Elucigene CF-EU2v1 Návod k použití

Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití

Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití Kat. kód:

CF2EUB2 – 50 testů CF2EUBX – 10 testů

Pro diagnostické použití in vitro

Vyrobeno společností Elucigene Diagnostics.

Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Prodej, zákaznický servis a technická podpora:

T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: [email protected] E: [email protected]

Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 1 z/ze 24


Elucigene CF-EU2v1 Určené použití Pro simultánní in vitro kvalitativní detekci následujících mutací lidského genu pro cystickou fibrózu transmembránového regulátoru vodivosti (CFTR) v DNA extrahované z plné krve (s přídavkem EDTA) a ze vzorků suchých krevních skvrn:

Tradiční

Podle směrnic HGVS Tradiční * cDNA name

Protein name

CFTRdele2,3

name c.54-5940_273+1025delProtein (c.54-5940_273+10250del21080)

E60X

c.178G>T

p.Glu60X

P67L

c.200C>T

p.Pro67Leu

G85E

c.254G>A

p.Gly85Glu

394delTT

c.262_263del (c.262_263delTT)

p.Leu88IlefsX22

444delA

c.313del (c.313delA)

p.Ile105SerfsX2

R117C

c.349C>T

p.Arg117Cys

R117H

c.350G>A

p.Arg117His

Y122X

c.366T>A

p.Tyr122X

621+1G>T

c.489+1G>T

711+1G>T

c.579+1G>T

L206W

c.617T>G

p.Leu206Trp

1078delT

c.948del(c.948delT)

p.Phe316LeufsX12

R334W

c.1000C>T

p.Arg334Trp

R347P

c.1040G>C

p.Arg347Pro

R347H

c.1040G>A

p.Arg347His

A455E

c.1364C>A

p.Ala455Glu

I507del

c.1519_1521del (c.1519_1521delATC)

p.Ile507del

F508del

c.1521_1523del (c.1521_1523delCTT)

p.Phe508del

1677delTA

c.1545_1546del (c.1545_1546delTA)

p.Tyr515X

V520F

c.1558G>T

p.Val 520Phe

1717-1G>A

c.1585-1G>A

G542X

c.1624G>T

p.Gly542X

S549R(T>G)

c.1647T>G

p.Ser549Arg

S549N

c.1646G>A

p.Ser549Asn

G551D

c.1652G>A

p.Gly551Asp

R553X

c.1657C>T

p.Arg553X

R560T

c.1679G>C

p.Arg560Thr

1811+1.6kbA>G

c.1680-886A>G

1898+1G>A

c.1766+1G>A

2143delT

c.2012del (c.2012delT)

p.Leu671X

2184delA

c.2052del (c.2052delA)

p.Lys684AsnfsX38

2347delG

c.2215del (c.2215delG)

p.Val739TyrfsX16

W846X

c.2538G>A

p.Trp846X

2789+5G>A

c.2657+5G>A

Q890X

c.2668C>T

3120+1G>A

c.2988+1G>A

CF2EUBYCS 002

p.Gln890X

Sep-2014

Strana 2 z/ze 24


Tradiční

Podle směrnic HGVS Tradiční * cDNA name

Protein name

Protein name

3272-26A>G

c. 3140-26A>G

R1066C

c.3196C>T

p.Arg1066Cys

Y1092X(C>A)

c.3276C>A

p.Tyr1092X

M1101K

c.3302T>A

p.Met1101Lys

D1152H

c.3454G>C

p.Asp1152His

R1158X

c.3472C>T

p.Arg1158X

R1162X

c.3484C>T

p.Arg1162X

3659delC

c.3528del (c.3528delC)

p.Lys1177SerfsX15

3849+10kbC>T

c.3718-2477C>T

S1251N

c.3752G>A

p.Ser1251Asn

3905insT

c.3773dup (c.3773dupT)

p.Leu1258PhefsX7

W1282X

c.3846G>A

p.Trp1282X

N1303K

c.3909C>G p.Asn1303Lys * with reference to – Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011)

CF-EU2v1 může rozlišit heterozygotní a homozygotní jedince u všech výše uvedených mutací a variant s výjimkou S549R(T>G) – viz část tohoto dokumentu popisující křížovou reaktivitu.

Souhrn a vysvětlení Cystická fibróza (CF) je nejběžnějším délku života omezujícím autozomálně recesivním onemocněním v bělošské populaci. Výskyt onemocnění je 1:3200 živě narozených dětí v bělošské populaci (1). V bělošské populaci je četnost heterozygotů cca 1:25. Cystická fibróza ovlivňuje epitel mnoha orgánů, což vede ke komplexnímu multisystémovému onemocnění, které napadá exokrinní část slinivky břišní, střeva, dýchací ústrojí, mužské pohlavní ústrojí, hepatobiliární systém a exokrinní potní žlázy. Projevy onemocnění se liší podle závažnosti mutací CFTR (2), genetických modifikátorů (3) a faktorů životního prostředí (4). Rozsah sahá od úmrtí v raném dětství v důsledku progresivního obstrukčního onemocnění plic s bronchiektázií, přes nedostatečnost pankreatu s postupně progresivním obstrukčním onemocněním plic v průběhu dospívání a zvýšenou četnost hospitalizací z důvodu pulmonálních onemocnění v rané dospělosti, po rekurentní sinusitidu a bronchitidu nebo mužskou neplodnost v rané dospělosti. Nejběžněji se diagnóza cystické fibrózy stanovuje u jedinců s jedním nebo více charakteristickými fenotypy CF s výskytem abnormality funkce CFTR na základě jedné z následujících možností: přítomnost dvou nemoc způsobujících mutací genu CFTR nebo dvě abnormální hodnoty kvantitativního stanovení chloridů po stimulaci pocení pilokarpinovou iontoforézou (>60 mEq/l) nebo rozdíl transepiteliálních potenciálů nosní sliznice (NPD), charakteristický pro CF. Četnost detekce mutací CFTR se liší podle metody testování a etnického původu. U některých symptomatických jedinců je detekovatelná pouze jedna nebo žádná nemoc způsobující mutace; u některých přenašečů není nemoc způsobující mutace detekovatelná.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 3 z/ze 24


