EKSPLORASI KHAMIR DAN BAKTERI SEBAGAI KANDIDAT AGENS ANTAGONIS PENYEBAB PENYAKIT BUSUK PANGKAL BATANG JERUK (Botryodiplodia theobromae Pat.)
NUR ANNISA SHALEHAH
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Eksplorasi Khamir dan Bakteri sebagai Kandidat Agens Antagonis Penyebab Penyakit Busuk Pangkal Batang Jeruk (Botryodiplodia theobromae Pat.) adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2017 Nur Annisa Shalehah NIM A34120104
ABSTRAK NUR ANNISA SHALEHAH. Eksplorasi Khamir dan Bakteri sebagai Kandidat Agens Antagonis Penyebab Penyakit Busuk Pangkal Batang Jeruk (Botryodiplodia theobromae Pat.). Dibimbing oleh MEITY SURADJI SINAGA Jeruk merupakan salah satu tanaman buah tahunan yang banyak diminati oleh masyarakat Indonesia, namun produksi jeruk terus mengalami fluktuasi dari tahun ke tahun. Salah satu penyakit utama yang menyerang pertanaman jeruk di Indonesia adalah penyakit busuk pangkal batang jeruk yang disebabkan oleh cendawan Botryodiplodia theobromae yang telah ditemukan di 11 sentra pertanaman jeruk. Penggunaan batang bawah yang resisten sudah tidak efektif karena perkembangan ras patogen yang cepat di lapangan. Oleh sebab itu, tujuan dari penelitian ini adalah mengisolasi khamir dan bakteri dari kulit batang, akar, dan daun tanaman jeruk sehat dan mengetahui potensinya sebagai agens antagonis B. theobromae in vitro. Penelitian ini dilaksanakan mulai April sampai Agustus 2016. Hasil isolasi didapatkan enam isolat khamir dan sebelas isolat bakteri. Semua isolat khamir dan sembilan isolat bakteri bukan patogen terhadap tanaman dan mamalia. Hasil pengujian in vitro yaitu khamir isolat MAFL001 dan MCFG003 mampu menekan pertumbuhan B. theobromae secara langsung dan memiliki afinitas hiperparasitisme yang tinggi. Isolat MAFL001 juga mampu memproduksi senyawa volatil toksik sementara isolat MCFG003 mampu memproduksi enzim kitinase. Berdasarkan identifikasi morfologi isolat MAFL001 termasuk anggota genus Candida, sementara isolat MCFG003 termasuk anggota genus Rhodotorula. Isolat bakteri TBFG007 dan TBFG008 mampu menghambat pertumbuhan B. theobromae secara langsung dan mampu memproduksi senyawa volatil toksik. Selain itu, isolat TBFG008 juga mampu memproduksi enzim kitinase. Empat isolat ini menunjukkan potensi terbaik sebagai agens antagonis B. theobromae in vitro. Kata kunci: bakteri antagonis, Botryodiplodia theobromae, khamir antagonis, penyakit busuk pangkal batang jeruk
ABSTRACT
NUR ANNISA SHALEHAH. Exploration of Yeast and Bacteria as Antagonist Agent Candidates of the Causative Agent of Citrus Foot Rot Disease (Botryodiplodia theobromae Pat.). Supervised by MEITY SURADJI SINAGA. Citrus is one of perennial fruit crops that is highly demanded by the people in Indonesia, but the production of citrus was fluctuative from year to year. One of the major disease that infect citrus plantations in Indonesia is foot rot caused by fungal Botryodiplodia theobromae that has been found in 11 citrus central production areas. The usage of resistant rootstock was no longer effective because of fast development of the pathogen races. Therefore, the aims of this research were to isolate yeast and bacteria from stem, root, and leaves of healthy citrus plants and found out their potential as biocontrol agent of B. theobromae in vitro. This research was conducted from April until August 2016. Six yeast isolates and eleven bacteria isolates were resulted from the isolation. All yeast isolates and seven bacteria isolates were nonpathogenic to plant and human. The results from in vitro assay were yeast isolates MAFL001 and MCFG003 could inhibit B. theobromae growth directly and had high hyperparasitism activity. Isolate MAFL001 could also produce toxic volatile compound while isolate MCFG003 could produce chitinase. Based on morphological identification, MAFL001 was identified as member of Candida species and MCFG003 was identified as member of Rhodotorula species. Bacteria isolates TBFG007 and TBFG008 could inhibit B. theobromae growth directly and produce volatil compound. In addition, isolate TBFG008 could also produce chitinase. These four isolates showed the best potential as biocontrol agents of B. theobromae in vitro. Key words: antagonistic yeast, antagonistic bacteria, Botryodiplodia theobromae, citrus foot rot
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2017 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyususnan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
EKSPLORASI KHAMIR DAN BAKTERI SEBAGAI KANDIDAT AGENS ANTAGONIS PENYEBAB PENYAKIT BUSUK PANGKAL BATANG JERUK (Botryodiplodia theobromae Pat.)
NUR ANNISA SHALEHAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
Judul Skripsi : Eksplorasi Khamir dan Bakteri sebagai Kandidat Agens Antagonis Penyebab Penyakit Busuk Pangkal Batang Jeruk (Botryodiplodia theobromae Pat.) Nama : Nur Annisa Shalehah NIM : A34120104
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Meity Suradji Sinaga, MSc Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Dr Ir Suryo Wiyono, MScAgr Ketua Departemen
Tanggal disetujui:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahuwata’ala atas segala curahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Eksplorasi Khamir dan Bakteri sebagai Kandidat Agens Antagonis Penyakit Busuk Pangkal Batang Jeruk (Botryodiplodia theobromae Pat.)” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada orang tua, saudara, dan keluarga yang selalu memberi doa dan dukungan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof Dr Ir Meity Suradji Sinaga, MSc selaku dosen pembimbing skripsi yang telah memberikan arahan, saran, dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Terima kasih penulis sampaikan pula kepada Prof Dr Ir Dadang, MSc selaku dosen penguji luar komisi atas sarannya dalam penulisan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada teman-teman Proteksi Tanaman angkatan 49, teman-teman anggota Laboratorium Mikologi Tumbuhan atas semangat dan bantuan dalam melaksanakan penelitian. Semoga penelitian ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2017 Nur Annisa Shalehah
DAFTAR ISI PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian BAHAN DAN METODE Tempat dan waktu Metode Penelitian Isolasi Khamir dan Bakteri Epifit dari Bagian Tanaman Sehat Isolasi Khamir dan Bakteri Endofit dari Bagian Tanaman Sehat Uji Patogenisitas Khamir Uji Hipersensitif Bakteri pada Tanaman Indikator Uji Gram Bakteri Pengujian Keefektifan Khamir dan Bakteri terhadap B. theobromae in vitro Uji Hiperparasitisme Khamir terhadap B. theobromae Uji Kultur Ganda Uji Aktivitas Enzim Kitinase Uji Produksi Senyawa Volatil Uji Keamanan Khamir dan Bakteri terhadap Mamalia Rancangan Percobaan dan Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Karakterisasi Khamir dan Bakteri Pengujian Patogenisitas Khamir dan Bakteri Pengujian Keefektifan Khamir terhadap B. theobromae in vitro Pengujian Keefektifan Bakteri terhadap B. theobromae in vitro SIMPULAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 8 10 12 15 15 16 19
