ISOLASI PLASMID DAN GEN β-laktamase DARI Escherichia coli SENSITIF DAN RESISTEN AMOKSILIN- KLAVULANAT

J. Sains Tek., April 2005, Vol. 11, No. 1

ISOLASI PLASMID DAN GEN β-LAKTAMASE DARI Escherichia coli SENSITIF DAN RESISTEN AMOKSILIN- KLAVULANAT Efrida Warganegara Program Studi Pendidikan Dokter FMIPA Unila Jl. Prof . Dr. Soemantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145

ABSTRACT There are many incidents of infectious diseases in Indonesia caused by Escherichia coli which is resistant to amoxycillin and amoxycillin-clavulanate. This research is intend to study frequency of E. coli which is resistant to amoxycillin and amoxycillin-clavulanate and plasmid that carried of gene and gene β-lactamase isolation. This research was conducted through descriptive methods, with E.coli identification from clinical samples. Susceptibility test conducted by disk of amoxycillin (25 ug) and amoxycillin-clavulanate (20/10 ug). The existence of plasmid that’s carried of gene and gene β-lactamase in E. coli which is sensitive or resistance of amoxycillin-clavulanate is detected from 4 clinical isolates. The isolation of plasmid through Queigley and Holmes Methode and isolatioan of gene β-lactamase throught amplification DNA with technique of PCR and nested-PCR. The data was analyzed by descriptive methods. The result showed that the frequency of E. coli is greatest isolated from feces, rectal swab and urine. Frequency of E. coli which is resistant amoxycillin is 48,73 % (134 isolates). The use of amoxycillinclavulanate resulted E.coli which is sensitive amoxycillin-clavulanate is 29,85 % (40 isolates), others 44,78 % (60 isolates) tendency to changes to be sensitive (intermedius) and 25,37 % (34 isolates) still resistance to amoxycillin-clavulanate. E.coli which is sensitive or resistence amoxycillin-clavulanate is produce β-lactamase enzymes because in 4 isolates there is plasmid that carried of gene which produced β-lactamase enzyme caused resistance in E. coli. Conclude : Frequency of E. coli which is resistant amoxycillin is 48,73 % and sensitive with the use of amoxycillin-clavulanate is 74,63 % (susceptibility is increasing). β-Lactamases enzyme is produce by E. coli which is sensitive or resistance amoxycillin-clavulanate and all of the β-lactamase genes is located in plamid. Keywords: E.coli, resistant amoxycillin, sensitive and resistance amoxycillinclavulanate, and β-Lactamase enzyme.

PENDAHULUAN Penyakit infeksi sering ditemukan pada negara sedang berkembang seperti Indonesia dan tak jarang menyebabkan kematian, sehingga perlu segera diobati dengan antibiotik. Pengobatan dengan antibiotik sering memberikan masalah  2005 FMIPA Universitas Lampung

berupa resistensi dari bakteri-bakteri yang penting di klinik terhadap antibiotik yang diberikan1,2. Selama 25 tahun terakhir ini terjadi peningkatan penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri komensal usus yaitu Escherichia coli yang juga adalah sumber gen pembawa sifat resistensi bagi bakteri patogen 21

