ISOLASI DNA BUAH
I.
TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah: •
Mengetahui cara/metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari buah-buahan berdaging lunak.
•
Mengetahui pengaruh kandungan air yang terdapat pada suatu buah terhadap hasil isolasi DNA.
I.
DASAR TEORI Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA terletak pada kromosom, dijumpai di nukleus, mitokondria dan kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di nukleus, sitoplasma, dan ribosom. DNA ada dalam setiap sel makhluk hidup. DNA adalah materi genetik yang diwarisi organisme dari orang tuanya. Suatu molekul DNA sangat panjang dan umumnya terdiri atas ratusan bahkan ribuan gen. DNA tersusun atas 3 komponen utama, yaitu suatu molekul organic yang disebut basa nitrogen,suatu pentose (gula berkarbon lima), dan gugus fosfat. (Campbell et al., 2002: 82-83). Zat ini disebut cetak biru kehidupan karena memiliki peranan yang sangat penting, yaitu sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. DNA bisa mengalami denaturasi dan renaturasi. Banyak hal yang mempengaruhi proses tersebut, antara lain suhu yang tinggi, pH ekstrim, kandungan elektrolit Na+ atau K+ dan komposisi basa C-G. (Elrod, 2007: 271) Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim
seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. (Carboni, 2007) Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada masingmasing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. (Sweeney, 2008) II.
BAHAN DAN ALAT III.1.
Bahan
• Buah-buahan
berdaging
tomat,papaya, dll.) • Garam dapur • Detergen cair • Aquadest • Etanol absolute dingin III.2.
Alat
• • Sumpit mie
• Kain kassa • Gelas kimia 2
• Garpu • Pengaduk / spatula • Tabung reaksi dan rak tabung
I.
CARA KERJA
lunak
(pisang,mangga,alpukat,
1. Membersihkan buah lalu mengupas buah. 2. Memotong buah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil lalu melumatkan
(menggerus) buah tersebut di dalam gelas kimia menggunakan garpu. 3. Menambahkan 3 gram garam ke dalam gerusan buah tadi. 4. Menambahkan
cairan
deterjen
ke
dalam
gelas
kimia
dengan
perbandingan 1 : 1 5. Menambahkan 50-100 mL aquades ke dalam gelas kimia, aduk perlahan sampai homogeny, dan didiamkan selama 5-10 menit. 6. Menyaring gerusan buah tadi ke dalam gelas kimia yang baru dengan menggunakan saringan halus 7. Menuangkan hasil saringan buah tadi ke dalam tabung reaksi sampai ± ¼ tabung. 8. Menambahkan etanol absolute dingin secara perlahan ke dalam tabung. 9. Menarik / mengambil massa putih yang terbentuk di dalam tabung
setelah diberi etanol absolute dingin tadi. 10. Mengamati hasil percobaan. I.
HASIL Setelah diekstraksi dan didiamkan selama 15 menit, maka larutan pada
tabung reaksi terlihat membentuk tiga lapisan, yang dapat dilihat pada gambar berikut : Kumpulan DNA
Ethanol
Ekstrak buah
Terlihat adanya tiga lapisan pada tabung, lapisan paling bawah yang berwarna kuning kehijauan ialah ekstrak buah yang masih tersisa setelah disaring, lapisan di tengah ialah ethanol, sedangkan yang paling atas adalah
kumpulan benang-benang DNA berwarna putih. Pada gambar, belum terlihat jelas warna putih pada massa DNA, karena massa putih tersebut baru terlihat pada sekitar menit ke-30 setelah pencampuran ethanol absolute dingin. II.
ANALISIS Pada praktikum kali ini, kita mempelajari cara yang tepat untuk melihat
DNA suatu organisme dengan mengisolasinya dari lokasi awalnya, yaitu di dalam nukleus. Dalam proses isolasi DNA, umumnya terdapat tiga tahapan yang harus dilakukan oleh seorang peneliti, yaitu : 1.
Melisis/menghancurkan sel dengan cara mekanik maupun kimiawi, karena untuk mengekstraksi DNA, dinding sel(jika ada), membran sel, dan membran nukleus(pada eukariot) harus dihancurkan terlebih dahulu sehingga DNA dapat keluar dan terlihat massanya.
2.
Purifikasi(pemurnian larutan). Ketika sel telah lisis, seluruh komponen sel akan bercampur satu sama lain. Sebagian besar proses manipulasi DNA mengharuskan agar DNA terpisah dan bebas dari protein dan RNA. Di laboratorium, peneliti juga akan memperhatikan untuk menginaktivasi enzim internal sel yang dapat mendegradasi/ menghancurkan DNA. Mereka kemungkinan
menggunakan
enzim
pencerna
protein,
pemanasan,
penambahan bahan kimia tertentu atau larutan organik seperti fenol untuk menonaktifkan enzim dan menghilangkan protein dari nukleus. Namun, kita tidak melakukannya pada percobaan ini, karena kita tidak
akan
menggunakan DNA yang diperoleh untuk tujuan eksperimen khusus. 3.
