PENUNTUN PRAKTIKUM DASAR BIOTEKNOLOGI TANAMAN
DISUSUN OLEH:
DR. Ir. SUKENDAH, MSc. IR. PANGESTI N., MP. IR. MAKHZIAH, MP.
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI AGROTEKNOLOGI, FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JAWA TIMUR
2014
YAYASAN KESEJAHTERAAN PENDIDIKAN DAN PERUMAHAN UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JATIM FAKULTAS PERTANIAN-LAB. BIOTEKNOLOGI
Nama Mahasiswa
: ……………………………………………………
NPM
: ……………………………………………………
Semester/ Progdi
: ……………………………………………………
Tahun Ajaran
: ……………………………………………………
Gol / Kelompok
: ……………………………………………………
Nilai Akhir
: ……………………………………………………
KARTU TANDA PESERTA PRAKTIKUM Praktikum : Dasar Bioteknologi Tanaman No
Materi Praktikum
Tanggal Praktikum
Laporan Tanggal
Nilai Aktifitas Laporan
I
I II III IV V VI VII VIII IX X
Keterangan : 1. Buku praktikum harap dibawa setiap praktikum 2. Buku hilang tanggung jawab praktikan Mengetahui, Ka.Lab. Bioteknologi
Pembimbing Praktikum
…………………………………
………………………………… i
II
KATA PENGANTAR Dengan mengucap syukur ke Hadirat ALLAH SWT, tim penyusun telah menyelesaikan penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman. Penuntun Praktikum ini disusun dengan tujuan sebagai pegangan dan membantu mahasiwa melakukan praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman. Penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman ini dibuat atas dasar perubahan kurikulum mata kuliah Dasar Bioteknologi Tanaman yang sekarang bermuatan teknopreneurship. Beberapa mata praktikum disusun untuk menghasilkan produk dengan orientasi bisnis. Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman kali ini merupakan ajang praktek dan marketing bagi mahasiswa untuk berwirausaha di bidang bioteknologi tanaman. Mahasiswa harus mampu menghasilkan produk-produk kultur jaringan yang mempunyai nilai jual tinggi. Mahasiswa diberi bekal kemampuan teknik in vitro dan molekuler khususnya untuk isolasi DNA. Setelah itu mahasiswa harus bisa mempraktekkan ilmu-ilmu kultur jaringan dalam berbagai mata praktikum ini yaitu: Pengembangan tanaman mini in vitro, Membangun sumber eksplan anggrek silangan, Mulptiplikasi dan aklimatisasi anggrek komersial, Mikroprogasi tanaman melalui organogenesis tidak langsung, dan Metode isolasi dna tanaman minipreparasi. Tim penyusun menyampaikan terima kasih kepada RAM-IPB yang telah memberi dukungan dana dalam perubahan kurikulum Dasar Bioteknologi Tanaman, termasuk penuntun praktikumnya. Tim Penyusun juga menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberi motivasim, dorongan dan bantuan dalam penyediaan referensi dalam penulisan penuntun praktikum ini. Saran dan tanggapan guna kesempurnaan materi dalam penuntun praktikum ini sangat kami harapkan. Semoga penuntun praktikum ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pihak yang membutuhkannya. Terima kasih
Surabaya, Maret 2014
Tim Penyusun
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR…………………………………………………………
Hal ii
DAFTAR ISI…………………………………………………………………..
iii
TERMINOLOGI……………………………………………………………….
1
PERSYARATAN LABORATORIUM………………………………………..
1
PRA-PRAKTIKUM/PERCOBAAN……………………………………….....
2
I.
PENGEMBANGAN TANAMAN MINI (MINI PLANT) IN VITRO…………
8
II.
MEMBANGUN SUMBER EKSPLAN ANGGREK SILANGAN…………..
11
III.
MULTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK KOMERSIAL………..
15
IV.
MIKROPROPAGASI TANAMAN MELALUI ORGANOGENESIS LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG……………………………………
20
ISOLASI DNA TANAMAN METODE MINI PREPARASI………………...
23
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………
25
LEMBAR PENGAMATAN…………………………………………………..
27
V.
iii
TERMINOLOGI
1. 2.
Aseptik Kalus
3.
Etiolasi
4.
Eksplan
5.
Embriogenesis
6.
BAP
7.
IAA
8. 9.
IBA In Vitro
10. NAA 11. Organogenesis 12. Totipotensi 13. 2,4-D
Bebas dari mikroorganisme kontaminan Masa sel yang tidak berdiferensiasi membentuk organ dan terbentuk karena pengaruh hormon tanaman pada level tertentu Tanaman yang memanjang dan berwarna kuning karena kekurangan atau tidak menerima cahaya Bagian dari tanaman yang digunakan sebagai sumber bahan tanam in vitro Embryogenesis adalah proses pembentukan dan perkembangan embrio sampai menjadi biji yang siap untuk berkecambah 6-Benzylaminopurine, salah satu hormon tanaman yang digunakan untuk menstimulasi dan pembentukan tunas Indoleacetic acid, hormon tanaman untuk meningkatkan perpanjangan sel di bawah kondisi tertentu. Implikasi dari IAA adalah menstimulasi pembelahan sel dan pembentukan akar indole-3-butyric acid, salah satu auksin endogen "di dalam kaca" adalah istilah yang dipakai untuk menyebutkan kultur suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di dalam laboratorium 1-Naphthalene acetic acid adalah salah satu auksin sintetik Kemampuan sel atau bagian tanaman untuk membentuk organ Kemampuan untuk membentuk tanaman utuh dari bagian kecil tanaman (sel, jaringan, organ) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), salah satu sintetik auksin yang sangat kuat
PERSYARATAN LABORATORIUM Ruangan Laboratorium - Laboratorium Bioteknologi Tanaman mempunyai ruangan-ruangan khusus yang terpisah antara satu dan lainnya dengan tujuan tertentu, misalnya ruangan untuk persiapan media dan sterilisasi, ruangan untuk tanam dan ruangan untuk penumbuhan. - Laboratorium Bioteknologi Tanaman juga dilengkapi dengan peralatan molekuler untuk isolasi DNA tanaman. Ruangan untuk isolasi DNA masih menjadi satu dengan ruangan persiapan media dan sterilisasi. . Glassware - Penggunaan glassware hanya untuk kepentingan kultur jaringan, bukan untuk penggunaan di lapang atau eksperimen lainnya. Bahan-bahan logam beracun akan terabsorbsi dalam glassware dan bisa menjadi problem untuk kultur in vitro - Cuci glassware dengan detergen kemudian bilas dengan air kran - Sebelum digunakan bilas glassware dengan air aquadest Air Aquadest - Gunakan air aquadest untuk semua prosedur kultur in vitro. Sebaiknya tidak menyimpan air kran karena bisa menjadi sumber kontaminan. - Untuk keperluan sterilisasi dan inokulasi eksplan gunakan air aquadest steril 1