Efrida Warganegara …Isolasi Plasmid dan gen β-laktamase

manusia2. Infeksi E.coli bia-sanya diobati dengan antibiotik golongan βlaktam (amoksisilin) karena absorb-sinya tidak dipengaruhi makanan, ber-sifat bakterisidal, serta mempunyai spektrum lebih luas3. E.coli isolat klinik yang resisten amoksisilin dilaporkan frekuensinya sekitar 45-50 % bahkan sampai 79,5%, dengan penyebab terpenting adalah produksi enzim β-laktamase4. Untuk mengatasi resistensi karena enzim β-laktamase dilakukan pemberian campuran inhibitor βlaktamase dan β-laktam (amoksisilinklavulanat), sehingga inhibitor akan menginaktivasi enzim β-laktamase yang diproduksi bakteri, dan amoksisilin tetap mempunyai aktivitas anti bakteri1. Pemakaian campuran ini meningkatkan sensitivitas bakteri sehingga campuran ini dipakai secara luas, dan konsekuensinya sekarang dilaporkan telah banyak E.coli yang resisten amoksisilinklavulant5. Tujuan penelitian ini untuk melihat frekuensi E.coli isolat klinik yang resisten amoksisilin dan melihat efek pemakaian campuran inhibitor βlaktamase dengan β-laktam (amoksisilinklavulanat), serta mengisolasi plasmid pembawa gen dan gen pengkode enzim β-laktamase pada E.coli sensitif maupun resisten amoksisilin-klavulanat. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Unit Penelitian FKUP / RSHS. Penelitian dilakukan selama 1 tahun mulai Januari 1998 sampai akhir tahun 1998. Penelitian ini adalah penelitian deskriptif dengan bakteri uji 4 isolat E.coli resisten dan sensitif amoksisilin-klavulanat. METODE PENELITIAN E.coli isolat klinik diperoleh dari beberapa laboratorium kesehatan di Bandung yaitu Laboratorium Prodia, RS.Boromeus, dan Laboratorium Depkes. E.coli hasil identifikasi sesuai standart 22

mikrobiologi selanjutnya dilakukan uji kepekaan terhadap antibiotik dengan cara difusi yaitu metoda Kirby-Bauer menggunakan cakram amoksisilin 25 ug dan amoksisilin-klavulanat 20/10 ug. Kriteria bakteri resisten sesuai dengan tabel NCCLS yaitu resisten amoksisilin dan sensitif amoksisilin-klavulanat bila kadar hambat minimum sama dengan atau lebih kecil dari 13 mm dan sama dengan atau lebih besar dari 18 mm6. Terhadap semua E.coli sensitif amoksisilin-klavulanat dilakukan uji keberadaan enzim β-laktamase dengan menggunakan cakram Cefinase. Semua isolate sensitive amoksisilin-klavulanat dilakukan pemaparan amoksisilin-klavulanat setiap hari sampai seluruh isolate menjadi resisten. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid pembawa gen β-laktamase pada E.coli sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat dengan cara Holmes & Quegley. Setelah dilakukan purifikasi dilakukan visualisasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa7. Kemudian untuk isolasi gen β-laktamase dilakukan amplifikasi DNA dengan menggunakan terknik PCR. Primer yang digunakan pada PCR adalah primer 1 (5’–d(ATAAAATTCTTGAAGACGA AA)- 3’, pada posisi – 5) dan primer 2 (5’– D(GACAGTTACCAATGCTTA ATCA)–3’, pada posisi + 1074. Sedangkan untuk memastikan bahwa gen yang berhasil diisolasi adalah benar gen βlaktamase maka dilakukan nested-PCR dengan menggunakan sepasang Primer Internal yaitu primer A (5’d(GTATGGATCCTCAACATTTCCGT GTCG) 3’, pada posisi 205) dan primer B (5’–D(ACCAAAGCTTAATCAGTGAGGCA) – 3’, pada posisi 1067). HASIL DAN PEMBAHASAN Koleksi E.coli isolat klinik selama 8 bulan dapat dilihat pada Tabel 1.

 2005 FMIPA Universitas Lampung


Tabel 1. E.coli Isolat Klinik yang berhasil diisolasi berjumlah 275 isolat No . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Asal Spesimen

Jumlah Isolat (Pria, Wanita)

Persentase

Feses Urine Rektal Swab Pus Sekret Vagina Peritoneum Sputum Liquor Cerebro Sp. Darah Gall Kultur Pharyngeal Swab Sekret Uretra Total

(66, 53) (20, 60) (26, 13) (13, 9) (0, 6) (2, 0) (2, 0) (1, 0) (1, 0) (1, 0) (0,1) (1, 0) 275 (133, 142)