Poruchy související s CFTR jsou dědičné autosomálním recesivním způsobem. Sourozenci probanda s cystickou fibrózou mají 25% pravděpodobnost postižení, 50% pravděpodobnost toho, že budou asymptomatickými přenašeči, a 25% pravděpodobnost, že nebudou postižení a nebudou přenašeči. Molekulárně genetické testování nemoc způsobující mutace (nebo mutací) CFTR genu se používá k detekci přenašečů ve screeningových programech populace. Jsou k dispozici prenatální testy pro těhotné pro případy zvýšeného rizika poruch souvisejících s CFTR, je-li známo, že jsou v rodině nemoc způsobující mutace. Od objevení genu CFTR v roce 1989 (5) bylo popsáno více než 1700 mutací a variant genu (6). Mnohé z těchto mutací jsou „privátní“, tj. byly popsány pouze u jednoho pacienta nebo u jedné rodiny. Rutinní testování všech potenciálních mutací není realizovatelné ani finančně únosné, a proto se omezujeme na testování nejběžnějších mutací. CF-EU2v1 je souprava pro testování cystické fibrózy, určená specificky k identifikaci mutací, které se nejběžněji vyskytují u populace evropského původu. Test identifikuje celkem 50 mutací a analyzuje také varianty polytymidinového traktu intronu 9 s přesným měřením přilehlého TG repeatu. Polymorfní tymidinový trakt na junkci intronu 9 a exonu 10 ovlivňuje transkripci. Počet tymidinových reziduí (5T, 7T nebo 9T) ovlivňuje účinnost splicingu („sestřihu“) exonu 10; je-li přítomna 5T alela, bude chybět část transkriptu exonu 10 a způsobí tak nefunkční protein a různé příznaky CF. Je hlášeno, že počet TG repeatů na 5’ konci polytimidinového traktu může také ovlivnit splicing exonu 10 (7). Při přítomnosti na stejné alele jako variant 5T existuje přímá úměra mezi délkou počtu TG repeatů a výškou podílu transkritpů CFTR bez exonu 10. Počet TG repeatů lze určit pomocí CF-EU2v1 změřením velikosti píků amplikonu 5T.

Principy metody Princip funkce soupravy Elucigene CF-EU2v1 je založen na použití fluorescenční alelově specifické amplifikační technologie ARMS (Amplification Refractory Mutation System, amplifikační refrakční mutační systém), která detekuje genové mutace, inserce nebo delece v deoxyribonukleové kyselině DNA (8). Princip ARMS je, že oligonukleotidy s chybně spárovaným reziduem na 3’ konci nebudou za specifikovaných podmínek fungovat jako primery v polymerázové řetězové reakci (Polymerase Chain Reaction, PCR). Výběr vhodných oligonukleotidů umožňuje amplifikaci a detekci specifických zmutovaných nebo normálních sekvencí DNA. Amplifikované sekvence (amplikony) jsou separovány pomocí kapilární elektroforézy v genetickém analyzátoru společnosti Applied Biosystems. Analytický software umožňuje identifikovat a označit amplikony podle velikosti a barvy. Test Elucigene CF-EU2v1 je vysoce multiplexní analýza sestávající ze dvou PCR reakcí (A a B). Ve směsi A je detekováno padesát mutantních sekvencí genu CFTR a zobrazováno jako modré amplikonové píky. Ve směsi B jsou detekovány odpovídající normální nemutantní sekvence (divokého typu) a zobrazovány jako zelené amplikonové píky. Směs A také detekuje normální sekvenci pro nejčastěji pozorovanou mutaci způsobující cystickou fibrózu u bělošské populace (nazývá se F508del), která se zobrazuje jako zelený amplikonový pík. Kromě toho jsou ve směsi A detekovány opakované sekvence polyT a zobrazovány jako černé amplikonové píky. Ve směsi A i B jsou zahrnuty vnitřní kontrolní markery amplifikace (nikoliv cystické fibrózy) za účelem monitorování účinnosti amplifikace vzorku, které se zobrazují jako červené amplikonové píky.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 4 z/ze 24


Varování a bezpečnostní opatření 1. Kontrolní vzorek DNA dodaný s touto soupravou je humánního původu a byl nezávisle testován pomocí rozboru na bázi PCR a shledán negativním na virus hepatitidy typu B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) na virus lidské imunodeficience 1 (HIV1). 2. Při manipulaci s materiály humánního původu je nutno postupovat opatrně. Všechny vzorky se musí považovat za potenciálně infekční. Žádná testovací metoda nemůže zaručit úplnou jistotu, že produkt neobsahuje HBV, HCV nebo HIV 1 nebo jiná infekční agens. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály. 3. Podle současné správné laboratorní praxe musí laboratoře při každém testu zpracovat své vlastní vzorky pro kontrolu kvality se známým genotypem, aby bylo možné vyhodnotit validitu postupu. 4. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály. 5. Pokud je krabice soupravy poškozená, mohlo dojít k poškození obsahu. Soupravu nepoužívejte a kontaktujte zákaznický servis.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 5 z/ze 24


Symboly použité na štítcích Symboly použité na všech štítcích a na obalech odpovídají harmonizované normě ISO15223

Výrobce

Počet testů

Čtěte návod k použití

X° C Skladujte při teplotě nižší, než je zde uvedeno

Datum exspirace

Katalogové číslo

Číslo šarže nebo dávky

Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 6 z/ze 24


Dodávané materiály Reagencie se musí skladovat v oblasti, kde nehrozí riziko kontaminace produktů DNA nebo PCR. Všechny reagencie jsou dodávány připravené k použití Neotevřené a otevřené reagencie skladujte při teplotě -20 °C. Otevřené reagencie lze skladovat až 3 měsíce. Součástí dodávky jsou materiály dostačující na 50 (10) testů: 2 x 120µl (50µl) lahvičky se směsí primerů CF-EU2v1 A, obsahující primery pro amplifikaci následujících mutantních alel: R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del, 3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G, 1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, 1898+1G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X a R1158X. Tato směs obsahuje také primery divokého typu pro detekci normální alely F508del, primery pro detekci polythymidinových variant, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T a primery pro identifikaci 2 hypervariabilních markerů typu STR (short tandem repeat) – 404473 (450043). 2 x 120µl (50µl) lahvičky směsi primerů CF-EU2v1 B obsahující primery divokého typu pro amplifikaci normálních alel mutantů amplifikovaných směsí primerů A, s výjimkou normální alely F508del, která je amplifikována primery zahrnutými ve směsi primerů A. Tato směs také obsahuje primery pro identifikaci 2 hypervariabilních markerů STR – 404474 (450044). 2 x 400µl (75l) lahvičky hlavní směsi pro PCR s obsahem HotStart Taq DNA polymerázy a deoxynukleotid trifosfátů v pufru – 404480 (450045). 1 x 50µl lahvička s kontrolním vzorkem DNA o 6 ng/µl, normální pro mutace detekované soupravou Elucigene CF-EU2v1 – 404489

Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky Laboratorní spotřební materiál – rukavice, mikrocentrifugové zkumavky se šroubovacím uzávěrem, 0,2ml PCR lahvičky nebo mikrotitrační destičky doporučené výrobcem použitého termálního cyklovače, pipetové špičky. Příprava DNA – souprava QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, kat. č. 51304/51306) nebo ekvivalent. Kapilární elektroforéza – standard velikosti GeneScan 600 LIZ (kat. číslo ABI 4366589), standard velikosti GeneScan 600v2 LIZ (kat. číslo ABI 4408399), multikapilární DS-33 (sada barviv G5) standardní matrice (kat. číslo ABI 4345833), polymer POP-7 (kat. číslo ABI 4352759), 10x pufr pro genetický analyzátor (kat. číslo ABI 402824) a činidlo Hi-Di Formamid (kat. číslo ABI 4311320). Poznámka: Zajistěte, aby všechny použité materiály byly v rámci doby stability uváděné výrobcem.

Požadované vybavení Vybavení laboratoře – přesné pipety (2 sady: 1 pro manipulaci před amplifikací a 1 pro manipulaci po amplifikaci); ochranný oděv; třepačka vortex; mikro centrifuga; 96jamková mikrotitrační destička do centrifugy. Amplifikace PCR – termální cyklovač kompatibilní s 96jamkovými mikrotitračními destičkami nebo 0,2ml lahvičkami s minimální tepelnou přesností +/-1 °C mezi 33 °C a 100 °C a rovnoměrností statické teploty +/-1 °C.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 7 z/ze 24


Poznámka: Termální cyklovač a jeho vybavení se musí pravidelně udržovat a kalibrovat v souladu s pokyny výrobce, aby bylo zajištěno správné provádění PCR a optimální výkon. Test Elucigene CF-EU2v1 byl vyvinut na termálních cyklovačích Applied Biosystems 9700. Přístroje jiných výrobců (a jiné modely) musí uživatel před oznamováním výsledků testu CF-EU2v1 plně otestovat a posoudit, zda poskytují optimální výkon. Kapilární elektroforéza – genetický analyzátor ABI 3130/3500 (se softwarem GeneMapper pro fragmentační analýzu), 36cm nebo 50cm (ABI3500) kapilární sestava, 96jamkové optické destičky, 96jamková septa, 96jamkové kazety. Poznámka:Zařízení pro kapilární elektroforézu se musí pravidelně udržovat a kalibrovat v souladu s pokyny výrobce, aby byl zajištěn optimální výkon.

Odběr a uchovávání vzorku Podle provedeného hodnocení jsou vzorky plné krve (s EDTA) a suchých krevních skvrn s tímto testem kompatibilní. Bylo hlášeno, že zařízení na odběr vzorků v určitých případech poškozují integritu určitých analytů a mohou rušit některé technologie metody (9). Všem uživatelům doporučujeme, aby zkontrolovali, zda se zvolené zařízení používá podle pokynů výrobce a zda jsou zařízení na odběr vzorků kompatibilní s tímto testem. Před preparací DNA se vzorky krve musí uchovávat při teplotě -20 °C. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování. Příprava DNA ze vzorků plné krve (EDTA) Konzistentní výsledky lze získat z DNA extrahované pomocí soupravy QIAamp 96 DNA Blood Kit (nebo QIAamp DNA Mini Kit používající K proteinázu) podle protokolu popsaného v příručce soupravy QIAamp; začněte s 200µl tekuté plné krve a proveďte ředění v 200µl vody v kvalitě pro použití v molekulární biologii. Příprava DNA ze suchých krevních skvrn Konzistentní výsledky lze získat z DNA extrahované pomocí soupravy QIAamp DNA Mini Kit podle protokolu popsaného v příručce soupravy QIAamp; začíná se však s disky 2 x 3 mm se suchou krevní skvrnou, která se vyplavuje ve 100µl vody v kvalitě pro použití v molekulární biologii. Pokud s testem Elucigene CF-EU2v1 použijete jiné metody extrakce DNA a použijete jiné typy vzorků, doporučujeme je pečlivě vyhodnotit předtím, než se výsledky testů použijí k diagnostickým účelům. Důležité faktory – množství DNA Za optimálních podmínek PCR a s použitím doporučeného nastavení nástřiku vzorků (viz poznámka v části popisující kapilární elektroforézu) uvedeného v kapilárním sloupci modulů cyklů byly pravidelně získány přijatelné výsledky z DNA extrahované výše uvedenými metodami za koncentrací mezi 1,5 ng/µl a 25 ng/µl. Kvantifikace DNA je velmi důležitá a je nutno měřit koncentraci každého vzorku DNA k testování, aby byly zajištěny optimální výsledky. Jsou přijatelné metody jako PicoGreen fluorescence nebo UV absorpce. Vzhledem k rozdílům v metodách kvantifikace DNA musí uživatel zvážit následující: Velmi vysoké vstupní množství DNA zvýší pravděpodobnost, že analytický software označí píky pozadí. Ke snížení pravděpodobnosti označení píků pozadí lze podniknout následující opatření:  Zřeďte vzorek DNA a proveďte znovu amplifikaci.  Zkraťte dobu nástřiku – viz část popisující kapilární elektroforézu.  Zvyšte práh minimální amplitudy píku, viz příručka k analytickému softwaru Elucigene CF-EU2v1.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 8 z/ze 24


