i
EKSPLORASI BAKTERI DAN CENDAWAN YANG BERASOSIASI DENGAN BUSUK BASAH PADA BUAH PEPAYA (Carica papaya L.)
YENI RIYANI SOLICHAH
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011
i
ABSTRAK
YENI RIYANI SOLICHAH. Eksplorasi bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah pada buah pepaya (Carica papaya L.), dibimbing oleh IVONNE OLEY SUMARAUW. Penelitian ini bertujuan mengetahui beberapa bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah pada buah pepaya. Tanaman pepaya dikenal sebagai tanaman multiguna, karena hampir seluruh bagian tanaman mulai dari akar hingga buah bermanfaat bagi manusia maupun hewan. Penelitian mengenai penyakit tanaman pepaya sampai saat ini masih sedikit. Selain pada batang, daun dan perakaran, bagian yang dapat terserang penyakit adalah buah. Penelitian diawali dengan mengambil contoh buah yang bergejala busuk basah, kemudian mengisolasinya untuk mendapatkan isolat bakteri dan cendawan. Identifikasi bakteri dilakukan dengan beberapa pengujian yang meliputi: uji Gram, hipersensitivitas pada daun tembakau, fluoresensi, pembusukan kentang, oksidatif/fermentatif, uji pertumbuhan pada media TZC, pertumbuhan pada media YDCA, dan pembentukan endospora. Identifikasi cendawan dilakukan dari hasil isolasi buah yang bergejala dan pengamatan langsung dari buah tersebut. Hasil isolasi menunjukkan bahwa terdapat beberapa bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah pada buah pepaya. Bakteri yang berhasil diidentifikasi adalah Bacillus sp. yang bersifat patogen maupun nonpatogen, bakteri Pantoea sp. yang bersifat nonpatogen, dan satu bakteri yang diduga Ralstonia sp. Cendawan yang ditemukan dari hasil isolasi dan pengamatan langsung dari buah yang bergejala adalah Aspergillus niger, Colletotrichum sp., Thielaviopsis sp., Mucor sp., Penicillium sp., dan Fusarium sp.
ii
EKSPLORASI BAKTERI DAN CENDAWAN YANG BERASOSIASI DENGAN BUSUK BASAH PADA BUAH PEPAYA (Carica papaya L.)
YENI RIYANI SOLICHAH A34061669
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011
iii
Judul Skripsi Nama Mahasiswa
: Eksplorasi Bakteri dan Cendawan yang Berasosiasi dengan Busuk Basah pada Buah Pepaya (Carica papaya L.) : Yeni Riyani Solichah
NRP
: A34061669
Menyetujui Dosen Pembimbing
Ir. Ivonne Oley Sumarauw, M.Si. NIP. 19490208 197603 2 002
Mengetahui Ketua Departemen Proteksi Tanaman
Dr. Ir. Dadang, M.Sc. NIP. 19640204 199002 1 002
Tanggal lulus:
iv
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cirebon, tanggal 12 Agustustus 1988 dari pasangan Bapak Abdul Azis Muslim dan Ibu Siti Maryam. Tahun 2006 penulis menamatkan Sekolah Menengah Umun di Pondok Pesantren Husnul Khotimah Kuningan. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Penulis memilih jurusan Proteksi Tanaman, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selama kuliah penulis memiliki pengalaman organisasi sebagai pengurus HIMASITA Divisi Keprofesian (2007-2008). Penulis pernah mengikuti magang di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor, serta pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dengan judul ”Tanaman Formulasi Bacillus subtilis pada Tepung Singkong sebagai Probiotik Tanaman” pada tahun 2009. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Hama Penyakit Benih (HPB D3).
v
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas karunia-NYA penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi sebagai salah satu syarat dalam memperoleh gelar sarjana Pertanian. Shalawat serta salam tercurah pula kepada Nabi Muhammad SAW, keluarganya, para sahabatnya, dan umat pengikutnya sampai hari kiamat. Teriring doa semoga Allah meridhoi karya ini. Penulis menyampaikan terima kasih sebesar-besarnya kepada Ir. Ivonne Oley Sumarauw, M.Si sebagai dosen pembimbing dan arahan kepada Penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M.Si selaku dosen penguji tamu yang telah memberi saran pada skripsi ini, serta Dr. Ir. Giyanto, M.Si selaku dosen pembimbing akademik selama masa perkuliahan. Penulis menyampaikan terima kasih kepada orang tua, Papa dan Mama tercinta, Mba Irma Elfira serta keluarga, Kak Taufik Gozali, Novi Pamela Sari, dan Muhammad Anwar Habib. Terima kasih kepada teman-teman di Pondok Malea Atas, anggota Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, serta keluarga besar PTN angkatan 43 atas semangat, kasih sayang, dan doa yang telah diberikan.
Bogor, Januari 2011
Yeni Riyani Solichah
vi
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
x
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
Latar Belakang ...................................................................................... Tujuan Penelitian ................................................................................... Manfaat Penelitian ................................................................................. Hipotesis................................................................................................
1 2 2 2
TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................
3
Arti Penting Tanaman Pepaya ................................................................. Agroekologi Tanaman Pepaya ................................................................ Patogen yang Terdapat pada Tanaman Pepaya ........................................
3 3 4
BAHAN DAN METODE ...............................................................................
5
Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................. Bahan dan Alat ....................................................................................... Metode Penelititian ................................................................................. Survei Buah Pepaya Sakit ....................................................................... Isolasi dari Buah Bergejala Busuk Basah ................................................ Identifikasi Bakteri ................................................................................. Uji Gram ..................................................................................... Uji Hipersensitivitas ..................................................................... Uji Fluoresensi ............................................................................ Uji Pembusukan Kentang ............................................................ Uji Oksidatif/Fermentatif ............................................................ Uji Tumbuh pada Media TZC ..................................................... Uji Tumbuh pada Media YDCA .................................................. Uji Pembentukan Endospora ....................................................... Identifikasi Cendawan ............................................................................
5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 8 9
HASIL DAN PEMBAHASAN..........................................................................
10
Survei Buah Sakit ................................................................................... Isolasi dari Buah Bergejala Busuk Basah ................................................ Identifikasi Bakteri ................................................................................. Uji Gram ..................................................................................... Uji Hipersensitivitas .................................................................... Uji Fluoresensi ............................................................................ Uji Pembusukan Kentang ............................................................
10 11 11 11 12 13 13
vii
Uji Oksidatif/Fermentatif ............................................................ Uji Tumbuh pada Media TZC ..................................................... Uji Tumbuh pada Media YDCA .................................................. Uji Pembentukan Endospora ....................................................... Identifikasi Cendawan ............................................................................
