REGENERASI ANAKAN RUMPUT LAUT HASIL TRANSFORMASI GEN Metallothionin TYPE II PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MENGGUNAKAN MEDIA YANG BERBEDA

787

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2014

REGENERASI ANAKAN RUMPUT LAUT HASIL TRANSFORMASI GEN Metallothionin TYPE II PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MENGGUNAKAN MEDIA YANG BERBEDA Emma Suryati*), Andi Parenrengi*), Utut Widyastuti**), Andi Tenriulo*), dan Rosmiati*) *) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan E-mail: [email protected] **) PAU-Institut Pertanian Bogor

ABSTRAK Transformasi gen metallothionin (Mamt) type II pada rumput laut Kappaphycus alvarezii telah berhasil dilakukan melalui mediasi Agrobacterium tumefacien, diinokulasi dengan bakteri yang mengandung plasmid PlG6 yang membawa gen MaMt2 melalui seleksi bertingkat menggunakan hygromisin 10 dan 20 ppm, dengan efisiensi transformasi dalam K. alvarezii pada media seleksi I adalah 82,07%, dan pada media seleksi II adalah 84,21%, dengan efisiensi regenerasi tunas transgenik pada K. alvarezii adalah 98,43%. Evaluasi gen MaMt2 pada anakan rumput laut dilakukan melalui analisis PCR di bawah kendali promotor ubiquitin dan nos terminator. Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen MaMt2 dilakukan pada media cair yang diperkaya dengan pupuk PES, Conwy,Grund dan SSW (kontrol), pada salinitas 30 ppt, dengan pH berkisar 6-8, untuk memacu pertumbuhan tunas, media diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat potensi regenerasi anakan hasil transformasi gen MaMt2 menggunakan media yang berbeda serta keberadaan gen MaMt2 pada anakan rumput laut hasil transformasi. Hasil analisis memperlihatkan media yang paling baik digunakan adalah media PES dengan sintasan mencapai 94%, walaupun tidak berbeda dengan media Grund (82%), berbeda dengan SSW dan Conwy. pH optimal untuk regenerasi anakan rumput laut adalah pada pH 6, dan laju pertumbuhan harian yang paling tinggi pada media yang diperkaya dengan campuran IAA dan BAP dengan perbandingan 1:2. Hasil analisis PCR memperlihatkan band pada 500 kb menunjukkan keberadaan gen MaMt2 pada anakaan rumput laut hasil transformasi. KATA KUNCI:

regenerasi, transformasi gen MaMt2, Kappaphycus alvarezii

PENDAHULUAN Kebutuhan rumput laut Kappaphychus alvarezii (DOTY) atau Eucheuma cotonii untuk berbagai kebutuhan baik industri maupun untuk bahan pangan sehari-hari semakin meningkat, sejalan dengan program pemerintah untuk meningkatkan produksi rumput laut hingga 10 juta ton pada akhir tahun 2014 (KKP, 2013). Kendala yang sering dihadapi petani dalam rangka peningkatan produksi ini adalah terbatasnya ketersediaan bibit yang berkualitas tinggi, lemahnya ketahanan terhadap penyakit iceice, serta kurangnya ketahanan terhadap cekaman lingkungan biotik maupun abiotik yang sering terjangkit pada lahan budidaya. Ketersediaan bibit yang berkualita sangat dipengaruhi oleh musim, salinitas, suhu, intensitas cahaya serta kondisi lingkungan perairan yang digunakan untuk membudidayakan rumput laut (Yulianto & Mira, 2009; Mamboya, 2007). Limbah industri, minyak bumi dan limbah rumah tangga merupakan sumber polusi dan pencemaran pada lingkungan, hal ini menjadi masalah yang serius serta dapat berakibat langsung terhadap pertumbuhan dan sintasan organisme pantai khususnya pada makroalgae (Mamboya, 2007). Tiram Crassostrea corteziensis, alga hijau Ulva compressa) dan alga coklat Laminaria digitata dan Sargassum sp. sering digunakan sebagi bioindikator logam berat secara alami (Contreras-Porcia et al., 2011; Bernal-Herna´ndez et al., 2010 dan Davis et al., 2003). Efek toksisitas logam berat seperti Cu pada alga dapat menyebabkan fotoinhibitor pada photosystem II yang berakibat pada Reactive Oxygen Species (ROS) dan disfungsi kloroplas (Owen et al., 2012). Metallothioneins (MT) merupakan protein dengan berat molekul rendah (4 – 8 kDa), kaya akan sistein dengan kemampuan mengikat atom logam (Moilanen et al., 1999; Mir et al., 2004). Sintesis metallothionin tidak hanya diinduksi oleh beberapa logam berat seperti Cd, Zn, dan Cu, tetapi juga

