EKSPLORASI BAKTERI DAN CENDAWAN RIZOSFER YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT BUSUK BASAH PADA BATANG PEPAYA (Carica papaya L.) DI PASIR KUDA, DESA CIOMAS, BOGOR
ANGGIE FERFINIA
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
EKSPLORASI BAKTERI DAN CENDAWAN RIZOSFER YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT BUSUK BASAH PADA BATANG PEPAYA (Carica papaya L.) DI PASIR KUDA, DESA CIOMAS, BOGOR
ANGGIE FERFINIA A34052316
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
Judul Skripsi
:
Eksplorasi Bakteri dan Cendawan Rizosfer yang Berasosiasi dengan Penyakit Busuk Basah pada Batang Pepaya (Carica papaya L.) di Pasir Kuda, Desa Ciomas, Bogor
Nama Mahasiswa
:
Anggie Ferfinia
NRP
:
A34052316
Menyetujui Dosen Pembimbing
Ir. Ivonne Oley Sumarauw, M.Si NIP. 1949 02 08 1976 032 002
Mengetahui Ketua Departemen Proteksi Tanaman
Dr. Ir. Dadang, M.Sc NIP. 1964 02 04 1990 021 002
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, 17 Juli 1987, dari pasangan Zainal Arifien dan Ferry Firdaus. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Penulis telah menyelesaikan pendidikan formal dari SMAN 7 Bogor pada tahun 2005. Pada tahun yang sama penulis diterima di IPB melalui jalur SPMB dan tercatat sebagai mahasiswa Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT untuk setiap petunjuk dan kemudahan yang senantiasa diberikan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ir. Ivonne Oley Sumarauw, M.Si sebagai pembimbing tugas akhir. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Dr. Ir. I Wayan Winasa, M.Si selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan saran dan masukan kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini, serta Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, M.Si sebagai pembimbing akademik selama masa perkuliahan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua teman di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, serta keluarga besar HPT angkatan 42 atas doa, dukungan, dan bantuannya. Terima kasih yang sebesar-besarnya kepada orang tua penulis, Ayah dan Ibu tercinta, Firza, Zarmy, Rafi serta seluruh keluarga atas semangat, kasih sayang dan dorongan yang telah diberikan. Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih memiliki kekurangan, tetapi penulis berharap semoga tulisan ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2010
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ....................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR......................................................................................ix DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................xi PENDAHULUAN ...........................................................................................1 Latar Belakang ......................................................................................1 Tujuan.....................................................................................................2 TINJAUAN PUSTAKA...................................................................................3 Arti Penting Tanaman Pepaya .................................................................3 Agroekologi ............................................................................................4 Penyakit Tanaman Pepaya.......................................................................4 Penyakit Busuk Basah pada Batang Pepaya .............................................4 Rizosfer...................................................................................................5 BAHAN DAN METODE ................................................................................7 Tempat dan Waktu ..................................................................................7 Bahan dan Alat........................................................................................7 Metode Penelitian ...................................................................................7 Pra-Pengamatan atau Survei ....................................................................7 Penentuan Tanaman Contoh dan Pengambilan Tanah ..............................8 Isolasi Mikroorganisme Rizosfer .............................................................8 Identifikasi ..............................................................................................8 Bakteri ..............................................................................................8 Cendawan .......................................................................................12 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................13 Penentuan Tanaman Contoh dan Pengambilan Tanah ............................13 Isolasi Mikroorganisme Rizosfer ...........................................................13 Identifikasi ............................................................................................14 Bakteri ............................................................................................14 Hasil Uji Gram (KOH 3%)...................................................14 Hasil Uji Oksidatif/fermentatif.............................................14
Hasil Uji Pembentukan Endospora .......................................15 Hasil Uji Fluoresensi............................................................15 Hasil Uji Levan....................................................................16 Hasil Uji Oksidase ...............................................................17 Hasil Uji Pembusukkan pada Kentang..................................17 Hasil Uji Arginine dihydrolase.............................................18 Hasil Reaksi hipersensitif.....................................................19 Hasil Uji Pertumbuhan pada media YDC .............................20 Hasil Uji Pertumbuhan pada media TZC ..............................20 Hasil Uji Pertumbuhan pada media D1M Agar ....................21 Cendawan .......................................................................................21 Keanekaragaman Mikroorganisme Rizosfer ..........................................23 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................29 Kesimpulan ...........................................................................................29 Saran.....................................................................................................29 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................30 LAMPIRAN ..................................................................................................32 Komposisi Bahan untuk Isolasi dan Identifikasi Bakteri dan Cendawan .................................................................................32 Kunci Identifikasi Bakteri (Schaad et al. 2001) .....................................36 Kunci Identifikasi Cendawan (Watanabe 1993).....................................37
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Hasil identifikasi cendawan pada tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi penyakit busuk basah pada batang ...............................22 2. Keanekaragamanan mikroorganisme rizosfer pada tanah tanaman pepaya terinfeksi dan tidak terinfeksi penyakit busuk basah pada batang..............................................................24
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Contoh tanah di sekitar perakaran yang diambil (a) dan gejala busuk basah pada batang pepaya (b) ................
.. 13
2. Reaksi bakteri Gram-negatif (a) dan bakteri Gram-positif (b) dalam uji Gram.................................................................................................14 3. Hasil uji oksidatif/fermentatif. Bakteri bersifat oksidatif (a), bakteri bersifat fermentatif (b).................................................................
.15
4. Hasil uji Fluoresensi pada media King s B. Reaksi positif (kiri) dan reaksi negatif (kanan)....
.16
5. Hasil uji Levan yang menunjukkan reaksi positif
17
6. Reaksi positif bakteri uji pada Uji Oksidase (diberi tanda panah) dibandingkan dengan kontrol negatif.......................................................
.17
7. Reaksi positif pembusukkan kentang (a) dan reaksi negatif (b)
.18
..
...
8. Reaksi negatif bakteri pada uji arginine dihydrolase (a) dan reaksi positif bakteri uji dibandingkan dengan kontrol (b).........................................................................................................19 9. Reaksi negatif (a) dan reaksi positif (b) dari uji hipersensitif pada daun tembakau...................................................................................
. 20
10. Reaksi positif pada media YDC......................................................................20 11. Isolat bakteri pada media TZC yang bersifat avirulen ..
21
12. Bakteri uji yang mampu tumbuh pada media D1M Agar......................... ..21 13. Makroskopis (a) Aspergillus sp., (b) Rhizopus sp., (c) Trichoderma sp., (d) Pestalotia sp............................................................................................... 22
14. Mikroskopis Aspergillus sp. (a), Rhizopus sp. (b), Trichoderma sp. (c), Pestalotia sp. (d)...........................................................23
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Komposisi bahan untuk isolasi dan identifikasi bakteri serta cendawan ......32 2. Kunci identifikasi bakteri (Schaad et al. 2001) ...........................................36 3. Kunci identifikasi cendawan (Watanabe 1993)...........................................37
PENDAHULUAN
Latar Belakang Pepaya (Carica papaya L.) adalah tumbuhan yang berasal dari Meksiko bagian selatan dan bagian utara dari Amerika Selatan. Pepaya kaya akan vitamin A, C, dan berfungsi sebagai obat untuk memperbaiki sistem pencernaan. Getahnya mengandung papain, yaitu enzim proteolitik yang dapat digunakan untuk melunakkan daging (Ashari 1995). Buah pepaya juga dapat dijadikan selai, salad, serta minuman segar. Pepaya termasuk tanaman yang mudah untuk dibudidayakan, namun petani banyak menemui kendala salah satunya serangan OPT termasuk penyakit. Menurut data BPS (Badan Pusat Statistik) tahun 2009, besarnya produksi buah pepaya di Indonesia mencapai 717.899 ton pada tahun 2008. Indonesia merupakan negara peringkat kelima sebagai penghasil pepaya terbesar setelah Brazil, Meksiko, Nigeria, dan India (FAO 2007). Penyakit busuk basah pada batang merupakan salah satu jenis penyakit baru yang ditemukan pada tanaman pepaya. Hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya menyatakan bahwa bakteri yang diduga menjadi penyebab busuk basah batang pepaya yaitu Erwinia sp. dan Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen) (Reny Widianti 2009, komunikasi pribadi). Dalam upaya pengembangan paket pengendalian terpadu hama dan penyakit pada tanaman pepaya perlu dilakukan kajian keanekaragaman bakteri dan cendawan rizosfer tanaman pepaya khususnya yang berasosiasi dengan penyakit busuk basah pada batang. Informasi yang diperoleh diharapkan dapat dimanfaatkan untuk rekomendasi penyusunan teknologi PHT pada pepaya. Rizosfer adalah bagian dari tanah yang dipengaruhi oleh akar tanaman (Sorensen dalam Elsas 2007) dan merupakan area yang dapat meningkatkan kegiatan dan jumlah organisme, serta adanya interaksi yang kompleks antara mikroorganisme dan akar (Kennedy dalam Sylvia 2005). Pentingnya rizosfer meningkat dengan adanya bahan organik dari akar dan efek dari meningkatnya kegiatan mikroba pada rantai nutrisi dan pertumbuhan tanaman. Jenis
2
mikroorganisme di rizosfer sangat melimpah dan jumlahnya berkurang seiring dengan bertambahnya jarak dari akar. Mikroorganisme yang menghuni tanah diantaranya adalah bakteri dan cendawan. Bakteri merupakan kelompok mikroorganisme tanah yang paling dominan dan terdapat dalam berbagai macam tipe tanah tetapi populasinya menurun dengan bertambahnya kedalaman tanah. Menurut Tate (2000) populasi bakteri distimulasi oleh eksudat akar. Bakteri-bakteri tersebut ditemukan sebagai mikrokoloni yang menutupi hampir 4 sampai 10% permukaan akar. Bakteri kelompok Pseudomonas dan kelompok bakteri Gramnegatif lainnya bersaing di rizosfer dan menempati bagian yang luas dari total populasi bakteri pada akar. Bakteri yang membutuhkan asam amino lebih banyak terdapat di daerah rizosfer dibandingkan tanah di luar rizosfer. Populasi cendawan tanah lebih sedikit dibandingkan dengan populasi bakteri, tetapi cendawan biasanya mempunyai biomassa yang lebih besar. Kebanyakan dari cendawan tanah hidup sebagai saprob dan kepadatannya bertambah di rizosfer (Gunawan et al. 2006).
Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keanekaragaman bakteri dan cendawan rizosfer yang berasosiasi dengan penyakit busuk basah pada batang pepaya di Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB (PKBT-IPB) Pasir Kuda, Desa Ciomas, Bogor.
TINJAUAN PUSTAKA
Arti Penting Tanaman Pepaya Pepaya merupakan tanaman buah berupa herba dari famili Caricaceae yang berasal dari Amerika Tengah dan Hindia Barat bahkan kawasan sekitar Meksiko dan Costa Rica. Tanaman pepaya banyak ditanam orang, baik di daerah tropis maupun sub-tropis, di daerah-daerah basah dan kering atau di daerah-daerah dataran rendah dan pegunungan (sampai 1000 m dpl). Buah pepaya merupakan buah yang bermutu dan bergizi tinggi. Pepaya (Carica papaya L.) merupakan salah satu tanaman buah yang sangat penting dalam pemenuhan sumber vitamin A dan C, serta berfungsi untuk memperbaiki sistem pencernaan (Samson 1980). Selain dikonsumsi sebagai buah segar, buah pepaya yang masak dapat diolah menjadi minuman penyegar, dan sebagai bahan baku industri makanan. Menurut Sunarjono (2005), getah pepaya (dari buah, daun, maupun batang) mengandung papain yang bersifat proteolitik (merombak protein), dapat digunakan sebagai pelunak daging. Karpaina yang terkandung dalam daun pepaya berguna untuk mengurangi gangguan jantung dan biji buah pepaya dapat digunakan sebagai obat peluruh urin. Menurut Semangun (1991), batang pepaya dapat digunakan sebagai makanan ternak. Buah pepaya masak yang mudah rusak perlu diolah menjadi makanan seperti sari pepaya, dodol pepaya, manisan pepaya. Dalam industri makanan buah pepaya sering dijadikan bahan baku pembuatan (pencampur) saus tomat yakni untuk penambah cita rasa, warna dan kadar vitamin. Selain itu, akarnya dapat digunakan sebagai obat penyembuh sakit ginjal dan kandung kemih. Daunnya sebagai obat penyembuh penyakit malaria, kejang perut dan sakit panas, penambah nafsu makan, serta dapat menyembuhkan penyakit beri-beri. Bunga pepaya yang berwarna putih dapat dirangkai dan digunakan sebagai “bunga kalung” pengganti bunga melati atau sering dibuat urap. Batangnya dapat dijadikan pencampur makanan ternak melalui proses pengirisan dan pengeringan.
4
Produksi pepaya di Indonesia adakalanya mengalami penurunan. Penurunan produksi ini disebabkan oleh banyak faktor diantaranya kekeringan, perubahan iklim, serangan hama dan penyakit.
Agroekologi Tanaman dapat tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian 1000 m dpl. Tanaman ini lebih senang tumbuh di lokasi yang banyak hujan (cukup tersedia air), curah hujan 1000-2000 mm/tahun dan merata sepanjang tahun. Di daerah yang beriklim kering, musim hujannya 2-5 bulan, dan musim kemaraunya 6-8 bulan, tanaman pepaya masih mampu berbuah, jika kedalaman air tanahnya 50150 cm. Menurut Ashari (1995) suhu udara optimum berkisar 22-26°C. Kelembaban udara sekitar 40% dan angin yang tidak terlalu kencang sangat baik untuk penyerbukan. Tanah yang subur dengan porositas baik, mengandung kapur dan ber-pH 6-7 paling sesuai untuk tanaman pepaya. Tanaman pepaya lebih menyukai daerah terbuka (tidak ternaungi) dan tidak tergenang air. Tanah yang berdrainase tidak baik menyebabkan tanaman mudah terserang penyakit akar (Sunarjono 2005).
Penyakit Tanaman Pepaya Penyakit yang sering menyerang yaitu bercak Antraknosa yang disebabkan oleh cendawan Colletotrichum gloeosporioides, busuk Rhizopus oleh cendawan Rhizopus stolonifer, bercak daun Cercospora oleh cendawan Cercospora papayae, busuk pangkal batang oleh Phytophthora palmivora, Papaya Ring Spot Virus oleh virus bercak cincin pepaya (papaya ringspot virus, PRV) dan penyebab gejala mosaik oleh virus mosaik pepaya (papaya mosaic virus, PMV) (Semangun 1991).
Penyakit Busuk Basah pada Batang Pepaya Penyakit busuk basah batang pepaya yang ditemukan di Pusat Kajian Buah Tropika Pasir Kuda, Ciomas menimbulkan kehilangan hasil karena tanaman menjadi lunak, mudah rebah, dan tidak mampu berbuah. Gejala dimulai dari pangkal batang dengan munculnya bercak basah gelap yang terus melebar dan
5
menyebar ke bagian batang lainnya yang berakibat batang menjadi lunak dan tanaman menjadi mudah rebah. Penelitian sebelumnya menyatakan bahwa bakteri yang diduga menjadi penyebab busuk basah batang pepaya yaitu Erwinia sp. dan Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen). Masing-masing bakteri ketika diinokulasikan pada batang pepaya sehat menimbulkan gejala busuk basah. Gabungan kedua bakteri Erwinia sp. dan Pseudomonas sp. (kelompok fluoresen) menghasilkan gejala busuk basah yang lebih parah dibandingkan jika hanya masing-masing bakteri saja (Reny Widianti 2009, komunikasi pribadi).
Rizosfer Rizosfer adalah area yang mengubah keragaman mikroba, meningkatkan aktivitas dan jumlah organisme, dan adanya interaksi yang kompleks antara mikroorganisme dan akar (Kennedy dalam Sylvia 2005). Rizosfer dicirikan oleh lebih banyaknya kegiatan mikrobiologis dibandingkan kegiatan di dalam tanah yang jauh dari perakaran tanaman. Intensitas kegiatan semacam ini tergantung dari panjangnya jarak tempuh yang dicapai oleh eksudasi sistem perakaran. Istilah “efek rizosfer” menunjukkan pengaruh keseluruhan perakaran tanaman terhadap mikroorganisme tanah maka akan lebih banyak jumlah bakteri, cendawan dan actinomycetes dalam tanah yang termasuk rizosfer dibandingkan tanah yang tidak memiliki rizosfer. Beberapa faktor seperti tipe tanah, kelembaban tanah, pH dan temperatur, dan umur serta kondisi tanaman mempengaruhi efek rizosfer. Efek rizosfer selain tampak dalam bentuk melimpahnya jumlah mikroorganisme juga dalam adanya distribusi bakteri yang memiliki ciri mempunyai kebutuhan khusus, yaitu asam amino, vitamin-vitamin B, dan faktor pertumbuhan
khusus
mikroorganisme
(kelompok
rizosfer
itu
nutrisional).
berbeda
dengan
Laju
kegiatan
metabolik
laju
kegiatan
metabolik
mikroorganisme dalam tanah non-rizosfer. Daerah sekitar perakaran, rizosfer, relatif kaya akan nutrisi atau unsur hara dimana fotosintat tanaman hilang sebanyak 40% dari akar. Konsekuensinya dukungan rizosfer cukup besar dan kemampuan menggunakan populasi mikroba aktif yang bermanfaat, netral atau yang merusak berpengaruh terhadap
6
pertumbuhan tanaman. Pentingnya populasi mikroba di sekitar rizosfer adalah untuk memelihara kesehatan akar, pengambilan nutrisi atau unsur hara, dan toleran
terhadap
stress
atau
cekaman
lingkungan.
