Využití NMR spektroskopie pro studium biomakromolekul
RCSB PDB
Uplatnění NMR spektroskopie ●
chemická struktura – kovalentní struktura – konformace, geometrie molekul
●
dynamické procesy – chemické a konformační výměny – reakční kinetika – dynamika molekul nebo jejich částí
●
aplikace v biologických vědách
RCSB PDB
– analýza přírodních látek – určení trojrozměrné struktury □
oligosacharidy a nukleové kyseliny – omezené možnosti
□
peptidy, proteiny
□
komplexy (NA–protein, enzym–substrát)
– dynamické studie
RCSB PDB Progr. NMR
Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR ●
měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí
●
sledování průběhu biochemických dějů
●
vysoce selektivní odezva na úrovni atomů
Čím jsme omezeni: ●
velikost molekuly (ovlivnění rychlostí relaxace NMR signálu) – do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA] □
lze řešit s přirozeným izotopovým zastoupením
– do 20 kDa [< 180 AA] □
nutné 100% isotopové obohacení
13C
a
15N
– do ~200 kDa □
100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)
– větší proteiny □
●
přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura
koncentrace vzorku – alespoň 0,2 mM
●
dlouhodobá stabilita vzorku – několik týdnů (ideálně při pokojové teplotě)
NMR = jaderná magnetická resonance ●
interakce elektromagnetického záření s atomovými jádry vzorku umístěného v silném magnetickém poli
●
elektromagnetické záření je v oblasti radiových vln
●
(101 – 102 MHz)
… princip NMR spektroskopie … → precese gyromagnetická (Larmorova frekvence) konstanta
→ rozdíl v populacích
a
rozdíl malý ⇒ nízká citlivost NMR → makroskopická magnetizace různé typy jader mají dostatečně odlišné frekvence absorbovaného elmg záření ⇒ při měření se detekuje jen jeden typ jader
… princip NMR spektroskopie – měření
z
z přijímač
RF vysílač
x
y
přijíma
excitace RF vysílač
č y
x zpětné vyzáření, detekce
NMR spektrum FID (free induction decay) Fourierova transformace
intenzita = f(Ω)
intenzita = f(t)
NMR spektrometry ●
FT NMR spektrometry s vysokým rozlišením – supravodivé magnety s B0 v rozmezí 11,6 až 23,2 T (1H frekvence 500 až 1000 MHz)
●
trojresonanční (kryo)sondy s vysokou citlivostí, cívky pro vytváření definovaných gradientů magnetického pole
Hlavní NMR parametry 1. počet a intenzita signálů – odráží situaci v molekule 2. chemický posun – umístění atomu v molekule (≡ frekvence absorbovaného záření) 3.
3. interakční konstanty – nejbližší vazebné okolí (počet atomů, geometrie) 4. relaxační vlastnosti – struktura, dynamika molekuly (NOE)
1.
2.
Příklad 1H-NMR spektra: ethylacetát O CH H3 C
O
C CH
2 3
1H/
intenzita
2
3
3
ppm
Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin – kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)
CH3
H aromatické HN peptidické HN postranní
O
H N
C R1 AA1
C H
R2
H N H
C
C O
AA2
H N
O
●
C R3 AA3
C
H alifatické Hα
●
●
H ●
1H
spinové systémy jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N
Vícedimensionální NMR experimenty ●
rozlišení informací obsažených v 1D spektrech
●
příklad: 1H-15N HSQC spektrum
projekce spektra
projekce 1H spektra
15N
15
N
1
H
1H-15N ●
HSQC – „otisk palce“ proteinu
ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, … sbalený protein
nesbalený protein
(ppm)
15N (ppm)
15N (ppm)
1H
1H
(ppm)
Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku
obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)
naměření NMR spekter
výpočet souboru počátečních struktur
přiřazení signálů atomům v molekule
přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury
vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení
výpočet souboru struktur validace struktur
Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí ●
přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule
●
postup: 1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a
●
H
R1
C
N H
C
C O
H N
C R3
C
H
O
C
R2
H
O
H N
13C)
je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu
Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA 13Cγ 1H
O
15N
55 13C' 15 13Cα 1H
13Cβ
i−1
13Cγ
13Cβ
140 13Cα
15N
7
1H
35
90
55 13C'
11 <1
1H
O
HNCA – po excitaci HiN je magnetizace přenesena na Ni (1JHN,N) a dále současně na Ciα (1JN,Cα) a Cαi−1 (2JN,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(HiN), ω(Ni), ω(Ciα)} a {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}
i 13Cγ
HN(CO)CA – po excitaci HiN je magnetizace je přenesena na Ni (1JHN,N), dále na Ci−1 (1JN,C ) a na Ci−1α (1JC ,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}
1H
13Cβ
O
1H
35 55 13C' 15
15N
13Cα 1H
13Cβ
