VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO
ANDIKA ARDI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK ANDIKA ARDI. Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam Produk Bakso. Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan HENNY NURAINI. Banyak kasus pemalsuan produk pangan berbahan dasar daging yang dijumpai di masyarakat. Reaksi rantai polimerase (PCR) telah dikembangkan sebagai metode yang tepat dan cepat untuk mengidentifikasi spesies daging baik dari daging mentah maupun produk makanan olahan daging. Ekstraksi merupakan titik kritis pada analisis PCR karena sangat berkaitan dengan mutu DNA yang diisolasi. Oleh karena itu, validasi metode ekstraksi dilakukan dalam penelitian ini untuk memastikan bahwa hasil ekstraksi memiliki mutu DNA yang baik. Metode ekstraksi DNA yang telah divalidasi selanjutnya diuji sensitivitasnya untuk mendeteksi kontaminasi daging babi dalam produk bakso yang diberi variasi cemaran daging babi serta dalam produk bakso yang dijual di Kota Bogor. Hasil validasi menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA memiliki limit deteksi kemurnian DNA sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian DNA sebesar 0.389, persen simpangan baku relatif sebesar 2.31%, dan ketidakpastian kemurnian DNA sebesar (1.93 ± 0.04). Cemaran babi masih dapat terdeteksi hingga tingkat cemaran 0.5% (b/b), dan tidak ditemukan cemaran daging babi pada sampel bakso dari 3 pasar di Kota Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar Warung Jambu)
ABSTRACT ANDIKA ARDI. Validation of DNA Extraction Methods on DNA Analysis of Pork in Meatball Products. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and HENNY NURAINI. There are many cases of fraud meat-based food products found in our society. Polymerase chain reaction (PCR) technique has been developed as a precise and quick method to identify meat species both from raw meat and from meat products. Extraction is the critical level on PCR analysis because it was very related with the quality of the isolated DNA. Therefore, validation of extraction method was carried out in this research to ensure that the extraction results had good DNA qualities. The validated extraction method was then tested for its sensitivity to detect the contamination of pork meat in meatball products made with various pork contamination and also in meatball products sold in Bogor. The validation results showed that the DNA extraction method had detection limit of DNA purity of 0.117, quantitation limit of DNA purity of 0.389, relative standard deviation of 2.31%, and uncertainty of DNA purity of (1.93 ± 0.04). The pork contamination could still be detected up to 0.5% (w/w) contamination and no pork contamination found in meatball samples from 3 market in Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor, and Pasar Warung Jambu)
VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO
ANDIKA ARDI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi Nama NIM
: Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam Produk Bakso : Andika Ardi : G44096021
Disetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS NIP 19631217 198803 2 002
Dr Ir Henny Nuraini, MSi NIP 19640202 198903 2 001
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam Produk Bakso. Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW, keluarganya, dan semoga kita semua menjadi pengikutnya hingga akhir zaman. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS dan Dr Ir Henny Nuraini, MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala Laboratorium Genetika Molekuler Prof Dr Ir Muladno, MSA, koordinator laboratorium Eryk Andreas, SPt, MSi dan rekan-rekan di laboratorium atas bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung. Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada Ayah, Ibu, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Kepada Eris, Mas Yana, Gina, Idis, Mbak Ana, dan teman-teman Ekstensi Kimia angkatan 2009 yang telah banyak membantu, memberikan saran, semangat, motivasi, dan dorongan selama penelitian, penulis ucapkan terima kasih. Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Februari 2012
Andika Ardi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 22 Desember 1987 sebagai putra pertama dari Bapak H Mawardi dan Ibu Hj Syamsidar. Penulis lulus dari SMA Negeri 2 Bogor pada tahun 2006 dan pada tahun yang sama diterima di Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi tes tulis. Penulis lulus dari AKA Bogor dengan predikat sangat memuaskan pada tahun 2009 dan melanjutkan pendidikan S1 melalui Program Penyelenggaraan Khusus Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB) pada tahun yang sama. Selama menjalani masa perkuliahan di AKA Bogor, Penulis pernah mengikuti kegiatan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Lingkungan (ISO 14001), Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Mutu (ISO 9001:2001), dan Pelatihan Sistem Manajemen Keselamatan dan Kesehatan Kerja – OHSAS 18001:2007. Penulis melakukan praktik kerja lapangan di PT Indonesia Power Suralaya pada tahun 2009 dengan judul laporan Pengujian Air pada Pengoperasian Ketel Uap Tekanan Tinggi di Unit Bisnis Pembangkitan Suralaya PT Indonesia Power.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 METODE Bahan dan Alat .............................................................................................. 1 Lingkup Kerja ................................................................................................ 2 Proses Pembuatan Bakso ............................................................................... 2 Ekstraksi DNA ............................................................................................... 2 Pengujian DNA Total .................................................................................... 2 Penentuan Konsentrasi dan Indeks Kemurnian DNA .. ................................ 3 Pengujian DNA dengan PCR ........................................................................ 3 Validasi Metode Ekstraksi ............................................................................. 3 Identifikasi Sampel Pasaran........................................................................... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Validasi Metode Ekstraksi DNA ................................................................... 4 Identifikasi Bakso .......................................................................................... 6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ...................................................................................................... 10 Saran ............................................................................................................ 10 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10 LAMPIRAN .......................................................................................................... 11
