Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie

Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie

Využití NMR spektroskopie v jednotlivých oborech podle nositele Nobelovy ceny za chemii Prof. Richarda Ernsta:

Medicine Biochemistry Chemistry

Physics

J.W. Emsley: “NMR started as the plaything of the physicists, became the favourite toy of the chemists and finally went on to seduce biochemists.”

Důvody pro využití NMR spektroskopie ke studiu biomolekul

 fyziologické prostředí  jednoduchá příprava vzorku

 vysoce selektivní odezva  široký rozsah fyzikálně-chemických vlastností  protože se zabýváme NMR spektroskopií

1. Jaké typy biologicky aktivních molekul ? 

peptidy a proteiny



nukleové kyseliny



oligosacharidy

2. Jaký typ informace může být pomocí NMR získán? 

identifikace substrátu



prostorová struktura molekuly



studium dynamického chování systému



prostorová struktura komplexu



zkoumání vazby ligandu a substrátu

Strategie pro určování struktur biomolekul NMR vzorek NMR spektra

Přiřazení signálů

NMR experimenty

Přiřazení experimentálních NMR parametrů (NOE…)

Obecné informace o molekule (primární struktura, kovalentní vazby…)

Odhad přibližné struktury

Zhodnocení kvality struktur

Oprava přiřazení NMR parametrů, signálů

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajů pro soubor konečných struktur

Porovnání s databázemi (Procheck, Whatif….)

Výpočet NOESY spekter

Požadavky na vzorek pro NMR experimenty



Úspěšné řešení proteinových struktur bezpodmínečně vyžaduje kvalitní spolupráci mezi NMR specialisty a biochemiky !



Vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný během NMR experimentů !!! rozpouštědlo H2O + 5-10% D2O (časová stabilizace magnetického pole) pufr

nejběžnější je fosfátový pufr, neobsahuje žádné protony acetátový pufr (lze pořídit deuterovaný)

teplota

podle požadavků studovaného materiálu (15 – 40C)

aditiva

nutná aditiva je možné někdy zaměnit za deuterovaná analoga

koncentrace pro NMR experimenty musí být v rozsahu alespoň 0.1-1.0 mM, vzorek nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení v tomto konc. rozmezí stabilita nutná dlouhodobá stabilita v rozsahu minimálně několika týdnů

Příprava vzorku proteinu pro NMR měření 1. Získání DNA proteinu 2. Příprava plasmidové DNA 3. Exprese rekombinantního proteinu, např. v E.Coli 4. Izolace a čištění 5. Zakoncentrování vzorku

6. Zopakování procesu se značeným médiem

Příprava vzorků se zvýšeným obsahem

13C/15N

C C

H

C

H CO

C CO

N

C

H

H

H

Exprese proteinů: - v minimálním médiu (15NH4Cl, 15NH4SO4 - jediný zdroj 15N ) (13C-glukosa, 13C-glycerol - jediný zdroj - izotopově obohacené růstové médium

13C)

Segmentové izotopové obohacení

Capsidový protein HIV-1 N-terminální doména

C-terminální doména

Segmentové izotopové obohacení

1. Obě domény se exprimují zvlášť

N-term Intein N-term

Tag

Cys

C-term

2. Intein se odštěpí thiolem a Tag proteasou

N-term

Intein N-term

Tag

Cys

C-term

3. Domény se spojí vytvořením peptidové vazby

N-term

Cys

C-term

Segmentové izotopové obohacení 15N

1 doména obohacena (15N)

1H

celý protein obohacen (15N)

„Cell-free“ expresní systém

Zdroj: propagační materiál firmy Promega

Přehled metod pro izotopové obohacení proteinů

http://www.protein-nmr.org.uk/labelling.html

Postup přípravy izotopově obohaceného vzorku • Příprava neznačeného vzorku proteinu o příslušné koncentraci kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace

sledování dlouhodobé stability • Příprava 15N obohaceného vzorku proteinu kontrola čistoty proteinu kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace

• Příprava 13C/15N (13C/15N/2H) obohaceného vzorku proteinu vlastní strukturní studie

Zakoncentrování vzorku Koncentrace měřeného vzorku v případě využití chlazené sondy Objem roztoku

~ 0,5 – 1,0 mM ~ 0,1 – 0,5 mM 250 - 500 l

Srovnání NMR spekter sbalené a nesbalené struktury proteinu správně sbalená forma proteinu nesbalená forma téhož proteinu 83 AA (9 kDa)