Bahan Tanam-Eksplan -
-
-
Tanaman yang digunakan untuk kultur in vitro harus sehat dan sedang aktif tumbuh. Tanaman yang sedang stres terutama stres air biasanya tidak akan tumbuh dalam in vitro. Tanaman untuk sumber eksplan sebaiknya yang bebas hama dan penyakit serta kontaminan lainnya. Sebaiknya diperlakukan lebih dulu dengan meletakkan di green house yang relatif steril atau disemprot dengan pestisida Untuk mendapatkan eksplan yang steril bisa dengan menggunakan benih yang dikecambahkan secara in vitro
Teknik Aseptik -
-
Yang paling penting untuk teknik aseptik adalah mencegah serangan mikroorganisme (kontaminan) selama proses pengkulturan. Bahan tanam (eksplan), peralatan, botol kultur, dan media harus dalam kondisi steril. Media dan peralatan bisa disterilkan dengan autoklaf tekanan 15 lbs/inch2 (121°C) selama15 menit. Bahan-bahan hormon yang sangat labil terhadap suhu panas seperti GA3 disterilkan dengan filter sterilization Inokulasi dan subkultur dilakukan di laminar flow hood yang dilengkapi dengan penyaring udara sehingga mikroorganisme tidak bisa masuk Bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi adalah etil alkohol, HgCl and 2
NaOCl Peralatan Laboratorium - Petridish: digunakan sebagai tempat peletakan potongan eksplan di LAF sebelum dilakukan penanaman. - Botol Kultur: digunakan sebagai botol tempat ditanamnya eksplan. - Erlenmeyer: digunakan untuk menyimpan larutan stok. - Scalpel: digunakan untuk memotong eksplan. - Pinset: digunakan untuk menjapit eksplan - Aluminium Foil: digunakan untuk menutup botol kultur maupun untuk melindungi larutan stok dari cahaya matahari secara langsung. PRA-PRATIKUM/PERCOBAAN Sebelum pratikum atau melakukan percobaan di laboratorium Bioteknologi Tanaman, maka beberapa hal yang perlu dipersiapkan adalah: A. Sterilisasi Peralatan, Eksplan dan Tempat Kerja 1. Sterilisasi alat dan botol kultur 2. Sterilisasi media 3. Sterilisasi eksplan, eksplan disterilkan dengan bahan kimia seperti etil alkohol, 4. Sterilisasi tempat kerja Prosedur Sterilisasi: 1. Dengan pemanasan menggunakan autoklaf (Steam or Wet sterilization): Sebagian besar sterilisasi alat dan media menggunakan autoklaf dengan suhu 0
antara 115- 135 C. Kondisi standard
untuk sterilisasi dengan autoklaf adalah suhu 2
0
121 C dan tekanan sebesar 15 psi (pounds per square inch) selama 15 menit. Kondisi ini berdasarkan keadaan yang dibutuhkan untuk membunuh mikroorganisme 0 termophilik. Suhu 121 C hanya dapat diperoleh pada tekanan 15 psi. -
Alat dan Bahan yang disterilisasi dengan autoklaf Bahan dan peralatan yang digunakan pada sterilisasi dengan autoklaf adalah: peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus, plastic seal. a. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian. b. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet. c. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. d. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.
-
Prosedur Kerja 1. Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil. 2. Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit. 3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali. 4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi. 5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil. 6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama dapat menyebabkan : 1. Penguraian gula. 2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
3
2. Dengan Sistem Filter Beberapa zat pengatur tumbuh (hormon) seperti asam amino dan vitamin sangat labil dalam kondisi panas dan akan rusak jika disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi hormon yang tidak tahan pemanasan atau vitamin dilakukan dengan menggunakan membran filter 0.22 μm to 0.45μm size. 3. Radiasi Sterilisasi dengan sistem radiasi hanya bisa dilakukan di suatu area yang dilengkapi dengan sinar UV. Sinar UV biasanya digunakan untuk mensterilkan petridish atau pipet di dalam suatu lemari yang dilengkapi dengan sinar tersebut. Sinar UV digunakan untuk membunuh organisme di dalam ruangan atau di area kerja (dalam laminair) dan sinar ini dalam gelombang panjang tertentu bisa merusak mata dan kulit. 4. Laminar Airflow Cabinet: Laminar Airflow Cabinet alat yang dipakai untuk menipulasi ruangan aseptik. Udara ditarik ke arah kipas elektrik dan melewati filter coarse kemudian melalui filter bakteri halus (HEPA-High Efficiency Particulate Air Filter). Dengan sistem kerja seperti ini, ruang kerja di dalam laminair bebas dari mikroorganisme. Sebelum dipakai ruangan kerja di sterilkan dengan menyemprot alkohol 70%.
B. Membuat Larutan Stok Unsur Hara Larutan stok adalah larutan media kultur yang dibuat dalam volume besar. Gunanya untuk efisiensi dalam pekerjaan pembuatan media, seperti menimbang bahanbahan kimia yang berulang-ulang dan dalam skala kecil. Selain itu juga untuk menekan terjadinya kesalahan dalam penimbangan dan meningkatkan ketelitian dalam pembuatan media kultur. Larutan stok dikelompokkan sesuai dengan kebutuhan unsur hara tanaman, yaitu: 1. Larutan Stok Hara Makro Kebutuhan unsur hara makro untuk embrio kelapa kopyor adalah: -NH4Cl : 535 mg/l -KNO3 : 2020 mg/l -MgSO4.7H2O : 247 mg/l -CaCl12.2H2O : 294 mg/l -KCl : 1492 mg/l -NaH2PO4.2H2O : 312 mg/l Karena kebutuhannya banyak, biasanya stok makro dibuat untuk 10 kali konsentrasi. Pembuatan yang lebih besar dikuatirkan akan terjadi pengendapan karena kepekatan yang tinggi. Cara pembuatan larutan stok makro: a. Setiap unsur hara makro ditimbang setelah dikalikan 10: Misal: NH4Cl = 535 x 10 = 5350 mg = 5.35 g KNO3= 2020 x 10 = 20200 mg = 20.2 g dst 4