14 14 15 16 17
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................... 20 Kesimpulan ............................................................................................. 20 Saran ................................................................................................... 20 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 21
viii
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Hasil identifikasi bakteri yang berasosiasi dengan busuk basah buah pepaya……………………………………………………………...... 17 2. Komposisi bahan media King’s B 100% ................................................... 24 3. Komposisi bahan media LB (Luria Broth)................................................. 24 4. Komposisi bahan media NA (Nutrient Agar) ............................................ 24 5. Komposisi bahan media Oksidatif/Fermentatif .......................................... 24 6. Komposisi bahan media PDA (Potato Dextrose Agar) .............................. 24 7. Komposisi bahan media Uji Gram ............................................................. 25 8. Komposisi bahan media TZC Agar ........................................................... 25 9. Komposisi bahan media Yeast Extract Dextrose CaCO3 Agar ................... 25 10. Komposisi larutan PBS (Phospate Buffer Saline) ...................................... 25
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Sampel buah bergejala busuk basah yang masih berada di pohon .............. 10 2. Sampel buah yang bergejala busuk basah .................................................. 10 3. Bagian buah yang diisolasi antara daerah yang sehat dan sakit .................. 11 4. Reaksi bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif ............................... 12 5. Reaksi positif dan kontrol uji hipersensitivitas pada daun tembakau .......... 12 6. Reaksi negatif dan reaksi positif pada media King’s B .............................. 13 7. Reaksi negatif uji pembusukan pada kentang ............................................. 14 8. Kontrol, reaksi oksidatif, dan reaksi fermentatif ........................................ 14 9. Bakteri virulen dan avirulen ...................................................................... 15 10. Isolat bakteri berwarna kuning dan isolat bakteri berwarna kream ............. 16 11. Bentuk cendawan Aspergillus niger .......................................................... 17 12. Konidia Thielaviopsis sp. dan Fusarium sp. (mikro (a) dan makrokonidia (b)) ..................................................................................... 18 13. Konidia Colletotrichum sp. (a) dan Mucor sp.(b) ....................................... 19
x
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Komposisi bahan untuk isolasi dan identifikasi cendawan dan bakteri (Schaad et al. 2001 dan Brown et al. 1980) .................................................... 24 2. Kunci Identifikasi Bakteri (Schaad et al. 2001) ............................................ 26 3. Kunci Identifikasi Bakteri (Brown et al. 1980) .............................................. 27 4. Kunci Identifikasi Cendawan (Watanabe 1993) ............................................. 29
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki keanekaragaman produk pertanian. Hasil produksi pertanian di Indonesia antara lain buah-buahan, sayuran, tanaman pangan, dan lain-lain. Komoditas buah-buahan merupakan penyumbang keanekaragaman dan kecukupan gizi bagi masyarakat Indonesia. Buah-buahan sangat penting bagi kesehatan karena mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, serat dan gula (Rukmana 2008). Salah satu jenis buah-buahan yang memiliki kandungan gizi yang baik adalah pepaya. Pepaya banyak mengandung vitamin A dan C yang baik untuk kesehatan tubuh. Vitamin C yang terkandung dalam buah pepaya lebih tinggi dibandingkan dengan buah jeruk, mangga, dan belimbing (Ashari 2006). Tanaman pepaya dikenal sebagai tanaman multiguna, karena hampir seluruh bagian tanaman mulai dari akar hingga buah bermanfaat bagi manusia maupun hewan. Tanaman pepaya dapat dimanfaatkan sebagai makanan, minuman, obat, kecantikan maupun sebagai pakan ternak (Semangun 2004). Indonesia merupakan Negara peringkat kelima sebagai penghasil pepaya terbesar setelah Brazil, Meksiko, Nigeria, dan India (FAO 2007). Di Indonesia terdapat banyak jenis pepaya baik yang berdaging buah kuning maupun yang berwarna jingga (Semangun 2006). Penelitian mengenai tanaman pepaya saat ini masih sedikit khususnya tentang penyakit. Untuk mengetahui ciri-ciri tanaman yang dapat dikatakan sakit antara lain dengan melihat gejala dan adanya tanda yang ditimbulkan oleh organisme penyebab penyakit. Gejala ataupun tanda dapat bermanfaat dalam proses pengidentifikasian penyebab penyakit yang muncul (Yudiarti 2007). Menurut hasil penelitian yang dilakukan oleh Widianti (2009) salah satu penyakit yang menyerang tanaman pepaya adalah penyakit busuk basah yang diduga disebabkan oleh bakteri Erwinia sp. dan Pseudomonas sp. Bakteri Erwinia dapat menyebabkan terjadinya busuk lunak, nekrosis, dan kelayuan pada tanaman. Bakteri ini dapat merusak lamella tengah sel-sel tumbuhan inang karena memiliki enzim protopektinase. Menurut penelitian Ferfinia (2010) mikroorganisme
2
rizosfer yang terdapat pada tanaman pepaya yang terinfeksi penyakit busuk basah terdiri atas bakteri Pseudomonas sp., Pantoea sp., Erwinia sp., Bacillus sp., serta dari golongan cendawan Trichoderma sp., Penicillium sp., dan Aspergillus sp. Selain pada batang dan perakaran, bagian yang dapat terserang penyakit adalah bagian buah. Penyakit-penyakit pada buah yang banyak ditemukan adalah busuk coklat, busuk kering, busuk hitam, antraknosa, dan busuk lunak (Semangun 2004). Namun gejala busuk basah pada buah pepaya di kebun percobaan Leuwikopo berbeda dengan gejala penyakit-penyakit tersebut. Gejala awal yang ditemukan berupa bercak kebasahan di permukaan buah yang kemudian berkembang keseluruh permukaan buah dan buah terasa lunak. Sampai saat ini belum banyak pustaka yang membahas tentang gejala kebasahan yang terjadi pada buah pepaya.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengetahui bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah buah pepaya.
Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah pengetahuan beberapa bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah buah pepaya yang kemungkinan merupakan patogen.