43,27 29,09 14,18 8,0 2,20 0,73 0,73 0,36 0,36 0,36 0,36 0,36 100

Tabel 2. Hasil uji kepekaan E.coli terhadap Amoksisilin

E.coli Persentase

Resisten 134 48,73

Intermedius 12 4,36

Sensitif 48 17,46

Lain-lain 81 29,45

Total 275 100

Tabel 3. Hasil uji kepekaan E.coli terhadap Amoksisilin- klavulanat

Jumlah Persentase

E.coli Resisten Amoksisilin, Klavulanat Sensitif Intermedius Resisten Total 40 60 34 134 29,85 44,78 25,37 100

Dari hasil pada Tabel 1. menunjukkan bahwa dari isolat klinik E. coli yang dapat diisolasi sebanyak 275 isolat. Isolat E.coli yang terbanyak pertama diperoleh dari feses sekitar 43,27 %, terbanyak kedua dari urine sekitar 29,09 % dan terbanyak ketiga dari rektal swab sekitar 14,18 %. Sedangkan E.coli dari bahan-bahan lain hanya dibawah 10 % saja. Hasil uji kepekaan terhadap amoksisilin dari E.coli isolat klinik dilihat pada Tabel 2. Dari hasil penelitian pada 275 sampel klinik (Tabel 2) didapatkan E.coli


resisten amoksisilin sebanyak 134 isolat (48,73 %), sedangkan E.coli yang sensitif hanya 48 isolat (17,46 %). Hasil uji kepekaan terhadap amoksisilinklavulanat dari E.coli isolat klinik yang resisten amoksisilin dapat dilihat pada Tabel 3. Dari Tabel 3 terlihat bahwa dari 134 E.coli resisten amoksisilin, 100 isolat mengalami perubahan (74,63 %), yaitu menjadi sensitif 40 isolat (29,85 %) dan menjadi intermedius 60 isolat (44,78 %), sedangkan yang tetap resisten hanya 34 isolat (25,37 %).

23


Pada ke-40 isolat E.coli resisten amoksisilin (sensitif amoksisilinklavulanat) selanjutnya dilakukan uji keberadaan enzim β-laktamase menggunakan cakram Cefinase dan hasilnya semua isolat E.coli (100 %) menunjukkan hasil positif. Hasil uji ini lebih mempertegas hasil uji kepekaan E.coli resisten amoksisilin menggunakan cakram campuran amoksisilin-klavulanat. Pada ke-40 isolat E.coli sensitif amoksisilin-klavulanat dilakukan pe-

nambahan amoksisilin-klavulanat sampai semua isolat menjadi resisten. Selanjutnya diambil 4 isolat E.coli baik yang sensitive maupun yang resisten amoksisilin-klavulanat (isolat no. 7, 13, 14, 15) untuk dilakukan isolasi plasmid dan gen β-laktamasenya. Hasil isolasi plasmid dapat dilihat pada elektoforesis gel agarosa seperti terlihat pada Gambar 1 sedangkan hasil isolasi gen enzim βlaktamase dapat dilihat pada elektoforesis gel agarosa seperti terlihat pada Gambar 2.

Gambar 1. Plasmid E.coli sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat pada Elektroforesis Gel Agarosa Keterangan: 1 = Plasmid pD3 sebagai kontrol; 2-9 = Isolat no. 15A, 15B, 14A, 14B, 13A, 13B, 7a dan 7B

Gambar 2. Elektroforesis Gen -laktamase Hasil PCR dan Nested-PCR dari E.coli Sensitif dan Resisten Amoksisilin-klavulanat pada Gel agarosa. (Keterangan : 1, 20 = Kontrol ukuran yaitu Ladder 100 pb; 10, 11 – kontrol negatif; 2,3,6,7,12,13,16,17 = produk nested-PCR isolat 7A,7B,13A,13B,14A,14B,15A dan 15B; 4,5,8,9,14,15,18,19 = Produk PCR isolat 7A,7B,13A,13B, 14A,14B,15A dan 15B; 800 pb = ukuran nukleotida kontrol Ladder 100 pb, 850 pb = Ukuran Produk Nested-PCR Isolat E.coli; 1050 pb = Ukuran Produk PCR Isolat E.coli)

