreggel, amely az arzén-kezelés hatására jelent meg C. Az arzén-kezelt növény hipokotiljának alsó, érzékeny része, a központi üreggel, amely az arzénkezelés hatására jelent meg D. Az uborka elsődleges gyökerének szövettani képe E. Az uborka elsődleges gyökerének szövettani képe, a gyökér csúcs felöli részén F. Az uborka járulékos gyökerének szövettani képe G. A kontroll uborka hipokotil alsó része, a központi üreg hiányzik H. A kontroll uborka hipokotiljának középső része, a központi üreg nem alakult ki I. A kontrol növény hipokotiljának sziklevél alatti része, megfigyelhető a szállító pályák kialakulása a sziklevelek felé J. A hipokotil középső része

88

9

Irodalomjegyzék

Abedin M., Cresser J. M., Meharg A. A., Feldmann J., Cotter-Howells J.: Arsenic accumulation and metabolism in rice (Oryza sativa L.). Environ. Sci. Technology 36: 962-968, 2002a. Abedin M., Feldmann J. J., Meharg A. A.: Uptake kinetics of arsenic species in rice (Oryza sativa L.) plants. Plant Physiol. 128: 1120-1128, 2002b. Ali W., Stanislav V. C., Isayenkov C., Zhao F-J., Frans J. M.: Arsenite transport in plants. Cell. Mol. Life Sci. 66:2329-2339, 2009. Andel O. M. van: The influence of salts on the exudation of tomato plants. Acta Bot. Neerlandica 2: 445-521, 1953. Asher C. J., Reay P. F.: Arsenic uptake by barley seedlings. Plant Physiol. 6: 459-466, 1979. Azad A. K., Sawa Y., Ishikawa T., Shibata H.: Phosphorylation of plasma membrane aquaporin regulates temperature-dependent opening of tulip petals. Plant Cell Physiol. 45: 608-617, 2004. Bartoli C. G., Tambussi E. A., Diego F., Foyer H.: Control of ascorbic acid synthesis and accumulation and glutathione by the incident light red/far red ratio in Phaseolus vulgaris leaves FEBS Letters 583: 118-122, 2009. Bartoli C. G., Yu J., Gomez F., Fernandez L., McIntosh L., Foyer C. H.: Inter-relationships between light and respiration in the control of ascorbic acid synthesis and accumulation in Arabidopsis thaliana leaves J.Exp. Bot. 57: 1621-1631, 2006. Bertolero F., Pozzi G., Sabbioni E., Saffiotti U.: Cellular uptake and metabolic reduction of pentavalent to trivalent arsenic as determinants of cytotoxicity and morphological transformation. Carcinogenesis 8: 803-808, 1987. Bleeker P. M., Schat H., Vooijs R., Verkleij J. A. C., Ernst W. H. O.: Mechanism of arsenate tolerance in Cytisus striatus. New Phytol. 157: 33-38, 2003. Bleeker P. M.,. Hakvoort H. W. J., Bliek M., Souer E., Schat H.: Enhanced arsenate reduction by a CDC25-like tyrosine phosphatase explains increased phytochelatin accumulation in arsenate-tolerant Holcus lanatus. Plant J. 45: 917-929, 2006.