Hipotesis Terdapat berbagai macam bakteri dan cendawan yang berasosiasi dengan busuk basah buah pepaya.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Arti Penting Tanaman Pepaya Salah satu tanaman yang mudah dibudidayakan di berbagai daerah khususnya di Indonesia adalah pepaya. Buah pepaya juga merupakan salah satu buah tropis yang mempunyai nilai ekonomis yang cukup tinggi dan banyak digemari oleh masyarakat Indonesia. Pengembangan pepaya sebagai komoditas hortikultura cukup prospektif karena jumlah permintaan pepaya cenderung meningkat (Kalie M & Baga 1999). Pepaya (Carica papaya L.) merupakan
tanaman yang berasal dari
Amerika tropis. Pusat penyebaran tanaman diduga berada di daerah sekitar Meksiko bagian selatan dan Nikaragua. Abad ke-16 tanaman ini menyebar ke berbagai benua dan negara, termasuk ke Benua Afrika dan Asia yang dibawa oleh pelayar-pelayar Portugis. Pepaya merupakan tanaman buah dari famili Caricaceae. Buah pepaya tergolong buah yang digemari oleh hampir seluruh masyarakat Indonesia. Daging buah pepaya berwarna merah atau kuning dan terasa lunak. Buah pepaya merupakan buah bermutu dan bergizi tinggi (Sastrahidayat 1991). Tanaman pepaya dapat dimanfaatkan untuk pengobatan antara lain bagian akar untuk menyembuhkan sakit ginjal, tekanan darah tinggi, dan gangguan kandung kemih. Daun pepaya memiliki rasa pahit, namun rasa pahit tersebut dapat berkhasiat bagi kesehatan (Verheij & Coronel 1997). Daun pepaya dapat berkhasiat menyembuhkan penyakit malaria, kejang perut, sakit panas, menambah nafsu makan, dan menyembuhkan penyakit beri-beri (Agromedia 2009). Getah pepaya dapat dimanfaatkan bagi manusia. Menurut Sunarjono (2005) getah yang terkandung dalam pepaya mengandung papain yang bersifat proteolitik (merombak protein), dapat digunakan sebagai pelunak daging. Papain membantu proses pencernaan makanan secara baik (Suryowihardi 2010).
Agroekologi Tanaman Pepaya Tanaman pepaya dapat tumbuh di seluruh daerah tropis dan substropis umumnya dapat tumbuh optimal di ketinggian 200-500 m dpl dengan suhu berkisar antara 25-30 0C (Sastrahidayat 1991). Tanaman pepaya merupakan
4
tanaman yang mirip dengan pohon, bentuk tanaman ini pada umumnya tidak bercabang, namun terdapat pula yang bercabang karena terjadi pelukaan. Tanaman tersebut mengandung getah putih pada seluruh bagiannya. Daundaunnya tersusun spiral, berkelompok dekat dengan ujung batangnya, tangkai daunnya mencapai panjang 1 m, berongga, lembaran daunnya berbentuk menjari (Verheij & Coronel 1997).
Patogen yang Terdapat pada Tanaman Pepaya Penyakit yang sering merugikan tanaman pepaya adalah penyakit yang disebabkan oleh cendawan, virus mosaik, bakteri dan nematoda (Sunarjono 2005). Penyakit-penyakit yang menyerang tanaman pepaya antara lain adalah busuk akar dan pangkal batang yang disebabkan Phytophthora palmivora (Butl.) Butl., bercak daun Corynespora yang disebabkan Corynespora cassiicola (Berk. et. Curt.) Wei., bercak daun Cercospora yang disebabkan Cercospora papayae Hansf., penyakit tepung yang disebabkan Oidium caricae Noack, penyakit busuk basah yang disebabkan bakteri Erwinia papayae (Rant) Magrou, bercak cicin yang disebabkan virus Papaya ringspot virus, mosaik yang disebabkan Papaya mosaic
virus,
antraknosa
yang
disebabkan
cendawan
Colletotrichum
gloeosporioides, dan busuk Rhizopus yang disebabkan Rhizopus stolonifer (Semangun 2004). Penyakit yang banyak ditemukan pada buah pepaya adalah busuk coklat oleh Fusarium sp. dan Phytophthora sp., antraknosa oleh Colletotrichum gloeosporioides., busuk hitam oleh Rhizopus sp., busuk kering oleh Phoma sp., dan busuk lunak oleh Botryodiplodia sp. (Sri Widadi dalam Semangun 2004). Menurut Martoredjo (2009) beberapa penyakit lain yang menyerang buah pepaya adalah bercak buah Alternaria (Alternaria alternata), penyakit bercak Guignardia (Guignardia sp.), dan penyakit busuk buah cat ungu (Erwinia herbicola).
5
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
dilaksanakan
di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan,
Departemen Proteksi Tanaman dan Kebun Percobaan Leuwikopo, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan April sampai Agustus 2010.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah buah pepaya sakit yang bergejala busuk basah varietas IPB 6, tanaman tembakau, dan umbi kentang. Media biakan yang digunakan Nutrient Agar (NA), Potato Dectrose Agar (PDA), dan Luria Broth (LB). Media yang digunakan untuk pengujian adalah media King’s B, Oksidatif/Fermentatif (O/F), Trypenil Tetrazolium Chloride (TZC), Yeast Extract Dectrose CaCO3 Agar (YDCA), Phospate Buffer Saline (PBS), KOH 3%, alkohol 70%, Malachite green 5% , Safranin 0,5%, parafin oil, akuades, kapas, silk dan tissu. Alat-alat yang digunakan: jarum suntik, autoklaf, bunsen, cawan petri, gelas bite, gelas obyek, gelas ukur, lup inokulasi, kantong plastik tahan panas, labu erlenmeyer, mikroskop cahaya, lampu UV, pipet mikrometer, pisau, dan inkubator bergoyang. Metode Penelitian Survei Buah Pepaya Sakit Survei buah pepaya dilakukan pada buah pepaya yang menimbulkan gejala busuk basah. Buah pepaya tersebut diamati kemudian dibawa ke Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan untuk diidentifikasi bakteri dan cendawan yang berasosiasi pada buah yang bergejala. Survei dilakukan beberapa kali, namun pengambilan sampel dilakukan sebanyak dua kali.
6
Isolasi Buah Bergejala Busuk Basah Sampel buah pepaya yang menimbulkan gejala busuk basah diisolasi dengan menggunakan pengenceran berseri. Bagian yang diambil untuk diisolasi adalah bagian antara sakit dan sehat. Bagian tersebut dibersihkan dengan air steril dan dimasukkan ke erlemeyer yang berisi 100 ml air steril dan PBS (Phospate Buffer Saline) dengan perbandingan 1:1 dan dishaker 150 rpm selama semalam (over night). Larutan PBS (Phospate Buffer Saline) merupakan larutan penyangga yang dapat mempertahankan pH agar tetap netral atau berada pada pH 7. Sebagian besar bakteri tumbuh dengan baik pada media dengan pH 7 (Hadioetomo 1990). Pengenceran berseri dilakukan terhadap suspensi buah hingga pengenceran 10-6. Setiap 0,1 ml suspensi ditumbuhkan dengan metode sebar menggunakan gelas bite pada media Nutrient Agar (NA) dan Potato Dextrose Agar (PDA) kemudian diidentifikasi bakteri dan cendawan yang muncul.