b. Setiap bahan/unsur hara dimasukkan satu per satu ke dalam beaker glass 1000 ml yang telah berisi 700 ml aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti pengadukan agar bahan terlarut sempurna, baru disusul oleh bahan berikutnya. c. Setelah bahan larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml dan diterakan sampai volume satu (1) liter dengan ditambah aquadest. d. Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label: Stok makro 10X, tanggal pembuatan, dan jenis media. e. Untuk pembuatan media satu liter diambil 100 ml dari larutan stok hara makro 2. Larutan Stok Hara Mikro Pembuatan stok hara mikro karena dibutuhkan dalam jumlah sedikit biasanya dibuat dalam konsentrasi besar, misal sampai 100x konsentrasi awal. Kebutuhan unsur hara mikro adalah: KI : 8.3 mg/l H3BO3 : 3.1 mg/l MnSO4.7H2O : 11.2 mg /l ZnSO4.7H2O : 7.2 mg/l CuSO4.5H2O : 0.25 mg/l CoCl12.6H2O : 0.24 mg/l NaMoO4. H2O : 0.24 mg/l NiCl.6 H2O : 0.024 mg/l Cara pembuatan larutan stok mikro: a. Setiap unsur hara makro ditimbang setelah dikalikan 100: Misal: KI : 8.3 mg/l = 8.3 x 100 = 830 mg/l = 0.83 g H3BO3: 3.1 mg/l = 3.1 x 100 = 310 mg/l = 0.31 g Dst. b. Setelah selesai penimbangan setiap unsur,bahan/unsur hara dimasukkan satu per satu ke dalam beaker glass 1000 ml yang telah berisi 700 ml aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti pengadukan agar bahan terlarut sempurna, baru disusul oleh bahan berikutnya. c. Jika bahan sudah larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml dan diterakan sampai volume satu (1) liter dengan ditambah aquadest. d. Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label: Stok makro 10X, tanggal pembuatan, dan jenis media. Botol yang berisi stok mikro dimasukkan di refrigerator. e. Untuk pembuatan media satu liter diambil 10 ml dari larutan stok hara makro
3. Larutan stok vitamin Sama seperti unsur hara mikro, kebutuhan vitamin juga sangat sedikit, sehingga bisa dibuat stoknya sampai 100 kali konsentrasi awal. Kebutuhan vitamin bagi embrio kelapa kopyor adalah: Pryridoxine HCl : 0.05 mg/l Thiamine HCl : 0.05 mg/l Nicotinic Acid : 0.05 mg/l Biotin : 0.05 mg/l Folic Acid : 0.05 mg/l Glycine : 1.00 mg/l Cara pembuatan larutan stok vitamin sama seperti larutan stok unsur hara mikro 5
4. Larutan Stok Besi/Iron Besi adalah unsur hara mikro, tetapi larutan stoknya dibuat tersendiri terpisah dari larutan stok mikro. Sumber unsur iron didapatkan dari Fe2SO4.7H2O dan Na2EDTA. Larutan stok besi juga dibuat dalam konsentrasi besar, misl sampai 100x. Kebutuhan unsur hara besi adalah: Fe2SO4.7H2O : 41.7 mg/l Na2EDTA : 55.8 mg/l Cara pembuatan larutan stok besi: a. Unsur ditimbang seratus kalinya, yaitu: Fe2SO4.7H2O : 41.7 mg/l x 100 = 4170 mg = 4.17 g Na2EDTA : 55.8 mg/l x 100 = 5580 mg = 5.58 g b. Setelah ditimbang, kedua larutan dilarutkan secara terpisah. Larutan EDTA dipanaskan hingga 40-60C selama beberapa menit. Selanjutnya ke dalam larutan EDTA ditambahkan larutan Fe2SO4.7H2O dan diaduk merata. c. Setelah tercampur sempurna larutan dibiarkan sampai mencapai suhu kamar (25C). Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label. Larutan sebaiknya disimpan di refrigerator. d. Untuk membuat media kultur satu liter diambil 10 ml dari larutan stok besi. 5. Larutan Stok Zat Pengatur Tumbuh Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat essensial dalam mengatur pertumbuhan kultur. Berbagai jenis ZPT yang digunakaan dalam kultur jaringan adalah: Auksin, Sitokinin, Giberellin, Zat Penghambat Tumbuh. ZPT yang sering dipakai adalah dari golongan auksin dan sitokinin. Umumnya ZPT hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit, sehingga larutan stok ZPT dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Berikut ini diuraikan cara pembuatan larutan stok ZPT dari golongan auksin dan sitokinin. a. Larutan Stok Auksin (IAA, NAA, IBA, dan 2-4 D) Golongan auksin bereaksi asam pelarut: NaOH 1 N atau alkohol 40% Konsentrasi: 1 mg/ml, membuat 100 ml: 1. Timbang bahan 100 mg 2. Tuang dalam beaker glass 100 ml yang berisi 70 ml aquadest 3. Teteskan sedikit NaOH 1 N sambil diaduk 4. Setelah larut merata, pindahkan ke labu takar 100 ml 5. Tambahkan aquadest sampai volume 100 ml 6. Pindahkan ke erlenmeyer 100 ml 7. Beri label, tanggal pembuatan dan konsentrasi, tutup rapat dan simpan di dalam refrigerator 8. Volume pemakaian: 1 ppm = 1 ml per 1 L media 2 ppm = 2 ml per 1 L media b. Larutan Stok Sitokinin (Kinetin, Adenin, Zeatin, BA, 2-iP) Golongan sitokinin merupakan reaksi basa pelarut: HCl 1 N dan pemanasan Konsentrasi: 1 mg/ml: 100 ml 1. Timbang bahan 100 mg 2. Tuang dalam beaker glass 100 ml yang berisi 70 ml aquadest 3. Teteskan larutan HCl 1 N sambil diaduk 4. Panaskan sebentar hingga bahan-bahan benar-benar larut dan berwarna jernih 6
5. Pindahkan ke labu takar 100 ml dan tambahkan aquadest sampai volume 100 ml 6. Pindahkan larutan ke dalam erlenmeyer 100 ml, tutup rapat dengan aluminium foil 7. Beri label, tanggal pembuatan dan konsentrasi, kemudian simpan dalam refrigerator 8. Volume pemakaian: 1 ppm = 1 ml per 1 L media 2 ppm = 2 ml per 1 L media
Hal-hal yang harus diperhatikan pada larutan stok 1. Larutan stok sebaiknya tidak disimpan terlalu lama, terutama vitamin dan ZPT. Oleh karena itu pembuatan larutan stok harus diperhitungkan betul jumlah kebutuhannya 2. Larutan stok yang telah mengalami perubahan, misalnya: ada pengendapan atau terkontaminasi (ditumbuhi mikroorganisme) sebaiknya tidak digunakan lagi 3. Semua alat-alat yang digunakan untuk membuat larutan stok dibilas terlebih dahulu dengan aquadest guna mencegah terkontaminasi dengan zat-zat lain yang tidak diinginkan 4. Setiap larutan stok harus berlabel mengenai: tanggal pembuatan, jenis larutan stok dan kepekatan. 5. Untuk larutan stok yang bersifat labil seperti vitamin dan ZPT disimpan di dalam refrigerator. Hindarkan larutan stok dari cahaya langsung, simpan dalam botol yang berwarna gelap.
