VERIFIKASI METODE EKSTRAKSI FENOL KLOROFORM UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi penelitian berjudul Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Ishfi Aryahiyyah NIM D14100101 .
ABSTRAK ISHFI ARYAHIYYAH. Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan. Dibimbing oleh HENNY NURAINI dan KOMAR SUTRIAH. Ekstraksi DNA yang merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular menjadi titik kritis dan sangat mempengaruhi hasil analisis. Salah satu metode ekstraksi yang banyak digunakan adalah metode fenol kloroform. Verifikasi terhadap metode ini sangat diperlukan untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian menggunakan metode tersebut dengan hasil yang valid. Penelitian ini bertujuan memverifikasi metode ekstraksi DNA metode fenol kloroform pada daging segar dan daging olahan dengan menggunakan presisi ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan metode (ruggedness). Tolak ukur analisis ini adalah kemurnian DNA yang diukur menggunakan spektrofotometer nanodrop. Berdasarkan hasil penelitian, uji presesi ketertiruan (repeatibility) yang dilakukan oleh seorang laboran dan uji presisi keseksamaan (reproducibility) yang dilakukan tiga analis yang berbeda menunjukkan nilai simpangan baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Hal ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan memiliki nilai presisi yang baik, sehingga hasil yang didapat akan sama walaupun dilakukan berulang dan oleh analis yang berbeda. Berdasarkan uji ketangguhan yang dilakukan menunjukkan bahwa volume fenol dan klororform isoamil alkohol (CIAA) optimal yang diberikan yaitu masing-masing 400 µL, serta bobot sampel yang digunakan yaitu 0.075 g untuk meningkatkan efisiensi metode. Kata kunci: ekstraksi DNA, fenol kloroform, ketangguhan, presisi, verifikasi
ABSTRACT ISHFI ARYAHIYYAH. Verification of Fenol Chloroform Extraction Method for DNA Isolation in Meat and Meat Products. Supervised by HENNY NURAINI and KOMAR SUTRIAH. DNA extraction which is routine procedure in molecular analysis to get DNA isolate became critical point that can influence analysis result. One of extraction method that common used is phenol chloroform. Verification of this method is really needed for explain that laboratory can use the method and get a valid result. This research was to verificate DNA extraction method which is phenol chloroform in meat and meat products with precision of repeatability and reproducibility also ruggedness. The measure of this research is DNA purification from sample which measured by nanodrop spectrophotometer. Result showed that precision of repeatability that has been done by one analyst and the precision of reproducibility that has been done by three different analyst had standard deviation above 5%. It means that extraction method that used in the laboratory was good because it had good precision. So the result of extraction will give same result even though it has done repeatedly by different analyst. The most efficient volume of phenol and CIAA
that added in this method is 400 µL and the most efficient sample weight used in this method is 0.075 g. Key words : DNA extraction, phenol chloroform, precision, ruggedness, verification
VERIFIKASI METODE EKSTRAKSI FENOL KLOROFORM UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi :Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan Nama : Ishfi Aryahiyyah NIM : D14100101
Disetujui oleh
Dr Ir Henny Nurani, MSi Pembimbing I
Drs Komar Sutriah, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan kemurahan hati-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judul Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan. Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan umatnya hingga akhir zaman. Penyusunan skripsi ini dilakukan untuk memverifikasi metode ekstraksi DNA yang dilakukan pada laboratorium menggunakan metode fenol kloroform. Tahapan ekstraksi merupakan tahapan yang cukup kritis karena dilakukan untuk mengisolasi DNA. Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi berbagai pihak. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Henny Nuraini, MSi dan Drs Komar Sutriah MSi selaku dosen pembimbing yang banyak memberi ilmu baru dan membimbing penulis dari awal hingga akhir penelitian. Di samping itu penghargaan penulis sampaikan kepada Eryk Andreas, SPt Msi; Shelvi, Ssi; Isyana Khaerunisa, SPt; dan Ahmad Furqon, SPt serta semua teman-teman dari Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak yang telah membantu selama penelitian berlangsung dan memberi banyak ilmu baru. Ungkapan terima kasih setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada Ayah Masruhan, Ibu Teti Sugiarti dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan kasih sayangnya. Terima kasih pula kepada teman-teman IPTP angkatan 47, terutama Anita Rahman, Laras S Fauziah, Annisa K Suwasandasari, Ria P Rahmadani, Fredy Fender, M. Jafar, Angga B Prasetya, Nenik T Wahyuni, Nurul Khikmah, Sela Pratiwi, Cahyatina T Rahayu, dan Jannaatin Alfaafa. Tak lupa juga apresiasi diberikan kepada seluruh keluarga besar Etos Bogor. Ucapan terima kasih yang tiada putus juga diberikan kepada semua sahabat penulis yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah mendukung penulis secara moril. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya. Bogor, September 2014 Ishfi Aryahiyyah
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan
1
Ruang Lingkup Penelitian
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Materi
2
Sampel
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur
2
Ekstraksi DNA Total
2
Uji Kemurnian DNA
3
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Rancangan Analisis Data
3
Uji Presisi
3
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Uji Presisi
5
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
6
Uji Ketangguhan Fenol
7
Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA)
7
Uji Ketangguhan Bobot Sampel
8
SIMPULAN DAN SARAN
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL 1 Uji presisi keterulangan (repeatibility) 2 Uji presisi ketertiruan (reproducibility) 3 Kemurnian DNA dengan volume fenol berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi 4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi 5 Kemurnian DNA dengan bobot sampel berbeda pada daging sapi dan sosis sapi
5 6 7 7 8
DAFTAR LAMPIRAN 1 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol pada ekstraksi DNA daging sapi 2 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA pada ekstraksi DNA daging sapi 3 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada ekstraksi DNA daging sapi 4 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol pada ekstraksi DNA sosis sapi 5 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA pada ekstraksi DNA sosis sapi 6 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada ekstraksi DNA sosis sapi
11 11 11 12 12 12
PENDAHULUAN Latar Belakang DNA yang merupakan unit keturunan terkecil dapat diperoleh dengan cara mengisolasi atau mengekstraksi bahan yang ingin diketahui (Muladno 2010). Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular dan menjadi titik kritis yang sangat mempengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil ekstraksi akan mempengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR (Ardi 2012). Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dan lain-lain) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis (Muladno 2010). Salah satu metode ekstraksi yang banyak digunakan adalah metode fenol kloroform. Selain biaya yang digunakan cukup murah, metode ini sangat bermanfaat untuk mendapatkan isolat DNA dengan kemurnian yang tinggi, sehingga tidak ada pengotor atau kontaminan yang menghalangi proses selanjutnya. Verifikasi terhadap metode ekstraksi ini perlu dilakukan untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid, selain itu juga membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja (Saputra 2009). Uji verifikasi yang dilakukan lebih dititikberatkan pada ekstraksi daging dan pangan olahan, mengingat pentingnya identifikasi objek tersebut pada masa ini. Pesatnya perkembangan produk makanan di lingkungan masyarakat Indonesia membuat para konsumen harus lebih berhatihati terhadap berbagai jenis pangan olahan yang dikonsumsi. Hal ini dikarenakan tidak semua pangan olahan mengandung bahan makanan yang sesuai. Banyak pemalsuan yang kerap dilakukan oleh produsen untuk meminimalkan biaya produksi. Salah satu cara yang dilakukan untuk mengidentifikasi bahan apa yang terkandung dalam produk tersebut adalah identifikasi DNA dengan metode PCR, dengan cara ini pula dapat diketahui apakah suatu produk telah tercampur oleh bahan yang bukan seharusnya. Diharapkan proses ekstraksi DNA yang valid dapat mempermudah proses identifikasi berbagai produk yang dilakukan oleh laboratorium. Tujuan Penelitian ini bertujuan melakukan verifikasi terhadap metode ekstraksi fenol kloroform untuk isolasi DNA pada daging dan produk olahan dengan uji presisi ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan metode (ruggedness). Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini merupakan salah satu usaha untuk menguji validitas metode ekstraksi DNA yang biasa digunakan pada Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Ekstraksi DNA dilakukan untuk mendapatkan isolat DNA yang akan mempengaruhi tahapan selanjutnya. Verifikasi yang dilakukan mencakup uji presisi ketertiruan (repeatibility), presisi keseksamaan