DAFTAR TABEL 1 Daftar isolat hasil isolasi 2 Karakter morfologi koloni isolat khamir dan hasil identifikasi 3 Karakter morfologi koloni isolat bakteri 4 Hasil uji patogenisitas khamir 5 Hasil uji patogenisitas bakteri 6 Hasil pengujian kemampuan antagonis khamir terhadap B. theobromae in vitro 7 Hasil pengujian kemampuan antagonis bakteri terhadap B. theobromae in vitro
5 6 7 8 9 10 13
DAFTAR GAMBAR 1 Karakteristik sel khamir secara mikroskopis pada perbesaran 100x10 isolat MAFL001, MBFG001, MBFG002, MCFG002, MCFG003, dan MCFG004 6 2 Kolonisasi batang bibit jeruk oleh khamir Candida sp. 1, Candida sp. 2, Sporobolomyces sp., Rhodotorula sp. 1, Rhodotorula sp. 2, Rhodotorula sp. 3, dan gejala nekrosis pada kontrol positif 8 3 Gejala klorosis pada daun tembakau yang diinokulasi dengan bakteri isolat TBFG005 dan TCFG012 serta gejala nekrosis pada daun yang diinokulasi dengan Xanthomonas oryzae pv oryzae 9 4 Pertumbuhan miselium B. theobromae terhambat dan lebih tipis pada perlakuan khamir Candida sp. 1 dibanding kontrol pada uji produksi senyawa toksik volatil 11 5 Perbedaan warna koloni B. theobromae pada perlakuan khamir yang masih berwarna abu-abu dibanding kontrol delapan hari setelah inokulasi 11 6 Zona bening di sekitar biakan khamir Rhodotorula sp. 2 pada media koloidal kitin; terbentuk zona bening pada margin biakan khamir Rhodotorula sp. 2 dan ujung hifa B. theobromae dibanding kontrol pada uji kultur ganda 12 7 Hifa B. theobromae yang abnormal setelah diparasit oleh sel khamir Candida sp. 1, Rhodotorula sp. 1, Rhodotorula sp. 2, dan Rhodotorula sp. 3 12 8 Pertumbuhan B. theobromae terhambat pada perlakuan isolat TBFG008 dan lebih lambat pada perlakuan isolat TBFG006 dan isolat TBFG007 dibanding kontrol yang sudah memenuhi setengah cawan pada uji produksi senyawa toksik volatil 14 9 Pembentukan zona bening pada margin isolat TBFG007 dengan ujung hifa B. theobromae; Pertumbuhan hifa yang lebih tipis di dekat isolat TCFG011 dibanding kontrol (c) 15
DAFTAR LAMPIRAN 1 Karakterisitik koloni bakteri berdasarkan Hadieotomo (1993) 2 Hasil uji potensi isolat sebagai patogen mamalia pada agar darah 3 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif khamir terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji produksi senyawa volatil 4 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif khamir terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji kultur ganda 5 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif bakteri terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji produksi senyawa volatil 6 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif bakteri terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji kultur ganda
21 21 22 22 22 22
1
2
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Jeruk (Citrus spp.) merupakan salah satu tanaman buah tahunan yang banyak diminati oleh masyarakat Indonesia. Selain karena rasa dan aromanya yang khas, buah jeruk juga merupakan sumber vitamin C. Sentra penanaman jeruk di Indonesia sendiri tersebar hampir ke seluruh pelosok negeri, mulai dari Garut (Jawa Barat), Tawangmangu (Jawa Tengah), Batu (Jawa Timur), Tejakula (Bali), Selayar (Sulawesi Selatan), Pontianak (Kalimantan Barat), dan Medan (Sumatera Utara) (Soelarso 1996). Produktivitas usaha tani jeruk nasional cukup tinggi, yaitu berkisar antara 17 sampai 25 ton per ha dari potensi 25 sampai 40 ton per ha (Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian 2005). Menurut data Kementerian Pertanian (2016), produksi jeruk Indonesia sejak tahun 2011 sampai 2015 berturut-turut adalah 1 721 880, 1 498 394, 1 548 394, 1 785 256, dan 1 744 330 ton. Data tersebut menunjukkan bahwa produksi jeruk terus mengalami fluktuasi selama beberapa tahun terakhir. Fluktuasi produksi tersebut dapat disebabkan oleh banyak faktor, salah satunya karena gangguan patogen tumbuhan. Penyakit-penyakit penting jeruk yang sudah menyebar di seluruh dunia seperti penyakit tristeza, huanglongbing, dan penyakit mati meranggas (Naqvi 2004). Salah satu penyakit utama yang menyerang pertanaman jeruk di Indonesia adalah gumosis atau busuk pangkal batang (BPB) yang dapat disebabkan oleh Phytophthora citrophthora (R.E. Sm. & E. H. Sm.) atau Botryodiplodia theobromae Pat. Penyakit BPB merupakan penyakit utama yang menyebabkan kematian pada batang dan cabang tanaman jeruk di Indonesia. Penyebaran penyakit ini hampir di seluruh pertanaman jeruk, terutama yang telah berumur lebih dari 10 tahun dengan pemeliharaan yang kurang intensif. Serangan melingkar pada cabang dan batang utama menyebabkan kematian bagian tanaman di atas titik serangan, bahkan menyebabkan kematian tanaman (Triwiratno 2014). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sinaga et al. (2009), dari 11 daerah produksi jeruk yakni Garut, Jember, Malang, Kintamani, Soe, Banjarmasin, Banjarbaru, Berastagi, Kampar, Muara Jambi, dan Tulang Bawang Barat ditemukan bahwa penyebab utama dari busuk pangkal batang jeruk adalah B. theobromae. Penyakit BPB yang disebabkan oleh P. citrophthora hanya ditemukan di Soe. Salah satu tindakan yang telah dilakukan untuk mencegah infestasi B. theobrome adalah penggunaan batang bawah (rootstock), yaitu Japansche Citroen (JC) yang tahan terhadap penyakit BPB (Sinaga et al. 2009). Namun karena perkembangan ras patogen yang sangat cepat di lapangan, tanaman masih rentan terhadap serangan patogen (Supraba 2014). Strategi pengendalian alami telah berkembang pada beberapa dekade terakhir. Informasi mengenai mikroorganisme yang berpotensi antagonis bagi patogen tumbuhan diperlukan agar dapat digunakan pada pengendalian hayati. Berbagai agens antagonis telah dievaluasi keefektifannya dalam menekan pertumbuhan B. theobromae (Retnosari 2011; Supraba 2014), namun hasilnya belum sepenuhnya efektif. Kelompok agens hayati lain yaitu khamir dan bakteri berpotensi untuk dijadikan sebagai alternatif pengendalian berbagai penyakit tanaman. Wachowska
2 et al. (2010) mengisolasi khamir epifit dan khamir endofit dari buah apel, pir, plum, jeruk, anggur, dan stroberi, serta dari daun apel, jeruk, anggur, stroberi liar, dan stroberi. Pada pengujian in vitro, 19% dari total isolat dapat menghambat pertumbuhan Botrytis cinerea secara signifikan. Selain itu, buah anggur yang diberi perlakuan isolat khamir epifiit yang didapat dari epidermis buah anggur, baik 1 maupun 24 jam sebelum inokulasi B. cinerea, dapat menurunkan kejadian penyakit kapang kelabu hingga mencapai 80% (Vargas et al. 2012). Hartati et al. (2014) berhasil memperoleh 43 isolat khamir epifit yang diisolasi dari daun dan buah cabai, dengan 23 isolat menunjukkan potensi sebagai agens antagonis Colletotrichum acutatum penyebab penyakit antraknosa, penyakit pascapanen penting pada cabai. Sementara itu, percobaan yang dilakukan oleh Latha et al. (2011) menunjukkan bahwa pada pengujian in vitro beberapa isolat P. fluorescens dapat menekan pertumbuhan miselium Lasioderma theobromae hingga 53.00% dan isolat B. subtilis dapat menekan hingga 52.00%. Oleh sebab itu penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi khamir dan atau bakteri dari tanaman jeruk untuk menghambat pertumbuhan in vitro B. theobromae.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat khamir dan bakteri epifit serta endofit yang dapat menghambat pertumbuhan in vitro B. theobromae.