Identifikasi Bakteri Bakteri yang muncul dari hasil isolasi kemudian dilakukan identifikasi berdasarkan kunci identifikasi Schaad et al. (2001) dan Brown et al. (1980) dengan beberapa pengujian yaitu uji Gram, hipersensitivitas pada daun tembakau, fluoresensi pada media King’s B, pembusukan kentang, uji Oksidatif/fermentatif, uji pertumbuhan pada media Yeast Extract Dextrose CaCO3 Agar (YDCA), pertumbuhan pada media Trypenil Tetrazolium Chloride (TZC), dan uji pembentukan endospora. Uji Gram Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui reaksi Gram isolat bakteri yang diuji. Isolat bakteri diambil dengan menggunakan lup inokulasi dan diletakkan pada gelas obyek yang telah ditetesi KOH 3% lalu dicampurkan dan diamati. Apabila terbentuk lendir dan terasa lengket ketika jarum inokulasi diangkat maka hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri golongan Gram negatif dan sebaliknya jika tidak terbentuk lendir dan tidak lengket maka bakteri tersebut adalah bakteri golongan Gram positif.
7
Uji Hipersensitivitas Uji hipersensitivitas pada daun tembakau bertujuan mengetahui sifat patogenik dari bakteri uji. Isolat bakteri yang diuji dibiakan pada 5 ml media LB (Luria Broth) sehingga menjadi suspensi bakteri, dishaker 100 rpm selama 20 jam dan diinokulasikan pada daun tembakau dengan cara disuntikan pada permukaan bawah daun sampai terlihat agak kebasahan. Apabila setelah 24-48 jam menunjukkan gejala nekrosis pada bagian daun tembakau tersebut, maka reaksi tersebut adalah positif, dan sebaliknya jika tidak menunjukan gejala maka reaksi tersebut adalah negatif. Kontrol dengan menggunakan media LB tanpa diberi bakteri.
Uji Fluoresensi Pengujian Isolat bakteri yang diremajakan pada media NA diambil dengan menggunakan jarum inokulasi lalu digoreskan pada media King’s B dan diinkubasi selama 24-48 jam. Pengamatan dilakukan di bawah sinar Ultra Violet (UV). Bakteri yang mengeluarkan warna hijau-kebiruan dan berpendar merupakan bakteri Pseudomonas dari golongan “fluorescent”. Pengujian ini bertujuan untuk membedakan bakteri Pseudomonas dengan bakteri yang lain.
Uji Pembusukan Kentang Bahan yang digunakan dalam pengujian ini adalah umbi kentang yang mentah. Alat-alat yang digunakan disterilisasi dengan alkohol 70% untuk mengurangi kontaminasi. Umbi kentang dikupas, dicuci dengan air bersih, dan diiris, selanjutnya irisan kentang tersebut diletakkan di dalam cawan steril yang telah dialasi dengan kertas saring yang steril dan telah dilembabkan. Biakan bakteri digoreskan di atas permukaan kentang, sebagai kontrol irisan kentang tidak diberi biakan bakteri. Reaksi positif ditunjukan dengan adanya pembusukan pada kentang dan terdapat lendir setelah diinkubasi selama 24-48 jam.
8
Uji Oksidatif/Fermentatif Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui sifat aerob dan anaerob dari bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media oksidatif/fermentatif (pH 7.2). Masing-masing bakteri diinokulasi pada 2 tabung yang berisi media O/F dengan cara ditusukkan dan diberi glukosa 5% sebanyak 1 ml. Salah satu tabung reaksi diberi perlakuan dengan menambahkan parafin oil steril sebanyak 1 ml sedangkan tabung lainnya tidak ditambahkan parafin oil. Kontrol pada pengujian ini berupa media O/F yang tidak diberi perlakuan bakteri. Apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada kedua media baik yang ditambahkan dan tidak ditambahkan parafin oil, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat fermentatif. Sebaliknya jika terjadi perubahan warna menjadi kuning hanya pada tabung yang tidak diberi parafin oil, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat oksidatif.
Uji Tumbuh pada Media TZC Isolat bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada media TZC yang telah ditambahkan 2,3,5 Tryphenil Tetrazolium Chloride 1% (b/v) dengan cara menggoreskan bakteri pada media. Media ini bertujuan untuk mengetahui bakteri uji bersifat avirulen atau virulen.
Uji Tumbuh pada Media YDCA Pengujian ini bertujuan membedakan bakteri Erwinia sp. dan Pantoea sp. Isolat bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada media YDCA dengan cara menggoreskan bakteri pada media. Pengamatan dilakukan setelah inkubasi 24-48 jam, dengan melihat warna koloni yang terbentuk yaitu warna putih atau kuning pada media YDCA. Apabila bakteri menunjukkan warna kuning maka reaksi tersebut adalah positif.
Uji Pembentukan Endospora Pengujian pembentukan endospora dilakukan pada isolat bakteri yang bersifat Gram positif baik anerob maupun aerob. Pengujian ini dilakukan untuk
9
mengetahui keberadaan endospora pada sel bakteri. Satu lup suspensi bakteri dicampurkan dengan akuades steril, ditetesikan pada gelas obyek dan dikeringanginkan, lalu ditetesi dengan malachite green 5% dan didiamkan selama 10 menit hingga mengering. Gelas obyek tersebut dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan kembali, selanjutnya diteteskan larutan safranin 0,5% diamkan selama 15 detik, lalu dibilas dengan air dan dikeringanginkan di atas bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya, sel bakteri terlihat berwarna merah. Identifikasi Cendawan Identifikasi cendawan dilakukan dengan mengambil cendawan yang tumbuh pada media PDA hasil isolasi atau cendawan yang diperoleh langsung pada buah pepaya yang bergejala. Cendawan yang telah diperoleh dibuat preparat slide pada gelas obyek. Identifikasi cendawan dilakukan dengan pengamatan di bawah mikroskop cahaya dan berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Watanabe (1993) dan Domsch et al. (1993).
10
HASIL DAN PEMBAHASAN
Survei Buah Sakit Survei dilakukan di kebun percobaan Leuwikopo, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, di lahan ini terdapat 69 tanaman pepaya. Kondisi lahan tidak terawat karena banyak terdapat gulma di sekitar area pertanaman. Hasil survei menunjukkan bahwa buah pepaya IPB 6 yang bergejala busuk basah ditandai dengan bercak kebasahan yang melebar di sekitar buah dan buah terasa lunak saat dipegang. Namun, buah yang bergejala busuk buah tidak terlalu banyak ditemukan. Menurut penelitian Widianti (2009) tanaman pepaya IPB 6 lebih tahan terhadap penyakit busuk basah.
