Marina Chimica Acta, Oktober 2001, hal.6-10 Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Hasanuddin
Vol. 2 No. 2 ISSN 1411-2132
EKSTRAKSI DNA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii DENGAN METODE FENOL KLOROFORM*) Andi Tenriulo, Emma Suryati, Andi Parenrengi, dan Rosmiat**) ABSTRAK Telah dilakukan ekstraksi genom DNA rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan metode konvensional fenol kloroform dengan modifikasi. Sampel yang digunakan berasal dari lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok. Hasil ekstraksi memperlihatkan pita genom DNA yang relatif bersih. Penambahan kalium asetat dapat meningkatkan kemurnian genom DNA yang diekstraksi. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian genom DNA dilakukan dengan menggunakan Spektrofotmeter UV-VIS, diperoleh konsentrasi DNA sekitar 180-240 ng/L dengan tingkat kemurnian rata-rata 1,89. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA 1.020 ng cukup untuk memperlihatkan pita yang jelas. Kata Kunci : Ekstraksi DNA, Kappaphycus alvarezii , Fenol kloroform
DNA EXTRACTION OF SEAWEED, Kappaphycus alvarezii BY PHENOL CHLOROFORM METHOD ABSTRACT The extraction DNA of seaweed Kappaphycus alvarezii by modification of phenol chloroform conventional method has been conducted. Samples were collected from culture area in Pinrang, Madura and Lombok. The extraction result showed genomic DNA band which are clear. The addition of potassium acetate can increase the purity of genomic DNA. The concentration and purity of genomic DNA measurement was done by using spectrophotometer UV-VIS. The analysis exhibited that the concentration of genomic DNA was obtained 180-240 ng/L with the purity of 1,89. The electrophoresis result showed that the genomic DNA concentration of 1.020 ng is suistainable for showing of the clear band. Key word : DNA extraction, Kappaphycus alvarezii , Phenol Chloroform
budidaya rumput laut selanjutnya. Namun informasi mengenai teknik ekstraksi dan isolasi DNA, serta karakteristik genetik rumput laut khususnya K. alvarezii belum cukup tersedia.
PENDAHULUAN Budidaya rumput laut telah berkembang demikian pesat, terutama dikawasan timur Indonesia dan khususnya di Sulawesi Selatan telah dicanangkan menjadi sentra rumput laut dunia, sehingga perlu dukungan teknologi yang cukup untuk meningkatkan dan mengendalikan kuantitas, kualitas, dan kontinuitas produksi. Salah satu jenis rumput laut yang paling banyak dibudidayakan antara lain Euchema cottoni yang secara taksonomi berubah menjadi Kappaphycus alvarezii (Doty,2000) Jenis ini termasuk alga merah (Rhodophyceae) penghasil karaginan yang banyak digunakan dalam industri makanan, farmasi, kosmetik tekstil, dan cat.(Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000).
Metode ekstraksi DNA yang tepat merupakan salah satu faktor keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang akan digunakan dalam analisis karakter genetika selanjutnya. Isolat genom DNA yang kurang baik akan mempengaruhi proses amplifikasi DNA. Untuk itu perlu dilakukan kajian terhadap metode yang umum digunakan pada pada tanaman dan hewan atau modifikasi dari metode yang telah ada untuk mengetahui metode ektraksi DNA yang sesuai untuk rumput laut K. alvarezii BAHAN DAN METODE
Perbedaan kualitas produksi dan karakteristik morfologi pada beberapa lokasi budidaya selain dipengaruhi oleh faktor lingkungan juga dipengaruhi oleh faktor genetik rumput laut itu sendiri. Untuk mengetahui karakteristik genetik rumput laut diperlukan tehnik ekstraksi dan isolasi DNA, kemudian dianalisis untuk membedakan karakter dari masing-masing spesies rumput laut yang kelak akan menjadi bibit untuk pengembangan
Koleksi Sampel Rumput laut, K. alvarezii dikoleksi dari beberapa lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok,dibawa dalam bentuk segar ke Laboratorium Bioteknologi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau, Maros.. Identifikasi secara morfologi dilakukan sebagai dasar pengelompokan
6
Andi Tenriulo, Emma Suryati, dkk
Mar. Chim Acta
2401 PC Simatdzu. Sampel diukur dengan volume cuvet 3 mL dan faktor pengenceran 200. Untuk mendapatkan konsentrasi DNA untai ganda digunakan rumus :
jenis rumput laut sebelum analisis genetika. Sampel ( 50 mg) dipreservasi dengan menggunakan 250 uL TNESUrea buffer (Asahida et al., 1996) dalam tabung eppendorf 1,5 mL. Sampel disimpan dalam suhu ruangan sampai dilakukan ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA
Konsentrasi DNA(цg/ml) = A260 x 50 x faktor pengenceran
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan. Kemurnian larutan DNA tersebut dapat dilihat dengan membagi nilai A 260 dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari,S dan M.S.A. Zein. 2003).