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil uji limit deteksi dan limit kuantitasi metode ekstraksi DNA pada sampel bakso dengan cemaran ...................................................................................... 5 2 Hasil uji presisi dan keterulangan metode ekstraksi DNA pada sampel bakso dengan cemaran ................................................................................................. 5 3 Hasil uji ketidakpastian kemurnian metode ekstraksi DNA pada sampel bakso dengan cemaran ................................................................................................. 6 4 Sekuens primer reverse spesifik fragmen DNA sapi dan babi ......................... 6 5 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dengan 7 variasi cemaran ........ 8 6 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar ................................. 9
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Fase yang terbentuk sesudah proses ekstraksi fenol-kloroform ........................ 5 2 Visualisasi DNA hasil ekstraksi pada gel agarosa 1%: sampel bakso dengan berbagai macam variasi cemaran (1–7) (a); sampel bakso pasar (1–10) (b)..... 6 3 Interaksi antara etidium bromida (EtBr) dan DNA .......................................... 6 4 Proses reaksi PCR ............................................................................................. 8 5 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dengan berbagai macam variasi cemaran pada gel agarosa 2%................................................................ 8 6 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa 2% ..................................................................................................................... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan tahapan penelitian ................................................................................ 12 2 Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi ....................... 13 3 Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA........................................... 14 4 Data pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso dengan variasi cemaran dan bakso pasar ..................................................................... 15
vii
PENDAHULUAN Produk makanan olahan pada saat ini sedang berkembang di Indonesia. Banyaknya variasi bentuk produk makanan olahan, terutama berbahan dasar daging, yang beredar di masyarakat harus diperhatikan. Pemalsuan produk makanan olahan berbahan dasar daging sering ditemui di lingkungan masyarakat secara luas dan semakin mengkhawatirkan. Akhir-akhir ini sering diberitakan di media massa, adanya campuran lain pada bahan baku produk tersebut, seperti daging dari jenis (spesies) yang menjadi bahan utamanya, yaitu daging sapi (Margawati & Ridwan 2010). Beberapa produk makanan olahan daging seperti abon, sosis, dan bakso diduga telah tercemar oleh kontaminan daging babi. Bakso merupakan salah satu produk makanan olahan daging yang sangat populer dan disukai masyarakat Indonesia. Hal ini tentu saja merugikan konsumen produk makanan olahan tersebut karena menyangkut kehalalan dari suatu produk. Kehalalan produk merupakan hal yang penting dari suatu produk yang dijual kepada masyarakat. Lebih dari 70% masyarakat muslim seluruh dunia mengacu pada produk makanan berstandar halal (Hayyan et al. 2009). Di Indonesia pada tahun 1989, Majelis Ulama Indonesia (MUI) membentuk suatu departemen, yaitu Lembaga Pengkajian Pangan, Obat-obatan, dan Kosmetika Majelis Ulama Indonesia (LP POM MUI) untuk membuat regulasi atas kehalalan produk yang ada di masyarakat. Masalah cemaran daging babi dalam suatu produk makanan halal sedang menjadi perhatian khusus LP POM MUI saat ini. Oleh sebab itu, diperlukan penelitian-penelitian tentang validasi ataupun verifikasi mengenai metode-metode analisis yang dapat diterapkan pada permasalahan ini. Identifikasi DNA suatu spesies dapat membantu untuk mengetahui apakah suatu produk telah tercemar oleh bahan yang bukan seharusnya. Telah banyak pengembangan metode analisis DNA untuk menemukan adanya indikasi cemaran babi dalam suatu produk makanan olahan. Salah satunya adalah dengan metode reaksi rantai polimerase (PCR) (Matsunaga et al. 1999) yang berdasarkan identifikasi sidik jari (Saez et al. 2004). Salah satu faktor penting dalam analisis DNA dengan metode PCR adalah isolasi DNA yang antara lain meliputi proses ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular dan
menjadi titik kritis yang sangat memengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil ekstraksi akan memengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR. Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut telah memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode dilakukan untuk menentukan apakah hasil analisis suatu metode telah sahih dan dapat dipertanggungjawabkan. Validasi metode ekstraksi DNA berguna untuk memastikan bahwa hasil ekstraksi yang dihasilkan sahih terhadap parameter-parameter uji validasi yang dilakukan, sehingga didapatkan mutu DNA yang baik serta hasil analisis DNA yang baik dan sahih. Penelitian ini bertujuan memvalidasi metode ekstraksi DNA dalam produk bakso sehingga setiap parameter yang diujikan akan memberikan hasil yang sahih. Selain itu, dapat diketahui jumlah cemaran terkecil yang masih dapat diidentifikasi secara PCR. Metode yang telah divalidasi selanjutnya digunakan untuk mengidentifikasi sampel di pasaran.