Nízké vstupní množství DNA zvýší pravděpodobnost, že diagnostické píky budou slabé a analytický software je neoznačí. K posílení signálu lze podniknout následující opatření.  Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund (důrazně se doporučuje pro extrakci z krevních skvrn), viz část popisující kapilární elektroforézu.  Opakujte extrakci vzorku krevní skvrny a proveďte vyplavení v menším objemu vody (50µl).  Zvyšte počet krevních skvrn k extrakci na 4 x 3mm disky. Důležité faktory – kvalita DNA Test CF-EU2v1 je vysoce multiplexní analýza a vyžaduje účinnou PCR amplifikaci, aby optimálně fungoval. Kvalita DNA může předurčit účinnost PCR procesu. Inhibitory extrahované spolu se vzorkem DNA mohou způsobit suboptimální amplifikaci a produkovat slabé a nevyvážené píky. Společnost Elucigene Diagnostics validovala pro použití se soupravou CF-EU2v1 krevní soupravu QIAamp 96 DNA Blood Kit a minisoupravu QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH). Jiné soupravy a metody pro extrakci DNA se musí pro použití s testem CF-EU2v1 validovat a optimizovat. Poznámka: Další informace vyhledejte v části popisující řešení problémů s Elucigene CFEU2v1.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 9 z/ze 24


Protokol testu Zamezení kontaminace PCR PCR proces generuje velký počet amplifikovaných produktů (amplikonů) a má vysoké riziko kontaminace, která může vést k falešným výsledkům. Kontaminace může pocházet ze dvou zdrojů: Křížová kontaminace – kontaminace vzorku neamplifikovaným materiálem z okolí nebo z jiných vzorků, které obsahují cílovou sekvenci. Kontaminace výsledného produktu – kontaminace vzorku amplikony z předchozích PCR cyklů vedoucí k amplifikaci jak cílového, tak kontaminujícího amplikonu. Laboratoře, které provádějí PCR, musí tyto zdroje kontaminace znát a mít zavedené postupy, které významně sníží riziko kontaminace. Metody omezení kontaminace jsou dobře dokumentovány (10) a zahrnují jak fyzické uspořádání laboratoře, postup práce a manipulaci se vzorkem, tak chemické a enzymatické metody. Dobře definované a správné laboratorní postupy jsou k omezení kontaminace PCR nezbytné a musí být zavedeny před testováním klinických vzorků.

Postup amplifikace Poznámka: K omezení rizika kontaminace se musí kroky 3-5 provádět v oblasti, kde se nenachází žádné produkty PCR, pokud možno v digestoři s laminárním prouděním. 1. Naprogramujte termální cyklovač na cyklus o jednom kroku pro aktivaci HotStart Taq při 94 °C po dobu 20 minut s navazujícím programem amplifikačního cyklování se schématem 1 minuta při 94 °C (denaturace), 2 minuty při 58 °C (anelace) a 1 minuta při 72 °C (extenze) pro 30 cyklů. Na toto schéma se naváže 20minutový soubor s prodlevou při 72 °C (extenze) ve finálním cyklu. 2. Součástí každého analytického cyklu PCR musí být negativní kontrola. 3. Nechte roztát směsi primerů a hlavní směs pro PCR a krátce je centrifugujte, aby se shromáždil obsah uložený na dně lahviček. Lahvičky jemně promíchejte na třepačce vortex a znovu je krátce centrifugujte. Připravte reakční směs v dostatečném množství pro počet vzorků a kontrol, které se budou testovat (tabulka 1). Poznámka: Hlavní směs pro PCR je viskózní a je nutno zajistit, aby byly používány správné objemy. Doporučuje se přidávat hlavní směs pro PCR do již nadávkovaných směsí primerů, aby se zajistilo napipetování veškeré kapaliny z pipety do směsi primeru. Poznámka: Nepoužívejte odlišné směsi nebo komponenty z různých šarží testu CF-EU2v1. Cyklování

Aktivace enzymů 94 °C

Konečná extenze

94 °C

20 min 1 min

72 °C

72 °C

1 min

20 min.

58 °C Pokojová teplota

2 min 30 cyklů

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 10 z/ze 24


Tabulka 1: Výroba reakční směsi

Směs primeru (μl) Hlavní směs pro PCR (μl) Celkem (μl)

Počet vzorků, které se mají testovat 1 10 25 50 4,5 45 112,5 225 7,5 12

75 120

187,5 300

375 600

4. Napipetujte 10μl každé reakční směsi na dno patřičně označených PCR lahviček o objemu 0,2 ml (nebo destiček). 5. Pomocí samostatných pipetovacích špiček přidejte do každé lahvičky 2,5μl testovaného vzorku DNA a uzavřete ji víčkem. Nepřidávejte vzorek DNA do lahvičky s negativní kontrolou; nahraďte jej 2,5 µl sterilní deionizované vody. 6. Krátce centrifugujte lahvičky s PCR, aby se shromáždil obsah uložený na dně lahviček. 7. Lahvičky napevno uložte do bloku teplotního cyklovače. Spusťte cyklus o jednom kroku při teplotě 94 °C následovaný programem amplifikačního cyklování. 8. Po dokončení programu amplifikačního cyklování lze před provedením analýzy kapilární elektroforézou vzorky uskladnit v temnu při pokojové teplotě přes noc nebo při teplotě 2-8 °C pro dobu až 7 dnů.

Kapilární elektroforéza Všem uživatelům doporučujeme ověřit, že se zvolené vybavení pro kapilární elektroforézu používá podle pokynů výrobce a že je kompatibilní s testem. Za klíčové prvky se v této souvislosti považuje polymer a kapilární sestava. Optimálních výsledků lze dosáhnout v následujících podmínkách kapilární elektroforézy: 1.

Smíchejte 6,8μl standardu velikosti GS600v2 LIZ a 250μl činidla Hi-Di Formamid a pečlivě promíchejte (dostatek směsi pro 16 jamek). Nakápněte 15μl směsi do každé jamky 96jamkové PCR destičky.

2.

Odměřte 3µl PCR produktu z amplifikací směsi A a směsi B a přidejte jednotlivě do jamek destičky, které již obsahují směs standard velikosti/formamid (z kroku 1).

3.

Produkt PCR nadávkovaný v PCR destičce denaturujte v termálním cyklovači s následujícím nastavením parametrů: 94 °C po dobu 3 minut a poté 4 °C po dobu 30 sekund.

4.

Destičku krátce centrifugujte, aby se shromáždil obsah na dně lahviček a aby se odstranily všechny vzduchové bublinky z jamek, a poté destičku založte do genetického analyzátoru.

