PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MUH. ALIAS L. RAJAMUDDIN

TRANSFORMASI GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii

MUH. ALIAS L. RAJAMUDDIN

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Transformasi Gen Kappa(κ)-Carrageenase pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii” adalah benar karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2016

Muh. Alias L. Rajamuddin NIM C161110021

RINGKASAN MUH. ALIAS L. RAJAMUDDIN. Transformasi Gen Kappa(κ)-Carrageenase pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii. Dibimbing oleh ALIMUDDIN, ENANG HARRIS dan UTUT WIDYASTUTI. Teknologi transgenesis telah diaplikasikan untuk meningkatkan performa karakter penting organisme budidaya, diantaranya peningkatan ketahanan terhadap penyakit, kondisi lingkungan yang ekstrim, atau peningkatan kandungan produk primer. Kandungan karagenan menentukan kualitas rumput laut Kappaphycus alvarezii. Dalam rangka untuk meningkatkan kandungan kappa(κ)karagenan pada K. alvarezii, pada penelitian ini gen penyandi enzim κCarrageenase (κ-Car) ditransformasi ke K. alvarezii dengan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Gen penyandi enzim κ-Car berperan dalam biosintesis κ-karagenan. Gen κ-Car dibuat dengan sintesis secara in vitro berdasarkan sekuen gen κ-Car yang berasal dari Pseudoalteromonas yang telah ada di bank gen. Penelitian ini terdiri atas 3 (tiga) tahapan utama. Penelitian tahap pertama bertujuan menghasilkan vektor kloning dan vektor ekspresi untuk proses transformasi. Sekuen gen penyandi κ-Car disisipkan dalam plasmid pMSH untuk membuat konstruksi biner pMSH/κ-Car yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (35S) dan terminator Nos (tNos). Transformasi plasmid pMSH/κ-Car pada bakteri Escherichia coli dilakukan menggunakan metode heat-shock, sedangkan pada Agrobacterium tumefaciens menggunakan metode tri-parental mating. Hasil penelitian menunjukkan bahwa koloni bakteri E. coli dan A. tumefaciens transforman dapat tumbuh pada media selektif. Analisis polymerase chain reaction (PCR) dengan cetakan DNA dari koloni bakteri tersebut menggunakan primer 35S-Forward (35S-F) dan tNos-Reverse (tNos-R) menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 2.000 bp, sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S, gen κ-Car, dan tNos. Pengurutan DNA dan analisis pensejajaran menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) menunjukkan kesamaan sekuen (73-76%) fragmen gen κ-Car produk PCR dengan urutan nukleotida gen κ-Carrageenase yang telah diisolasi dari sumber lainnya yang ada di bank gen. Hasil ini juga menguatkan bahwa fragmen κ-Car yang ditransformasi ke vektor adalah sesuai yang diharapkan. Konstruksi pMSH/κ-Car berhasil dibuat dan telah dihasilkan koloni A. tumefaciens transforman positif membawa pMSH/κ-Car. Penelitian tahap kedua bertujuan menghasilkan rumput laut K. alvarezii transgenik gen κ-Car. Transformasi gen κ-Car ke eksplan K. alvarezii dilakukan menggunakan metode mediasi A. tumefaciens. Pemeliharaan eksplan pascatransformasi dilakukan selama empat bulan secara steril pada botol kultur 200 mL dengan penggoyangan 100 rpm. Analisis K. alvarezii transgenik yang membawa gen κ-Car dilakukan menggunakan metode PCR dengan dua set primer. Hasil pemeliharaan eksplan pascatransformasi menunjukkan bahwa sintasan eksplan dengan perlakuan transformasi (transforman) sebesar 36%, dan kontrol (non transformasi) sebesar 92%. Jumlah eksplan yang hidup, kemudian bertunas adalah sebesar 88,9% pada transforman dan kontrol sebesar 87%, dengan ukuran panjang tunas 5-10 mm. Dua eksplan bertunas yang dianalisis PCR DNA, menunjukkan 100% membawa gen κ-Car (transgenik). Ukuran fragmen DNA

hasil amplifikasi dari K. alvarezii transgenik menggunakan primer 35S-F dan tNos-R adalah 2.000 bp, berukuran sama dengan produk PCR dari kontrol positif dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car. Sementara itu, tidak ada produk amplifikasi pada K. alvarezii yang tidak ditransformasi (kontrol negatif). Selanjutnya, analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R menunjukkan produk amplifikasi berukuran 300 bp, hal ini sama dengan ukuran sekuen promoter 35S CaMV. Dengan demikian, rumput laut K. alvarezii transgenik yang membawa κ-Car telah berhasil diproduksi. Penelitian tahap ketiga, meliputi pemeliharaan lanjut eksplan K. alvarezii transgenik, kandidat transgenik lainnya dan non transgenik (kontrol), serta analisis ekspresi mRNA. Pemeliharaan lanjut dilakukan selama delapan bulan secara semisteril menggunakan wadah botol kerucut volume 1500 mL yang dilengkapi sistem aerasi. Ekstraksi RNA total dari K. alvarezii transgenik dilakukan menggunakan TRIzol® Reagent dan sintesis DNA komplementer (cDNA) dilakukan menggunakan IscriptTM cDNA Synthesis Kit dengan teknik reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Primer yang digunakan untuk gen κ-Car adalah κ-Car-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-3’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG-3’ sedangkan primer untuk gen Actin sebagai kontrol internal adalah Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA-3’ dan Actin-R 5’GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-3’. Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Hasil analisis kuantitatif PCR pada K. alvarezii transgenik menunjukkan tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase dinormalisasi dengan ekspresi gen Actin adalah sebesar 0,983 untuk tunas transgenik T1 dan 0,962 pada tunas transgenik T2. Dengan demikian, gen κCarrageenase diekspresikan pada Kappaphycus alvarezii transgenik dengan level relatif sama. Kata kunci: Kappaphycus alvarezii, gen Kappa(κ)-Carrageenase, transgenesis

SUMMARY MUH. ALIAS L. RAJAMUDDIN. Transformation of Kappa(κ)-Carrageenase gene in seaweed Kappaphycus alvarezii. Supervised by ALIMUDDIN, ENANG HARRIS and UTUT WIDYASTUTI. Foreign gene transformation technique have been applied to improve the valuable traits of farmed organism. Carrageenan content determines quality of seaweed Kappaphycus alvarezii. As the first step towards increasing of kappa(κ)carrageenan content in K. alvarezii, in this study kappa(κ)-Carrageenase gene (κCar) from Pseudoalteromonas was transformed into K. alvarezii mediated by Agrobacterium tumefaciens method. The κ-Car gene involves in κ-carrageenan biosynthesis. This research consisted of three steps. The first steps of research purpose was to produce a cloning vector and an expression vector for transformation process. The κ-Car gene sequence was artificially synthesized, an then inserted in pMSH plasmid to generate a binary pMSH/κ-Car plasmid. The pMSH/κ-Car was controlled by 35S CaMV promoter (35S) and Nos terminator (tNos). Transformation of pMSH/κ-Car to Escherichia coli as cloning vector was performed using a heat-shock method, while into Agrobacterium tumefaciens was using triparental mating method. The result showed that the transformed E. coli and A. tumefaciens colonies could grow on the selective media. PCR analysis with DNA template from bacterial colonies using 35S-Forward primer (35S-F) and tNos-Reverse (tNos-R) produced DNA fragment with size of 2,000 bp, the same size with the total length of 35S promoter, κ-Car gene, and tNos sequences. Thus pMSH/κ-Car construct and A. tumefaciens transformant carrying pMSH/κ-Car were successed to be produced. The second steps of research purpose was to produce a transgenic K. alvarezii carrying κ-Car gene. Transfomation of κ-Car gene to K. alvarezii was conducted using A. tumefaciens mediation method. Analysis of K. alvarezii transgenic carrying κ-Car was performed by PCR method with two set primers. The result showed that survival percentage posttransformation of K. alvarezii explants was 36% and sprout was 88.9% while the percentage of transgenic was 100% out of the sprout explants samples. The size of DNA band of PCR product from K. alvarezii transformants using 35S-F and tNos-R set primers was 2,000 bp, the same size as PCR product of the positive control of pMSH/κ-Car plasmid as template, while no amplification product in non-transformated as negative control was found. Furthermore, PCR analysis using 35S-F and 35S-R set primers showed amplification product of 300 bp, the same size as the length of 35S promoter sequence. Thus, K. alvarezii transgenic carrying κ-Car gene had been generated. The third steps of research purpose was to analyze the level of κ-Car gene expression of transgenic K. alvarezii. Growing of transgenic explants was conducted by semi sterile culture method in cone bottle with 1500 ml volume with aeration. Total RNA was extracted from transgenic explants using TRIzol® reagent and synthesis of cDNA was performed using IscriptTM cDNA synthesis kit. Set primers used for κ-Car gene expression analysis was κ-Car-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-3’ and κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC

CGT CAA CG-3’. Set primers of Actin gene as internal control of mRNA loading in cDNA synthesis was Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA-3’ and Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-3’. Analysis of κ-Car gene expression level was carried out by quantitative real time PCR (qrt-PCR). The result of rearing culture showed that survival of transgenic K. alvarezii explants was 100%, the others transgenic candidates explant were 36% and controls was 43%. The number of shoots was 2-4 each explants, and the length of shoots was 5-8 mm. Expression analysis results of Kappaphycus alvarezii transgenic indicated the normalized expression level of κ-Carrageenase gene/Actin gene was 0.983 in T1 explant transgenic and 0.962 in T2 explant transgenic. Thus κCarrageenase gene was expressed in similar level in Kappaphycus alvarezii transgenic. Keywords: Kappaphycus alvarezii, Kappa(κ)-Carrageenase gene, transgenesis

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

TRANSFORMASI GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii

MUH. ALIAS L. RAJAMUDDIN

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Akuakultur

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

Penguji pada Ujian Tertutup:

Dr Raden Roro Sri Puji Sinarni Dewi Dr Dinamella Wahjuningrum

Penguji pada Sidang Promosi: Dr Raden Roro Sri Puji Sinarni Dewi Dr Dinamella Wahjuningrum

Judul Disertasi

: Transformasi Gen Kappa(κ)-Carrageenase pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii

Nama

: Muh. Alias L. Rajamuddin

NIM

: C161110021

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Dr Alimuddin, SPi, MSc Ketua

Prof Dr Ir Enang Harris, MS Anggota

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Widanarni, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian Tertutup: 2 Agustus 2016 Tanggal Sidang Promosi: 16 Agustus 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga penulisan disertasi ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 ini adalah Aplikasi teknologi transgenesis rumput laut, dengan judul “Transformasi Gen Kappa(κ)-Carrageenase pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii”. Penelitian ini mencakup pembuatan konstruksi plasmid biner pMSH/κ-Car, transformasi dan pemeliharaan lanjut K. alvarezii transgenik serta analisis ekspresi. Penghargaan dan ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr Alimuddin, Bapak Prof Enang Harris, Ibu Dr Utut Widyastuti (alm), dan Bapak Prof. Komar Sumantadinata (alm), selaku komisi pembimbing, serta kepada Ibu Dr Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi dan Ibu Dr Dinamella Wahjuningrum sebagai penguji luar komisi atas saran penyempurnaan pada disertasi ini. Penelitian ini merupakan salah satu bagian yang dibiayai program kerjasama penelitian antara Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau (BPPBAP), Kementerian Kelautan dan Perikanan dengan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB a.n. Dr Utut Widyastuti. Untuk itu, ucapan terima kasih kepada Pimpinan beserta semua staf di BPPBAP Maros, dan ucapan terima kasih yang sama kepada Pimpinan beserta semua staf di PPSHB-IPB, atas bantuan alat dan bahan selama pelaksanaan penelitian. Terima kasih kepada teman-teman seperjuangan di Lab. Biorin dan Kultur Jaringan PPSHB-IPB. Terima kasih kepada Bapak/Ibu dosen dan semua staf di Program Studi Ilmu Akuakultur (AKU)-IPB, serta teman-teman seperjuangan di prodi AKU, spesial S3 AKU 2011. Terima kasih dan penghargaan kepada Pimpinan dan semua staf di Politeknik Pertanian Negeri Pangkep tempat penulis mengabdi, atas izin dan segala bantuan yang diberikan. Terima kasih khusus disampaikan kepada isteri tercinta Nurjanna, S.Pi, anak-anakku: N. Abdi Sahab L.Rajamuddin, N. Putra Shafar L.Rajamuddin, N. Agung Ramadhan L.Rajamuddin. Hormat dan sujud kepada ayahanda L.Rajamuddin, ibunda Husniah dan mertua A.Hawiyah Krg Tonji. Terima kasih juga kepada saudara-saudaraku/ipar, serta seluruh keluarga, atas segala bantuan, doa dan kasih sayangnya selama penulis melaksanakan pendidikan Doktor. Spesial kepada Palem 6 Group, Forum Mahasiswa Pascasarjana IPB Sul-Sel, Badminton Club, kolega, semua pihak yang tidak sempat disebut satu per satu. Semoga disertasi ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2016

Muh. Alias L.Rajamuddin

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

x

DAFTAR ISTILAH

xi

1 PENDAHULUAN UMUM 1.1 Latar Belakang 1.2 Perumusan Masalah 1.3 Hipotesis 1.4 Tujuan Penelitian 1.5 Manfaat Penelitian 1.6 Ruang Lingkup Penelitian 1.7 Kebaruan Penelitian (Novelty)

1 1 2 3 3 3 3 4

2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Biologi Rumput Laut Kappaphycus alvarezii 2.2 Karagenan pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii 2.3 Teknologi Transgenesis 2.4 Transformasi Gen dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens

5 5 5 7 8

3 KONSTRUKSI VEKTOR BINER GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium tumefaciens SEBAGAI MEDIA UNTUK PEMBUATAN RUMPUT LAUT TRANSGENIK 3.1 Pendahuluan 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2.2 Sekuen dan Sumber Gen κ-Carrageenase 3.2.3 Pembuatan Vektor Ekspresi pMSH/κ-Car 3.2.4 Transformasi pMSH/κ-Car ke Escherichia coli DH5α 3.2.5 Transformasi pMSH/κ-Car ke Agrobacterium tumefaciens 3.2.6 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase 3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Vektor Ekspresi pMSH/κ-Car 3.3.2 Identifikasi Transforman Escherichia coli DH5α 3.3.3 Identifikasi Agrobacterium tumefaciens Transforman 3.3.4 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase 3.4 Simpulan

11 12 13 13 13 13 14 15 16 16 16 16 18 19 20

4 TRANSFORMASI GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii 4.1 Pendahuluan 4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian

21 22 23 23

vii

4.2.2 Preparasi Talus dan Sumber Eksplan Steril Kappaphycus alvarezii 4.2.3 Transformasi Gen κ-Carrageenase pada Kappaphycus alvarezii 4.2.4 Pemeliharaan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi 4.2.5 Analisis DNA Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR 4.3 Hasil dan Pembahasan 4.3.1 Pertumbuhan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi 4.3.2 Identifikasi Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR 4.4 Simpulan

23 23 24 24 24 24 26 27

5 PEMELIHARAAN LANJUT EKSPLAN Kappaphycus alvarezii TRANSGENIK DAN ANALISIS EKSPRESI mRNA 5.1 Pendahuluan 5.2 Metode Penelitian 5.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian 5.2.2 Pemeliharaan Lanjut Eksplan/Tunas K. alvarezii Transgenik 5.2.3 Analisis Ekspresi Gen κ-Carrageenase dengan q-PCR 5.3 Hasil dan Pembahasan 5.3.1 Pemeliharaan Lanjut Eksplan/Tunas K. alvarezii Transgenik 5.3.2 Analisis Ekspresi Gen κ-Carrageenase 5.4 Simpulan

28 29 29 29 30 30 31 31 33 35

6 PEMBAHASAN UMUM

36

7 SIMPULAN UMUM DAN SARAN 7.1 Simpulan Umum 7.2 Saran

39 39 39

DAFTAR PUSTAKA

40

LAMPIRAN

46

RIWAYAT HIDUP

51

DAFTAR TABEL 1 Analisis kesejajaran fragmen nukleotida gen κ-Carrageenase menggunakan program BLAST 2 Persentase eksplan hidup dan bertunas dari eksplan Kappaphycus alvarezii hasil perlakuan transformasi gen κ-Carrageenase (κ-Car) 3 Pertumbuhan panjang tunas dan jumlah tunas pada eksplan transgenik, kandidat transgenik dan kontrol hasil pemeliharaan pada kultur pembesaran secara semi-steril 4 Hasil kuantifikasi cDNA Kappaphycus alvarezii transgenik (T) dan non transgenik (NT) menggunakan mesin Nanodrop-2000 5 Nilai Cт (cycle of threshold) dan rasio Cт gen κ-Carrageenase (κCar) dan gen Actin dari masing-masing cDNA Kappaphycus alvarezii transgenik (T1 dan T2)

20 25

32 33

34

DAFTAR GAMBAR 1 Kerangka alir penelitian transformasi gen Kappa(κ)-Carrageenase pada rumput laut Kappaphycus alvarezii (Doty) 2 Morfologi dan warna talus Kappaphycus alvarezii: coklat (A), coklat kemerahan (B), dan hijau (C) 3 Perbedaan stereotipe struktur molekul dan posisi ion sulfat dari tiga tipe karagenan (Campo et al. 2009) 4 Struktur kimia dan pembentukan kappa-karagenan dari bentuk sebelumnya mu-karagenan, oleh enzim sulfohydrolase κ-Carrageenase (Meta Cyc Pathway: carrageenan biosynthesis 2015) 5 Ilustrasi mekanisme transformasi genetik menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens (Tzfira & Citovsky 2002) 6 Sekuen gen κ-Carrageenase berukuran sekitar 1.300 bp; highlight warna hijau: start codon; warna kuning: stop codon (B), diligasi ke vektor kloning pJET1.2 (A) menghasilkan plasmid pJET1.2Emblcds-Carrageenase dengan ukuran total 4.168 bp 7 Peta plasmid pMSH (NAIST, Japan) (A) dan posisi insersi gen κCarrageenase (κ-Car) di daerah MCS plasmid pMSH, RB: right border, pNos: promoter Nos, NPT II: gen marka seleksi neomycin phosphotransferase II, T: terminator Nos, HPT: gen marka seleksi hygromycin phosphotransferase, p35S: promoter 35S CaMV, MCS: multiple cloning site, LB: left border 8 Peta plasmid pMSH/κ-Car: gen κ-Carrageenase (κ-Car) tersisip pada situs NotI dan SpeI di daerah multiple cloning site (MCS) pada vektor pMSH. Panjang total sekuen dari p35S hingga terminator Nos pada plasmid pMSH/κ-Car adalah 2.000 bp 9 Koloni bakteri Escherichia coli DH5α pada uji media selektif. Koloni-koloni transforman ditunjukkan dengan tanda panah, dapat tumbuh pada media selektif (A), koloni E. coli DH5α tanpa transformasi, tidak dapat tumbuh, sebagai kontrol negatif (B), dan