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode fenol-kloroform yang telah dikembangkan oleh Parenrengi (2001) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi metode dilakukan yaitu dengan penambahan kalium asetat dalam proses ektraksi. Sampel yang sudah dipreservasi dengan TNESUrea buffer ditambahkan 500 цL lysis buffer (0,5 M NaCl, 0,001 M EDTA, 1 % (w/v) SDS, 0,8 % (v/v) Triton x-100, dan 0,1 M Tris-HCl pH 9,0) kemudian dimasukkan ke tabung eppendorf dan ditambahkan 40 mL SDS 10 % (w/v) dan 20 цL proteinase K (20 mg/mL larutan), diinkubasi pada 550C selama 1–3 jam, kemudian ditambahkan 12,5 цL RNAse (20 mg/mL larutan) dan disimpan pada suhu ruangan selama 15-30 menit Selanjutnya ditambahkan fenol : kloroform : isoamyl alkohol (PCIA (25:24:1)) dan divortex secara perlahan sampai homogen, disimpan pada suhu ruangan selama 10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 8 menit. Bagian lapisan atas cairan dipindahkan ke tabung eppendorf baru volume 1,5 mL. Penambahan PCIA ini diulangi sekali lagi seperti di atas. Lapisan atas diambil dan ditambahkan larutan kloroform : isoamyl alkohol (CIA (24:1)), disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Lapisan atas dipindahkan lagi ke tabung baru dan ditambahkan 0,1 volume kalium asetat 5 M, 0,25 volume etanol, dan 1 vol CIA (24 : 1) disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Lapisan atas kemudian ditambahkan etanol absolut dingin dan digoyang dengan pembalikan secara perlahan beberapa saat. DNA yang mengendap pada dasar tabung berupa pellet warna putih sesudah sentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit dicuci dengan 1 mL ethanol 70 % dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. DNA dikering-anginkan selama lebih kurang 24 jam pada suhu ruangan dan ditambahkan 100 uL aquadest atau TE buffer (10 mM Tris dan 1 mM EDTA, pH 8,0), disimpan pada suhu –20oC untuk proses selanjutnya. Untuk mengetahui keberhasilan metode ekstraksi yang digunakan, campuran 7,5 цL genom DNA dan 2,5 цL Loading Dye dielektroforesis dalam 0,8 % gel agarose dalam 1 x TBE (Tris-Boric acid-EDTA) pada tegangan 50 volt. Gel distaining dengan 0,5 цg/mL dalam larutan ethidium bromida. Hind III marker digunakan sebagai standar marker genom DNA yang diekstraksi.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi DNA Hasil ekstraksi DNA rumput laut menggunakan metode konvensional fenol-kloroform menghasilkan fragmen tunggal genom yang relatif bersih. Hal ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang telah dikembangkan untuk ikan (hewan) atau tanaman dapat diaplikasikan pada alga khususnya rumput laut K. alvarezii (Gambar 1.)
1 5
2 6
3 77
4
Gambar 1. Genom DNA rumput laut G. verrucosa yang dieksraksi dengan Metode Fenol-Kloroform, 1=Marker Hind III; 2,3,4 = Genom DNA
Pita genom DNA yang bersih tanpa latar belakang mengindikasikakan tingkat kemurnian DNA yang baik (DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi). Kontaminasi oleh fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya latar belakang yang smear disepanjang jalur pergerakan pita genom DNA. terdegradasi dan kontaminasi RNA ditandai dengan adanya pita yang kabur pada posisi berat molekul yang rendah. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponenkomponen lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya dan harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi
Pengukuran Tingkat Kemurnian dan Kuantitas DNA. Kuantitas dan kualitas DNA diukur melalui spektrofotometri sinar ultra-violet dengan alat spektrofotometer UV-VIS Recording Spektrofotometer 7
Vol. 2 No. 2
Ekstraksi DNA Rumput laut …
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti ethyllenediamine tetraacetic (EDTA), Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) dan Triton X-100. EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan aktifitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat). SDS dan Triton X100 merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membran sel dan menyebabkan pecahnya kromosom . Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein dan enzim RNAse digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh (Muhammad,S.A., dan Praseno. 1991). Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan fenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan kloroform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.