24



Dari hasil PCR dan nested-PCR pada Gambar 2 dapat dilihat bahwa pada ke-4 plasmid dari E.coli sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat yang digunakan sebagai templat memperlihatkan hasil positif baik pada PCR maupun nestedPCR. Dari Tabel 1 terlihat bahwa E.coli yang berhasil diisolasi adalah bakteri komensal usus yang merupakan penghuni normal pada usus manusia. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa E.coli yang merupakan bakteri komensal usus dapat menyebabkan penyakit infeksi yang serius. Infeksi oleh E.coli terjadi karena adanya faktor perlekatan dan kolonisasi pada permukaan sel bakteri, juga disebabkan oleh faktor tambahan lain seperti faktor virulensi (enterotoksin) yang berlainan, dengan gen pengkode umumnya berlokasi pada plasmid1. Dari Tabel 1 pula terlihat bahwa E.coli isolat klinik terbanyak kedua diperoleh dari urine sebesar 29,09 %. Hasil ini memperlihatkan E.coli sebagai bakteri komensal usus dapat menyebabkan infeksi di tempat lain selain usus. E.coli merupakan penyebab utama dari infeksi saluran kemih (ISK) (90 %), karena organ yang paling dekat secara anatomis adalah saluran kemih3. Hasil ini mendukung pernyataan Plorde sebelumnya bahwa hampir 80 % ISK tanpa komplikasi disebabkan oleh E.coli karena secara normal urine adalah steril. Dari hasil pada Tabel 2. terlihat bahwa E.coli sebagian besar telah resisten amoksisilin (48,73 %). Hasil ini tidak jauh berbeda dengan laporan Zhou et al.5 dan Stapleton et al.4 yang menyatakan E.coli resisten amoksisilin telah meningkat selama 20 tahun terakhir ini sekitar 30-50 % dan 45-50 %. Hasil ini juga menunjang pernyataan Thomson dan


Amyes yang menyatakan bahwa di negara sedang berkembang resistensi bakteri terhadap antibiotik lebih tinggi, dan selama 50 tahun terakhir ini bakteri resisten antibiotik meningkat karena pemakaian yang luas di klinik dan pemakaian yang bebas pada masyarakat8. Namun Bemer-Melchior et al. mendapatkan hasil sedikit berbeda, yaitu E.coli resisten amoksisilin lebih kecil sekitar 28-38,5 %9. Hal ini mungkin terjadi oleh karena adanya variasi geografik dari infeksi yang disebabkan oleh E.coli tersebut. Dari Tabel 3. terlihat adanya peningkatan sensitivitas akkibat pema-kaian amoksisilin-klavulanat (74,63 %). Hasil penelitian ini menunjang per-nyataan Bella dkk.10 dan Santoso dkk.11 bahwa terdapat peningkatan sensitivitas sebesar 78,6 – 85 % akibat pemakaian amoksisilin-klavulanat pada E.coli. Peningkatan sensitivitas terhadap amoksisilin-klavulanat terjadi karena enzim βlaktamase yang diproduksi diinhibisi oleh inhibitor β-laktamase (klavulanat) sehingga amoksisilin tetap berfungsi sebagai anti bakteri1. Pemakaian inhibitor β-laktamase ini merupakan salah satu strategi untuk mengatasi E.coli resisten amoksisilin akibat produksi enzim β-laktamase, karena klavulanat adalah inhibitor β-laktamase yang potensial sebab berikatan dengan afinitas yang kuat dan irreversibel pada enzim βlaktamase tersebut.12. Pada uji keberadaan enzim β-laktamase semua E.coli sensitif amoksisilinklavulanat memberikan hasil positif. Hasil ini membuktikan bahwa enzim βlaktamase merupakan enzim yang paling tersebar luas pada bakteri Gram negatif sebagai salah satu penyebab resistensi terhadap antibiotika golongan β-laktam, seperti yang dinyatakan oleh Bush 13. Hasil ini mendukung pula pernyataan 25


