PERUBAHAN SEBAGIAN NUKLEOTIDA GEN β-lakatamase PADA Escherichia coli RESISTEN AMOKSISILIN-KLAVULANAT SECARA IN VITRO

J. Sains Tek., April 2006, Vol. 12, No. 1, Hal.: 41 - 48 ISSN 0853-733X

PERUBAHAN SEBAGIAN NUKLEOTIDA GEN β-LAKATAMASE PADA Escherichia coli RESISTEN AMOKSISILIN-KLAVULANAT SECARA IN VITRO Efrida Warganegara Program Studi Pendidikan Dokter, FMIPA Universitas Lampung Jl. Prof. Sumantri Brojonegoro No. 1 Bandarlampung 35145 Diterima 30 April 2005, perbaikan 23 Maret 2006, disetujui untuk diterbitkan 7 April 2006

ABSTRACT In Indonesia there are many E. coli resistant amoxicillin-clavulanate exist, and the fundamental causes are the hyperproduction of TEM-1 β-lactamase enzyme and or IRT (Inhibitor Resistance TEM). This research is aimed to observe the alteration of nucleotide gene order which causes the alteration of β-lactamase amino acid enzyme order in the fourth isolates clinical E. coli sensitive to amoxicillin-clavulanate. Plasmid that success isolated from the fourth E. coli amox-clavS and four E. coli amox-clavR are used as the template for the amplification of β-lactamase gene through PCR technique. Nucleotide sequences directly determined by using automatic DNA-sequencer.As the result it is found out that all nucleotide in all gene very homology to TEM-1 β-lactamase gene. The comparation analysis of nucleotide gene sequence from sensitive and resistance of amoxicillin-clavulanate shows inform of nucleotide difference over 1 until 3. Two of them located in regulation area and down stream of early translation and also the area of enzyme code, and the resistance happens because the mutation influences gene expression level. One of them located on the area enzyme code and the resistance happens because of the very often use of amino acid codon. While the other do not have any alteration in its nucleotide gene and the resistance that is happens may be caused by the mutation in other area, such as porin gene or amplification gene. All nucleotide alteration in the area of enzyme code does not cause any alteration on amino acid enzyme sequences.In conclusion : The effect of the exposure of amoxicillin-clavulanate in vitro can cause alteration E. coli from sensitive to resistant amoxicillin-clavulanate, and the alteration is caused by the alteration of nucleotide sequences but this does not cause any alteration in β-lactamase amino acid enzyme sequences.. Keywords: E. coli, Resistant amoxicillin-clavulanat, Nucleotide β-lactamase gene sequences

1. PENDAHULUAN Penyakit infeksi pada negara sedang berkembang seperti Indonesia, selama 25-30 tahun terakhir ini terutama disebabkan oleh bakteri gram negatif misalnya Escherichia coli yang merupakan flora normal pada usus manusia1. E.coli ini juga merupakan sumber gen pembawa sifat resistensi antibiotik pada bakteri pathogen yang berbahaya pada tubuh manusia2,3,4. Infeksi oleh E. coli ditanggulangi dengan cara pemberian amoksisilin dan telah digunakan secara luas di klinik, yang berakibat timbulnya E.coli resisten amoksisilin sekitar 25 – 30 %5 bahkan sampai 48,1 %6. Penyebab resistensi E.coli yang paling dominant adalah produksi enzim β-laktamase TEM-1 yang telah dilaporkan sejak awal tahun 1960-an, dengan gen pengkodenya berlokasi pada plasmid6,7. Penanggulangan sifat resistensi ini adalah dengan pemberian kalium klavulanat, suatu inhibitor β-