Page 803 of 1000

Page 1 of 10

Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen ..... (Emma Suryati)

788

menjadi mediator pada stress fisiologis, termasuk hormon dan Reactive Oxygen Spesies (ROS) (Shestivska, et al., 2011). Anggraito (2012) telah berhasil melakukan transformasi genetik pada tanaman Nicotiana benthamiana L. dan kedelai dengan menggunakan gen MaMt2 yang berasal dari Melastoma affine, sehingga diperoleh tanaman yang tahan terhadap cekaman aluminium. Perbaikan mutu genetik rumput laut, telah dirintis melalui kultur jaringan, fusi protoplas serta transformasi genetik pada rumput laut Porphyra yezoensis (Suryati et al., 2010; Cheney, 2000). Transformasi genetik melalui mediasi Agrobacterium tumefaciens yang umumnya digunakan pada tanaman tingkat tinggi, fungi, yeast dan sel manusia (Vieira & Camilo, 2011), juga dapat digunakan pada transformasi genetik pada algae dan rumput laut (Daud et al., 2013; Suryati et al., 2013). Upaya peningkatan toleransi rumput laut K. alvarezii terhadap kondisi lingkungan perairan yang tercemar logam berat telah dilakukan melalui perbaikan genetik berupa transformasi gen MaMt2 pada K. alvarezii menggunakan perantara A. Tumefaciens untuk meningkatkan pertahanan rumput laut terhadap kondisi lingkungan yang tercemar logam berat (Fajriah et al 2014). Namun upaya tersebut masih dalam skala laboratorium sehingga diperlukan teknik transformasi dan regenersi anakan agar diperoleh bibit dan anakan yang dapat dimanfaatkan oleh masyarakat. Penelitian ini bertujuan untuk melihat regenerasi serta perbanyakan rumput laut K. alvarezii hasil transformasi gen MaMt2 melalui perantara A. Tumefaciens, menggunakan media kultur dan pupuk yang berbeda. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium BPPBAP Maros, Januari 2013 sampai dengan Oktober 2013. Bahan Penelitian Rumput laut K. alvarezii yang digunakan merupakan rumput laut hasil seleksi varietas dari Kab. Takalar. Media pertumbuhan rumput laut Provasoli Enrichment Seawater (PES), kultur Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 mengandung plasmid pIG6 yang membawa gen MaMt2 dibawah kendali promotor ubiquitin (Anggraito, 2012). Peta plasmid pIG6 yang membawa gen MaMt2 di sajikan pada Gambar 1.

Gambar 1. Peta fisik plasmid pIG6 (Anggraito, 2012) Primer UbiQF (5’-TGATGGCCCTGCCTTCATACG-3’), NosTR1 (5’-CTCATAAATAACGTCATGCATTACA-3’), NosTR2 (5’-TGCCGGTCTTGCGATGATTA-3’), SMt2UF (5’-TCATGGATCCATGTCTTGCTGTGGAGG-3’) dan SMt2UR (5’-GTCAACTAGTTCACTTGCAGGTGCAAG-3’) digunakan untuk mendeteksi keberadaan gen MaMt2 di dalam genom rumput laut transgenik. Metode Penelitian Persiapan Rumput Laut Thalus rumput laut yang akan digunakan sebagai eksplan merupakan rumput laut K.alvarezii hasil seleksi varietas dari Kab. Takalar. Sulawesi Selatan . Thalus yang sehat dipotong sepanjang 5 cm dan di bersihkan dari kotoran yang menempel. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan 1% larutan