89

Castillo-Michel H., Parsons J. G., Peralta-Videa J. R., Martinez-Martinez A., Dokken K. M., Gardea-Torresdey J. L.: Use of X-ray absorption spectroscopy and biochemical techniques to caracterize arsenic uptake and reduction in pea (Pisum sativum) plants. Plant Physiol. Biochem. 45: 457-463, 2007. Chilvers D. C., Peterson P. J.: Global cycling of arsenic. In: Hutchinson T. C., Meema K. M. (eds.) Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. 31: 279-301, 1987. Clark G. T., Dunlop J., Phung H. T.: Phosphate absorption by Arabidopsis thaliana: interactions between phosphorus status and inhibition by arsenate. Aust. J. Plant Physiol. 27: 959-965, 2000. Cullen W. R., Reimer K., J.: Arsenic speciation in the environment. Chem. Rev. 89: 713-764, 1989. Cseh E., Bujtás K., Buzás I., Szebeni Sz-né., Meisel T-né., Mády Gy., Lakatos B.: A vasfelvétel hatékonyságának vizsgálata. Agrokémia és Talajtan 31: 311-332, 1982. Cseh E., Fodor F.: Role of boron in the plasmalemma turbo reductase activity. In: Bell R. W. and Rerkasem B. (eds.) Boron in Soils and Plants. Kluwer Academic:Publishers, pp. 175-177, 1997. Cseh E., Fodor F., Varga A., Záray Gy.: Effect of lead treatment on the distribution of essentail elements in cucumber. J. Plant Nutr. 23: 1095-1105, 2000. Cseh E., Váradi Gy., Fodor F.: Fe-komplexek és N-formák hatása az uborka Feabszorpciójára, -felvételére és -transzlokációjára. Bot. Közlemények 81: 47-55, 1994a. Cseh E., Váradi Gy., Fodor F.: A N-formák hatása az uborka Fe-felvételére és transzlokációjára HCO3− jelenlétében. Bot. Közlemények 81: 195-199, 1994b. Czech V., Cseh E., Fodor F.: Arsenate induces water stress. Journal of Plant Nutrition, 34: 6067, 2011 Czech V., Czövek P., Fodor J., Bóka K., Fodor F., Cseh E.: Investigation of arsenate phytotoxicity in cucumber plants. Acta Biol. Szegediensis 52: 79-80, 2008. Dasgupta T., Hossain S., Meharg A. A., Price A. H.: An arsenate tolerance gene on chromosome 6 of rice. New Phytol. 163: 45-49, 2004. De Samber B., Silversmit G., De Schamphelaere K., Evens R., Schoonjans T., Vekemans B., Janssen C., Masschaelec B., Van Hoorebeke L., Szaloki I., Vanhaecke F., Rickers K., Falkenberg G., Vincze L.: Element-to-tissue correlation in biological samples

90

determined by three-dimensional X-ray imaging methods. J. Anal. At. Spectrom., 25: 544-553, 2010a. De Samber B., Vanblaere S., Evens R., De Schamphelaere K., Wellenreuther G., Ridoutt F., Silversmit G., Schoonjans T., Vekemans B., Masschaele B., Van Hoorebeke L., Rickers K., Falkenberg G., Szaloki I., Janssen C., Vincze L.: Dual detection X-ray fluorescence cryotomography and mapping on the model organism Daphnia magna. Power Diffraction 25: 169-174, 2010b. De Tullio M. C., Ciraci S., Liso R., Arrigoni O.: Ascorbic acid oxidase is dynamically regulated by light and oxygen. A tool for oxygen management in plants? J. Plant Physiol. 164: 39-46, 2007. Dembitsky V. M., Rezanka T.: Natural occurrence of arseno compounds in plants, lichens, fungi, algal species, and microorganisms. Plant Sci. 165: 1177-1192, 2003. Dhankher O. P.: Arsenic metabolism in plants: an inside story. New Phytol. 168: 503-505, 2005. Dhankher O. P., Li Y., Rosen B. P., Shi J., Salt D., Senecoff J. F., Sashti N. A., Meagher R. B.: Engineering tolerance and hyperaccumulation of arsenic in plants by combining arsenate reductase and gamma-glutamylcysteine synthetase expression. Nature Biotechnology 20: 1140-1145, 2002. Dhankher O. P., Rosen B P., McKinney E. C., Meagher R. B.: Hyperaccumulation of arsenic in the shoots of Arabidopsis silenced for arsenate reductase (ACR2). PNAS 103: 54135418, 2006. Diorio C., Cai J., Marmor J., Shinder R., Dubow M. S.: An Escherichia coli chromosomal ars operon homolog is functional in arsenic detoxification and is conserved in gramnegative bacteria. J. Bacteriol. 177: 2050-2056, 1995. Duan G-L., Zhu Y-G., Tong Y-P., Cai Ch., Kneer R.: Characterization of arsenate reductase in the extract of roots and fronds of chinese brake fern, an arsenic hyperaccumulator. Plant Physiol. 138: 461-469, 2005. Esaka M., Nishitani H., Fukui H., Suzuki K., Kubota K.: Stimulation of ascorbate oxidase secretion from cultured pumpkin cells by divalent cations. Phytochemistry 28: 26552658, 1989.