4 5 6

7 10

13

14

16

ix

10

11

12

13

14

15

16

17

koloni E. coli pada media LA tanpa antibiotik marka seleksi, sebagai kontrol positif (C) Master plate (replika) koloni Escherchia coli DH5α transforman (A), elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer 35S-F dan tNnos-R menghasilkan fragmen sekitar 2.000 bp (kepala panah) (B), M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH/κCar sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif, E1-E5: koloni bakteri E. coli DH5α hasil transformasi Koloni A. tumefaciens transforman hasil konjugasi dapat tumbuh pada media selektif (tanda panah) yang mengindikasikan proses triparental mating/TPM berhasil dilakukan (A), sedangkan kultur tunggal masing-masing: Escherichia coli DH5α/donor (1), E. coli DH1 (pRK2013)/helper (2), Agrobacterium tumefaciens/resipien (3) tidak tumbuh pada media selektif, sebagai kontrol negatif (B) Master plate (replika) koloni A. tumefaciens transforman (A), dan elektroforegram amplikon PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan fragmen berukuran sekitar 2.000 bp (B). Tanda kepala panah di sebelah kanan Gambar 12B menunjukkan ukuran produk amplikon PCR, M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH/κ-Kar sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif Koleksi Kappaphycus alvarezii hasil budidaya sebagai sumber eksplan (A), adaptasi pemeliharaan secara terkontrol di laboratorium (B), dan eksplan steril ukuran 7-10 mm, siap digunakan dalam proses transfer gen (C) Eksplan Kappaphycus alvarezii awal transformasi gen κCarrageenase (A), dan eksplan umur empat bulan pascatransformasi yang memiliki tunas baru dengan ukuran panjang 5-10 mm (lingkaran merah) (B) 25 Hasil ekstraksi DNA genom rumput laut Kappaphycus alvarezii (A), analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan produk berukuran sekitar 2.000 bp (B), dan analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R dengan produk sekitar 300 bp (C). G: genom; λ-3 dan λ-5: marka dengan konsentrasi 30 ng/µl dan 50 ng/µl (BioLabs, Inc. New England); T1 dan T2: K. alvarezii transgenik; NT: K. alvarezii kontrol non-transformasi; K+: plasmid pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif, M: marker gen ruler 1KB DNA ladder (BioLabs, Inc. New England); tanda kepala panah menunjukkan target produk PCR Morfologi perkembangan tunas Kappaphycus alvarezii pada wadah pembesaran semisteril di botol kerucut volume 1500 ml dengan aerasi: 2 tunas (A), 3 tunas (B) dan 4 tunas (C) Produk RT-PCR menggunakan primer κ-Car-F dan κ-Car-R (A) dan primer actin-F dan actin-R (B) dengan cetakan cDNA dari K. alvarezii transgenik (T1 dan T2) dan non-transgenik (NT) tidak teramplifikasi (A); M: marker 100 bp DNA ladder (BioLabs, Inc.

17

17

18

19

23

26

32

New England); K+: produk amplifikasi dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car.

34

DAFTAR LAMPIRAN 1 Komposisi media PES (Prevasoli’s Enriched Seawater) stok 2 Gambar pemeliharaan secara steril eksplan Kappaphycus alvarezii pascatransformasi menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan 3 Komposisi bahan bufer ekstraksi DNA dengan metode CTAB 2x 4 Gambar pemeliharaan lanjut semi steril eksplan Kappaphycus alvarezii transgenik menggunakan botol kerucut volume 1500 ml yang dilengkapi dengan aerasi

47

48 49

50

DAFTAR ISTILAH 35SCaMV bp cDNA ddH2O DEPC DMSO DNA EDTA GFP IPTG κ-Car LA LB MCS mRNA PCR PES Plasmid biner

: cauliflower mosaic virus (salah satu promoter kuat) : base pair (pasang basa) : complementary DNA : double distilled H2O/sterile distilled water : diethylpyrocarbonate : dimethyl sulfo oxide : deoxyribonucleic acid : ethylenediaminetetraacetic acid : green fluorescent protein : isopropanoltio-β-D-galaktopiranosida : gen penyandi enzim κ-Carrageenase : Luria Bertani + Agar : Luria Bertani : multiple cloning site : messenger RNA : polymerase chain reaction : Provasoli enriched seawater (media kultur alga) : sistem plasmid di Agrobacterium tumefaciens untuk mentransfer segmen T-DNA yang membawa gen ke inang pMSH : vektor/plasmid biner pMSH : quantitative real time- PCR q-PCR RNA : ribonucleic acid RT-PCR : reverse transcription-PCR Sel kompoten : sel yang tingkat permeabilitas membran selnya telah mampu dilewati plasmid DNA SOD : superoxide dismutase T-DNA : transfer-DNA/deoxyribonucleic acid TFB : transformation buffer TPM : tri-parental mating Transformasi : proses introduksi gen asing yang menyandikan karakter tertentu ke inang Transgenik : Inang hasil rekayasa yang telah tersisipi gen asing

1 PENDAHULUAN UMUM 1.1 Latar Belakang Kappaphycus alvarezii adalah salah satu spesies rumput laut dari kelompok alga merah Rhodophyceae (Neish 2005b), yang mempunyai nilai ekonomis tinggi dengan produk hidrokoloid kappa karagenan (κ-karagenan). Karagenan merupakan bahan yang memiliki aplikasi sangat luas (McHugh 2003) baik pada industri farmasi, kosmetika, makanan, minuman, cat, industri tekstil, industri pesawat terbang, atau dapat digunakan untuk menghasilkan sekitar 500 jenis produk akhir (end products) (DPDPB-KKP 2011). Kompleksitas nilai guna rumput laut yang begitu besar sebagai penunjang kebutuhan hidup masyarakat dunia membuat rumput laut saat ini menjadi komoditas yang prospektif dan telah menjadi bagian dari kebutuhan global. Pertumbuhan penduduk dunia yang semakin pesat, akan diiringi oleh semakin tingginya tuntutan kebutuhan hidup masyarakat, sehingga kebutuhan karagenan diprediksi akan mengalami kenaikan secara signifikan. Upaya-upaya peningkatan produksi karagenan dari rumput laut, yang selama ini telah dilakukan pemerintah antara lain melalui kebijakan: intensifikasi (perbaikan teknologi budidaya), ekstensifikasi (perluasan areal budidaya), dan diversifikasi spesies (pengembangan spesies rumput laut lainnya penghasil karagenan selain K. alvarezii) (DPDPB-KKP 2011). Selain itu, peningkatan produksi karagenan juga dapat dilakukan dengan perbaikan mutu genetik rumput laut, seperti: kegiatan seleksi klon, hibridisasi somatik dan zigotik, ataupun rekayasa genetik dengan transgenesis (Yuwono 2006 ; Nasir 2002). Teknologi transgenesis merupakan terobosan teknis dalam pemuliaan karena dilakukan pada level molekul DNA. Modifikasi genetik pada genom inang dilakukan secara terarah dengan melakukan penyisipan gen asing yang menyandikan karakter tertentu dan dapat memprediksi sifat-sifat baru yang akan muncul pada inang hasil rekayasa (Yuwono 2006). Transfer gen asing ke inang dengan cara memasukkan DNA asing ke dalam nukleus sel target dan menggabungkannya ke genom inang. Transformasi karakter-karakter genetik baru atau over-ekspresi ke suatu individu diharapkan dapat diwariskan ke keturunannya (Lutz 2001). Aplikasi teknologi transfer gen atau transgenesis telah banyak dilakukan pada berbagai spesies ikan dengan tujuan seperti peningkatan pertumbuhan (Devlin et al. 2004 ; Kobayashi et al. 2007), resistensi penyakit (Dunham et al. 2002) dan daya tahan terhadap kondisi lingkungan ekstrim (Wang et al. 1995; Wu et al. 1998), sedangkan aplikasi transgenesis pada rumput laut (alga) juga sudah mulai dikembangkan dan telah memperlihatkan potensi yang besar di masa mendatang (Hallmann 2007; Walker et al. 2005), misalnya dalam rangka peningkatan kandungan karagenan, ketahanan pada lingkungan yang ekstrim dan peningkatan resistensi terhadap penyakit. Potvin & Zhang (2010) juga menyebutkan tentang prospek rekombinan protein pada mikroalga transgenik. Beberapa penelitian transgenik pada alga dan rumput laut yang telah berhasil dilakukan, antara lain: pengujian ekspresi gen marka β-glucuronidase (GUS) pada Laminaria japonica (Li et al. 2009); gen LacZ pada Gracillaria (Huddy et al. 2012). Uji ekspresi gen-gen ketahanan pada kecaman lingkungan,

2

seperti: gen isoenzim superoxide dismutase (SOD) pada Haematococcus pluvialis Chlorophyceae (Wang et al. 2011); gen manganese SOD dari dua strains Gracilaria lemaneiformis Gracilariaceae-Rhodophyta (Lu et al. 2012). Pada K. alvarezii telah sukses dilakukan transfomasi gen green fluorescent protein (GFP) menggunakan promoter berbeda (Rajamuddin et al. 2014); gen LacZ (Wang et al. 2010); gen PaCS (penyandi sitrat sintase) (Daud et al. 2013); gen lisozim-c (Handayani et al. 2014); dan gen metallothionein tipe II (Fajriah et al. 2014). Hingga saat ini belum ada penelitian yang terkait transformasi genetik rumput laut K. alvarezii menggunakan gen κ-Carrageenase, sehingga penelitian ini bertujuan mentransformasi gen yang menyandikan protein enzim κCarrageenase ke K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Gen ini berperan sebagai regulator dalam sintesis κ-karagenan dalam tubuh K. alvarezii. Rumput laut K. alvarezii hasil transformasi diharapkan dapat mengekspresikan gen κ-Carrageenase (over ekspresi), dalam rangka perakitan rumput laut K. alvarezii yang memiliki kandungan κ-karagenan lebih tinggi. 1.2 Perumusan Masalah Kebutuhan bahan baku karagenan dari rumput laut K. alvarezii, dalam negeri maupun ekspor terus meningkat seiring berkembangnya konsumsi masyarakat dunia yang sumbernya dari produk olahan karagenan dan derivatnya seperti fungsi emulsifier, pensuspensi, pengental pada industri: makanan, minuman, pembuatan kertas, serta kosmetik dan farmasi (obat-obatan). Upaya peningkatan produksi karagenan telah banyak dilakukan, diantaranya: penambahan luasan areal budidaya, perbaikan teknologi budidaya, dan diversifikasi spesies. Karakteristik budidaya rumput laut K. alvarezii di perairan pantai yang sepenuhnya bergantung pada kondisi perairan (water base culture), menyebabkan sangat kecil kemungkinan untuk dilakukan intervensi lingkungan seperti pemberian pupuk dalam upaya peningkatan produksi budidaya, ataupun pengobatan dalam rangka pengendalian penyakit. Dengan karakter budidaya rumput laut K. alvarezii tersebut, sehingga salah satu upaya alternatif yang efektif untuk peningkatan produksi karagenan adalah melalui rekayasa genetik dengan transgenesis. Peningkatan mutu genetik dengan transgenesis memiliki keutamaan, diantaranya: dapat dilakukan secara terarah (menyisipkan gen penyandi dan menghasilkan karakter yang diinginkan), dan sekali sukses terintegrasi ke genom inang, maka karakter tersebut dapat diwariskan ke keturunannya. Pada penelitian ini dilakukan transformasi gen penyandi protein enzim κ-Carrageenase ke genom K. alvarezii. Gen ini berperan pada mekanisme sintesis κ-karagenan dalam tubuh rumput laut K. alvarezii, sehingga diharapkan K. alvarezii hasil transformasi mempunyai karakter kandungan κ-karagenan yang lebih tinggi (ekspresi berlebih).

3

1.3

Hipotesis

a. Gen κ-Carrageenase dapat ditransformasi ke rumput laut K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. b. Rumput laut K. alvarezii hasil transformasi, dapat mengekspresikan gen κ-Carrageenase. 1.4 Tujuan Penelitian Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan rumput laut Kappaphycus alvarezii yang mengekspresikan gen penyandi enzim κ-Carrageenase, dalam rangka perakitan rumput laut K. alvarezii dengan karakter kandungan karagenan lebih tinggi. Penelitian ini terdiri atas tiga tahap, dengan masing-masing tujuan sebagai berikut : a. Menghasilkan vektor kloning dan vektor ekspresi untuk transformasi gen κ-Carrageenase ke rumput laut K. alvarezii. K. alvarezii transgenik mengandung gen b. Menghasilkan rumput laut κ-Carrageenase c. Menganalisis tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii transgenik yang dipelihara lebih lanjut. 1.5 Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat menyediakan rumput laut K. alvarezii yang mempunyai karakter kandungan karagenan tinggi. Rumput laut hasil transformasi ini diharapkan menjadi salah satu alternatif efektif dalam rangka peningkatan produksi karagenan dari rumput laut K. alvarezii. Hasil penelitian ini juga diharapkan menjadi acuan dan referensi dalam mentransformasikan gen target yang menyandikan karakter lainnya ke rumput laut K. alvarezii, seperti: gen ketahanan terhadap penyakit, gen ketahanan dari kondisi lingkungan yang ekstrim, ataupun gen pertumbuhan cepat, pada penelitianpenelitian berikutnya. 1.6 Ruang Lingkup Penelitian Upaya sistematis produksi rumput laut Kappaphycus alvarezii kandungan karagenan tinggi, melalui penggunaan teknologi transgenesis maka dirancang desain penelitian dengan tahapan kegiatan seperti pada Gambar 1.

4

Gambar 1 Kerangka alir penelitian transformasi gen Kappa(κ)-Carrageenase pada rumput laut Kappaphycus alvarezii 1.7 Kebaruan Penelitian (Novelty) Menghasilkan plasmid biner pMSH/κ-Carrageenase dan rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik yang mengekspresikan gen κ-Carrageenase dalam rangka perakitan rumput laut Kappaphycus alvarezii yang kandungan κkaragenannya lebih tinggi.

2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Biologi Rumput Laut Kappaphycus alvarezii Rumput laut tergolong tanaman tingkat rendah, umumnya di alam tumbuh melekat pada substrat tertentu seperti karang, lumpur, pasir, batu, benda keras lainnya ataupun dapat melekat pada tumbuhan lain secara epifitik. Tanaman ini tidak mempunyai akar, batang maupun daun sejati tetapi hanya menyerupai batang yang disebut talus (Neish 2005b). Untuk pertumbuhannya, rumput laut mengambil nutrisi dari sekitarnya secara difusi melalui dinding talusnya (Neish 2005b). Secara taksonomi rumput laut dikelompokkan ke dalam divisio Thallophyta (Rhodophyta). Berdasarkan kandungan pigmennya, Kappaphycus alvarezii dikelompokkan dalam kelas Rhodophyceae (ganggang merah), bangsa Gigartinales, suku Solierisceae, marga Eucheuma (Neish 2005a). Kappaphycus alvarezii atau Eucheuma cottonii tergolong penghasil karagenan tipe kappa (kappa-karagenan mempunyai sifat gel yang kuat atau rigid), dari dasar ini sehingga para ahli taksonomi dan klasifikasi sepakat merubah nama spesiesnya menjadi Kappaphycus alvarezii.

Gambar 2 Morfologi dan warna talus Kappaphycus alvarezii: coklat (A), coklat kemerahan (B), dan hijau (C) Ciri-ciri K. alvarezii yaitu talus silindris, permukaan licin, cartilageneus menyerupai tulang rawan muda, serta berwarna hijau terang, hijau olive dan coklat kemerahan (Gambar 2). Warna talus tidak menjadi pedoman utama dalam klasifikasi dan pengenalan jenis, karena tidak stabil dan sangat dipengaruhi oleh substrat dan lingkungan perairan di mana rumput laut tumbuh dan dibudidayakan (Sukardi et al. 2005). Percabangan talus berujung runcing atau tumpul, ditumbuhi nodulus (tonjolan), dan duri lunak atau tumpul untuk melindungi gametangia. Percabangan bersifat alternatus (berseling), tidak teratur serta dapat bersifat dichotomus (percabangan dua-dua) atau trichotomus (sistem percabangan tigatiga). Umumnya perkembangbiakan dan perbanyakan K. alvarezii dilakukan masyarakat pembudidaya secara vegetatif dengan cara stek yaitu potongan talus yang kemudian tumbuh menjadi tanaman baru (Neish 2005a). 2.2 Karagenan pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii Eucheuma sp termasuk K. alvarezii menghasilkan metabolit primer senyawa hidrokoloid yang disebut karagenan (carrageenan) sehingga disebut pula rumput laut carrageenophyte (karagenofit). Karagenan merupakan nama yang diberikan

6

untuk keluarga polisakarida linear yang diperoleh dari rumput laut merah dan penting untuk pangan. Dalam bidang industri, tepung karagenan berfungsi sebagai stabilisator (pengatur keseimbangan), thickener (bahan pengental), pembentuk gel dan lain-lain. Karagenan merupakan getah rumput laut yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan menggunakan air panas atau larutan alkali pada suhu tinggi (Glicksman 1983). Karagenan hasil ekstraksi dapat diperoleh melalui pengendapan dengan alkohol: methanol, etanol dan isopropanol (Winarno 1996). Karagenan di dalam talus Eucheuma terdapat pada dinding sel. Dinding sel alga merah tersusun atas dua lapisan, yaitu lapisan dalam dan lapisan luar. Lapisan dalam yang lebih keras banyak mengandung selulosa, sedangkan lapisan luar terdiri atas substansi pektik yang mengandung agar dan karagenan. Karagenan adalah galaktan tersulfatasi linear hidrofilik. Galaktan tersulfatasi ini diklasifikasi menurut adanya unit 3,6-anhydro D-galactose (DA) dan posisi gugus sulfat (Campo et al. 2009). Selain galaktosa dan sulfat, beberapa karbohidrat juga ditemui, seperti xylose, glucose, uronic acids, dan substituen seperti methyl esters dan grup pyruvate (Van de Velde 2002). Karagenan merupakan senyawa hidrokoloid yang terdiri atas ester kalium, natrium, magnesium, dan kalium sulfat dengan galaktosa 3,6 anhidrogalaktosa kopolimer. Karagenan adalah suatu bentuk polisakarida linear dengan berat molekul lebih dari 100 kDa (Winarno 1996). Karagenan tersusun dari perulangan unit-unit galaktosa dan 3,6-anhidro galaktosa (3,6-AG). Keduanya baik yang berikatan dengan sulfat atau tidak, dihubungkan dengan ikatan glikosidik α–1,3 dan β-1,4 secara bergantian (Villanueva & Montaño 2003). Didasarkan pada stereotipe struktur molekul dan posisi ion sulfatnya, karagenan dibedakan menjadi tiga macam, yaitu: kappa, iota dan lambda karagenan (Gambar 3). Ketiganya berbeda dalam sifat gel dan reaksinya terhadap protein (Villanueva & Montaño 2003). Pembentukan DA atau pengurangan sulfat merupakan reaksi penting dan dikenal sebagai reaksi karagenan serta digunakan untuk meningkatkan sifat gelasi (Campo et al. 2009). Jenis karagenan yang berbeda ini diperoleh dari spesies Rhodophyta yang berbeda. Menurut Glicksman (1983), terdapat tiga fraksi karagenan yang bernilai penting, yaitu kappa, iota dan lambda, serta empat fraksi yang kurang penting yaitu mu, nu, theta dan xi. Karagenan mu adalah prekursor karagenan kappa, sedangkan karagenan nu adalah prekursor karagenan iota (Campo et al. 2009).