 2006 FMIPA Universitas Lampung

laktamase yang kuat, dalam bentuk campuran dengan amoksisilin sehingga amoksisilin dapat berfungsi sebagai antibakteri. Hal ini menyebabkan peningkatan kepekaan E.coli dari 51,9 - 79,7 % sehingga pemakaian campuran ini sangat meluas dan akibatnya sejak awal tahun 1990-an telah dilaporkan timbulnya sifat resistensi dari E. coli terhadap amoksislin-klavulanat8,9. Penyebab utama dari resistensi ini adalah hiperproduksi enzim βlaktamase dan atau produksi enzim β-laktamase IRT (inhibitor resistancy TEM) sebagai akibat perubahan urutan nukleotida gen & asam amino enzim β-laktamase TEM-1, sehingga menyebabkan perubahan sifat kinetik enzim5,8,9,10. Perubahan sifat enzim β-laktamase terutama terhadap proses inhibisi dari inhibitor β-laktamase yaitu menjadi kurang pekanya enzim β-laktamase terhadap inhibitor β-laktamase, yang awalnya dilaporkan sekitar tahun 19875. Sampai sekarang telah dilaporkan sebanyak 28 enzim resisten

41

Efrida Warganegara…Perubahan Sebagaian Nukleotida Gen

inhibitor β-laktamase yang lebih dikenal dengan enzim β-laktamase IRT = Inhibitor Resistance TEM5,7,11. Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat perubahan urutan nukleotida gen βlaktamase pada E.coli yang telah dibuat resisten secara invitro dari isolat klinik yang sensitif amoksisilin-klavulanat serta mengetahui apakah terdapat produksi enzim β-laktamase IRT.

gel dan siap dibaca menggunakan ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequensing Ready Reaction Kit (The Perkin Elmer Corporation), menggunakan Terminator premix (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequensing Ready Reaction Kit with AmpliTaq DNA Polymerase Protocol, 1995). Kemudian dilihat apakah terdapat perubahan urutan nukleotida gen serta perubahan urutan asam amino hasil deduksi semua enzim β-laktamase pada E. coli resisten amoksilin-klavulanat. Analisis data dengan komputer menggunakan Program GENMON versi 4.1.

2. METODA PENELITIAN Jenis penelitian merupakan penelitian deskriptif dengan menggunakan E.coli yang sensitive amoksisilin-klavulanat dan isolat klinik yang telah dibuat resisten secara invitro, serta pada uji keberadaan enzim β-laktamase menggunakan cakram cefinase keduanya menunjukkan hasil positif. Penelitian dilakukan dengan menggunakan gen β-laktamase yang berlokasi pada plasmid dari 4 bakteri uji E.coli yang sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat. Selanjutnya dilakukan penentuan urutan nukelotida dengan cara : mencampur reagen-reagen dalam tabung yaitu campuran terminator, templat, primer, dan air, lalu tutup dengan mineral oil. Siklus sequensing dilakukan sebanyak 25 siklus dengan suhu sebagai berikut : suhu tahap denaturasi 96oC selama 30 menit, tahap penempelan primer 50oC selama 15 detik dan suhu tahap pemanjangan 60oC selama 4 menit, dan terakhir suhu diturunkan menjadi 4oC. Selanjutnya dilakukan pemurnian produk pemanjangan, dan sample dikeluarkan ke dalam

3. HASIL DAN PEMBAHASAN E. coli sensitive dan resisten amoksisilinklavulanat dapat dilihat pada Gambar 1 dan plasmid pembawa gen β-laktamase yang berukuran lebih kecil dari kontrol plasmid pD3 yaitu 6,7 kb dapat dilihat pada Gambar 2. Gen yang akan ditentukan urutan nukleotidanya berukuran sekitar 1050 pb dengan kontrol ukuran produk PCR adalah ladder 100 pb berukuran 800 pb dapat dilihat pada Gambar 3. Dari hasil sekuensing gen β-laktamase E.coli, didapatkan urutan-urutan nukelotida yang mengalami perubahan pada basanya, dan perubahan ini dapat dilihat pada Tabel 1 dan urutan nukleotida secara utuh pada Gambar 4,5, dan 6.