METODE Bahan dan Alat Alat-alat yang digunakan antara lain alatalat kaca, tabung eppendorf, mikropipet, vorteks, inkubator, spektrofotometer GeneQuant 1300, mesin PCR GeneAmp® PCR system 9700 (Applied BiosystemsTM), satu set alat elektroforesis gel agarosa (MUPID), dan kamera Polaroid (MP 4 Polaroid camera + UV transluminator). Bahan uji yang digunakan adalah sampel produk makanan olahan bakso dengan berbagai tingkat cemaran yang telah ditentukan serta sampel bakso yang diambil dari 3 pasar di Kota Bogor, yaitu Pasar Anyar (A), Pasar Bogor (B), dan Pasar Warung Jambu (J). Bahan kimia yang digunakan antara lain bufer 1× natrium tris EDTA (STE), natrium dodesil sulfat (SDS), CIAA (klorofom-isoamil alkohol 24:1), fenol, etanol 70%, etanol absolut (EtOH), NaCl 5 M, bufer tris EDTA (TE), akuades, 10× Dream Tag Buffer (Fermetas), primer forward 5’-GAC CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA-3’, primer reverse 5’CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG-3’ (spesifik sapi) dan 5’-GTC GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA-3’
2
(spesifik babi), dNTP, agarosa, etidium bromida (EtBr), bufer 0.5× tris borat EDTA (TBE), loading dye (biru bromtimol), DNA marker (100 bp). Enzim yang digunakan ialah proteinase-K 5 mg/mL dan Tag DNA polymerase (Fermetas). Lingkup Kerja Lingkup kerja penelitian ini diringkaskan dalam bagan tahapan penelitian di Lampiran 1. Tahapan yang dilakukan meliputi validasi metode ekstraksi berdasarkan parameter validasi yang diuji, penentuan tingkat cemaran terkecil, dan pengujian sampel dari pasar. Proses Pembuatan Bakso Daging sapi segar yang sudah dibersihkan lemaknya dipotong kecil-kecil, kemudian ditambahkan daging babi (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, dan 20% b/b) dan dimasukkan ke dalam food processor. Setelah itu, dimasukkan bahan tambahan seperti es batu, tepung tapioka, garam, bawang putih, natrium tripolifosfat (STPP), dan merica dengan komposisi masing-masing 40, 20, 15, 10, 5, dan 0.5% dari total bobot daging. Adonan selanjutnya dicetak berbentuk bulatan-bulatan bakso dan dimasukkan ke dalam panci yang berisi air mendidih (80 oC) selama 15 menit. Bulatanbulatan bakso dimasak kembali pada air mendidih (100 oC), lalu diangkat dan ditiriskan selama 15 menit. Bakso dikemas dalam plastik untuk selanjutnya diekstraksi. Ekstraksi DNA Sampel yang digunakan merupakan produk olahan daging yang tercemar daging babi. Ekstraksi DNA pada sampel dilakukan dengan menggunakan metode standar fenolkloroform (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi untuk produk tercemar daging babi. Preparasi Sampel Sebanyak 75 mg sampel bakso diambil dari 5 titik yang tersebar pada sampel. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Degradasi Protein Sampel dalam tabung ditambahkan 1× STE sampai volume 340 µL, 40 µL SDS 10%, dan 20 µL protein kinase K 5 mg/mL. Campuran diinkubasi pada suhu 55 oC selama 2 jam sambil digoyang perlahan.
Degradasi Bahan Organik Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL kloroform-isoamil alkohol (24:1), dan 40 µL NaCl 5 M. Campuran digoyang dalam suhu kamar selama 1 jam. Presipitasi DNA Sampel hasil ekstraksi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit hingga fase air terpisah dengan fase fenol. Fase air dipindahkan ke dalam tabung baru dengan volume terukur (± 400 µL). Molekul DNA diendapkan dengan cara menambahkan 800 µL alkohol absolut dan 40 µL NaCl 5 M. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama semalam, dan selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit. Endapan DNA yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% kemudian diendapkan lagi. Endapan DNA yang telah bersih dari alkohol dipulihkan dengan menambahkan 100 µL TE. Sampel DNA disimpan pada suhu -20 oC dan siap digunakan. Pengujian DNA Total Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%. Gel dibuat dari 0.3 g agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan agarosa dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan 1.25 μL pewarna etidium bromida. Sebanyak 5 μL sampel DNA dilarutkan dalam 1 μL loading dye, lalu elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt sampai pewarna mencapai bagian bawah gel. Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer GeneQuant 1300. Sampel DNA 3 μL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL dan ditambahkan akuades 597 μL. Larutan TE digunakan sebagai blangko, dibuat dengan cara yang sama, yaitu sebanyak 3 μL larutan TE ditambah 597 µL akuades, lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Sampel dan blangko di-spin down selama 0.5 menit, kemudian dilakukan pengujian dengan spektrofotometer.
3
Penentuan Konsentrasi dan Indeks Kemurnian DNA (Muladno 2010) Konsentrasi DNA sampel yang didapat dari isolasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. Apabila kerapatan optis (optical density) pada 260 nm atau OD260 sama dengan satu, maka konsentrasi DNA setara 50 µg/mL. Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian (nisbah A260/A280). DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian 1.8_2.0. × fp × 50 μg/mL [DNA] (µg/mL) = A 260 A Indeks Kemurnian DNA = 260 A 260 Keterangan: [DNA] = konsentrasi DNA fp = faktor pengenceran = absorbans pada 260 nm A260 = absorbans pada 280 nm A280
biru bromtimol mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pemotretan menggunakan UV. Validasi Metode Ekstraksi Limit Deteksi (LD) dan Limit Kuantitasi (LK) Penentuan limit deteksi dan limit kuantitasi dilakukan dengan mengukur kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7 kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai limit deteksi dan limit kuantitasi diperoleh dari persamaan berikut: LD = 3 × SB LK = K × SB Keterangan : LD = limit deteksi LK = limit kuantitasi SB = Simpangan baku kemurnian DNA K = koefisien limit kuantitasi (K=10) Presisi