91

Fayiga A. O., Ma L. Q., Rathinasabapathi B.: Effects of nutrients on arsenic accumulation by arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L. Environ. Experimental Bot. 62: 231-237, 2008. Fitz W. J. and Wenzel W. W.: Arsenic transformations in the soil–rhizosphere–plant system: fundamentals and potential application to phytoremediation. Journal of Biotechnology 99: 259-278, 2002 Fodor F., Cseh E., Varga A., Záray Gy.: Lead uptake, distribution, and remobilization in cucumber. J. Plant Nutr. 21: 1363-1373, 1998. Fodor F., Sárvári É., Láng F., Szigeti Z., Cseh E.: Effects of Pb and Cd on cucumber depending on the Fe-complex in the culture solution. J. Plant Physiol. 148: 434-439, 1996. Foyer C. H., Noctor G.: Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell Environ. 28: 10561071, 2005a. Foyer C. H, Noctor G.: Redox homeostasis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17: 1866-1875, 2005b. Franceschi V. R., Tarlyn N. M.: L-Ascorbic acid is accumulated in source leaf phloem and transported to sink tissues in plants. Plant Physiol. 130: 649-656, 2002. Gay C., Collins J., Gebicki J. M.: Hydroperoxide assay with the ferric-xylenol orange complex. Analytical. Biochem. 273: 149-155, 1999. Gomes D., Agasse A., Thiébaud P., Delrot S., Gerós H., Chaumont F.: Aquaporins are multifunctional water and solute transporters highly divergent in living organisms. Biochim. Biophys. Acta 1788: 1213-1228, 2009. Gosset D. R., Millhollon E. P., Lucas M. C.: Antioxidant response to NaCl stress in salttolerant and salt-sensitive cultivars of cotton. Crop Sci. 34: 706-714, 1994. Guo Z., Tan H., Zhu Z., Lu S., Zhou B.: Effect of intermediates on ascorbic acid and oxalate biosynthesis of rice and in relation to its stress resistance. Plant Physiol. Biochem. 43: 955-962 2005 Hartley-Whitaker J., Woods C., Meharg A. A.: Is different phytochelatin production related to decreased arsenate influx in arsenate tolerant Holcus lanatus? New Phytol. 155: 219-

92

225, 2002. Hidalgo A., González-Reyes J. A., Navas P.: Ascorbate free radical enhances vacuolization in onion root meristems. Plant Cell Environ. 12: 455-460, 1989. Hideg É., Vitányi B., Kósa A., Solymosi K., Bóka K., Won S., Inoue Y., Ridge R. W., Böddi B.: Reactive oxygen species from type-I photosensitized reactions contribute to the light-induced wilting of dark-grown pea (Pisum sativum) epicotyls. Physiol. Plantarum 138: 485-492, 2010. Honda S. I.: Ascorbic acid oxidase in barley roots. Plant Physiol. 30: 174-181, 1955. Horemans N., Foyer C. H., Asard H.: Transport and action of ascorbate at the plant plasma membrane. Trends in Plant Science 5: 263-267, 2000. Horie T., Kaneko T., Sugimoto G., Sasano S., Panda S. K.: Mechanisms of water transport mediated by PIP aquaporins and their regulation via phosphorylation events under salinity stress in barley roots. Plant Cell Physiol. 52: 663-675, 2011. Isayenkov S. V., Maathuis F. J. M.,: The Arabidopsis thaliana aquaglyceroporin AtNIP7;1 is a pathway for arsenite uptake. FEBS Letters 582: 1625-1628, 2008. Johansson, I., Karlsson M., Shukla V. K., Chrispeels M. J., Larsson C., Kjellbom P.: Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell. 10: 451-459, 1998. Kato N. and Esaka M.: Expansion of transgenic tobacco protoplasts expressing pumpkin ascorbate oxidase is more rapid than that of wild-type protoplasts. Planta 210: 10181022, 2000. Kertulis G. M., Ma L. Q., MacDonald G. E., Chen R., Winefordner J. D., Cai Y.: Arsenic speciation and transport in Pteris vittata L. and the effects on phosphorus in the xylem sap. Environmen. Experimental Bot. 54: 239-247, 2005. Knipfer T., Fricke W.: Water uptake by seminal and adventitious roots in relation to whole-plant water flow in barley (Hordeum vulgare L.). Journal of Experimental Botany 62: 717-733, 2011 Knipfer T., Besse M., Vrdeil J-L., Fricke W.: Aquaporin-facilitated water uptake in barley (Hordeum vulgare L.) roots. Journal of Experimental Botany 62: 4115-4126, 2011