7
I. PENGEMBANGAN TANAMAN MINI (MINI PLANT) IN VITRO
I.1. Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Kemajuan teknik propagasi tanaman dengan cara in vitro telah memacu perkembangan ilmu tanaman dengan pesat. Propagasi tanaman in vitro kini bukan hanya sekedar bertujuan untuk perbanyakan tanaman pangan saja, namun telah meluas kepada berbagai komoditi tanaman. Bahkan perkembangan metode propagasi tanaman in vitro lebih banyak diterapkan terhadap tanaman non pangan, antara lain tanaman hias dan tanaman obat-obatan. Tanaman hias dibudidayakan untuk memenuhi kebutuhan akan keindahan dan kenyamanan, serta sebagai sarana penyaluran hobi / kesenangan (to have fun growing). Budidaya tanaman hias dengan metode kultur jaringan in vitro, selain untuk mengembangbiakkan tanaman, juga sekaligus untuk memperoleh bibit tanaman yang unik dengan cara memanipulasi media dan lingkungan tumbuh in vitro. Keunikan tanaman tumbuh di dalam sebuah wadah kaca, dapat menjadi daya tarik yang memiliki nilai jual. Tidak salah jika dikatakan bahwa kultur jaringan tanaman adalah: “… the art and science of multiplying plants in vitro.” 1.2. Tujuan Praktikum bertujuan untuk membuat tanaman mini in vitro unik yang memiliki daya jual. I.2.
Bahan dan Metode
2.1.
Bahan Bahan tanaman (eksplan): shoot tip (tunas pucuk) tanaman Puring, ujung daun muda tanaman Sansivera, tunas pucuk kastuba, dan daun Begonia Media padat dalam botol kultur: (MS+BAP), (MS+NAA) dalam botol kultur Sterilant (Alkohol, Larutan sublimat dan Bayclin) Aquadestilata
2.2.
Peralatan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah laminar flow cabinet, pisau scalpel, pinset, botol kultur, lampu bunsen, gunting, petridish, hand sprayer, tisu, label. (Semua peralatan sudah disterilkan). 2.3.
Metode
a. Sterilisasi eksplan Eksplan berupa tunas pucuk (shoot tip) Puring sepanjang ± 5 cm, Daun muda Sansivera dan Begonia, diambil dari tanaman di dalam Green House. Pemotongan tunas dilakukan dengan menggunakan pisau atau gunting yang bersih dan tajam. Tunas pucuk dicuci bersih di bawah air mengalir selama 15 menit, direndam dalam larutan deterjen selama 15 menit, kemudian direndam dalam larutan fungisida + bakterisida 2% selama 30 menit. Bilas hingga benar-benar bersih. Pembilasan terakhir dilakukan dengan menggunakan aquadest steril, kemudian ditiriskan. Dilakukan pemotongan untuk memperkecil ukuran eksplan. Pemotongan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi aseptik. Dilakukan sterilisasi bertingkat sebagai berikut: 1) direndam dalam larutan alkohol 70% selama 15 menit, 2) bilas dengan aquadest steril 3) direndam dalam larutan sublimat (Hg2Cl2) 0.1% + 5 tetes Tween 4) bilas dengan aquadest steril 8
5) 6) 7) 8)
larutan Clorox 20% selama 15 menit bilas dengan aquadest steril larutan Clorox 5% selama 15 menit celupkan dalam larutan Bethadine 50% selama 1 detik
b. Penanaman eksplan Penanaman dilakukan di dalam LAF yang telah disterilkan dengan sinar UV dan dilap dengan larutan alcohol 70% eksplan yang telah disterilkan selanjutnya ditanam dalam botol kultur yang telah berisi media tanam. Setiap botol diisi dengan 4 atau 5 eksplan Penanaman dengan menggunakan pinset yang senantiasa diterilkan dalam larutan alcohol 90% dan dibakar pada lampu Bunsen. Mulut botol kultur diusahakan agar selalu dekat dekat lampu Bunsen Setelah penanaman, botol kultur segera ditutup kembali dan diberi label c. Penumbuhan dan multiplikasi eksplan Eksplan dalam botol kultur disimpan dalam rak kultur di ruang inkubasi Dilakukan pengamatan visual eksplan setiap hari Dijaga agar suhu udara, kelembaban udara dan cahaya konstan Setelah eksplan tumbuh dan bertunas, dilakukan multiplikasi (pemisahan tunas) dan ditumbuhkan dalam media tanam baru (sub kultur) Eksplan yang akan disubkultur diletakkan di petridish, kemudian segera ditanam pada media sesuai perlakuan dengan menggunakan pinset setiap botol diisi satu atau dua eksplans, kemudian botol ditutup Multiplikasi dilakukan sebulan sekali Eksplan yang telah berdaun lengkap dipindahkan (sub kultur) pada media untuk perakaran. d. Perlakuan Setiap jenis tanaman diperlakukan dalam beberapa komposisi media tanaman sebagai berikut: Tabel 1. Perlakuan Media Tanam Media Penumbuhan tunas
Puring MS+BAP 1 mg/L
Sansivera MS+BA 1 mg/L
Begonia MS+BAP 0.2 mg/L
Sub kultur
MS+BAP 3 mg/L
MS+BAP 1
MS+BAP 0.4 mg/L
Perakaran
MS+NAA 3 mg/L
MS+NAA 0.4mg/L
MS+NAA 0.2 mg/L
Aklimatisasi
Pasir+kompos
Pasir+Kompos
Pasir+kompos
2.4. Pengamatan a. Persentase pertumbuhan eksplan (%) Kultur dikatakan tumbuh adalah berwarna hijau, secara visual ukuran bertambah, berat bertambah dan perubahan embriogenesis maupun morfogenesis. Persentase tumbuh dihitung tiap minggu dengan rumus:
9
Persentase tumbuh = Jumlah eksplan yang tumbuh x 100% Jumlah eksplan per perlakuan b. Jumlah tunas (tunas) Dihitung jumlah tunas yang terbentuk dari setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian. c. Panjang tunas (cm) Tinggi planlet diukur dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur dari tempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi dilakukan pada akhir penelitian. c. Jumlah daun (helai) Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka sempurna dari setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian. d. Jumlah akar (helai) Jumlah akar dihitung dari jumlah akar yang terbentuk dari leher akar pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian. e. Bentuk daun Bentuk daun dilihat daun membulat atau melebar pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian. f. Warna daun Warna daun dilihat berwarna hijau, kuning atau perpaduan kuning dan hijau pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.