Gambar 1. Isolat klinik E.coli Sensitif dan resisten amoksisilin-klavulanat (isolat 7A-7B; 13A-13B; 14A14B; dan 15A-15B Ket.: A : Isolat E. coli sensitive amoksisilin-clavulanate; B : Isolat E. coli resistent amoksisilin-clavulanate;

Tabel 1. Perubahan Urutan Nukleotida Gen β-Laktamase Isolat 7, 13 dan 15

No. Isolat 7A 7B 13A 13B 15A 15B

42

+2

G A

+ 28 G C

Posisi Nukleotida / Asam Amino + 53 / 6 + 263 / 76 + 431 /132

T C

+ 849 /271 G A

T C G T



Ket.: G = Guanin; A = Adenin; T = Timin; C = Sitosin; + = Posisi dihitung dari awal transkripsi ke arah 3’.

dari E.coli12,13. Perubahan resistensi pada E.coli yang sebelumnya sensitif amoksisilin-klavulanat terjadi karena perubahan urutan RBS dapat menyebabkan peningkatan efisiensi translasi dan produksi enzim β-laktamase. Perubahan urutan nukleotida posisi +28 pada gen β-laktamase E.coli ini belum pernah dilaporkan.

Gambar 2. Plasmid pembawa gen β-laktamase dari E.coli sensitive dan resisten amoksisilinklavulanat pada Gel agarosa Ket : 1 = kontrol, plasmid pD3 (6,7 kb); 2, 4, 6 dan 8 = isolate E.coli sensitive amoksisilin- klavulanat (isolat 15, 14, 13 dan 7); sedangkan 3, 5, 7, dan 9 = isolate E.coli resisten amoksisilin-klavulanat (isolat 15, 14, 13 dan 7)

Hasil analisis isolat 13 didapatkan perubahan urutan nukleotida posisi +2 (pada awal transkripsi, sebelah hulu daerah promotor konsensus –10) dari G pada isolat 13A menjadi A pada isolat 13B. Hasil penelitian ini mendukung pernyataan bahwa untuk beberapa promotor urutan nukleotida sekitar +1 atau sebelah hulu daerah promoter terlihat sangat penting bagi kekuatan promotor14. Perubahan urutan nukleotida pada isolat 13B ini mungkin menyebabkan produksi enzim βlaktamase meningkat sehingga merubah fenotip menjadi E.coli resisten amoksisilin-klavulanat. Dari penelusuran pustaka perubahan urutan nukleotida posisi +2 pada gen β-laktamase E.coli belum pernah dilaporkan. 3.1.2. Tiga Gen β-Laktamase E.coli Resisten Amoksisilin-Klavulanat Mengalami terdapat perubahan Urutan Nukleotida Pada Daerah Pengkode Enzim β-Laktamase

Gambar 3. Elektroforesis Gen β–laktamase Hasil PCR & nested-PCR dari E.coli sensitive & resisten Amoksisilin-klavulanat pada Gel Agarosa Ket.: 1, 20 = kontrol ukuran ladder 100 pb (800pb); 23, 6-7, 12-13, dan 16-17 = produk nested-PCR isolate no.7, 13, 14, dan 15; 4-5, 8-9, 14-15, dan 18-19 = produk PCR isolate no.7, 13, 14, dan 15; 800 pb = ukuran nukleotida control Ladder 100 pb; 850 pb = ukuran produk nested-PCR isolat E.coli; dan 1050 pb = ukuran produk PCR isolat E.coli.

3.1. Gen β-Laktamase pada Tiga E.coli AmoksKlavR Mempunyai urutan Nukleotida Berbeda dengan Gen β-Laktamase E.coli Amoks-KlavS 3.1.1 Dua Gen β-Laktamase Isolat E.coli AmoksKlavR Mengalami Perubahan Urutan Nukleotida Pada Daerah Regulasi Pada Tabel 1 dapat dilihat perubahan urutan nukleotida (mutasi titik) pada daerah regulasi gen, dari nukleotida G pada isolat 7A menjadi C pada isolat 7B pada posisi +28 (daerah urutan ribosome binding site = RBS) sebelum ATG (awal translasi pada posisi +36). Hasil penelitian ini mendukung pernyataan bahwa RBS (Shine-Dalgarno) berperanan penting pada inisiasi proses translasi