1 2
(reproducibility), dan ketangguhan metode (ruggedness). Tolak ukur evaluasi adalah kemurnian DNA yang dihasilkan dari masing-masing perlakuan dan diukur menggunakan spektrofotometer nanodrop. Proses ekstraksi yang baik dan sesuai prosedur akan menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi. Kemurnian DNA akan sangat memengaruhi hasil analisis selanjutnya.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan, yakni dari bulan Desember 2013 hingga April 2014. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Uji kemurnian DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop dilakukan di Laboratorium Institut Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC). Materi Sampel Sampel yang diekstraksi terdiri atas daging sapi, daging babi, bakso sapi, sosis sapi, bakso sapi, nugget ayam, dan kornet sapi. Sampel produk olahan didapat dari toko di sekitar Darmaga, Bogor, Jawa Barat. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan prosedur baku operasional yang ditetapkan oleh Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bahan-bahan yang akan digunakan untuk ekstraksi DNA dari sampel produk adalah destilation water (DW), 1x sodium tris EDTA (STE), sodium dodesil sulfat (SDS) 10%, fenol, proteinase K 5 mg mL-1, kloroform isoamil alkohol (CIAA), NaCl 5M, EtOH (etanol) absolut, EtOH 70% dan tris EDTA (TE) 80%. Alat-alat yang akan digunakan untuk ekstraksi DNA adalah tabung 1.5 mL, rak tabung, alat penggerus, gunting, timbangan, cawan petri, satu set micropippet beserta tipnya, tilter, vortex, sentrifuge, frezeer dan inkubator. Kemurnian DNA diukur menggunakan spektrofotometer nanodrop. Prosedur Ekstraksi DNA Total Ekstraksi DNA dilakukan dengan acuan metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi oleh Andreas et al. (2010). Sampel diambil dan ditimbang dengan alat timbang analitik merk Sartoris sebanyak 0.075 g. Masing-masing sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian digerus hingga halus dengan alat penggerus. Setelah itu ditambahkan 40 µL SDS 10%, 20 µL proteinase K, dan 350 µL STE untuk menghancurkan membrane sel dan mengeluarkan isi sel. Sampel digoyang pelan pada inkubator di suhu 55 oC selama dua jam. Setelah dua jam ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL CIAA, dan 40 µL NaCl 5 M untuk
1 3 memisahkan bahan organik dari asam nukleat, lalu digoyang kembali pada suhu ruang selama satu jam. Selanjutnya disentrfuge degan kecepatan 12 000 rpm di suhu 200 C selama lima menit. Bagian DNA (supernatant yang bening) dipindahkan menggunakan pipet sebanyak 400 µL ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang baru dan telah diberi label. Setelah itu ditambahkan 800 µL larutan EtOH absolut dan 40 µL NaCl 5 M, lalu dibekukan pada suhu -20 oC over night untk memaksimalkan proses presipitasi DNA. Larutan yang telah didiamkan semalaman kemudian disentrifuge pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit, lalu dibuang bagian supernatannya dan ditambahkan 800 µL EtOH 70%. Cairan tanpa supernatant tersebut kembali disentrifugasi lagi pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit. Langkah selanjutnya yakni didiamkan dalam keadaan terbuka sampai alkohol hilang dan sampel mengering. Setelah kering maka ditambahkan 100 µL TE 80% atau Elution Buffer. Hasil ekstraksi DNA yang sudah didapat bisa langsung digunakan. Uji Kemurnian DNA Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan mengukur konsentrasi kemurnian DNA sampel yang didapat dari proses ekstraksi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurniaan 1.8-2.0 (Muladno 2010):
Keterangan : A260 = absorbans pada 260 nm A280 = absorbans pada 280 nm
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Analisis Data Uji Presisi DNA diekstrak dari masing-masing sampel yang berupa daging sapi, daging babi, kornet, sosis sapi, nugget, daging sapi giling dan bakso sapi. Hali ini mengacu pada Harmita (2004) yang menyatakan bahwa uji presisi dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel. Setiap ekstraksi yang dilakukan diulang sebanyak 7 kali. Data yang diambil untuk uji presisi yaitu kemurnian DNA masing-masing sampel. Perhitungan presisi, baik ripitabilitas dan reprodusibilitas dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: 1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.........xn maka simpangan bakunya adalah √ 2.