Presipitasi,
yaitu
pemisahan
DNA
dari
larutan,
dengan
cara
mencampurkannya dengan suatu bahan tidak dapat melarutkannya(DNA) sehingga ia dapat memisah/terpresipitasi.( Anonim A, 2005) Sekarang mari kita analisis satu-persatu tahapan percobaan yang telah kita lakukan untuk mengetahui tujuan sebenarnya pelaksanaan seluruh tahapan dalam proses isolasi DNA ini. 1.
Pemilihan bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini ialah irisan daging buah yang lunak, pemilihan buah dengan daging buah yang lunak tak lain ialah untuk mempermudah proses pelumatan, karena dalam praktikum ini kita tidak menggunakan blender sebagai alat untuk
menghaluskan bahan dan hanya menggerusnya dengan bantuan garpu saja. 2.
Penghalusan/pelumatan buah. Sel tumbuhan memiliki sistem proteksi berupa dinding sel dan membran sel Dinding sel tersusun dari polisakarida. Untuk mengisolasi DNA, maka hal pertama yang dilakukan adalah mendegradasi dinding sel yang merupakan struktur paling luar dari sel tumbuhan dengan cara menggerus bagian buah yang dijadikan sampel hingga lumat dan sehalus mungkin. Selain itu, penggerusan juga bertujuan untuk memisahkan sel yang satu dengan lainnya sehingga memberikan hasil yang lebih baik pada proses ekstraksi selanjutnya. (Carboni, 2007)
3.
Penambahan garam.. Untuk mengekstraksi DNA, maka DNA yang terdapat di dalam nukleus perlu diuraikan dari protein-protein lain yang mengikatnya. Penambahan garam, khususnya dengan konsentrasi tinggi (> 1 M) dapat memisahkan nuclear protein (khususnya protein histon sehingga gulungan DNA dapat terurai dan terlihat sebagai gumpalan benang
putih
di
permukaan
larutan)
dan
juga
memisahkan
karbohidrat(polisakarida) yang terkandung dalam esktrak. Penambahan garam juga dapat membantu proses presipitasi DNA. Ion Na+ dari NaCl akan memasuki membran sel secara difusi dan memasuki nukleus melalui pori-pori nukleus. Ion Na+ pada garam dapat mengikat ion fosfat- pada DNA, sehingga molekul-molekul yang memiliki muatan yang sama(negatif) dan bersifat polar kini tidak lagi saling tolak menolak karena tidak lagi bermuatan (netral) atau nonpolar. Proses tersebut mempermudah pemekatan dan pengumpulan massa DNA pada proses presipitasi DNA. (Weising et al., 2005: 90) 4.
Penambahan larutan detergen. Kini DNA di dalam nukleus menjadi terurai. Namun, untuk dapat keluar dari sel, membran sel harus didegradasi terlebih dahulu. Membran sel tersusun atas fosfolipid, protein, glikogen, dan kolesterol. Komponen-komponen membran sel tersebut ada yang bersifat hidrofilik(glikoprotein, protein ekstrinsik, ‘kepala’ fosfolipid) dan hidrofobik(kolesterol, sebagian protein intrinsik, ‘ekor’ fosfolipid) (Kimball, 1983: 89). Oleh karena itulah diperlukan deterjen yang dapat
mendegradasi membran sel melalui mekanisme khusus.
Sisi hidrofilik
pada deterjen akan mengikat sisi protein yang bersifat hidrofilik dan sisi hidrofobik detergen akan mengikat lipid dan sisi hidrofobik protein sehingga membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Peristiwa inilah menyebabkan interaksi polar yang menyatukan membran sel, sehingga membran sel pun terdegradasi/lisis. ( Ilustrasinya dapat dilihat pada gambar 1.1 di bawah ini. Hydrofob part
(Intrinsic protein)
Hydrophylic part
Gambar 1.1 sisi hidrofobik pada molekul detergen akan mengikat sisi hidrofobik protein(dan komponen hidrofobik lain pada membran sel), demikian pula dengan sisi hidrofilik, sehingga terbentuklah lipid-protein-detergen kompleks. (
5.
Genetech Foundation for Biomedical Sciences, 2001)
Penambahan aquades dan pengadukan. Untuk mempercepat proses penghancuran membran sel, maka setelah detergen dituang, perlu dilakukan homogenisasi antara gerusan buah dan larutan detergen. Oleh karena itu, campuran kedua keduanya lalu ditambahkan aquades dan diaduk perlahan. Warna larutan pun berubah, yang tadinya kuning khas warna mangga menjadi hijau kekuningan, tanda bahwalarutan telah homogen.
6.
Penyaringan larutan. Setelah dihomogenkan, maka larutan harus disaring dengan mengunakan kasa. Fungsi proses filtrasi ini ialah untuk mengumpulkan larutan yang kaya akan DNA dan untuk memisahkannya dari sisa-sisa sel dan jaringan lainnya pada buah yang kemudian akan dibuang. Untuk mempermudah proses penyaringan, maka larutan terlebih dahulu didiamkan selama 5-10 menit agar molekul dengan massa terbesar dapat mengendap di dasar.
7.
Penambahan ethanol absolute dingin.