Gambar 3 Perbedaan stereotipe struktur molekul dan posisi ion sulfat dari tiga tipe karagenan (Campo et al. 2009) Karagenan berdasarkan kandungan sulfatnya terbagi menjadi dua fraksi, yaitu kappa karagenan yang mengandung sulfat kurang dari 28% dan iota karagenan jika lebih dari 30% (Doty 1987). Winarno (1996) menyatakan bahwa

7

kappa karagenan dihasilkan dari rumput laut jenis cottonii, iota karagenan dihasilkan dari Eucheuma spinosum, sedangkan lambda karagenan dari Chondrus crispus. Kappa karagenan tersusun dari α(1,3)-D-galaktosa-4-sulfat dan β(1,4)-3,6anhidro-D-galaktosa. Karagenan juga mengandung D-galaktosa-6-sulfat ester dan 3,6-anhidro-D-galaktosa-2-sulfat ester. Iota karagenan ditandai dengan adanya 4sulfat ester pada setiap residu D-glukosa dan gugus 2-sulfat ester pada setiap gugus 3,6-anhidro-D-galaktosa. Lambda karagenan berbeda dengan kappa dan iota karagenan, karena memiliki residu disulfat β(1-4) D-galaktosa, sedangkan kappa dan iota karagenan selalu memiliki gugus 4-fosfat ester (Winarno 1996). Secara alami, dalam tubuh rumput laut, jenis karagenan kappa dibentuk secara enzimatis dari prekursornya oleh enzim sulfohydrolase κ-Carrageenase. Karagenan mu adalah prekursor dari kappa-karagenan (Gambar 4).

Gambar 4 Struktur kimia dan pembentukan kappa-karagenan dari bentuk sebelumnya mu-karagenan, oleh enzim sulfohydrolase κ-Carrageenase (Meta Cyc Pathway: carrageenan biosynthesis 2015) Menurut Doty (1987), rumput laut yang dihasilkan di Indonesia sampai saat ini masih tergolong berkualitas rendah dilihat dari indeks nilainya. Rumput laut standar, memiliki clean anhydrous carrageenan yield (CAY) atau kandungan karagenan dalam rumput laut bersih dan kering, sebesar 40% sedangkan rumput laut berkualitas rendah memiliki CAY sebesar 30%. 2.3 Teknologi Transgenesis Bidang bioteknologi yang sedang mengalami kemajuan luar biasa, kemudian menawarkan solusi modern yaitu ”rekayasa genetika”. Melalui teknik rekayasa genetika dimungkinkan untuk merancang sifat-sifat genetis mahluk hidup versi baru dengan karakteristik yang diinginkan, kombinasi ataupun penggabungan gen antar spesies yang satu dengan spesies yang lain (meskipun berbeda kingdom sekalipun) jelas dimungkinkan. Teknologi transgenesis adalah teknologi rekayasa gen dengan mentransformasikan satu atau lebih DNA asing ke inang uji dengan tujuan memanipulasi genotipenya ke arah yang lebih baik dan dapat ditransmisikan ke keturunannya (Beaumont et al. 2010). Teknik rekayasa genetika yang dikembangkan pada awalnya dimodifikasi untuk pembawa satu sifat tertentu yang diinginkan seperti toleran terhadap herbisida atau antibiotik atau tahan terhadap hama. Dengan prinsip perekayasaan yang sama, tanaman

8

dapat diskenario untuk mampu menghasilkan bahan pangan yang lebih bergizi sehingga dapat meningkatkan kesehatan manusia. Teknologi transgenesis merupakan suatu proses mentransformasi DNA asing ke organisme lain dengan maksud untuk memanipulasi struktur genetiknya (Glick & Pasternak 2003). Gen yang disisipkan ke dalam genom inang target harus dapat diekspresikan sehingga menghasilkan protein yang diinginkan serta harus stabil diwariskan ke generasi berikutnya. Gen-gen yang diekspresikan pada inang target pada awalnya adalah gen-gen asli dari sumbernya : bakteri, jamur, hewan, namun kebanyakan ekspresi dari gen tersebut di dalam inang sangat rendah. Hal ini antara lain disebabkan oleh penggunaan kodon sinyal peptida yang tidak sesuai. Oleh karena itu modifikasi penggunaan kodon yang sesuai dengan inang target telah umum dilakukan untuk meningkatkan ekspresi gen. Selain itu penambahan enhancer dikombinasikan dengan penggunaan promoter kuat atau promoter spesifik dapat meningkatkan ekspresi gen pada inang. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa apabila gen telah terintegrasi pada genom inang target maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi berikutnya. Aplikasi transgenesis pada rumput laut (makroalga) memperlihatkan potensi besar pada masa mendatang (Hallmann 2007; Walker et al. 2005), misalnya untuk peningkatan ketahanan dari cekaman lingkungan dan resistensi terhadap penyakit. Hingga saat ini penelitian transformasi gen pada makroalga telah berhasil dilakukan, antara lain: Porphyra yezoensis (Cheney et al. 2001) dan Laminaria japonica (Li et al. 2009) menggunakan gen β-glucuronidase (GUS); serta Gracilaria dengan gen LacZ (Huddy et al. 2012). Pada K. alvarezii telah sukses dilakukan transfomasi gen green fluorescent protein (GFP) menggunakan promoter berbeda (Rajamuddin et al. 2014); gen LacZ (Wang et al. 2010); gen PaCS (penyandi sitrat sintase) (Daud et al. 2013); gen lisozim-c (Handayani et al. 2014); dan gen metallothionein tipe II (Fajriah et al. 2014). Potvin dan Zhang (2010) juga menyebutkan tentang prospek rekombinan protein pada mikroalga transgenik, serta beberapa progres transgenik pada alga lainnya. Alga sebagai sumber gen-gen baru, juga telah banyak diteliti yang nantinya akan diaplikasikan untuk kegiatan transgenesis pada alga, seperti isolasi gen antisalt dan anticadmium dari alga hijau laut Chlamydomonas sp (Tanaka et al. 2007). Kloning dan uji ekspresi gen-gen ketahanan dari kecaman lingkungan, seperti gen isoenzim SOD superoxide dismutase pada Haematococcus pluvialis Chlorophyceae (Wang et al. 2011); kloning gen, analisis ekspresi dan aktivitas gen manganese SOD dari dua strains Gracilaria lemaneiformis GracilariaceaeRhodophyta (Lu et al. 2012). 2.4 Transformasi Gen dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens Proses transformasi genetik menggunakan perantara A. tumefaciens dijelaskan pada Gambar 5, pada prinsipnya terdiri 8 tahap utama, yaitu: (1) pengenalan dan pelekatan Agrobacterium pada sel inang, (2) pengindraan sinyal tanaman yang spesifik oleh dua komponen sistem transduksi sinyal pada Agrobacterium yaitu VirA/VirG, (3) aktivasi gen vir yang memulai proses transfer T-DNA, (4) salinan T–DNA yang akan dipindahkan ke inang diproduksi oleh kerja protein VirD1/D2, (5) T-DNA dihantarkan dalam bentuk kompleks VirD2-DNA, bersama-sama dengan beberapa protein vir lainnya ke dalam

9

sitoplasma sel inang, (6) Vir E2 berasosiasi dengan utas T-DNA dan bergerak menuju sitoplasma sel inang, (7) kompleks T-DNA dimasukkan ke dalam inti sel inang melalui proses impor aktif dan (8) di dalam inti, T-DNA dibawa menuju ke titik tempat integrasi DNA pada kromoson, kemudian protein-protein pengawal TDNA terlepas dan DNA akhirnya terintegrasi ke dalam genom inang. Interaksi antara Agrobacterium dan sel inang target didahului dengan mekanisme secara kimiawi di mana sel inang yang luka menghasilkan suatu metabolit yang berperan sebagai isyarat bagi Agrobacterium. Metabolit tersebut dapat berupa senyawa gula, asam, asam amino atau senyawa fenol (Winans 1992). Adanya senyawa tersebut menginduksi Agrobacterium untuk bergerak aktif menuju ke sel sasaran. Gerakan yang bersifat kemotaksis dan untuk memperkuat kontak tersebut Agrobacterium mengeluarkan suatu metabolit yaitu β-1-2-glukan. Beberapa gen dalam kromosom Agrobacterium diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesis berbagai senyawa glukan, yaitu chvA, chvB, dan exoC. Gen lain pada kromosom yang berperan seperti ketiga gen tersebut adalah cel, produk cel berperan penting dalam sintesis senyawa selulosa fibril (Douglas et al. 1985; Gelvin 2000). Induksi faktor virulensi (vir) yang akan mengatur proses pemotongan dan transfer T-DNA ke sel inang target. Beberapa metabolit yang disekresi oleh inang, akan menginduksi faktor virulensi. Metabolit tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringon, koniferil alkohol dan etil piruvat (Winans 1992). Aktivasi gen vir dimulai dengan penerimaan sinyal oleh VirA. VirA merupakan protein sensor trans-membran yang berfungsi mendeteksi molekul sinyal berupa senyawa fenolik seperti asetosiringon. Selain itu, beberapa jenis monosakarida juga berfungsi sebagai sinyal. Deteksi monosakarida dimungkinkan oleh adanya interaksi dan asosiasi antara protein VirA dengan ChvE yang berfungsi sebagai protein pengikat gula (glukosa/galaktosa) pada periplasma (de la Riva et al. 1998). Protein dari VirA ini akan menginduksi VirG melalui fosforilasi, yang selanjutnya VirG akan mengaktifkan ekspresi berbagai Vir lainnya (Winans 1992). Induksi protein-protein Vir dikontrol oleh dua komponen sistem yaitu VirA/G (Rosen & Ron 2011). Protein yang dihasilkan oleh gen Vir berperan untuk memotong dan mentransfer T-DNA ke inang. Proses perpindahan T-DNA ke sel tanaman diawali dengan pemotongan utas T-DNA dari plasmid Ti. Protein VirD1 dan VirD2 yang memiliki aktivitas endonuklease akan mengenali sekuen batas T-DNA dan memotong utas DNA pada posisi tersebut dan melepaskan utas tunggal T-DNA. Setelah pemotongan, protein VirD2 tetap terikat secara kovalen pada ujung 5’ utas T-DNA (batas kanan). Asosiasi VirD2 melindungi T-DNA dari aktivitas eksonuklease pada ujung 5’ T-DNA dan juga berfungsi membedakan ujung 5’ TDNA (batas kanan) sebagai ujung yang akan ditransfer terlebih dahulu ke sel tanaman. Sintesis utas T-DNA dimulai dari batas kanan T-DNA dan berlangsung dalam arah 5’ ke 3’. Kompleks utas tunggal T-DNA-VirD2 diselubungi oleh VirE2. Asosiasi protein ini mencegah serangan nuklease dan berfungsi membentangkan utas kompleks T-DNA sehingga bentuknya menjadi lebih ramping dan mudah melintasi kanal membran (de la Riva et al. 1998). Transpor kompleks T-DNA dan protein Vir lainnya (VirE2 dan VirF), dari Agrobacterium menuju ke sel inang melalui sistem sekresi tipe IV. Sistem sekresi tipe IV adalah kanal penghubung Agrobacterium-inang yang tersusun atas protein

10

VirD4 dan 11 jenis protein VirB (Tzfira & Citovsky 2002; Judd et al. 2005). Protein-protein VirB membentuk kanal membran dan juga berfungsi sebagai ATPase yang menyediakan energi untuk pembentukan kanal maupun proses ekspor T-DNA. VirD4 berperan menunjang interaksi kompleks T-DNA-VirD2 dengan komponen sekresi VirB (Gelvin 2000). VirD2 pada kompleks T-DNA akan mengarahkan pergerakan kompleks menuju ke protein VirD4 pada kanal sekresi dan akhirnya menuju ke sitoplasma sel inang.

Gambar 5 Ilustrasi mekanisme transformasi genetik menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens (Tzfira & Citovsky 2002) Kompleks T-DNA ditargetkan menuju ke nukleus melintasi membran inti. Sinyal lokasi inti atau nuclear location signals (NLS) yang terdapat pada protein VirD2 dan VirE2 mengarahkan kompleks menuju ke inti sel. Protein VirF juga diduga berperan dalam penargetan T-DNA ke nukleus (de la Riva et al. 1998). Penghantaran kompleks T-DNA menuju nukleus dibantu oleh perangkat transpor intraseluler yang dimiliki oleh sel inang. Dynein dan mikrotubula pada sel tanaman target diduga memfasilitasi transpor T-DNA melintasi sitoplasma. Kompleks T-DNA masuk ke dalam inti sel melalui kompleks pori nukleus atau nuclear-pore complex (NPC) (Tzfira & Citovsky 2006). Proses masuknya T-DNA ke dalam inti sel melibatkan kerja sama antara faktor-faktor inang seperti karyopherin α (KAPα) dan protein interaksi VirE2 1 atau VirE2-interacting protein1 (VIP1); dengan faktor-faktor asal bakteri seperti VirD2, VirE2 dan VirE3 (Tzfira et al. 2002). Integrasi T-DNA ke dalam genom inang merupakan tahap paling menentukan dalam transformasi genetik. Mekanisme molekuler yang mendasari integrasi T-DNA masih belum jelas. Integrasi T-DNA diduga terjadi melalui rekombinasi yang difasilitasi oleh perangkat perbaikan DNA sel inang. Utas tunggal T-DNA diubah menjadi molekul intermediat berutas ganda. Molekul intermediat tersebut akan dikenali sebagai fragmen DNA yang putus, dan kemudian akan digabungkan kembali ke dalam genom inang (Tzfira & Citovsky 2006).

11

3 KONSTRUKSI VEKTOR BINER GEN KAPPA(Κ)CARRAGEENASE DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium tumefaciens SEBAGAI MEDIA UNTUK PEMBUATAN RUMPUT LAUT TRANSGENIK ABSTRAK Peningkatan kandungan kappa(κ)-karagenan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii berpotensi dicapai melalui aplikasi teknologi transgenesis. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan konstruksi gen κ-Carrageenase, dan Agrobacterium tumefaciens membawa konstruksi gen tersebut. Gen penyandi enzim κ-Carrageenase (κ-Car) berperan dalam biosintesis κ-karagenan. Sekuen gen κ-Car diligasi antara sekuen promoter 35S CaMV dan terminator Nos untuk menghasilkan vektor ekspresi pMSH/κ-Car. Ekspresi gen κ-Car pada plasmid pMSH/κ-Car diatur oleh promoter 35S CaMV dan terminator Nos. Transformasi plasmid pMSH/κ-Car ke bakteri Escherichia coli dilakukan menggunakan metode heat-shock, sedangkan ke Agrobacterium tumefaciens menggunakan metode triparental mating. Hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa koloni bakteri E. coli dan A. tumefaciens tumbuh pada media selektif yang mengandung antibiotik. Analisis PCR dengan cetakan DNA dari koloni bakteri E. coli dan A. tumefaciens tersebut menggunakan primer 35S-Forward dan tNos-Reverse menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 2.000 bp, sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S CaMV, gen κ-Car, dan terminator tNos. Hal tersebut menunjukkan bahwa konstruksi pMSH/κ-Car telah berhasil dibuat, dan koloni A. tumefaciens transforman positif membawa plasmid pMSH/κ-Car telah dihasilkan. Kata kunci:

Agrobacterium tumefaciens, transgenesis, vektor

gen

Kappa(κ)-Carrageenase,

BINARY VECTOR CONSTRUCTION OF KAPPA(κ)CARRAGEENASE GENE AND TRANSFORMATION TO Agrobacterium tumefaciens AS MEDIATOR FOR SEAWEED TRANSGENIC GENERATION ABSTRACT Increasing of kappa (κ)-carrageenan content in Kappaphycus alvarezii seaweed is potentially be achieved by applying transgenesis technology. This study was performed to obtain a κ-Carrageenase gene construct and Agrobacterium tumefaciens having those construct. The κ-Carrageenase (κ-Car) gene involves in κ-carrageenan biosynthesis. The κ-Car gene sequence was ligated between the 35S CaMV promoter and tNos terminator sequences to generate pMSH/κ-Car expression vector. Transformation of pMSH/κ-Car plasmid to Escherichia coli was performed by heat-shock method, and to Agrobacterium tumefaciens by triparental mating method. The results showed that several colonies of E. coli and A. tumefaciens were grew in the selective culture medium containing antibiotic. PCR analysis using primers 35S-Forward and tNos-Reverse with DNA template from

12

those bacterial colonies resulted DNA fragment of about 2,000 bp, the same as the total length of 35S CaMV promoter, κ-Car gene and tNos terminator sequences. Thus, the pMSH/κ-Car gene construct succeed to make and A. tumefaciens transformant carrying pMSH/κ-Car plasmid have been produced. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, transgenesis, vector