I.3. Tugas Praktikum a. Setiap kelompok melakukan percobaan dengan satu jenis tanaman, dan setiap mahasiswa menanam eksplan dalam 5 botol kultur (5 ulangan) b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada tanaman masingmasing dan tanaman kelompoknya c. Membuat catatan pengamatan mingguan (Tabel 1 dan 2) d. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum
Tabel I.1. Pengamatan Pertumbuhan Eksplan Tanggal
Perlak uan / ulang an
% eksplan berbentuk kalus
%eksplan membentuk tunas
∑ tunas per eksplan
% eksplan mati dan terkontaminasi
Penyebab kontaminasi
Table I.2. Pengamatan Visual Tanggal Perlakuan
Ulangan
10
II. MEMBANGUN SUMBER EKSPLAN ANGGREK SILANGAN
II.1. Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Pada dasarnya tanaman anggrek merupakan tanaman yang sulit untuk melakukan penyerbukan sendiri, sehingga perkembangbiakannya pun cukup sulit. Selain itu, biji yang kecil, tidak mengandung cadangan makanan dan kulit yang sangat keras serta tebal membuat tanaman anggrek sulit ditumbuhkan tanpa bantuan manusia, kecuali anggrek yang tumbuh liar di hutan. Untuk mengatasi hal tersebut dan menumbuhkan anggrek secara masal, maka tindakan yang bisa dilakukan adalah dengan mengawinkan anaman anggrek (dapat sekaligus memperoleh varietas persilangan yang baru). Perbanyakan anggrek pada umumnya dilakukan dengan cara perkecambahan biji secara in-vitro (Young et.al., 2001 dalam Rianawati dkk., 2009), sehingga hasil yang diperoleh tidak seragam dan menghasilkan warna bunga yang beragam (Rianawati, dkk. 2009). Setelah membentuk buah dan berbiji, maka penumbuhan bijinya dilakukan secara in-vitro hingga menjadi tanaman yang siap ditanam di area terbuka untuk berproduksi atau dipasarkan. Sebelum melakukan kultur jin vitro anggrek, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk anggrek yang akan diperbanyak. Bahan induk anggrek ini merupakan sumber eksplan yang akan dikultur. Bahan induk anggrek bisa diperoleh melalui persilangan dalam satu atau antar spesies. Persilangan memerlukan indukyang mempunyai sifat-sifat unggul sehingga perpaduan dari sifat-sifat tersebut akan muncul pada hasil persilangan. Hasil persilangan berupa buah yang mengandung puluhan biji anggrek hibrida. Penyilangan anggrek sebagai sumber eksplan dilakukan dengan cara memilih induk jantan dan betina yang mempunyai sifat-sifat unggul, seperti ukuran bunga, warna dan bentuk bunga. Agar penyilangan berhasil, sebaiknya dipilih induk betina yang mempunyai kuntum bunga yang kuat, tidak cepat layu atau gugur, mempunyai tangkai putik dan bakal buah yang lebih pendek agar tabung polen (pollen tube) dapat dengan mudah mencapai kantong embrio yang terdapat pada bagian bawah bakal buah. Pencatatan nama kedua induk yang disilangkan sangat penting agar tidak merusak tata namanya. 1.2. Tujuan Tujuan dari Praktikum ini adalah : Mahasiswa dapat membangun sumber eksplan anggrek hasil silangan Mahasiswa mampu melakukan persilangan pada tanaman anggrek Mahasiswa tanda-tanda keberhasilan maupun kegagalan dalam persilangan anggrek II.2.
Bahan dan Metode
2.1.
Bahan Bahan tanaman anggrek yang berbunga putih, merah, kuning dan ungu. Label, cotton bud atau tusuk gigi. 2.2.
Peralatan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spidol, pensil, loupe, pinset/jarum oase.
11
2.3.
Metode
a. Kenali bagian-bagian dari bunga anggrek seperti yang tertera pada Gambar II.1. berikut ini:
Putik
Polen k Gambar II.1. Bagian-bagian bunga anggrek termasuk putik dan polen yang sangat penting untuk proses persilangan
b. Tahap Persiapan Persilangan -
Pemilihan tanaman induk: pilih induk betina ( putik) dan induk jantan (sumber polen/serbuk sari)
-
Pemilihan karakteristik induk: Catat karakter induk jantan dan induk betina → jenis/spesies, bentuk bunga, warna bunga (bila memungkinkan ambil gambar/foto induk jantan dan induk betinanya)
-
Pengecekan kematangan putik dan polinia. Kuntum bunga yang akan disilangkan sebaiknya yang sudah mekar selama 3-4 hari.
12
c. Tahap Persilangan -
-
-
-
Siapkan alat untuk mengambil polen/tepung sari: jarum, cotton bud, atau tusuk gigidibersihkan atau disterilkan Kuntum bunga induk betina dipilih yang bernomor ganjil dihitung dari pangkal batang. Sementara untuk bunga induk jantan bisa dipilih yang mana saja asalkan masih segar, sehat dan kuat. Ambil tepung sari dari bunga jantan dengan memakai cotton bud/jarum/tusuk gigi. Tepung sari letaknya di pusat bunga berwarna kuning. Congkel perlahanlahan tepung sarinya (Gambar II.2). Tepung sari akan melekat pada ujung jarum (Gambar II.3). Tempelkan/usapkan tepung sari ke putik pada bunga betina sampai menempel sempurna. Posisi putik persis di bawah kotak sari, yaitu suatu lekukan yang berlendir (Gambar II.4). Tepung sari dari induk bunga betina dibuang. Labellum dari induk bunga betina dibuang untuk mencegah serangga datang dan menempelkan tepung sari dari bunga lain.
Persiapan alat persilangan
Gambar II.3
Gambar II.2
Labeling
Gambar II.4
Pengamatan
Gambar II.5. Skema persilangan anggrek untuk sumber eksplan 13
Tiap kelompok menyilangkan 3 macam anggrek dan diulang pada 3 bunga seperti yang tertera pada tabel berikut ini:
-
No.
Induk Betina
Induk Jantan
Bunga 1 (ulangan 1)
Bunga 2 (Ulangan 2)
Bunga 3 (Ulangan 3)
1. 2. 3.
d. Pengamatan Dalam waktu 3-4 hari jika tangkai kuntum bunga induk betina masih segar berwana kehijauan, berarti persilangan berhasil. Sebaliknya jika kelopak dan mahkota bunga layu dan gugur berarti persilangan gagal. Tanda terbentuknya buah: 1. Mahkota dan kelopak layu setelah diserbuki, tangkai bunga tetap segar 2. Beberapa hari kemudian bakal buah mulai membesar 3. Mahkota dan kelopak bunga mengering, bakal buah semakin membesar
-
Buah anggrek
Gambar II.6. Ciri-ciri bunga yang berhasil dalam persilangan sehingga membentuk buah -
Pengamatan hasil persilangan Tabel II.1. Tanggal dan keberhasilan dalam persilangan antar induk anggrek
No.
Tanggal Persilangan
Parent (Induk Betina x Induk Jantan)
% bunga yang jadi
Terbentuknya buah
1. 2. 3.