Manfaat Penelitian Keberhasilan isolat khamir dan bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan in vitro B. theobromae akan menjadi acuan untuk alternatif pengendalian penyakit busuk pangkal batang pada tanaman jeruk.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dari bulan April sampai Agustus 2016.
Metode Penelitian Isolasi Khamir dan Bakteri Epifit dari Bagian Tanaman Sehat Isolasi dilakukan menurut metode Hartati et al. (2014). Sebanyak 10 gram kulit batang sehat, akar, dan daun dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi 100 ml aquades steril, kemudian dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan
3 120 rpm selama 15 menit. Setelah itu, dilakukan pengenceran bertingkat dari 10-1 sampai 10-3. Sebanyak 0.1 ml suspensi yang diambil dari setiap hasil pengenceran disebar dalam media NA (Nutrient Agar), MEA (Malt Extract Agar), dan YGCA (Yeast Glucose Chloramphenicol Agar), kemudian diratakan menggunakan segitiga penyebar. Selanjutnya diinkubasi selama 3 sampai 4 hari. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati berdasarkan Hadieotomo (1993). Pengamatan mikroskopis terhadap setiap koloni dilakukan untuk mengetahui bentuk dan ukuran sel agar dapat membedakan antara khamir dan bakteri. Pemurnian khamir dilakukan pada media PDA (Potato Dextrose Agar) dan pemurnian bakteri dilakukan pada media NA. Penyimpanan khamir dilakukan pada media PDA miring sementara penyimpanan bakteri dilakukan pada media NA miring dan disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 ˚C. Isolasi Khamir dan Bakteri Endofit dari Bagian Tanaman Sehat Isolasi dilakukan menurut metode Mukhtar et al. (2010) dengan beberapa modifikasi. Bagian tanaman yang akan digunakan disterilisasi permukaan terlebih dahulu dengan alkohol 70% dan NaOCl 1%. Keberhasilan sterilisasi diuji dengan menyebarkan masing-masing air sisa bilasan pada media NA, MEA, dan YGCA. Setelah itu, kulit batang, akar, dan daun dipotong kecil-kecil dan dilumatkan menggunakan mortar, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dari 10-1 sampai 10-3. Sebanyak 0.1 ml suspensi yang diambil dari setiap hasil pengenceran disebar dalam media NA, MEA, dan YGCA, kemudian diratakan menggunakan segitiga penyebar. Inkubasi, pemurnian, dan penyimpanan dilakukan dengan cara yang sama seperti pada isolasi khamir dan bakteri epifit. Uji Patogenisitas Khamir Khamir dengan kerapatan sel sebesar 107 sampai 108 cfu ml-1 digunakan pada pengujian patogenisitas. Uji patogenisitas in vivo dilakukan dengan menggunakan batang bibit jeruk. Setiap batang yang telah disterilisasi diinokulasi dengan satu koloni khamir. Pengamatan terhadap gejala nekrotik yang muncul dan kemampuan khamir dalam mengkolonisasi batang jeruk dilakukan setiap hari selama 7 hari. Uji Hipersensitif Bakteri pada Tanaman Indikator Pengujian patogenisitas untuk bakteri dilakukan dengan menggunakan tanaman indikator, yaitu tembakau. Isolat bakteri diinokulasi pada media NB dan dikocok menggunakan shaker selama 24 jam. Suspensi bakteri kemudian disuntikkan pada daun tembakau. Pengamatan terhadap gejala nekrotik yang muncul pada daun dilakukan setiap hari selama 5 hari sambil dilakukan pemeliharaan terhadap tanaman. Uji Gram Bakteri Pengujian jenis Gram bakteri dilakukan menggunakan KOH 3%. Metode pengujian dengan KOH 3% dilakukan dengan mencampurkan 1 lup koloni bakteri dengan KOH 3% pada kaca preparat steril. Jika terbentuk konsistensi berlendir saat lup diangkat dari campuran bakteri dan KOH 3%, koloni bakteri dapat dikategorikan sebagai Gram negatif, sementara jika konsistensi campuran tetap cair koloni bakteri dapat dikategorikan sebagai Gram Positif (Suslow et al. 1982).
4
Pengujian Keefektifan Khamir dan Bakteri terhadap B. theobromae In Vitro Uji hiperparasitisme khamir terhadap B. theobromae. Calon agens hayati yang diuji adalah yang tidak menunjukkan sifat patogenik terhadap tanaman. Media water agar dipotong persegi dan diletakkan di atas gelas objek. Disk biakan B. theobromae diletakkan di atas blok agar sementara biakan khamir digores melingkari disk B. theobromae, kemudian ditutup menggunakan cover glass. Gelas objek kemudian diletakkan ke dalam cawan petri dan diinkubasi selama 7 hari. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop untuk melihat interaksi hiperparasitisme yang terjadi. Afinitas khamir dianggap rendah jika sel yang menempel pada hifa <10; sedang jika sel yang menempel pada hifa 10-50; tinggi jika sel yang menempel pada hifa >50 (Chan & Tian 2005). Uji kultur ganda. Uji penghambatan pertumbuhan miselium cendawan patogen dilakukan berdasarkan metode Hartati et al. (2014). Biakan khamir atau bakteri digores secara melintang di bagian tengah media PDA di cawan petri. Disk biakan B. theobromae diletakkan di sisi kanan dan kiri goresan khamir atau bakteri dengan jarak sekitar 3 cm. Pertumbuhan biakan B. theobromae diamati setiap hari selama 5 hari dan kemampuan penghambatan isolat khamir dan bakteri dihitung menggunakan rumus: R1 R 2 X 100 % THR R1 dimana THR adalah tingkat hambatan relatif (%), R1 adalah diameter pertumbuhan B. theobromae pada control (mm), dan R2 adalah diameter pertumbuhan B. theobromae pada perlakuan (mm) Uji aktivitas enzim kitinase. Isolat khamir dan bakteri dikocok pada media PDB dan NB selama 24 jam pada kecepatan 120 rpm. Sebanyak 0.1 ml suspensi kemudian diteteskan pada kertas saring berdiameter yang telah diletakkan pada media koloidal kitin. Zona bening yang terbentuk di sekitar biakan menunjukkan kemampuan isolat dalam menghasilkan enzim kitinase. Indeks kitinolitik dihitung dengan rumus (Hartati et al. 2014): ΔY = y2/y1 dimana ΔY adalah indeks kitinolitik, y1 adalah lebar koloni khamir (mm), dan y2 adalah lebar zona bening di sekitar koloni (mm). Uji produksi senyawa volatil. Uji volatil dilakukan dengan menangkupkan cawan petri dengan media yang dikolonisasi khamir atau bakteri ke cawan petri yang telah diinokulasi dengan disk B. theobromae. Pertumbuhan B. theobromae diamati dengan mengukur diameter pertumbuhan selama 7 hari. Kemampuan penghambatan isolat khamir dan bakteri dihitung menggunakan rumus: THR =
X 100%
dimana THR adalah tingkat hambat relatif (%), dk adalah diameter B. theobromae pada kontrol (cm), dan dp adalah diameter B. theobromae pada perlakuan (cm). Uji Keamanan Khamir dan Bakteri terhadap Mamalia Pengujian keamanan khamir dan bakteri terhadap mamalia dilakukan berdasarkan metode Manns et al. (1994). Sebanyak 10 µl biakan diinokulasi pada media agar darah dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 oC. Zona bening
5 yang terbentuk di sekitar biakan isolat terbentuk apabila isolat mikroba yang diinokulasikan memiliki kemampuan haemolisis yaitu mampu menguraikan sel darah yang terdapat pada media. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Uji-uji in vitro dilakukan menggunakan rancangan percobaan acak lengkap dengan 3 ulangan. Tabel diolah dengan MS Office Excel 2010. Data tingkat hambatan relatif pada uji kultur ganda dan uji produksi senyawa volatil dianalisis ragam dan perlakuan yang berpengaruh nyata diuji lanjut dengan DMRT pada taraf nyata 5% menggunakan software SAS 9.1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Karakterisasi Khamir dan Bakteri Khamir dan bakteri diisolasi dari bagian tanaman jeruk sehat dengan harapan isolat yang didapat telah beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang sama dengan B. theobromae yang menyerang pertanaman jeruk. Sampel bagian tanaman diambil dari lahan jeruk milik petani di desa Situ Gede, Kabupaten Bogor dan di lahan petani jeruk di Blitar. Hasil isolasi dari bagian tanaman jeruk sehat diperoleh enam isolat khamir epifit, sepuluh isolat bakteri epifit, dan satu isolat bakteri endofit (Tabel 1).