Mikroorganisme
menguntungkan ini dapat menjadi komponen yang signifikan dalam manajemen pengelolaan untuk dapat mencapai hasil, yang telah ditegaskan bahwa hasil tanaman budidaya dibatasi hanya oleh lingkungan fisik alamiah tanaman dan potensial genetik bawaan. Menurut Tate (2000), umumnya rizosfer dari kebanyakan tanaman mengandung bakteri Gram-negatif dan terdapat pada daerah rizoplan. Beberapa genus
bakteri
ini
adalah
Pseudomonas,
Arthrobacter,
Agrobacterium,
Azotobacter, Mycobacterium, Flavobacterium, Cellulomonas, Micrococcus ditemukan dalam jumlah yang banyak namun ada juga yang tidak ditemukan sama sekali. Bakteri yang membutuhkan asam amino lebih banyak terdapat di daerah rizoplan dan daerah rizosfer dibandingkan tanah di luar rizosfer.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Kebun Percobaan Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB (PKBT-IPB) Pasir Kuda, Desa Ciomas, Bogor, dan Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai dengan Oktober 2009.
Bahan dan Alat Tanah di sekitar perakaran tanaman pepaya varietas IPB 9 yang terinfeksi penyakit busuk basah pada batang dan tanah dari tanaman yang sehat. Bahan tanaman lain yaitu tanaman tembakau. Media biakan yang digunakan nutrient agar (NA), luria broth (LB), martin agar (MA), dan potato dextrose agar (PDA). Media uji yang digunakan adalah media Oksidatif-Fermentatif (O/F), media King’s B, media tryphenil tetrazolium chloride (TZC), media Arginine, Levan, yeast extract dextrose CaCO3 (YDC), media D1M Agar. Komposisi masing-masing media terdapat pada lampiran 1. Bahan lain yang digunakan yaitu umbi kentang mentah, KOH 3%, alkohol 70%, paraffin oil, malachite green 5%, safranin 0,5%, dimethyl-pphenylenediamine dihydrochloride 1%, air steril, dan kapas. Alat-alat yang digunakan adalah mikroskop compound, autoklaf, alat shaker, cawan petri, tabung reaksi, labu erlenmeyer, pipet, jarum inokulasi, alat suntik, glass-bite, gelas objek, baki plastik, seal, pisau, lampu bunsen, dan tisu.
Metode Penelitian Pra-pengamatan atau survei Survei dilakukan pada lahan yang terdapat gejala serangan penyakit busuk basah. Survei tersebut bertujuan untuk mengetahui kondisi lahan, kondisi tanaman yang akan diamati, dan memudahkan dalam menentukan tanaman yang akan dijadikan sampel.
8
Penentuan tanaman contoh dan pengambilan tanah Lahan yang digunakan telah ditanami pepaya varietas IPB 9. Tanah dari tanaman contoh diambil sampai kedalaman 20 cm dengan mengambil 3 sampel tanaman yang terserang penyakit busuk basah dan 3 sampel tanaman sehat.
Isolasi mikroorganisme rizosfer Sampel tanah yang telah diambil dari lapang diisolasi menggunakan pengenceran berseri dengan cara mencampur sebanyak 5 gram tanah dari setiap contoh dan air steril sebanyak 50 ml, kemudian di-shaker 100 rpm selama semalam (overnight). Suspensi diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml air steril pada tabung. Pengenceran berseri dilakukan terhadap sampel tanah sampai 10-5. Dari pengenceran 10-3, 10 -4, 10 -5, setiap 0,1 ml suspensi ditumbuhkan dengan metode sebar pada media NA untuk bakteri, PDA dan MA untuk menumbuhkan cendawan.
Identifikasi A. Bakteri Identifikasi bakteri berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Schaad et al. (2001) (Lampiran 2) dan Brown et al. (1980). Beberapa uji yang dilakukan untuk mengetahui genus bakteri hasil isolasi rizosfer tanaman pepaya IPB 9 yang terinfeksi penyakit busuk basah maupun yang tidak terinfeksi, sebagai berikut: 1. Uji Gram (KOH 3%) Uji ini dilakukan dengan mencampurkan satu lup isolat bakteri pada gelas obyek yang telah ditetesi KOH 3%, kemudian diamati terbentuk tidaknya lendir. Jika terbentuk lendir maka bakteri tersebut dikelompokkan ke dalam Gram-negatif dan sebaliknya jika tidak terbentuk lendir maka bakteri tersebut tergolong Gram-positif.
2. Uji Oksidatif/Fermentatif Uji Oksidatif/Fermentatif dilakukan dengan menumbuhkan bakteri uji pada media Oksidatif/fermentatif (Lampiran 1) dengan pH 7.2 pada tabung
9
reaksi. Masing-masing bakteri uji diiinokulasikan pada 2 tabung reaksi. Bakteri uji diinokulasikan pada media dengan cara menusukkannya pada kedalaman 0,5 cm, kemudian ditutup dengan paraffin oil steril pada salah satu tabung, sedangkan tabung yang satunya tanpa diberi parafin. Kontrol pada pengujian ini berupa media uji tanpa bakteri. Pengamatan dilakukan selama 714 hari. Jika terjadi perubahan warna menjadi kuning hanya pada media uji tanpa paraffin oil berarti bakteri tersebut bersifat oksidatif, sedangkan bakteri bersifat fermentatif jika mengalami perubahan warna menjadi kuning, baik pada media berparafin maupun tanpa parafin (Brown et al. 1980).
3. Uji Pembentukan Endospora Uji ini hanya dilakukan pada bakteri Gram-positif untuk mengetahui keberadaan endospora pada sel bakteri. Pertama, satu lup suspensi bakteri dicampurkan dengan akuades steril yang telah ditetesi pada kaca preparat dan telah dikeringanginkan, kemudian ditetesi malachite green 5%, didiamkan selama 10 menit hingga mengering, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, selanjutnya ditetesi larutan safranin 0,5% selama 15 detik, dibilas dengan air, dan dikeringkan sambil dilewatkan di atas Bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop compound dengan perbesaran kuat 100x menggunakan minyak imersi. Sel bakteri akan terlihat berwarna merah, spora yang masih menempel berwarna transparan, dan spora yang sudah terlepas berwarna hijau kebiruan.
4. Uji Fluoresensi Pengujian
ini
dilakukan
untuk
membedakan
kelompok
bakteri
Pseudomonas sp. dengan kelompok bakteri lainnya. Bakteri yang akan diuji digores pada media King’s B (Lampiran 1) dan diinkubasi selama 24-48 jam kemudian diamati di bawah sinar UV. Jika berpendar dengan menghasilkan warna biru kehijauan maka bakteri tersebut merupakan kelompok bakteri Pseudomonas.
10
5. Uji Levan Pengujian ini dilakukan dengan menggoreskan bakteri uji pada media NA yang ditambahkan dengan 5% (b/v) sukrosa. Jika terbentuk koloni berwarna putih, berlendir dan cembung setelah diinkubasi selama 3-5 hari berarti menunjukkan reaksi positif.
Uji
ini untuk
membedakan
kelompok
Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen) patogen (bereaksi positif) dengan yang non-patogen (Brown et al. 1980).
6. Uji Oksidase Uji ini dilakukan dengan menggoreskan koloni bakteri berumur 24 jam pada kertas saring steril yang telah ditetesi dengan larutan dimethyl-pphenylenediamine dihydrochloride 1%. Reaksi positif ditunjukkan dengan perubahan warna bakteri menjadi warna ungu gelap pada kertas saring setelah 10 sampai 15 detik (Brown et al. 1980).
