LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ISOLASI DNA KASAR”
Disusun Oleh: Nama
: Helmi D.A
NIM
: 115040201111199
Kelompok
: jumat,15.00 wib
Asisten
:
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012 BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA. Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. 1.2 Tujuan
• Untuk mengetahui apa itu isolasi DNA. • Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA. • Untuk mengetahui cara untuk melakukan isolasi DNA. 1.3 Manfaat
Praktikum ini bermanfaat agar praktikan memahami dan mengerti tahap-tahap yang dilakukan dalam mengisolasi DNA pada tanaman.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi DNA Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumbersumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin. DNA is a nucleic acid that contains the genetic material and serve to regulate the biological development of all forms of life in color. DNA found in the nucleus, mitochondria and chloroplasts. The differences between them are: DNA and the linearshaped nucleus is closely associated with histone proteins, whereas mitochondrial and chloroplast DNA is circular and is not associated with histone proteins. (Lewis, 2003) 2.2 Macam Metode Isolasi DNA
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair. Metode I. Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g
selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan molecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair. Metode II. Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada suhu 65°C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali.
Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 μL molecular water dan disimpan pada suhu -20°C. Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995). Metode III. Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 μL dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 μL buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 μL kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4 oC. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 μL molecular water dan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 μL molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC. Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda. (Tim Dosen Biologi FMIPA UB)
2.3 Perbedaan Isolasi DNA Kasar dengan Isolasi DNA Buffer DNA Ekstraksi 2.4 Manfaat Isolasi DNA Isolasi DNA memiliki beberapa manfaat diantaranya: 1. Bermanfaat sebagai tempat penyimpanan dan penyalur informasi genetic suatu makhluk hidup. 2. Bermanffat sebagai heterokatalis, yaitu untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekulmolekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri. 3. Sebagai visualisai DNA dnegan elektoforesis gel. 4. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik hibridisasi southern. 5. Isolasi DNA genomic dalam rangka pembuatan pustaka genomic. 6. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA. 7. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. (Tim Dosen Biologi FMIPA UB)
BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat: Timbangan : Untuk menimbang bahan Mortar : Sebagai tempat penggilingan Pestle : Untuk menggiling bahan Bekker Glass : Untuk meletakkan larutan Pipet : Untuk mengambil larutan Gelas Ukur : Untuk mengukur larutan Tabung Eppendorf : Sebagai tempat untuk meletakkan larutan yang sudah diekstrak Tissue : Untuk mengeringkan alat yang basah Pisau : Untuk memotong bahan Spatula : Untuk mengambil bahan dalambentuk bubuk 3.1.2 Bahan: Buah mangga Detergen cair Detergen bubuk Bu Cream
: Bahan yang akan dimati : Sebagai pembanding DNA : Sebagai pembanding : Sebagai pembanding
3.2 Langkah Kerja Timbang mangga 5 g Haluskan dengan mortar Masukkan Bekker Glass Tambah aquades 50 ml yang sudah ada Aram 2,5 g dan detergen 2,5 g Sentrifuge 10.000 rpm 10’ Homogenkan Campur dengan larutan mangga Diamkan selama 15 menit Saring Ekstrak bahan Ambil 5 ml dengan pipet Tambahkan alcohol dingin Masing-masing 6 ml Amati penggumpalannya
3.3 Analisa Perlakuan Analisa perlakuan pada praktikum kali ini yaitu pada saat larutan buah manga yang telah dicampur dengan detergen dan garam, maka didiamkan selama 15 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan agar endapan yang ada dapat turun kebawah sehingga kita dapat melihat perbedaannya.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Dokumentasi No.
Dokumentasi
Keterangan
1.
Mangga dihaluskan dengan menggunakan mortar dan pestle
2.
Mangga yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam botol masingmasing
3.
Ditambah garam, rinso cair, aquadest, diaduk dan didiamkan selama 10 menit
4.
Ditambah garam, rinso bubuk, aquadesh, diaduk dan didiamkan selama 10 menit
5.
Ditambah garam, bu cream, aquadesh, diaduk dan didiamkan selama 10 menit
6.
Merupakan hasil dari kiri ke kanan : a)garam+rinso cair,b)garam+rinso bubuk,c)garam+bukream
7.
Hasil setelah diberi etanol 6 %
4.2 Pembahasan Dari isolasi DNA secara kasar pada buah mangga arum manis dapat kita ketahu bahwa jumlah DNA terbesar yang muncul adalah pada ekstark mangga yang dicampur dengan larutan rinso cair,kemudian ekstrak mangga dengan campuran larutan garam+rinso bubuk dan yang terakhir adalah ekstrak mangga dengan campuran larutan garam+bukcream. Sebenarnya campuran larutan yang memunculkan DNA paling banyak adalah larutan garam+rinso bubuk karena terdapat partikel- partikel yang bewarna merah dan biru yang membantu pemecahan dinding sel.tetapi itu tidak terjadi,mungkin dikarenakan saaat mengaduk terlalu keras sehingga busa muncul dan menutupi DNA yang keluar dan untuk dapat melihat DNA tersebut baik nya diberi etanol 6% dalam keadaan dingin
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Dari hasil praktikum yang telah dilakukan dengan menggunakan bahan detergen cair dan bubuk dengan merk Rinso, dan detergen cream dengan merk Bu Krim dapat disimpulkan bahwa detergen bubuk lebih banyak menibulkan benang-benang DNA. Hal ini disebabkan karena semakin sedikit air yang terkandung dalam buah maka DNA yang akan terpresipitasi akan semakin sedikit. Tabung selanjutnya yang dapat terlihat benang-benang DNA adalah detergen yang cream, kemudian cair. Disini untuk detergen bubuk dan cir menggunakan detergen dengan merk Rinso, sedangkan untuk yang cream, menggunakan detergen dengan merk Bu Krim. 5.2 Saran Pemberian materinya santai tapi serius
DAFTAR PUSTAKA Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Anonim a. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ, (Online), (http://www.gslc.genetics.utah.edu/units/activities/whea tgerm.html, diakses 6 April 2007) Hays, Lana. 2005. Introduction to DNA Extraction, (Online), (http://www.tsl.orst.edu.tgerc/dnaext.html, diakses 6 April 2007). Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Tim Dosen Biologi FMIPA UB. Tanpa Tahun. Teknik Analisis Protein dan DNA. Malang: FMIPA Universitas Brawijaya. Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi dan Upaya Eliminasi Bakteri Penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration). Desertasi tidak diterbitkan. Malang: Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya.