coklat (Kraan dan Guiry, 1998) dan metode yang digunakan pada Rhodophyta (Wattier et al., 2000). Konsentrasi dan kemurnian DNA Selain dari hasil elektroforesis, keberhasilan proses ektraksi dapat diketahui dari hasil pengukuran absorban menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Dengan pengambilan sampel secara acak tanpa penambahan kalium asetat didapatkan rata-rata jumlah DNA = 372,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian DNA = 1,4. Pada penggunaan metode fenol kloroform dengan penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata jumlah DNA = 226,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian (purity) = 1,824. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan kalium asetat dapat menanggulangi masalah tingginya kandungan polisakarida pada rumput laut. Penambahan kalium asetat sebanyak 10 % dari volume pengambilan larutan setelah penggunaan kloroform isoamyl alkohol dapat mengurangi kontaminasi polisakarida atau fenol di dalam larutan ( Kraan S. and Guiry M.D, 1998). Banyaknya radiasi ultraviolet yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dengan banyaknya DNA dalam sampel. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada 260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada 280 nm. Hasil pengukuran tingkat kemurnian dan kuantitas DNA dapat dilihat pada tabel 1.
Parenrengi (2001) menggunakan metode fenolkloroform pada ekstraksi ikan Kerapu (Epinephelus spp) dan menggunakan metode yang sama pada ekstraksi rumput laut Gracilaria verrucosa. Metode fenolkloroform yang dikembangkan oleh Parenrengi et al.,(2007) pada G.verrucosa menunjukkan hasil yang lebih baik dari metode CTAB yang digunakan pada alga
Tabel 1. Tingkat kemurnian dan kuantitas DNA (ng/ цL) pada beberapa sampel rumput laut K. alvarezii, yang diambil secara acak.
Sampel
Tanpa Penambahan K asetat Tingkat Kuantitas kemurnian (ng/ цL) (A260/A280)
Sampel
Penambahan K asetat Tingkat Kuantitas kemurnian (ng/ цL) (A260/A280)
MH31
1,83
110
PH 72
1,92
230
PC 66
1,55
170
PH 73
1,83
220
MC 34
1,05
560
PC 79
1,85
240
500
PC 80
1,75
210
1,18
520
PC 82
1,77
230
1,36
372
Jumlah
1,824
226
LH 43 PH 58 Jumlah
1,19
8
Andi Tenriulo, Emma Suryati, dkk
Mar. Chim Acta
Hasil uji tingkat kemurnian DNA sampel PC66 adalah 1,55 nilai tersebut dihasilkan dengan membagi nilai A260 dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0. Kontaminasi protein dan bahan organik lainnya ditandai dengan rendahnya nilai rasio A260/A280 (<1,8), sebaliknya kontaminasi fenol ditandai dengan tingginya nilai rasio tersebut (>2,0). (Linacero et al., 1998 ).
1
2
3
4
5
6
7
Genom DNA dengan Volume dan Konsentrasi yang berbeda. Hasil isolasi DNA rumput laut yang dilakukan dengan metode fenol-kloroform diuji kualitasnya dengan elektroforesis gel agarose dan volume genom yang digunakan adalah : 3 цL ; 6 цL; 9 цL; 12 цL; 15 цL; 18 цL. Pengujian kuantitas DNA sampel PC-66 dengan alat spektrofotometer menunjukkan hasil absorban atau A260 = 0,017, sehingga diketahui konsentrasi DNA sampel PC-66 adalah = 170 ng/ цL yaitu dengan menggunakan rumus = A260 x faktor pengenceran x 50 = 170 ng/ цL larutan DNA hasil isolasi. Pada sumur nomor 2 dengan volume 3 цL berarti jumlah DNAnya adalah 3 x 170 ng/ цL = 510 ng, sumur 3 konsentrasi DNA = 1.020 ng, sumur 4 konsentrasi DNA = 1.530 ng, sumur 5 konsentrasi DNA = 2.040 ng, sumur 6 konsentrasi DNA = 2.550 ng dan sumur nomor 7 adalah 18 x 170 = 3.060 ng. Kualifikasi beberapa volume DNA sampel dilihat pada gambar 2 :
Gambar 2. Hasil elektroforesis genom DNA rumput laut K. alvarezii PC66 dengan konsentrasi yang berbeda. Ket: (Konsentrasi DNA = 170 ng/ цL. 1= marker Hind III; 2= genom DNA 3 цL; 3= genom DNA 6 цL ; 4 = genom DNA 9 цL ; = 5 genom DNA 12 цL ; 6 = genom DNA 15 цL ; Sumur 7 = genom DNA 18 цL).