Gambar 1. Sampel buah bergejala busuk basah yang masih berada di pohon
Gambar 2. Sampel buah yang bergejala
11
Isolasi Buah Bergejala Busuk Basah
Gambar 3. Bagian buah yang diisolasi antara daerah yang sehat dan sakit
Hasil isolasi dari buah pepaya bergejala busuk basah yang ditumbuhkan pada media PDA dan NA diperoleh enam jenis bakteri sebagai berikut: bakteri (A) berwarna putih dengan bentuk bulat dengan tepian tidak beraturan, elevasi timbul; bakteri (B) berwarna kekuningan dengan bentuk bulat; elevasi cembung; dan tepian tak beraturan, bakteri (C) berwarna putih bening bentuk bulat; dengan tepian licin; dan elevasi cembung, bakteri (D) berwarna putih bentuk bulat dengan tepian tak beraturan; elevasi cembung, bakteri (E) berwarna kekuningan dengan bentuk bulat; tepian tak beraturan; elevasi cembung; dan bakteri (F) berwarna kuning dengan bentuk bulat; tepian tak beraturan; elevasi cembung. Cendawan yang tumbuh pada media PDA memiliki meselium berwarna hitam.
Identifikasi Bakteri Uji Gram Hasil isolasi bakteri yang berasal dari buah bergejala busuk basah diperoleh enam macam isolat bakteri. Berdasarkan pengujian dua isolat menunjukkan bakteri Gram negatif, sedangkan empat bakteri lain menunjukkan Gram positif. Bakteri Gram negatif ditandai dengan adanya lendir dan terasa lengket ketika jarum inokulasi diangkat, dan bakteri Gram positif tidak terbentuknya lendir. Menurut Schaad (2001) bakteri Gram negatif mempunyai dinding sel yang lebih tipis dibandingkan dengan bakteri Gram positif sehingga ketika dicampur KOH 3% lup inokulasi akan terasa lengket karena bakteri
12
menghasilkan lendir. Larutan KOH 3% memiliki viskositas lebih tinggi dibandingkan dengan sel bakteri sehingga cairan dari dalam sel akan keluar seperti yang terjadi pada bakteri Gram negatif (Schaad 2001).
Gambar 4. Reaksi Bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif
Uji Hipersensitivitas Berdasarkan pengamatan dan pengujian dari semua bakteri yang didapat baik bakteri yang bersifat Gram negatif maupun bakteri yang bersifat Gram positif, dua bakteri Gram positif menunjukkan reaksi positif, sedangkan empat isolat menunjukkan reaksi negatif. Reaksi positif ditandai dengan menimbulkan gejala nekrosis pada daun tembakau. Kontrol pengujian dilakukan tanpa menggunakan bakteri. Bakteri yang dapat menunjukkan reaksi positif dengan munculnya gejala nekrosis pada daun tembakau yang diinokulasi bakteri uji merupakan bakteri yang bersifat patogen (Lelliot & Stead 1997).
Gambar 5. Reaksi positif dan kontrol uji hipersensitif pada daun tembakau
13
Uji Fluoresensi Berdasarkan hasil pengujian terhadap isolat bakteri, semua isolat bakteri yang diuji tidak mengeluarkan pigmen “fluorescent” ketika diamati di bawah sinar ultraviolet. Berdasarkan uji ini maka isolat yang diperoleh bukan merupakan bakteri Pseudomonas sp, karena bakteri Pseudomonas sp. akan menunjukkan warna kebiruan pada media ketika diuji di bawah sinar UV (Kiewnick dan Sands 2001).
Gambar 6. Reaksi negatif dan reaksi positif pada media King’s B
Uji Pembusukan Kentang Semua isolat bakteri yang digoreskan pada permukaan umbi kentang, menunjukkan reaksi negatif. Reaksi negatif yang terjadi pada pengujian umbi kentang ditandai dengan tidak membusuknya umbi dan tidak terbentuknya lendir pada umbi. Walaupun pada pengujian hipersensitivitas terjadi reaksi positif dengan munculnya gejala nekrosis pada daun tembakau, hal ini menunjukkan bahwa tidak semua bakteri yang bersifat patogen pada pengujian pembusukan kentang. Menurut Kiewnick dan Sand (2001) bakteri yang mempunyai enzim pektolitik yang dapat merusak umbi kentang. Salah satu contoh bakteri yang tidak merusak permukaan umbi kentang adalah Bacillus sp.
14
Gambar 7. Reaksi negatif uji pembusukan pada kentang
Uji Oksidatif/Fermentatif Bedasarkan uji oksidatif/fermentatif tiga isolat bakteri menunjukkan reaksi fermentatif atau bakteri anaerob (dapat tumbuh tanpa adanya oksigen) dan tiga isolat bakteri menunjukkan reaksi oksidatif atau bakteri aerob (dapat tumbuh dengan adanya oksigen). Bakteri fermentatif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi kuning pada kedua tabung baik pada tabung yang diberi parafin oil maupun yang tidak, sedangkan bakteri oksidatif mengalami perubahan warna menjadi kuning hanya pada tabung yang tidak diberi parafin oil (Kerr 1980). Perlakuan kontrol tidak mengalami perubahan warna baik pada tabung yang diberi parafin oil maupun tabung yang tidak diberi parafin oil.
Gambar 8. Kontrol, reaksi oksidatif, dan reaksi fermentatif
Uji Tumbuh pada Media TZC Berdasarkan pengujian pada media TZC dari enam isolat bakteri yang diujikan, satu isolat bakteri termasuk bakteri virulen ditandai dengan bentuk
15
koloni yang agak membesar, berlendir, berwarna merah dibagian tengahnya dengan tepian putih. Menurut Kerr (1980) koloni bakteri Ralstonia solanacearum merupakan koloni virulen dengan bentuk agak membesar, berlendir, tepian putih, dan bagian tengah berwarna pink sampai merah orange. Media TZC merupakan media selektif yang dapat membedakan antara bakteri avirulen dengan bakteri virulen.
Gambar 9. Bakteri virulen dan avirulen
Uji Tumbuh pada Media YDCA Berdasarkan hasil isolasi dua isolat yang bersifat fermentatif menunjukkan warna kuning pada media NA, satu isolat menunjukkan warna kuning pada media YDCA dan isolat yang lain berwarna krem. Media YDCA merupakan media yang dapat membedakan pertumbuhan bakteri Erwinia sp. dengan bakteri Pantoea sp. Bakteri Pantoea sp. menunjukkan warna kuning pada media YDCA karena bakteri ini mempunyai pigmen warna kuning saat ditumbuhkan pada media YDCA, sehingga satu isolat tersebut diidentifikasi sebagai bakteri Pantoea sp. (Schaad 2001).
