LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA
LAPORAN I (ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID)
KHAIRUL ANAM P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0
ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi.
TINJAUAN PUSTAKA
Plasmid Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan 1
membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan
protein
dan
polisakarida
dari
larutan).
Etanol
berfungsi
untuk
memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).
Spektrofotometer Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)
Elektroforesis Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, 2
sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum
dilakukan
elektroforesis,
suspensi
DNA
terlebih
dahulu
harus
ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong 3
DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen. Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong. Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi 4
variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.
Pemetaan Plasmid Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang
dihasilkan
oleh tiap-tiap endonuklease
restriksi
harus
ditentukan
dengan
elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi.
5
BAHAN DAN METODE KERJA
Isolasi DNA Plasmid Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid. Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolakbalik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Bufer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM).
Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm. 6
Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM, asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%). Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Selesai inkubasi, dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. Selanjutnya, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya. Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan HindIII, 8. NotI dan EcoRI.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Plasmid Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi DNA, 3. Pengendapan DNA.
Gambar 1. Lisis dinding dan membran sel bakteri Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi.
Gambar 2. Ekstraksi DNA dengan PCI
8
Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.
Gambar 3. Pemurnian DNA dengan etanol Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.
9
Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Dari DNA plasmid yang diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan menggunakan metode spektrofotometri, didapatkan hasil seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm Kel
Abs λ260
Abs λ280
Abs λ260/ Abs λ280
konsentrasi ng/ul
6
2.213
1.333
1.66
110.6
Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280 sebesar 1.66 adalah lebih kecil dari 1.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni. Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul, 20 ng/ul, 40 ng/ul. Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna menjauhi sumuran. Untuk kuantifikasi, jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.
Gambar 4. Hasil elusi isolasi DNA Plasmid 10
Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier. Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan seperti pada kelompok 5, untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis mengandung bobot 40 ng, sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. Sehingga ketika akan dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2.5 ul untuk mendapatkan 100 ng DNA.
Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid
Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan
pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya masing-masing. pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5. EcoRI NotI HindII SacI EcoRI HindIII NotI I HindIII SacI HindIII
Gambar 5. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi 11
Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai berikut, 1. NotI: 3018 bp + 806 bp 2. EcoRI: 3018 bp + 806 bp 3. HindIII: 3824 bp 4. SacI: 3711 bp + 113 bp 5. EcoRI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp 6. HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp 7. NotI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp Maka dari data tersebut dapat diperoleh pemetaan enzim restriksi pada plasmid pGEM T Easy seperti yang terlihat pada Gambar 6.
SacI, EcoRI, NotI
SacI
pGEM T Easy 3824 bp
HindIII EcoRI, NotI
Gambar 6. Pemetaan plasmid pGEM T Easy Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI, EcoRI dan NotI memiliki dua
situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama, sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. Situs pengenalan pengenalan EcoRI dan NotI memiliki jarak restriksi yang sama.
12
SIMPULAN 1. Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid sebesar 110.6 ng/ul 2. Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear, sirkular, open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul. 3. Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs restriksi dengan enzim SacI, EcoRI dan NotI dan HindIII.
DAFTAR ACUAN Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of microorganisms. Prentice Hall. Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica. Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C. Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor. Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika
13