Isolat* MAFL001 MBFG001 MBFG002 MCFG002 MCFG003 MCFG004 TBDL003 TBFG001 TBFG004 TBFG005 TBFG006 TBFG007 TBFG008 TBFG010 TCFG006 TCFG011 TCFG012 *
Tabel 1 Daftar isolat hasil isolasi Bagian Jenis tanaman Epifit Akar Epifit Batang Epifit Batang Epifit Daun Epifit Daun Epifit Daun Endofit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Batang Epifit Daun Epifit Daun Epifit Daun
Asal isolat Blitar Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Blitar Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor Bogor
Keterangan: M: khamir, T: bakteri, A: akar, B: Batang, C: daun, F: epifit, D: endofit, L: Blitar, G: Bogor
6 Bagian filosfer tumbuhan umumnya dikolonisasi oleh beraneka ragam bakteri, khamir, cendawan, dan alga. Bakteri dapat ditemukan pada permukaan tanaman dengan jumlah dan keragaman yang tinggi (Lindow dan Brandl 2003). Khamir dan cendawan mampu mengkolonisasi bagian permukaan daun secara lebih aktif, sementara spora cendawan mendominasi permukaan daun secara pasif (Andrews dan Harris 2000). Khamir seringkali tumbuh pada kondisi lingkungan yang lembab dimana banyak tersedia eksudat tanaman yang mudah terurai seperti gula dan asam amino sederhana. Oleh sebab itu, khamir umum ditemukan pada permukaan daun dan buah, pada akar, dan berbagai jenis makanan (Deacon 2003). Koloni isolat khamir yang diperoleh dibedakan secara makroskopis berdasarkan bentuk, warna, tepian, dan elevasi koloni (Tabel 2). Sebagian khamir memiliki koloni berwarna dan diperkirakan merupakan jenis khamir yang dapat menghasilkan pigmen warna. Filoplan umumnya dihuni oleh khamir yang menghasilkan pigmen warna, seperti genus Rhodotorula dan Sporobolomyces yang sering disebut sebagai khamir merah muda dan genus Cryptococcus yang tidak berpigmen dan sering disebut sebagai khamir putih (Rosa & Peter 2006). Tabel 2 Karakter morfologi koloni isolat khamir dan hasil identifikasi Isolat MAFL001 MBFG001
Bentuk Bundar Bundar
MBFG002
Bundar
MCFG002 MCFG003 MCFG004
Bundar dengan tepian timbul Bundar dengan tepian timbul Tak beraturan
Warna Putih susu Putih susu Merah muda pucat Cokelat muda
Tepian Licin Berlekuk
Elevasi Cembung Cembung
Hasil identifikasi Candida sp. 1 Candida sp. 2
Licin
Cembung
Rhodotorula sp. 1
Licin
Timbul
Sporobolomyces sp.
Merah muda
Licin
Cembung
Rhodotorula sp. 2
Merah muda
Berlekuk
Timbul
Rhodotorula sp. 3
a
b
c
d
e
f
a Gambar 1 Karakteristik sel khamir secara mikroskopis pada perbesaran 100x10 isolat MAFL001 (a), MBFG001 (b), MBFG002 (c), MCFG002 (d), MCFG003 (e), dan MCFG004 (f)
Sebagian besar isolat khamir memiliki bentuk sel bulat sampai oval dan isolat lainnya memiliki bentuk lonjong (Gambar 1). Ukuran sel khamir berkisar antara 4 sampai 6 µm, dengan komposisi nukleus sebesar 10% dari volume total sel dan dinding sel sebesar 10 sampai 25% massa kering sel (Milo & Phillips
7 2016). Lingkaran merah pada gambar 1b menunjukkan sel yang sedang berkecambah atau budding. Organel sel yang dapat dilihat dengan jelas pada Gambar 1e merupakan vakuola sentral yang merupakan organel sel terbesar yang berperan pada proses pembesaran sel (Deacon 2003). Berdasarkan karakteristik morfologi yang diamati, isolat MAFL001 dan MBFG001 termasuk ke dalam anggota genus Candida yang memiliki koloni berbentuk bundar, kering, dan tidak licin, berwarna putih susu, dan elevasi cembung. Khamir yang diisolasi oleh Glushakova et al. (2007) dari filosfer tanaman teridentifikasi sebagai C. oleophila memiliki karakteristik koloni yang mirip dengan isolat MAFL001 dan MBFG001. Selain itu, sel C. oleophila memiliki bentuk bundar sampai sedikit oval dengan ukuran 2.5 x 4.5 µm yang mirip dengan kedua isolat khamir tersebut. Isolat MBFG002, MCFG003, dan MCFG004 yang memiliki koloni berwarna merah muda termasuk ke dalam genus Rhodotorula yang memiliki bentuk sel oval sampai sedikit lonjong, sementara isolat MCFG002 yang memiliki koloni berwarna cokelat muda termasuk ke dalam genus Sporobolomyces yang memiliki bentuk sel lonjong. Koloni isolat bakteri yang diperoleh dibedakan secara makroskopis berdasarkan bentuk, warna, tepian, dan elevasi koloni (Tabel 3). Seluruh isolat memiliki karakteristik koloni yang berbeda-beda meskipun diisolasi dari bagian tanaman yang sama. Hal tersebut menunjukkan keragaman bakteri dari setiap bagian tanaman. Sebagian besar bakteri yang diisolasi dari batang dan daun memiliki koloni berwarna merah murah muda. Bakteri adalah penghuni daun dengan jumlah dan keragaman tertinggi, dengan jumlah yang dapat dikulturkan berkisar antara 102 hingga 1012 sel/g daun (Inacio et al. 2002). Seluruh isolat bakteri merupakan Gram positif.
