BAHAN DAN METODE
Tahap I: Pembuatan Konstruksi Vaksin DNA KHV dan Plasmid DNA KHV yang digunakan sebagai sumber isolasi gen adalah DNA yang berasal dari virus tipe liar.
DNA ini diperoleh dari Balai Riset Perikanan
Budidaya Air Tawar (BRPBAT Bogor). Sampel DNA dari virus tipe liar tersebut berkode 2, 3, 1A, 2A, 3A, B1, B2, B3, U2B, U2C. Plasmid yang digunakan adalah pGEMT-Easy (Promega) yang memiliki gen lacZ dan penanda resisten ampisilin, sedangkan plasmid yang berfungsi untuk mengekspresikan gen adalah pActD6 (Alimuddin et al.
2005) yang
mengandung promoter β-aktin (Act) dari ikan medaka (Jepang) yang menyisip pada situs EcoRI dan poly-A (terminator) yang yang berasal dari bovine growth hormone dan menyisip pada situs XhoI. Plasmid ini masih mengandung gen masu salmon Δ6-desaturase- like di antara Act dan BGH-polyA. Disain Primer Disain primer dilakukan terhadap ORF 25 sekuens lengkap koi herpesvirus (Aoki et al. 2007) yang dimulai pada basa ke-45587 sampai 47393. Primer forward disusun dari start codon ATG sampai basa ke-19, sedangkan primer
reverse
disusun
dari
stop
codon
komplemennya sampai sebanyak 22 basa.
TAA
dan
ditentukan
basa
Untuk keperluan konstruksi
sehingga hasil amplifikasi sesuai dengan situs yang ada di
vektor ekspresi
maka ke dalam primer forward disisipkan situs SalI. Isolasi Gen Penyandi Glicoprotein Isolasi DNA dilakukan dengan cara mengamplifikasi DNA KHV dengan menggunakan primer yang didisain khusus (primer spesifik) yaitu primer forward F:
TTGTCGACATGACGGGTTGTGGGGTTTG
TTAGGGCCTCCGGGAAACCTGG.
Kondisi
dan reaksi
primer
reverse
polimerisasi
R:
adalah
prakondisi pada suhu 95oC selama tujuh menit, denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, annealing pada suhu 64oC selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72 oC selama dua menit dan finally pada suhu 72oC selama tujuh menit. Gen yang telah teramplifikasi tersebut kemudian dielektroforesis dan diisolasi dengan menggunakan EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit (Biobasic). Gen yang telah dielektroforesis tersebut kemudian dipotong dengan
menggunakan skalpel dan hasil potongan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml. Larutan binding buffer sebanyak 400 ul ditambahkan ke dalam tabung mikro yang berisi potongan DNA dalam agar, diinkubasi pada suhu 55oC selama 10 menit dan selanjutnya dikocok dengan kuat sampai agar terlarut. Isi tabung mikro dituang ke dalam EZ-10 column dan dibiarkan selama dua menit, selanjutnya disentrifugasi pada 10000 rpm selama dua menit dan supernatan dibuang.
Cairan pencuci (wash solution) ditambahkan ke dalam
column sebanyak 500 ul, disentrifugasi pada 10000 rpm selama satu menit. Cairan dalam tabung dibuang. Cairan pencuci (wash solution) ditambahkan lagi ke dalam column sebanyak 500 ul dan disentrifugasi pada 10000 rpm selama satu menit.
Column ditempatkan pada tabung Eppendorf, ditambahkan
sebanyak 30-50 ul elution buffer pada bagian tengah column dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua menit. Column dan tabung eppendorf tersebut disentrifugasi pada 10000 rpm selama dua menit untuk mengelusi DNA. Ligasi Fragmen Glikoprotein dan pGEMT-Easy Gen penyandi glicoprotein pada KHV diligasikan dengan plasmid pGEMT-Easy (Promega) dengan cara mencampurkan antara 1 ul pGEMT-Easy dengan 4 ul gen glicoprotein KHV. Enzim ligase yang digunakan untuk proses ligasi tersebut adalah enzim T4 DNA ligase sebanyak 1 ul dan buffer T4 DNA ligase sebanyak 7 ul. Pencampuran dilakukan pada suhu ruang, dibiarkan selama 2 jam, setelah itu disimpan di refrigerator. Transformasi pada E.coli Kompeten Setelah plasmid pGEMT-Easy tersisipi gen glicoprotein KHV maka plasmid ini siap diintroduksi ke dalam sel kompeten yang berasal dari bakteri E.coli DH5α.