16
Gambar 10. Isolat bakteri berwarna kuning dan isolat bakteri berwarna kream Bakteri Pantoea sp. merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang, bersifat anaerob fakultatif. Kelompok bakteri ini dapat dibedakan dengan kelompok bakteri Erwinia sp. dengan melihat produksi pigmen berwarna kuning yang dihasilkan oleh kedua bakteri tersebut. Bakteri Pantoea sp. menghasilkan pigmen berwarna kuning dibandingkan dengan bakteri Erwinia sp. Faktor lain yang dapat membedakan antara kedua bakteri tersebut adalah bakteri Pantoea sp. tidak dapat mendegradasi pektat dan tidak memproduksi urease (Coplin & Kado dalam Schaad 2001). Uji Pembentukan Endospora Berdasarkan hasil pengujian terhadap empat isolat bakteri yang bersifat Gram positif dan bersifat aerob maupun anaerob, semua isolat bakteri membentuk endospora. Spora bakteri berwarna hijau kebiruan pada bagian ujung sel yang terlihat di bawah mikroskop. Bakteri yang membentuk endospora yang bersifat aerob dan anaerob tersebut adalah bakteri Bacillus sp. baik yang bersifat patogen maupun yang non patogen. Bakteri Bacillus sp. merupakan salah satu bakteri yang memilki spora (Chun dan Vidader dalam Schaad 2001). Bakteri Bacillus sp. merupakan bakteri Gram-positif yang bersifat aerob atau anerob fakultatif dan membentuk endospora sebagai alat pertahanan pada kondisi yang tidak menguntungkan (Chun dan Vidaver dalam Schaad 2001). Endospora dibentuk di dalam sel, bakteri ini diduga sebagai bakteri yang menghasilkan antibiotik, dan kebanyakan bersifat saprofit di dalam tanah.
17
Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri yang berasosiasi dengan busuk basah pada buah pepaya No.
Pengujian
A
B
C
D
E
F
1. 2. 3.
Uji Gram Uji Hipersensitivitas Uji Tumbuh pada Media YDCA Uji Tumbuh pada Media TZC
+ +
+ -
-
+ +
+ -
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
O
F
O
O
F
F
+
+
-
+
+
-
B. sp.
B. sp.
R. sp.
B. sp.
B. sp.
P. sp.
4. 5. 6. 7. 8.
Uji Pembusukan Kentang Uji Fluoresensi Uji Oksidatif/Fermentatif Uji Pembentukan Endospora Kemungkinan Bakteri
Keterangan: B. sp. = Bacillus sp., P. sp. = Pantoea sp.
Identifikasi Cendawan Selain bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi yang berasal dari buah pepaya bergejala busuk basah dan pengamatan langsung dari buah tersebut, beberapa cendawan juga diperoleh antara lain adalah Aspergillus niger, Colletotrichum sp., Fusarium sp., Thielaviopsis sp., Penicillium sp., dan Mucor sp.
Gambar 11. Bentuk cendawan Aspergillus niger
18
Bentuk konidia dari A. niger adalah berbentuk bulat kecil berwarna kecoklatan dengan ujung konidiofora berbentuk bulat. Cendawan A. niger tumbuh pada media PDA dengan miselium berwarna hitam. Cendawan Aspergillus sp. merupakan cendawan dari kelas Deuteromycetes yang sebagian besar bersifat saprofitik. Cendawan Aspergillus dapat menyebabkan infeksi, alergi atau keracunan baik pada tumbuhan, hewan, bahkan pada manusia (Anonim 2003).
Gambar 12. Konidia Thielaviopsis sp. dan Fusarium sp. (mikro (a) dan makroonidia (b))
Sementara bentuk konidia yang diperoleh dari cendawan Fusarium sp. berbentuk seperti bulan sabit, bersepta, dan hialin, memiliki mikrokonidia dan makrokonidia (Gambar a dan b). Koloni cendawan Fusarium sp. biasanya cepat tumbuh, dengan warna pucat atau berwarna cerah (tergantung pada spesies). Makro dan mikro konidia hialin, berbentuk sabit, bersepta, sebagian besar dengan sel apikal memanjang (Ellis D 2010). Konidiofor cendawan Thielaviopsis berwarna coklat pucat, sedangkan konidia hialin atau coklat dan bersel satu. Cendawan Thielaviopsis sp. merupakan cendawan yang bersifat saprofit fakultatif, bersifat parasit pada tanaman kurma, tebu, nenas, dan lain-lain. Konidiofor berada pada cabang-cabang lateral yang pendek. Konidia berbentuk seperti batang, berwarna gelap, dan memiliki klamidospora yang berdinding tebal (Streets 1972).
19
b
a
Gambar 13. Konidia Colletotrichum sp. (a) dan Mucor sp. (b)
Pada tanaman pepaya terdapat cendawan Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Sacc, identik dengan C. papayae (P. Henn) yang merupakan penyebab penyakit antraknosa. Bentuk konidianya seperti tabung, hialin, tidak bersepta, dan bersel satu dengan ujung membulat (Semangun 2004). Namun pada penelitian ini ditemukan konidia yang berbentuk sabit, hialin, bersel satu, dan tidak bersepta (Gambar 13a). Menurut Semangun (1991) cendawan Colletotrichum mempunyai banyak ras fisiologis, yang dalam hal ini memerlukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan spesiesnya. Oleh sebab itu dalam penelitian ini hanya dicantumkan Colletotrichum sp. Bentuk konidia cendawan Mucor sp. (Gambar 13b) bulat hampir sama dengan Rhizopus sp. namun pada Mucor sp. tidak ditemukan akar stolon (rhizoid), dan konidia hialin. Cendawan Mucor sp. bersifat saprofit atau parasit pada tanaman, manusia, dan binatang. Spora aseksual cendawan nonmotil yang diproduksi dalam sporangia. Cendawan ini penyebab kapang roti, busuk pada buah-buahan dan sayuran di tempat penyimpanan (Sinaga 2006). Cendawan Penicillium sp. merupakan cendawan Deuteromycetes yang memiliki konidiofor dengan fialid (sel pembawa spora) membentuk struktur seperti sikat atau sapu lidi. Cendawan ini banyak ditemukan pada buah-buahan pascapanen atau benih yang rusak dan dapat menyebabkan busuk kapang biru, bersifat saprofit maupun parasit pada tumbuhan. Cendawan ini mampu menghasilkan antibiotik yang berguna dalam bidang kedokteran (Isarmanto 2009).
20
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Bakteri yang berasosiasi dengan busuk basah buah pepaya adalah Bacillus sp., Pantoea sp., dan Ralstonia sp. Cendawan yang ditemukan adalah A. niger, Colletotrichum sp., Mucor sp., Thielaviopsis sp., Penicillium sp., dan Fusarium sp. Bakteri Bacillus sp. yang ditemukan ada yang bersifat patogen dan nonpatogen, sedangkan bakteri Pantoea sp. yang ditemukan tidak termasuk bakteri patogen. Saran Perlu dilakukan pengujian lanjutan untuk mengetahui bakteri nonpatogen yang kemungkinan merupakan bakteri antagonis di dalam buah pepaya yang bergejala busuk basah.