Isolat TBDL003 TBFG001 TBFG004 TBFG005 TBFG006 TBFG007 TBFG008 TBFG010 TCFG006 TCFG011 TCFG012
Tabel 3 Karakter morfologi koloni isolat bakteri Bentuk Warna Tepian Elevasi Bundar Putih susu Siliat Datar Bundar Merah muda Siliat Cembung Tidak Merah Berlekuk Timbul beraturan Bundar Merah muda Siliat Timbul Tidak Krem Berlekuk Timbul beraturan Bundar Putih Licin Cembung Bundar Kuning Licin Datar Seperti Bundar Merah muda Licin tombol Bundar Merah muda Berombak Cembung Tidak Seperti Merah muda Berlekuk beraturan tombol Bundar Putih susu Licin Cembung
Gram + + + + + + + + + + +
8 Pengujian Patogenisitas Khamir dan Bakteri Deteksi sifat patogenik terhadap tanaman sangat penting bagi mikroorganisme yang akan digunakan sebagai agens antagonis (Hartati et al. 2014). Seluruh isolat khamir tidak bersifat patogen terhadap mamalia yang dicirikan dengan tidak terbentuknya zona bening atau zona kehijauan di sekitar biakan pada media agar darah (Tabel 4). Zona bening menunjukkan aktivitas hemolisin β yang mengakibatkan lisis total sel darah merah, sementara zona kehijauan menunjukkan aktivitas hemolisin α yang menunjukkan penurunan jumlah haemoglobin sel darah merah (Aryal 2015). Semua batang jeruk yang diinokulasi dengan khamir tidak menunjukkan gejala nekrotik sementara batang jeruk yang diinokulasi dengan B. theobromae menunjukkan gejala nekrotik 3 hari setelah inokulasi. Tabel 4 Hasil uji patogenisitas khamir Media
Isolat Candida sp. 1 Candida sp. 2 Sporobolomyces sp. Rhodotorula sp. 1 Rhodotorula sp. 2 Rhodotorula sp. 3
Batang bibit jeruka ++ ++ ++ ++ ++ ++
Agar darahb -
a
(-) = pada batang terdapat gejala nekrosis; (+) = pada batang tidak terdapat nekrosis; (++) = batang dikolonisasi oleh khamir. b (+) = pada media agar darah terdapat zona bening; (-)= pada media agar darah tidak terdapat zona bening
a
b
c
d
e
f
g
Gambar 2 Kolonisasi batang bibit jeruk oleh khamir Candida sp. 1 (a), Candida sp. 2 (b), Sporobolomyces sp. (c), Rhodotorula sp. 1 (d), Rhodotorula sp. 2 (e), Rhodotorula sp. 3 (f), dan gejala nekrosis pada kontrol positif (g) Gambar 2 menunjukkan batang bibit jeruk yang ditumbuhi oleh khamir (lingkaran merah) namun tidak menunjukkan gejala nekrotik dibandingkan dengan kontrol positif yang diinokulasi dengan B. theobromae. Pertumbuhan khamir juga terjadi pada uji patogenisitas yang dilakukan oleh Hartati et al. (2014) pada buah cabai. Keberhasilan khamir untuk tumbuh pada bagian tanaman menunjukkan kemampuan khamir untuk memanfaatkan nutrisi dan beradaptasi
9 dengan baik pada lingkungan tanaman tanpa menimbulkan efek negatif pada tanaman. Seluruh isolat bakteri tidak menghasilkan zona bening atau zona kehijauan pada media agar darah, sehingga dapat disimpulkan bahwa seluruh isolat tidak bersifat patogen terhadap mamalia (Tabel 5). Sementara itu, sembilan isolat bakteri tidak menunjukkan gejala nekrosis pada daun tembakau, sementara dua isolat lainnya, yaitu isolat TBFG005 dan isolat TCFG012 menunjukkan gejala klorosis sehingga kedua isolat ini dianggap bersifat patogen terhadap tanaman (Gambar 3). Tabel 5 Hasil uji patogenisitas bakteri Media
Kode Isolat TBDL003 TBFG001 TBFG004 TBFG005 TBFG006 TBFG007 TBFG008 TBFG010 TCFG006 TCFG011 TCFG012 a b
Daun tembakaua + +
Agar darahb -
(+) = pada daun terdapat gejala nekrosis; (-) = pada daun tidak terdapat nekrosis (+) = pada media agar darah terdapat zona bening; (-)= pada media agar darah tidak terdapat zona bening
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
Gambar 3 Gejala klorosis pada daun tembakau yang diinokulasi dengan bakteri isolat TBFG005 (d) dan TCFG012 (k) serta gejala nekrosis pada daun yang diinokulasi dengan Xanthomonas oryzae pv oryzae (l)
10 Pengujian Keefektifan Khamir terhadap B. theobromae In Vitro Mekanisme yang berperan penting pada aktivitas biokontrol khamir terhadap cendawan termasuk di antaranya kompetisi nutrisi dan ruang, produksi enzim laminarinase dan kitinase, mampu menekan tingkat perkecambahan spora dan mengurangi ukuran panjang tabung kecambah, dan penghambatan pertumbuhan miselium dengan metabolit difusi dan metabolit volatil (Nally et al. 2015). Isolat khamir Candida sp. 1 dan Rhodotorula sp. 2 merupakan isolat dengan keefektifan tertinggi dalam menekan pertumbuhan B. theobromae (Tabel 6). Candida sp. 1 dan Rhodotorula sp. 2 mampu menekan pertumbuhan B. theobromae secara langsung dan memiliki kemampuan hiperparasitisme yang tinggi. Selain itu, Candida sp. 1 juga memproduksi senyawa toksik volatil sementara Rhodotorula sp. 2 mampu memproduksi enzim kitinase. Candida sp. 1 menunjukkan tingkat hambatan relatif tertinggi dibanding isolat khamir yang lain pada uji produksi senyawa volatil. Penelitian yang dilakukan oleh Gholamnejad et al. (2010) menunjukkan bahwa tiga strain C. membranfaciens memiliki tingkat hambatan relatif antara 57.18 sampai 78.94% terhadap Penicillium expansum pada uji volatil. Produksi senyawa volatil oleh khamir Candida sp. 1 menyebabkan pertumbuhan miselium B. theobromae lebih lambat, lebih tipis, dan terhambatnya pembentukan konidia dibandingkan dengan koloni kontrol pada 4 HSI (Gambar 4) tanpa adanya kontak langsung di antara keduanya. Koloni B. theobromae pada perlakuan khamir delapan hari setelah inokulasi masih berwarna putih keabu-abuan sementara kontrol sudah berwarna hitam (Gambar 5). Senyawa volatil yang diproduksi oleh khamir dari filum Ascomycota yang diisolasi dari daerah tropis ditemukan dalam bentuk alkohol, aldehid dan ester (Buzzini et al. 2003). Senyawa volatil tersebut bersifat sebagai mikofumigan, sehingga khamir yang mampu menghasilkan senyawa-senyawa tersebut dapat menekan pertumbuhan cendawan patogen. Tabel 6 Hasil pengujian kemampuan antagonis khamir terhadap B. theobromae in vitro THR oleh THR pada Indeks Hiperparasenyawa uji kultur Keefektifanc kitinolitik sitismeb a a volatil(%) ganda(%) Kontrol 0 0 0.00 +++ ++ 19.22a Candida sp. 1 15.09a 0.00 ++ 0.00b Candida sp. 2 7.08b 0.00 + 3.92b Sporobolomyces sp. 10.38ab 0.00 +++ + 0.78b Rhodotorula sp. 1 12.74ab 0.00 +++ ++ 4.71b Rhodotorula sp. 2 16.04a 3.12 +++ + 0.00b Rhodotorula sp. 3 7.08b 0.00 a Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada lajur yang sama menunjukkan perbedaan nyata pada uji Duncan α=5 b (-) Tidak memiliki kemampuan hiperparasitisme; (+) Kemampuan hiperparasitisme rendah; (++) Kemampuan hiperparasitisme sedang; (+++) Kemampuan hiperparasitisme tinggi. c (-) Tidak efektif; (+) Keefektifan rendah; (++) Keefektifan sedang; (+++) Keefektifan tinggi. Isolat
11
a
b
Gambar 4 Pertumbuhan miselium B. theobromae terhambat dan lebih tipis pada perlakuan khamir Candida sp. 1 (a) dibanding kontrol (b) pada uji produksi senyawa toksik volatil
a
b
e
c
f
d
g
Gambar 5 Perbedaan warna koloni B. theobromae pada perlakuan khamir yang masih berwarna abu-abu (a-f) dibanding kontrol (g) delapan hari setelah inokulasi Sementara itu, mekanisme penekanan oleh khamir pada interaksi langsung dengan patogen dapat terjadi melalui persaingan ruang dan nutrisi (Sugipriatini 2009) dan melibatkan penggunaan senyawa metabolit sekunder atau senyawa toksik sehingga menghambat pertumbuhan patogen (Hagagg dan Mohamed 2007). Rhodotorula sp. 2 menunjukkan tingkat hambatan relatif tertinggi pada perlakuan kultur ganda. R. mucilaginosa memiliki tingkat hambatan relatif antara 34.51 sampai 61.4% terhadap P. expansum pada uji kultur ganda (Gholamnejad et al. 2010). Selain itu, Rhodotorula sp. 2 merupakan satu-satunya isolat yang menghasilkan zona bening pada media koloidal kitin (Gambar 6). Zona bening merupakan salah satu karakteristik aktivitas kitinolitik. Kitinase dihasilkan oleh khamir dengan menghidrolisis kitin menjadi monomer N-asetil glukosamina yang digunakan sebagai sumber karbon (Yanai et al. 1992). Isolat khamir yang menghasilkan zona bening pada media kitin berpotensi mendegradasi dinding sel B. theobromae yang sebagian besar tersususan atas kitin.