∑
̅
Simpangan baku relatif (SBR) adalah ̅
1 4 Jika hasil simpangan baku relatif (SBR) kemurnian DNA kurang dari 5%, maka dapat dinyatakan bahwa metode tersebut memiliki presisi yang tinggi dan valid untuk digunakan (Ermer 2005). Uji Ketangguhan (Ruggedness) Rancangan yang digunakan untuk uji ketangguhan ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dan dihitung menggunakan ANOVA (Harmita 2004). Jika hasil yang diperoleh berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan. Uji ketangguhan ini dilakukan untuk menguji seberapa tangguh jumlah volume fenol, jumlah kloroform isoamil alkohol (CIAA), dan bobot sampel yang digunakan pada metode ekstraksi fenol kloroform. Sampel yang digunakan dalam uji ini yaitu daging sapi dan sosis sapi. Uji terhadap pemberian fenol diteliti dengan 3 perlakuan, yakni 200 µL, 400 µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan: Yij = μ + Pi + εij Keterangan Yi : Kemurnian DNA dengan volume fenol (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan ke-j (1, 2 dan 3) µ : Nilai tengah kemurnian DNA Pi : Pengaruh pemberian volume fenol ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian kadar CIAA pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3 perlakuan, yakni 200 µL, 400 µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan: Yij = μ + Pi + εij Keterangan Yij : Kemurnian DNA dengan volume CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan ke-j (1, 2 dan 3) μ : Nilai tengah kemurnian DNA Pi : Pengaruh pemberian CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkatat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian bobot sampel pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3 perlakuan, yakni 0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g dengan kondisi tidak ada perubahan volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan: Yij = μ + Pi + εij Keterangan Yij : Kemurnian DNA dengan perbedaan bobot sampel taraf ke-i (0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g) dan ulangan ke-j (1,2 dan 3) μ : Nilai tengah kemurnian DNA Pi : Pengaruh perbedaan bobot sampel ke-i (0.025 g, 0.075g dan 0.125 g) terhadap kemurnian DNA εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
1 5
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Presisi Presisi yang dilakukan dalam penelitian ini yakni presisi keterulangan (repeatibility) dan presisi ketertiruan (reproducibility). Valcarcél (2000) menyatakan bahwa uji presisi dilakukan untuk mengetahui nilai konsistensi antara hasil yang diperoleh pada suatu sampel yang diuji. Presisi keterulangan (repeatibility) dilakukan oleh satu orang analis dalam satu periode tertentu, menggunakan pereaksi dan peralatan yang sama dalam laboratorium yang sama (Harvey 2000) serta dilakukan dalam interval yang pendek (Chan 2004). Presisi keterulangan dilakukan untuk mengukur perbedaan internal dalam sebuah metode (Valcarcél 2000). Hasil uji presisi keterulangan (repeatibility) dapat dilihat pada Tabel 1
Ulangan 1 2 3 4 5 6 7 ̅ SB SBR
Db 2.205 2.010 2.135 2.010 2.105 2.095 1.995 2.079 0.078 3.752
Tabel 1 Uji presisi keterulangan (repeatibility) Ds Sos Bs Na Sg 1.960 1.860 1.910 2.010 2.015 1.995 1.865 1.935 2.015 2.000 1.985 1.890 1.920 1.960 1.990 1.985 1.870 1.900 1.990 2.000 1.950 1.890 1.925 1.975 1.985 1.995 1.910 1.910 2.015 2.010 2.000 1.875 1.900 1.950 1.970 1.981 1.880 1.914 1.988 1.996 0.019 0.017 0.013 0.027 0.015 0.963 0.934 0.682 1.353 0.771
Ks 1.885 1.865 1.890 1.905 1.915 1.890 1.875 1.889 0.017 0.897
Keterangan : Db = Daging babi, Ds = Daging Sapi, Sos = Sosis sapi, Bs = Bakso sapi, Na = Nugget ayam, Sg = Sapi giling, Ks = Kornet Sapi
Tabel 1 menunjukkan hampir semua sampel, yakni daging sapi, sosis sapi, bakso sapi, nugget, daging sapi giling, dan kornet sapi memiliki rata-rata tingkat kemurnian DNA tinggi yakni berada dalam rentang nilai 1.8-2.0 (Muladno 2010). Akan tetapi rata-rata kermunian DNA yang diperoleh daging babi yaitu 2.079. Kemurnian DNA yang bernilai lebih besar dari dua menunjukkan bahwa DNA tersebut terkontaminasi oleh RNA (Khosravinia et al. 2007; Santella 2006). Nilai presisi keterulangan (repeatibility) yang diperoleh semua sampel yakni berada di bawah 5%. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan valid. Menurut Ermer (2005), nilai presisi yang diterima untuk ketidakmurnian yaitu <5%. Semakin rendah presisinya, maka keseksamaan antara setiap ulangan akan semakin tinggi. Selain uji presisi keterulangan (repeatibility), dilakukan juga uji ketertiruan (reproducibility) untuk mengetahui keseksamaan metode yang dilakukan antar analis yang berbeda. Hasil uji presisi ketertiruan (reproducibility) yang telah dilakukan disajikan pada tabel 2.