Pengujian DNA dengan PCR Amplifikasi Fragmen DNA Spesifik Sapi dan Babi Amplifikasi fragmen DNA spesifik dilakukan dengan metode PCR. Komponen reaksi yang digunakan sebanyak 25 µL, terdiri atas 50 µg sampel DNA, primer forward 15 pmol, primer reverse 5 pmol, campuran dNTP 200 µM, MgCl2 1 mM, dan Taq polymerase 0.5 unit beserta bufernya. Proses amplifikasi dijalankan dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 95 oC selama 5 menit, kemudian dilakukan 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 95 oC selama 45 detik, penempelan primer pada suhu 60 oC selama 45 detik, dan pemanjangan DNA baru pada suhu 72 oC selama 1 menit. Setelah itu, pemanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 oC selama 5 menit. Elektroforesis dan Visualisasi Produk PCR Produk PCR divisualisasikan dengan teknik elektroforesis gel agarosa 2%. Gel dibuat dari 0.6 g agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan agarosa dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan 2.5 μL pewarna etidium. Sebanyak 5 μL produk PCR dilarutkan dalam 1 μL loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan 100 volt atau sampai pewarna
Uji presisi dilakukan dengan mengukur kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7 kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai persen simpangan baku relatif (SBR) dari 7 ulangan tersebut berdasarkan rekomendasi IUPAC dengan persamaan n 2 ∑ ( x - x) i i =1 SB = n −1
SBR (%) = Keterangan: SB =
SB
x
× 100%
xi
=
x
=
simpangan baku kemurnian DNA konsentrasi DNA pada setiap ulangan konsentrasi DNA rata-rata
n SBR
= =
jumlah pengulangan simpangan baku relatif
Ketidakpastian Kemurnian (Uncertainty for Purity)
DNA
Ketidakpastian kemurnian DNA juga ditentukan dari hasil pengukuran kemurnian dengan spektrofotometer terhadap 7 ulangan hasil ekstraksi DNA. Nilai ketidakpastian ditentukan mengikuti persamaan-persamaan sebagai berikut:
Ketidakpastian presisi:
u ( p) =
n 2 ∑ (x - x ) m i =1 i n -1
Ketidakpastian baku rata-rata:
um =
u (x ) m n
Ketidakpastian gabungan:
⎛u ⎜ m ⎜x ⎝ m
uc =
⎞ ⎟ ⎟ ⎠
2
Ketidakpastian diperluas: ue = k × uc
Pelaporan ketidakpastian kemurnian DNA:
[
]
Kemurnian DNA = Kemurnian DNA ± u e
Keterangan: rerata kemurnian DNA xm = n = banyaknya sampel k = faktor ketidakpastian dimana k adalah 2 untuk n-1 > 6 untuk selang kepercayaan 95% (IUPAC 2002) Identifikasi Sampel Pasaran
Sampel diambil dari 3 pasar di Kota Bogor, yaitu Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar Jambu Dua. Pengambilan sampel ditujukan pada pedagang-pedagang bakso yang membuat sendiri bakso yang dijualnya. Total sampel yang diambil sebanyak 2 butir per pedagang dengan rincian jumlah pedagang per pasar sebagai berikut: 3 pedagang dari Pasar Anyar (A1, A2, dan A3), 1 pedagang dari Pasar Bogor (B1), dan 1 pedagang dari Pasar Warung Jambu (J1). Tahapan pengujian sama seperti pada bakso yang dibuat dengan campuran daging babi.
HASIL DAN PEMBAHASAN Teknik analisis berdasarkan DNA telah banyak digunakan dalam berbagai bidang. Sektor pangan merupakan salah satunya, yang memfokuskan pada pengujian keamanan bahan pangan untuk dikonsumsi.
Berkembangnya industri pangan menuntut masyarakat untuk lebih waspada terhadap keamanan bahan pangan yang dikonsumsi. Keamanan pangan didefinisikan sebagai kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah bahan pangan dari kemungkinan tercemari bahan biologis, kimia, dan bahan lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia (Peraturan Pemerintah Nomor 28 Tahun 2004). Maraknya pemalsuan produk makanan olahan saat ini membuat konsumen sangat dirugikan. Masalah kehalalan produk pangan sering ditemui, seperti adanya cemaran selain daging sapi, khususnya cemaran daging babi, pada produk makanan olahan bakso. Identifikasi DNA secara PCR merupakan salah satu solusi untuk menyelesaikan masalah pemalsuan produk pangan. Teknik analisis PCR merupakan salah satu teknik deteksi dan identifikasi jenis hewan yang terkandung dalam suatu produk pangan yang sangat praktis diaplikasikan, akurat, dan mempunyai kelebihan dapat mendeteksi protein yang sudah terdegradasi (matang atau produk olahan) dalam kandungan yang sangat sedikit (μg) (Nuraini 2004). Ada beberapa tahapan pada analisis DNA dengan teknik PCR, salah satunya ialah isolasi DNA, yaitu proses ekstraksi dan amplifikasi DNA. Validasi Metode Ekstraksi DNA
Isolasi DNA merupakan tahapan terpenting dalam analisis DNA. Ekstraksi merupakan proses yang sangat kritis dalam isolasi DNA dan memengaruhi mutu DNA yang diisolasi. Mutu DNA lebih lanjut akan mempengaruhi hasil amplifikasi DNA yang dilakukan. Proses ekstraksi DNA dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu preparasi sampel, lisis, degradasi protein, degradasi bahan organik, dan presipitasi DNA. Preparasi sampel merupakan tahapan penimbangan sejumlah sampel yang akan diekstraksi. Proses lisis dilakukan dengan penambahan detergen SDS yang digunakan untuk merusak membran. Penambahan protein kinase K dimaksudkan untuk mendegradasi protein dalam sampel. Selanjutnya penambahan fenol, klorofom, dan isoamil alkohol dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein sisa atau hasil degradasi dan sebagian kecil RNA. Kloroform berfungsi membersihkan protein dan molekul lain seperti polisakarida, hingga didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas
5
kontaminan. Isoamil alkohol meencegah terjadinya fooaming. Ekstrakssi dengan feenol dan klooroform akan menghhasilkan 3 fasee larutan (Gam mbar 1). Lapisan takbberwarna yanng mengandunng DNA (fase air) terbentuk t di atas lapisann fenol. Presipitasi DNA dalam fase air diilakukan a dan NaCl. dengan peenambahan alkohol Setelah didiiamkan 1 malam, DNA dippulihkan dengan TE.