7. Uji Pembusukkan Kentang Uji ini dilakukan dengan menggoreskan inokulum bakteri berumur 24-48 jam pada irisan kentang yang telah disterilisasi permukaannya dengan natrium hipoklorit (NaOCl) 1%, kemudian dibilas dengan akuades selama 1 menit. Selanjutnya irisan kentang tersebut diinkubasi dalam cawan petri pada kondisi lembab. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya pembusukkan pada kentang akibat adanya enzim pektolitik setelah 24 jam penggoresan inokulum bakteri. Permukaan kentang yang diinokulasi menjadi berlendir dan terdapat lubang kecil cukup dalam. Uji ini digunakan untuk membedakan bakteri kelompok Pseudomonas yang bersifat patogenik maupun non-patogenik pada tanaman. Pada bakteri kelompok Pseudomonas non-patogen, lubang yang terbentuk lebih dangkal dan tidak terdapat lendir pada kentang yang diinokulasi (Lelliott & Stead 1987).
8. Uji Arginine Dihydrolase Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji ke dalam tabung reaksi yang berisi media arginin dengan cara menusukkannya sampai
11
kedalaman sekitar 0,5 cm, kemudian ditutup dengan menggunakan paraffin oil steril. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari jingga menjadi merah muda (Brown et al. 1980).
9. Reaksi Hipersensitif Reaksi ini berguna untuk mengetahui sifat patogenik bakteri uji. Satu lup koloni bakteri dicampur dengan 5 ml LB (luria broth), dikocok dengan kecepatan 100 rpm selama 21 jam, kemudian suspensi bakteri tersebut diinokulasi pada daun tembakau dengan cara menyuntikkan pada permukaan bawah daun. Reaksi positif ditunjukkan setelah 24 sampai 48 jam inokulasi dengan terbentuknya gejala nekrosis pada bagian daun yang disuntikkan.
10. Pertumbuhan pada Media YDC Yeast extract Dextrose CaCO3 (YDC) merupakan salah satu media untuk membedakan pertumbuhan bakteri Erwinia sp. dengan Pantoea sp. Bakteri uji digores pada media YDC dan diinkubasi selama 48 jam. Jika koloni bakteri berwarna kuning pada media, hal tersebut menunjukkan reaksi positif.
11. Uji pada Media TZC Isolat bakteri berumur 24 jam digores ke media TZC yang telah ditambahkan larutan 2,3,5 Tryphenil Tetrazolium Chloride 1% (b/v). Media TZC berguna untuk mengetahui bakteri yang diuji bersifat virulen atau avirulen khususnya bakteri Ralstonia solanacearum (Brown et al. 1980).
12. Pertumbuhan pada Media D1M Agar D1M merupakan media semiselektif untuk pertumbuhan bakteri Agrobacterium sp. untuk membedakannya dengan Burkholderia sp., Acidovorax sp., dan Ralstonia sp. Uji ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri uji pada media D1M agar.
12
B. Cendawan Cendawan yang diperoleh dari hasil isolasi dibuat preparat slide pada kaca preparat yang telah ditetesi air steril kemudian diidentifikasi menggunakan mikroskop cahaya. Identifikasi dilakukan berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Watanabe (1993) (Lampiran 3) dan Domsch et al. (1993).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan tanaman contoh dan pengambilan tanah Bagian tanah yang dijadikan contoh berasal di sekitar perakaran. Pada tanaman yang terinfeksi penyakit busuk basah menimbulkan gejala awal pada batang terlihat basah seperti tersiram air panas.
(a) (b) Gambar 1 Contoh tanah di sekitar perakaran yang diambil (a) dan gejala busuk basah pada batang pepaya (b). Isolasi Mikroorganisme Rizosfer Lima isolat bakteri dan tiga isolat cendawan dari tanah tanaman terinfeksi pada tanaman pepaya IPB 9 yang diambil dari PKBT-IPB Pasir Kuda yaitu koloni kuning bundar, bening tak beraturan, kuning bening konsentris, putih tak beraturan, dan krem kekuningan tak beraturan, sedangkan isolat cendawan yang diperoleh memiliki miselium berwarna hijau gelap, hijau kelabu, dan hijau kuning. Hasil isolasi mikroorganisme rizosfer pada tanah tanaman tidak terinfeksi diperoleh enam isolat bakteri yaitu krem bundar, krem konsentris, kuning krem tak beraturan, bening konsentris, putih tak beraturan, dan putih kekuningan tak beraturan, sedangkan enam isolat cendawan yang diperoleh berwarna hitam, putih kelabu, hijau muda, hijau kelabu, hitam kelabu, dan putih. Semua isolat murni bakteri dan cendawan yang diperoleh pada tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi diidentifikasi untuk mengetahui genus dari setiap isolat yang diperoleh.
14
Identifikasi Bakteri 1. Uji Gram Lima isolat bakteri dari tanah tanaman terinfeksi yang diuji, empat isolat menghasilkan lendir pada pengujian menggunakan KOH 3%, sedangkan satu isolat lainnya tidak menghasilkan lendir. Pada tanah tanaman tidak terinfeksi diperoleh tiga isolat yang menghasilkan lendir dan tiga isolat yang tidak membentuk lendir saat pengujian. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri yang menghasilkan lendir saat pengujian dengan KOH 3% adalah bakteri Gram-negatif, dan sebaliknya jika isolat bakteri tidak menghasilkan lendir berarti bakteri tersebut merupakan kelompok Gram-positif.
(a) (b) Gambar 2 Reaksi bakteri Gram-negatif (a) dan bakteri Gram-positif (b) dalam uji Gram. 2. Uji Oksidatif/Fermentatif Tiga isolat dari tanah tanaman terinfeksi mengalami perubahan warna menjadi kuning pada media yang diberi paraffin oil steril (kondisi anaerob) dan yang tidak diberi parafin (kondisi aerob) sehingga bersifat fermentatif, sedangkan dua isolat bersifat oksidatif karena hanya mengalami perubahan warna menjadi kuning pada media tanpa paraffin oil. Pada tanah tanaman tidak terinfeksi, tiga isolat bersifat fermentatif dan tiga isolat bersifat oksidatif.
15
(a) (b) Gambar 3 Hasil uji oksidatif/fermentatif. Bakteri bersifat oksidatif (a), bakteri bersifat fermentatif (b). 3. Uji Pembentukan Endospora Berdasarkan hasil pengujian terhadap empat isolat bakteri Gram-positif, semua isolat membentuk endospora, yaitu isolat yang berasal dari tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi. Sel vegetatif berwarna merah dan spora bakteri berwarna hijau kebiruan pada bagian ujung sel. Berdasarkan hasil pengamatan uji Oksidatif/Fermentatif, bakteri yang membentuk endospora tersebut merupakan bakteri yang bersifat aerob dan anaerob fakultatif, sehingga dapat disimpulkan pada tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi tersebut adalah Bacillus sp.
4. Uji Fluoresensi Berdasarkan pengujian semua isolat bakteri pada media King’s B, terdapat dua isolat yang mengeluarkan pigmen fluoresen di bawah sinar ultraviolet. Berdasarkan uji ini dapat diketahui bahwa isolat tersebut adalah bakteri Pseudomonas sp. Untuk mengetahui apakah bakteri tersebut bersifat patogen atau non-patogen diperlukan uji lanjutan yaitu Levan, Oxidase, Pectolitic activity, Arginine dihydrolase, dan Tobacco hypersensitivity (LOPAT) (Brown et al. 1980).
16
Gambar 4 Hasil uji Fluoresensi pada media King’s B. Reaksi positif (kiri) dan reaksi negatif (kanan). 5. Uji Levan Dari dua isolat bakteri yang diuji pada media Levan, bakteri Pseudomonas sp. yang diuji, satu isolat yang menunjukkan hasil negatif dengan tumbuhnya isolat yang tidak melebar dan berlendir, sedangkan isolat yang lain bereaksi positif ditunjukkan dengan warna putih susu, bentuk cembung, berlendir, dan melebar. Levan dihasilkan oleh bakteri kelompok Pseudomonas yang dapat mencerna sukrosa (Stanier et al. dalam Hildebrand & Schroth 1966). Menurut Lelliott & Stead (1987) levan adalah polimer yang disintesis dari bagian fruktosa yang berasal dari molekul sukrosa, dan biasanya menghasilkan koloni berlendir dari beberapa Pseudomonas dan Erwinia spp. pada media yang mengandung banyak sukrosa. Uji ini merupakan uji karakterisasi sifat bakteri kelompok Pseudomonas sp., untuk membuktikan apakah termasuk bakteri patogen atau non-patogen terhadap tanaman.