Page 804 of 1000

Page 2 of 10

789

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2014

iodine dan 0,05% larutan antibiotik. Eksplan yang telah di sterilisasi ditumbuhkan pada media PES cair, di goyang menggunakan shaker kecepatan 100 rpm dengan suhu 23°C selama 1 minggu. Eksplan yang bertahan hidup selanjutnya dipotong sepanjang 2 cm dan dikultur selama 1 bulan dengan subkultur dilakukan setiap 2 minggu sekali. Eksplan siap diinokulasi dengan A. tumefaciens. Kokultivasi Metode transformasi genetik pada rumput laut K. alvarezii menggunakan metode Cheney (2000) dan Anggraito (2012) yang telah dimodifikasi. Bakteri A. tumefaciens strain LBA 4404 yang mengandung plasmid pIG6-SMt2 ditumbuhkan pada 5 ml media LB yang mengandung antibiotik (100 mg/L streptomisin, 50 mg/L kanamisin, 50 mg/L higromisin) pada suhu ruangan, digoyang dengan kecepatan 220 rpm selama 2 hari. Suspensi bakteri yang tumbuh selanjutnya di subkultur pada media yang sama selama 18 jam. Bakteri yang tumbuh selanjutnya di sentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Pelet bakteri yang diperoleh diresuspensi dengan media PES cair dan penambahan 100 µM Acetosyringone hingga mencapai OD600= 0,5-1. Eksplan yang siap ditransformasi sebelumnya di lukai dengan menggunakan jarum steril diseluruh permukaan, selanjutnya eksplan di masukkan ke dalam media infeksi selama 15-60 menit pada shaker dengan kecepatan 100 rpm. Eksplan yang telah diinfeksi dipindahkan pada media kokultivasi berupa media PES cair yang diberi penambahan 100 µM Acetosyringone selama 3 hari pada kondisi gelap. Seleksi Eksplan dari media kokultivasi selanjutnya dibilas dengan air laut steril yang mengadung cefotaxim 100 ppm, kemudian dipindahkan pada media recovery I (media PES cair dengan penambahan ZPT 0,1 NAA: 0,5 BAP) selama 2 minggu. Eksplan yang tumbuh pada media recovery I eksplan dipindahkan pada media seleksi yaitu media PES cair yang di beri penambahan higromisin 10 mg/L (seleksi I) dan diinkubasi selama 7 hari. Eksplan yang hidup pada media seleksi I dipindahkan pada media seleksi II (higromisin 20 mg/L) dan diinkubasi selama 14 hari. Eksplan yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya dipindahkan pada media recovery II (media PES cair dengan ZPT 0,1 NAA: 0,5 BAP) hingga tumbuh tunas baru. Analisis Tanaman Transgenik Sebanyak 0,1 g tunas yang tumbuh pada media recovery II diisolasi DNA menggunakan metode (Wattier et al 2000). DNA hasil isolasi dianalisis PCR menggunakan primer UbiQF dan Primer NosTR2 dan primer Smt2UF dan NosTR1. Campuran reaksi yang digunakan adalah 100 ng DNA genom; 0,5 µl masing-masing primer Foward dan Reverse (10 pmol/µl); 2 µl 1x buffer PCR; 2 µl dNTPmix; 0,2 µl Tag Polymerase dan ditambah dengan ddH2O hingga volume total reaksi 20 µl. Analisis dilakukan dengan kondisi PCR: pra PCR 950C, 5 menit; denaturasi 940C, 30 detik; penempelan primer 600C, 30 detik; pemanjangan 720C, 30 detik dan reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus; dan diakhiri dengan pasca PCR 200C, 10 menit. Hasil PCR dielektroforesis menggunakan 1% gel agarosa pada 100 volt selama 28 menit. Gel divisualisasi di atas UV transluminator setelah diwarnai dengan ethidium bromide. Regenerasi dan Perbanyakan Rumput Laut Hasil Trangenik Eksplan rumput laut hasil transformasi yang mengandung gen Mamt II, dipindahkan pada media cair yang diperkaya dengan pupuk antara lain PES, Grund dan SSW sebagai kontrol. Penggunaan ZPT untuk merangsang pertumbuhan eksplan dilakukan dengan campuran Indol Acetic Acid (IAA) dan Benzyl Amino Purin (BAP) dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 2:1, pada media terbaik pada kegiatan di atas, pemeliharaan eksplan dilakukan pada labu yang dilengkapi dengan aerasi diletakan di dalam Cultur chamber pada suhu 20OC. HASIL DAN BAHASAN Transformasi K. alvarezii dengan Gen MaMt2 Transformasi genetik pada K. alvarezii dilakukan menggunakan potongan thalus yang ditumbuhkan pada media PES cair. Eksplan yang telah diadaptasikan pada media PES cair diinokulasi dengan A.