KESIMPULAN 1. Ekstraksi DNA rumput laut K. alvarezii.dapat dilakukan dengan metode konvensional fenol-kloroform dengan sedikit modifikasi. 2. Penambahan kalium asetat pada metode fenolkloroform dapat meningkatkan tingkat kemurnian DNA. Pada penggunaan metode fenol kloroform dengan penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata jumlah DNA = 226,0 ng/цL dengan tingkat kemurnian (purity) = 1,824 tanpa penambahan kalium asetat didapatkan rata-rata jumlah DNA = 372,0 ng/цL dengan tingkat kemurnian DNA = 1,36 3. Semakin besar volume genom yang di loading pada sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi DNA yang terkandung di dalam larutan sampel tersebut dan membentuk pita yang lebih tebal.
Uji kualitas DNA memperlihatkan bahwa genom dengan konsentrasi yang lebih tinggi memperlihatkan ketebalan pita yang lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi yang lebih rendah (Gambar.2). Pita yang nampak pada sumur 2 (konsentrasi genom 510 ng) sangat tipis dibandingkan dengan sumur lainnya yaitu 3 (1.020 ng), 4(1.530 ng), 5(2.040 ng), 6(2.550 ng),dan 7 (3.060 ng). Hal ini menunjukkan bahwa volume 6 uL (konsentrasi DNA 1.020 ng) cukup untuk memperlihatkan band yang jelas. Semakin besar volume genom yang di loading pada sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi DNA yang terkandung di dalam larutan sampel tersebut.
DAFTAR PUSTAKA Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000. Bioteknologi Hasil Laut. Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Lautan Institut Pertanian Bogor. hal 47 Asahida, T., T. Kabayashi, K. Saitoh, and I. Nakayama. 1996. Tissue preservation and total DNA extraction from fish store at ambient temperature using buffer containing high concentration of urea. Fisheries Science 62(5):727-730. Doty, 2000. The Production an Use Eucheuma Departement Of Botany University of Hawaii Honolulu, Hawai, p.45. Kraan, S., dan M.D. Guiry, 1998. Strain selection in the edible brown seaweed Alaria esculenta: Genetic fingerprinting and hybridization studies under laboratory conditions. Departement of Botany, Martin Ryan Science Institute, National University of Ireland, Galway, Ireland, 30 pp. 9
Vol. 2 No. 2
Ekstraksi DNA Rumput laut …
Linacero, R., J. Rueda and A.M.Vazquez. 1998. Quantification of DNA. Pages 18-21 in Karp, A., P. G. Isaac, and D. S. Ingram (Eds.) Molecular Tools for Screening Biodiversity: Plants and Animals. Chapman and Hall. London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras. Muhammad,S.A., dan Praseno (Eds.). 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Hal 31-33. Parenrengi,A., Sulaeman, E. Suryati dan A.Tenriulo. 2007. Karakteristik Genetik Rumput Laut Gracillari verrucosa dari Beberapa Sumber. Makalah telah disampaikan pada Konfrensi Masyarakat Akuakultur Indonesia tgl 5 – 7 Juli 2007 di Surabaya. 11 hal. Parenrengi, A., 2001. Studies on genetic variability of groupers (Epinephelus spp.) from Indo-Malaysian waters using PCRRAPD analysis. Master thesis of Kolej University Terengganu, Universiti Putra Malaysia, Malayasia, 174 pp Sulandari,S dan M.S.A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI.hal 72-87 Wattier, R.A., P.A. Prodohl and C.A. Maggs., 2000. DNA isolation protocol for red seaweed (Rhodophyta). Plant Molecular Biology Reporter 18:275-281.
10