17
Gambar 5 Hasil uji Levan yang menunjukkan reaksi positif. 6. Uji Oksidase Dari dua isolat yang diuji, semua isolat menunjukkan reaksi positif dengan terjadinya perubahan menjadi warna ungu gelap pada kertas saring yang telah diberi bakteri uji, sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan tidak terjadinya perubahan warna pada kertas saring setelah 60 detik. Uji ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan sitokrom c pada bakteri (Stanier et al. dalam Hildebrand & Schroth 1966).
Gambar 6 Reaksi positif bakteri uji pada uji Oksidase (diberi tanda panah) dibandingkan dengan kontrol negatif. 7. Uji Pembusukkan Kentang Bakteri Pseudomonas sp. yang diuji menunjukkan reaksi positif dengan menyebabkan terbentuknya lubang, terjadi pembusukkan, dan berlendir pada kentang. Hal ini membuktikan bahwa isolat bakteri tersebut termasuk bakteri Pseudomonas sp. patogen. Menurut Lelliot & Stead (1987), Pseudomonas sp.
18
hanya menyebabkan lubang yang dangkal, sedangkan Erwinia sp. menyebabkan lubang yang dalam dan berlendir. Dua isolat yang berasal dari tanah tanaman terinfeksi yang menunjukkan reaksi positif, kemudian setelah diuji dengan uji oksidatif/fermentatif dan uji pertumbuhan pada media YDC diduga bakteri tersebut adalah Erwinia sp.
(a) (b) Gambar 7 Reaksi positif pembusukkan kentang (a) dan reaksi negatif (b). 8. Uji Arginine Dihydrolase Semua isolat bakteri yang diuji termasuk Pseudomonas sp. menunjukkan reaksi positif pada media arginin dengan terjadinya perubahan warna dari jingga menjadi merah muda. Hal tersebut mengindikasikan adanya perubahan basa (Lelliott & Stead 1987). Menurut Kiewnick & Sands dalam Schaad (2001), uji ini untuk mengetahui kegiatan dua enzim yang memungkinkan beberapa kelompok Pseudomonas mampu tumbuh pada kondisi anaerob. Kedua enzim tersebut adalah arginine desmidase mengubah arginine menjadi citrulline dan NH3, serta citrulline ureidase yang mengubah citrulline menjadi ornithine, CO2, dan NH3. Reaksi basa dari produksi NH3 dapat dideteksi dengan uji ini. Berdasarkan uji LOPAT yang dilakukan pada bakteri Pseudomonas sp. maka dapat diketahui bahwa genus bakteri rizosfer tanaman pepaya di PKBT-Pasir Kuda Bogor adalah Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen) yang bersifat patogen.
19
(a) (b) Gambar 8 Reaksi negatif (a) dan reaksi positif bakteri uji dibandingkan dengan kontrol (b). 9. Reaksi Hipersensitif Berdasarkan hasil pengamatan dan pengujian semua bakteri uji yang disuntikkan ke tanaman tembakau. Pada tanah tanaman terinfeksi, empat isolat menunjukkan reaksi positif dengan munculnya gejala nekrosis, sedangkan satu isolat bereaksi negatif. Pada tanah tanaman tidak terinfeksi, lima isolat bereaksi positif, sedangkan satu isolat bereaksi negatif. Uji hipersensitif merupakan uji yang dilakukan untuk dapat mengetahui sifat patogenesitas suatu bakteri tanaman. Menurut Lelliot & Stead (1987), bakteri yang bersifat patogen bagi tanaman akan menunjukkan gejala nekrotik pada daun tembakau yang diinokulasikan bakteri uji dan gejalanya akan muncul pada 24-48 jam setelah inokulasi.
20
(a) (b) Gambar 12 Reaksi negatif (a) dan reaksi positif (b) dari uji hipersensistif pada daun tembakau. 10. Pertumbuhan pada media YDC Hasil isolasi pada tiga isolat bakteri, semua isolat menunjukkan koloni berwarna kuning pada media NA. Dua isolat berwarna krem pada media YDC. YDC merupakan salah satu media untuk membedakan pertumbuhan bakteri Erwinia sp. dengan Pantoea sp. Berdasarkan pengujian ini, terdapat satu isolat yang bersifat fermentatif dengan koloni warna kuning tumbuh pada media YDC diidentifikasi sebagai bakteri Pantoea sp.
Gambar 9 Reaksi positif pada media YDC. 11. Uji pertumbuhan pada media TZC Berdasarkan hasil pengujian pada empat isolat bakteri Gram-negatif dan bersifat aerob dari tanah tanaman yang terinfeksi dan tidak terinfeksi, semua isolat tidak menunjukkan karakteristik yang sama dengan Ralstonia solanacearum. Media ini digunakan untuk melihat pertumbuhan Ralstonia solanacearum baik yang virulen maupun avirulen. Jika virulen, pada media
21
koloni bakteri akan berwarna merah muda sampai merah jingga pada bagian tengah dan putih krem pada bagian tepinya, sedangkan yang avirulen berwarna merah dan merah kebiruan atau ungu (Brown et al.1980).
Gambar 10 Isolat bakteri yang bersifat avirulen. 12. Pertumbuhan pada media D1M Agar Berdasarkan hasil pengujian dari empat isolat bakteri Gram-negatif dan bersifat aerob, hanya dua isolat yang mampu tumbuh pada media D1M agar. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan Agrobacterium sp., karena D1M agar merupakan media semiselektif untuk pertumbuhan bakteri tersebut.
Gambar 11 Bakteri uji yang mampu tumbuh pada media D1M Agar. Identifikasi Cendawan Tiga isolat cendawan dari tanah tanaman terinfeksi dan enam isolat dari tanah tanaman tidak terinfeksi diidentifikasi dengan menggunakan mikroskop compound perbesaran 10x40. Pengamatan dilakukan secara makroskopis dengan
22
melihat warna miselium yang tumbuh (Tabel 1) dan secara mikroskopis dengan melihat bentuk spora maupun konidia cendawan (Gambar 14). Tabel 1. Hasil identifikasi cendawan pada tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi penyakit busuk basah pada batang Warna Miselium Tanah tanaman terinfeksi
Nama Cendawan
Hijau gelap
Trichoderma sp.
Hijau kuning
Aspergillus sp.
Hijau kelabu
Penicillum sp.
Tanah tanaman tidak terinfeksi Hitam
Aspergillus niger
Putih kelabu
Rhizopus sp.
Hijau muda
Aspergillus flavus
Hijau kelabu
Penicillium sp.
Hitam kelabu
Pestalotia sp.
Putih
Aspergillus sp.
Dari Tabel 1 terlihat bahwa cendawan yang diperoleh dari rizosfer tanaman tidak terinfeksi lebih beranekaragam dibandingkan dengan rizosfer tanaman terinfeksi penyakit busuk basah jika dilihat dari genus cendawan yang berhasil diidentifikasi. Pada tanah tanaman yang terinfeksi yang diperoleh hanya Trichoderma sp., Aspergillus sp., dan Penicillium sp., sedangkan dari tanah tanaman tidak terinfeksi yaitu Aspergillus niger, Rhizopus sp., Aspergillus flavus, Penicillium sp., Pestalotia sp., dan Aspergillus sp.
(a) (b) (c) (d) Gambar 13 Makroskopis (a) Aspergillus sp., (b) Rhizopus sp., (c) Trichoderma sp.,(d) Pestalotia sp.
23
(a)
(b)
(c) (d) Gambar 14 Mikroskopis Aspergillus sp. (a), Rhizopus sp. (b), Trichoderma sp. (c), Pestalotia sp. (d). Keanekaragaman Mikroorganisme Rizosfer Berdasarkan hasil identifikasi, mikroorganisme rizosfer yang terdapat pada tanaman pepaya yang terinfeksi Penyakit Busuk Basah terdiri dari bakteri Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen), Pantoea sp., Erwinia sp., Bacillus sp., serta cendawan Trichoderma sp., Penicillium sp., dan Aspergillus sp., sedangkan dari tanah tanaman tidak terinfeksi diperoleh mikroorganisme berupa
bakteri
Pseudomonas
sp.
(Pseudomonas
kelompok
fluoresen),
Agrobacterium sp., Bacillus sp., serta cendawan Aspergillus niger, Rhizopus sp., Aspergillus
flavus,
Penicillium
sp.,
Pestalotia
sp.,
Aspergillus
Keanekaragaman mikroorganisme rizosfer tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.
sp.