12
a
b
c
Gambar 6 Zona bening di sekitar biakan khamir MCFG003 pada media koloidal kitin (a); terbentuk zona bening pada margin biakan khamir Rhodotorula sp. 2 dan ujung hifa B. theobromae (b) dibanding kontrol (c) pada uji kultur ganda Kemampuan hiperparasitisme khamir dapat mengakibatkan keabnormalan pada hifa cendawan. Hashem dan Alamri (2009) menyebutkan bahwa hifa yang terkolonisasi oleh khamir dapat mengalami perubahan bentuk seperti pembengkakan dan penonjolan pada hifa, melubangi dinding sel hifa, serta kerusakan pada hifa yang kemudian dapat dipenetrasi oleh sel khamir. Candida sp. 1, Rhodotorula sp. 1, Rhodotorula sp. 2, dan Rhodotorula sp. 3 mampu memparasit hifa B. theobromae dengan afinitas tinggi dan menyebabkan malformasi pada hifa yang diparasiti., Candida sp. 1, Rhodotorula sp. 1, dan Rhodotorula sp. 3 menyebabkan penyusutan ukuran hifa sehingga hifa terlihat kurus dan berlekuk-lekuk (Gambar 7a, 7b, 7d). Sementara itu, Rhodotorula sp. 2 menyebabkan pembengkakan hifa dan terbentuknya tonjolan pada hifa (7c). Produksi enzim pendegradasi dinding sel seperti kitinase dan β-1,3-glukanase berkolerasi dengan kemampuan penempelan sel khamir ke hifa patogen (Chan & Tian 2005). a
b
c
d
Gambar 7 Hifa B. theobromae yang abnormal setelah diparasit oleh sel khamir Candida sp. 1 (a), Rhodotorula sp. 1 (b), Rhodotorula sp. 2 (c) dan Rhodotorula sp. 3 (d)
Pengujian Keefektifan Bakteri terhadap B. theobromae In Vitro Mikroorganisme yang bersifat antagonis dapat langsung menghambat patogen dengan cara: 1) sekresi antibiotik, toksin, atau biosurfaktan; 2) kompetisi dalam kolonisasi ruang dan nutrisi; 3) kompetisi mineral; 4) menurunkan patogenesitas patogen; dan 5) parasitisme dengan mensekresi enzim pendegradasi dinding sel (Berg 2009). Bakteri antagonis merupakan bakteri yang dapat memberi pengaruh negatif terhadap pertumbuhan organisme lainnya. Beberapa
13 mekanisme terlibat dalam penekanan serangan patogen oleh bakteri, baik secara langsung di dalam tanaman seperti antibiosis terhadap patogen dan kompetisi terhadap nutrisi, maupun secara tidak langsung dengan cara menginduksi respons ketahanan pada tanaman (Senthil et al. 2011). Isolat bakteri TBFG007 dan TBFG008 merupakan isolat dengan keefektifan tertinggi dalam menekan pertumbuhan B. theobromae (Tabel 7). Isolat TBFG007 dan TBFG008 mampu menekan pertumbuhan B. theobromae secara langsung dan memproduksi senyawa volatil yang mampu menghambat pertumbuhan miselium B. theobromae. Selain itu, isolat TBFG008 juga menghasilkan enzim kitinase yang dapat melisis dinding sel B. theobromae yang sebagian besar terdiri atas kitin. Isolat yang menunjukkan keefektifan tertinggi adalah isolat yang memiliki lebih dari satu mekanisme penekanan terhadap B. theobromae dengan harapan bahwa jika salah satu kemampuan penekanan patogen tidak efektif karena beberapa faktor seperti kondisi lingkungan yang tidak sesuai atau tingginya virulensi patogen, agens tersebut masih memiliki mekanisme penekanan lainnya. Oleh sebab itu, meskipun isolat TBFG006 menunjukkan tingkat hambatan relatif yang tinggi pada uji volatil dan isolat TCFG011 menunjukkan tingkat hambatan relatif tertinggi pada uji kultur ganda, kedua isolat ini dianggap masih memiliki keefektifan yang rendah. Tabel 7 Hasil pengujian kemampuan antagonis bakteri terhadap B. theobromae in vitro THR oleh THR pada uji Indeks Isolat senyawa volatil kultur ganda Keefektifanb kitinolitik a a (%) (%) 0 Kontrol 0 0.00 41.79ab TBDL003 1.69cd 0.00 + TBFG001 -13.59b -8.61d 0.00 TBFG004 20.00ab 14.79c 0.00 + TBFG006 52.82ab 16.67c 0.00 + TBFG007 48.72ab 40.54ab 0.00 ++ TBFG008 58.97a 19.94bc 1.87 ++ TBFG010 -2.56ab 15.73c 0.00 TCFG006 8.72ab 7.77cd 0.00 TCFG011 12.82ab 42.42a 0.00 + a
Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada lajur yang sama menunjukkan perbedaan nyata pada uji Duncan α=5%. b (-) Tidak efektif; (+) Keefektifan rendah; (++) Keefektifan sedang; (+++) Keefektifan tinggi.
