.D W
W
W
Elektronová mikroskopie v přímé ří é di diagnostice ti bakteriálních b kt iál í h a virových infekcí
EX
YN
Dagmar Hulínská NRL ELM, NRL LB, WHO Centrum, CLČ Stát í zdravotní Státní d t í ústav ú t P Praha h
Z
.C
Borrelia burgdorferi s.l. (ELM, ISEM) Anaplasma phagocytophilum phagocytophilum, Ehrlichia sp Rickettsia helvetica, R. monacensis Bartonella henselae, Neisseria meningitis
YN
.D W
• • • •
W
W
Patogenní bakterie a viry viry-v NRL ELM
EX
• Rozpoznává: Virus TBE TBE, Coronavirus, Coronavirus EBV EBV, HSV HSV, C6 , vakcinia, Leukoviruses,Reoviruses, Adenoviruses, Poxviruses,, Parvoviruses,, Enterovirus,, Myxoviruses y Picornavirus,Paramyxovirus (Dr.J. Schramlová, CSc)
Z
.C
W
W
ELM přímý průkaz v krátkém čase čase-- přímo z léze, tělní tekutiny, biopsie, autopsie
.D W
• Negativní barvení PTA, MTA- rychlá, neselektivní morfologická identifikace • frontline , open view method (P.R.Hazelton, (P R Hazelton Emerg. Emerg Infect.Dis. 9, 3, 2003)
EX
YN
• Imunosorbentní mikroskopie p ISEMidentifikace patogena polyklonální nebo monoklonální protilátkou • Imunohistologie I hi t l i na polosilných l il ý h a ultratenkých řezech pro studium patogeneze • Aplikace : v klinicky nebo epidemiologicky kritické situaci, při bioterorismu, kontrola kvality y – kontrola vakcin
Z
.C
EX
YN
.D W
W
W
Negativní barveníbarvení- PTA B. garinii a B. afzelii
Z
.C
krev
EX
YN
.D W
W
W
ISEM – diagnostika pomocí Mab
Z
.C
B. garinii – centrifugace v
EX
YN
.D W
W
W
34 000x g, 20 min, -10° 10°C, uvolnění mikrovesiklů
Z
.C
W
W
Vznik bakteriemie
EX
YN
.D W
• Bb z kůže do krveuvolní aktivní OspA mikrovesikly • adhesin OspA a) Inhibuje fagosoml lysosom funkci f k i makrofágu b) Aktivuje produkci IL 1 c) IL1- > dekorin – Aktivace fibroblastů endocytosa
Z
.C
W
Lokalizova fáze Bb a HGA v kůži
EX
YN
.D W
W ANAPLASMA
.C
BORRELIA
Hulínská et al. J.Basic.Microbiol. (NSR), 29, 73-83 (1989)
Z
V endotelii
W
Uloha Bičíků : pohyb, dělení ztrátou vznik cysty – L formy
W
antigenní ti í struktury t kt x anti antiti-axonální ál í protilátkyprotilátky tilátk mimikrymimikry-persistentní „neurologic dysfunction“
kůra
-obal
báse
EX
rotor
YN
Víko
.D W
(Sigal, Williams, Infect Immun,2006)
Z
.C
EX
YN
.D W
W
W
důsledek ztráty bičíků - antigenní rozdíly povrchu Bb pod vlivem protilátek a antibiotik
Z
.C
Plaky mrtvé L formy Plaky-
EX
YN
.D W
W
W
Vegetativní formy B. garinii vytvoření L formy - vliv hyperimunního séra
.C IFA
Z
ELM
Vegetativní formy ( Nelson, 1999; 1999; Duray 1994 McDonald,
EX
YN
.D W
W
W
2000; 2000; Cinco 2004 2004)) alterované Bb vlivem stresu (teplota, antibiotika, protilátky atd.)