24
Tabel 2. Keanekaragaman mikroorganisme rizosfer pada tanah tanaman terinfeksi dan tidak terinfeksi penyakit busuk basah pada batang Jenis
Tanah tanaman
Mikroorganisme
terinfeksi
Bakteri
Tanah tanaman tidak terinfeksi
Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.
(kelompok fluoresen)
(kelompok fluoresen)
Pantoea sp.
Agrobacterium sp.
Erwinia sp.
Bacillus sp.
Bacillus sp. Cendawan
Trichoderma sp.
Aspergillus niger
Penicillium sp.
Rhizopus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus flavus Penicillium sp. Pestalotia sp. Aspergillus sp.
Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen) adalah bakteri Gram-negatif dan bersifat aerob. Beberapa kelompok Pseudomonas berasosiasi dengan tanaman sebagai penghuni rizosfer (Kiewnick & Sands dalam Schaad 2001). Pada tanaman terinfeksi maupun tidak terinfeksi, keduanya bersifat patogen. Hal ini ditunjukkan dengan munculnya gejala nekrosis pada uji hipersensitif menggunakan daun tembakau. Hal ini dapat terjadi diduga karena lahan sudah ditanami pepaya sejak tahun 2000 (Baisyuni 2009, komunikasi pribadi). Pantoea sp. adalah Gram-negatif, berbentuk batang, anaerob fakultatif, oksidase negatif. Kelompok bakteri ini dapat dibedakan dari kelompok Erwinia oleh diproduksinya pigmen berwarna kuning. Faktor lain yang membedakan Pantoea dan Erwinia adalah tidak dapat mendegradasi pektat, tidak memerlukan faktor pertumbuhan, dan tidak memproduksi urease (Coplin & Kado dalam Schaad 2001). Pada tanaman terinfeksi, bakteri ini bersifat patogen karena bereaksi hipersensitif positif pada daun tembakau.
25
Erwinia sp. sering menyerang jaringan tanaman yang hidup, bersifat patogen pada tanaman sayuran seperti menyebabkan gejala busuk lunak (Janse 2005). Erwinia sp. termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, bersifat anaerob fakultatif, dan Gram-negatif. Pada tanaman terinfeksi, Erwinia sp. yang diidentifikasi bersifat patogen pada tanaman pepaya dengan munculnya gejala nekrosis pada daun tembakau. Agrobacterium sp. merupakan bakteri Gram-negatif, bersifat aerob, banyak terdapat di tanah, akar dan batang tanaman, serta sering menyebabkan hipertropi (pembesaran sel-sel) dari jaringan yang terinfeksi. Agrobacterium sp. terkenal sebagai bakteri tular tanah yang menginfeksi tanaman dikotil, termasuk tanaman buah-buahan yang memiliki nilai ekonomi tinggi, tanaman kacangkacangan, tanaman anggur, dan tanaman hias (seperti mawar, dahlia, dan bunga matahari) (Moore et al. dalam Schaad 2001). Pada tanaman yang tidak terinfeksi, bakteri ini menunjukkan reaksi hipersensitif negatif sehingga tidak bersifat patogen. Bacillus sp. merupakan bakteri Gram-positif, bersifat aerob atau anaerob fakultatif dan membentuk endospora sebagai alat pertahanan pada kondisi yang tidak menguntungkan (Chun & Vidaver dalam Schaad 2001). Endospora dibentuk di dalam sel. Genus ini diduga sebagai penghasil antibiotik. Bakteri ini kebanyakan bersifat saprofit pada tanah. Pada tanaman pepaya yang terinfeksi, Bacillus sp. tidak bersifat patogen, hal ini terlihat dari reaksi negatif pada daun tembakau yang telah diinokulasi setelah 24-48 jam. Daun tembakau yang diuji menunjukkan reaksi hipersensitif negatif dengan tidak munculnya gejala nekrosis, sedangkan pada tanaman yang tidak terinfeksi, Bacillus sp. yang diidentifikasi bersifat patogen karena menunjukkan reaksi hipersensitif positif dengan munculnya gejala nekrotik setelah 24-48 jam dilakukan inokulasi pada daun tembakau. Trichoderma
sp.
termasuk
dalam
kelas
Deuteromycetes
yang
konidiofornya banyak dan bercabang-cabang, konidia berbentuk oval dan berwarna hijau gelap jika berjumlah banyak, umumnya hidup sebagai saprob di tanah. Trichoderma sp. telah banyak dipublikasikan sebagai agens hayati, dekomposer bahan organik dan dapat merangsang pertumbuhan tanaman.
26
Beberapa spesies Trichoderma seperti T. harzianum ,T. viride, T. album telah diteliti peranannya sebagai agens hayati (Anonim 2003). Penicillium
sp.
merupakan
cendawan
Deuteromycetes,
memiliki
konidiofor dengan fialid yang membentuk struktur seperti sikat atau sapu lidi. Cendawan ini mampu menghasilkan antibiotik yang berguna dalam bidang kedokteran. Aspergillus sp. termasuk dalam kelas Deuteromycetes. Sebagian besar bersifat saprofitik. Fialid (sel pembawa spora dengan ujung berbentuk tabung) dibentuk pada vesikel (gelembung) dan memiliki sel kaki. Aspergillus sp. dapat menyebabkan infeksi, alergi atau keracunan baik pada tumbuhan, hewan, maupun manusia (Anonim 2003a). Rhizopus sp. merupakan cendawan Deuteromycetes yang semula miseliumnya tampak seperti kapas, namun semakin lama berubah menjadi kehitaman karena banyaknya sporangium dan spora. Rhizopus hampir menyerupai Mucor sp., hanya miselium Rhizopus terbagi-bagi atas stolon, yang menghasilkan akar (rhizoid) dan sporangiofor. Pestalotia sp. merupakan cendawan kelas Deuteromycetes. Konidia berbentuk gelendong (fusoid) dan berwarna gelap, terdiri dari beberapa sel dan sel yang di ujung hialin. Konidium dihiasi setula, yaitu berupa benang di bagian ujung. Mikroorganisme rizosfer pada tanah tanaman tidak terinfeksi lebih beanekaragam khususnya untuk cendawan, sedangkan pada tanah tanaman terinfeksi lebih banyak ditemukan bakteri. Hal ini diduga karena terjadinya kompetisi yang berarti mikroorganisme yang bersifat antagonis mampu mereduksi kegiatan patogen dengan mendapatkan sejumlah ketersediaan sumber yang terbatas seperti nutrisi organik dan anorganik, faktor tumbuh, oksigen, atau ruang (Graham dalam Sylvia 2005). Mikroorganisme yang tidak mampu bersaing akan tereleminasi sehingga hanya mikroorganisme yang mampu bersaing yang dapat bertahan. Mikroorganisme yang mampu bertahan pada tanaman pepaya terinfeksi diantaranya Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen), Pantoea sp., Erwinia sp., Bacillus sp., Trichoderma sp., Penicillium sp., dan Aspergillus sp.,
27
sedangkan Pantoea sp., Erwinia sp., dan Trichoderma sp. tidak ditemukan pada tanah tanaman tidak terinfeksi. Bakteri Pantoea, Pseudomonas, Serratia, dan Bulkhorderia spp. dapat memproduksi kitinase yang bersifat antagonis terhadap cendawan patogen tanaman. Hal ini dapat juga diduga karena sedikitnya jumlah cendawan yang mampu memproduksi antibiotik. Produksi antibiotk dari cendawan Deuteromycetes seperti Aspergillus, Fusarium, dan Penicillium menguntungkan lingkungan secara berkelanjutan dalam ketersediaan sumber nutrisi. Pertahanan dan pertumbuhan bakteri tergantung pada ketersediaan karbon organik yang melimpah (Alexander dalam Sylvia 2005). Beberapa bakteri rizosfer bersifat saprofit yang tidak berbahaya dan memperoleh makanan dari nutrisi organik eksudat akar. Eksudat akar terdiri dari berbagai asam amino dan vitamin. Beberapa bakteri diantaranya dapat melindungi tanaman dari infeksi mikroba penyebab penyakit dengan adanya kompetisi dengan patogen dalam hal nutrisi atau sumber lainnya, atau oleh zat yang dihasilkan yang secara langsung dapat menghambat patogen. Beberapa organisme secara nyata dapat langsung beradaptasi dengan rizosfer, namun dalam keberhasilannya membentuk koloni dengan akar dipengaruhi oleh adanya kompetisi dengan organisme lain dan kondisi tanamannya. Menurut Tate (2000) mikroba penghuni akar dan patogen tanaman dapat berkompetisi dalam hal ruang dan nutrisi. Kompetisi ruang dan nutrisi dapat mengagalkan patogen untuk menimbulkan penyakit (Kennedy dalam Sylvia 2005). Populasi bakteri dan cendawan dipengaruhi oleh pH, praktik pertanian, pemupukan, pemakaian pestisida, dan penambahan bahan organik (Subba-Rao 1994). Adanya mikroorganisme pada tanah tanaman tidak terinfeksi dapat memberikan
beberapa
keuntungan
seperti
memelihara
kesehatan
akar,
pengambilan nutrisi atau unsur hara, dan toleran terhadap stress atau cekaman lingkungan. Mikroorganisme yang menguntungkan dapat menjadi komponen yang signifikan dalam manajemen pengelolaan untuk dapat mencapai hasil yang diharapkan. Beberapa keuntungan dari adanya kegiatan mikroorganisme di rizosfer adalah dekomposisi residu tanaman dan bahan organik, meningkatkan ketersediaan nutrisi tanaman, melindungi dari patogen akar, meningkatkan biodegradasi pestisida sintetik, dan lain-lain. Mikroorganisme penghuni rizosfer,
28
seperti patogen atau mikroorganisme yang memproduksi fitotoksin dapat merusak kesehatan tanaman. Tantangannya untuk saat ini adalah meningkatkan hubungan yang menguntungkan dan meminimalisasi interaksi yang merugikan.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Pada tanaman terinfeksi penyakit busuk basah terdapat berbagai bakteri dan cendawan. Bakteri yang berhasil diidentifikasi adalah Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen), Pantoea sp., Erwinia sp., dan Bacillus sp., sedangkan cendawan yang diperoleh yaitu Trichoderma sp., Penicillium sp., dan Aspergillus sp. Pada tanaman tidak terinfeksi, bakteri yang diperoleh adalah Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen), Agrobacterium sp., dan Bacillus sp., sedangkan untuk cendawan yang berhasil diidentifikasi adalah Aspergillus niger, Rhizopus sp., Aspergillus flavus, Penicillium sp., dan Pestalotia sp. Pada tanah yang terinfeksi penyakit busuk basah maupun yang tidak terinfeksi terdapat bakteri yang bersifat patogen dan non-patogen terhadap tanaman.
Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui peranan dari setiap mikroorganisme rizosfer yang diperoleh sehingga dapat mengetahui potensinya sebagai agens hayati, pemacu pertumbuhan tanaman, dekomposer bahan organik, dan lain-lain, serta diharapkan dapat lebih membantu dalam pengendalian penyakit.
DAFTAR PUSTAKA
[Anonim]. 2003. Trichoderma. http://www.agrobiologicals.com/glossary/G1707htm. [14 Juli 2009]. [Anonim]. 2003a. Aspergillus spp.: Taxonomic classification. http://doctorfungus.org/thefungi/Aspergillus-spp.htm. [17 Mei 2009]. [BPS RI]. Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. 2009. Produksi BuahBuahan 2008. http://www.bps.go.id/tab_sub/view.php?tabel=1&daftar=1&id_subyek=55 ¬ab=2. [4 November 2009]. [FAO]. Food and Agriculture Organization. 2009. Top Production of Papayas in 2007. http://www.fao.org/corp/statistics/en/. [4 November 2009]. Ashari S. 1995. Hortikultura Aspek Budidaya. Jakarta: UI Press. Brown JF, Kerr A, Morgan FD, Parbey IH. 1980. Plant Protection. Australia: Australian Vice-Chancelors Committee. Chun W, Vidaver AK. 2001. Gram-Positive Bacteria-Bacillus. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Coplin DL, Kado CI. 2001 Gram-Negative Bacteria-Pantoea. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Domsch KH, Gams W, Anderson TH. 1993. Compendium of Soil Fungi. Vol 1. IHW-Velag. Gunawan AW, Dharmaputra OS, Rahayu G, et al. 2006. Cendawan dalam Praktik Laboratorium. Bogor: IPB Press. Janse JD. 2005. Phytobacteriology: Principles & Practice. UK: CABI Publishing. Kennedy AC. 2005. Rhizosphere. Di dalam Principles and Applications of Soil Microbiology. Sylvia DM, et al, editor. 2005. 2 nd Ed. New Jersey: Pearson Prentice Hall. Kiewnick AB, Sands DC. 2001. Gram-Negative Bacteria-Pseudomonas. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. St Paul: APS Press.
31
Lelliott RA & Stead DE. 1987. Methods in Plant Pathology Volume 2: Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plant. London: Blackwell Scientific Publications. Moore LW, Bouzar H, Burr T. 2001. Gram-Negative Bacteria-Agrobacterium. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun W, editor. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Samson JA. 1980. Tropical Fruits. New York: Longman Inc. Schaad NW, Jones JB, Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. Minnesota: APS Press. Semangun H. 1991. Penyakit-penyakit Tanaman Hortikultura di Indonesia. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Sorensen J, Sessitsch A. 2007. Plant-Associated Bacteria: Lifestyle and Molecular Interactions. Di dalam: Modern Soil Microbiology. Elsas JD van, Jansson JK, Trevors JT, editor. 2007. 2nd Ed. USA: CRC Press. Stanier RY, Palleroni NJ, Doudoroff M. 1966. Identification of the fluorescent pseudomonads. Di dalam: Proceedings of the Third International Conference on Plant Pathogenic Bacteria Wageningen, 14-21 April 1971. Hildebrand DC, Schroth MN, editor. Wageningen: Centre for Agricultural Publishing and Documentation. Subba-Rao NS. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Ed ke2. Susilo H, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Soil Microorganisms and Plant Growth. Sunarjono HH. 2005. Berkebun 21 Jenis Tanaman Buah. Jakarta: Penebar Swadaya. Tate RL. 2000. Soil Microbiology. 2nd Edition. Kanada: John Wiley & sons, Inc. Watanabe T. 1993. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species. USA: Lewis Publisher.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Komposisi bahan untuk isolasi dan identifikasi bakteri serta cendawan.
Tabel 1 Komposisi bahan media NA (nutrient agar) No.
Bahan
Jumlah
1.
Beef extract
3.0 g
2.
Pepton
5.0 g
3.
Agar
4.
Akuades
15.0 g 1.0 l
Tabel 2 Komposisi bahan media PDA (potato dextose agar) No.
Bahan
Jumlah
1.
Kentang
200 g
2.
Dextrose
20 g
3.
Agar
15 g
4.
Akuades
1l
Tabel 3 Komposisi bahan media MA (martin agar) No.
Bahan
Jumlah
1.
Pepton
20.0 g
2.
Dextrose
10.0 g
3.
KH2PO4.7H2O
1.0 g
33
4.
MgSO4.7H2O
0.5 g
5.
Rose Bengal 1%
3.3 ml
6.
Agar
7.
Akuades
8.
Streptomycin
20.0 g 1.0 l 50.0 mg/l
Tabel 4 Komposisi bahan media Uji Gram No.
Bahan
1.
KOH
Jumlah 3%
Tabel 5 Komposisi bahan media Oksidatif/Fermentatif No.
Bahan
Jumlah
1.
Pepton
1.0 g
2.
NH4H2PO4
1.0 g
3.
KCl
0.2 g
4.
MgSO4.7H2O
0.2 g
5.
Bromotimol Biru
6.
Agar
1.5 g
7.
Akuades
1.0 l
40.0 ml/l
pH 7.2 sebelum ditambah agar
Tabel 6 Komposisi bahan media Uji Pembentukan Endospora No.
Bahan
Jumlah
1.
Malachyte green
5% ( 5 gram
2.
Safranin
0.5% ( 0.5 gram
Tabel 7 Komposisi bahan media King’s B 100%
dalam 100 ml ) dalam 100 ml )
34
No.
Bahan
Jumlah
1.
Protease pepton no.3
20.0 g
2.
Gliserol
15.0 ml
3.
K2HPO4
1.5 g
4.
MgSO4.7H2O
1.5 g
5.
Agar
6.
Akuades
15.0 g 1.0 l
Tabel 8 Komposisi bahan media Levan No.
Bahan
Jumlah
1.
Nutrient Broth
2.
Sukrosa
50.0 g
3.
Agar
15.0 g
4.