Gambar 1
Fase yangg terbentuk sesudah proses fenolekstraksi kloroform
Validasii metode ekstrraksi DNA diilakukan untuk mem mastikan hasil ekstraksi bermutu b baik sehinggga didapatkaan hasil PCR R yang akurat. Valiidasi dilakukaan mengikuti metode Sambrook et e al (1989). Parameter-paarameter yang diuji meliputi limit l deteksii, limit d ketidakkpastian kuantitasi, presisi, dan kemurnian DNA. Penillaian parameeter uji d melihat indeks kem murnian dilakukan dengan DNA yang diperoleh d (Anntonia et al. 20008) Kemurnian DNA diperoleh dengan k h hasil ekstrakssi DNA mengukur konsentrasi dengan speektofotometer. Indeks kem murnian DNA berkkorelasi denngan mutu DNA. Kemurnian diperoleh deengan melihatt nisbah serapan padda panjang gellombang 260 nm dan 280 nm (A2660/A280). Limit Deteeksi (LD) daan Limit Ku uantitasi (LK) Limit deeteksi merupaakan jumlah terkecil analit yangg dapat diddeteksi dan masih memberikann respons signnifikan dibandingkan dengan blanngko, sedanggkan limit kuuantitasi diartikan sebbagai jumlah terkecil analiit dalam sampel yangg masih mem menuhi kriteriaa cermat dan saksam ma (Harmita 2004). 2 Limit deteksi dan limit kuantitasi k diujji dengan meengukur kemurnian DNA hasil ekstraksi e sebaanyak 7 d pada Taabel 1. ulangan. Haasilnya dapat dilihat
Hasil uji limitt deteksi dan n limit kuuantitasi metoode ekstraksi DNA paada sampel bakso dengan d ceemaran Ulangann Indeks sampell kem murnian DNA 1 1.903 2 1.842 3 1.857 4 1.938 5 1.923 6 1.850 7 1.913 Rerataa 1.889 SB 0.039 LD 0.117 LK 0.389
Tabel 1
Tabel 1 memperlihatkkan bahwa metode m D memiliiki limit deteksi d ekstraksi DNA kemurnian DNA D sebesarr 0.117 dan n limit kuantitasi seebesar 0.389. Perhitungan n limit deteksi dan liimit kuantitassi dapat dilihaat pada Lampiran 2. Presisi Presisi menunjukkan m kesesuaian antara beberapa haasil pengukuuran yang diukur dengan caraa yang samaa (Sumardi 2002). Presisi mennggambarkan galat acak k dan variabilitas analisis hasil-hasil yang bersangkutann. Presisi metoode ekstraksii DNA ditentukan deengan mengukkur simpangan n baku relatif kem murnian DNA A dari 7 kali pengulangan sampel. Hasiil uji presisi metode m A dapat dilihaat pada Tabel 2. ekstraksi DNA Haasil uji presissi dan keterulangan meetode ekstrakssi DNA pada sampel s bakkso dengan ceemaran Ulangann Indeks sampell kem murnian DNA 1 1.938 2 1.875 3 1.857 4 1.950 5 1.938 6 1.923 7 2.000 Rerataa 1.925 SB 0.044 %) SBR(% 2.31
Tabel 2
6
Hasil pengukuran menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang dilakukan mempunyai persen SBR sebesar 2.31%. Nilai tersebut menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan memiliki ketelitian sedang (2% < %SBR < 5%) dan metode ini sesuai digunakan dengan kondisi laboratorium. Perhitungan uji presisi dapat dilihat pada Lampiran 2. Ketidakpastian Kemurnian DNA
Ketidakpastian merupakan gambaran rentang hasil pengukuran yang akan didapatkan (Harvey 2000). Ketidakpastian kemurnian DNA ditentukan untuk melihat kisaran galat yang masih dapat diterima dalam ekstraksi DNA serta melihat mutu DNA yang didapat. Ketidakpastian kemurnian DNA ditentukan dari hasil pengukuran indeks kemurnian DNA dengan spektrofotometer terhadap hasil 7 kali ulangan ekstraksi. Hasil uji ketidakpastian kemurnian DNA dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Hasil uji ketidakpastian kemurnian metode ekstraksi DNA pada sampel bakso dengan cemaran Ulangan Indeks sampel kemurnian DNA 1 1.812 2 1.842 3 2.067 4 1.847 5 2.071 6 2.020 7 1.857 Rerata 1.930 Perhitungan ketidakpastian kemurnian DNA selengkapnya diberikan pada Lampiran 3. Didapat nilai ketidakpastian sebesar (1.93±0.04). Nilai tersebut masih sesuai dengan kemurnian DNA optimum yaitu 1.80_2.00 (Sambrook & Russel 2001). Identifikasi Bakso
Analisis PCR dilakukan pada penelitian ini untuk mengetahui adanya cemaran daging babi pada produk pangan olahan bakso. Sampel yang diuji terdiri atas 2 jenis, yaitu sampel bakso dengan variasi cemaran daging babi dan sampel yang ada di pasaran. Identifikasi terhadap sampel bakso dengan variasi cemaran daging babi dimaksudkan untuk mengetahui tingkat terendah cemaran
yang masih dapat dideteksi dengan analisis PCR, sedangkan uji lapangan dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya cemaran daging babi pada sampel bakso yang dijual di pasaran. Sampel bakso dengan variasi tingkat cemaran dibuat dengan cemaran sebanyak 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, dan 20% (b/b). Bakso daging sapi dengan cemaran daging babi 0.1% (b/b) berarti dalam 99.9 g daging sapi ditambahkan 0.1 g daging babi. Bakso pasar yang diuji diambil dari pedagang bakso kaki lima di 3 pasar, yaitu Pasar Anyar (A), Pasar Bogor (B), dan dan Pasar Jambu Dua (J). DNA Total
