11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011. Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Objek Penelitian Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S. incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.
Tahapan Analisis DNA S. incertulas
Ekstraksi DNA Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris HClEDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) untuk menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain (kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril. Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk membekukan jaringan, sehingga mempermudah proses penghancuran toraks.
12
Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M TrisHCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml). Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya, supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit), lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240 µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol
(CIAA), lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA. Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4
o
C (overnight).
Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit) pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM, lalu disimpan pada suhu -4 0C.
13
Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S. incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298 dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1, Gambar 4). Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S. incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis
Primer
Mt D4 Mt D9
A-298 Bt-LYS
Gen COI TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC (Simon et al. 1994) Gen COII ATTGGACATCAATGATATTGA GTTTAAGAGACCAGTACTTG (Liu & Beckenbach1992, Simon et al. 1994)
1442 tRNA-Tyr
Posisi primer pada mtDNA O. furnacalis (No. Akses GenBank: NC003368)
Sekuen 5’-3’
2977
1339-1365 2131-2157
3337 - 3357 3739 - 3758
3040
3721
tRNA-Leu Gen COI
tRNA-Lys Gen COII A-298
Mt D4 Mt D9
Bt-LYS
100 pb
Gambar 4
Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas.
14
Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM). Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC (2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC (1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masingmasing 30 siklus.
Elektroforesis dan visualisasi DNA Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M).
Visualisasi DNA
menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).
Sekuen DNA Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa kromatogram di-edit secara manual.
Analisis Data DNA S. incertulas Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win dan program BioEdit Versi 7.0.9.0.
15
Analisis Homologi DNA S. incertulas
Gen COI Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLASTN) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php). Gen COII Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.
Tabel 2 No
Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) Sampel
Haplotipe Sampel Lep.12062007.H1 Lep.20032007.H1 Lep.16042007.H1 Lep.23032006.H1 Lep.10062005.H1 Lep.10042007.H2 Lep.13042007.H3 Lep.20052006.H4 Lep.10022006.H5 Lep.28052006.H6
1 Lep.12062007 2 Lep.20032007 3 Lep.16042007 4 Lep.23032006 5 Lep.10062005 6 Lep.10042007 7 Lep.13042007 8 Lep.20052006 9 Lep.10022006 10 Lep.28052006 Keterangan: H = Haplotipe; Jabar = Jawa Barat; Jateng Jatim = Jawa Timur
Lokasi Dieng, Wanasaba, Jateng Pakembinangun, Sleman, DIY Magetan, Jatim Karangmangu, Baturaden, Jateng Garut, Jabar Baluran National Park, Jatim Alas Purwo National Park, Jatim Ciamis, Jabar Wates, Kulon Progo, DIY Halimun-Salak National Park, Jabar
No. Akses GenBank AB495265 AB495267 AB495268 AB495272 AB495273 AB495269 AB495270 AB495271 AB495266 AB495274
= Jawa Tengah; DIY = Daerah Istimewa Yogyakarta;
16
Tabel 3
Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin dan Samudra (2010)
Sc7Bg Sc9Bg Sc22Kr
Haplotipe Sampel Sc7Bg.H1 Sc9Bg H1 Sc22Kr.H1
Bogor, Jabar Bogor, Jabar Karawang, Jabar
Sc8Id Sc10Id Sc11Bg
Sc8Id.H1 Sc10Id.H1 Sc11Bg.H2
Indramayu, , Jabar Indramayu, Jabar Bogor, Jabar
No
Sampel
1 2 3 4 5 6
Lokasi
Titik Koordinat L: -6,872 A: 109,359 L: -6,256 A: 107,322 L: A: L: -6,872 A: 109,359 L: A: -
7 Sc24Kr Sc24Kr.H3 Karawang, Jabar 8 Sc1Cb Sc1Cb.H4 Cirebon, Jabar Keterangan: H = Haplotipe; Bg = Bogor; Kr = Karawang; Id = Indramayu; Cb = Cirebon L= Latitude, A= Altitude; = tidak ada data latitude dan altitude
Analisis Homologi Asam Amino Putataive S. incertulas Sekuen nukleotida gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini masing-masing ditranslasi ke dalam asam amino dengan mengunakan program Genetyx Win versi 4.0. Tahap berikutnya, sekuen asam amino putative gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi dengan data GenBank. Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Protein (BLAST-P) dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen asam amino putative di-alignment terhadap individu S. incertulas untuk masingmasing gen COI dengan gen COII.
Analisis Jarak Genetik Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI S. incertulas dan S. innotata (Si; No. Akses GenBank: AB495264). Sedangkan, analisis jarak genetik gen COII S. incertulas dilakukan antara S. excerptalis asal Papua Nugini dan India (Se.PNG dan Se.India; berturut-turut No. Akses GenBank: AY320508 dan AY320507). Proses analisis jarak gen COI dan COII S. incertulas menggunakan program MEGA 5.
17
Analisis Filogeni Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI S. incertulas (ingroup) dan spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. innotata, C. suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 4). Pada gen COII, konstruksi pohon filogeni dilakukan antar S. incertulas (ingroup) spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. excerptalis, C. suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 5).
Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 5. Tabel 4
No 1 2 3
Spesies S. innotata C. suppressalis O. furnacalis
Tabel 5
No 1
Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini Lokasi Indonesia Cina Cina Cina
No. Akses GenBank AB495264 EU362114 EU362115 NC003368
Sampel Si.AB495264 Cs.H1.EU362114 Cs.H2.EU362115 Of.NC003368
Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
Spesies S. excerptalis
2
C. suppressalis
3
O. furnacalis
Lokasi India Papua Nugini Cina Cina Cina
No. Akses GenBank AY320507 AY320508 EU362116 EU362117 NC003368
Sampel Se.India.AY320507 Se.PNG.AY320508 Cs.H1.EU362116 Cs.H2.EU362117 Of.NC003368