Akuades
8.0 g
1.0 l
Tabel 9 Komposisi bahan media Uji Oksidase No.
Bahan
Jumlah
1.
Dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride
Tabel 10 Komposisi bahan media Arginine Dihydrolase No.
Bahan
Jumlah
1.
Pepton
1.0 g
2.
NaCl
5.0 g
3.
K2HPO4
0.3 g
4.
L (+) arginin HCl
10.0 g
5.
Phenol red
0.01 g
6.
Agar
3.0 g
7.
Akuades
1.0 l
pH 7.2 sebelum ditambah agar
1%
35
Tabel 11 Komposisi bahan media LB (luria broth) No.
Bahan
Jumlah
1.
Tryptone
10 g
2.
NaCl
5g
3.
Yeast Extract
5g
4.
Akuades
1l
Tabel 12 Komposisi bahan media Yeast extract Dextrose CaCO3 (YDC) Agar No.
Bahan
Jumlah
1.
Yeast Extract
10.0 g
2.
Glukosa
20.0 g
3.
CaCO3
20.0 g
4.
Agar
15.0 g
5.
Akuades
1.0 l
Tabel 13 Komposisi bahan media TZC Agar No.
Bahan
Jumlah
1.
Triphenyl Tetrazolium Chloride
2.
Pepton
3.
Glukosa
5.0 g
4.
Casamino Acid
1.0 g
5.
Agar
6.
Akuades
1% 10.0 g
17.0 g 1.0 l
Tabel 14 Komposisi bahan media D1M Agar No.
Bahan
1.
Cellobiose
Jumlah 5.0 g
36
2.
NH4Cl
1.0 g
3.
Na2H2PO4
1.0 g
4.
K2HPO4
1.0 g
5.
MgSO4.7H2O
3.0 g
6.
Malachyte green
10.0 mg
7.
Agar
15.0 g
8.
Akuades
1.0 l
36
Lampiran 2 Kunci Identifikasi Bakteri (Schaad et al. 2001)
Gram Reaction -
+
Erwinia, Pantoea, Xylophilus, Acidovorax, Burkholderia Ralstonia, Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium
Coryneform, Bacillus, Clostridium, Streptomyces
Anaerobic Growth +
Endospored Formed
-
+
-
Erwinia, Pantoea
Xylophilus, Acidovorax, Burkholderia , Ralstonia Bacillus,
Colonies Yellow +on YDC -
Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium Clostridium Streptomyces Fluorescent Pigment on KB Anaerobic Growth Aerial + + Mycellium
Pantoea
Erwinia
Pseudomonas
Xylophilus
Clostridium
Coryneform,
Bacillus +
Acidovorax, Burkholderia,
-
Streptomyces
Ralstonia, Xanthomonas, Agrobacterium
Coryneform
Colonies Yellow on YDC/NA +
-
Xanthomonas, Xylophilus
Agrobacterium, Acidovorax, Burkholderia, Ralstonia
Urease
Growth at 33°C on YDC
+
-
Xylophilus
+
-
Xanthomonas
Growth on D1M Agar +
-
Agrobacterium
Acidovorax, Burkholderia,
Xanthomonas Xylophilus
Ralstonia Utilizes Arginine and Betaine +
-
Burkholderia
Ralstonia, Acidovorax Growth at 40° C
+ Acidovorax
Ralstonia
37
Lampiran 3 Kunci Identifikasi Cendawan (Watanabe 1993) Key to Soil Fungus Classes 1. Hyphae
septate ...........................................................................6 aseptate .........................................................................2
2.Sporangiospores
formed........................................................ Zygomycetes none .............................................................................3
3.Oospores
formed .................................................. Mastigomycetes none ..............................................................................4
4.Zoospores
formed................................................... Mastigomycetes none ..............................................................................5
5.Zygospores
formed........................................................ Zygomycetes none ........................................ Mastigo- or Zygomycetes
6.Hyphae
with clamp connection ............................ Basidiomycetes without clamp connection..............................................7
7.Spores
formed...........................................................................8
8.Ascospores
formed ........................................................ Ascomycetes
Basidiospores
formed .................................................... Basidiomycetes
Conidia
formed....................................................Deuteromycetes
Key to Zygomycetes 1.Vesicles
formed between sporangiophore and sporangia..............2 none ..............................................................................4
2.Sporangia
formed directly on vesicle .............................................3 at apexes of branches developed on vesicle .. Umbelopsis
3.Conidia Merosporangia 4.Sporangia
formed...................................................Cunninghamella formed ................................................. Syncephalastrum globose .........................................................................5 flask-shaped ................................................... Saksenaea
5.Sporangia
with apophysis ..............................................................6 without apophysis..........................................................7
6.Apophysis
globose........................................................Gongronella not so ..................................................................Absidia
38
7.Sporangia
well columellate ............................................................8 without columella or poorly columellate........Mortierella
8.Columella
twisted or coiled ................................... Helicocephalum not so ............................................................................9
9.Rhizoid
formed just below sporangiophore .................... Rhizopus
Key to Deuteromycetes 1.Conidiocarp or sporodochia 2.Pycnidia Sporodochia
formed……...……. .......................................................2 not formed.....................................................................3 formed........................................... A. Pycnidium-former formed .....................................B. Sporodochium-former
(or acervuli) Synnemata 3.Conidia
formed............................................. C. Synnema-former formed..........................................................................4 not formed.................................................. Sterile fungi
4.Conidia
Aleuriospore-type ................................ D. Aleuriosporae Arthrospore-type ................................... E. Arthrosporae Blastospore-type.....................................F. Blastosporae Phialospore-type.................................... G. Phialosporae Porospore-type ........................................ H. Porosporae Sympodurospore-type .................... I.Sympodurosporae Others ..................................J. Annelosporae and others
B Sporodochium-Forming Fungi 1.Setae
on sporodochia formed .................................................2 not formed....................................................................4
2.Setae
curved........................................................ Sarcopodium not curved ....................................................................3
3.Sporodochia
well differentiated ........................................... Volutella not so ..................................................... Colletotrichum
4.Conidia
simple...........................................................................5
5.Conidia
with filiform appendages ..............................................6
39
6.Conidia
cylindrical, concolor ................................Hyphodiscosia elliptical with central dark cells and hyaline end cells .................................. Pestalotia
G Phialosporae 1.Conidia
over 2-celled..................................................................2 1-celled ..........................................................................4
2.Conidiophores
penicilliate with stipe and terminal vesicles, conidia cylindrical ........................... Cylindrocladium simple, conidia not cylindrical.......................................3
3.Conidia
lunate with a foot cell .......................................Fusarium cylindrical, without a foot cell ................ Cylindrocarpon
4.Conidiophores
with inflated apical cells bearing numerous phialides ................................................... Aspergillus without an inflated apical cell ........................................5
5.Conidia
pigmented......................................................................6 hyaline ........................................................................10
6.Conidiophores
poorly developed ...........................................................7 well developed ..............................................................8
7.Conidia
aggregated in a mass.................................... Phialophora catenulate ....................................................Torulomyces
8.Conidia
branched........................................................................9 almost unbranched ......................................Stachybotrys
9.Conidia
catenulate .................................................... Phialomyces aggregated in a mass .................................. Myrothecium
10.Conidia
globose....................................................... Cladorhinum not so ..........................................................................11
11.Conidia
boat-shaped or lunate, with or without appendages ..................................................Codinaea not so ..........................................................................12
12.Conidia
clavate .........................................................................13 not so ..........................................................................15
40
13.Conidia
catenulate ....................................................................14 aggregated in a spore mass ....................... Stachybotryna
14.Clamydospores
solitary ..............................................................Chalara catenulate ................................................... Thielaviopsis
15.Conidiophores
poorly developed, almost phialide...............Acremonium (= Cephalosporium) well developed ............................................................16
16.Conidia
dry...............................................................................17 wet ..............................................................................20
17.Conidiophores
pigmented, conidia catenulate ................... Thysanophora hyaline, spore aggregated in a row...............................18
18.Conidia
cylindrical ...................................................Metarhizium not so ..........................................................................19
19.Conidia
globose, conidiophores densely penicilliate ...Penicillium limoniform, conidiophores poorly penicilliate .......................... Paecilomyces
20.Spore mass
only at the apex of conidiophores................ Gliocladium formed at apical parts of conidiophores .......................21
21.Conidiophores
hyaline........................................................................22 pigmented .................................................. Gonytrichum
22. Conidiophores
verticilliate.................................................... Verticillium irregularly branched ................................... Trichoderma