Plasmid ini dispindown sebentar, sebanyak 6
ul plasmid
dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikondisikan dingin (tabung diletakkan di es). Sebanyak 50 ul sel kompeten diambil secara hati-hati dan dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi plasmid hasil ligasi.
Tabung mikro ini
diletakkan di dalam es sampai dalam suasana dingin selama 20 menit. Tabung selanjutnya diberi kejutan panas (heat shock) selama 50 detik pada waterbath yang bersuhu 42 oC. Tabung mikro segera dipindahkan ke dalam es selama dua menit dan segera diberi media SOC sebanyak 950 ul. Tabung diinkubasi dalam shaker incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 200 rpm. Bakteri yang telah diinkubasi selanjutnya dibiakkan sebanyak 300 ul di
25
media Luria Bertani yang diberi ampisilin ( 100 ug/ml atau 20 ul/cawan), IPTG (20 mg/ml) sebanyak 100 ul/cawan dan X-gal (40 mg/ml) sebanyak 100 ul/cawan. Cawan diinkubasi overnight selama 16-24 jam pada 37 oC. Verifikasi Hasil Transformasi Verifikasi terhadap hasil transformasi dilakukan dengan cara mengamati adanya koloni putih-biru.
Plasmid pGEMT-Easy yang digunakan memang
mamiliki penanda khusus koloni putih-biru ini. Koloni putih adalah koloni yang tersisipi plasmid yang mengandung sisipan gen glikoprotein. Plasmid pGEMTEasy ini memiliki gen lacZ yang menyandi β-galactosidasse yang akan mengubah molekul X-gal dari tidak berwarna menjadi melekul yang berwarna biru. Ekspresi gen lacZ diinduksi oleh IPTG (isopropil thiogalactosida). Bila gen lacZ tersisipi oleh molekul DNA lain, maka lacZ ini tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung plasmid demikian tidak dapat mengubah X-gal menjadi berwarna biru.
Oleh karena itu sel yang tersisipi plasmid yang
mengandung gen target maka koloninya akan berwarna putih.
Sedangkan
koloni biru berarti sel bakteri tersebut mengandung plasmid pGEMT-Easy yang tidak mengandung sisipan gen pada daerah lacZ. Koloni yang berwarna putih ini diambil dengan tusuk gigi steril dan dimasukkan ke dalam tabung mikro. Sisa bakteri yang menempel di ujung tusuk gigi digores di agar untuk membuat master-plate. Untuk melihat adanya plasmid yang mengandung gen glikoprotein maka sel bakteri dipecah dengan menggunakan metode Cracking dengan menggunakan bahan-bahan kimia. Ke dalam tabung mikro yang berisi bakteri ditambahkan 5 µl buffer cracking (0.2 gram sakarosa, 40 µl NaOH 5 M dan 50 µl SDS 10 %; dilarutkan dalam 1 ml akuades bebas ion) dan 5 µl EDTA dan dibiarkan selama 5 menit dalam suhu ruang.
Loading dye sebyak 1 µl ditambahkan pada cekungan tutup bagian
dalam. Ependof dispindown, divorteks skala medium dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 5 µl sampel dielektroforesis dan sisanya diencerkan 10 kali dan diverifikasi dengan PCR. Verifikasi dapat dilanjutkan dengan sekuensing apabila kedua verifikasi sebelumnya menunjukkan hasil yang positif.
26
Isolasi Plasmid Bakteri yang mengandung pGEMT-GP diperbanyak untuk diambil plasmidnya sehingga sekuensing dapat dilakukan.