14
III. MULPTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK KOMERSIAL III.1. Pendahuluan 1.1 Latar Belakang Biji anggrek hasil silangan pada praktikum sebelumnya hanya memiliki embrio dan tidak memiliki endosperm (cadangan makanan) sehingga tidak bisa disemaikan dengan cara biasa. Umumnya biji anggrek disemaikan dengan cara in vitro pada media buatan yang berperan sebagai endosperm yaitu cadangan makanan bagi embrio untuk tumbuh (Arditti, 1992). Di alam biji anggrek akan berkecambah apabila di tempat jatuhnya terdapat cendawan mycoryza. Hasil dari metabolisme mycoryza berupa senyawa-senyawa organik sederhana yang dimanfaatkan biji anggrek untuk berkecambah dan tumbuh sebelum mampu memproduksi makanan sendiri. Embrio yang berkecambah membentuk protocorm yaitu struktur seperti corm (batang berlapis) berukuran sangat kecil, berwarna hijau dan dapat melakukan fotosintesis. Setelah senyawa organik yang terbentuk mencukupi dalam protocorm, barulah tunas dan akar akan terbentuk (Wattimena et al., 1992) Planlet anggrek yang diperoleh dari protocorm selanjutnya di multiplikasi dalam media multiplikasi untuk mendapatkan anggrek dalam jumlah yang banyak. Setelah cukup dewasa anggrek dipindahkan dari botol kultur di dalam laboratorium ke pot yang ada di screen house (aklimatisasi). Aklimatisasi anggrek tidak hanya sekali dilakukan, tetapi beberapa kali tergantung fase pertumbuhannya.
1.2 Tujuan Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu: 1. menanam biji anggrek hasil silangan dengan teknik in vitro 2. melakukan subkultur planlet anggrek. 3. melakukan aklimatisasi planlet anggrek dari botol ke compot. 4. memelihara tanaman anggrek dengan baik dan benar selama di screen house.
III.2.
Bahan dan Metode
2.1. Bahan Bahan utama yang digunakan pada praktikum ini adalah buah-buah anggrek hasil silangan dan planlet Dendrobium, serta Phalaenopsis, media MS, dan agar. Bahan-bahan tambahan yang dibutuhkan yaitu alkohol 70%, aquades, spiritus, plastik, karet gelang, dan tisu. Sedangkan bahan yang digunakan pada proses aklimatisasi yaitu bibit anggrek, arang sekam, sphagnum moss, serbuk pakis, cocopeat, dan fungisida. 2.2. Peralatan Alat-alat yang digunakan yaitu otoklaf, laminar air flow cabinet, neraca analitik, botol kultur, bunsen, hand sprayer, pinset, cawan petri, labu erlenmayer, gelas piala, gelas ukur, pisau, corong, scapel, pengaduk kaca, pipet, labu takar, pH meter, dan kain pembersih. Sedangkan alat yang digunakan untuk proses aklimatisasi yaitu toples plastik, pinset, baskom dan hand sprayer.
15
2.3. Metode a. Penaburan benih/biji anggrek - Buah anggrek dipilih yang sudah matang, sekitar 3 bulan hingga 2 tahun setelah penyerbukan tergantung pada jenisnya. Buah yang akan merekah dicirikan oleh perubahan warna menjadi hijau kekuningan. Biji yang berwarna keputih-putihan dan kosong adalah biji yang kurang baik. Biji yang baik yaitu bulat berisi, berwarna kuning atau kecoklat-coklatan. - Sterilisasi buah/kapsul anggrek. Kapsul anggrek yang berisi puluhan biji disterilkan dengan klorok 1.5% selama 15 menit. Setelah itu buah dibilas dengan aquadest steril. - Di dalam laminair air flow, kapsul dibakar sebentar di atas bunsen dan dibuka dengan scapel. Biji-biji anggrek dikeluarkan dari kapsul dan diinokulasi pada media MS. - Botol-botol kultur yang berisi media dengan biji-biji anggrek selanjutnya diletakkan dalam ruang penumbuhan dengan cahaya lampu. b. Multiplikasi planlet -
Persiapan Planlet. Planlet anggrek yang digunakan berasal dari biji-biji anggrek silangan yang dikulturkan secara in vitro. Planlet dikeluarkan dari botol dan diletakkan pada cawan petri steril (Gambar III.1). Setiap planlet dipisahkan satu persatu dari rumpun menggunakan scapel.
-
Penanaman planlet. Penanaman planlet pada seluruh media dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Alat-alat, bahan atau tangan harus disterilisasi terlebih dahulu dengan menyemprotkan alkohol 70% ketika menanam. Penanaman planlet dilakukan dengan menancapkan ke dalam media 2 planlet setiap botol.
Gambar III.1. Rumpun planlet yang akan dipisahkan menjadi satu planlet - Pembesaran dan pemeliharan planlet. Pembesaran dan pemeliharaan planlet dilakukan dengan menjaga keadaan lingkungan ruangan kultur yaitu memberikan penyinaran lampu flourescent berintensitas cahaya 1000 lux pada rak kultur tempat o
botol-botol diletakkan dan suhu ruangan diatur 20-25 C. Kondisi ini terus berlangsung selama 24 jam setiap hari.
16
c. Aklimatisasi -
Persiapan bibit dan media Media tanam yang akan digunakan dicuci hingga bersih terlebih dahulu kemudian direndam dalam fungisida 1 g/l selama 5 menit kemudian ditiriskan. Setelah itu masing-masing media dimasukkan ke dalam pot. Bibit yang akan digunakan dikeluarkan dari botol. Buka tutup botol, kemudian isi dengan air. Kemudian satu persatu bibit ditarik dengan kawat yang ujungnya dibentuk U, dan diusahakan akar keluar dulu (Gambar III.2). Apabila sulit dikeluarkan, botol dapat dipecahkan.
-
Bibit dicuci bersih sampai media agar-agarnya hilang, kemudian dimasukkan bak yang berisi fungisida dan direndam beberapa menit. Bibit diangkat dan ditiriskan di atas nampan yang dialasi kertas atau tisu bersih (Gambar III.3).
Gambar III.2. Planlet anggrek dalam botol yang dikeluarkan untuk diaklimatisasi
Gambar III.3. Bibit anggrek yang sedang ditiriskan di atas nampan untuk dipindahkan ke pot dalam proses aklimatisasi
17
-
Penanaman Pot komunitas (compot) diisi pecahan batu bata sebanyak 1/3 bagian bawah, arang pada lapisan tengah, dan lapisan atas diisi pakis. Bibit ditanam sedalam 12 cm. Dalam satu compot (diameter 15 cm) jumlah yang ditanam tidak lebih dari 20 bibit.
Gambar III.4. Compot yang berisi bibit anggrek pada proses aklimatisasi
-
Pemeliharaan Pot diletakkan pada tempat yang terkena sinar matahari pagi dan diberi naungan (bisa dengan paranet 35 %) (Iswanto, 2002). Pemeliharaan dilakukan dengan penyiraman 2 kali sehari, pemupukan menggunakan pupuk daun Vitabloom (3010-10) 2 g/l satu kali seminggu dengan cara disemprotkan ke daun dan pencegahan cendawan menggunakan Dithane M-45 berbahan aktif Mancozeb 80% sebanyak 3 g/l 2 minggu sekali.
Gambar III.5. Proses aklimatisasi anggrek di pembibitan
-
Pemindahan Tanaman dari Compot ke Single Pot Setelah tanaman mencapai ketinggian 5 cm atau lebih sebaiknya bibit dipindahkan satu per satu ke single pot. Cara pengisian media dan penanaman bibit sama seperti pada compot (Iswanto, 2002).