Hasil analisis homologi urutan nukleotida gen dan asam amino hasil deduksi pada daerah pengkode isolat 7 (Tabel 1), menunjukkan satu perubahan yaitu mutasi titik pada nukleotida posisi +28 yang sesuai dengan asam amino ke 271. Pada posisi tersebut terdapat kodon GCG untuk isolat 7A dan GCA untuk isolat 7B yang mengkode alanin (Ala). Untuk isolat 13 didapatakan dua perubahan urutan nukleotida yaitu pada posisi +53 dan +263 yang sesuai dengan asam amino ke 6 dan 76. Pada posisi +53 terdapat perubahan kodon TTT untuk isolat 13A menjadi kodon TTC untuk isolat 13B yang mengkode fenilalanin (Phe). Pada posisi +263 didapatkan perubahan kodon GGT pada isolat 13A menjadi kodon GGC untuk isolat 13B yang mengkode glisin (Gly). Untuk isolat 15 diperoleh satu perubahan urutan nukleotida pada posisi +431 (asam amino ke 132). Mutasi berupa perubahan dari kodon GCG pada isolat 15A menjadi kodon GCT pada isolat 15B yang mengkode alanin (Ala). Sedangkan isolat 14 tidak mengalami perubahan. Pada analisis codon usage dari hasil penelitian ini didapatkan bahwa kodon GCA untuk isolat 7B dan kodon GCT untuk isolat 15B lebih jarang dibandingkan dengan kodon GCG pada isolat 7A dan kodon GCG pada isolat 15B. Dari hasil analisis tersebut diduga perubahan fenotip menjadi

2  2006 FMIPA Universitas Lampung


E.coli resisten amoksisilin-klavulanat karena mutasi pada gen pengkode tRNA pembawa asam

aminonya15.

Gambar 4. Hasil analisis homologi urutan nukleotida gen β-laktamase E. coli Amoks Klavs 7A dan E. coli Amoks Klavr 7B

44


J. Sains Tek., April 2006, Vol. 12, No. 1

Gambar 5. Hasil analisis homologi urutan nukleotida gen β-laktamase E. coli Amoks KlavS 13A dan E. coli Amoks KlavR 13B


45


46



Gambar 6. Hasil analisis homologi urutan nukleotida gen β-laktamase E. coli Amoks KlavS 15A dan E. coli Amoks KlavR 15B Tabel 2. Asam-asam amino Posisi Spesifik Bagi Enzim β-Laktamase pada Isolat 7, 13, 14 dan 15 Posisi Asam - asam Amino 37 68 102 162 203 235 236 Glu Arg Gln Ala Gly TEM-1 Gln Ser Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 7A Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 7B Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 13A Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 13B Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 14A Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 14B Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 15A Gln Ser Glu Arg Gln Ala Gly 15B Gln = glutamin; Ser = serin; Glu = glutamat; Arg = arginin; Ala = alanin; Thr = threonin Hasil ini juga sesuai dengan pernyataan bahwa codon usage mengatur ekspresi gen pada tingkat translasi, kodon yang jarang digunakan menyebabkan waktu translasi lebih lama, serta efiseiensi translasi gen sangat bergantung pada penyesuaian codon usage dengan konsentrasi tRNA15,16,17. Berbagai kemungkinan penyebab perubahan fenotip menjadi resisten amoksisilin-klavulanat pada E.coli untuk isolat 13B adalah karena faktor kecenderungan penggunaan kodon TTC dan GGC yang lebih sering. Selain itu perubahan nukleotida ke 3 pada kedua kodon dari T menjadi C lebih disukai dan mempunyai kecenderungan diekspresi lebih tinggi dari nukleotida lainnya. Kedua hal diatas menyebabkan terjadi efisiensi translasi16. Untuk isolat 14B perubahan fenotip E.coli resisten amoksisilin-klavulanat mungkin terjadi akibat mutasi pada gen lain misalnya gen pengkode porin atau amplifikasi gen atau plasmid. Analisis urutan asam amino hasil deduksi pada ke4 isolat E.coli baik yang sensitif maupun resisten amoksisilin-klavulanat menunjukkan bahwa asam amino glutamin (Gln) dan serin (Ser) terdapat pada posisi asam amino ke 37 dan 68. Berdasarkan lokasi asam amino pada posisi tersebut maka hasil yang diperoleh dari penelitian ini merupakan enzim β-laktamase tipe A yaitu TEM-1 (Tabel 2). Asam-asam amino posisi spesifik lainnya bagi enzim β-laktamase TEM-1 adalah pada posisi ke 102, 162, 203, 235, 236, 237, dan 261 yaitu asam amino glutamat (Glu), arginin (Arg), glutamin (Gln), alanin (Ala), Glisin (Gly), glutamat (Glu), dan treonin (Thr). Hasil penelitian ini menunjang pernyataan bahwa enzim yang penting dalam klinik untuk bakteri Gram negatif dan penyebab terutama resistensi terhadap antibiotik β-laktam dan