Kappa(κ)-Carrageenase

gene,

3.1 Pendahuluan Peningkatan kandungan karagenan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii merupakan salah satu target rekayasa gen (transgenesis) yang sangat potensial untuk dilakukan. Hal tersebut dapat dicapai dengan menyisipkan gen κ-Carrageenase penyandi enzim yang terlibat dalam biosintesis karagenan. Aplikasi transgenesis pada rumput laut (alga) memperlihatkan potensi besar pada masa mendatang (Walker et al. 2005; Hallmann 2007; Potvin & Zhang 2010). Beberapa penelitian transgenik pada alga yang telah berhasil dilakukan, antara lain: pengujian ekspresi gen β-glucuronidase (GUS) pada Laminaria japonica (Li et al. 2009), gen LacZ pada Gracilaria (Huddy et al. 2012), gen Sitrat sintase pada K. alvarezii (Daud et al. 2013), gen green fluorescent protein (GFP) pada K. alvarezii (Rajamuddin et al. 2014), gen lisozim pada K. alvarezii (Handayani et al. 2014), dan gen Metallothionein tipe II pada K. alvarezii (Fajriah et al. 2014). Dalam rangka pembuatan rumput laut transgenik, dua tahap awal diperlukan yaitu pembuatan vektor ekspresi gen dan penyediaan bakteri transforman sebagai kendaraan/biotransport (Muladno 2002). Terkait dengan biosintesis kappakaragenan, telah tersedia informasi sekuen gen penyandi enzim kappa (κ)Carrageenase (κ-Car). Gen penyandi enzim κ-Car mengonversi µ-karagenan menjadi κ-karagenan dalam tubuh K. alvarezii (Campo et al. 2009). Pembuatan sekuen gen secara sintetis in vitro dan pembuatan vektor ekspresi telah dapat dilakukan menggunakan metode molekuler. Selanjutnya, teknik penyediaan bakteri A. tumefaciens transforman dengan metode tri-parental mating/TPM (Bevan, 1984) juga sudah dikembangkan untuk kebutuhan pembuatan rumput laut transgenik. Tiga jenis bakteri diperlukan, yaitu Escherichia coli DH5α sebagai vektor kloning dan donor, E.coli DH1 (pRK2013) sebagai helper, dan A. tumefaciens LBA4404 sebagai resipien dalam proses TPM. Agrobacterium tumefaciens sebagai agen transformasi, telah digunakan pada proses transformasi gen pada makroalga laut Porphyra yezoensis (Rhodopiceae) (Cheney et al. 2001; Bernasconi et al. 2004), pada K. alvarezii (Daud et al. 2013; Handayani et al. 2014; Fajriah et al. 2014), mikroalga Haematococcus pluvialis (Kathiresan et al. 2009), mikroalga laut Schizochytrium (Cheng et al. 2012), dan fungi perairan Blastocladiella emersonii (Vieira & Camilo 2011). Hingga saat ini belum ada K. alvarezii transgenik yang mengekspresikan gen κ-Car. Dalam rangka pembuatan K. alvarezii transgenik tersebut yang mampu menyintesis banyak kappa-karagenan, sebagai tahap awal diperlukan vektor ekspresi dan biotranspor yang membawa vektor ekspresi tersebut. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan konstruksi gen κ-Car dan bakteri A. tumefaciens yang membawa konstruksi gen tersebut.

13

3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biorin, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor (IPB), mulai Februari 2013 sampai Juni 2013. 3.2.2 Sekuen dan Sumber Gen κ-Carrageenase Gen κ-Carrageenase (κ-Car) yang digunakan pada penelitian ini, disintesis secara in vitro menggunakan jasa Genetika Science (1st BASE Pte Ltd. Singapore) berdasarkan sekuen gen κ-Carrageenase yang berasal dari Pseudoalteromonas (Zhou et al. 2008) yang ada di bank gen. Sekuen gen κ-Car disisipkan sementara pada vektor kloning pJET1.2 (Gambar 6) sebelum digunakan lebih lanjut.

Gambar 6 Sekuen gen κ-Carrageenase berukuran sekitar 1.300 bp; highlight warna hijau: start codon; warna kuning: stop codon (B), diligasi ke vektor kloning pJET1.2 (A) menghasilkan plasmid pJET1.2-EmblcdsCarrageenase dengan ukuran total 4.168 bp 3.2.3 Pembuatan Vektor Ekspresi pMSH/κ-Car Sekuen gen κ-Car dari plasmid pJET1.2 dikonstruksi ke vektor ekspresi plasmid biner pMSH (Nara Institute of Science and Technology/NAIST, Japan), dan hasil ligasi disebut pMSH/κ-Car. Plasmid biner pMSH sudah umum digunakan sebagai vektor DNA plasmid pada transgenesis yang dimediasi Agrobacterium tumefaciens. Sekuen gen κ-Car disisipkan pada daerah multiple cloning site (MCS) pada plasmid pMSH (Gambar 7). Selanjutnya plasmid pMSH/κ-Car ditransformasikan ke sel kompoten Escherichia coli untuk perbanyakan plasmid.

14

Gambar 7 Peta plasmid pMSH (NAIST, Japan) (A) dan posisi insersi gen κCarrageenase (κ-Car) di daerah MCS plasmid pMSH, RB: right border, pNos: promoter Nos, NPT II: gen marka seleksi neomycin phosphotransferase II, T: terminator Nos, HPT: gen marka seleksi hygromycin phosphotransferase, p35S: promoter 35S CaMV, MCS: multiple cloning site, LB: left border 3.2.4 Transformasi pMSH/κ-Car ke Escherichia coli DH5α Transformasi pMSH/κ-Car ke bakteri E. coli DH5α menggunakan metode heat-shock dan identifikasi koloni transforman (Sambrook et al. 1989 dengan beberapa modifikasi Suharsono et al. 2002). Pembuatan Sel E. coli DH5α Kompeten Sebuah koloni bakteri E. coli DH5α diambil dari biakan murni dan dikultur dalam 2 mL media cair Luria Bertani dalam tabung reaksi (LB: 1% tripton; 0,5% ekstrak khamir; dan 1% NaCl), sebagai sub kultur. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam pada shaker inkubator kecepatan 180 rpm. Hasil kultur segar bakteri diletakkan di atas es selama 30 menit. Sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan transformation buffer (TFB) CaCl2 sebanyak 495 µL (0,33% dari volume 1,5 mL) dan diresuspensi, kemudian diletakkan di atas es selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan dengan TFB sebanyak 125 µL (0,08% dari volume 1,5 mL) dan antioksidan dimethyl sulfo oxide (DMSO) sebanyak 8,8 µL (7,8% dari volume 1,5 mL), kemudian diletakkan di atas es selama 10 menit. Bakteri yang telah kompeten siap digunakan untuk transformasi. Transformasi Transformasi pMSH/κ-Car ke bakteri E. coli DH5α dilakukan dengan cara 50 μL sel bakteri kompeten yang telah dibuat sebelumnya, dicampurkan dengan 5 μL plasmid pMSH/κ-Car ke dalam tabung mikro, selanjutnya diinkubasi dalam es selama 20-30 menit. Campuran tersebut diberi kejutan panas (heat-shock) untuk membuka pori sel bakteri, pada suhu 42 oC selama 45 detik, kemudian diletakkan dalam es selama 5 menit. Hasil kejutan panas ditambahkan 100 μL media LB, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC pada shaker inkubator dengan kecepatan 200 rpm selama 30-60 menit. Analisis Transforman E. coli DH5α Analisis keberhasilan transformasi pMSH/κ-Car ke E coli DH5α dilakukan dengan pengujian pada media selektif dan analisis PCR koloni E coli DH5α hasil transformasi. Pengujian pada media selektif dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri E coli DH5α hasil transformasi pada media Luria Bertani Agar (LA: 1% tripton; 0,5% ekstrak khamir; 1% NaCl, dan bacto agar 2,5%) yang mengandung

15

antibiotik kanamisin dan higromisin, masing-masing 50 mg/L. Bakteri yang tumbuh pada media tersebut merupakan kandidat transforman. Analisis PCR dilakukan untuk meyakinkan koloni bakteri yang merupakan transforman. PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F: 5’-ATG GCT GGA GTA TTA GCT GGG-3’ dan tNos-R: 5’-CTC ATA AAT AAC GTC ATG CAT TAC A-3’ (Hannum 2012). Cetakan DNA yang digunakan adalah koloni transforman yang dilarutkan ddH2O sebanyak 10 µL. Program PCR yang digunakan adalah pradenaturasi pada suhu 95 °C selama 5 menit, 30 siklus amplifikasi yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 °C selama 30 detik, annealing pada suhu 56 °C selama 1 menit, dan extention pada suhu 72 °C selama 2 menit, serta final extention pada suhu 72 °C selama 5 menit dan pendinginan pada 20 °C selama 10 menit. Sebanyak 10 μl produk PCR diseparasi dengan elektroforesis 100 V selama 30 menit pada 1% agarose dalam TAE 1x (stok TAE 50x terdiri dari: 4,84 g Tris base, 1,14 mL Acetic acid glacial, 2 mL EDTA pH 8 0,5 M, 800 mL ddH2O). Hasil elektroforesis divisualisasi dengan gel documentation system-UV transilluminator. Sampel koloni sebagai cetakan DNA juga digoreskan ke dalam master plate, yang merupakan sumber koloni bakteri untuk tahap penelitian berikutnya. Master plate berisi koloni bakteri E. coli DH5α transforman, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 8 jam. 3.2.5 Transformasi pMSH/κ-Car ke Agrobacterium tumefaciens Plasmid pMSH/κ-Car selanjutnya ditransformasi ke A. tumefaciens menggunakan metode tri-parental mating (TPM) mengacu pada metode Bevan (1984) dengan beberapa modifikasi Liberty et al. (2008) dan Handayani et al. (2014). Proses transformasi menggunakan prinsip konjugasi melibatkan tiga macam bakteri, yakni E. coli DH5α sebagai donor pembawa plasmid pMSH/κCar, bakteri E. coli DH1 (pRK2013) sebagai helper, dan A. tumefaciens LBA4404 sebagai resipien. Bakteri E. coli DH5α tahan terhadap antibiotik kanamisinR dan higromisinR, E.coli DH1 tahan kanamisinR, dan A. tumefaciens LBA4404 tahan terhadap streptomisinR. Ketiga bakteri ini disegarkan terlebih dahulu dengan mengkultur pada media LB yang ditambahkan antibiotik sesuai marka seleksinya, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam (E. coli DH5α dan E. coli DH1) dan A. tumefaciens pada suhu 30 oC selama 32 jam. Hasil kultur segar ditumbuhkan masing-masing sebanyak 20 μl pada media LA secara sendiri-sendiri (tunggal) sebagai kontrol positif dan secara mix (gabungan ketiganya) untuk proses konjugasi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 oC selama 32 jam. Pembuktian keberhasilan transformasi pMSH/κ-Car ke A. tumefaciens hasil konjugasi TPM, dilakukan menggunakan uji pada media selektif dan analisis PCR terhadap koloni transforman. Pada uji media selektif, koloni dari kultur tunggal (kontrol positif) maupun kultur mix (hasil konjugasi), diambil satu gores dan dilarutkan dengan 1 ml LB, kemudian ditumbuhkan pada media LA yang ditambahkan antibiotik marka seleksi kanamisin, higromisin dan streptomisin. Biakan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 32 jam. Pada analisis PCR, dilakukan sama seperti pada uji koloni E. coli transforman.

16

3.2.6 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase Pengurutan DNA gen κ-Carrageenase (κ-Car) terhadap produk PCR dilakukan dengan menggunakan automatic DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, USA). Analisis kesejajaran gen κ-Car dengan database gen di gen bank dilakukan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Vektor Ekspresi pMSH/κ-Car Gen κ-Carrageenase (sekitar1300 bp) tersisip pada situs NotI dan SpeI di daerah MCS pada vektor pMSH yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (sekitar 300 bp) di bagian depan dan terminator Nos (tNos; sekitar 400 bp) di bagian left border, sehingga total ukuran dari promoter 35S, gen κ-Car, sampai dengan tNos adalah sekitar 2.000 bp (Gambar 8).

Gambar 8 Peta plasmid pMSH/κ-Car: gen κ-Carrageenase (κ-Car) tersisip pada situs NotI dan SpeI di daerah multiple cloning site (MCS) pada vektor pMSH. Panjang total sekuen dari p35S hingga terminator Nos pada plasmid pMSH/κ-Car adalah 2.000 bp 3.3.2 Identifikasi Transforman Escherichia coli DH5α Koloni bakteri E. coli DH5α hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media selektif ditunjukkan pada Gambar 9A, E. coli DH5α yang bukan hasil transformasi pada Gambar 9B, sedangkan E. coli DH5α yang ditumbuhkan pada media tanpa antibiotik ditunjukkan pada Gambar 9C. Kemampuan koloni bakteri E. coli DH5α hasil transformasi untuk tumbuh pada media selektif menunjukkan bahwa bakteri tersebut mengandung pMSH/κ-Car atau disebut sebagai bakteri E. coli DH5α transforman. Bakteri transforman dapat hidup pada media selektif karena plasmid pMSH/κ-Car mengandung gen neomycin phosphotransferase II (NPT II) penyandi resistensi terhadap kanamisin, dan hygromycin phosphotransferase (HPT) penyandi resistensi higromisin. Sebaliknya, E. coli DH5α yang bukan transforman, tidak dapat tumbuh pada media selektif (Gambar 9B). Hal tersebut sejalan dengan Muladno (2002), Tsen et al. (2002), dan Tu et al. (2005) bahwa apabila sel bakteri membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan

17

gen insersi) ditumbuhkan pada media dengan antibiotik marka seleksi, maka sel E. coli DH5α akan mampu berkembang biak membentuk koloni. Sebaliknya jika sel E. coli DH5α tidak membawa plasmid gen insersi, akan mati pada media dengan antibiotik

Gambar 9 Koloni bakteri Escherichia coli DH5α pada uji media selektif. Kolonikoloni transforman ditunjukkan dengan tanda panah, dapat tumbuh pada media selektif (A), koloni E. coli DH5α tanpa transformasi, tidak dapat tumbuh, sebagai kontrol negatif (B), dan koloni E. coli pada media LA tanpa antibiotik marka seleksi, sebagai kontrol positif (C) Hasil verifikasi transforman lebih lanjut dengan analisis PCR menggunakan pasangan primer 35S-Forward dan tNos-Reverse disajikan pada Gambar 10. Lima sampel koloni E. coli DH5α transforman (Gambar 10A) menghasilkan amplikon dengan posisi fragmen sekitar 2.000 bp (Gambar 10B). Fragmen tersebut sesuai dengan total ukuran sekuen promoter 35S CaMVsampai dengan terminator Nos (Gambar 8). Hal tersebut juga menunjukkan bahwa proses ligasi gen κ-Car ke plasmid pMSH, dan proses transformasi pMSH/κ-Car ke bakteri E. coli DH5α berhasil dilakukan.

Gambar 10 Master plate (replika) koloni Escherichia coli DH5α transforman (A), elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer 35S-F dan tNnos-R menghasilkan fragmen sekitar 2.000 bp (kepala panah) (B), M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif, E1-E5: koloni bakteri E. coli DH5α hasil transformasi

18

Setelah proses transformasi, berlangsung integrasi plasmid rekombinan di dalam sel inang bakteri Escherichia coli DH5α, selanjutnya plasmid target bereplikasi seiring replikasi sel E. coli DH5α. Vektor bereplikasi menghasilkan banyak salinan atau turunan yang identik dan pada proses yang sama selain vektor menggandakan diri juga menggandakan plasmid gen yang dibawanya. 3.3.3 Identifikasi Agrobacterium tumefaciens Transforman Uji keberhasilan konjugasi dengan metode tri-parental mating (TPM) untuk transformasi pMSH/κ-Car ke Agrobacterium tumefaciens ditunjukkan pada Gambar 11. Pada kultur tunggal, ketiga bakteri tidak tumbuh (Gambar 11B), sedangkan bakteri A. tumefaciens yang dikonjugasi dan diinkubasi pada media selektif berhasil tumbuh (Gambar 11A).

Gambar 11 Koloni A. tumefaciens transforman hasil konjugasi dapat tumbuh pada media selektif (tanda panah) yang mengindikasikan proses triparental mating/TPM berhasil dilakukan (A), sedangkan kultur tunggal masing-masing: Escherichia coli DH5α/donor (1), E. coli DH1 (pRK2013)/helper (2), Agrobacterium tumefaciens/resipien (3) tidak tumbuh pada media selektif, sebagai kontrol negatif (B) Agrobacterium tumefaciens transforman mampu tumbuh di media selektif yang ditambahkan antibiotik marka seleksi (kanamisin, higromisin dan streptomisin), karena selain memiliki gen marka seleksi sendiri (streptomisin), juga telah membawa gen marka seleksi kanamisin dan higromisin yang terdapat pada konstruksi pMSH/κ-Car. Sementara kultur tunggal (donor, helper dan resipien) tidak dapat tumbuh, karena donor E. coli DH5α maupun helper E. coli DH1 (pRK2013) hanya membawa gen marka seleksi kanamisin dan higromisin saja, tetapi tidak membawa marka seleksi streptomisin. Demikian juga resipien A. tumefaciens (sebelum konjugasi) yang hanya membawa marka seleksi streptomisin tetapi tidak membawa marka seleksi kanamisin dan higromisin. Bakteri yang mampu tumbuh pada media selektif, hanya A. tumefaciens hasil konjugasi yang telah mengandung gen insersi (Wise et al. 2006), dalam hal ini plasmid pMSH/κ-Car. Dengan demikian, hasil tersebut menunjukkan bahwa proses transformasi pMSH/κ-Car ke A. tumefaciens telah berhasil dilakukan.

19

Gambar 12 Master plate (replika) koloni A. tumefaciens transforman (A), dan elektroforegram amplikon PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan fragmen berukuran sekitar 2.000 bp (B). Tanda kepala panah di sebelah kanan Gambar 12B menunjukkan ukuran produk amplikon PCR, M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH/κ-Kar sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif Hasil analisis PCR disajikan pada Gambar 12B, dengan cetakan DNA dari koloni A. tumefaciens yang tumbuh pada media selektif (Gambar 12A). Produk PCR dengan primer 35S-F dan tNos-R (2.000 bp, Gambar 12B), sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S, gen κ-Car, dan tNos (Gambar 8). Hasil ini mendukung hasil identifikasi transforman melalui uji pada media selektif. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa proses transformasi konstruksi gen pMSH/κCar berhasil dilakukan ke A. tumefaciens. Mekanisme konjugasi bakteri donor dan resipien pada proses TPM dimulai dengan sel donor memproduksi pilus, kemudian penempelan pilus ke sel resipien dan membawa dua sel secara bersamaan. Perpindahan plasmid berlangsung setelah pemotongan oleh enzim endonuklease menjadi untai tunggal dan selanjutnya ditansfer ke sel resepien. Kedua sel menyintesis dan melengkapi untai tunggal menjadi untai ganda membentuk plasmid sirkular kembali dan juga memproduksi pili, akhirnya kedua sel menjadi donor yang viabel (Clewell 1993, Liberty et al. 2008). 3.3.4 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase Pengurutan DNA dan analisis kesejajaran gen κ-Carrageenase (κ-Car) berdasarkan urutan nukleotida dengan data gen di gene bank dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) menunjukkan bahwa fragmen κ-Car mempunyai kesamaan 76% dengan a carrageenovora genes cgkA and cgkB, dan 76% dengan Pseudoalteromonas tetraodonis cgk-k142a gene for kappa-carrageenase, serta 73% dengan Pseudoalteromonas sp. LL1 kappa-carrageenase gene (Tabel 1). Hasil analisis pensejajaran menunjukkan kesamaan sekuen (73-76%) fragmen gen κ-Carrageenase produk PCR dengan urutan nukleotida gen κCarrageenase yang telah diisolasi dari sumber lainnya yang ada di bank gen. Hasil ini juga menguatkan bahwa fragmen κ-Carrageenase yang ditransformasi ke vektor adalah sesuai yang diharapkan.