Koloni putih yang
mengandung plasmid pGEMT-GP dikultur pada media cair 2YT (1,6% polypeptone, 1% yeast extract, 0,5% NaCl dan 1,5% agarosa dalam SDW) pada suhu 37 oC selama 14-18 jam. Bakteri dipanen dan plasmidnya diisolasi. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas Life sciences) dengan prosedur sesuai manual (Lampiran 2). Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalam tabung mikro 1,5 mL.
Bakteri
diendapkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm sekitar 30 detik, supernatan dibuang dan ini dilakukan sampai bakteri di media kultur habis. Ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan Resuspend Solution sebanyak 250 µL, dilanjutkan dengan vorteks hingga semua pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan Lysis Solution sebanyak 250 µL, tabung mikro dibolak-balik sekitar 4-6 kali sampai larutan menjadi bening/jernih (tidak perlu dilakukan vorteks pada tahap ini untuk menghindari kerusakan DNA serta tidak disimpan lebih dari 5 menit untuk mencegah denaturasi plasmid DNA yang berbentuk supercoil). Setelah itu ditambahkan Neutralization Solution sebanyak 350 µL. Tabung mikro dibolak-balik dengan kuat kira-kira 4-6 kali, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke spin column yang disediakan satu paket dengan kit yang digunakan dengan cara menuang maupun diambil dengan menggunakan pipet, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama satu menit. Cairan yang tersaring dibuang dan column ditempatkan kembali pada tabung koleksi pasangannya. Sebanyak 500 µL Wash Solution dimasukkan ke dalam GeneJet spin column, disentrifugasi selama 30-60 detik pada kecepatan 13.000 rpm. Column dikembalikan ke tabung koleksi semula. Penambahan Wash Solution dilakukan sekali lagi dan disentrifugasi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Larutan yang tersaring dibuang, column ditempatkan kembali pada tabung koleksi, dilakukan sentrifugasi pada 13.000 rpm selama satu menit untuk menghindari terdapatnya residu etanol pada plasmid.
Plasmid DNA
dilarutkan menggunakan SDW sebanyak 30-50 µL, divorteks dan tabung mikro berisi plasmid dibiarkan selama 2 menit di suhu ruang. Sentrifugasi dilakukan pada suhu ruang dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Konsentrasi
27
DNA diukur menggunakan mesin kuantifikasi DNA/RNA merek Gene Quant. Plasmid pGEMT-Easy yang sudah mengandung gen glikoprotein selanjutnya dikirim ke Laboratorium Fish Physiology, Tokyo University of Marine Science and Technology untuk disekuensing. Hasil sekuensing ini kemudian dianalisis dengan software Genetix Version 7 dan Blast 2.0 (www.ebi.ac.uk)
untuk
disejajarkan (alignment) dengan data yang ada di GeneBank.
Pembuatan Konstruksi Vaksin DNA Vektor dasar plasmid yang dibangun untuk membawa gen glikoprotein adalah pGEMT-Easy (Promega), yaitu plasmid berspektrum inang luas dengan penanda resisten ampisilin. Gen glikoprotein yang diligasikan dengan pGEMTEasy dan telah diperbanyak dipotong (didigesti) dengan menggunakan enzim SalI.
Gen ini selanjutnya disisipkan pada plasmid pActD6 (Alimuddin et.al.
2005). Plasmid dasar yang digunakan tersebut berasal dari plasmid p-Bluescript (Lampiran 4). Plasmid pActD6 ini mengandung promoter β-actin (Act) dari ikan medaka asal Jepang, gen salmon masu Δ6-desaturase-like dan polyA dari bovine growth hormone. Gen masu salmon Δ6-desaturase-like ini dikeluarkan dengan menggunakan enzim SalI dan posisinya digantikan dengan gen glikoprotein sehingga terbentuk konstruksi pActGP25 yang siap diekspresikan di ikan (Lampiran 2). Gen GP25 inilah yang diharapkan dapat menyandi terbentuknya glikoprotein yang berperan menginduksi sistem kekebalan tubuh ikan sehingga ikan mampu membentuk antibodi yang dapat menetralkan virus KHV. Plasmid yang telah dikonstruksi sedemikian rupa ini selanjutnya digunakan sebagai vaksin DNA. Verifikasi ligasi gen GP25 pada pAct dengan arah yang benar dilakukan menggunakan metode PCR dengan primer F-GP dan R-T7 (5’TTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3’).