1 6
Sampel Db Ds Sos Bk Na Sg Ks
Tabel 2 Uji presisi ketertiruan (reproducibility) Analis 1 Analis 2 Analis 3 Rata-rata SB 2.079 2.004 1.997 2.027 0.045 1.981 1.981 1.980 1.981 0.003 1.879 1.885 1.884 1.883 0.001 1.907 1.934 1.909 1.917 0.013 2.001 2.017 2.109 2.042 0.063 1.871 1.994 1.986 1.950 0.005 1.990 1.860 1.871 1.907 0.015
SBR 2.243 0.141 0.029 0.689 3.099 0.266 0.782
Keterangan : Db = Daging babi, Ds = Daging Sapi, Sos = Sosis sapi, Bs = Bakso sapi, Na = Nugget ayam, Sg = Sapi giling, Ks = Kornet sapi
Ketertiruan atau yang biasa disebut reprodusibilitas adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan antar laboratorium menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda (Harvey 2000). Pengujian ini harus berdasarkan standar prosedur analisis yang berlaku (Chan 2004). Penelitian ini menggunakan alat dan metode yang sama namun dengan tiga orang analis yang berbeda. Hal ini dilakukan untuk mengetahui seberapa besar keseksamaan terhadap metode yang sama namun dilakukan oleh analis yang berbeda. Tabel 2 menunjukkan hampir semua rata-rata kemurnian DNA sampel yang diperoleh ketiga analis memiliki kemurnian tinggi yang berada dalam rentang 1.8-2.0. Terdapat 2 sampel yang memiliki nilai kemurnian DNA di luar rentang yakni daging babi dan nugget. Perlakuan yang dilakukan sebanyak 7 kali ulangan pada semua sampel memperoleh nilai presisi ketertiruan yakni dibawah 5%. Hal ini menunjukkan bahwa presisi ketertiruan antar analis memiliki nilai ketelitian yang baik dan akan memiliki nilai kemurnian DNA yang relatif sama walaupun jika dilakukan dengan analis yang berbeda. Pernyataan ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa presisi yang baik memiliki nilai RSD di bawah 5% (Ermer 2005). Uji Ketangguhan (Ruggedness) Uji ketangguhan (ruggedness) dilakukan terhadap 3 faktor analisis, yakni penambahan fenol dan kloroform isoamil alkohol (CIAA), serta perbedaan bobot sampel. Ketiga hal ini diujikan karena diduga merupakan komponen yang paling kritis dalam metode ekstraksi fenol kloroform pada tahap purifikasi DNA. Tahap purifikasi atau pemurnian DNA ini bertujuan untuk mendapatkan DNA dengan kemurnian yang tinggi karena terjadi pemisahan isolat dari kontaminasi bahan selain DNA. Pelarut organik yang digunakan berupa fenol dan kloroform yang secara signifikan dapat menghilangkan protein dan melarutkan komponen lipid (Surzycki 2003). Pemberian fenol bertujuan menghilangkan protein dari larutan dengan cara mengikat protein dan sebagian kecil RNA, sedangkan kloroform diberikan untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan (Muladno 2010). Pemberian fenol dan kloroform yang sesuai akan menghasilkan DNA dengan kermunian yang baik.