20

Tabel 1 Analisis kesejajaran fragmen menggunakan program BLAST

nukleotida

gen

Aksesi

Deskripsi

Skor

1

X71620.1

608

2

GU38634 2.1

579

90%

3

GU38634 2.1

A carrageenovora genes cgkA and cgkB, partial Pseudoalteromonas tetraodonis cgk-k142a gene for kappa-carrageenase, complete cds Pseudoalteromonas sp. LL1 kappa-carrageenase gene, complete cds

Query cover 94%

281

64%

No

κ-Carrageenase Evalue 5e170 3e161

Kesamaan 76%

1e-71

73%

76%

Bakteri A. tumefaciens transforman yang membawa konstruksi pMSH/κ-Car telah siap digunakan untuk perlakuan ke rumput laut Kappaphycus alvarezii atau rumput laut jenis lainnya untuk pembuatan transgenik. Proses transfer gen pada rumput laut K. alvarezii, telah dilakukan dengan menggunakan metode elektroporasi (Rajamuddin et al. 2014), juga telah dapat dilakukan menggunakan metode perantara A. tumefaciens (Daud et al. 2013; Fajriah et al. 2014; Handayani et al. 2014). Sebagai kelanjutan dari tahap ini, dilakukan pembuatan Kappaphycus alvarezii transgenik gen κ-Carrageenase menggunakan metode mediasi A. tumefaciens. Rumput laut yang mengekspresikan gen κ-Carrageenase diharapkan akan memiliki kandungan kappa-karagenan lebih banyak (over-ekspresi) daripada non-transgenik. 3.4 Simpulan Produk PCR dengan cetakan DNA dari Agrobacterium tumefaciens berukuran sekitar 2.000 bp menunjukkan bahwa konstruksi gen pMSH/κ-Car telah berhasil dibuat, dan Agrobacterium tumefaciens yang membawa konstruksi gen tersebut telah berhasil diperoleh.

4 TRANSFORMASI GEN KAPPA(Κ)-CARRAGEENASE PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii ABSTRAK Teknik transformasi gen asing telah diaplikasikan untuk meningkatkan karakter penting pada organisme akuatik. Sebagai langkah awal menuju peningkatan kandungan kappa(κ)-karagenan, dalam penelitian ini gen κ-Carrageenase (κ-Car) ditransformasi ke rumput laut Kappaphycus alvarezii melalui mediasi Agrobacterium tumefaciens. Pada penelitian ini digunakan konstruksi plasmid biner pMSH (pMSH/κ-Car) yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (35S) dan terminator Nos (tNos). Analisis DNA untuk identifikasi K. alvarezii transgenik dilakukan dengan metode PCR menggunakan dua set primer. Hasil pemeliharaan eksplan pascatransformasi menunjukkan bahwa 36% eksplan lulus hidup dan bertunas sebesar 88,9%, dan 100% dari jumlah tunas yang disampling membawa gen κ-Car. Ukuran fragmen DNA produk PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R adalah 2.000 bp, ukuran sama dengan produk PCR dari kontrol positif dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car, sementara tidak ada produk amplifikasi pada K. alvarezii non-transformasi (kontrol negatif). Selanjutnya, analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R menunjukkan produk amplifikasi 300 bp, ukuran yang sama seperti sekuen promotor 35S CaMV. Dengan demikian, K. alvarezii transgenik yang membawa κ-Car telah dihasilkan. Keywords: gen Kappa(κ)-Carrageenase, Kappaphycus alvarezii, transformasi gen

TRANSFORMATION OF KAPPA (κ)-CARRAGEENASE GENE TO SEAWEED Kappaphycus alvarezii ABSTRACT Foreign gene transformation techniques have been applied to improve the valuable traits of farmed organism. As the first step towards increasing of kappa (κ)-carrageenan content, in this study κ-Carrageenase gene (κ-Car) was transferred into K. alvarezii by mediation of Agrobacterium tumefaciens. The pMSH/κ-Car binary plasmid construct controlled by 35S CaMV promoter (35S) and Nos terminator (tNos) was used in this study. DNA analysis to identify the transgenic was conducted by PCR method using two sets of primer. The result showed that 36% transformed explants were survived, 88.9% sprouted and 100% of the sprouted explants were having the κ-Car gene. The size of amplified DNA fragment from K. alvarezii transgenic using 35S-F and tNos-R set primers was 2,000 bp, the same size as PCR product of the template of pMSH/κ-Car plasmid, while no amplification product in non-transformated explants (negative control) was found. Furthermore, PCR analysis using 35S-F and 35S-R set primers showed amplification product of 300 bp, the same size as the length of 35S CaMV promoter sequence. Thus, K. alvarezii transgenic carrying κ-Car had been generated. Keywords: gene transformation, Kappaphycus alvarezii, Kappa(κ)-Carrageenase gene

22

4.1 Pendahuluan Rumput laut Kappaphycus alvarezii termasuk kelompok alga merah Rhodophyceae (Doty 1987) dengan produk utama berupa hidrokoloid kappa(κ)karagenan (Neish 2005a). Karagenan memiliki kegunaan sangat luas bagi industri (McHugh 2003) sehingga diprediksi kebutuhan karagenan akan terus meningkat di masa datang. κ-karagenan dalam tubuh K. alvarezii merupakan bentuk akhir dari bentuk prekursornya, µ-karagenan (Campo et al. 2009). Pembentukan κ-karagenan dikendalikan oleh enzim sulfohidrolase κ-Carrageenase. Studi molekuler terkait biosintesis κ-karagenan pada rumput laut K. alvarezii belum banyak dilakukan. Gen κ-Carrageenase telah berhasil diisolasi dari beberapa organisme laut, yakni Pseudoalteromonas carrageenovora (Michel et al. 2001), γ-Proteobacterium, Pseudomonas elongata syn, Microbulbifer elongatus comb. Nov. (Khambhaty et al. 2007), Pseudoalteromonas-like bacterium (Zhou et al. 2008), marine bacterium: Alteromonadaceae, Marinimicrobium, dan Microbulbifer (Tayco et al. 2013). Bakteri memiliki struktur sel lebih sederhana dan ukuran genom lebih kecil sehingga banyak dijadikan sumber gen, karena isolasi lebih mudah dan tingkat keberhasilan lebih tinggi. Teknologi transgenesis diaplikasikan untuk memodifikasi genetik pada genom inang secara terarah berupa penyisipan gen asing yang menyandikan karakter tertentu dan dapat memprediksi sifat-sifat baru yang akan muncul pada inang hasil rekayasa (Yuwono 2006; Lutz 2001). Aplikasi transgenesis pada rumput laut (makroalga) memperlihatkan potensi besar dimasa mendatang (Hallmann 2007; Walker et al. 2005), misalnya untuk peningkatan ketahanan dari cekaman lingkungan dan resistensi terhadap penyakit. Hingga saat ini penelitian transfer gen pada makroalga telah berhasil dilakukan, antara lain: Porphyra yezoensis (Cheney et al. 2001) dan Laminaria japonica (Li et al. 2009) menggunakan gen β-glucuronidase (GUS); serta Gracilaria dengan gen LacZ (Huddy et al. 2012). Pada K. alvarezii telah sukses dilakukan transfer gen green fluorescent protein (GFP) menggunakan promoter berbeda (Rajamuddin et al. 2014); gen LacZ (Wang et al. 2010); gen PaCS (penyandi sitrat sintase) (Daud et al. 2013); gen lisozim-c (Handayani et al. 2014); dan gen Metallothionein tipe II (Fajriah et al. 2014). Pembuatan K. alvarezii transgenik oleh Rajamuddin et al. (2014) menggunakan metode elektroporasi, Wang et al. (2010) menggunakan metode particle bombardment, sedangkan Daud et al. (2014), Handayani et al. (2014) dan Fajriah et al. (2014) menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Kelebihan transformasi menggunakan A. tumefaciens, diantaranya: jumlah salinan gen lebih banyak dan teknik pengulangan percobaan memberikan hasil serupa (reproducible) (Hiei et al. 1997; de la Riva et al. 1998). Penelitian pada tahap ini bertujuan mentransformasi gen yang menyandikan enzim κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens, dalam rangka meningkatkan kandungan κkaragenan pada K. alvarezii sebagai tujuan akhir.

23

4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Biorin, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor (IPB), mulai bulan Februari 2014 sampai April 2015. 4.2.2 Preparasi Talus dan Sumber Eksplan Steril Kappaphycus alvarezii Eksplan rumput laut K. alvarezii dikoleksi dari hasil budidaya di perairan Pangkep, Sulawesi Selatan (Gambar 13A). Selanjutnya rumput laut diadaptasikan dalam wadah pemeliharaan terkontrol (Gambar 13B) di Laboratorium PPSHBIPB. Preparasi eksplan K. alvarezii steril (Gambar 13C) mengacu pada metode Reddy et al. (2003)

Gambar 13 Koleksi Kappaphycus alvarezii hasil budidaya sebagai sumber eksplan (A), adaptasi pemeliharaan secara terkontrol di laboratorium (B), dan eksplan steril ukuran 7-10 mm, siap digunakan dalam proses transfer gen (C) 4.2.3 Transformasi Gen κ-Carrageenase pada Kappaphycus alvarezii Transformasi dilakukan mengikuti metode Cheney (2000) dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 50 eksplan steril K. alvarezii ukuran panjang 7-10 mm, dilukai menggunakan jarum steril. Eksplan direndam dalam media infeksi yang berisi A. tumefaciens yang membawa gen κ-Carrageenase (pMSH/κ-Car) (OD600=0,5-1,0) dan 100 μM asetosiringon selama 30 menit dengan penggoyangan 100 rpm. Selanjutnya eksplan dikering-udarakan dengan tisu steril dan dipindahkan ke media ko-kultivasi (media padat PES dan 100 μM asetosiringon) selama 3 hari di ruang gelap. Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci dengan cefotaxim 200 mg/L, dibilas dengan air laut steril sebanyak 3 kali, dikering-udarakan dengan tisu steril, kemudian eksplan dipelihara di media recovery (PES tanpa asetosiringon) selama 7 hari. Modifikasi metode pada penelitian ini, tidak dilakukan skrining eksplan pada media seleksi antibiotik, untuk meminimalisasi eksplan stres akibat terpapar perlakuan yang terlalu lama. Konsekuensi modifikasi metode tersebut, menyebabkan analisis PCR harus

24

dilakukan satu per satu terhadap tunas-tunas yang tumbuh dari eksplan hasil transformasi. 4.2.4 Pemeliharaan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi Eksplan hasil transformasi dipelihara sampai keluarnya tunas-tunas baru, pemeliharaan eksplan pascatransformasi mengacu metode Sulistiani et al. (2012) dan Rajamuddin et al. (2010). Media dasar pemeliharaan menggunakan air laut steril salinitas 30-32 g/L, diperkaya dengan Provasoli enriched seawater/PES (Lampiran 1) (Provasoli 1968). Pemeliharaan dilakukan secara steril pada suhu ruangan 24-26 °C menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan 100 rpm (Lampiran 2), sebanyak 5 eksplan per botol. Selama pemeliharaan dilakukan pergantian media setiap tiga minggu, dengan lama pemeliharaan empat bulan. Tunas-tunas baru yang tumbuh dianalisis DNA untuk identifikasi eksplan transgenik yang membawa gen κ-Carrageenase. 4.2.5 Analisis DNA Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR Sebanyak dua eksplan K. alvarezii yang telah tumbuh tunas baru dan sudah memenuhi syarat ukuran untuk analisis DNA (sekitar 0,1 g). Masing-masing satu tunas dari dua eksplan hasil transformasi, dipotong sebanyak 0,1 g untuk ekstraksi DNA menggunakan bufer ektraksi CTAB (Lampiran 3) mengikuti metode Doyle & Doyle (1987). Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F: 5’-ATG GCT GGA GTA TTA GCT GGG-3’ dan tNos-R: 5’-CTC ATA AAT AAC GTC ATG CAT TAC A-3’ (Hannum 2012). Verifikasi PCR DNA K. alvarezii transgenik juga dilakukan menggunakan primer 35S-F: 5’-AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT-3’ dan 35S-R: 5’-GAA GGG TCT TGC GAA GGA TA-3’ (Suharsono et al. 2002). Program PCR yang digunakan adalah pradenaturasi pada suhu 95 °C selama 5 menit, 30 siklus amplifikasi yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 °C selama 30 detik, annealing pada suhu 56 °C selama 1 menit, dan extention pada suhu 72 °C selama 2 menit, serta final extention pada suhu 72 °C selama 5 menit dan pendinginan pada 20 °C selama 10 menit. Sebanyak 10-15 μl produk PCR diseparasi dengan elektroforesis 100 V selama 30 menit pada 1% agarosa dalam buffer TAE 1x (stok TAE 50x terdiri dari: 4,84 g Tris base, 1,14 mL Acetic acid glacial, 2 mL EDTA pH 8 0,5 M, 800 mL ddH2O). Hasil elektroforesis divisualisasi dengan gel documentation system-UV translluminator. 4.3 Hasil dan Pembahasan 4.3.1 Pertumbuhan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi Hasil pertumbuhan eksplan hasil perlakuan transformasi disajikan pada Tabel 2. Persentase eksplan yang hidup pascatransformasi (36%) dan bertunas (persentase eksplan bertunas) adalah 88,9%. Hasil ini menunjukkan bahwa pada eksplan dengan perlakuan transformasi, mortalitas tinggi hanya terjadi pada tahap penginfeksian sampai dengan ko-

25

kultivasi, sedangkan pada pascatransformasi tingkat kelangsungan hidup eksplan relatif sama dengan kontrol. Persentase eksplan hidup pascatransformasi (36%) dan persentase eksplan bertunas (88,9%) pada penelitian ini, lebih tinggi dari beberapa hasil penelitian sebelumnya, sebesar: 27,4% (Fajriah et al. 2014), 23,6% (Handayani et al. 2014), dan 7,5% (Daud et al. 2013). Tabel 2 Persentase eksplan hidup dan bertunas dari eksplan Kappaphycus alvarezii hasil perlakuan transformasi gen κ-Carrageenase (κ-Car) Parameter yang diamati a. Jumlah eksplan awal b. Jumlah eksplan hidup pascatransformasi c. Persentase eksplan hidup pascatransformasi (b/a x 100) d. Jumlah eksplan hidup dan bertunas e. Persentase eksplan hidup dan bertunas (d/b x 100)

Transformasi

Perlakuan Kontrol (tanpa transformasi)

50 18

50 46

36 16

92 40

88,9

87

Tingginya persentase eksplan hidup dan bertunas yang diperoleh pada penelitian ini dibandingkan hasil yang diperoleh dari tiga penelitian sebelumnya, disebabkan karena modifikasi metode transformasi, di mana setelah perlakuan kokultivasi tidak dilakukan skrining pada media seleksi antibiotik sehingga eksplan tidak mengalami stres dalam rentang waktu yang lama. Tunas-tunas yang tumbuh (Gambar 14B) dari eksplan hasil transformasi (Gambar 14A), telah berukuran sekitar 5-10 mm selama kurun waktu empat bulan pemeliharaan pada wadah pemeliharaan secara steril menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan.