Koloni bakteri yang membawa
plasmid pAct-GP25 dengan arah ligasi yang benar dikultur dan selanjutnya plasmid pAct-GP25 diisolasi menggunakan kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas Life Sciences, USA).
Tahap II: Uji Ekspresi Vaksin Penelitian tahap II diawali dengan uji promoter β-aktin yang dilakukan dengan menginjeksikan secara intramuscular plasmid pAct-GFP (Hidayani 2009) ke juvenil ikan mas ukuran 10-15 g/ekor. Konsentrasi DNA plasmid yang
28
diinjeksikan adalah 12,5 µg/100µL fosfat buffer salin (PBS).
Total RNA
diekstraksi dari otot tempat injeksi, insang, limpa dan ginjal ikan mas yang diinjeksi dengan pAct-GFP pada saat 24 jam pasca injeksi (hari pertama) dan 1 minggu pasca injeksi.
Sementara itu untuk uji vaksin DNA pAct-GP25, total
RNA diekstraksi dari jaringan/organ yang sama dengan pada pAct-GFP, tetapi dilakukan pada 24 jam, 2 minggu dan hari 4 minggu setelah injeksi. Ekstraksi RNA dilakukan menggunakan Isogen (Nippon Gen, Japan). Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Masing-masing dosis disuntikkan ke 10 ekor ikan dan selanjutnya ikan dipelihara pada tiga akuarium yang berbeda.
a. Isolasi RNA Ikan yang telah divaksinasi diperiksa kandungan RNA-nya pada bagian bekas suntikan. Bagian bekas suntikan tersebut dipotong dengan skalpel steril, dikeluarkan secara aseptis dan langsung dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 200 µl ISOGEN yang disimpan on-ice. Untuk meminimalkan pengaruh RNase, semua alat dan bahan isolasi RNA diperlakukan dengan air yang mengandung dietylpyrocarbonate (DEPC). Sebelumnya alat-alat yang akan digunakan dalam isolasi telah disterilisasi pada suhu 123oC selama 15 menit. Jaringan bekas suntikan digerus sampai hancur dengan menggunakan grinder, setelah hancur lalu ditambahkan ISOGEN sampai volume akhir 800 µl dan disimpan pada suhu ruang selama 5 menit agar terlisis sempurna. Setelah itu ditambahkan 200 µl kloroform, divorteks selama 15 detik pada kecepatan sedang, lalu disimpan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi pada 12000 rpm, pada suhu ruang selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 400 µl isopropanol, dihomogenasi menggunakan vorteks pelan sampai homogen dan selanjutnya disimpan pada suhu ruang selama 5-10 menit. Tabung disentrifugasi pada 12000 rpm, suhu 4oC selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin dan disentrifugasi pada 12000 rpm, suhu 4oC selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu dikering udarakan. Setelah kering ditambahkan DEPC sebanyak 50 µl. Konsentrasi RNA total hasil isolasi diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNA/DNA (merek Gene-Quant). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.