1 7 Ketangguhan metode merupakan derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lainlain. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji (Harmita 2004). AOAC (2006) menyatakan bahwa ketangguhan (ruggedness) merupakan kemampuan hasil prosedur analitik untuk tahan terhadap perubahan ketika terjadi sedikit perbedaan lingkungan dan prosedur variabel. Uji ketangguhan harus membuktikan ketahanan terhadap prosedur analitik di bawah prosedur operasi normal. Spesifikasi tertinggi dan terendah pada setiap tahap dievaluasi untuk mengetahui ketahanan suatu metode. Tolak ukur evaluasi yang diamati adalah nilai kemurnian DNA yang diperoleh. Nilai kemurnian DNA yang tinggi mengindikasikan DNA tersebut bebas kontaminasi. Uji Ketangguhan Fenol Hasil rata-rata kemurnian DNA dengan olume fenol berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Kemurnian DNA dengan volume fenol berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi Sampel Volume Fenol 200 µL 400 µL 600 µL Daging sapi 1.970 ± 0.022 1.950 ± 0.020 1.947 ± 0.013 Sosis sapi 1.892 ± 0.023 1.855 ± 0.017 1.860 ± 0.017 Tabel 3 menunjukkan bahwa nilai rata-rata kemurnian DNA daging sapi dan sosis yang dihasilkan tidak nyata (P>0.05). Pemberian fenol sebanyak 200-600 µL pada ekstraksi sampel daging sapi dan sosis sapi memberikan nilai kemurnian DNA yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini akan lebih efisien jika fenol yang diberikan sebanyak 400 µL. Hasilnya sama-sama memberikan kemurnian DNA yang tinggi, namun pemberian fenol dengan jumlah sedikit akan mempersulit pengambilan DNA pada fase air yang berada pada bagian atas setelah dilakukan pemisahan dengan cara sentrifugasi. Pengambilan DNA pada fase cair harus dilakukan dengan sangat hati-hati oleh analis terlatih agar kontaminan pengotor tidak ikut terbawa. Sebaliknya pemberian fenol yang melebihi standar akan menghabiskan biaya lebih besar. Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA) Hasil rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi dan sosis sapi Sampel Volume CIAA 200 µL 400 µL 600 µL Daging sapi 1.973 ± 0.016 1.965 ± 0.000 1.963 ± 0.013 Sosis sapi 1.882 ± 0.016a 1.848 ± 0.008ab 1.862 ± 0.013b Keterangan : angka-angka pada baris sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
1 8 Tabel 4 menunjukkan nilai rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada daging sapi menghasilkan nilai tidak nyata (P>0.05), sedangkan uji ketanggguhan pada sampel sosis sapi memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05). Dilakukan uji lanjut Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan. Uji Duncan menunjukkan pemberian volume 200 µL memberikan hasil yang sama dengan pemberian volume 400 µL namun memberikan hasil yang berbeda pada pemberian 600 µL. Pemberian volume 400 µL memberikan hasil yang sama dengan pemberian 600 µL. Berdasarkan hasil pada kedua tabel dapat disimpulkan bahwa pemberian CIAA sebanyak 200 hingga 600 µL sama-sama memberikan nilai kemurnian DNA yang tinggi. Akan tetapi tahapan ini akan lebih efisien jika fenol yang diberikan sebanyak 400 µL untuk lebih mempermudah hal teknis dan biaya, sedangkan pemberian CIAA pada sampel sosis sapi pada volume 200-600 µL tidak memberikan nilai kemurnian DNA yang sama tinggi. Jadi volume CIAA terbaik yang digunakan pada ekstraksi DNA sosis sapi yaitu 400 µL. Bahan utama dalam CIAA adalah kloroform, yang dapat mendenaturasi rantai polipeptida untuk masuk secara parsial, yang terhenti pada interfase air-kloroform. Hal ini menghasilkan protein dengan konsentrasi tinggi pada fase tersebut dan terjadi pengendapan protein. Isoamil alkohol ditambahkan sebagai pengemulsi antara air dan alkohol. Efisiensi deproteinisasi tergantung pada besarnya area interfase (Surzycki 2003), jika volume CIAA yang diberikan terlalu sedikit maka akan memperkecil daerah interfase dan mempersulit dalam proses pengambilan DNA yang berada pada fase cair di bagian atas. Penambahan volume CIAA yang terlalu banyak akan membutuhkan biaya lebih besar walaupun dapat meemperbesar daerah interfase sehingga akan mempermudah pemipetan DNA yang berada pada fase cair di bagian atas. Uji Ketangguhan Bobot Sampel Hasil rata-rata kemurnian DNA dengan bobot sampel berbeda pada ekstraksi daging sapi dan sosis sapi disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Kemurnian DNA dengan bobot sampel sapi Sampel 0.025 g Daging sapi 1.825 ± 0.173 Sosis sapi 1.893 ± 0.048