Setelah disaring, larutan
tersebut dituang ke dalam tabung reaksi hingga ¼ tinggi tabung. Ethanol absolute dingin sejumlah 5 mL dituangkan secara perlahan melewati dinding sel agar larutan yang berbagai komponenenya mulai terpisah tidak menyatu kembali. Setelah beberapa saat, maka akan segera terlihat bahwa ethanol berada di atas lapisan atas, sementara filtrat berada di dasar, hal ini terjadi karena ethanol memiliki densitas(kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. Kemudian, setelah diamati selama ± 15-30 menit, terlihat adanya kumpulan benang-benang putih yang melayanglayang ke permukaan tabung reaksi. Kumpulan benang-benang putih tersebut ialah DNA yang terpresipitasi dari filtrat. DNA dapat memisah dari larutan campuran (ethanol+filtrat) karena DNA tidak larut dalam ethanol. (Kalumuck, 2000). Berikut adalah penjelasan atas peristiwa presipitasi DNA : DNA bersifat polar, karena adanya muatan negatif dari gugus rangka fosfatnya. Sifat polar ini, berdasarkan prinsip “like dissolve like” (sejenis terlarut dalam sejenis), membuat DNA larut dalam air yang juga memiliki sifat polar yang tinggi. Sifat polar air dibuktikan dengan tingginya nilai konstanta dielektriknya, yaitu 80,1(pada suhu 20°C), yang berarti bahwa kekuatan listrik antara dua muatan dalam larutan yang mengandung air jauh berkurang jika dibandingkan dengan kekuatan yang terjadi di ruang hampa atau di udara. Daya listrik pada ikatan ion pada Kristal NaCl akan melemah saat terlarut dalam air, sehingga membiarkan ion Na+
yang
dilindungi oleh pelindung hidrasi (hydration shell)tersebar dalam air. Mekanisme yang sama terjadi antara muatan negatif fosfat DNA. Walaupun ion positif juga ada dalam larutan, kekuatan listrik yang relatif lemah mencegahnya untuk membentuk ikatan ion yang stabil dengan fosfat pada DNA dan memisahkannya dari larutan. Ethanol memiliki tingkat polar yang lebih rendah daripada air, konstanta
dielektriknya
adalah
24.3(pada
suhu
25°C).
Artinya,
penambahan ethanol pada larutan akan mengacaukan ‘penyaringan’ muatan oleh air. Jika ethanol dalam jumlah memadai ditambahkan , maka daya tarik antara fosfat dan beberapa ion positif yang terlarut (contohnya
ion Na+ dari NaCl yang telah ditambahkan sebelumnya) menjadi cukup kuat untuk membentuk ikatan ion yang stabil dan mempresipitasikan/ memisahkan DNA. Hal ini umumnya terjadi jika jumlah ethanol telah mencapai
64%
dari
volume
larutan,
dan
mekanisme
tersebut
+
mengharuskan adanya ion positif yang terlarut. Biasanya Na , NH4+, atau Li+ memegang peranan ini, namun karena sebelumnya kita telah menambahkan NaCl pada ekstrak buah, maka kemungkinan Na+ lah yang memegang peranan terbesar dalam proses ini.(Anonim B, 2009) Suhu ethanol yang dingin berperan dalam mempermudah proses pemekatan DNA, semakin dingin suhu ethanol, maka DNA yang mengumpul dan terpresipitasi akan semakin banyak. Walau DNA yang terkumpul sangat banyak, kita tidak akan dapat melihat DNA dalam susunan double helix, walaupun dengan mikroskop elektronik sekalipun, karena susunan double helix DNA hanyalah gambaran mikrograf saja. Pada percoban kali ini, diperlukan waktu 30 menit untuk dapat melihat DNA. Ini disebabkan karena menggunakan buah mangga yang memiliki kadar air yang relatif tinggi. Kadar air dalam buah mempengaruhi waktu yang digunakan dalam presipitasi DNA. Semakin tinggi kadar air dalam buah, semakin lama pula waktu yang diperlukan dalam mempresipitasi DNA.
Ini
disebabkan karena buah yang memiliki kadar air yang banyak, memiliki sel-sel yang lebih sedikit dibanding dengan kadar air yang dikandungnya. Buah yang memiliki kandungan air yang lebih sedikit memiliki jumlah sel yang lebih banyak sehingga DNA yang dihasilkan lebih banyak dan lebih cepat terlihat massanya di permukaan tabung. I.
KESIMPULAN Untuk
mengisolasi
DNA
pada
buah,
diperlukan
langkah-langkah
sistematis, yaitu menghancurkan dinding sel dengan penggerusan bahan, melisiskan membran sel dan membran nukleus dengan pencampuran detergen, serta presipitasi DNA dengan penambahan ethanol absolut dingin dan bantuan ion Na+ dari NaCl (Kristal garam). DNA akan terlihat sebagai massa benangbenang putih yang perlahan naik ke permukaan tabung. Kadar air pada buah mempengaruhi waktu dan banyaknya DNA yang terpresipitasi. Semakin banyak
kadar air maka semakin lama waktu yang dibutuhkan, dan jumlah DNA yang terpresipitasi semakin sedikit.