(1H)

1H- 15N

10.5

10.0

WVQPI

107 AA (12 kDa)

IMMCS

WVQPI

107 AA (12 kDa)

IMMCS

9.5

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

korelace v oblasti amidických vodíků (vzorek nespecificky obohacen 15N) (15N)

čerstvě připravený 108 110 vzorek

vzorek po 5 dnech

112 114 116 118 120 122 124 126 128 (1H) 9.5

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

ppm

9.5

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

ppm



NMR experimenty










Biomolekulární NMR spektroskopie: měřená jádra

1H

 vysoké přirozené zastoupení (99.98%)  vysoká citlivost (1.00)  malá disperze chemických posunů NMR signálů (~15.0 ppm)

13C

 velká disperze chemických posunů NMR signálů (~200.0 ppm)  nízké přirozené zastoupení (1.108%), možné uměle navýšit až na 100%  nízká citlivost (1.76x10-4), po 100%ním izotopovém obohacení (1.59x10-2)

15N

 střední disperze chemických posunů NMR signálů (~30.0 ppm) (oproti 13C nezávislost na typu aminokyseliny)  nízké přirozené zastoupení (0.37%), možné uměle navýšit až na 100%  velmi nízká citlivost (3.85x10-6), po 100%ním izotopovém obohacení (1.04x10-3)

2H

 používá se pro speciální účely

Potlačení signálu vody Proč H2O? 1. Voda je fyziologické prostředí 2. Nelze použít D2O z důvodů chemické výměny s amidickými protony.

Signál H2O je 104-105 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly.

Potlačení signálu vody: metoda presaturace 90° CW-ozařování

Během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým RF polem. 1H

spektrum proteinu po presaturaci H2O

zbytkový signál H2O

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE Selektivní manipulace se signály vody a rozpuštěné látky doplněná o čistící gradientní echo.

90° 180°

t

1H

G

t G

G Selektivní 180° puls

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE

Multidimensionální NMR spektroskopie

F2(13C)

F1(15N) F3(1H)

H 1H

- spektrum H

H

H

H

8.5

8.0

7.5

7.0

ppm

6.5

H

H

N

6.0

5.5

1D 1H spektrum proteinu kuřecí lysozym 129 AA, Mw = 14.6 kDa methyl H

aromatic H NH-backbone aliphatic H NH-SC CH

Odezva více jader v jednom spektru 13

C

pN (0 ≤ pN ≤ 1)

35Hz

13

C

H

13

C130HzH

35Hz

35Hz

C55Hz 13C’ 15Hz 15N 11Hz 13C 55Hz 13C’

13

140Hz 7Hz

H pH (0 ≤ pH ≤ 1)

<1Hz

90Hz

HN

H

pravděpodobnost překryvu

při zobrazení jednoho jádra pH(H),pN(N) a pC(C) při zobrazení dvou jader (H-N) najednou P = pH . pN při zobrazení tří jader (H-N-C) najednou P = pH . pN . pC

pC (0 ≤ pC ≤ 1)

Korelační spektroskopie jako nástroj pro zjednodušení NMR spekter 1D

3D

F1(1H) F2(X)

2D

F2(1H)

F1(1H/X) F3(1H) F3(X)

4D

Lepší rozlišení je ve vícedimenzionálních spektrech zajištěno využitím izotopového obohacení 15N a 13C.

F2(X)

F4(1H)

F1(1H/X)

F1(1H)

Přiřazování rezonancí • NMR experimenty pro přiřazení signálů pracují se dvěma nebo třemi různými jádry najednou (experimenty s trojnásobnou rezonancí), chemické posuny těchto jáder jsou navzájem zkorelovány. • Názvy takovýchto experimentů se tvoří podle typu jader, která korelují: HNCA koreluje amidický vodík s příslušným dusíkem a uhlíkem v pozici . HN(CO)CA koreluje stejné typy atomů (jader) jako HNCA, ale přes CO. To naznačuje směr korelace, tj. H a N i-té aminokyseliny a C aminokyseliny v pozici i-1. • Směr přenosu magnetizace je v případě těchto experimentů H N  C a zpět. Experimenty se nazývají „out and back“ • Naproti tomu přenos magnetizace u experimentů např. CBCA(CO)NH začíná na atomu CB (i-1) aminokyseliny a končí na amidickém H aminokyseliny následující, tj. experimenty „out and stay“.