Isolasi DNA kedua jenis sampel dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi DNA Sambrook et al (1989). DNA hasil ekstraksi kemudian diuji kualitatif maupun kuantitatif untuk mengetahui mutunya. Pengujian kuantitatif dengan spektrofotometer UV dilakukan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi (Muladno 2010). Kemurnian DNA yang optimum ditunjukkan oleh indeks kemurnian DNA antara 1.8 dan 2.0. Asam nukleat menyerap sinar UV 260 nm, sedangkan protein kontaminan menyerap sinar UV 280 nm. Oleh karena itu, nisbah absorbans pada kedua panjang gelombang ini akan menunjukkan kemurnian DNA (Sambrook & Russel 2001). Hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso diberikan pada Lampiran 4. Pengujian kualitatif dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1% yang diamati pada UV transluminator. Hasil visualisasi DNA bakso dengan variasi cemaran dan bakso di pasaran dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2a menunjukkan bahwa DNA bakso dengan variasi cemaran memiliki mutu yang baik, terlihat dari pola fragmen yang jelas terlihat. Sementara itu, hasil visualisasi DNA bakso pasar pada Gambar 2b menunjukkan pola pita yang memanjang (smear), hal ini karena pemberian bahan tambahan pada pembuatan bakso yang tidak diketahui komposisinya. Menurut Nuraini (2004), bahan lain dan bumbu-bumbu yang ditambahkan menyebabkan DNA yang diekstraksi masih tercampur dengan senyawa kontaminan seperti oligopeptida, polisakarida, protein, dan bahan-bahan organik lainya.
7
(a))
(b)
Gambar 2 V Visualisasi DNA D hasil ekstraksi pada geel agarosa 1% %: sampel bakkso dengan beerbagai macam variassi cemaran (1––7) (a); sampeel bakso pasarr (1–10) (b). Molekull DNA berssifat asam sehingga akan bergerrak dari kutubb negatif (kattode) ke kutub posittif (anode). Pergerakan P D DNA di dalam gel bergantung pada bobott/ukuran D bentuk konformasi DNA, molekul DNA, konsentrasi agarosa, teggangan listrik yang digunakan, dan kekuatann bufer elektrooforesis. p DNA dapaat divisualisaasi karena pewarna etidium broomida (EtBr) dapat terperrangkap (intercalatedd) di antaraa pasangan-pasangan basa DNA (Gambar 3)), yang jika disinari m n cahaya dengan radiasi UV akan memendarkan sehingga daapat terdeteksi.
pada proses amplifikasi ddengan mesin n PCR. mpuran Sampel dirreaksikan ddengan cam komponen PCR P yang tterdiri atas primer p forward, f primer reverse,, campuran dNTP, m tag polym merase, dan bufer. MgCl2, enzim Amplikasi diijalankan pada suhu penem mpelan (annealing) 60 6 oC. Primer yaang digunakann dalam ampllifikasi fragmen DN NA spesifikk sapi dan babi mengikuti Matsunaga M et aal. (1999). Seekuens primer forward keduanya ssama, yaitu 5’’-GAC G CCA TC CA AAC ATC C TCA CTC CCA GCT TCT TGA TGA AA-3’, sekuens primer p reverse ditunjjukan pada Taabel 4. Tabel 4 Jenis ternak Sapi
Babi
Sekuens primeer reverse sp pesifik frragmen DNA sapi dan babi R Reverse (5’-3’) Targeet hasil amplifikasi CTA GAA A AAG b 274 bp TGT AAG ACC (basee pair) TA CGT AAT AT AG GTC GAT AG GT AGA TTT GT TG ATG ACC GTA
b 398 bp
Sumber: Matsuunaga et al. (1999)
Gambar 3 Interaksi antaara etidium bromida b ( (EtBr) dan DN NA (Reha et al. a 2003) Amplifikasi DNA DNA baakso hasil isoolasi yang telah diuji kualitatif maupun kuantittatif selanjutnnya diuji R. Identifikassi DNA dengaan PCR dengan PCR dilakukan dengan konssentrasi DNA A hasil L yang akan bereaksi b isolasi sebesar 50 μg/μL
Proses reeaksi PCR teerdiri atas 3 tahap utama: denatturasi, penemppelan, dan ellongasi (pemanjangann rantai DNA A) (Gambar 4)). Tiga tahapan terseebut akan terjaadi pada suhu u yang telah diatur. Pada P tahap peertama, akan terjadi denaturasi potongan p DN NA utama. Suhu denaturasi yang digunakaan pada pen nelitian adalah 95 oC. Untai tuunggal DNA hasil denaturasi sellanjutnya akann mengalami proses penempelan oleh primerr forward maupun m
8
reverse padaa suhu 60 oC. Proses yang terakhir adalah pemaanjangan rantaai DNA pada suhu 72 o C sesuai dengan d panjanng basa target yang telah ditentuukan. Produk DNA yang teerbentuk pada ampllifikasi pertaama akan menjadi m cetakan padda siklus selanjjutnya. Hasil amplifikasi a D DNA bakso dengan variasi cemaran ditunjukkkan pada Gambar 5. b dengann variasi Terlihat bahhwa sampel bakso cemaran menghasilkan m fragmen DNA A yang beragam. Fragmen F DNA A sapi akan muncul pada 274 bpp dan babi padda 398 bp. Vissualisasi DNA hasil reaksi PCR dilakukan pada p gel agarosa 2%. Tingkat kebberhasilan ampplifikasi p olahann bakso DNA yang berasal dari produk dengan 7 tingkat cemaaran disajikaan pada H yang diiperoleh menuunjukan Tabel 5. Hasil bahwa fraggmen DNA teramplifikassi pada setiap tingkat cemarann walaupun dengan persentase keberhasilan k y yang beragam..