Gambar 14 Eksplan Kappaphycus alvarezii awal transformasi gen κCarrageenase (A), dan eksplan umur empat bulan pascatransformasi yang memiliki tunas baru dengan ukuran panjang 5-10 mm (lingkaran merah) (B)

26

4.3.2 Identifikasi Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR Hasil ekstraksi genom rumput laut K. alvarezii disajikan pada Gambar 15A, yang menunjukkan bahwa ekstraksi genom berhasil dilakukan baik pada K. alvarezii hasil transformasi maupun kontrol. Dengan membandingkan pita DNA marka λ (lambda) 30 ng/μl dan 50 ng/μl, konsentrasi DNA genom hasil ekstraksi dari K. alvarezii adalah berkisar 30-40 ng/μl. Hasil analisis PCR terhadap K. alvarezii transgenik disajikan pada Gambar 15B dan Gambar 15C. Dengan menggunakan primer 35S-F dan tNos-R, hasil PCR menunjukkan produk sekitar 2.000 bp pada K. alvarezii transgenik (T1 dan T2), sedangkan pada K. alvarezii kontrol non-transforman (NT) tidak ada produk amplifikasi (Gambar 15B). Ukuran produk PCR tersebut konsisten dengan ukuran vektor pMSH/κ-Car (K+). Untuk konfirmasi lebih lanjut, PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F dan 35S-R, dan hasil amplifikasi menunjukkan adanya pita DNA berukuran sekitar 300 bp (Gambar 15C). Ukuran produk PCR tersebut sesuai dengan ukuran fragmen promoter 35S pada vektor pMSH/κ-Car. Kedua hasil PCR (Gambar 15B dan Gambar 15C) tersebut mengindikasikan kesuksesan transformasi dan K. alvarezii transgenik berhasil diproduksi. Pada penelitian ini, dari 16 eksplan yang hidup dan bertunas, telah disampling 2 tunas untuk analisis PCR, dan dari dua sampel yang diperiksa tersebut semuanya (100 %) positif PCR (transgenik). Sementara itu, Handayani et al. (2014) melaporkan tiga dari enam putatif transforman (50%) positif PCR, dan Fajriah et al. (2014) melaporkan 13 dari 135 putatif transforman (9,63%) adalah transgenik. λ-3

GNT

GT1

GT2

λ-5

κ-car

A

Gambar 15 Hasil ekstraksi DNA genom rumput laut Kappaphycus alvarezii (A), analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan produk berukuran sekitar 2.000 bp (B), dan analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R dengan produk sekitar 300 bp (C). G: genom; λ-3 dan λ-5: marka dengan konsentrasi 30 ng/µl dan 50 ng/µl (BioLabs, Inc. New England); T1 dan T2: K. alvarezii transgenik; NT: K. alvarezii kontrol non-transformasi; K+: plasmid pMSH/κCar sebagai kontrol positif, M: marker gen ruler 1KB DNA ladder (BioLabs, Inc. New England); tanda kepala panah menunjukkan target produk PCR

27

Hasil penelitian transformasi gen pada K. alvarezii lainnya dilaporkan Alizadeh et al. (unpublish) dengan metode transformasi yang sama menghasilkan persentase transformasi sebesar 20% menggunakan gen GUS dan promoter 35S. Wang et al. (2010) menghasilkan persentase transformasi lebih tinggi sebesar 33% tetapi dengan metode berbeda yaitu micro-particle bombardment pada tekanan 450 psi, menggunakan gen LacZ dan promoter SV40. Tingginya persentase transformasi pada penelitian ini (100%) karena analisis PCR baru dilakukan secara acak pada dua sampel tunas, dan belum dilakukan pada semua tunas dari eksplan hasil transformasi. Dua tunas tersebut telah memenuhi ukuran untuk syarat minimum sampel ekstraksi DNA sebanyak 0,1 g (Doyle dan Doyle 1987). Mengacu hasil analisis PCR tersebut, dimana dari dua sampel dan semuanya transgenik, maka peluang lebih besar tunas-tunas lainnya juga merupakan transgenik. Faktor-faktor yang juga berperan dalam kesuksesan transformasi gen menggunakan mediasi A. tumefaciens adalah penambahan asetosiringon, kepadatan bakteri A. tumefaciens dan waktu kokultivasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan 100 μM asetosiringon dengan OD 0,5-1,0 dengan lama masa infeksi 30 menit telah menghasilkan persentase transformasi yang baik pada penelitian ini. Menurut James et al. (1993), penambahan asetosiringon ke dalam media infeksi dan media kokultivasi, efektif meningkatkan efisiensi transformasi. Penambahan asetosiringon mampu menginduksi gen vir yang berfungsi mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman dan mempertinggi efektivitas infeksi A. tumefaciens sehingga meningkatkan jumlah sel transforman (Rashid et al. 2010). Selain itu, perlakuan lama ko-kultivasi (inkubasi) antara bakteri dan eksplan sangat mempengaruhi efektivitas infeksi bakteri. Inkubasi yang terlalu cepat dapat mempengaruhi keberhasilan transformasi, karena bakteri belum sempat menginfeksi sel-sel eksplan secara sempurna. Menurut Alimohammadi & Bagherieh-Najjar (2009) bahwa keberhasilan transfer gen oleh A. tumefaciens sangat ditentukan oleh ada tidaknya luka (perlukaan), kerapatan bakteri (optical density), lama inokulasi dan lama kokultivasi. Pada tahap penelitian ini, ukuran tunas-tunas dari eksplan hasil transformasi masih relatif kecil. Oleh karena itu, diperlukan pemeliharaan lebih lanjut agar diperoleh tunas lebih banyak untuk analisis ekspresi dan integrasi gen. 4.4 Simpulan Gen κ-Carrageenase telah berhasil ditransformasi ke rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36% dan bertunas 88,9%, lebih tinggi dari penelitian-penelitian sebelumnya, dengan persentase transgenik sebesar 100%.

5 PEMELIHARAAN LANJUT EKSPLAN Kappaphycus alvarezii TRANSGENIK DAN ANALISIS EKSPRESI mRNA ABSTRAK Adanya ekspresi mRNA gen yang ditransfer menunjukkan potensi tinggi diperoleh karakter yang diinginkan pada organisme transgenik. Penelitian tahap ini dilakukan pemeliharaan lanjut Kappaphycus alvarezii transgenik dan kontrol, serta menganalisis tingkat ekspresi mRNA gen κ-Carrageenase. Pemeliharaan lanjut eksplan transgenik dilakukan secara semi-steril pada wadah pembesaran botol kerucut volume 1500 ml dengan aerasi. Analisis ekspresi mRNA dari dua tunas transgenik dan satu tunas non-transformasi (kontrol). Ekstraksi RNA total dilakukan menggunakan TRIzol® Reagent, dan sintesis DNA komplementer (cDNA) dilakukan menggunakan IscriptTM cDNA Synthesis Kit dengan teknik reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Kuantifikasi tingkat ekspresi gen κ-Car dilakukan dengan quantitative real time PCR (qrt-PCR). Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Analisis ekspresi K. alvarezii transgenik menghasilkan tingkat ekspresi gen κCarrageenase setelah dinormalisasi terhadap ekspresi gen Actin adalah masingmasing sebesar 0,983 untuk transgenik T1 dan sebesar 0,962 untuk transgenik T2. Dengan demikian, gen κ-Carrageenase diekspresikan dengan level relatif sama pada K. alvarezii transgenik Kata kunci: analisis ekspresi gen, cycle of threshold, qrt-PCR

REARING OF TRANSGENIC Kappaphycus alvarezii EXPLANT AND GENE EXPRESSION ANALYSIS ABSTRACT Presence mRNA expression of transferred gene indicates a high potency to achieve a characteristic target on transgenic organism. This research was conducted to analyze the level of κ-Car gene mRNA expression on transgenic Kappaphycus alvarezii. Rearing of the sprout explants was conducted on semi sterile method in cone bottle with 1500 ml volume with aeration. In this study mRNA expression was analyzed in two sprouts of transgenic explant and one nontransformation (control) as sample. Total RNA extraction was conducted using a TRIzol® Reagent, and complementer DNA (cDNA) synthesis was conducted using an IscriptTM cDNA Synthesis Kit with reverse transcriptase PCR (RT-PCR) technique. Expression level quantification of κ-Car gene was conducted by a quantitative real time PCR (qrt-PCR) method. The result of rearing culture showed that survival percentage of transgenic K. alvarezii explants was 100%, transgenic candidates explant others was 36% and controls was 43%. The number of shoots was 2-4 each explants, and long shoots was 5-8 mm. Results of expression analysis indicated the normalized mRNA κ-Carrageenase/Actin gene expression level was 0.983 and 0.962 in transgenic T1 and T2, respectively. Thus,

29

κ-Carrageenase gene was expressed with similar level in transgenic Kappaphycus alvarezii. Key words: gene expression analysis, cycle of threshold, qrt-PCR 5.1 Pendahuluan Penggunaan teknologi transgenesis untuk memproduksi rumput laut Kappaphycus alvarezii yang memiliki karakter tertentu yang diinginkan, merupakan peluang efektif dan strategis. Kemajuan terbaru dalam teknologi transfer gen tersebut memiliki potensi sangat besar untuk pengembangan rumput laut K. alvarezii transgenik yang membawa gen penyandi enzim κ-Carrageenase yang berperan dalam sintesis karagenan. Hal ini menjadi salah satu alternatif dalam upaya peningkatan kandungan karagenan. Tahapan transgenesis yang penting berikutnya dalam rangka perakitan rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik, adalah pemeliharaan lanjut dari eksplan transgenik dan analisis ekspresi gen pada level RNA. Adanya ekspresi messenger RNA (mRNA) gen yang ditransfer menunjukkan potensi tinggi diperoleh karakter yang diinginkan pada organisme transgenik. Pengamatan ekspresi gen dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya menggunakan gen reporter sebagai indikator pengamatan ekspresi sementaranya (Alimuddin 2003; Her et al. 2004; Kato et al. 2007). Ekspresi gen juga dapat dianalisis dengan cara mengukur level mRNA dan protein. mRNA dari gen asing dapat dideteksi dengan menggunakan probe dengan melabel fragmen DNA dengan radioaktif, dan protein dengan cara immunodeteksi dengan menggunakan antibodi (Alimuddin et al. 2003). Metode analisis ekspresi gen lainnya yang berkembang sekarang adalah menggunakan teknik RT-PCR. Reverse transkripsi dikombinasikan dengan polymerase chain reaction (RT-PCR) telah terbukti menjadi metode yang tepat untuk mengukur ekspresi gen (Horikoshi et al. 1992). Teknologi real time PCR telah diadaptasi untuk melakukan quantitative Real Time-PCR (qrt-PCR). Strategi kuantifikasi ekspresi gen target menggunakan metode qrt-PCR, pada beberapa artikel ilmiah antara lain menyebutkan sebagai kuantifikasi mutlak (absolut), relatif, ataupun komparatif (Pfaffl, 2004). Metode untuk menganalisis data untuk mengukur perubahan relatif ekspresi gen menggunakan persamaan 2ΔΔCт telah dilakukan Schmittgen et al. (2000), sedangkan kuantifikasi komparatif adalah kuantifikasi rasio yang menggambarkan ekspresi gen target dibandingkan kapasitas inang mengekspresikan gen kontrol internal (house keeping gene). Pada penelitian ini dilakukan analisis tingkat ekspresi mRNA gen κCarrageenase pada rumput laut K. alvarezii transgenik menggunakan metode qrtPCR dengan membandingkan ekspresi gen κ-Carrageenase dengan gen Actin sebagai kontrol internal. 5.2 Metode Penelitian 5.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian Pembesaran eksplan-tunas Kappaphycus alvarezii transgenik dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, dan analisis ekspresi dilaksanakan di

30

Laboratorium Biorin PPSHB-IPB. Tahap ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2015 sampai April 2016. 5.2.2 Pemeliharaan Lanjut Eksplan/Tunas K. alvarezii Transgenik Dua eksplan yang tunasnya telah positif membawa gen κ-Carrageenase dari hasil analisis DNA pada tahap sebelumnya, dan 14 eksplan kandidat transgenik lainnya serta 14 eksplan kontrol, selanjutnya dipelihara pada wadah pemeliharaan semi steril. Pemeliharaan dilakukan mengacu metode Sulistiani et al. (2011) dengan beberapa modifikasi, menggunakan media air laut air laut steril salinitas 30-32 g/L, diperkaya dengan Provasoli enriched seawater/PES (Lampiran 1). Pemeliharaan lanjut semi steril menggunakan botol kerucut volume 1500 ml yang dilengkapi dengan aerasi (Lampiran 4), pada suhu ruangan 26-28 °C. Eksplan transgenik (positif PCR DNA) masing-masing satu ekplan per botol, sedangkan eksplan kandidat transgenik lainnya serta kontrol sebanyak tiga eksplan per botol. Pergantian air dilakukan setiap dua minggu, selama delapan bulan pemeliharaan. 5.2.3 Analisis Ekspresi Gen κ-Carrageenase dengan q-PCR Ekstraksi RNA total RNA total diekstraksi dengan menggunakan TRIzol® Reagent (Invitrogen USA). Dua tunas transgenik dan satu tunas non-transforman (kontrol) diambil sebagai sampel, sebanyak 10-25 mg per sampel tunas. Sampel digerus dalam nitrogen cair sampai halus, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang berisi 800 μl trizol reagent dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit agar sampel dapat terlisis sempurna. Sampel ditambahkan dengan 200 μl kloroform kemudian dihomogenisasi dengan vorteks dan dibiarkan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 10 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru yang telah berisi dengan 500 μL iso-propanol. Sampel dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung mikro secara perlahan kemudian disimpan dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet dilarutkan dalam 500 μl etanol 70% dingin dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 5 menit. Supernatan dibuang, dan selanjutnya pelet dalam tabung mikro dikering-udarakan menggunakan vacum dryer. Pelet RNA dilarutkan dengan DEPC water 0,1%, kemudian disimpan dalam oven 55-57 °C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pengecekan pita RNA dengan elektroforesis. Sebanyak 50 μl RNA total digunakan untuk menyintesis cDNA.

Síntesis cDNA dengan RT-PCR Sampel RNA terlebih dahulu dibersihkan dari sisa-sisa DNA dengan menambahkan 1,3 μl reaksi DNase (DNase, buffer DNase), kemudian didenaturasi pada suhu 25 °C selama 5 menit. Selanjutnya di tambahkan EDTA 1 μl dan didenaturasi lagi pada suhu 65 °C selama 10 menit, kemudian disimpan di atas es selama 5 menit. Sintesis DNA komplementer (complementary DNA, cDNA) dilakukan dengan menggunakan IscriptTM cDNA synthesis kit (BIORAD

31

USA) dengan teknik reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Cetakan RNA sebanyak 5 μl ditambahkan 5x Iscript mix 2 μl, Iscript-RT 0,5 μl dan nuclease free water 2,5 μl sehingga volume akhir menjadi 10 μl. Program PCR dilakukan pada suhu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 30 menit, 85 °C selama 5 menit, hold pada suhu 4 °C. Hasil cDNA diambil sebanyak 2 μl untuk dikuantifikasi konsentrasinya menggunakan mesin Nanodrop-2000 (Thermo scientific). Kuantifikasi Ekspresi Gen dengan qPCR Kuantifikasi tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase (κ-Car) pada rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik dilakukan dengan quantitative polymerase chain reaction (qPCR). cDNA gen κ-Car diamplifikasi dengan primer spesifik κCar-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-3’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG-3’. Primer spesifik κ-Car didesain berdasarkan sekuen κ-Car dengan posisi sekuen ke 630 untuk forward dan sekuen ke 705 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 98 bp. Gen aktin digunakan sebagai kontrol internal dengan primer Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA-3’ dan Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-3’. Primer spesifik Actin didesain berdasarkan sekuen Actin K. alvarezii (kode akses bank gen JQ013141.1) dengan posisi sekuen ke 247 untuk forward dan sekuen ke 325 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 99 bp. Analisis q-PCR dilakukan menggunakan mesin NANOBIOSYS UltraFast Real Time PCR G2-4 dan SYBR Green Real Time PCR Kit (NANOBIOSYS Korea). Komposisi reaksi qPCR untuk masing-masing pasangan primer (κ-Car dan Actin) yaitu 1 µl cDNA konsentrasi 75 ng/µl, 0,25 µl primer forward dan reverse konsentrasi 10 pmol/µl, 5 µl SYBR Green dan nuclease free water 3,5 µl, sehingga total volume menjadi 10 µl. Program qPCR yang digunakan sama untuk primer κ-Car dan Actin, yaitu pradenaturasi pada 95 °C selama 3 menit, denaturasi pada 94 °C selama 10 detik, penempelan primer dan elongasi pada 55 °C selama 40 detik. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus. Kuantifikasi tingkat ekspresi gen target dilakukan berdasarkan rasio ekspresi cDNA gen κ-Car sebagai gen target terhadap ekspresi gen Actin K. alvarezii sebagai kontrol internal jumlah mRNA digunakan dalam sintesis cDNA (Pfaffl, 2004). Perhitungan rasio ekspresi gen dilakukan dengan membandingkan nilai Cт (Cycle of Threshold) dari ekspresi gen κ-Car dan gen Actin. 5.3 Hasil dan Pembahasan 5.3.1 Pemeliharaan Lanjut Eksplan/Tunas K. alvarezii Transgenik Hasil pemeliharaan eksplan/tunas pada wadah pembesaran semi steril, menunjukkan pertambahan ukuran panjang tunas dan jumlah tunas baru, seperti disajikan pada Tabel 3 danGambar 16. Pertumbuhan panjang telah mencapai 18 mm pada beberapa tunas, sedangkan jumlah tunas telah tumbuh 3-4 tunas baru pada beberapa eksplan. Hasil ini menunjukkan bahwa perkembangan eksplan telah mengalami pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan pada wadah pemeliharaan steril pada botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan pada penelitian tahap sebelumnya (Gambar 14 dan Tabel 2).

32

Pertambahan ukuran panjang dan jumlah tunas baru dari eksplan transgenik dan kandidat transgenik pada pemeliharaan semi-steril ini, menunjukkan hasil yang relatif sama dengan eksplan pada non-transgenik sebagai kontrol (Tabel 3). Demikian pula, selama proses pembesaran secara semi steril, terjadi mortalitas pada beberapa eksplan-tunas, baik pada eksplan transgenik maupun pada eksplan non-transgenik. Tabel 3 Pertumbuhan panjang tunas dan jumlah tunas pada eksplan transgenik, kandidat transgenik dan kontrol hasil pemeliharaan pada kultur pembesaran secara semi-steril Jenis eksplan

Jumlah eksplan Awal Akhir

Jumlah tunas/eksplan

Panjang tunas (mm)

Kontrol

14

6

2-3

5-15

Transgenik-1 (T1)

1

1

2

1. 10 (T1) 2. 12 * 1. 10 (T2) 2. 7 *

Transgenik-2 (T2)

1

1

2

Kandidat transgenik lainnya

14

5

2-4

5-18 *

Keterangan : * belum dianalisis PCR Jumlah eksplan awal yang dipelihara pada pembesaran secara semi steril untuk transgenik sebanyak dua eksplan dan kandidat transgenik sebanyak 14 eksplan dan kontrol non-transgenik sebanyak 14 eksplan. Sampai dengan dilakukannya analisis ekspresi gen, jumlah eksplan yang masih hidup untuk transgenik sebanyak dua eksplan, dan kandidat transgenik sebanyak 5 eksplan, sedangkan kontrol non-transgenik sebanyak enam eksplan (Tabel 3). Dengan demikian, sintasan eksplan pada pemeliharaan pembesaran semi-steril, untuk eksplan transgenik sebesar 100%, dan eksplan kandidat transgenik sebesar 36%, sedangkan pada eksplan non-transgenik sebesar 43%.