Z
.C
X 29 000
Z
.C
ISEM, Mab anti-OspA
EX
YN
.D W
W
W
ELM detekce alterovaných borrelií, cyst, granul a zárodků v klinických ý vzorcích
.D W
W
W
Rozdělení Bb v germinativní zárodky CSF
EX
YN 78 000 000x
.C
Germinativní zárodky v CSF
Z
EX
YN
.D W
W
W
Ixodes ricinus – slinné žlázy Borrelia gariniigarinii- ultrathin section, Eppon , UALC , 54000x
Z
.C
EX
YN
.D W
W
W
Z
.C
W
W
Kontrola ELM
EX
YN
.D W
• Čl Členství t í : Directory Di t off Electronmicroscopy El t i facilities for emergency, DEF,CA-USA • External Quality Assessment (EQA) pro , Kochův Institut,, Berlin ELM,• EU Network in Diagnostic ELM in Infectious Diseses- EUROTOM7 • PCR, RT-PCR, Sekvenace pozitivních vzorků orků • Atlas ELM- CDC- NASA
Z
.C
0.020
91
100 100
98
55 100
Subtyp 3
strain-E50
B. bissettii
Subtyp 4
Z
A01-K275 A05-2B A04-3B Subtyp 2 A10-A541 strain-BA-93M
Subtyp 6 100 A09-261M A06-K32 Subtyp 5 99 1358A3 strain57M
.C
44
1998A3 57 1992A3 86 1921A3 Subtyp 1 1988A3 47 1996A3 76 1994A3 52 1997A3 176A_patient 82 1922A3 100 A08 336M A08-336M A07-K4 Subtyp 7
EX
YN
.D W
W
W
Přímá sekvenační analýza produktů OspA různých kmenů
EX
YN
.D W
W
W
Z
.C
W
W
Vyšetření ELMELM- v r. 2005 a 2006 (1 256 pacientů)
.D W
Procento pozitivity v r.2006 podle m ěs íců - bílé s loupce, s rovnání s rokem 2005 tm avé s loupce vpravo 25
20
23
19.07
YN
17.13 16.3
15
14.2 11 82 11.82
13.97
11 8 11.8
8.7
6 5
3
9.5
ú únor
bř březen
d b duben
k ět květen
9.23
.C
0 l d leden
13.8
EX
10
10
17.13
č červen
č červec
s rpen
Z
EX
YN
.D W
W
W Kapilára
.C Z
Borrelie v endotelii a lumen krevní kapiláry v srdci
.D W
W
W
Bb ve stěně endotelie myokardu
EX
YN
EN
.C
Bartůněk P.,, Hulínská D.,, Paleček P. Clin.Res.Cardiology gy 96,6: , 410-11,, 2007
Z
EX
YN
.D W
W
W Z
.C
SYNOVIUM- LA
W
EM – jaterní biopsie, hepatitis - cysty MAb anti ti O OspA OspAA-peroxidase peroxidaseid -diaminobenzidine di i b idi
EX
YN
.D W
W Z
Mab anti OspA v cystách
.C
makrofág jater
Cysta se zárodky
80 70
.D W
W
W
Procento pozitivity PCR na LB tkání v r.2003-2008
60 50 40
pozitivní negativni %
20 10 0 placenta
kůže
synovium tkáň jiná
Z
.C
srdce
EX
YN
30
W
2008
60 50 40
6
.D W
70
W
Sp o jito s t výš e m axim áln í te p lo ty a s r áž e k v m m n a p o z itivitu DNA Bo r r el i a b u r g d o r fer i s.l . u k líš at
5 4
YN
3
30 20
0 bøez en
duben
èerven
s ráž k y m m
èervenec
0
s rpen
.C
m ax .tepl.
k vì ten
1
EX
10
2
poz it.B B
Z
Ko-infekce při LB- Anaplasma , Rickettsia spp.
EX
YN
.D W
W
W Z
.C
YN
.D W
W
W
Persistence : snížení imunity hostitelehostiteletěhotenstvím koinfekcekoinfekce- Anaplasma
HGA
EX Z
.C
W
Anaplasma sp. Ko Ko--infekce v srdci : myokard srdce DKMP (č.222)(č.222)- PCR PCR+ , ELM +
EX
YN
.D W
W
Ložiska leukocytů v polosilném řezu s Mab P44 (histochemie Silver Silver-methenamin)
Z
.C •Bartunek P., Hulínská D., et al. Medical Res.2006,107: 213213-226
EX
YN
.D W
W
W
RT--PCR – maxima pozitivity klíšťat na RT HGA a Bb v r.2007 2007
Z
.C
.D W
W
W
Rickettsia helvetica sekvenací k íO OmpA A
X 23 000
EX
YN .C
Rickettsia uvolněná v kultuře Vero buněk (x1100)
PTA,UA,LC, x 38 000
Č.121
Z
Rickettsia v endotelové buňce
,
cykly versus logaritmus koncentrací gen r ompB
EX
YN
.D W
W
W
RT--PCR kvantifikuje RT j agens g
Z
.C
Melting curve analysis
Amplifikační lineární vztah ( logaritmus fluorescence versus počet cyklů)
EX
YN
.D W
W
W .C
B t Bartonella ll h henselae l z pacientů i tů s endomyokarditidou d k ditid
Z
EX
YN
.D W
W
W Z
.C
Bartonella henselae izolovaná z klíšťat
EX
YN
.D W
W
W Bartonella henselae (MVD O (MVDr O.Melter) M lt )
Z
.C
X 110 000
EX
YN
.D W
W
W
Přímý průkaz virů v negativním barvení Rickettsia sp.+ TBE a neznámý virus v CSF
Z
.C
x 120 000
EX
YN
.D W
W
W
Virus chřipky a ptačí chřipky
.C
x 100 000
X 120 000
Z
Z
.C
X 75 000
EX
YN
.D W
W
W
Virus HIV, negativní barvení nativního preparátu a ultratenký řez lymfocytem
W
W
negativní barvení PTA Virus neštovic, neštovic
X 100 000
EX
YN
.D W
Virus příušnic
X 110 000
Z
.C
X 110 000
EX
YN
.D W
W
W
Virus klíšťové encefalitidy (TBE)
.C
kůň
Z
Ebola- sbírka Koch Inc. X 135 000
Dr.J. Schramlová
EX
YN
.D W
W
W
Viry přenosné ze zvířat ohrožující život
100 000x
Marbursky virus
Z
.C
Virus vztekliny
120 000x
EX
YN
.D W
W
W
Děkuji za pozornost
Z
.C