29
b. Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR Konsentrasi RNA dibuat 3 mikrogram dalam 30 µl DEPC, kemudian dihomogenasi menggunakan vorteks dengan kecepatan rendah. Sebelumnya telah disiapkan inkubator dengan suhu 65oC, lalu tabung mikro dimasukkan ke dalam inkubator selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke dalam es selama 2 menit. Kemudian RNA dimasukkan ke dalam tabung ” First Strand Reaction Mix Beads” (white tube) yang telah berisi 2 butir bola putih. Kemudian
ditambahkan
3
µl
primer
”dT3`RACE-VECT”
(5`-
GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3`) dengan konsentrasi 1 µg/3 µl lalu dibiarkan selama 1 menit, setelah itu dihomogenasi menggunakan vorteks dengan kecepatan rendah. Tabung mikro dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37oC, diinkubasi selama 1 jam. Hasil sintesis cDNA ditambahkan 50 µl SDW steril. Dalam proses amplifikasi PCR untuk cDNA gen GP25 digunakan primer GP. Satu mikrogram cDNA digunakan sebagai sampel untuk PCR, kemudian dicampur dengan 1 µl primer forward maupun reverse (10 pmol/ µl), 1 µl dNTP, 1 µl Ex Taq buffer, 0.05 µl Ex Taq polymerase (TAKARA, Shiga, Jepang) kemudian ditambahkan SDW sampai volume akhir menjadi 10 µl. Proses polimerisasi dijalankan pada mesin PCR pada suhu 95oC selama 7 menit sebanyak 1 siklus; (95oC selama 30 detik; 62oC selama 30 detik; 72oC selama 1 menit) sebanyak 35 siklus; 72oC selama 5 menit sebanyak 1 siklus; dan 4oC (tak hingga). Hasil PCR dielektroforesis di agarose 0,7 % untuk melihat ada tidaknya gen GP25 yang teramplifikasi
Tahap III: Uji Tantang Skala Laboratorium Uji tantang dilakukan dalam dua tahap. Uji tantang tahap I dilakukan pada bulan Desember 2008 sampai Februari 2009, sedangkan uji tantang tahap II dilakukan pada pertengahan bulan November sampai bulan Desember 2009. Ikan terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh House Brand (PD.Eltra Raya Perkasa, Tangerang) dosis 0,04 ppt sebelum divaksinasi, diambil darahnya maupun diuji tantang dengan virus.
30
Preparasi Virus Sebanyak 1 gram insang yang terinfeksi KHV digerus kemudian disuspensikan dengan 9 ml larutan PBS. Suspensi insang ini disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas milipore 0,45 µm. Supernatan ini diencerkan 1000 kali dengan PBS (1:1000).
Uji Tantang Tahap I Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Ikan yang berukuran 10-15 gram tersebut diadaptasikan selama dua minggu sebelum perlakuan. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 60 ekor per perlakuan. Ikan dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing kelompok sebanyak 30 ekor.
Kelompok ikan pertama digunakan untuk pengamatan
haematologi dan kelompok ikan kedua digunakan untuk pengamatan RPS. Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi dengan dosis 2,5 µg/100 µl, 7,5 µg/100 µl dan 12,5 µg/100 µl serta kontrol negatif (ikan tidak divaksinasi dan tidak diuji tantang) dan kontrol positif (ikan tidak divaksinasi dan diuji tantang). Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore. Vaksinasi dilakukan selama 42 hari dan setelah itu ikan diuji tantang dengan virus KHV.
Pengambilan dan pemeriksaan sampel darah dilakukan
setiap minggu sampai satu bulan setelah uji tantang.
a. Pengamatan RPS (Relative Percent Survival) Setelah diuji tantang maka mortalitas ikan dicatat setiap hari. Persentase mortalitas dideterminasi dari masing-masing perlakuan dan kelangsungan hidup relatif dihitung untuk masing-masing perlakuan vaksinasi dan dibandingkan dengan kontrol (Johnson et al. 1982 dalam Leong, 1986; Ellis 1988; Corbeil et al. 1999). Perhitungan dilakukan dengan rumus: RPS = (1 - Mn )X 100 M0 Dimana: RPS = relative percentage survival / tingkat kelangsungan hidup relatif Mn = % mortalitas ikan perlakuan ke-n Mo = % mortalitas ikan kontrol
31
b. Pengambilan Sampel Darah Pengambilan darah dilakukan setiap satu minggu sekali yang dimulai satu minggu setelah vaksinasi.
Setiap sampling dilakukan pengambilan 3 ekor
ikan untuk masing-masing perlakuan.
Pengambilan sampel darah dilakukan
dengan menggunakan spuit pada vena caudalis yang telah dibasahi dengan antikoagulan Na-sitrat 3,8 % untuk mencegah pembekuan darah. Darah yang telah terambil diberi antikoagulan dengan perbandingan 1:4 dengan jumlah darah yang diambil.