Gambar 16 Morfologi perkembangan tunas Kappaphycus alvarezii pada wadah pembesaran semi steril di botol kerucut volume 1500 ml dengan aerasi: 2 tunas (A), 3 tunas (B) dan 4 tunas (C)

33

Hal ini menunjukkan bahwa penyebab terjadinya mortalitas hanya karena faktor kemampuan adaptasi eksplan pada kondisi media pemeliharaan semi-steril, dan bukan pengaruh dari perlakuan transfer gen. Pertumbuhan tunas yang masih relatif lambat pada wadah pembesaran semi steril dibandingkan pertumbuhan di alam, hal ini disebabkan karena masih kurang sempurnahnya pergerakan eksplan pada wadah pemeliharaan. Pergerakan eksplan adalah salah satu faktor utama yang dapat menyebabkan percepatan daya tumbuh terhambat. Secara umum tumbuhan laut Eucheuma di alam mendapatkan pertumbuhan terbaiknya dalam air yang bergerak (Neish 2005b). Pergerakan air dan gaya/kekuatan hidroliknya merangsang pertumbuhan rumput laut, juga menyingkirkan sisa-sisa metabolisme, membersihkan tanaman, dan menghadirkan nutrisi yang baru. Pada batas-batas ketahanan bibit, bahwa pergerakan air yang cepat juga mempercepat pertumbuhan. Dalam air yang mengalir cepat tanaman Kappaphycus dapat tumbuh sampai mencapai panjang dua meter dan percabangan utamanya lebih dari 2 cm (Neish 2005b). 5.3.2 Analisis Ekspresi Gen κ-Carrageenase Kuantitas cDNA hasil sintesis disajikan pada Tabel 4. Semua sampel diperoleh cDNA dengan konsentrasi berkisar 1016,8 s.d 2263,6 ng/µl, sedangkan blanko tidak terdeteksi adanya cDNA. Hal tersebut menunjukkan bahwa ekstraksi RNA total dan sintesis cDNA berhasil dilakukan. Kemurnian DNA dapat yang digambarkan oleh nilai absorbansi λ 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280 (A260/A280), karena DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada λ 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur, di mana nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0. Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran/senyawa lainnya sehingga kadar DNA yang didapat belum murni. Jika nilai kemurnian kurang dari 1,8 maka ddH2O yang terambil lebih banyak daripada jumlah DNA yang terambil lebih sedikit. Tabel 4 Hasil kuantifikasi cDNA Kappaphycus alvarezii transgenik (T) dan non transgenik (NT) menggunakan mesin Nanodrop-2000 Sampel Blank T1 (1) (2) T2 (1) (2) NT (1) (2)

Konsentrasi asam nukleat (ng/µl) 0,0 1954,3 2026,8 2254,5 2263,6 1007,6 1016,8

A 260 0,001 39,085 40,535 45,089 45,273 20,153 20,337

A 280 -0,011 23,840 24,687 27,338 27,369 11,604 11,753

Ket : A 260 = nilai absorbansi pada λ 260 nm A 280 = nilai absorbansi pada λ 268 nm 260/280 = nilai kemurnian DNA (baik: 1,8-2,0) TP = nilai tingkat pengotor DNA (bersih: < 2,00)

260/ 280 -0,008 1,64 1,64 1,65 1,65 1,74 1,73

TP -0,10 1,00 1,06 1,94 1,93 0,24 0,24

34

Hasil analisis RT-PCR menggunakan pasangan primer gen κ-Car-F dan κ-Car-R dengan cetakan cDNA dari rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik (T1 dan T2) menghasilkan pita DNA berukuran sekitar 98 bp, sedangkan pada non transgenik (NT) tidak teramplifikasi. Ukuran produk RTPCR tersebut sama dengan ukuran produk amplifikasi dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car (K+) sebagai kontrol positif (Gambar 17A).

Gambar 17 Produk RT-PCR menggunakan primer κ-Car-F dan κ-Car-R (A) dan primer actin-F dan actin-R (B) dengan cetakan cDNA dari K. alvarezii transgenik (T1 dan T2) dan non-transgenik (NT) tidak teramplifikasi (A); M: marker 100 bp DNA ladder (BioLabs, Inc. New England); K+: produk amplifikasi dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car. Produk PCR menggunakan pasangan primer gen Actin-F dan Actin-R sebagai kontrol internal, menghasilkan ukuran fragmen sekitar 99 bp (Gambar 17B), baik pada non-transgenik (NT) maupun pada transgenik (T1 dan T2). Gen Actin selain sebagai gen internal, penggunaan primer gen Actin juga berfungsi untuk memastikan bahwa DNA yang digunakan sebagai cetakan adalah berkualitas baik. Analisis ekspresi gen κ-Carrageenase dari rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik menggunakan qRT-PCR menghasilkan nilai Cт gen κ-Car dan Cт gen Actin, seperti pada Tabel 5. Tabel 5 Nilai Cт (cycle of threshold) dan rasio Cт gen κ-Carrageenase (κ-Car) dan gen Actin dari masing-masing cDNA Kappaphycus alvarezii transgenik (T1 dan T2) Sampel

Cт Gen κ-Car

Cт Gen Actin

Rasio Cт (κ-Car/Actin)

T1

35,40

36,00

0,983

T2

33,00

34,30

0,962

Analisis qRT-PCR menunjukkan hasil bahwa nilai Cт gen Actin menggambarkan kapasitas dari masing-masing K. alvarezi transgenik untuk mengekspresikan gen-gen protein dalam K. alvarezii, termasuk gen κCarrageenase (κ-Car). K. alvarezi transgenik T1 dengan kapasitas ekspresi gen Actin (Cт sebesar 36,00) mampu menghasilkan ekspresi gen κ-Car (Cт sebesar

35

35,40) dengan rasio Cт 0,983, sedangkan transgenik T2 dengan kapasitas ekspresi gen Actin (Cт sebesar 34,30) mampu menghasilkan ekspresi gen κ-Car (Cт sebesar 33,00) dengan rasio Cт 0,962. Hasil analisis tersebut memperkuat bahwa gen κ-Carrageenase (κ-Car) telah berhasil diintroduksikan ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii sehingga K. alvarezii transgenik yang mengandung gen κ-Car yang dikontrol oleh promotor kuat 35S CaMV, telah diperoleh. Hal ini juga menunjukkan bahwa peran promoter CaMV 35S merupakan bagian penting dalam mengaktifkan gen κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii. Hasil penelitian Rajamuddin et al. (2014) menunjukkan promoter CaMV 35S dapat bekerja mengaktifkan gen pada rumput laut K. alvarezii. Promoter ini merupakan promoter konstitutif dan bisa aktif di semua organ. Hasil penelitian Rogers et al. (1985) menunjukkan peningkatan ekspresi gen sampai 40 kali dengan menggunakan promoter 35S. Hasil analisis ekspresi ini menunjukkan potensi besar dalam meningkatkan kandungan karagenan rumput laut K. alvarezii. Penelitian lebih lanjut diperlukan agar diperoleh talus dalam jumlah cukup banyak untuk analisis kandungan karagenan. 5.4 Simpulan Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Analisis ekspresi menggunakan metode qrt-PCR menunjukkan bahwa gen κCarrageenase diekspresikan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik dengan level relatif sama.

6 PEMBAHASAN UMUM Upaya peningkatan kandungan kappa(κ)-karagenan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii dapat dilakukan salah satunya dengan teknologi transgenesis. Gen target yang ditransformasi pada penelitian ini adalah gen kappa(κ)-Carrageenase, dimana gen ini menyandikan enzim yang berperan dalam sintesis κ-karagenan. Rumput laut K. alvarezii transgenik dapat mengekspresikan gen κ-Carrageenase sehingga memiliki kandungan karagenan lebih tinggi (over ekspresi). Kebaruan dari penelitian ini adalah menghasilkan rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik yang mengekspresikan gen κ-Carrageenase dalam rangka perakitan rumput laut Kappaphycus alvarezii yang kandungan κkaragenannya lebih tinggi. Teknologi transfer gen (transgenesis) telah dikembangkan sebagai pendukung upaya yang sudah ada untuk meningkatkan kualitas dari karakter yang diinginkan pada rumput laut K. alvarezii. Prosedur transgenesis dimulai dengan melakukan identifikasi dan persiapan gen target, menemukan kesesuaian metode transfer dan promoter, serta melakukan deteksi dan pemantauan organisme transgenik (Khoo 2000). Organisme yang telah mengandung gen asing atau gen homolog yang dimasukkan secara buatan disebut transgenik (Dunham 2004). Manfaat lain dari transfer DNA (gen) asing dari luar ke inang merupakan strategi yang baik dalam mempelajari regulasi dari ekspresi gen secara in vivo (Volckaert et al. 1994). Tahap pertama dalam penelitian ini, adalah pembuatan vektor ekspresi gen dan penyediaan bakteri transforman sebagai kendaraan/biotransport (Muladno 2002). Gen κ-Carrageenase (sekitar 1300 bp) dikonstruksi pada vektor pMSH (pMSH/κ-Car) dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (sekitar 300 bp) di bagian depan dan terminator Nos (tNos; sekitar 400 bp) di bagian left border, sehingga total ukuran dari promoter 35S, gen κ-Car, sampai dengan tNos adalah sekitar 2.000 bp. Kesuksesan transformasi pMSH/κ-Car ke Escherchia coli DH5α (vektor kloning) dan ke Agrobacterium tumefaciens (agen transformasi), dibuktikan hasil uji pada media selektif menunjukkan koloni bakteri transforman dapat tumbuh pada media selektif, sedangkan koloni non transforman tidak dapat tumbuh. Kemampuan koloni bakteri untuk tumbuh pada media selektif menunjukkan bahwa bakteri tersebut mengandung pMSH/κ-Car (bakteri transforman). Hal tersebut sejalan dengan Muladno (2002); Tsen et al. (2002), dan Tu et al. (2005) bahwa apabila sel bakteri transforman yang membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan gen insersi) ditumbuhkan pada media dengan antibiotik marka seleksi, akan mampu berkembang biak membentuk koloni, sebaliknya sel bakteri yang tidak membawa plasmid gen insersi akan mati. Hasil uji dengan PCR koloni E. coli maupun A. tumefaciens transforman menggunakan primer 35S-Forward dan Tnos-Reverse menghasilkan fragmen sekitar 2.000 bp, sesuai ukuran mulai 35S, gen κ-Carrageenase, sampai tNos. Hal ini menunjukkan transformasi gen κ-Carrageenase (pMSH/κ-Car) ke biotranspor E. coli dan A. tumefaciens telah berhasil dilakukan dan siap digunakan lebih lanjut untuk transformasi pada K. alvarezii. Tahap kedua pada penelitian ini adalah transformasi gen κ-Car ke rumput laut K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens yang membawa pMSH/κ-Car. Eksplan hasil transformasi dipelihara sampai keluarnya

37

tunas-tunas baru, dilakukan secara steril menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36% dan bertunas 88,9%, lebih tinggi dari penelitian-penelitian sebelumnya. Dari eksplan yang hidup dan bertunas, telah disampling dua tunas untuk analisis PCR. Hasil PCR dan amplifikasi DNA K. alvarezii menggunakan primer 35S-F dan tNos-R, menunjukkan produk PCR sekitar 2.000 bp pada K. alvarezii transgenik, sedangkan pada kontrol (non-transforman) tidak ada produk amplifikasi. Ukuran produk PCR tersebut sama dengan ukuran pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif. Konfirmasi lebih lanjut, analisis PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F dan 35S-R, menunjukkan hasil amplifikasi berukuran sekitar 300 bp pada K. alvarezii transgenik. Ukuran produk PCR tersebut sama dengan ukuran promoter 35S. Kedua hasil PCR tersebut mengindikasikan kesuksesan transformasi gen κ-Car ke K. alvarezii. Dua sampel tunas yang di PCR tersebut semuanya (100%) transgenik (T1 dan T2). Sementara itu, Handayani et al. (2014) melaporkan tiga dari enam putatif transforman (50%) positif PCR, dan Fajriah et al. (2014) melaporkan 13 dari 135 putatif transforman (9,63%) positif PCR. Tahap ketiga penelitian ini adalah pemeliharaan lanjut eksplan/tunas K. alvarezii transgenik secara semi steril dan analisis tingkat ekspresi gen κ-Car. Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Selama proses pemeliharaan lanjut secara semi steril, terjadi mortalitas pada beberapa eksplan-tunas kandidat transgenik maupun pada eksplan non-transgenik (kontrol). Hal ini menunjukkan bahwa penyebab terjadinya mortalitas hanya karena faktor kemampuan adaptasi eksplan pada kondisi media pemeliharaan semi steril, dan bukan pengaruh dari perlakuan transfer gen. Pertambahan ukuran panjang serta jumlah tunas baru dari eksplan transgenik dan kandidat transgenik, menunjukkan hasil yang relatif sama dengan eksplan non-transgenik sebagai kontrol. Analisis PCR cDNA menggunakan pasangan primer gen κ-Car-F dan κCar-R, menghasilkan amplifikasi berukuran sekitar 98 bp, sama dengan ukuran fragmen pada plasmid pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif. Kontrol internal menggunakan pasangan primer gen Actin-F dan Actin-R, menunjukkan hasil amplifikasi dengan ukuran sekitar 99 bp pada non-transgenik (NT) maupun pada transgenik (T1 dan T2), sesuai target amplifikasi primer. Hasil analisis ekspresi menunjukkan Kappaphycus alvarezii transgenik menghasilkan tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase yang relatif sama, yang dinormalisasi dengan gen Actin dengan rasio masing-masing untuk transgenik T1 sebesar 0,983 dan transgenik T2 sebesar 0,962. Hasil ini juga menunjukkan bahwa peran promoter CaMV 35S merupakan bagian penting dalam mengaktifkan gen κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii. Hasil penelitian Rajamuddin et al. (2014) menunjukkan promoter CaMV 35S dapat bekerja mengaktifkan gen pada rumput laut K. alvarezii. Promoter ini merupakan promoter konstitutif dan bisa aktif di semua organ. Hasil penelitian Rogers et al. (1985) menunjukkan peningkatan ekspresi gen sampai 40 kali dengan menggunakan promoter 35S. Selanjutnya, hasil analisis ekspresi ini menunjukkan potensi besar dalam meningkatkan kandungan karagenan rumput laut K. alvarezii dengan transfer gen yang menyandikan enzim κ-Carrageenase.

38

Hasil penelitian tahap pertama sampai tahap ketiga yang telah dilaksanakan menunjukkan bahwa peluang besar peningkatan kandungan κ-karagenan dapat tercapai, pada rumput laut K. alvarezii dengan transfer gen κ-Car. Untuk mencapai tujuan akhir perakitan K. alvarezii transgenik tersebut, tahap regenerasi dan perkembangbiakan eksplan-tunas transgenik masih perlu dilakukan, untuk mendapatkan talus K. alvarezii yang lebih banyak dan generasi stabil. Transformasi gen menggunakan jaringan rumput laut seperti eksplan, menunjukkan pertumbuhan eksplan pada skala laboratorium relatif lambat, sehingga diperlukan modifikasi pemeliharaan yang lebih mendekati keadaan umum syarat pertumbuhan K. alvarezii di alam. Strategi lain yang dapat dilakukan agar regenerasi dan pertumbuhan rumput laut transgenik lebih cepat yaitu transformasi gen dilakukan pada fase embrio somatik hasil induksi kalus. Regenerasi embrio somatik menjadi mikropropagul dan menjadi planlet (rumput laut muda) relatif lebih cepat dibandingkan regenerasi jaringan dewasa seperti eksplan (Sulistiani et al. 2011). Merujuk pada perkembangan produk transgenik pada komoditas tanaman, maka peluang pengembangan komoditas perikanan transgenik di Indonesia juga berpotensi untuk dikembangkan, termasuk pada rumput laut K. alvarezii. Serangan penyakit ice-ice akibat kondisi lingkungan yang labil, merupakan salah satu permasalahan pada budidaya K. alvarezii, yang dapat diatasi melalui perbaikan kualitas genetik dengan transgenesis. Aplikasi transgenesis pada rumput laut (alga) sudah mulai dikembangkan dan telah memperlihatkan potensi yang besar di masa mendatang (Hallmann 2007; Walker et al. 2005). Penelitian transgenesis pada rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens juga telah sukses dilakukan (Fajriah et al. 2014; Handayani et al. 2014; Daud et al. 2013). Regulasi yang mengatur tentang syarat rilis dan peredaran produk transgenik di Indonesia juga telah diatur dengan Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 39 tahun 2010 dan diperbaharui menjadi Peraturan Presiden No. 53 tahun 2014 tentang Komisi Keamanan Hayati Produk Rekasaya Genetik (KKH-PRG). Dengan kekhasan pada rumput laut, maka beberapa penyesuaian diperlukan agar memenuhi syarat yang ada dalam peraturan tersebut.

39

7 SIMPULAN UMUM DAN SARAN 7.1 Simpulan Umum Konstruksi gen κ-Carrageenase berupa plasmid biner pMSH/κ-Car telah berhasil dibuat dan Agrobacterium tumefaciens yang membawa konstruksi gen tersebut telah berhasil diperoleh. Gen κ-Carrageenase telah berhasil ditransformasi ke rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36% dan bertunas sebesar 88,9%, dengan persentase transgenik sebesar 100%. Sintasan eksplan K. alvarezii pada pemeliharaan lanjut, untuk transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Analisis ekspresi menggunakan metode qrt-PCR menunjukkan bahwa gen κCarrageenase dapat diekspresikan dengan tingkat ekspresi relatif sama pada Kappaphycus alvarezii transgenik yang diuji. 7.2 Saran Diperlukan pemeliharaan eksplan Kappaphycus alvarezii transgenik pada wadah volume 1-2 ton secara terkontrol untuk mendapatkan ukuran talus yang memenuhi ukuran (200-300 gram) untuk analisis kandungan karagenan dan perbanyakan talus transgenik. Pada pembuatan rumput laut K. alvarezii transgenik, sebaiknya perlakuan transformasi gen target dilakukan pada fase embrio somatik dengan induksi kalus. Hal ini terkait dengan percepatan proses pembesaran dan regenerasi eksplan transgenik.

DAFTAR PUSTAKA Alimohammadi M, Bagherieh-Najjar M. 2009. Agrobacterium-mediated transformination of plants: basic principles and influencing factors. Afr J Biotechnol. 8(20):5142-5148. Alimuddin. 2003. Introduction and expression of foreign Δ6-desaturase-like gene in a teleostean fish [thesis]. Tokyo University of Fisheries, Japan. Beaumont AR, Boudry P, Hoare K. 2010. Biotechnology and Genetics in Fisheries and Aquaculture. 2nd edition. Blackwell Science Ltd. Blackwell Publishing Inc. 214p. Bernasconi P, Cruz-Uribe T, Rorrer G, Bruce N, Cheney DP. 2004. Development of a TNTdetoxifying strain of the seaweed Porphyra yezoensis through genetic engineering. J Phycol. 40(suppl.):31. Bevan M. 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research. 12:8711-8721. Campo VL, Kawano DF, Silva JDB, Ivone CI. 2009. Carrageenans: biological properties, chemical modifications and structural analysis. Carbohydrate Polymers. 77:167-180. Cheney DP. 2000. Agrobacterium-mediated genetic transformation of multicellular marine algae, resultant strains and their products. Northeastern University. United States. [internet]. [diacu 2012 Agustus 29]. Tersedia dari: http://www. patentlens.net/patentlens/patents.htmL?patnums. Cheney DP, Metz B, Stiller J. 2001. Agrobacterium-mediated genetic transformation in the macroscopic red alga Porphyra yezoensis. J Phycol. 37:11-12. Cheng R, Ma R, Li K, Rong H, Ling X, Wang Z, Yang S, Ma Y. 2012. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of marine microalgae Schizochytrium. Microbiological Research. 167(3):179-186. Clewell DB. 1993. Bacterial Conjugation (Defense Research Series 4). Publisher: Springer. ISBN: 0306443767. WAPI (Tower ID): 101313984. Daud RF, Widyastuti U, Suharsono, Suryati E, Parenrengi A. 2013. Introduksi gen sitrat sintase ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens. J Ris Akuakultur. 8(2):201-208. de la Riva GA, Gonzalez-Cabrera J, Vazquez-Padron R, Ayro-pardo C. 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic J Biotech. 1(3):118-133. Devlin RH, Biagi CA, Yesaki TY. 2004. Growth, viability and genetic characteristics of GH transgenic coho salmon strains. Aquaculture. 236:607632. [DPDPB-KKP] Direktorat Produksi Ditjen Perikanan Budidaya, Kementerian Kelautan Perikanan. 2011. Status Rumput Laut Indonesia, Peluang dan Tantangan [internet]. http://seaweed81jpr.blogspot.com. 18 Mei 2011. Doty MS. 1987. The Production and Use of Eucheuma dalam Doty MS, Caddy JF, Santelices B (editor). Case Studies of Seven Commercial Seaweed Resources. No.281. Roma (IT): FAO Technical Paper. p:123-161.