21
DAFTAR PUSTAKA
[Ellis D]. 2010. Cendawan Fusarium sp. http://www.skripsi//fusariumsp.htm [2 Oktober 2010]. [FAO]. Food and Agriculture Organization. 2009. Top Production of Papayas in 2007. http://www.fao.org/corp/statistics/en/. [27 Desember 2010]. [Isarmanto]. 2009. Jamur/Fungi. http://www.jamur-fungi.html. [2 Oktober 2010]. [Ramdan]. 2010. Fusarium oxysporum. oxysporum.htm [2 Oktober 2010].
http://www.skripsi/Fusarium
[Suryowihardi]. 2010. Khasiat Buah Pepaya. http://www.purwakarta.org [23 Desember 2010]. Brown JF, Kerr A, Morgan FD, Parbey IH. 1980. Plant Protection. Australia: Australian Vice-Chancelors Committee. Chun W, Vidader AK. 2001. Gram-Positive Bacteria-Bacillus. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Coplin DL, Kado CI. 2001. Gram-Negatif Bacteria-Pantoea. Di dalam: Schaad NW. Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Ferfinia A. 2010. Eksplorasi bakteri dan cendawan rizosfer yang berasosiasi dengan penyakit busuk basah pada batang papaya (Carica papaya L.) di Pasir Kuda, desa Ciomas, Bogor [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Hadioetomo RS. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Kalie M, Baga. 1999. Bertanam Pepaya. Jakarta: Penebar Swadaya. Martoredjo T. 2009. Ilmu Penyakit Pascapanen. Ed ke-1. Jakarta: Bumi Aksara. 209:109-111. Rukmana R. 2008. Bertanam Buah-buahan Di Perkarangan. Yogyakarta: Kanisius. Sastrahidayat. 1991. Budidaya Berbagai Jenis Tanaman Tropika. Surabaya: Usana Offset Printing. Schaad NW, Jones JB, Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press.
22
Semangun H. 1991. Penyakit-Penyakit Tanaman Pangan Di Indonesia. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Semangun H. 2004. Penyakit-Penyakit Tanaman Hortikultura Di Indonesia. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Semangun H. 2006. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Sinaga Meity Suradji. 2006. Dasar-dasar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Jakarta: Penebar Swadaya. Streets RB. 1980. Diagnosis Penyakit Tanaman. Santoso Iman, penerjemah. Gede Jaya. Terjemahan dari: Diagnosis of Plant Diseases. Sunarjono H. 2005. Berkebun 21 Jenis Tanaman Buah. Jakarta: Penebar Swadaya Verheij, Coronel, editor. 1997. Prosea Sumber Daya Nabati Asia Tenggara 2 Buah-buahan Yang Dapat Dimakan. Jakarta: Gramedia Pustaka. Widiati R. 2009. Identifikasi bakteri penyebab busuk basah pada batang pepaya (Carica papaya L.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Watanabe T. 1993. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species. USA: Lewis Publisher. Yudiarti T. 2007. Ilmu Penyakit Tumbuhan. Yogyakarta: Graha Ilmu.
23
LAMPIRAN
24
Lampiran 1. Komposisi bahan untuk isolasi dan identifikasi cendawan dan bakteri (Schaad et al. 2001 dan Brown et al. 1980) Tabel 2. Komposisi bahan media King’s B 100% No. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Nama bahan Protease pepton No. 3 Glycerol K2HPO4 MgSO4.7H2O Agar Akuades
Jumlah 20.0 g 15.0 ml 1.5 g 1.5 g 15.0 g 1.0 L
Tabel 3. Komposisi bahan media LB (Luria Broth) No. Nama bahan Jumlah 1. Tryptone 10.0 g 2. NaCl 5.0 g 3. Yeast Extract 5.0 g 4. Akuades 1.0 L Tabel 4. Komposisi bahan media NA (Nutrient Agar) No. Nama bahan Jumlah 1. Beef extract 3.0 g 2. Peptone 5.0 g 3. Agar 15.0 g 4. Akuades 1.0 L Tabel 5. Komposisi bahan media Oksidatif/Fermentatif No. Nama bahan Jumlah 1. Peptone 2.0 g 2. KH2PO4 0.3 g 3. NaCl 5.0 g 4. Agar 3.0 g 5. Bromotimol Biru 3.0 ml 6. Akuades 1.0 L pH 7.2 sebelum ditambah agar Tabel 6. Komposisi bahan media PDA (Potato Dextrose Agar) No. Nama bahan Jumlah 1. Kentang 200 g 2. Dextrose 10.0 g 3. Agar 15.0 g 4. Akuades 1L
25
Tabel 7. Komposisi bahan media Uji Gram No. Nama bahan Jumlah 1. KOH 3% Tabel 8. Komposisi bahan media TZC Agar (Tryphenil Tetrazolium Chloride 1%) No. Nama bahan Jumlah 1. Pepton 10.0 g 2. Glukosa 10.0 g 3. Casamino acid 1.0 g 4. Agar 18.0 g 5. Akuades 1.0 L 6. Tryphenil Tetrazolium Chloride 1% (5 ml /L) Tabel 9. Komposisi bahan media Yeast Extract Dextrose CaCO3 Agar No. Nama bahan Jumlah 1. Yeast Extract 10.0 g 2. Dextrose 20.0 g 3. CaCO3 20.0 g 4. Agar 15.0 g 5. Akuades 1.0 L Tabel 10. Komposisi Larutan PBS (Phospate Buffer Saline) No. Nama bahan Jumlah 1. NaCl 80.0 g 2. KH2PO4 2.0 g 3. Na2HPO4 11,5 g 4. KCl 2.0 g 5. Akuades 1.0 L
26
Lampiran 2. Kunci Identifikasi Bakteri (Schaad et al. 2001) Gram Reaction
(-) Erwinia, Pantoea, Xylophilus, Acidovorax, Burkholderia Ralstonia, Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium
(+) Coryneform, Bacillus, Clostridium,Streptomyces
Anaeroobic Growth
Endospored Formed
(+)
(-)
(+)
(-)
Erwinia, Pantoea
Xylophilus, Acidovorax, Burkholderia Bacillus Ralstonia, Pseudomonas, Clostridium Xanthomonas, Agrobacterium
Colonies Yellow on YDCA
Fluorecent Pigment on KB Anaerobic growth Aerial Mycellium
(+)
(-)
Pantoea Erwinia
(+)
(-)
(+)
Coryneform Streptomyces
(-)
Pseudomonas
Xylophilus Clostridium Bacillus (+) (-) Acidovorax, Stretomyces Burkholderia, Coryneform Agrobacterium,Ralstonia,Xanthomonas
Colonies Yellow (YDCA dan NA) (+) Xanthomonas, Xylophilus
(-) Agrobacterium, Acidovorax, Burkholderia, Ralstonia
D1M
(+) Agrobacterium
(-) Acidovorax, Ralstonia Burkholderia
Argenine+Betanine
(+) Burkholderia
(-) Ralstonia, Acidovorax
Growth 400C (+) Acidovorax
(-) Ralstonia
27
Lampiran 3. Kunci Identifikasi Bakteri (Brown et al. 1980)
Key to assist in the screening of bacteria isolate from plants but which have not been tested for pathogenicity 1.