93

Knörzer O. C., Durner J., Böger P.: Alterations in the oxidative system of suspension-cultured soybean cells (Glycine max) induced by oxidative stress. Physiol. Plantarum 97: 388396, 1996. Kovács K., Kuzmann E., Fodor F., Cseh E., Homonnay Z., Vértes A.: Mössbauer investigation of iron uptake in wheat. Hyperfine Interact 185: 63-67, 2008. Kovács K., Kuzmann E., Fodor F., Vértes A., Kamnev A. A.: Mössbauer study of iron uptake in cucumber root. Hyperfine Interact 165: 289-294, 2005. Kovács K., Kuzmann E., Vértes A., Lévai L., Cseh E., Fodor F.: Effect of cadmium on iron uptake in cucumber roots: A Mössbauer-spectroscopic study. Plant Soil 327: 49-56, 2010. Láng F., Sárvári É., Szigeti Z., Fodor F., Cseh E.: Changes of the photosynthetic properties of excised cucumber (Cucumis sativus L.) leaves during formation of new roots. Plant Physiol. Biochem. Spec. issue, p. 109, 1996. Láng F., Szigeti Z., Fodor F., Cseh E., Zolla L., Sárvári É.: Influence of Cd an Pb on the ion content, growth and photosynthesis in cucumber.. In.: Garab G.(ed.) Photosynthesis: Mechanisms and Effects. Vol. IV. Kluwer Academic Publishers, pp. 2693-2696, 1998. Li R-Y., Ago Y., Liu W-J., Mitani N., Feldmann J., McGrath S. P., Ma J. F., Zhao F-J.: The rice aquaporin Lsi1 mediates uptake of methylated arsenic species. Plant Physiol. 150: 2071-2080, 2009. Liang Y. C., Chen Q., Liu Q., Zhang W. H., Ding R. X.: Exogenous silicon (Si) increases antioxidant enzyme activity and reduces lipid peroxidation in roots of salt-stressed barley (Hordeum vulgare L.). J. Plant Physiol. 160: 1157-1164, 2003. Liang Y. C., Si J., Römheld V.: Silicon uptake and transport is an active process in Cucumis sativus. New Phytol. 167: 797-804, 2005. Liu W-J., Wood B. A., Raab A., McGrath S. P., Zhao F-J., Feldmann J.: Complexation of arsenite with phytochelatins reduces arsenite efflux and translocation from roots to shoots in Arabidopsis. Plant Physiol. 152: 2211-2221, 2010. Lombi E., Zhao F.-J., Fuhrmann M., Ma L.Q., McGrath S.P.: Arsenic distribution and speciation in the fronds of the hyperaccumulator Pteris vittata. New Phytol. 156: 195203, 2002. Lundegardh, H.: Transport of water and salts through plant tissues. Nature 157: 575-577,