Page 805 of 1000

Page 3 of 10

Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen ..... (Emma Suryati)

790

tumefaciens yang membawa gen Mamt2 dengan teknik kokultivasi dengan penambahan 100 µM acetosyringone selama 3 hari pada media PES cair dengan kondisi gelap dan suhu 230C. Konsentrasi acetosyringone yang diberikan sesuai dengan yang diberikan oleh Cheney (2000) pada transformasi rumput laut Porphyra yezoensis menggunakan A. tumefaciens. Perendaman eksplan pada suspensi bakteri dimaksudkan untuk memberi kesempatan kontak antara bakteri agrobacterium dengan air laut dan eksplan dengan bakteri agrobacterium pada media infeksi (Cheney, 2000). Eksplan dari media kokultivasi, direndam dengan air laut steril yang mengandung 100 ppm cefotaxim untuk menghilangkan agrobakteri yang masih berada pada thalus rumput laut, selanjutnya dipindahkan pada media recovery I yaitu media PES semi solid yang diperkaya dengan penambahan ZPT (0,1 IAA: 0,5 BAP) selama 14 hari. Thalus yang telah ditumbuhkan media kokultivasi terdapat beberapa jenis yaitu 1). Thalus yang tidak mengalami perubahan bentuk dan warna yaitu coklat tua; 2). Thalus yang mengalami perubahan warna menjadi coklat muda dan pada bagian ujung terdapat warna kemerahan dan terdapat kerutan pada dinding thalus. Eksplan yang mengalami perubahan warna umumnya tidak bertahan lama pada media recovery I, hal ini ditandai dengan perubahan thalus menjadi berwarna putih transparan dan akhirnya mati (Gambar 2b).