Penghambatan pertumbuhan miselium B. theobromae terlihat pada perlakuan dengan bakteri isolat TBFG006, TBFG007, dan TBFG008, sementara kontrol sudah memenuhi lebih dari setengah diameter cawan pada uji produksi senyawa volatil (Gambar 8). Tingkat hambatan relatif tertinggi terhadap pertumbuhan B. theobromae didapat dari perlakuan dengan isolat TBFG008 dengan persentase hambatan mencapai 59%. Giorgio et al. (2015) menyebutkan bahwa meskipun pada uji produksi senyawa volatil terdapat beberapa bakteri yang
14 tidak mampu menghambat pertumbuhan miselium cendawan patogen, namun senyawa volatil yang dihasilkan mampu menghilangkan pigmentasi warna miselium cendawan. Selain menghilangkan pigmen warna miselium, beberapa bakteri juga mampu menurunkan kemampuan perkecambahan spora cendawan. Cendawan dan bakteri mampu menghasilkan banyak senyawa volatil organik sebagai campuran alkohol, aldehida, ester, terpenoid, dan molekul-molekul ringan lainnya yang dapat menguap dengan mudah (Morath et al. 2012).
a
b a
c
d
Gambar 8 Pertumbuhan B. theobromae terhambat pada perlakuan isolat TBFG008 (a) dan lebih lambat pada perlakuan isolat TBFG006 (b) dan isolat TBFG007 (c) dibanding kontrol yang sudah memenuhi setengah cawan (d) pada uji produksi senyawa volatil Kompetisi ruang dan nutrisi antara mikroba antagonis dan patogen kemungkinan besar merupakan mekanisme penekanan utama oleh antagonis terhadap perkembangan patogen (Sharma et al. 2009). Mekanisme penekanan cendawan oleh bakteri umumnya melibatkan produksi siderofor, penurunan faktor virulen cendawan, sampai produksi beragam komponen antifungi yang terjadi saat keduanya berada dalam jarak dekat atau terjadi kontak fisik di antara keduanya (Kai et al. 2007). Zona bening yang terbentuk pada margin biakan bakteri dengan ujung hifa cendawan menunjukkan bahwa bakteri menghasilkan suatu senyawa atau enzim pendegradasi dinding sel sehingga mampu menghambat pertumbuhan patogen. Namun pada penelitian ini terlihat bahwa zona bening yang terbentuk sangat tipis (Gambar 9).
15
a
b
c
Gambar 9 Pembentukan zona bening pada margin isolat TBFG007 dengan ujung hifa B. theobromae (a) Pertumbuhan hifa yang lebih tipis di dekat isolat TCFG011 (b) dibanding kontrol (c) Pengujian kultur ganda antara bakteri Bacillus spp. dan cendawan yang dilakukan oleh Giorgio et al. (2015) pada media PDA menunjukkan kurang bahkan tidak ada kemampuan penghambatan oleh bakteri dibanding pengujian yang dilakukan pada media King’s B agar (KBA) dan minimal medium agar (MMA). Berdasarkan hal tersebut, terdapat kemungkinan bahwa jenis media juga dapat mempengaruhi kemampuan bakteri untuk menghasilkan senyawa difusi untuk menekan pertumbuhan patogen.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Dari bagian tanaman jeruk berhasil diperoleh enam isolat khamir nonpatogenik, sembilan isolat bakteri nonpatogenik, dan dua isolat bakteri patogenik. Isolat khamir yang mampu menghambat pertumbuhan in vitro B. theobromae ialah isolat MAFL001 dan MCFG003 yang berturut-turut teridentifikasi sementara sebagai Candida sp. dan Rhodotorula sp. Candida sp. menghambat B. theobromae melalui mekanisme hiperparasitisme yang tinggi dan produksi senyawa volatil yang toksik. Sedangkan Rhodotorula sp. menghambat B. theobromae melalui mekanisme enzimatis kitinase dan hiperparasitisme yang tinggi, tanpa kemampuan produksi senyawa toksin yang volatil. Isolat bakteri yang berhasil diisolasi dan memiliki kemampuan penghambatan patogen yaitu isolat TBFG007 dan TBFG008. Mekanisme penghambatan in vitro yang dilakukan ialah enzimatis kitinase dan antibiosis. Saran Perlu dilakukan pengujian in vivo dan in planta untuk mengetahui kemampuan isolat khamir dan bakteri dalam menekan kejadian dan keparahan penyakit busuk pangkal batang. Selain itu juga perlu dilakukan isolasi khamir dan bakteri dari rhizosfer tanaman jeruk yang berpotensi sebagai agens antagonis B. theobromae.
16
DAFTAR PUSTAKA Andrews JH, Harris RF. 2000. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces. Annu Rev Phytopathol 38:145-180. Aryal S. Haemolysis of Streptococci and its types with examples [Internet]. [diunduh 16 Des 2]. Tersedia pada: http://www.microbiologyinfo.com/haemolysis-of-streptococci-and-its-typeswith-examples/ [BBPP] Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 2005. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis Jeruk. Departemen Pertanian. Berg G. 2009. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspective for controlled use of microorganisms in agriculture. Appl Microb Biotech 84(1): 11-18. doi: 10.1007/s00253-009-2092-7. Buzzini P, Martini A, Cappelli F, Pagnoni UM, Davoli P. 2003. A study on volatile organic compounds (VOCs) produced by tropical ascomycetous yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek. 84(4):301-11. Chan Z, Tian S. 2005. Interaction of antagonistic yeasts against postharvest pathogens of apple fruit and possible mode of action. Posharv Biol Tech 36(2005): 215-223. doi: 10.1016/j.postharvbio.2005.01.001. Deacon J. 2003. The microbial world: yeast and yeast-like fungi [Internet]. [diunduh 16 Okt 23). Tersedia pada: http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/yeast.htm Gholamnejad J, Etebarian HR, Sahebani N. 2010. Biological control of apple blue mold with Candida membranifaciens and Rhodotorula mucilaginosa. Afr J Food Sci 4(1): 1-7. Giorgio A, De Stradis A, Lo Cantore P, Iacobellis NS. 2015. Biocide effects of volatile organic compounds produced by potential biocontrol rhizobacteria on Sclerotinia sclerotium. Front. Microbiol. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2015.01056. Glushakova AM, Yurkov AM, Chernov IY. 2007. Massive isolation of anamorphous Ascomycete yeasts Candida oleophila from plant phyllosphere. Microbiol 76(6): 799-803. doi 10.1134/S0026261707060215. Hadieotomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek (Teknik dan Prosedur Laboratorium). Jakarta (ID): PT. Gramedia Pustaka Utama. Hagagg WM, Mohamed HAA. 2007. Biotechnological aspects of microorganisms used in plant biological control. American-Eurasian J Sust Agri 1(1): 7-12. Hardiati NR. 2015. Peran mikoriza arbuskular, kitosan, dan Trichoderma harzianum dalam pengendalian penyakit busuk pangkal batang (Botryodiplodia theobromae Pat.) pada tanaman jeruk [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Hartati S, Wiyono S, Hidayat SH, Sinaga MS. 2014. Seleksi khamir epifit sebagai agens antagonis penyakit antraknosa pada cabai. J Hort 24(3):258-265. Hashem M, Alamri S. 2009. The biocontrol of postharvest disease (Botryodiplodia theobromae) of guava (Psidium guajava L.) by the application of yeast strain. Postharv Biol Tech 53(2009): 123-130.