94

1946. Ma J-F., Yamaji N.: Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in Plant Science 11: 392-397, 2006. Ma J-F., Gato S., Tamai K., Ichii M.: Role of root hairs and lateral roots in silicon uptake by rice. Plant Physiol. 127: 1773-1780, 2001. Ma J-F., Tamai K., Yamaji N., Mitani N., Konishi S., Katsuhara M., IshiguroM., Murata Y., Yano M.: A silicon transporter in rice. Nature 440: 688-691, 2006. Ma J-F., Yamaji N., Mitani N., Tamai K., Konishi S., Fujiwara T., Katsuhara M., Yano M.: An efflux transporter of silicon in rice. Nature 448: 209-213, 2007. Mandal B. K. and Suzuki K. T.: Arsenic round the world: a review. Talanta 58: 201-235, 2002 Maggio, A., Joly R. J.: Effects of mercuric chloride on the hydraulic conductivity of tomato root systems. Plant Physiol. 109: 331-335, 1995. Marschner H.: Mineral Nutrition of higher Plants. Academic Press, 1986. Martinez-Ballester M. C., Diaz R., Martinez V., Carvajal M.: Different blocking effets of HgCl2 and NaCl on aquaporins of pepper plants. J. Plant Physiol. 160: 1487-1492, 2003. Maurel C.: Aquaporins and water permeability of plant membranes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 48: 399-429, 1997. Maurel C., Kado R. T., Guern J., Chrispeels M. J.: Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporin α-TIP. EMBO J. 14: 3028-3035, 1995. Maurel C., Verdoucq L., Luu D. T., Santoni V.: Plant aquaporins: membrane channels with multiple integrated functions. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 595-624, 2008. Meharg A. A., Jardine L.: Arsenite transport into paddy rice (Oryza sativa) roots. New Phytol. 157: 39-44, 2003. Meharg A. A., Macnair M. R.: An altered phosphate uptake system in arsenate-tolerant Holcus lanatus L. New Phytol. 116: 29-35, 1990. Meharg A. A., Macnair M. R.: Suppression of the high affinity phosphate uptake system: A mechanism of arsenate tolerance in Holcus lanatus L. J. Exp. Bot. 4: 519-524, 1992. Meharg A. A., Naylor J., Macnair M. R.: Phosphorus-nutrition of arsenate-tolerant and nontolerant phenotypes of velvetgrass. J. Environmental Quality 23: 234-238, 1994.

95

Meirer F., Pepponi G., Streli C., Wobrauschek P., Mihucz V. G.,. Záray Gy., Czech V., Broekaert J. A. C., Fittschen U. E. A., Falkenberg G.: Application of synchrotronradiation-induced TXRF-XANES for arsenic speciation in cucumber (Cucumis sativus L.) xylem sap. X-Ray Spectrom. 36: 408-412, 2007. Mihucz V. G., Tatár E., Kmethy B., Záray Gy., Cseh E.: Investigation of the transported heavy metal ions in xylem sap of cucumber plants by size exclusion chromatography and atomic absorption spectrometry. J. Inorganic Biochem. 81: 81-87, 2000. Mihucz V. G., Tatár E., Virág I., Cseh E., Fodor F., Záray Gy.: Arsenic speciation in xylem sap of cucumber (Cucumis sativus L.). Anal Bioanal Chem 383: 461-466, 2005. Mitani N., Ma J. F.: Uptake system of silicon in different plant species. J. Exp. Bot. 56: 12551261, 2005. Mitani N., Chiba Y., Yamaji N., Ma J-F.: Identification and characterization of maize and barley Lsi2-like silicon efflux transporters reveals a distinct silicon uptake system from that in rice. Plant Cell 21: 2133-2142, 2009. Mozafar A., Oertli J. J.: Vitamin C (ascorbic acid). Uptake and metabolism by soybean. J. Plant Physiol. 141. 316-321, 1993. Mukhopadhyay R., Rosen B. P., Phung L-T., Silver S.: Microbial arsenic: from geocycles to genes and enzymes. FEMS Microbiology Reviews 26: 311-325, 2002. Oberbacher M. F., Vines H. M.: Spectrophotometric assay of ascorbic acid oxidase. Nature 197: 1203-1204, 1963. Peterson R. L.: Adaptations of root structure in relation to biotic and abiotic factors. Canadian Journal of Botany 70:661-675, 1992. Peterson C. A. and Enstone D. E. : Functions of passage cells in the endodermis and exodermis of roots. Physiol. Plantarum 97: 592-598, 1996. Pickering I. J., Prince R. C., George M. J., Smith R. D., George G. N., Salt D. E.: Reduction and coordination of arsenic indian mustard. Plant Physiol. 122: 1171-1177, 2000. Pignocchi C., Foyer C. H.: Apoplastic ascorbate metabolism and its role in the regulation of cell signalling. Current Opinion in Plant Biology 6: 379-389, 2003. Poyton Ch. Y., Huang J. W., Blaylock M. J., Kochian L. V., Elles M. P.: Mechanisms of arsenic hyperaccumulation in Pteris species: root As influx and translocation. Planta 219: 1080-1088, 2004. 96