B

A

Gambar 2. Tahap inokulasi thalus K. alvarezii; A) Eksplan pada media recovery I. Bar=1 cm B) Eksplan pada media kokultivasi Untuk mengetahui eksplan yang terintegrasi dengan gen Mamt2 maka dilakukan seleksi menggunakan agen seleksi yang terdapat pada peta plasmid pIG6 yaitu higromisin. Higromisin dan kanamisin adalah agen seleksi yang umum digunakan untuk menentukan keberhasilan dari transformasi (Torregrosa et al., 2000). Seleksi higromisin pada penelitian ini dilakukan secara bertingkat, dimana pada seleksi I dengan konsentrasi higromisin 10 mg/L selama 7 hari dan seleksi II dengan konsentrasi higromisin 20 mg/L selama 14 hari. Pada penelitian transformasi K. alvarezii yang sama, Daud et al. (2013) melakukan seleksi menggunakan higromisin dengan konsentrasi 10 mg/L, dan Handayani (2012) menggunakan higromisin dengan konsentrasi 20 mg/L. Menurut Anggraito (2012) seleksi bertingkat dimaksudkan untuk mendapatkan tanaman transgenik dengan persentase yang lebih tinggi dan mengurangi adanya tanaman transgenik palsu. Dari 520 eksplan yang diinokulasi dengan Agrobacterium yang mengandung gen Mamt II, kemudian dikultur pada media seleksi I (hygromisin 10 ppm) yang hidup sebanyak 380 eksplan (73,07%), kemudian pada seleksi II diperoleh eksplan yang tahan sebanyak 320 (84,21%). Selanjutnya eksplan yang tahan pada media seeksi II yang diinkubasi selama 14 hari, dipindahkan pada media recovery I yaitu media PES semi solid yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 0,1 : 0,5 ppm, memperlihatkan eksplan yang ditanam pada media ini dapat beregenerasi sebanyak 315 (94,21%) (Tabel 1). Persentase eksplan yang hidup pada media seleksi higromisin ini lebih tinggi dibandingkan dengan persentase hasil seleksi higromisin pada penelitian transformasi K. alvarezii yang dilakukan oleh Handayani (2012) sebesar 23,56% dan penelitian yang dilakukan oleh Daud (2013) sebesar 7,5%. Eksplan yang diperoleh dari hasil seleksi higromisin selanjutnya ditumbuhkan pada media recovery II yaitu media PES semi solid dengan penambahan ZPT (0,1 IAA; 0,5 BAP). Suryati et al (2009) menyatakan bahwa kombinasi ZPT dari golongan auxin dan sitokinin pada media pertumbuhan akan menghasilkan kristal filamen dan embrio sebagai anakan rumput laut. Anakan rumput laut

Page 806 of 1000

Page 4 of 10

791

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2014

Tabel 1. Perkembangan eksplan selama transformasi dan seleksi

Perlakuan

Jumlah eksplan

Inokulasi*

520

Tidak Diinokulasi**

80

Tidak Diinokulasi***

80

Seleksi I

Seleksi II

Jumlah Efisiensi eksplan regenerasi beregenerasi

Hidup

Mati

Hidup

Mati

380 (73,07%) 60 (75%) 72 90%)

140

320 (84,21%) 36 (60%) 70 (97,22)

60

315

98,43%

24

30

83,3%

2

20

28,57%

20 8

* diinokulasi dengan A. Tumefaciens ** di tumbuhkan pada media higromisin 20 mg/L *** ditumbuhkan pada media yang tidak mengandung higromisin

A

B

C

D

Gambar 3. Perkembangan eksplan pada media Seleksi Bertingkat. A). Eksplan transforman di media seleksi I (higromisin 10 mg/L); B). Eksplan transforman di media seleksi II (higromisin 20 mg/L); C) Eksplan transforman di media recovery I; D). Eksplan non transforman di media recovery ke II. Bar= 1 cm pada penelitian ini berupa tunas-tunas baru yang tumbuh pada eksplan yang ditransfomasi. Tunastunas baru yang tumbuh selanjutnya disebut sebagai tunas transgenik putatif. Analisis Integrasi Gen Mamt2 pada K. alvarezii Isolasi genom K.alvarezii yang mengandung gen Mamt II dilakukan menggunakan metode (Wattier et al 2000) dapat dilihat pada Gambar 4. Tunas baru yang tumbuh pada eksplan yang hidup pada media recovery II selanjutnya diisolasi DNA dan dianalisis PCR. 135 tunas baru yang tumbuh pada eksplan, dianalisis menggunakan pasangan primer dari promotor-terminator dan gen-terminator. Hasil analisis PCR dapat dilihat pada Gambar 5.