Poznámka: Nastavení nástřiku vzorku lze upravit tak, aby vyhovovalo množství amplikonu vyrobeného během PCR, které se může lišit podle množství přidávané vstupní genomické DNA. Menší množství amplikonu lze do analytické kolony aplikovat zkrácením doby nástřiku nebo snížením napětí nástřiku. Naopak prodloužením doby nástřiku nebo zvýšením napětí nástřiku lze do analytické kolony aplikovat více amplikonu. Vzorky již amplifikované lze nastříknout vícekrát pro opakovanou analýzu – viz část popisující řešení problémů s Elucigene CF-EU2v1.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 11 z/ze 24


Přístroje ABI 3130: Je potřeba vytvořit modul a protokol analytického cyklu CF-EU2, který lze následně použít v každém analytickém cyklu CF-EU2. Vytvořte modul analytického cyklu CF-EU2 v programu pro Module Manager (Správu modulů) softwaru pro sběr dat 3130. Zkontrolujte, zda je vybráno následující nastavení: •

Type (Typ): Regular (Pravidelně)

•

Template (Šablona): FragmentAnalysis36_POP7

•

Zadejte nastavení, které je podrobně popsáno v níže uvedené tabulce: 36cm kapilární modul #

Název parametru

1 2 3 4 5 6 7 8

Oven Temperature (Teplota pece) Poly_Fill_Vol. (Plnicí objem polym.) Current Stability (Stabilita proudu) PreRun_Voltage (Napětí předcyklu) Pre_Run_Time (Doba předcyklu) Injection_Voltage (Napětí nástřiku) Injection_Time (Doba nástřiku) Voltage_Number_Of_Steps (Napětí, počet kroků) Voltage_Step_Interval (Interval kroku napětí) Data_Delay_Time (Doba zpoždění dat) Run_Voltage (Napětí analyt. cyklu) Run_Time (Doba analyt. cyklu)

9 10 11 12

Hodnota

Rozsah

60 6500 5,0 15,0 180 3,0 12,0** 20

vn.18…65 °C 6500…38000 kroků vn.0...2000 uA 0…15 kV 1…1000 s 1…15 kV 1…600 s 1…100 nk

15

1…60 s

60

1…3600 s

15,0 1200

0…15 kV 300…14000 s

** Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund pro analýzu DNA extrahované z krevních skvrn Poznámka: Požadovaná doba analytického cyklu se bude lišit v závislosti na teplotě prostředí místa, kde je genetický analyzátor instalován. Další informace o vytváření modulů cyklů vyhledejte v návodu k použití genetického analyzátoru Applied Biosystems 3130. Vytvořte protokol CF-EU2 ve Protocol Manager (Správci protokolu) a ověřte, že je vybráno následující nastavení: •

Type (Typ): Regular (Pravidelně)

•

Run Module (Modul anal. cyklu): CF-EU2 (viz modul anal. cyklu výše)

•

Dye Set (Souprava barviva): G5

Chcete-li analyzovat vzorky, musíte vytvořit seznam vzorků pomocí Plate Manager (Správce destičky). Ověřte, že byl vybrán správný protokol přístroje pro CF-EU2v1 (viz výše). Poznámka: Další informace o sestavení přístroje, provozu a řešení problémů vyhledejte v návodu k použití genetického analyzátoru Applied Biosystems 3130.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 12 z/ze 24


Přístroje ABI 3500: Je potřeba vytvořit Instrument Protocol (Protokol přístroje) CF-EU2, který lze následně použít v každém analytickém cyklu CF-EU2v1. Instrument Protocol (Protokol přístroje) CF-EU2 se vytváří pomocí knihovny protokolů přístroje 3500. Zkontrolujte, zda je vybráno následující nastavení: •

Run Module (Modul analyt. cyklu): FragmentAnalysis50_POP7

•

Zadejte nastavení, které je podrobně popsáno v níže uvedeném obrázku:

**

** Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund pro analýzu DNA extrahované z krevních skvrn Chcete-li analyzovat vzorky, vytvořte destičku vzorku tak, že kliknete na příkaz Create Plate from Template (Vytvořit destičku ze šablony) na Dashboard (Přístrojové desce); zkontrolujte, zda je přiřazen správný protokol přístroje pro CF-EU2v1 (viz výše).

Nastavení seznamu vzorků pro aplikaci GeneMarker: Software GeneMarker umožňuje provést přímé srovnání dat A a B stejného jedince. Pro usnadnění tohoto kroku je důležité, aby byly konzistentní názvy souboru fsa (výstup nezpracovaných dat) ve všech vzorcích a směsích. Seznam vzorků má obsahovat jedinečný název vzorku pro každý vzorek, který se má testovat, a příponu _A nebo _B podle toho, která směs se bude testovat. Pokud má název souboru fsa obsahovat také ID destičky, musí se používat vždy stejný formát (např. CFEU2 DDMMRRRR). Parametr Results Destination (cíl výsledků) na přístroji 3130 se musí nastavit tak, aby byl název vzorku obsažen v názvu souboru fsa (např. CFEU2 DDMMYYYY_1234,5_A_A01).

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 13 z/ze 24


Konvence pojmenovávání souborů na přístroji 3500 se musí nastavit tak, aby byl název vzorku obsažen v názvu souboru fsa (např. CFEU2 DDMMRRRR_1234,5_A_A01).