237 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

261 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr

inhibitor β-laktamase adalah enzim β-laktamase tipe A yaitu TEM-17. Dari hasil deduksi asam amino enzim β-laktamase semua isolat E.coli resisten amoksisilin-klavulanat tidak didapatkan substitusi asam amino dari enzim β-laktamase TEM-1. Hal ini sesuai dengan pernyatan bahwa isolat E.coli penghasil enzim βlaktamase IRT sangat jarang (sekitar 0,37 % ) dari enzim β-laktamase TEM-1 atau hanya 7 % dari isolat klinik10.

4. KESIMPULAN E.coli resisten amoksisilin-klavulanat terjadi karena ada perubahan nukleotida pada gen βlaktamase yang merupakan suatu enzim βlaktamase TEM-1. Resistensi terjadi karena kombinasi dari kecenderungan penggunaan kodon asam amino yang sering, mutasi gen pengkode tRNAAA, atau mutasi gen lain yaitu gen porin, selain amplifikasi gen β-laktamase dan tidak didapatkan produksi enzim β-laktamase IRT. Didapatkan mutasi yang belum pernah dilaporkan yaitu pada urutan nukleotida + 2 dan + 28 (daerah regulasi gen). UCAPAN TERIMA KASIH Saya mengucapkan ribuan terima kasih kepada Prof.Dr.H.Imam Supardi, dr. Sp.MK, Prof. H.Iman Supandiman, dr, Sp.PD-KH dari Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran Bandung dan Debbie S. Retnoningrum, Dra. Ph.D dari Jurusan Farmasi Fakultas FMIPA /PAU Institut Teknologi Bandung, yang telah memberi bantuan berupa konsultasi dalam melakukan penelitian ini. Demikian pula pada Direktorat Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional atas bantuang dana melalui program TMPD serta PT. Sanbe Farma atas bantuan amoksisilin & klavulanat yang digunakan dalam penelitian ini

47


DAFTAR PUSTAKA

Samore, M.H., Anderson, G., Rasheed, J.K. and Tenover, F.C. 2004. Variety of β-lactamases

1.

Brooks, G.F., Butel, J. S., and Morse, S.A. 2004, Jawetz, Milnick & Adelberg’s Medical Microbiology, Twenty third edition, International Edition, p : 196 – 199; 161-195.

Produced by Amoxicillin-Clavulanate-Resistant Escherichia coli Isolated in the Northeastern United States, Antimicrob. Agents Chemother., 48 (5): 1520-1525.

2.

Saenz, Y., Brinas, L., Dominguez, E., Ruiz, J., Zarazaga, M., Vila, J. and Torres, C. 2004. Mechanism of Resistance in MultipleAntibioticResistant Escherichia coli Strains of Human, Animal, and Food Origins, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48 (10): 3996-4001

10. Miro, E., Navarro, F., Mirelin, B., Sabate, M., Rivera, A., Coll, P. and Prats, G. 2002. Prevalence of Clinical Isolates of Escherichia coli Producing Inhibitor-Resistant β-Lactamases at a University Hospital in Barcelona, Spain, over a 3-Years Period, Antimicrob. Agents Chemother., 46 (12): 3991-3994.

3.