Lousova et al.14 bahwa klavulanat sangat efektif sebagai inhibitor enzim βlaktamase. Dari hasil isolasi plasmid pada Gambar 1 dapat dilihat bahwa pada ke-4 E.coli isolat klinik baik yang sensitif maupun resisten terhadap amoksisilin-klavulanat mengandung plasmid dengan ukuran lebih kecil dari 6,7 kb. Hasil penelitian ini mendukung pernyataan Thomson dan Amyes8, Saves et al.15 dan Siu et al.16 bahwa enzim β-laktamase penyebab resistensi terhadap antibiotik β-laktam pada E.coli secara umum dikode oleh gen yang sebagian besar berlokasi pada plasmid. Adapun Tait17 menyatakan bahwa dengan adanya antibiotik maka bakteri yang mengandung gen resistensi pada plasmid akan berkembang dan plasmid resistensi ini stabil di dalam sel atau dapat diturunkan ke sel anak. Menurut Lousova et al.14 lokasi gen pada plasmid merupakan faktor resiko yang sangat serius, karena plasmid tersebut dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lain bahkan dapat pula terjadi perpindahan dari sel bakteri Gram negatif ke bakteri Gram positif melalui konjugasi. Dari hasil PCR dan nested-PCR pada Gambar 2 dapat dilihat bahwa pada ke-4 plasmid dari E.coli sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat yang digunakan sebagai templat memperlihatkan hasil positif baik pada PCR maupun nestedPCR. Ini berarti bahwa plasmid yang berhasil diisolasi membawa gen βlaktamase dan produk PCR memang benar gen β-laktamase (Gambar 2). Ukuran gen β-laktamase E.coli baik sensitif maupun resisten amoksisilinklavulanat hasil PCR sekitar 1050 pb. Hasil ini sesuai dengan ukuran nukleotida yang dibatasi oleh sepasang primer yang digunakan pada PCR antara 26

–5 sampai +1074 yaitu 1079 nukleotida. Hasil ini mendekati hasil yang diperoleh oleh Siu et al.16 bahwa keseluruhan urutan nukleotida produk PCR hasil amplifikasi gen β-laktamase E.coli resistensi antibiotik β-laktam adalah 1079 pb. Ukuran 1050 pb ini mungkin terjadi karena cara penghitungan hanya menggunakan jarak migrasi produk PCR dibandingkan dengan kontrol pada gel agarosa. Kesimpulan : Prevalensi E.coli resisten amoksisilin (sensitif amoksisilin-klavulanat) sekitar 48,73 % dan diantaranya sebanyak 25,37 % resisten terhadap amoksisilin klavulanat. Penyebab resistensi tersebut karena produksi enzim βlaktamase. Dari ke-4 E.coli sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat seluruhnya mengandung plasmid dan plasmid ini pembawa gen enzim β-laktamase pada E.coli tersebut. Saran untuk penelitian ini adalah: (1) melakukan penentuan urutan nukleotida gen β-laktamase antara isolat resisten dan sensitif, (2) mengetahui jenis enzim β-laktamase yang diproduksi dan (3) penentuan sifat produksi enzim β-laktamase. DAFTAR PUSTAKA 1. Salyers, A.A. dan Whitt D.D., 1994, Bacterial Pathogenesis, A Molecular Approach, First Edition, American Society for Microbiology, Washington, DC. : 103. 2. Salyers, A.A. 1997, Clinical Microbiology in The 21st Century, Proceeding Kongres Nasional ke-7 Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia, Denpasar, Indonesia. 3. Plorde, J.J. 1994. Antimicrobics and Chemotherapy of Bacterial and Viral