Interpretace výsledků Během shromažďování dat bude možné sledovat fragmenty PCR na elektroforeogramu nezpracovaných dat jako modré píky (mutantní píky) nebo zelené píky (píky divokého typu). Každý jedinec má dvě kopie genu CFTR. Pokud mají tyto kopie stejné pořadí pro každé dané místo, je jedinec v tomto místě popisován jako homozygotní. Pokud mají tyto kopie v daném místě jiné pořadí, je jedinec v tomto místě popisován jako heterozygotní. Po dokončení sběru dat je nutno pomocí softwaru pro fragmentační analýzu porovnat velikost fragmentů PCR CF-EU2v1 proti standardu velikosti GS600v2 LIZ.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 14 z/ze 24


Další podrobné pokyny pro nastavení softwaru a pro analýzu a interpretaci výsledků obsahuje příručka k analytickému softwaru Elucigene CF-EU2v1. Příručka k analytickému softwaru GeneMapper a GeneMarker je k dispozici na internetových stránkách společnosti Elucigene Diagnostics: www.elucigene.com/products Výsledky směsi A (mutantní) určují, zda je jedinec nositelem mutace, což je znázorněno přítomností modrého píku. Mutantní směs obsahuje také primery pro normální alelu F508, a proto lze pomocí této směsi stanovit, zda je jedinec normální pro F508 (pouze zelený pík), homozygotní pro mutantní F508del (pouze modrý pík) nebo heterozygotní pro F508del (modrý a zelený pík). Pokud je pozorována jakákoliv jiná mutace, lze analyzovat výsledky směsi B (divokého typu) za účelem zjištění homozygotního nebo heterozygotního stavu. Přítomnost zeleného píku pro určitou alelu ve směsi divokého typu indikuje, že je jedinec heterozygotní pro určitou mutaci, a nepřítomnost zeleného píku indikuje, že je jedinec homozygotní pro určitou mutaci. V obou směsích jsou obsaženy hypervariabilní markery STR (červené). Ty umožňují porovnat vzorek amplifikovaný pomocí směsi mutantu a vzorek amplifikovaný pomocí směsi divokého typu, aby se snížilo riziko záměny vzorků. Odlišný profil STR u obou směsí poukazuje na to, že došlo k záměně vzorků. Nepřítomnost těchto markerů STR indikuje selhání vzorku. Přítomnost markerů STR ve velmi nízkých relativních fluorescenčních jednotkách indikuje slabou koncentraci vzorku, kterou je třeba analyzovat s opatrností. Poznámka: Další informace viz část popisující řešení problémů.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 15 z/ze 24


Detekované markery V níže uvedené tabulce jsou souhrnně uvedeny markery detekované směsí CF-EU2v1. Markery jsou seřazeny podle rozsahu velikosti sledovaného produktu PCR. Detekované markery Marker (Pík č.) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

CF2EUBYCS 002

Marker R347H R347P 2789+5G>A 3120+1G>A 711+1G>T R334W I507del F508del 3849+10KbC>T 1677delTA 1078delT V520F L206W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549R(T>G)* S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X(C>A) S1251N 444delA 1811+1.6kbA>G 1717-1G>A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898+1G>A W846X 2184delA D1152H CFTRdel2,3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272-26A>G 621+1G>T

Sep-2014

Produkt bp Rozsah velikosti (3130, údaje POP7) 110.5-116.5 117-123 124-130 132.5-138.5 141.5-147.5 147.5-154 156-162.5 163-169 172-178 180-188.5 193-199 206-211.5 215-220 224.5-230.5 234.5-240.5 242-246 250-252 255.5-261.5 265-267 267.5-269.5 275-280 282-288 289-295.5 297-303.5 308-314 315-321 323-326 332-338 341.5-347.5 349-355 357-360 360-366.5 367-373 377-383 384-390 391-397 398.5-404.5 406-411 413-418 423-429 433-439 439.5-445.5 446-450.5 453.5-460.5 461-465.5 470-476 485.5-491.5

Strana 16 z/ze 24


Číslo markeru 48 49 50 5T** 7T 9T

Produkt bp Rozsah velikosti (3130, údaje POP7) 496-503 506-512 516.5-524.5 110-130 140-160 175-195

Marker A455E R1162X R1158X IVS8-5T IVS8-7T IVS8-9T

*S549R(T>G) Pík 20 se nachází pouze ve směsi A. ** Velikosti alely 5T

Marker 5T (9) 5T (10) 5T (11) 5T (12) 5T (13)

Produkt bp Rozsah velikosti (3130, údaje POP7) 117.25 – 118.75 119.25 – 120.75 121.25 – 122.75 123.25 – 124.75 125.25 – 126.75

POZNÁMKA: Velikosti markerů se mohou lišit v závislosti na použitém přístroji a polymeru.

Příklady interpretace I507del Vzhledem k poloze delece I507del v genu CFTR je možné detekovat přítomnost tohoto markeru pomocí 3 bp posunu velikosti píku F508del a také mutantního specifického píku I507del. Tam, kde je jedna přítomna mutantní alela I507del, bude viditelný mutantní pík I507del jako modrý pík v cca 159 bp. Lze pozorovat přítomnost píku divokého typu pro F508, avšak přibližně v polovině výšky píku normálně spojovaného s homozygotním genotypem divokého typu; zobrazuje se jako zelený pík v cca 167 bp. Také bude viditelný další zelený pík v cca 164 bp. Heterozygotní vzorek I507del

Výsledkem vzorku I507del/F508del bude posunutý zelený pík F508del WT v cca 164 bp (o 3 bp méně než normálně), modrý mutantní pík F508del v 166 bp a modrý mutantní pík I507del v cca 159 bp.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 17 z/ze 24


Výsledkem vzorku I507del/I507del bude modrý pík v cca 159 bp a jediný zelený pík v cca 164 bp (o 3 bp menší než normální pík F508, který lze pozorovat při nepřítomnosti I507del). F508del Přítomnost mutace F508del brání fungování primeru divokého typu I507del. Proto jedinec homozygotní pro F508del nebude mít pík divokého typu (WT) I507del ve směsi WT (viz níže).

U výsledků směsi B pro jedince heterozygotního pro F508del bude možné sledovat sníženou výšku píku divokého typu I507del a 2 píky vzájemně posunuté o 3 bp na pozicích 10 a 12 ve směsi WT (viz níže).

Inserce a delece Vzhledem k povaze designu soupravy CF-EU2v1 bude přítomnost insercí nebo delecí mezi dvěma protikladnými primery vést ke změně velikosti všech amplikonů produkovaných mezi těmito dvěma primery. Proto mohou být kromě 50 mutací detekovaných soupravou CF-EU2v1 detekovány jakékoliv inserce a delece v amplifikovaných cílových sekvencích podle změny očekávané velikosti amplikonu ve směsi divokého typu (B). Údaje byly zaneseny do tabulek a jsou k dispozici v samostatném dokumentu na internetových stránkách společnosti Elucigene Diagnostics: www.elucigene.com/products Příklady insercí a delecí detekovaných soupravou a dopad, který mají na profil směsi B uvádíme níže. F508del/1677delTA U jedince heterozygotního pro mutace F508del/1677delTA bude možné ve výsledcích směsi B sledovat na pozici 12 dva píky vzájemně posunuté o 1 bp (V520F WT).