Gram positive ………………………………………………………………...2 Gram negative ...……………...………………………………………………5
2.
Cocci ………………………….Micrococcus or Sarcina, not a plant pathogen Rods or cocco- bacilli ……….………………………………………………..3
3.
Spores present (visual or heat test) Bacillus Spores absent …………………………………………………………………4
4.
Cells more than 0.8 µm wide …………………...not a plant pathogen, discard Cells less than 0.8 µm wide ………………Corynebacterium, Brevibacterium
5.
Cocci (all cells round) .……….Micrococcus or Sarcina, not a plant pathogen Rods or coccu-bacilli …………………………………………………………6
6.
Spores present (visual or heat test) Bacillus Spores absent …………………………………………………………………7
7.
Colonies whitish, or grayish to buff ………………………………………….8 Colonies yellow ...……………...……………………………………………16 Colonies other colours ...……………...…………………………………….18
8.
Produces fluorescein on Medium B of King et. al …………………………...9 Not fluoresceint pigmen on King’s Medium B ……….…………………….10
9.
Kovacs oxidase negative …………..Pseudomonas, probably a plant pathogen Kovacs oxidase positive ….Pseudomonas, some plant pathogens in this group
10. Kovacs oxidase negative ……………………………………………………11 Kovacs oxidase positive ….............................................................................15 11. Acid from glucose acrobically and anaerobically …………………………..12 Acid from glucose acrobically only …Achromobacter, Acinebacter, and other non
plant
pathogen.
Some
less
common plant pathogens many key out here No acid from glucose ……………………………………………………….14 12. Soft rots potato tissue .………...............................Erwinia (caratovora group)
28
No soft rot potato tissue …………………………………………………….13 Acid from glucose aerobically and anaerobically …Azotomonas, Aeromonas, not a plant pathogen. 12. Acisd from glucose aerobically only .………............Pseudomonas, includes some
plant
pathogen,
Agrobacterium No acid from glucose …………………………......Alcaligenes, Pseudomonas (few plant pathogens)
29
Lampiran 4. Kunci Identifikasi Cendawan (Watanabe 1993)
Key to sporodochium-forming fungi 1. Setae
on sporodochia formed…………………………………….2 not formed………………………………………………...4
2. Setae
curved…………………………………………Sarcopodium not curved…………………………………………………3
3. Sporodochia
well differentiated…………………………………Volutella not so……………………………………….Colletotrichum
4. Conidia
simple……………………………………………………...5
5. Conidia
with filiform appendages………………………………….6
6. Conidia
cylindrical. ……………………….................Hyphodiscosia elliptical with central dark cells and hyaline end cells……………………………..Pestalotia
Key to Phialosporae 1. Conidia
over 2-celled……………………………………………….2 1-celled…………………………………………………….4
2. Conidiophores
penicilliate with stipe and terminal vesicles conidia cylindrical……………….Cylindrocladium simple, conidia not cylindrical…………………………….3
3. Conidia
lunate with a foot cell…………………………….Fusarium cylindrical, without a foot cel………………Cylindocarpon
4. Conidiophores
with inflated apical cells bearing numerous phialides……………………………..Aspergillus without an inflated apical cell……………………………..5
5. Conidia
pigmented…………………………………………………6 hyaline…………………………………………………....10
6. Conidiophores
poorly developed………………………………………….7 well developed…………………………………………….8
7. Conidia
aggregated in a mass…………………………..Phialophora catenulate……………………………………..Torulomyces
30
8. Conidia
branched…………………………………………………..9 almost unbranched……………………………Stachybotrys
9. Conidia
catenulate……………………………………...Phyalomyces aggregated in a mass………………………….Myrothecium
10. Conidia
globose………………………………………..Cladorhinum not so…………………………………………………….11
11. Conidia
boat-shaped or lunate, with or without appendages………………………………………..Codinaea not so……………………………………………………..12
12. Conidia
clavate……………………………………………………13 not so…………………………………………………….15
13. Conidia
catenulate………………………………………………...14 aggregated in a spore mass…………………...Stachbotryna
14. Clamydospores
solitary……………………………………………..Chalara catenulate……………………………………..Thielaviopsis
15. Conidiophores
poorly developed, almost phialide……………Acremonium (=Cephalosporium) well developed…………………………………………....16
16. Conidia
dry………………………………………………………...17 wet……………………………………………………......20
17. Conidiophores
pigmented, conidia catenulate……………….Thysanophora hyaline, spore aggregated in a row………………………18
18. Conidia
cylindrical……………………………………..Metarhizium not so…………………………………………………….19
19. Conidia
globose, conidiophores densely penicilliate……...................................................Penicillium limoniform, conidiophores poorly penicillate……………………………..Paecilomyces
20. Spore mass
only at the apex of conidiophores…………….Gliocladium formed at apical parts of conidiophores………………….21
21. Conidiophores
hyaline……………………………………………………22 pigmented……………………………………..Gonytrichum
31
22. Conidiophores
verticillate………………………………………Verticillium irregularly branched…………………………..Trichoderma
Key to the Species Aspergillus sp. 1. Spore masses
green……………………………………………………….2 not green…………………………………………………...5
2. Spore masses
cylindrical, dark green……………………………………..3 radiate, yellowish green ……………………...A.parasiticus
3. Conidia
under 3 πm in diamete……………………………………..4 4.2-6.3 πm in diameter …………………………A. brevipes
4. Spore masses
175-244 πm long ……………………………...A. fumigatus under 160 πm long ……………Aspergillus sp. sect. clavati
5. Spore masses
black ……………………………………………….A. niger brown ………………………….Aspergillus sp. sect. wentii
Key to the species Colletotrichum sp. 1. Ascocarp
formed in single culture………Colletotrichum destructivum (anamorph of Glomerella glycines) not formed………………………………………………...2
2. Conidia
lunar-shape………………………………………………...3 cylindrical ………………………………………………...4
3. Sclerotia
formed ………………………………………..C. truncatum not formed ……………………………………..C. falcatum
4. Conidia
under 4 πm wide, setose sclerotia formed ……C. coccodes over 4 πm wide, sclerotia not formed …C. lindemuthianum
Key to the species Fusarium sp. 1. Microconidia
catenulate, chlamydospores lacking...............F. moniliforme not catenulate, chlamydospores formed…………………...2
2. Chlamydospores
over 3 spores in a chain ………………………….F. roseum solitary or twins …………………………………………...3
3. Conidiophores
well-formed, over the length of macroconidia by a
32
few time……………………………………………F. solani poortly formed, under the with of macroconidia ……………………...............F. oxysporum