Infection, In : Ryan K.J., Sherris Medical Microbiology An Introduction to Infectious Diseases, Third Edition, Prentice-Hall International Inc. Connecticut : 189-198. 4. Stapleton, P., Wu, P.J., King, A., Shanon, K., French, G.and Phillips, I.1995. Incidence and Mechanism to Combination of Amoxicillin and Clavulanic Acid in Escherichia coli, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39 (11), : 2478-2483. 5. Zhou, X.Y., Bordon, F., Sirot, D., Kitzis, M.-D. and Gutmann, L.1994. Emergence of Clinical Isolates of Escherichia coli Producing TEM-1 Derivates or an OXA-1 b-Lactamase conferring Resistance to β-Lactamase Inhibitors, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38 (5) : 1085-1089. 6. Jorgensen J.H., Ferraro, M.J., Craig, W.A., Doern, G.V., Finegold, G.M., Fung-Tome, J., Hansen, S.L., Hindler, J., Reller, L.B., Sevenson, J.M., Tenover, F.C., Tesca, R.T. and Wikler, M.A.1997. Performance Standart for Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLS, Pensylvania : 17 (1). 7. Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis, T.1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 6.3-6.35. 8. Thomson, C.J. and Amyes, S.G.B.1992. TRC-1 : Emergence of a Clavulanic acid resistant TEM βLactamase in Clinical Strain, FEMS Microbiol. Lett., 91 : 113-118. 9. Bemer-Melchior, P., Silly, L., Jugroot-Klotz, K., Brun, T., Nevot,


P. and Paul, G. 1995. Resistance to Amoxycillin and Amoxycillinclaculanic acid combination of 231 clinical strain of Escherichia coli, Isolated in 1992 at the Cochin Hospital, Pathology Biol., 43 (9) : 760-765. 10. Bella, B., Triyatni, M., Sudarmono, Hutabarat, T. and Isyah, L.1993. Sensitivity Pattern of Positive and Gram Negative Bacteria against Amoxicillin-Clavulanic acid Preparation on by Dilution Agar and Diffusion Agar Methods, Proceeding Kongres Nasional ke VI Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia dan Second Adean meeting on Microbiology, Surabaya : 59. 11. Santoso, A.U.S., Warsa, U.C., Sudarmono, P., Suharno, J.S., Isyah, L., Asmono dan Hutabarat, T.1993. Perbandingan aktivitas Invitro Amoksisillin vs Amoksisillin-Potasium Klavulanat terhadap berbagai kuman isolat klinik, Proceeding Kongres Nasional ke VI Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia dan Second Asean meeting on Microbiology, Surabaya : 155. 12. Chopra, I., Hodgson, J., Metcalf, B. and Poste, G.1997. Mini Review : The Search for Antimicrobial Agent Effective Against bacteria Resistant to multiple Antibiotic, Antimicrobial Agents and Chemother., 41 (3) : 497503. 13. Bush, K. 1997. The Evolution of βLactamase, Ciba Found., Symp., 207: 152-163. 14. Lousova, A., Bujdajova, H. and Kettner, M.1997. β-Lactam Antibiotics Mechanism of Action and Resistance in Enterobacteriaceae, 27


Epidemiol. Microbiol., Immunol., 46 (2) 73-80 15. Saves, I., Odile, B.S., Swaren, P., Lefevre, F., Massoni, J.M., Prome, J.C. and Samama, J.P. 1995. The Asparagin to Aspartic acid Substitution at Position 276 of TEM-35 and TEM-36 is involved in the βlactamase Resistance to Clavulanic acid, J. Biol. Chem., 270 (31): 18240-18245.

28

16. Siu, L.K., Cheng, W.L., Ho, P.L. Ng, W.S., Chan. P.Y. & Lol, Y. 1998, Correlation of invitro susceptibility Testing results for amox-clav and Ampi-Sulbac using a paralel βLactamase producing Enterobacteriaceae, APMIS, Sept., 106(9). 17. Tait, S., 1993, Mobile Genetic, Element in Antibiotic Resistance, Journal Medical Microbiology, 38 : 157-159.


ISOLASI PLASMID DAN GEN β-laktamase DARI Escherichia coli SENSITIF DAN RESISTEN AMOKSILIN- KLAVULANAT

Recommend Documents