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 18 z/ze 24


V520F U jedince heterozygotního pro mutaci V520F bude možné ve výsledcích směsi B sledovat pík divokého typu a snížené výšky na pozici 10 (1677delTA WT), neboť zde dochází k potlačení funkce primeru 1677delTA WT. U jedince homozygotního pro mutaci V520F vypadnou píky 10 a 12 z ostatních výsledných píků.

394delTT U jedince heterozygotního pro mutaci 394delTT budou ve výsledcích směsi B viditelné na pozicích 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) a 44 (E60X WT) dva píky vzájemně posunuté o 2 bp. Pík 34 vypadne a píky 35, 42 a 44 budou mít očekávanou výšku, ale budou posunuté o 2 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro mutaci 394delTT.

F508del/CFTRdele2,3 U jedince heterozygotního pro mutaci CFTRdele2,3 budou ve výsledcích směsi B viditelné píky snížené velikosti na pozicích 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) a 44 (E60X WT). U jedince homozygotního pro mutaci CFTRdele2,3 ve výsledcích vypadnou píky 34, 35, 41, 42 a 44.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 19 z/ze 24


444delA U jedince heterozygotního pro mutaci 444delA budou ve výsledcích směsi B viditelné dva píky vzájemně posunuté o 1 bp na pozicích 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) a 47 (621+1 WT). Pík 27 vypadne a píky 30, 31, 33 a 47 budou mít očekávanou výšku, ale budou posunuté o 1 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro mutaci 444delA.

2347delG U jedince heterozygotního pro mutaci 2347delG budou ve výsledcích směsi B viditelné dva píky vzájemně posunuté o 1 bp na pozicích 39 (2184delA WT) a 43 (2143delT WT). Pík 16 vypadne a píky 39 a 43 budou mít očekávanou výšku, ale budou posunuté o 1 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro mutaci 2347delG.

3905insT U jedince heterozygotního pro mutaci 3905insT budou ve výsledcích směsi B viditelné na pozici 26 (S1251N WT) dva píky vzájemně posunuté o 1 bp. Pík 24 vypadne a pík 26 bude mít očekávanou výšku, ale bude posunutý o 1 bp výše, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro mutaci 3905insT.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 20 z/ze 24


R1158X U jedince heterozygotního pro mutaci R1158X bude ve výsledcích směsi B viditelný pík nižší výšky na pozici 49 (R1162X WT). U jedince homozygotního pro mutaci R1158X pík 49 vypadne z výsledků.

Polymorfismus rs4148721 (delAT) v oblasti intronu 22 U jedince heterozygotního pro polymorfismus rs4148721 (delece AT) v oblasti intronu 22 budou ve výsledcích směsi B viditelné dva píky vzájemně posunuté o 2 bp na pozicích 45 (3659delC WT), 49 (R1162X WT) a 50 (R1158X WT). Píky 45, 49 a 50 budou mít očekávanou výšku, ale budou posunuté o 2 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro polymorfismus rs4148721.

Další pozorování V520F – polymorfismus 1584G>A v exonu 12 Bylo zjištěno, že polymorfismus 1584G>A interferuje s amplifikací mutanty V520F a sekvencí divokého typu. U jedince heterozygotního na polymorfismus 1584G>A bude pozorováno ve směsi B snížení výšky píku v pozici 12 (V520F). U jedince homozygotního na polymorfismus 1584G>A nebude pík 12 ve směsi B přítomen. Jedinec heterozygotní na mutaci F508del a rovněž heterozygotní na mutaci 1584G>A bude vykazovat pouze jeden pík 12 ve směsi B, namísto očekávaných dvou píků v pozici 12, které se normálně objevují u heterozygotů F508del – viz příklad níže. U jedince heterozygotního na V520F mutaci s polymorfismem 1584G>A na téže alele nebude pík 12 ve směsi A přítomen, což je výsledek dosud nepozorovaný a pravděpodobně představuje vzácnou kombinaci.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 21 z/ze 24


Křížová reaktivita Během vývoje testu bylo vynaloženo veškeré úsilí k tomu, aby nedocházelo k ovlivnění funkčnosti testu přítomností dalších hlášených polymorfismů a mutací genu CFTR. Bylo zjištěno, že vzácná mutace R1283M způsobuje křížovou reaktivitu a tuto mutaci nelze detekovat pomocí soupravy Elucigene CF-EU2v1. Dále test nedetekoval následující polymorfismy: 1655T/G (F508C), 1651A/G. Vyhodnocení známých mutací a polymorfismů genu CFTR zvýraznilo následující vlivy na výsledky získané pomocí soupravy Elucigene CF-EU2v1: 1. Mutantní primer G551D ve směsi A bude rovněž detekovat mutaci S549RT>G. Analytický software tento pík označí jako pík 20. Ve směsi B nebude odpovídající pík divokého typu. 2. Mutantní primer 2184delA ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA 2183AA>G; výsledkem bude mutantní pík na pozici 2184delA. 3. Mutantní primer 1078delT ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA F316L; výsledkem bude mutantní pík na pozici 1078delT. 4. Mutantní primer R347P ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA R347H; výsledkem bude mutantní pík na pozici R347P, jehož výška bude nižší než výška skutečného píku R347P. 5. Přítomnost polymorfismu F508C (1655T>G) povede k redukci výšky píku I507del ve směsi B CF-EU2v1. 6. Přítomnost R117H povede k redukci výšky píku R117C ve směsi B CF-EU2v1. U vzorků homozygotních pro R117H bude pík R117C chybět. 7. Přítomnost G85E povede k redukci výšky píku 394delTT ve směsi B CF-EU2v1. U vzorků homozygotních pro G85E bude pík 394delTT chybět. 8. U výsledků heterozygotního F508del a zvláště pak u homozygotního vzorku F508del je občas možné pozorovat velmi malý artefaktový pík na pozici I507del. 9. U následujících mutací nebyla potenciální křížová reaktivita testována kvůli nedostupnosti relevantních vzorků a tyto mutace mohou narušovat funkčnost testu: R117P, R117L, 1717-2A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V a vzácná kombinace I507del s polymorfismem 1651A/G.