Selanjutnya dilakukan pengamatan jumlah lekosit total,
diferensial leukosit dan indeks fagositik. c. Penghitungan Jumlah Leukosit Total Penghitungan leukosit total dilakukan dengan cara mengencerkan darah terlebih dahulu dengan menggunakan larutan Turk’s.
Penambahan larutan
Turk’s yang bersifat asam akan menyebabkan sel darah mengalami lisis sehingga yang tertinggal hanya sel darah putih saja. Pencampuran dilakukan di dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Pipet ini berisi bulir berwarna putih yang berfungsi sebagai pengaduk. Untuk menghitung sel darah putih, darah dihisap dengan pipet pencampur sampai skala 0,5 dan selanjutnya ditambah dengan larutan Turk’s. Pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Sebelum dilakukan penghitungan, dua tetes pertama dari campuran tersebut dibuang dan selanjutnya diteteskan pada haemacytometer tipe Neubauer dan ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dihitung dengan bantuan mikroskop pada pembesaran 400 kali. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak besar haemacytometer dengan rumus sebagai berikut (Nabib & Pasaribu 1989)
Σ leukosit = rataan Σ sel terhitung x
____1___________ x pengenceran Volume kotak besar
d. Aktivitas Fagositosis Penghitungan indeks fagositosis dilakukan menurut Anderson dan Siwicki (1993), yaitu dengan memasukkan sampel darah dari ikan sampel ke dalam
mikrotiter
plate
sebanyak
50
µl
dan
ditambahkan
suspensi
Staphylococcus aureus dalam PBS (107 sel), kemudian dicampur secara
32
homogen dan diinkubasi selama 20 menit. Campuran darah dan bakteri diambil sebanyak 5 µl, dibuat sediaan ulas dan dikeringudarakan.
Ulasan darah
tersebut diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 15 menit dan dicuci dengan air mengalir dan berikutnya dikeringkan dengan kertas tissue.
Aktivitas
fagositosis dihitung berdasarkan persentase sel yang menunjukkan proses fagositosis dari 100 jumlah sel yang dihitung.
Uji Tantang Tahap II Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Ikan yang berukuran 10-15 gram tersebut diadaptasikan selama dua minggu sebelum perlakuan.
Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi
dengan dosis 2,5 µg/100 µl, 7,5 µg/100 µl dan 12,5 µg/100 µl serta kontrol negatif (ikan tidak divaksinasi dan tidak diuji tantang dan kontrol positif (ikan tidak divaksinasi dan diuji tantang). Tiap-tiap perlakuan dirancang dengan tiga kali ulangan. Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore. Vaksinasi dilakukan selama 28 hari dan setelah itu ikan diuji tantang dengan virus KHV. Gejala klinis diamati secara visual.
Uji Keamanan Vaksin Bersamaan dengan uji tantang tahap kedua ini dilakukan vaksinasi ikan dengan vaksin DNA untuk melihat
keamanan vaksin terhadap ikan yang
divaksinasi. Keamanan vaksin dapat dibuktikan dengan membuat sayatan tipis jaringan ikan yang divaksinasi dan diamati secara mikroskopis (KinKelin 1988). Uji keamanan vaksin dilakukan dengan menyuntik 10 ekor ikan mas berukuran 10-15 gram dengan vaksin DNA dengan dosis 12,5 µg per ekor. Ikan tersebut dipelihara dalam akuarium beraerasi dan diberi pakan pellet sebanyak dua kali per hari. Ikan ini diamati dan dicatat kelangsungan hidupnya. Untuk melihat kelainan jaringan atau organ secara mikroskopik dilakukan melalui pembuatan preparat jaringan. Preparat dibuat dari jaringan otot yang menjadi tempat penyuntikan vaksin, insang, limpa dan ginjal. Selanjutnya potongan jaringan diproses lebih lanjut untuk dibuat preparat dan diwarnai (Lampiran 5).
33
Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis secara deskriptif yang disajikan dalam bentuk tabel, grafik dan gambar. Untuk membedakan efektivitas dosis yang dikaitkan dengan penghitungan nilai RPS dianalisis dengan ANOVA dan diuji lanjut dengan uji BNT (beda nyata terkecil).
34