Quaghebeur M., Rengel Z.: The distribution of arsenate and arsenite in shoots and roots of Holcus lanatus in influenced by arsenic tolerance and arsenate and phosphate supply. Plant Physiol. 132: 1600-1609, 2003. Quaghebeur M., Rengel Z., Smirk M.: Arsenic speciation in terrestial plant material using microwave-assisted extraction, ion chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Royal Soc. Chem. 18: 128-134, 2003. Raab A., Feldmann J., Meharg A. A.: The nature of arsenic-phytochelatin complexes in Holcus lanatus and Pteris cretica. Plant Physiol. 134: 1113-1122, 2004. Rosen B. P. : Biochemistry of arsenic detoxification. FEBS Letters 529: 86-92, 2002. Schoen A., Beck B., Sharma R., Dube E.: Arsenic toxicity at low doses: epidemiological and mode of action considerations. Toxicology and Applied Pharmacology 198: 253-267, 2004. Silver S., Ji H., Broer S., Day S., Dou D., Rosen B., R.: Orphan enzyme of patriarch of a now tribe: The arsenic resistance ATPase of bacterial plasmids. Mol. Microbiol. 8: 637-642, 1993. Silversmit G., Vekemans B., Nikitenko S., Bras W., Czech V., Zaray Gy., Szaloki I:, Vinczea L.: Polycapillary-optics-based micro-XANES and micro-EXAFS at a third-generation bending-magnet beamline. J. Synchrotron Rad. 16, 237-246, 2009. Singh N. and Ma, L.Q.: Arsenic speciation, and arsenic and phosphate distribution in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L. and non-hyperaccumulator Pteris ensiformis L. Environ. Pollut. 141: 238-246, 2006. Singh N., Ma L. Q., Srivastava M., Rathinasabapathi B.: Metabolic adaptation to arsenicinduced oxidative stress in Pteris vittata L and Pteris ensiformis L. Plant Sci. 170: 274282, 2006. Slatyer R. O.: Plant-Water Relationships. London, New York, Acad. Press., 1967. Srivastava S., Srivastava A. K., Suprasanna P., D’Souza S. F.: Comparative biochemical and transcriptional profiling of two contrasting varieties of Brassica juncea L. in response to arsenic exposure reveals mechanisms of stress perception and tolerance. J. Exp. Bot. 60: 3419-3431, 2009. Stoeva N., Berova M., Zlatev Z.: Physiological response of maize to arsenic contamination. Biological Plantarum 47: 449-452, 2003/4.

97

Stoeva N., Berova M., Zlatev Z.: Effect of arsenic on some physiological parameters in bean plants. Biologia Plantarum 49: 293-296, 2005. Takahama U. and Oniki T.: The association of ascorbate and ascorbate oxidase in the apoplast with IAA-enhanced elongation of epicotyls from Vigna angularis. Plant Cell Physiol 35: 257-266, 1994. Tatár E., Mihucz V. G., Varga A., Záray Gy., Fodor F.: Determination of organic acids in xylem sap of cucumber. Effect of lead contamination. Microchemical Journal 58: 306314, 1998. Tu S., MA L. Q., MacDonald G. E., Bondada B.: Effects of arsenic species and phosphorus on arsenic absorption, arsenate reduction and thiol formation in excised parts of Pteris vittata L. Environmen. Experimental Bot. 51: 121-131, 2004. Ullrich-Eberius C. Sanz I. A., Novacky A. E.: Evaluation of arsenate- and vanadateassociated changes of electrical membrane potential and phosphate transport in Lemna gibba G1. J. Exp. Bot. 40: 119-128, 1989. Varga A., Záray Gy., Fodor F.,: Determination of element distribution between the symplasm and apoplasm of cucumber plant parts by total reflection X-ray fluorescence spectrometry. Journal of Inorganic Biochemistry 89: 149-154, 2002. Vines H. M. and Oberbacher M. F.: Citrus Fruit Enzymes. I. Ascorbic Acid Oxidase in Oranges. Plant Phyisiol. 38: 333-337, 1963. Wang, J., Zhao F-J., Meharg A. A., Raab A., Feldmann J., McGrath S. P.: Mechanisms of arsenic hyperaccumulation in Pteris vittata. Uptake kinetics, interactions phosphate, and arsenic speciation. Plant Physiol. 130: 1552-1561, 2002. Wojas S., Clemens S., Hennig J., Sklodowska A., Kopera E., Schat H.: Over expression of phytochelatin synthase in tobacco: distinctive effects of AtPCS1 and CePCS genes on plant response to cadmium. J. Exp. Bot 59: 2205-2219, 2008. Wojas S., Clemens S., Sklodowska A., Antosiewicz D. M.: Arsenic response of AtPCS1- and CePCS-expressing plants – effects of external As(V) concentration on As-accumulation pattern and NPT metabolism. J.Plant Physiol. 167: 169-175, 2010. Wright W. J., Fitter A. H., Meharg A.A.: Reproductive biomass in clones of Holcus lanatus L. that differ in their phosphate uptake kinetics and mycorrhizal colonisation. New Phytol. 146: 493-501, 2000.