Page 807 of 1000

Page 5 of 10

Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen ..... (Emma Suryati)

1

2

3

4

5

6

7

792

8

Gambar 4. Elektroforesis DNA genome rumput laut K.alvarezii, M = marker DNA ë/H Ind III, Columns 1-7 = DNA samples

Gambar 5. Hasil analisis PCR. (a) primer UbiqF-NosTR2 dan (b) Primer Smt2F-NosTR1. Kolom 1&10= kontrol positif (plasmid pIG6); 2&9 = kontrol negatif (NT); 3-8 = sampel DNA. M= marker 1 Kb ladder Analisis PCR pada tunas transgenik putatif pada kolom 1-4 menggunakan primer UbiQF-NosTR2, menghasilkan pita berukuran 431 pb. Hasil ini sesuai dengan kontrol positif dari plasmid pIG6. Hasil PCR tersebut dikonfirmasi ulang menggunakan primer Smt2F-NosTR1 dengan pita berukuran 450 pb. Pita yang dihasilkan sesuai dengn kontrol positif yang menggunakan DNA dari plasmid pIG6. Pita yang dihasilkan menunjukkan bahwa tunas rumput laut yang dianalisis adalah tanaman transgenik yang mengandung gen Mamt2 dibawah promotor ubiquitin dan terminator NosTR. Konfirmasi menggunakan primer yang sama juga dilakukan pada DNA rumput laut non transgenik (kolom 2 dan 9). Hasil analisis PCR pada sampel rumput laut non trangenik tidak menghasilkan pita DNA. Sehingga dapat dipastikan bahwa primer yang digunakan spesifik terhadap promotor dan terminator yang terdapat pada plasmid pIG6. Regenerasi dan Perbanyakan Rumput Laut Transgenik Regenerasi eksplan rumput laut transgenik dilakukan pada media cair dengan pupuk yang berbeda antara lain SSW, PES, Conwy dan Grund. hasil penelitian memperlihatkan sintasan yang paling tinggi pada media PES dan Grund, berbeda nyata dengan SSW, namun tidak berbeda nyata dengan media Conwy (Gambar 6). Hal ini disebabkan kebutuhan nutrien pada rumput laut dapat dipenuhi oleh nutrien yang berada pada media yang diperkaya dengan PES dan grund, selain itu eksplan yang digunakan memang diadaptasi pada media dengan pupuk yang sama sehingga tidak perlu menyesuaikan diri dengan lingkungannya sendiri (Gambar 6)

Page 808 of 1000

Page 6 of 10

793

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2014 94ab

100

80ab

Sintasan

80 60 44ab 40 20

15a

0 SSW

PES

Grund

Convy

Pupuk

Gambar 6. Sintasan rumput laut hasil transformasi gen Mamt pada media kultur dengan pupuk yang berbeda Nilai yang diikuti huruf yang sama pada setiap diagram batang menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05)menggunakan uji LSD Untuk memacu pertumbuhan tunas pada rumput laut transgenik dilakukan pada media PES yang diperkaya dengan penambahan ZPT antara lain dari golongan auksin dan sitokinin antara lain IAA dan BAP dengan perbandingan 1:1, 1 : 2, dan 2:1. Dapat meningkatkan kemampuan untuk bertumbuh dan beregenerasi (Suryati et al 2009). Hasil analisis memperlihatkan pertumbuhan tunas yang paling baik yaitu pada media PES yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 1:2, berbeda nyata dengan kontrol, namun tidak berbeda dengan perbandingan 1:1, dan 2:1, demikian juga kontrol tidak berbeda nyata dengan perbandingan 1:1 dan 2:1..

Gambar 7. Laju pertumbuhan eksplan transgenik yang kultur pada media yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan a: IAA:BAP= 1: 1; b: IAA:BAP = 1:2; c: IAA :BAP= 2:1 Eksplan yang mengandung tunas transgenik putatif selanjutnya ditumbuhkan pada media pertumbuhannya yaitu media PES dengan penambahan ZPT ( IAA : BAP= 1:2), namun tunas tersebut mengalami pertumbuhan yang lebih lambat jika dibandingkan dengan tunas non transgenik pada eksplan yang sama. Tunas transgenik putatif yang berumur 3 bulan memiliki panjang tunas kurang dari 1 mm, sedangkan tunas non transgenik dengan umur yang sama memiliki panjang tunas 5 mm.