-
Pemupukan Pemupukan dilakukan melalui daun, caranya dengan penyemprotan Pemupukan sebaiknya dilakukan pada pagi hari, antara pukul 07.00-09.00. Sehingga pupuk yang diberikan tidak cepat menguap. Jika pupuk diberikan lewat media, yang diambil oleh tanaman hanya yang larut dalam air saja dan yang langsung kontak dengan ujung akar. Sisanya akan terus berada dalam pot.
18
d. Pengamatan a. Pembesaran planlet secara in vitro: 1. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna. 2. Jumlah akar, dihitung saat akar mencapai 2 mm. 3. Tinggi tunas, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal tunas hingga titik pertemuan antara dua daun paling atas 4. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang dari pangkal hingga ujung daun. 5. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian tengah daun. 6. Panjang akar, diukur saat akhir pengamatan pada akar terpanjang dari pangkal hingga ujung akar.
b. Aklimatisasi bibit Pada proses aklimatisasi, peubah yang diamati yaitu: 1. Persentase hidup, dengan membandingkan bibit hidup dengan bibit awal dikalikan 100%. 2. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna. 3. Tinggi tanaman, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal hingga titik tumbuh tunas. 4. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang dari pangkal hingga ujung daun. 5. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian tengah daun. Contoh Tabel Pengamatan Nama Anggrek : Tanggal Tranplanting : Jumlah awal : ∑ anggrek setelah transplanting Ming gu 1
Ming gu 2
Ming gu 3
Ming gu 4
∑ daun Ming gu 1
Ming gu 2
Ming gu 3
Tinggi tanaman Ming gu 4
Ming gu 1
Ming gu 2
Ming gu 3
Panjang daun Ming gu 4
Ming gu 1
Ming gu 2
Ming gu 3
19
Ming gu 4
IV. MIKROPROGASI TANAMAN MELALUI ORGANOGENESIS LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG IV.1. Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Kultur jaringan (Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Juga merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas, sel, jaringan dan organ (daun, batang, akar, biji, bunga, buah) dan menumbuhkan dalam kondisi aseptik (Rahardja 1989). Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplan bisa berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda dan terdiri dari sel-sel meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif membelah-belah dan apabila dikulturkan pada media tumbuh yang sesuai secara invitro, maka eksplan tersebut akan tumbuh dan berkembang biak menjadi banyak (Nugroho dan Sugito 2004). Organogenesis merupakan proses pembentukan organ-organ tubuh. Untuk mendapatkan tanaman utuh dengan kultur jaringan tumbuhan dapat melalui dua cara yaitu organogenesis dan embriogenesis somatik (Karim 2006), secara langsung atau tak langsung melalui pembentukan kalus terlebih dahulu (George & Sherington 1984). Organogenesis merujuk kepada proses yang menginduksi pembentukan jaringan, sel atau kalus menjadi tunas tanaman sempurna. Proses ini diawali oleh hormon pertumbuhan benziladenin dan sitokinin lainnya, baik sendiri maupun dalam kombinasi dengan asam naftalasetat atau asam indolasetat dan kadang-kadang dengan asam giberelat menyebabkan diferensiasi dan pembentukkan tunas. Tanaman yang digunakan dalam praktikum ini adalah sirsak dan karet. Buah Sirsak (Annona muricata L) adalah salah satu buah yang populer di Indonesia karena kasiatnya. Salah satunya adalah obat penyakit kanker. Buah sirsak mengandung banyak karbohidrat, terutama fruktosa. Kandungan gizi lainnya adalah vitamin C, vitamin B1 dan vitamin B2 yang cukup banyak. Bijinya beracun, dan dapat digunakan sebagai insektisida alami, seperti juga biji srikaya. Sementara itu karet adalah tanaman perkebunan yang penting namun sudah lama tidak mengalami peremajaan atau diregenerasikan. Media yang digunakan adalah media dasar Murashige Skoog (MS) termasuk media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap dibandingkan media dasar lainnya, walaupun demikian perlu ditambah suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan. Indeks keasaman (pH) media adalah 5,6. Komposisi dalam media Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro, mikro, vitamin, gula, asam amino dan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk differensiasi sel (Gunawan 1995). 1.2. Tujuan -
Mahasiswa mampu melakukan mikropropagasi pada tanaman sirsak dan karet Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis langsung pada tanaman sirsak dan karet Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis tidak langsung pada tanaman sirsak dan karet
IV. 2. Bahan dan Metode 2.1. Alat dan bahan
20
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah laminar, pinset, pisau, botol steril, gelas ukur, bunsen, silk, plastik, dan karet. Sedangkan bahan yang digunakan adalah biji sirsak dan karet, larutan fungisida dan bakterisida, larutan bayclin 5%, larutan tween, alkohol 96%, alkohol 70%, dan media MS, Hormon BAP dan 2,4-D, aquadest steril, label 2.2. Metode - Menyiapkan bahan yang akan digunakan. Ambil biji sirsak dan karet (Gambar IV. 1) dan direndam dengan larutan fungisida 2 g/ml, dan bakterisida 2 g/ml selama 1 jam. Bilas dengan air mengalir selama 30 menit. - Bawa kedalam laminar, sterilisasi dengan alcohol 70% selama 5 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian merendam dengan bayklin 20% selama 10 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian rendam dengan bayklin 10% selama 5 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian rendam/gojok dengan bayklin 5% selama 20 menit. Terakhir bilas dengan akuades steril
Gambar IV.1. Biji sirsak dan karet yang akan dijadikan sumber eksplan - Penanaman biji steril Biji sirsak dan karet ditanam pada media MS dengan posisi tidur. Satu botol kultur tiga biji steril. Botol kultur diinkubasi pada ruang kultur. - Induksi kalus dan tunas Setelah biji sirsak dan karet tumbuh menjadi bibit, ambil bagian kotiledon, hypokotil dan internodia sebagai sumber eksplan. Tanam pada media untuk induksi kalus (MS + +BA 0.1 mg/l +2,4-D 1.0 mg/l) sedangkan untuk proliferasi kalus pindah ke media MS+BA 0.1 mg/ l +2,4-D 0.5 mg/l. Media untuk induksi tunas sirsak adalah MS + BA 1.0-2 mg l–1 + NAA; 0.1 mg l–1. Botol kultur yang berisi eksplan sirsak dan karet selanjutnya diinkubasi pada ruang kultur yang dilengkapi dengan lampu inflourescent.
IV.3. Pengamatan Tanggal
Perlak uan / ulang an
% eksplan berbentuk kalus
%eksplan membentuk tunas
∑ tunas per eksplan
% eksplan mati dan terkontaminasi
Penyebab kontaminasi
21
IV.4. Tugas Mahasiswa a. Mahasiswa dibagi dalam 4 kelompok. Setiap kelompok melakukan percobaan dengan satu jenis tanaman (sirsak atau karet) dan satu metode mikropropagasi, yaitu organogenesis langsung atau tidak langsung b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada tanaman masingmasing dan tanaman kelompoknya c. Membuat catatan pengamatan mingguan d. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum No. 1. 2. 3. 4.