Gambar 4 Proses reakssi PCR (Barttlett & Stirling 20033).
Gambar 5 Visualisasi hasil h amplifikkasi DNA saampel bakso dengan berbaagai macam variasi v cemaran padda gel agarosaa 2%. Keterang gan Gambar 5 pada Tabel 55.
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Taabel 5 Tingkaat keberhasilann amplifikasi DNA D bakso deengan 7 variasi cemaran Keberhaasilan PCR ke-3 PCR kee-1 PC CR ke-2 amplifikasi//sampel Sampel (%) Sapi Babi Sapi Babi Sapi S Babi Sapi Babi Sapi + + + 100 0 Babi + + + 0 100 S Sapi+Babi + + + + + + 100 100 Baakso 0.1% + + + 100 0 Baakso 0.5% + + + + + + 100 100 B Bakso 1% + + + + + + 100 100 B Bakso 5% + + + + + + 100 100 B Bakso 10% + + + + + + 100 100 B Bakso 15% + + + + + + 100 100 B Bakso 20% + + + + + + 100 100 Kontrool negatif (Airr) 0 0
Keterangan: + DNA terampllifikasi; - DNA tidak terampliffikasi
9
Persentase keberhasilan amplifikasi pada Tabel 5 menunjukkan bahwa semua tingkat cemaran teramplifikasi dengan baik, namun pada cemaran 0.1% (b/b) hanya terdeteksi fragmen DNA sapi pada 274 bp, sedangkan fragmen DNA babi sudah tidak dapat terdeteksi pada 398 bp. Hasil ini mengindikasikan, tingkat cemaran terkecil yang masih dapat terdeteksi pada sampel bakso adalah 0.5% (b/b). Meskipun tipis, fragmen yang terbentuk masih dapat terdeteksi. Kontrol positif yang digunakan pada pengujian ialah DNA sapi, babi, dan campuran sapi dan babi yang diambil dari
DNA darah, sedangkan air digunakan sebagai kontrol negatif. Pengujian sampel dari pasar dilakukan 2 kali ulangan (duplo). Sampel Pasar Anyar diambil ada 3 (A1, A2, dan A3), Pasar Bogor 1 sampel (B1), dan Pasar Warung Jambu 1 sampel (J1). Gambar 6 menunjukkan bahwa seluruh sampel teramplifikasi dengan baik, ditunjukkan dengan munculnya fragmen DNA sapi pada 274 bp. Fragmen DNA babi tidak muncul untuk semua sampel dan hanya muncul pada kontrol positif. Persentase keberhasilan amplifikasi sampel bakso di pasaran dapat dilihat pada Tabel 6.
Gambar 6 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa 2%. Keterangan Gambar 6 pada Tabel 6. Tabel 6 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar Sampel PCR ke-1 PCR ke-2 PCR ke-3 Keberhasilan amplifikasi/sampel (%) Sapi Babi Sapi Babi Sapi Babi Sapi Babi 1 Sapi + + + 100 0 2 Babi + + + 0 100 3 Sapi+Babi + + + + + + 100 100 4 A11 + + + 100 0 5 A12 + + + 100 0 6 A21 + + + 100 0 7 A22 + + + 100 0 8 A31 + + + 100 0 9 A32 + + + 100 0 10 B11 + + + 100 0 11 B12 + + + 100 0 12 J11 + + + 100 0 13 J12 + + + 100 0 14 Kontrol negatif (Air) 0 0 Keterangan : + DNA teramplifikasi; - DNA tidak teramplifikasi.
No
Persentase keberhasilan mencapai 100% untuk setiap sampel yang diujikan dan hanya DNA sapi yang teramplifikasi pada setiap sampel uji. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada sampel bakso yang diambil dari 3 pasar di Kota Bogor tidak ditemukan adanya cemaran babi.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Validasi metode ekstraksi DNA menghasilkan limit deteksi kemurnian DNA sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian DNA sebesar 0.389, persen SBR 2.31%, dan ketidakpastian kemurnian DNA sebesar 1.93 ± 0.04. Berdasarkan hasil tersebut, metode ekstraksi DNA telah memiliki kelayakan yang baik untuk analisis PCR. Teknik PCR yang dilakukan mampu mengidentifikasi cemaran daging babi dalam sampel bakso hingga tingkat cemaran 0.5% (b/b). Pengujian terhadap sampel bakso dari 3 pasar berbeda di kota Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor dan Pasar Jambu Dua) dengan teknik PCR tersebut tidak menunjukkan adanya cemaran daging babi. Saran
Perlu dilakukan pengujian parameter validasi yang lain seperti ketertiruan (reproducibility) dan ketangguhan metode (ruggedness). Pengujian juga perlu dilakukan pada jenis sampel yang lain seperti dendeng dan abon.
DAFTAR PUSTAKA Antonia et al. 2008. The validation of the DNA extraction method from Apis mallifera L. Animal Sci Biotech 65:387390. Bartlett JMS, Stirling D. 2003. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. New Jersey: Humana Pr. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Maj Ilmu Kefarmasian 3:117-135. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill.