NMR experimenty










Přiřazování rezonancí 13

C

HNCA experiment

35Hz

13

C

H

13

35Hz aminokyselinový zbytek I-1

13

C

55Hz

C’

13

11Hz 13

15Hz 15

N

130Hz

C

aminokyselinový zbytek I

35Hz

C

H

90Hz

N

H

H

C’

55Hz 13

140Hz 7Hz

H

<1Hz

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA

F2(15N )

I F1(13C) F2(15N ) I-1

F3(1HN) F1(13C) F3(1HN)

Přiřazování rezonancí 13

C

HN(CO)CA experiment

35Hz

13

C

H

13

35Hz

13

C

55Hz

130Hz

C

35Hz

C’

13

11Hz 13

15Hz 15

N

C

7Hz

90Hz

N

H

H

C’

55Hz 13

140Hz

H

H

<1Hz

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA/HN(CO)CA

F2(15N )

F2(15N )

I F1(13C) F2(15N ) I-1

F3(1HN) F1(13C) F3(1HN)

I-1

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce HN(CO)CA

missing crosspík

HNCA

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C

HNCACB experiment 13

C

Výhoda: chemický posun C je charakteristický pro typ aminokyselinového zbytku

35Hz

13

C

H

13

35Hz aminokyselinový zbytek I-1

13

C

55Hz

C’

13

11Hz 13

15Hz 15

N

130Hz

C

35Hz aminokyselinový zbytek I

C

H

90Hz

N

H

H

C’

55Hz 13

140Hz 7Hz

H

<1Hz

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C 13

HN(CO)CACB experiment

C 35Hz

13

C

H

13

35Hz

13

C

55Hz

130Hz

C

35Hz

C’

13

11Hz 13

15Hz 15

N

C

7Hz

90Hz

N

H

H

C’

55Hz 13

140Hz

H

H

<1Hz

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C

HNCACB/HN(CO)CACB experiment Ser11

L eu12

Thr13

L eu14

Trp15

25

30

35

40

13

( C)

45

50

55

60

65

70 (15N) 114.9 ppm (1H)

(15N) 123.7 ppm (1H)

(15N) 126.8 ppm (1H)

(15N) 124.7 ppm (1H)

(15N) 119.9 ppm (1H)

Přiřazování rezonancí postranních řetězců

H C H

H

C

H

C

H

H

C

H

C

C’

N

C

C’

H

H

H

N

H

Přiřazování rezonancí postranních řetězců H

H

Kompletní přiřazení Prolinu 4 proteázy M-PMV pomocí hCCH-COSY spektra

 

H H: 4.296 ppm ppm

H: 1.818 ppm Pro4CG-CB-HB2

30 Pro4CB-CA-HA

Pro4CB-CB-HB2

H: 2.185 ppm

H: 1.913 ppm

Pro4CG-CB-HB3

Pro4CG-CG-HG

Pro4CB-CB-HB3

Pro4CB-CG-HG

H: 3.589 ppm

H: 3.715 ppm

Pro4CG-CD-HD2

30

H



O

H3C

O

3D

13

( C)

40

 N

H

Pro4CG-CD-HD3

40

H

H

Pro4CD-CG-HG

50

Pro4CD-CD-HD3

Pro4CD-CD-HD2

50

F2(1H) 60

60 Pro4CA-CA-HA

Pro4CA-CB-HB2

Pro4CA-CB-HB3

F1(13C) 65

60

35

30

35

30

30 (13C)

25

55

50

55

50

ppm

F3(13C)

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa  Práce s velkými molekulami způsobuje dvojí komplikaci  • velmi komplikovaná spektra • rychlá spin-spinová relaxace

R2 



 

2 2 H ( D) C 6 CH

8r

[ J ' s.... f (t )] c

H/ D ~ 6.6  Řešení: výměna atomů vodíku za deuterium 

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa  Exprese proteinu v růstovém médiu obohaceném o 13C/ 15N/ 2H 

13

C

13

C

H D

35Hz

CD3

CD3

35Hz

13

C130HzHD 35Hz

C55Hz 13C’ 15Hz 15N 11Hz 13C 55Hz 13C’

C

D

N

C

CO

H

D

13

140Hz 7Hz

H D

<1Hz

90Hz

N

H

H D

Teoreticky může být R2 snížen až 44 násobně, prakticky většinou maximálně 15x.