i−1
13Cγ
13Cα
15N
7 90
140 55 13C'
11 <1
1H
O
i interakční konstanty J v Hz
Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA ●
2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých amidických N HN(CO)CA
HNCA
HN(CO)CA
C N
H
někdy chybí pík…
HNCA
HN(CO)CA
HNCA
HN(CO)CA
HNCA
Chemický posun ●
chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře
chemický posun
α-helix
přiřazení resonancí hlavního řetězce (Hα, Cα a C')
výpočet indexů chemického posunu (CSI)
odhad sekundární struktury podle lokální hustoty CSI
δ(Hα)
klesá
roste
náhodné klubko
β-sheet
Histogram indexu chemického posunu jader Hα, Cα a C' −1 0 +1 sekvence proteinu C
N
helix I
helix II
helix III
helix IV
Nukleární Overhauserův efekt (NOE) ●
přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace
●
Vypovídá o blízkosti dvou atomů v prostoru bez ohledu na primární strukturu
γH τc ω
rIS
... ... ... ...
gyromagnetická konstanta 1H korelační čas molekuly Larmorova frekvence vzdálenost interagujících jader
NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. ●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. ●
dosah interakce do 5–6 Å
H H
Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce
Identifikace prvků sekundární struktury
Strukturní omezení z NMR parametrů
Výpočet trojrozměrné struktury
vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) ✔
dihedrální úhly z chemických posunů atomů páteře proteinu ✔
případně další omezení
✔
molekulová mechanika + simulované žíhání
Výpočet struktury proteinu ●
molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)
použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému –simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (103 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. Cílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. –přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie –například pro NOE: ●
energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu
V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnich/úhlů).
Vypočítané struktury
●
obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi – Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně. – Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.
●
struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru
soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)
vybraná reprezentativní struktura
Validace struktur ●
ověření “normality” struktur – Ramachandranův diagram – páteř proteinu – rotamery – Pakování Program Cing
Interakce proteinu s ligandem • • • •
Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)
• •
Farmaceutický průmysl Proteomické studie
• • • • •
Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování H-D chemické výměny NH skupin
Změny chemických posunů • • • •
Titrace proteinu ligandem Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji HN) Interakční povrch Disociační konstanta
Transferred NOESY H r<5Å
H • Princip: •
H NOE
chemická výměna r>5Å
H
informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována
• Uspořádání: „malý“ ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký • Podmínka • Využití: • •
substrát (Mw > 40 kDa) neviditelný pro NMR
vhodná kinetika systému 10-8 > Kd > 10-3 M-1 - struktura ligandu - nepřímo struktura vazebného místa - způsob vazby
•Peptid antikolagulační kaskády •Inhibitor trombinu
Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem • 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu
NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu
NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu
Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5C v komplexu s thrombinem
Struktura komplexu thrombinu Complex between thrombin and TM52+5C a ligandu TM52+5C
Studium dynamického chování molekul ●
molekuly nejsou statické, reagují a pohybují se v různých časových škálách
– různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují ●
funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě – regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace
●
vypočítaná struktura je někdy průměrem mnoha stavů – charakterizace
●
NMR dává možnost měřit molekulární procesy v různých časových škálách – chemické reakce (ms – s) – konformační výměny (μs – ms) – dynamika pohybu – relaxační vlastnosti
●
15N
a
13C
(ps – ns)
příklad: adenylát kinasa – globální konformační výměna; zde limituje rychlost enzymatické přeměny – rychlá dynamika residuí v místě ohybu
červeně: residua ovlivněná konformační výměnou žlutá šipka: rychlá dynamika
Wolf-Watz et
al.
(2004) Nat.
Struct.