berbeda pada daging sapi dan sosis Bobot Sampel 0.075 g 1.947 ± 0.020 1.902 ± 0.003
0.125 g 1.903 ± 0.015 1.865 ± 0.018
Tabel 5 menunjukkan bahwa nilai rata-rata kemurnian DNA daging sapi dan sosis yang dihasilkan tidak nyata (P>0.05). Hal ini menunjukkan bobot sampel yang digunakan dalam rentang 0.025 g hingga 0.125 g menghasilkan DNA dengan nilai kemurnian yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini lebih efisien jika bobot sampel yang digunakan sesuai standar, yakni 0.075 g. Bobot sampel yang terlalu besar akan mempersulit proses penghancuran sampel di dalam tabung eppendorf, sedangkan jika bobot sampel yang digunakan terlalu sedikit maka akan sedikit konsentrasi DNA yang dihasilkan.
1 9
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Proses ekstraksi DNA menggunakan metode fenol kloroform di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan IPB sudah memenuhi standar verifikasi. Hal ini ditunjukkan dengan nilai presisi yang baik dengan nilai simpangan baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Volume fenol dan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA) optimal yang digunakan sebagai campuran larutan pengekstrak sebanyak 400 µL, sedangkan bobot sampel optimal yang digunakan sebanyak 0.075 g. Saran Perlu diadakan verifikasi lanjutan dengan beberapa uji lainnya. Uji ketangguhan (ruggedness) dapat terus dilakukan terhadap berbagai faktor analisis lainnya pada metode ekstraksi fenol kloroform ini, misalnya pada suhu dan waktu inkubasi, kecepatan sentrifugasi, perbedaan volume bahan-bahan lain yang digunakan.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Presidential Task Force on Best Practices for Microbiological Methodology. Gaithersburg (US). Andreas E, Sumantri C, Nurani H, Farajallah A, Anggraeni A. 2010. Identification of GH|AluI genes polymorphisms in indonesian buffalo. Indonesian Trop Anim Agric 35:25-221. Ardi A. 2012. Validasi metode ekstraksi DNA pada analisis DNA babi dalam produk bakso [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor Chan CC, Herman L, Lee YC, Xue MZ. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performan Verification. Canada (CA): John Wiley & Sons, Inc. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(3):117-135. Ermer J, John HM. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Weinheim (DE): WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York (US): The Mc Graw Hill Companies, Inc. Khosravinia H, Murthy NN, Parasad DT, Pirany N. 2007. Optimazing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African Journal of Biotechnology. 6(4):481-486. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York (US): CSH Laboratory Press.
1 10
Santella RM. 2006. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome amplification. Cancer Epidemiology Biomarkers. 15(9): 1585-1587. Saputra YE. 2009. Verifikasi dan Validasi Metode di Laboratorium [Internet]. [diunduh 2013 Des 10]. Tersedia pada:http//www.chemistry.org/artikel_kimia/ kimia_analisis/verifikasi-dan validasi-metoda-di-laboratorium/. Surzycki S. 2003. Laboratory Manual Human Molecular Biology. New York (US): Blackwell Publishing Valcarcél M. 2000. Principles of Analytical Chemistry. Berlin (DE): Springer
1
11
LAMPIRAN Lampiran 1 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol pada ekstraksi DNAdaging sapi Ulangan 1 2 3 Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total