17 Inacio J, Pereira P, de Carvalho M, Fonseca A, Amaral-Collaco MT, Martins IS. 2002. Estimation and diversity of phylloplane mycobiota on selected plants in a mediterranean-type ecosystem in Portugal. Microb Ecol 44: 344-353. Kai M, Effmert U, Berg G, Piechulla B. 2007. Volatiles of bacterial antagonists inhibit mycelial growth of the plant pathogen Rhizoctonia solani. Arch Microbiol 187(5):351-360. doi: 10.1007/s00203-006-0199-0. [Kementan] Kementerian Pertanian. 2016. Produksi jeruk siam/keprok menurut provinsi, 2011-2015 [Internet]. [diunduh 16 Okt 22]. Tersedia pada: http://www.pertanian.go.id/Data5tahun/pdf-HORTI2016/2.2Produksi%20Jeruk%20Siam.pdf Latha P, Anand T, Prakasam V, Jonathan EI, Paramathma M, Samiyappan R. 2011. Combining Pseudomonas, Bacillus, and Trichoderma strains with organic amendments and micronutrient to enhance suppression of collar and root rot disease in physic nut. Appl Soil Ecol 49:215-223. Lindow SE, Brandl MT. 2003. Microbiology of the phyllosphere. Appl Environ Microbiol 69(4):1875-1883. doi: 10.1128/AEM.69.4.1875-1883.2003. Manns JM, Mosser DM. 1994. Buckley HR. Production of a hemolytic factor by Candida albicans. Infect Immun 62:5154–5156. Milo R, Phillips R. 2016. How big is a budding yeast cell? [Internet]. [diunduh 16 Des 2]. Tersedia pada: book.bionumbers.org/how-big-is-a-budding-yeastcell/ Morath SU, Hung R, Bennett JW. 2012. Fungal volatile compounds: a review with emphasis on their biotechnological potential. Fungal Biol Rev 26(2012):73-83. http://dx.doi.org/10.1016/j.fbr.2012.07.001 Mukhtar I, Mushtaq S, Ali A, Khokhar I. 2010. Epiphytic and endophytic phyllosphere microflora of Cassytha filiformis L. and its hosts. ECOPRINT 17: 1-8. www.nepjol.info/index.php/eco Nally MC, Pesce VM, Maturano YP, Rodriguez Assaf LA, Toro ME, Castellanos de Figueroa LI, Vazquez F. 2015. Antifungal modes of action of Saccharomyces and other biocontrol yeasts against fungi isolated from sour and grey rots. IJFM 204: 91-100. Naqvi SAMH. 2004. Diseases of Fruits and Vegetables: Diagnosis and Management Volume I. Dordrecht (US): Kluwer Academic Publishers. Retnosari E. 2011. Identifikasi penyebab busuk pangkal batang jeruk (Citrus spp.) serta uji antagonisme in vitro dengan Trichoderma harzianum dan Gliocladium virens [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Rosa CA, Peter G, ed. 2006. Biodiversity and Ecophysiology of Yeast. Berlin (Gr): Springer. Senthil R, Prabakar K, Rajendran L, Karthikeyan G. 2011. Efficacy of different biological control agents against major postharvest pathogens of grapes under room temperature storage conditions. Phytopathol Mediterr 50:55-56. Sharma RR, Singh D, Singh R. 2009. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: a review. Biol Ctrl 50:205221. Sinaga MS, Wiyono S, Husni A, Kosmiatin M. 2009. Pemanfaatan batang bawah jeruk mutan dan mikoriza arbuskular untuk mengendalikan penyakit busuk pangkal batang phytophthora pada tanaman jeruk. Ringkasan Eksekutif Hasil-hasil Penelitian Tahun 2009: 45-47.
18 http://www.litbang.pertanian.go.id/ks/one/343/file/pemanfaatan-batangbawah-j.pdf. Soelarso RB. 1996. Budi Daya Jeruk Bebas Penyakit. Yogyakarta (ID): Kanisius. Sugiprihatini S. 2009. Potensi penggunaan khamir dan kitosan untuk pengendalian busuk buah Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffn & Maubl. (syn. Botryodiplodia theobromae Pat.) pada buah mangga selama penyimpanan [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Supraba AP. 2014. Keefektifan fungi mikoriza arbuskular dan Gliocladium fimbriatum dalam mencegah busuk pangkal batang (Botryodiplodia theobromae) pada jeruk [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Suslow TV, Schroth MN, Isaka M. 1982. Application of a rapid method for Gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. J Phytopathol 72: 917-918. Triwiratno A. 2014. Gejala Serangan Penyakit Diplodia (Botryodiplodia theobromae Pat.) dan Pengendaliannya [Internet]. [diunduh 2015 Jun 2]. Tersedia pada: http://balitjestro.litbang.pertanian.go.id/id/gejala-seranganpenyakit-diplodia.dan-pengendaliannya. Vargas M, Garrido F, Zapata N, Tapia M. 2012. Isolation and selection of epiphytic yeast for biocontrol of Botrytis cinerea PERS. on table grapes. Chilean JAR 72(3): 332-338. Wachowska U, Stasiulewicz-Paluch AD, Kowalska E. 2010. Screening of epiphytic and endophytic yeast-like fungi as potential biocontrol agents against grey mould of the strawberry. Nauka Przyr 4(6):106-118. Yanai K, Takaya N, Kojima N, Horiuchi H, Ohta A, Takagi M. 1992. Purification of two chitinases from Rhizopus oligosporus and isolation and sequencing of the encoding genes. J Bacteriol 57: 7398-7406.
19
LAMPIRAN
20
21
Lampiran 1 Karakterisitik koloni bakteri berdasarkan Hadieotomo (1993)
Lampiran 2 Hasil uji potensi isolat sebagai patogen mamalia pada agar darah
a
b
Zona bening maupun zona kehijauan tidak terbentuk pada media agar darah di sekitar koloni isolat khamir (a) dan isolat bakteri (b)
22
Lampiran 3 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif khamir terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji produksi senyawa volatil Sumber Jumlah Kuadrat Db F-Hitung Nilai P Keragaman Kuadrat Tengah P 5 812.379854 162.475971 9.15 0.0009 Galat 12 213.148789 17.762399 Total 17 1025.528643 Lampiran 4 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif khamir terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji kultur ganda Sumber Jumlah Kuadrat Db F-Hitung Nilai P Keragaman Kuadrat Tengah P 5 301.5604605 60.3120921 2.93 0.0419 Galat 18 371.1285156 20.6182509 Total 23 672.6889761 Lampiran 5 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif bakteri terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji produksi senyawa volatil Sumber Jumlah Kuadrat Db F-Hitung Nilai P Keragaman Kuadrat Tengah P 8 16378.30375 2047.28797 1.73 0.1596 Galat 18 21332.14990 1185.11944 Total 26 37710.45365 Lampiran 6 Hasil analisis sidik ragam tingkat hambatan relatif bakteri terhadap pertumbuhan B. theobromae pada uji kultur ganda Sumber Jumlah Kuadrat Db F-Hitung Nilai P Keragaman Kuadrat Tengah P 8 13144.85171 1643.10646 5.05 0.0002 Galat 45 14649.87586 325.55280 Total 53 27794.72756
23
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Buntok, Kalimantan Tengah pada tanggal 31 Maret 1994 sebagai anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Malkan dan Asdah. Tahun 2012 penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas Negeri 1 Dusun Selatan dan pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Beasiswa Utusan Daerah (BUD). Selama kuliah penulis aktif dalam organisasi kemahasiswaan sebagai bendahara Forum Komunikasi Rohis Departemen Fakultas Pertanian (2012-2013), wakil bendahara Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman IPB (2012-2013), anggota English Conversation Club Departemen Proteksi Tanaman (2013-2015), dan ketua English Conversation Club Departemen Proteksi Tanaman (2015-2016). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Ilmu Hama Tumbuhan Dasar tahun 2015, praktikum Penyakit Benih dan Pascapanen tahun 2016, dan praktikum Hama Penyakit Tanaman Pangan dan Hortikultura tahun 2016. Pada tahun 2014 penulis diterima dalam program pertukaran pelajar ke Universiti Putra Malaysia dalam program Asean International Mobility for Student (AIMS) yang dibiayai oleh Kementerian Pendidikan selama satu semester.