Kelompok Mahasiswa Kelompok I Kelompok II Kelompok III Kelom[ok IV
Jenis Tanaman Sirsak Sirsak Karet Karet
Jenis Mikropropagasi Organogenesis Langsung Organogenesis Tidak langsung Organogenesis Langsung Organogenesis Tidak langsung
22
V. ISOLASI DNA TANAMAN METODE MINIPREPARASI V.1. PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang Deoxiribose Nucleic Acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Untuk analisis yang menggunakan DNA misalnya identifikasi kekerabatan, identifikasi dan pemetaan gen, konservasi dan lain-lain, maka diperlukan isolasi DNA. Kegiatan utama dalam isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Presipitasi bertujuan mengendapkan protein histon. Isolasi DNA melalui beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap isolasi jaringan adalah untuk mengisolasi jaringan sel, maka sel yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel. Pelisisan dinding dan membran sel dilakukan dengan cara memberikan larutan pelisis sel yang merupakan larutan hipotonis. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel dari zat-zat lain yaitu dengan memberikan RNAse. Presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon sehingga DNA menjadi dapat dilihat dan diambil. 1.2 Tujuan Praktikum bertujuan untuk dapat mengisolasi DNA tanaman dengan metode minipreparasi. V.2. BAHAN DAN METODE 2.1 Bahan: 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Daun jagung, sengon, puring, tomat dan cabe Nitrogen cair Bufer lisis (0,2 M Tris-Cl pH 7,5; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl; 2% CTAB) Bufer ekstraksi (0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O). Bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl). TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0)
2.2 Alat: 1. Mortar dan pestel 2. Tabung 1,5 µl 3. Sentrifuse 2.3. Cara Kerja: 1.
Ambil sampel daun sebanyak kurang lebih 1 gram kemudian digerus dengan menambahkan nitrogen cair 2 ml sampai halus dan dimasukkan tabung 1,5 ml dan ditambahkan buffer isolasi 750 µl . Inkubasi 1 jam dengan suhu 65º C. Tambahkan 750 µl kloroform:isoamil (24:1) dan disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit. 23
2.
3. 4. 5. 6.
Supernatan (cairan) diambil dipindahkan ke tabung 1,5 µl baru. Larutan diendapkan (presipitasi) dengan iso propanol dua kali jumlah volume. Homogenkan dengan vortex dan disentrifus 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil dan supernatan dibuang, kemudian dibilas dengan etanol 70% sebanyak 1 ml, dihomogenkan dan sentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan pelet dibuang, kemudian dikering anginkan. Tambahkan 50 µl TE. DNA disimpan pada suhu -200 C.
V.3. PENGUKURAN DNA Pengukuran DNA dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara kuantitatif dan kualitatif. Kedua cara tersebut dapat dilakukan dengan metode elektroforesis dan dengan menggunakan spektrofotometer. Elektroforesis bertujuan memisahkan DNA berdasarkan ukurannya pada gel agarose yang dialiri listrik (Gambar 1), sedangkan pengukuran DNA dengan spektrofotometer berdasarkan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Gambar 1. Visualisasi DNA hasil elektroforesis beberapa jenis tanaman
a. Konsentrasi DNA (µg/ml) = nilai absorb. 260 x 50 µg/ml x faktor pengenceran b. Kualitas (kemurnian) DNA = absorbansi 260 = 1,7 – 2,0 (sangat baik). absorbansi 280
V.4. TUGAS MAHASISWA 1. Setiap kelompok mahasiswa mengisolasi DNA tanaman yang berbeda. 2.Tentukan kualitas dan konsentrasi DNA yang diperoleh dengan spektrofotometer. 3. Bandingkan konsentrasi DNA tiap tanaman. 4. Buat pembahasan maksud dan tujuan dari tiap perlakuan tahapan isolasi DNA dan faktor – faktor yang mempengaruhi konsentrasi dan kualitas DNA.
24
DAFTAR PUSTAKA Anonymous, 2008. Report on of The Validation on” Dellaporta Derived”. Method for DNA Extraction from Ground Maize Grains and Seeds. CRF-GMFF: maize grains and seeds DNA Extraction Ardiana, Wahyuni, Dwi. 2009. Teknik Pemberian Benzil Amino Purin Untuk Memacu Pertumbuhan Kalus dan Tunas Pada Kotiledon Melon (Cucumis melo L.). Sumatera Barat. Buletin Teknik Pertanian Vol 14, No 2, 2009, hal 50-53. CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s First Training Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p. Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15. George.E.F. And Sherrington.P.D. 1984. Plant Propagation by Tissue Cultures. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. England: Exegenetics limited. Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Laboratorium Kutur Jaringan PAU Bioteknologi IPB, Bogor. Hal: 252. Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Jakarta: Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Hal: 304. Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies, and R. L. Geneve. 1990. Plant propagation principles and practices. 6th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs, N.J. Kyte, L. 1990. Plants From Test Tubes. An Introduction to Micropropagation. Oregon: Timbers Press, Portland. Moega, J.P. 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta: Erlangga. Hlm. 204-208. Rout GR, Mohapatra A, Mohan Jain S. 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotechnology Advances 24 (2006) 531–560. Available online at www.scienedirect.com Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. Santoso, Untung dan Nursandi, Fatimah. 2001. Kultur Jaringan Tanaman. Malang: Universitas muhammadiyah Malang (UMM Press). Sarmast MK, Salehi M, Salehi H. 2009. The Potential of Different Parts of Sansevieria Trifasciata L. Leaf for Meristemoids Production. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 2506-2509 Sudarmadji. 2003. Penggunaan Benzil Amino Purin Pada Pertumbuhan Kalus Kapas Secara in vitro. Malang. Buletin Teknik Pertanian Vol 8, No 1, 2003. Wattimena, G. A. 1992. Sitokinin, Bioteknologi Tanaman. Bandung: Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Hal: 66-67. Wijayani, Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius. 25
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan: Cara memperbanyak tanaman secara efisien. Agro Media Pustaka, Jakarta Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Kiat Mengatasi Masalah Praktis. Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efesien. Jakarta: Agromedia Pustaka. Yusnita, Pungkastiani W, Hapsoro D. 2011. In Vitro Organogenesis of Two Sansevieria Cultivars on Different Concentrations of Benzyladenine (BA). Agrivita 33 (2):147-153 Zulkarnain. 2009. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara. .
26
LEMBAR PENGAMATAN I
27
LEMBAR PENGAMATAN II
28
LEMBAR PENGAMATAN III
29
LEMBAR PENGAMATAN IV
30
LEMBAR PENGAMATAN V
31