Prais, D., Straussberg, R., Avitzur, Y., Nussinovitch, M., Harel, L. and Amir, J. 2003. Bacterial susceptibility to oral antibiotics in community acquired urinary tract infection, Archieves of Disease in Childhood, 88 : 215218.

11. Alonso, R., Gerbaut, G., Galimand, M. and Courvalin, P. 2002 TEM-103/IRT-28 βlactamase, a New TEM Variant Produced by Escherichia coli BM4511, Antimicrob. Agents Chemother., 46 (11): 3627-3629.

4.

Mandal, S., Mandal, M.D., and Pal, N.K. 2004. Plasmid-Encoded Multi drug Resistance of Salmonella typhi and some Enteric Bacteria in and around Kolkata, India : A Preliminary Study, Online J. Health Allied Sci., 3 (4): 2.

5.

Leflon-Guibout, V., Speldooren, V., Heym, B. and Nicolas-Chanoine, M.-H. 2000. Epidemiological Survey of AmoxicillinClavulanate Resistance and Corresponding Molecular Mechanisms in Escherichia coli Isolates in France: New Genetic Features of BlaTEM Genes, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 44 ( 10): 2709-2714.

6.

Sotto, A., De Boever, C.M., Febbro-Peray, P., Gouby, A., Sirot, D. and Jourdan, J. 2001. Risk Factors for Antibiotic-Resistant Escherichia coli Isolated from Hospitalized Patients with Urinary Tract Infections: a Prospective Study, J. Clin.l Microbiol., 39 (2):. 438-444.

7.

Bradfort, P. A. 2001. Extended-Spectrum βlactamases in the 21st Century : Characterization, Epidemiolgy, and Detection of This Important Resistance Threat, Clin. Microbio. Rev., 14 (4): 933-951.

8.

Leflon-Guibout, V., Bonacorsi, S., Clermont, O., Ternat, G., Heym, B. and Nicolas-Chanoine, M.-H. 2002. Pyelonephritis caused by multiple clones of Escherichia coli, susceptible and resistant to co-amoxiclav, after a 45 day course of co-amoxiclav, J. Antimicro. Chemother., 49: 373-377.

9.

48

Kaye, K. S., Gold, H. S., Schwaber, M. J., Venkataraman, L., Qi, Y., De Girolami, P. C.,

12. Hrzenjak, A., Artl, A., Knipping, G., Kostner, G., Sattler, W.,and Malle, E. 2001 Silent Mutation in secondary Shine-Dalgarno sequences in thecDNA of Human serum amyloid A4 promoters expression of recombinant protein in Escherichia coli, Protein Engineering, 14 (12): 949-952. 13. Ma, J., Campbell, A. and Karlin, S. 2002. Correlations between Shine-Dalgarno Sequences and Genes Features Such as Predicted Expression Levels and Operon Structures, J. Bacterio., 184 (20): 5733-5745. 14. Frederique, M., Leflon-Guibout, V., Poirel, L., Nordmann, P. and Nicolas-Chanoine, M.-H. 2002. Promoters P3, Pa/Pb, P4 and P5 Upstream from blaTEM Genes and Their Relationship to B-lactam Resistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46, (12): 4035-4037 15. Yarian, C., Townsend, H., Czestkowski, W., Sochacka, E., Malkiewicz, A. J., Guenther, R. Miskiewicz, A. and Agris. P.F. 2002. Accurate Translation of the Genetic Code Depends on tRNA Modified Nucleosides, J. Biol. Chem., 277 (19): 16391-16395. 16. Hooper, S. D. and Berg, O. G. 2000, Gradient in Nucleotide and Codon Usage along Escherichia coli genes, Nucleic Acid Research, 28 (18): 3517-3523. 17. Rocha, E. P.C. 2004, Codon usage bias from tRNA’s point of view : Redudancy, specialization, and efficient decoding for translation optimization, Genome Research, 14 : 2279-2286.



46


PERUBAHAN SEBAGIAN NUKLEOTIDA GEN β-lakatamase PADA Escherichia coli RESISTEN AMOKSISILIN-KLAVULANAT SECARA IN VITRO

Recommend Documents