Fa (200 µL) 1.980 1.985 1.945 DB 2 6 8
JK 0.0009556 0.0020667 0.0030222
Fb (400 µL) 1.970 1.950 1.930 KT 0.0004778 0.0003444
Fc (600 µL) 1.960 1.935 1.945 F 1.39
P 0.320
Keterangan : P > 0.05 = Tidak nyata
Lampiran 2 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA pada ekstraksi DNA daging sapi Ulangan 1 2 3 Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total Keterangan : P > 0.05
Ca (200 µL) 1.985 1.980 1.955 DB 2 6 8
JK 0.0001722 0.0008333 0.0010056
Cb (400 µL) 1.965 1.965 1.965 KT 0.0000861 0.0001389
Cc (600 µL) 1.965 1.975 1.950 F 0.62
P 0.569
= tidak nyata
Lampiran 3 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada ekstraksi DNA daging sapi Ulangan 1 2 3 Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total
Na (0.025 g) 1.915 1.935 1.625 DB 2 6 8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK 0.02282 0.06148 0.08430
Nb (0.075 g) 1.925 1.950 1.965 KT 0.01141 0.01025
Nc (1.025 g) 1.920 1.900 1.890 F 1.11
P 0.388
1 12
Lampiran 4 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol pada ekstraksi DNA sosis sapi Ulangan 1 2 3
sFa (200 µL) 1.905 1.905 1.865
sFb (400 µL) 1.845 1.875 1.845
Sumber Keragaman DB JK Perlakuan 2 0.0023722 Galat 6 0.0022667 Total 8 0.0046389 Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
sFc (600 µL) 1.840 1.870 1.870
KT 0.0011861 0.0003778
F 3.14
P 0.117
Lampiran 5 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA pada ekstraksi DNA sosis sapi Ulangan 1 2 3 Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total
sCa (200 µL) 1.900 1.875 1.870 DB 2 6 8
sCb (400 µL) 1.850 1.840 1.855
JK 0.0016889 0.0009500 0.0026389
sCc (600 µL) 1.860 1.850 1.875
KT 0.0008444 0.0001583
F 5.33
P 0.047
Keterangan : P< 0.05 = berbeda nyata
Hasil uji Duncan Grup Duncan B B B
A A A
Rata-rata
N
Perlakuan
1.88167
3
A
1.86167
3
C
1.84833
3
B
Lampiran 6. Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada ekstraksi DNA sosis sapi Ulangan 1 2 3 Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total
sNa (0.025 g) 1.895 1.845 1.940 DB 2 6 8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK 0.0022167 0.0051833 0.0074000
sNb (0.025 g) 1.900 1.900 1.905 KT 0.0011083 0.0008639
sNc (0.025 g) 1.870 1.845 1.880 F 1.28
P 0.344
1 13
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama Ishfi Aryahiyyah dilahirkan di Karawang pada tanggal 3 Oktober 1992 dari pasangan ayah Masruhan dan ibu Teti Sugiarti. Penulis merupakan anak pertama dari 4 bersaudara dengan adik Shofia Andari, Kayla Mazaya dan Muhammad Arkarozi. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK Kharisma tahun 1998, SDN Margajaya IV tahun 2004, MDA Annajahul Islami tahun 2005, SMPN 1 Bekasi tahun 2007, MAN 1 Bekasi tahun 2010. Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN tulis pada program studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP). Selama menjadi mahasiswa penulis memperoleh beastudi Etos Dompet Dhuafa selama 6 semester, beasiswa Program Prestasi Akademik (PPA) IPB, beasiswa Yayasan Amanah IPB dan beasiswa Karya Salemba Empat. Kegiatan penulis di luar akademik yaitu menjadi anggota aktif UKM Karate IPB tahun 2010/2013, divisi sosial pada Sekolah Desa Produktif Bestudi Etos Bogor tahun 2010/2011, anggota rohis kelas IPTP 47 tahun 2011/2014, divisi Islamic Student Center (ISC) Lembaga Dakwah Fakultas FAMM Al-An’aam Fapet IPB 2011/2013 dan divisi Forum Rohis Kelas IPB (FRKI) pada Forum Silaturahim Lembaga Dakwah Fakultas IPB (FSLDKI) tahun 2012/2013 serta serangkaian kepanitiaan kegiatan di dalam dan luar kampus. Penulis juga menjadi asisten praktikum Pendidikan Agama Islam (PAI) pada tahun 2013/2014. Prestasi yang pernah diraih oleh penulis selama kuliah yakni, juara favorit senam aerobik kelas A04 pada tahun 2010, PKM kewirausahaan didanai DIKTI tahun 2010 dan 2012, seminar dan publikasi karya tulis pada prosiding internasional AISC Taiwan pada tahun 2013 serta PKM penelitian didanai DIKTI tahun 2014.
.