Page 809 of 1000

Page 7 of 10

Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen ..... (Emma Suryati)

A

B

C

D

794

Gambar 8. Regenerasi transgenik rumput laut K.alvarezii pada media PES yang diperkaya dengan IAA dan BAP (A) pemeliharaan 2 minggu, (B) 4 minggu, (C) 6 minggu (D) 8 minggu KESIMPULAN Gen Mamt2 pada plasmid pIG6 telah berhasil diintroduksikan ke dalam rumput laut K. alvarezii melalui A. tumifaciens. Dari hasil transformasi genetik di peroleh 315 tunas transgenik putatif dengan dengan efisiensi transformasi 98,43%. Media regenerasi yang paling baik yaitu media PES yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 1:2. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terimakasih diberikan atas kerjasama riset Balai Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya Air Payau (BPPBAP) Maros dengan PPSHB-IPB, sehingga penelitian ini dapat berjalan sesuai dengan yang direncanakan. DAFTAR ACUAN Anggraito YU. 2012. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana L. dan Kedelai dengan Gen MaMt2 penyandi Metallothionein Tipe II dari Melastoma malabathricum L. [Disertasi]. Bogor [ID]: Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bernal-Herna´ndez YY, Medina-Dý´az IM, Robledo-Marenco ML, Vela´zquez-Ferna´ndez JB, Giro´nPe´rez MI, Ortega-Cervantes L, Maldonado -Va´zquez WA, Rojas-Garcý´a AE. 2010. Acetylcholinesterase and metallothionein in oysters (Crassostrea corteziensis) from a subtropical Mexican Pacific estuary. Ecotoxicol 19:819–825. doi:10.1007/s10646-009-0459-2. Cheney, 2000. Cheney DP. 2000. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Multicellular Marine Algae, Resultant Strains And Their Products. International classes. Northeastern University (Huntington Avenue Boston) US. http://ip.com/patfam/en/22440221. [tanggal akses 20 september 2012]. Contreras-Porcia L, Dennett G, González A, Vergara E, Medina C, Correa JA, Moenne A. 2011. Identification of Copper-Induced Genes in the Marine Alga Ulva compressa (Chlorophyta). Mar Biotechnol 13:544–556. doi:10.1007/s10126-010-9325-8.