41

Douglas CJ, Stanloni RJ, Rubin RA, Nester EW. 1985. Identification and genetic analysis of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence region. J Bacteriol. 161:850-860. Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19:11-15. Dunham RA, Warr G, Nichols A, Duncan PL, Argue B, Middleton D, Liu Z. 2002. Enhanced bacterial diseases resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus, possessing cecropin genes. Mar Biotechnol. 4:338-344. Dunham RA. 2004. Aquaculture and fisheries biotechnology: genetic approach. Wallingford, Oxfordshire, UK: CABI Publishing. p372. Fajriah U, Suryati E, Parenrengi A, Suharsono, Widyastuti U. 2014. Introduksi gen metallothionein tipe II ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens. J Ris Akuakultur. 9(3):377-385. Gelvin SB. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annu Rev Plant Physiol Mol Biol. 51:223-256. Glick BR, Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press. Washington DC. 760p. Glicksman M. 1983. Food Hydrocolloids. Vol.2. CRC Press, Inc. Florida (US). 207 hal. Hallmann A. 2007. Algal transgenics and biotechnology. Trans Plant J. 1(1):8189. Handayani T, Alimuddin, Widyastuti U, Suryati E, Parenrengi A. 2014. Binary vector construction and mediated Agrobacterium tumefaciens transformation of lysozyme gene in seaweed Kappaphycus alvarezii. Biotropia. 21(2):80-90. Hannum S. 2012. Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (Cuzn-Sod) dari Melastoma Malabathricum L (Disertasi). Bogor (ID). Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 107 hal. Her GM, Chiang CC, Wu JL. 2004. Zebrafish intestinal fatty acid binding protein (I-FABP) gene promoter drives gut-specific expression in stable trangenic fish. Genesis. 38:26-31. Hiei Y, Komari T, Kubo T. 1997. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol. 35:205-218. Horikoshi T, Danenberg KD, Stadlbauer THW, Volkenandt M, Shea LCC, Aigner K, Gustavsson B, Leichman L, Roland Frösing, Ray M, Gibson NW, Spears CP, Danenberg PV. 1992. Quantitation of thymidylate synthase, dihydrofolate reductase, and DT diaphorase gene expression in human tumors using the polymerase chain reaction. Cancer Res. 52:108–116. Huddy SM, Meyers AE, Coyne VE. 2012. Transformation of lacZ using different promoters in the commercially important red alga, Gracilaria gracilis. African J Biotech. 11(8) :1879-1885. James DJ, Uratsu S, Cheng J, Negri P, Viss P, Dandekar AM. 1993. Acetosyringone and osmoprotectants like betaine or proline synergistically enhance Agrobacterium-mediated transformation of apple. Plant Cell Rep. 12:559-563.

42

Judd PK, Mahli D, Das A. 2005. Moleculer characterization of the Agrobacterium tumefaciens DNA transfer protein VirB6. Microbiology. 151:3483-3492. Kathiresan S, Chandrashekar A, Ravishankar GA, Sarada R. 2009. Agrobacterium-mediated transformation in the green alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae, Volvocales). J Phycol. 45(3):642-649. Kato K, Takagi M, Tamaru Y, Akiyama SI, Konishi T, Murata O, Kumai H. 2007. Construction of an expression vector containing a β-actin promoter region for gene transfer by microinjection in red sea bream Pagrus major. Fish Sci. 73:440-445. Khambathy Y, Mody K, Jha B. 2007. Purification and characterization of κcarrageenase from a novel γ-Proteobacterium, Pseudomonas elongata (MTCC 5261) syn. Microbulbifer elongatus comb. Nov. Biotechnol Bioprocess Eng. 12: 668-675. Khoo HW. 2000. Transgenesis and its applications in aquaculture. Asian Fish Sci. 8:1-25. Kobayashi SI, Alimuddin, Morita T, Miwa M, Lu J, Endo M, Takeuchi T, Yoshizaki G. 2007. Transgenic Nile tilapia Oreochromis niloticus overexpressing growth hormone showed reduced ammonia excretion. Aquaculture. 270:427-435. Li F, Qin S, Jiang P, Wu Y, Zhang W. 2009. The integrative expression of GUS gene driven by FCP promoter in the seaweed Laminaria japonica (Phaeophyta). J Appl Phycol. 21:287-293. Liberty, Herman M, Wattimena GA. 2008. Konstruksi plasmid biner pembawa gen Cry1Ab dan transformasi plasmid biner dengan metode tri parental mating. Zuriat. 19(2):130-139. Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-Time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25:402-408. Lu N, Zang Xi, Zhang Xu, Chen H, Feng X, Zhang L. 2012. Gene Cloning, Expression and Activity Analysis of Manganese Superoxide Dismutase from Two Strains of Gracilaria lemaneiformis (Gracilariaceae, Rhodophyta) under heat stress. Molecules. 17:4522-4532. Lutz CG. 2001. Practical Genetics for Aquaculture. Fishing New Books. Blackwell Science Company. (USA). p:218-219. McHugh DJ. 2003. A Guide to the Seaweed Industry. FAO Fisheries Technical Paper, Rome (BR) : FAO. No. 441. 105pp. Michel G, Chantalat L, Duee E, Barbeyron T, Henrissat B, Kloareg B, Dideberg O. 2001. The κ-carrageenase of P. carrageenovora features a tunnel-shaped active site: A novel insight in the evolution of clan-B glycoside hydrolases. Structure. 9:513-525. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha. Bogor (ID). 123 hal. Nasir M. 2002. Bioteknologi Potensi dan Keberhasilannya dalam Bidang Pertanian. PT.Raja Grafindo Persada. Jakarta (ID). 286 hal. Neish IC. 2005a. The Eucheuma Seaplant Handbook. “Taksonomi, Reproduksi dan Morfologi”. Matulessi LV, penerjemah. Makassar (ID): SEAPlantNet Technical Monograph. 48 hal.

43

Neish IC. 2005b. The Eucheuma Seaplant Handbook. “Fisiologi Dasar Tumbuhan Euchema”. Matulessi LV, penerjemah. Makassar (ID): SEAPlantNet Technical Monograph. 14hal. Pfaffl MW. 2004. Quantification strategies in real-time PCR. In: Bustin SA (ed), A–Z of Quantitative PCR. La Jolla, CA: IUL Biotechnology Series, International University Line. pp. 87-120. Potvin G, Zhang Z. 2010. Strategies for high-level recombinant protein expression in transgenic microalgae: A review. Biotechnology Advances. 28:910-918. Provasoli L. 1968. Media and prospects for the cultivation of marine algae. In Watanabe A, Hattore A [eds.] Culture and Collection of Algae. Tokyo (JP): Jap Soc Plant. Physiol. p:63-75. Rajamuddin MAL, Jaya AA, Ridwan, Suryati E. 2010. Callus induction of Kappaphycus alvarezii for somatic embryos production. J Ris Akuakultur. 5(2):211-219. Rajamuddin MAL, Alimuddin, Widyastuti U, Faizal I. 2014. Evaluation of different promoters driving the GFP reporter gene in seaweed Kappaphycus alvarezii. Indonesian Journal of Biotechnology. 19(2):129-135. Rashid H, Afzal A, Khan MH, Chaudhry Z, Malik SA. 2010. Effect of bacterial culture density and acetosyringone concentration on Agrobacterium mediated transformation in Wheat. Pak J Bot. 42(6):4183-4189. Reddy CRK, Kumar GRK, Siddhanta AK, Tewari A. 2003. In vitro somatic embryogenesis and regeneration of somatic embryos from pigmented callus of Kappaphycus alvarezii (Doty) (Rhodophyta, gigartinales). J Phycol. 39:610-616. Rogers HJ, Maund SL, Johnson LH. 1985. A β-galactosidae-like gene is expressed during tobacco pollen development. J Exp Bot. 52(354):67-75. Rosen R, Ron EZ. 2011. Proteomics of a plant pathogen: Agrobacterium tumefaciens. Proteomics. 11:3134-3142. Sambrook J, Fritsch ED, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY. 2nd ed. 4955pp. ISBN:7-03-002808-2/Q.372. Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW. 2000. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal Biochem. 285(2):194-204. Suharsono U, Fujisawa Y, Kawasaki T, Iwasaki Y, Satoh H, Shimamoto K. 2002. The heterotrimeric G protein a subunit acts upstream of the small GTPase Rac in disease resintance of rice. Proc Natl Acad Sci. 99:13307-13312. Sukardi MF, Kusnendar E, Ahda A, Surono A, Imam A, Batubara I, Ismanji I, Suitha IM, Yunaidar R, Setawan, Kurnia N, Danakusumah E, Sulistijo, Zatnika A, Basmal J, Effendi E, Runtuboy N. 2005. Profil Rumput Laut Indonesia. Ditjenkan Budidaya, Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta (ID). 169 hal. Sulistiani E, Soelistyowati DT, Yani SA. 2011. Thallus Regeneration from Callus of Cottonii Seaweed Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty. Research Report of DIPA 2011. SEAMEO BIOTROP. Bogor.

44

Sulistiani E, Soelistyowati DT, Alimuddin , Yani SA. 2012. Callus induction and filaments regeneration from callus of cottonii seaweed Kappaphycus alvarezii (Doty) collected from Natuna Islands, Riau Islands Province. Biotropia. 19(2):103-114. Tanaka S, Suda Y, Ikeda K, Ono M, Miyasaka H, Watanabe M, Sasaki K, Hirata K. 2007. A novel gene with antisalt and anticadmium stress activities from a halotolerant marine green alga Chlamydomonas sp.W80. FEMS Microbiol Lett. 271:48-52. Tayco CC, Tablizo FA, Regalia RS, Lluisma AO. 2013. Characterization of a κcarrageenase-producing marine bacterium, isolate ALAB-001. Philippine J Sci. 142 (1):45-54. Tsen SD, Fang SS, Chen MJ, Chien JY, Lie CC, Tsen DHL. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. J Biomed Sci. 9(3):246-252. Tu Z., He G, Li KX, Chen MJ, Chang J, Chen L, Yao Q, Liu DP, Ye H, Shi J, Wu X. 2005. An improved system for competent cell preparation and high efficency plasmid transformation using different Escherichia coli strains. Electronic Journal of Biotechnology. 8(1):113-120. Tzfira T, Citovsky V. 2002. Partners-in-infection: host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium. Trends Cell Biol. 12(3):121-129. Van de Velde F, Knutsen SH, Usov AI, Romella HS, Cerezo AS. 2002. ”1H and 13C High Resolution NMR Spectoscopy of Carrageenans: Aplication in Research and Industry”. Trend in Food Science and Technology. 13:73-92. Vieira ALG, Camilo CM. 2011. Agrobacterium tumefasciens-mediated transformation of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Fungal Genetics and Biology. 48:806-811. Villanueva RD, Montaño MNE. 2003. Fine chemical structure of carrageenan from the commercially cultivated Kappaphycus striatum (sacol variety) (SOLIERIACEAE, GIGARTINALES, RHODOPHYTA). J Phycol. 39:513-518. Volckaert FA, Hellemans BA, Galbusera P, Ollevier F. 1994. Replication, expression, and fate of foreign DNA during embryonic and larval development of the African catfish Clarias gariepinus. Mol Mar Biol Biotechnol. 3:57-69. Walker TL, Collet C, Purton S. 2005. Algal transgenic in the genomic era. J Phycol. 41:1077-1093. Wang R, Zhang P, Gong Z, Hew CL. 1995. Expression of the antifreeze protein gen in transgenic goldfish Carassius auratus and its implication in cold adaptation abstract. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 4:2026. Wang J, Jiang P, Cui Y, Deng X, Li F, Liu J, Qin S. 2010. Genetic transformation in Kappaphycus alvarezii using micro-particle bombardment: a potential strategy for germ plasm improvement. Aquacult Int. 18(6):1027-1034. Wang J, Sommerfeld M, Hu Q. 2011. Cloning and expression of isoenzymes of superoxide dismutase in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under oxidative stress. J Appl Phycol. 23:995-1003. Winans SC. 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions. Microbiol Rev. 56 (1):12-31

45

Winarno FG. 1996. Teknologi Pengolahan Rumput Laut. Pustaka Sinar Harapan. Jakarta (ID). 112 hal. Wise AA, Liu Z, Binns AW. 2006. Three methods for introduction of foreign DNA into Agrobacterium. Meth Mol Biol. 343(1):43-54. Wu SM, Hwang PP, Hew CL, Wu JL. 1998. Effect of antifreeze protein on cold tolerance in juvenile tilapia Oreochromis mossambicus Peters and milkfish Chanos chanos Forsskal. Zoo Stud 37:39-44. Yuwono T. 2006. Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press. 284 hal. Zhou M, Ma J, Li J, Ye H, Huang K, Zhao X. 2008. A κ-carrageenase from a newly isolated Pseudoalteromonas-like Bacterium, WZUC10. Biotechnol Bioprocess Eng. 13:545-551.

46

LAMPIRAN

47

Lampiran 1 Komposisi media PES (Prevasoli’s Enriched Seawater) stok Bahan

Kandungan

NaNO3

3,5 g

Β-gliserophosphat

0,5 g

Fe

25 mL (1 mol)

PII metal

250 mL

Vitamin B12

100 μg

Thiamin (Vitamin B1)

5 mg

Biotin (Vitamin B6)

5 μg

Tris

5 mg

Akuades Steril

1000 ml

Komposisi PII metal: H2EDTA

250 mg

FeCl3

2,5 mg

H3BO3

10 mg

MnCl2

10 mg

ZnCl2

1,25 mg

CaCl2

0,25 mg

Akuades steril

500 mL

48

Lampiran 2 Gambar pemeliharaan secara steril eksplan Kappaphycus alvarezii pascatransformasi menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan

49

Lampiran 3 Komposisi bahan bufer ekstraksi DNA dengan metode CTAB 2x Bahan

Kandungan

NaCl

5M

CTAB

2%

EDTA pH 8

0,5 M

Tris-HCl pH 8

1M

PVP

3%

50

Lampiran 4 Gambar pemeliharaan lanjut semi steril eksplan Kappaphycus alvarezii transgenik menggunakan botol kerucut volume 1500 ml yang dilengkapi dengan aerasi

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Batuasang Kecamatan Hero Lange-lange Kabupaten Bulukumba, pada tanggal 28 April 1971 dari ayah L.Rajamuddin dan ibu Husniah. Penulis merupakan anak kelima dari 10 (sepuluh) bersaudara. Menjalani pendidikan dasar sampai SLTA di Bulukumba, salah satu kabupaten di bagian Selatan dari Sulawesi-Selatan. Penulis tamat Sekolah Pertanian Pembangunan (SPP) tahun 1989 dan diterima menjadi PNS di Politeknik Pertanian UNHAS tahun 1990 sebagai pelaksana di Laboratorium Kesehatan Ikan. Sambil melaksanakan tugas-tugas sebagai PNS, penulis melanjutkan pendidikan Sarjana (S1) pada Program studi Budidaya Perairan, Fakultas Pertanian Universitas Muhammadiyah Makassar (1996-2002). Selama mengikuti pendidikan S1, penulis aktif di salah satu organisasi keilmuan mahasiswa Aquatic Study Club Makassar (ASCM) dan menjabat Ketua II periode kepengurusan 1999-2000. Tahun 2005 penulis dialihkan status kepegawaian menjadi Dosen di unit kerja yang sama Politeknik Pertanian Negeri Pangkep (eks UNHAS). Tahun 2007-2010 penulis mengikuti pendidikan Magister (S2) pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor di Program studi Ilmu Akuakultur dengan biaya BPPS (Bantuan Pendidikan Pascasarjana) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) DEPDIKNAS. Tahun 2011 penulis kembali melanjutkan pendidikan Doktor (S3) pada Program studi dan sumber pembiayaan yang sama, seperti saat S2. Artikel ilmiah berjudul “Konstruksi vektor biner gen Kappa(κ)Carrageenase dan transformasi ke Agrobacterium tumefaciens sebagai media untuk pembuatan rumput laut transgenik” telah diseminarkan secara oral pada Simposium Nasional Kelautan dan Perikanan II di Universitas Hasanuddin, Makassar pada tanggal 9 Mei 2015, dan telah acceptable pada Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis Vol. Juni 2016. Artikel lainnya berjudul “Transformation of Kappa(κ)-Carrageenase gene in seaweed Kappaphycus alvarezii [Doty]” telah diseminarkan secara oral pada Seminar Nasional Bioteknologi di Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta pada tanggal 18 Oktober 2014, dan telah difinalisasi untuk publikasi Vol. September 2016 pada Pakistan Journal of Biotechnology. Karya-karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari disertasi ini selama penulis mengikuti program S3. Penelitian disertasi ini, merupakan rangkaian penelitian S2 penulis yang merupakan satu kesatuan yang tidak terpisahkan. Penggunaan promoter CaMV 35S pada konstruksi gen yang digunakan pada penelitian S3, merupakan kesimpulan hasil penelitian pendahuluan, dan artikel ilmiahnya berjudul “Evaluation of different promoters driving the GFP reporter gene in seaweed Kappaphycus alvarezii” telah dipublikasikan pada Indonesian Journal of Biotechnology 19(2):129-135 tahun 2014.