98

Xu X. Y., McGrath S. P., Zhao F. J.: Rapid reduction of arsenate in the medium mediated by plant roots. New Phytol 176:590-599, 2007. Yabuta Y., Mieda T., Rapolu M., Nakamura A., Motoki T., Maruta T., Yoshimura K., Ishikawa T., Shigeoka S.: Light regulation of ascorbate biosynthesis is dependent on the photosynthetic electron transport chain but independent of sugars in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 58: 2661-2671, 2007. Yamaji N., Mitani N., Ma J-F.: A transporter regulating silicon distribution in rice shoots. Plant Cell 20: 1381-1389, 2008. Záray Gy., Phuong D. T., Varga I., Varga A., Kántor T., Cseh E., Fodor F.: Influences of lead contamination and complexing agents on the metal uptake of cucumber. Microchemical Journal 51: 207-213, l995. Záray Gy., Varga A., Fodor F., Cseh E.: Microanalytical investigation of xylem sap of cucumber by total reflection X-ray fluorescence spectrometry. Microchemical Journal 55: 64-71, 1997. Zhao F. J., Ma J. F., Meharg A. A:, McGrath S. P.: Arsenic uptake and metabolism in plants New Phytol. 181: 777-794, 2009. Zhao F-J., McGrath S. P., Meharg A. A.: Arsenic as a food chain contaminant: mechanisms of plant uptake and metabolism and mitigation strategies. Annu. Rev. Plant. Biol. 61: 535559, 2010. Zhu Z., Wei G., Li J., Qian O., Yu J.: Silicon alleviates salt stress and increases antioxidant enzymes activity in leaves of salt-stressed cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Sci. 167: 527-533, 2004.

99

Köszönetnyilvánítás Köszönöm

a

lehetőséget

Dr.

Fodor

Ferencnek

és

Dr.

Szigeti

Zoltán

tanszékvezetőknek, hogy a Doktori munkámat a Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszéken készíthettem el. Köszönettel tartozom Dr. Cseh Editnek, hogy együtt dolgozhattam vele, tanácsokkal láttott el, óriási tudásával és tapasztalatával bevezettett a növényélettani kísérletek csodás világába. Külön köszönöm türelmét. Köszönöm Dr. Bóka Károlynak, hogy a mikroszkópos munkákban segítségemre volt és ötleteivel segítette munkámat. Köszönöm Dr. Szalóki Imrének a BME Nukleáris Technikai Intézet, Atomenergetika Tanszék munkatársának hogy bepillantást adott a röntgenfluoreszcens kutatásokba (HASYLAB), így egy fizikus szemével is „átláthattam” a növényeken. Köszönöm Solti Ádámnak munkáját, kreativitását. Köszönöm Dr. Záray Gyulának a Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék tanszékvezetőjének

és

munkatársainak

Mihucz

Viktornak,

Kröpfl

Krisztinának és Varga Anitának az elemanalitikai mérések során nyújtott közreműködésért. Köszönöm Bendegúznak és Matyinak a türelmüket, hogy kiváncsiak voltak a munkámra, kérdeztek, drukkoltak és szerettek még akkor is, amikor nem tudtam velük lenni.

100