Funkční charakteristiky Bylo provedeno zaslepené testování jednoho sta deseti vzorků DNA extrahovaných z tekuté plné krve (EDTA) pomocí testu Elucigene CF-EU2v1. Pět vzorků nebylo možno testovat po PCR kvůli nízké koncentraci DNA (méně než 1,5 ng/μl). Z celkového počtu vzorků, u kterých byly získány interpretovatelné výsledky, bylo 96 normálních, 5 heterozygotních pro F508del, 1 byl heterozygotní pro 1717-1G>A, 1 byl heterozygotní pro G551D, 1 byl heterozygotní pro 621+1G>T, 1 byl heterozygotní pro G542X a 1 byl kompozitně heterozygotní pro G542X/F508del. Ze vzorků ve formě suchých krevních skvrn bylo extrahováno 91 vzorků DNA a slepě testováno pomocí testu Elucigene CF-EU2v1. U pěti vzorků amplifikace selhala. U vzorků se zdařenou amplifikací 20 vzorků nesplňovalo analytická kritéria pro interpretaci po 12 sekundovém nástřiku do genetického analyzátoru 3500. Všechny neúspešné vzorky měly nízkou koncentraci DNA (méně než 1,5 ng/μl). Těchto 20 neúspěšných vzorků bylo znovu nastřikováno do genetického analyzátoru 3500 po dobu 36 sekund a znovu analyzováno, 7 vzorků nesplnilo analytická kritéria pro interpretaci. Ze 79 vzorků, které podaly interpretovatelné výsledky, bylo 38 normálních, 5 bylo heterozygotních na F508del, 3 byly heterozygotní na G551D, 3 byly heterozygotní na W1282X, 2 byly heterozygotní na D1152H a 2 byly heterozygotní na G542X. Byly také zjištěny čtyři složené heterozygoty 3120+1G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del a R553X/F508del. Kromě toho byly při jedné příležitosti jednotlivě pozorovány následující heterozygotní vzorky: E60X, G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 1717-

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 22 z/ze 24


1G>A, R553X, 1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X, 3659delC, 3849+10kbC>T, S1251N a N1303K. Při pěti samostatných testech bylo amplifikováno 46 vzorků DNA reprezentujících všech 50 mutací detekovaných soupravou CF-EU2v1. U všech vzorků byly získány očekávané výsledky se žádnými falešně negativními nebo falešně pozitivními výsledky, což prokázalo 100% klinickou specificitu a citlivost.

Řešení problémů Tento návod k použití se poskytuje k zajištění optimálního výkonu testu. Uživatelé se nesmí odchylovat od zde popsaných postupů. Jakékoliv odchylky mohou způsobit suboptimální výkon a vést k získání dat špatné kvality. Návod k řešení problémů, který si můžete vyžádat od společnosti Elucigene Diagnostics, poskytuje příklady a řešení nejčastějších otázek, které se mohou u CF-EU2v1 vyskytnout:        

Žádné diagnostické nebo STR píky Slabé diagnostické nebo STR píky Nadměrný počet píků typu Breakthrough (prolomený) nebo píků pozadí Neoznačené píky Slabé píky FAM (mutantní) Nevyvážený profil směsi A Nevyvážený profil směsi B Rozštěpené píky v profilu směsi B

Chcete-li požádat o návod k řešení problémů pro Elucigene CF-EU2v1, kontaktujte skupinu technické podpory: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: [email protected] E: [email protected]

Omezení postupu 1.

Výsledky získané při tomto nebo jakémkoli jiném diagnostickém testu je nutno používat a interpretovat pouze v kontextu celkového klinického obrazu. Společnost Elucigene Diagnostics neodpovídá za žádná přijatá klinická rozhodnutí.

2.

Nepřítomnost mutace detekované touto soupravou není žádnou zárukou nepřítomnosti jiných mutací genu CFTR. Existují možnosti jiných mutací, které tato souprava nedetekuje.

3.

Četnost mutací se u různých populací liší. Údaje o četnosti mutací u různých populací jsou k dispozici u Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (Konzorcium genetických analýz cystické fibrózy) (6).

Uživatel této soupravy musí tyto skutečnosti zdůraznit při hlášení výsledků klinickému lékaři, který stanovuje diagnózu, nebo lékaři z genetické poradny.

Prohlášení Výsledky tohoto diagnostického testu i jiných testů musí být interpretovány ve spojení s jinými laboratorními a klinickými údaji, které jsou dostupné lékaři. Tyto reagencie Elucigene se dodávají pro diagnostické testy in vitro. Další podrobné informace pro interpretaci dat jsou k dispozici v postupech v příručce k analytickému softwaru Elucigene CF-EU2v1: www.elucigene.com/products

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 23 z/ze 24


Reference 1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589–95. 2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101:208–11 3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353:1443–53 4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:816–21 5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui LC. „Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis.“ Science 1989; 245 (4922): 1073-8 6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app 7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): 176–179. 8. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989). 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:15091510 (1994). 10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1

ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS je ochranná známka společnosti AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP je ochranná známka společnosti Qiagen GmbH. PICOGREEN je ochranná známka společnosti Molecular Probes Inc. GENE MARKER je ochranná známka společnosti SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ a HI-DI jsou ochranné známky společnosti Life Technologies Corporation. UPOZORNĚNÍ PRO KUPUJÍCÍ: LIMITOVANÁ LICENCE Polynukleotidy značené barvivy VIC, NED a PET (a jejich použití) mohou být chráněny jedním nebo několika patenty ve vlastnictví společnosti Life Technologies Corp. Kupní cena tohoto výrobku zahrnuje omezená nepřenosná práva, vlastněná společností Life Technologies Corp. v rámci některých patentů, která jsou poskytována pouze v tomto rozsahu výrobku a výhradně pro aktivity kupujícího při detekci cíle v oboru diagnostiky v humánní medicíně. Žádná jiná práva se neposkytují. Potřebujete-li další informace o možnostech zakoupení licencí týkajících se výše uvedených barviv, kontaktujte vedoucího pracovníka oddělení licencí: Director of Licensing, [email protected]

Copyright  2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd.

CF2EUBYCS 002

Sep-2014

Strana 24 z/ze 24

Elucigene CF-EU2v1 Návod k použití

Recommend Documents