Hayyan et al. 2009. Identifying of fats of halal and non halal animals using a geometric method. Halal Sci 3:43-51. [IUPAC] International Union of Pure and Applied Chemistry. 2002. Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Method of Analysis (IUPAC Technical Report). London: IUPAC. Margawati ET, Ridwan M. 2010. Analysis of porcine contamination by using PCR technology in several meat ball products: to find an effective assessment system. Berita Biol 10:93-98. Matsunaga T et al. 1999. A quick and simple method for the identifcation of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci 51:143-148. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor: IPB Pr. Nuraini H. 2004. Pengembangan sekuen Porcine Repetitive Element (PRE-1) sebagai penanda molekuler untuk mendeteksi material babi pada produk daging olahan [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 28 Tahun 2004 tentang Keamanan, Mutu, dan Gizi Pangan. Jakarta. Reha D et al. 2003. Nature of stacking interactions between intercalators (ethidium, daunomycin, ellipticine, and 4′,6-diaminide-2-phenylindole) and DNA base pairs. Chem Soc 124:3366-3376. Saez R, Sanz Y, Toldra F. 2003. PCR-based fingerprinting technique for rapid detection of animal species in meat product. Meat Sci 66:659-665. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Lab. Sambrook J, Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbour Lab. Sumardi. 2002. Validasi Metode Pengujian. Jakarta: Pusat Standardisasi dan Akreditasi Sekretariat Jenderal Departemen Pertanian.
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Bagan tahapan penelitian
Sampel
Preparasi Sampel
Degradasi Protein
Degradasi Bahan Organik
Ekstraksi DNA
Presipitasi DNA
Penentuan Kemurnian DNA
Validasi Metode Ekstraksi DNA
Visualisasi Fragmen DNA
Pengujian DNA dengan PCR
Visualisasi Fragmen DNA Hasil PCR
Identifikasi Cemaran Daging Babi pada Sampel Bakso
13
Lampiran 2 Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi No 1 2 3 4 5 6 7
•
•
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran A280 A260/A280 μg/μL Sampel A260 1 0.059 0.031 1.903 590 2 0.035 0.019 1.842 350 3 0.039 0.021 1.857 390 4 0.031 0.016 1.938 310 5 0.027 0.014 1.923 310 6 0.074 0.040 1.850 740 7 0.044 0.023 1.913 440 Rerata 1.889 SB 0.039
Limit deteksi LD = 3×SB LD = 0.117% kemurnian DNA Limit kuantitasi LQ = 10 x SB LQ = 0.389% kemurnian DNA
No 1 2 3 4 5 6 7
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran A280 A260/A280 μg/μL Sampel A260 1 0.031 0.016 1.938 310 2 0.030 0.016 1.875 300 3 0.039 0.021 1.857 390 4 0.039 0.020 1.950 390 5 0.031 0.016 1.938 310 6 0.027 0.014 1.923 270 7 0.038 0.019 2.000 280 Rerata 1.925 SB 0.044 SBR(%) 2.31
•
Persisi SB
× 100% x SBR (%) = 2.31%
SBR (%) =
14
Lampiran 3 Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran A280 A260/A280 μg/μL No Sampel A260 1 1 0.029 0.016 1.812 290 2 2 0.035 0.019 1.842 350 3 3 0.031 0.015 2.067 390 4 4 0.242 0.131 1.847 2420 5 5 0.029 0.014 2.071 290 6 6 0.101 0.050 2.020 1010 7 7 0.039 0.021 1.857 390
Ulangan sampel 1 2 3 4 5 6 7 Rerata
Indeks Kemurnian DNA 1.812 1.842 2.067 1.847 2.071 2.020 1.857 1.930
(x - x )
-0.118 -0.088 0.137 -0.083 0.141 0.090 -0.073
0.0139 0.0077 0.0187 0.0068 0.0198 0.0081 0.0053
uc =
Ketidakpastian baku rata-rata: u (x ) m um = n 0.11592
Ketidakpastian diperluas: ue = k × uc u e = 0,045
[
]
Kemurnian DNA = Pengukuran Kemurnian DNA ± u e
[
]
Kemurnian DNA = 1.93 ± 0,04
2
u c = 0.0227
Ketidakpastian pengukuran kemurnian DNA
⎛ 0.04382 ⎞ ⎟ ⎜ ⎝ 1.930 ⎠
u e = 2 × 0.0227
7
u m = 0,04382
2
i
Ketidakpastian gabungan: 2 ⎛ um ⎞ uc = ⎜ ⎟ ⎝ Xm ⎠
Ketidak pastian presisi: n 2 ∑ (x -x ) i =1 i m u (p) = n-1 u (p) = 0.11592
um =
xi - x
15
Lampiran 4 Data pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso dengan variasi cemaran dan bakso pasar Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel baksodengan variasi cemaran No Sampel A260 A280 A260/A280 μg/μL 1 Bakso 0.1% 0.008 0.007 1.143 80 2 Bakso 0.5% 0.013 0.004 3.250 210 3 Bakso 1% 0.029 0.014 2.071 290 4 Bakso 5% 0.061 0.027 2.259 610 5 Bakso 10% 0.040 0.015 2.667 400 6 Bakso 15% 0.016 0.007 2.286 160 7 Bakso 20% 0.101 0.050 2.020 1010
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso pasar A280 A260/A280 Sampel A260 A11 0.092 0.051 1.804 A12 0.059 0.031 1.903 A21 0.055 0.028 1.964 A22 0.044 0.023 1.913 A31 0.028 0.016 1.750 A32 0.027 0.015 1.800 B11 0.044 0.039 1.641 B12 0.074 0.040 1.850 J11 0.049 0.023 2.130 J12 0.040 0.019 2.105
μg/μL 920 590 550 440 280 270 640 740 490 400