Page 810 of 1000

Page 8 of 10

795

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2014

Daud R. F, Utut Widyastuti, Suharsono, Emma Suryati dan Andi Parenrengi. 2013. Introduksi Gen Sitrat sintase ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobactrium tumefaciens ISSN 1907-6754. Vol 8 No 2 hal 201-208. 7 hal Davis et al., 2003 Davis TA, Volesky B, Mucci A. 2003. A review of the biochemistry of heavy metal biosorption by brown algae. Water Res 37: 4311–4330. doi:10.1016/S0043-1354(03)00293-8. Fajriah 2 , Emma Suryati 1 , Andi Parenrengi 1 , Suharsono 2 , Utut Widyastuti 2 2014. Introduksi gen Metallothionein Tipe II Ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens1) JRA ( in press) Handayani (2012 Handayani, T. 2012. Konstruksi Vektor Biner dan Transformasi Gen Lisozin pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens.[Tesis]. Bogor [ID]: Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Yulianto K dan Mira S. 2009. Budidaya Makro Alga Kappaphycus alvarezii (Doty) secara vertikal dan gejala penyakit “ice-ice” di perairan Pulau Pari. Di dalam: Juwana S dan Riyatno. Oseanologi dan Limnologi di Indonesia Edisi 35(3). Jakarta [ID]: Pusat Penelitian Oceanografi dan Penelitian Limnologi LIPI. hlm 325 – 334. ISSN 0125 – 9830. http://www.limnologi.lipi.go.id/limnologi/doc/public/ 3._Naskah_Kresno__Mira.pdf Kementrian Kelautan dan Perikanan. 2013. Ekspor Rumput 2013, US$230 Juta. J Nas Tanggal 17 Januari 2013 Hal.10. info media. Website Resmi KKP.htm. http://www.kkp.go.id/index.p...mobile/ arsip/?categori_id=58 [tanggal akses 12 Maret 2013]. Mamboya, FA. 2007. Heavy Metal Contamination and Toxicity: Studies of Macroalgae from the Tanzania Coast. Stockholm [US]: Stockholm University library. pp. 1–48. ISBN 91-7155-374-6. http://www.divaportal.org/smash/get/diva2:197112/FULLTEXT01.pdf Mir G, Dome‘nech J, Huguet G, Guo WJ, Goldsbrough P, Atrian S, Molinas M. 2004. A plant type 2 metallothionein (MT) from cork tissue responds to oxidative stress. J Exp Bot 55 (408): 2483– 2493. doi:10.1093/jxb/erh254. Moilanen, Lori H., Fukushige T, Freedman JH. 1999. Identification of Upstream Regulatory Elements and Transcription Factors Responsible for Cell-Specific Expression of The Metallothionein Genes from Caenorhabditis Elegans. J Biol Chem 274 (42), Issue of October 15: 29655–29665. doi:10.1074/ jbc.274.42.29655. Owen JR, Morris CA, Nicolaus B, Harwood JL, Kille P. 2012. Induction of expression of a 14-3-3 gene in response to copper exposure in the marine alga, Fucus vesiculosus. Ecotoxicol 21:124–138. doi:10.1007/s10646-011-0772-4. Shestivska S, Adam V, Prasek J, Macek T, Mackova M, Havel L, Diopan V, Zehnalek J, Hubalek J, Kizek R. 2011. Investigation of the Antioxidant Properties of Metallothionein in Transgenic Tobacco Plants using Voltammetry at a Carbon Paste Electrode. Int. J. Electrochem. Sci., 6 : 2869 – 2883. http:// www.electrochemsci.org/papers/vol6/6072869.pdf Suryati, E, S. Fadilah, dan Rosmiati. 2010. Perbaikan mutu genetik rumput laut Kappaphycus alvarezii mealuii hibridisasi dan fusi protoplas secara in vitro. ISBN 978-979-786-033-2. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. hal 535-540 Suryati E, Sitti Fadilah, dan Mujayana. 2012. Regenerasi mikroplantet Kappaphycus alvarezii pada media PES 1/20 yang diperkaya dengan Indol Acetic Acid (IAA), Zeatin dan Kinetin. Prosiding Indoaqua-Forum Inovasi Teknologi Akuakultur . ISBN 978-979-789-041-4. 7 hal Torregrosa, L., Péros, J. P., Lopez, G., Bouquet, A . (2000): Effect of hygromycin, kanamycin and phosphinothricin on the embryogenic callus development and axillary micropropagation of Vitis vinifera L. Acta Hort. 528:403-406 Wattier, RA, Prodohl, P & Maggs, C 2000, DNA isolation protocol for red seaweed (rhodophyta). Plant Molecular Biology Reporter, vol 18, no. 3, pp. 275-281. Vieira ALG, Camilo CM. 2011. Agrobacterium tumefasciens-mediated transformation of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Fungal Genet Biol 48 : 806–811. doi: 10.1016/j.fgb.2011.02.006.

Page 811 of 1000

Page 9 of 10

Regenerasi anakan rumput laut hasil transformasi gen ..... (Emma Suryati)

796

DISKUSI

Nama Penanya: Ibnu Rusdi Pertanyaan: Apakah yang diikat dari logamnya? Tanggapan: Untuk rumput laut bisa menggunakan aluminium dan untuk logam 3 yang lain nanti di kaji lagi.

Page 812 of 1000

Page 10 of 10