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Missing crosspeaks are marked

Praktické návody-jak na to? www.protein-nmr.org.uk



NMR experimenty










Získání experimentálních parametrů z NMR spekter.

 chemický posun (chemické okolí jádra)  NOE interakce (meziatomová vzdálenost)

 interakční konstanta (dihedrální úhel)  zbytková dipolární interakce (orientace)  vodíková vazba (vzdálenost, vazebný úhel)

Chemický posun

Výpočet indexu chemického posunu Změna chemického posunu indukovaná sekundární strukturou

Chemické posuny některých jader jsou ovlivněny typem pravidelné sekundární struktury, do které jsou zahrnuty!!!

 (H) -sheet  „random coil“  -helix

Přiřazení rezonancí hlavního řetězce: H,C, C’

Histogram indexu chemického posunu jader H, C a C‘. +1 0 -1

Výpočet indexů chemického posunu, tzv. CSI

Odhad sekundární struktury na základě „lokální hustoty“ těchto indexů

C

N helix I

helix II

Sekvence aminokyselin

helix III helix IV

-1

CSI 0

1

Secondary structure of M-PMV PR from CSI

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Nukleární Overhauserův efekt NOE Experimentální omezení vzdáleností • přímá spin-spinová interakce mezi jádry • interakce mezi dipóly interagujících jader

rIS < 5-6 Ǻ

• relaxační jev

• výměna energie mezi oběma jádry

H

H

• charakterizuje vzdálenost mezi oběma jádry

2

2 4    h   IS     4  10

 6t c  6  t c  rIS 1  4 t 2 c  

IS - rychlost nárustu NOE tc - korelační čas rIS - meziatomová vzdálenost  - pracovní frekvence

 IS  f r

6



Převod intenzity NOE krospíků na vzdálenost mezi atomy. 1.8 Ǻ  r  2.5 Ǻ

1.8 Ǻ  r  3.5 Ǻ

Dolní mez :1.8 Ǻ Jedná se o součet vzdáleností van der Waalsovských poloměrů dvou interagujících atomů vodíku Horní mez : Nastavuje se podle intenzity příslušného krospíku. Pro větší molekuly se používá max. vzdálenost až 6 Å. 1.8 Ǻ  r  5.0 Ǻ

Editovaná NOESY spektra 4D 13C/ 15N-editované NOESY

15N

NOE 1H

JHN

1H

15N

13C

13C

JHC

1H 1H

3D 15N-editované NOESY 15N=

106.4 ppm

4D 13C/15N-editované NOESY 15N=

106.4 ppm 13C= 45.8 ppm

G78HN-G78H

15N= 13C=

106.4 ppm 56.1 ppm

G78HN-S77H

Nepřímá spin-spinová interakční konstanta Experimentální omezení dihedrálních úhlů

O

C

y

Karplusova rovnice 3J = A cos2Q  B cosQ  C

H H C

Vztah mezi interakční konstantou a dihedrálními úhly peptidu

c2 f

C

c1

H H

N



C

3J H-NC-H

10

C

O

H-NC-CO

8

H-NC-C

CO-NC-H 6 4 2 0

[Hz]

-120

0

60

120

Q deg

Typické hodnoty interakčních konstant 3JHH pro dihedrální úhel f -helix f ~  60 deg   J  6 Hz

typické nastavení pro úhel f: 110  f  10 deg

-struktura skládaného listu f ~ 10 6  J  9 Hz typické nastavení pro úhel f: 170  f  70 deg

Residual dipolar couplings RDC Long-range constraint

- experiments for measurement J constants - IPAP experiments (better resolution)

15N

Principal axis system Bo

Azz

122.0

120.0

118.0

NMR experiments:

H 8.8

8.7 119.0

8.9

120.0

Janiso 121.0

Jiso

8.86

8.84

1H

q f

15N

D

122.0

9.0

N N

1H

Dresid  Janiso  Jiso

Axx Ayy

Stretched polyacrylamide gel

– ~ 6% polyacrylamide gel (crosslinked with bisacrylamide) – protein diffuses into dried gel – axial stretching (radial compression) of the gel

squeeze

alignment of protein in oblate pores

NMR tube

Vodíkové vazby v pravidelných strukturách Další omezení vzdáleností

C

-helix

Měření: - výměnné experimenty s D2O - teplotní závislost labilních protonů (NH, OH…) Z NMR experimentů je možné získat pouze informaci o donoru! Informaci o příslušném akceptoru lze získat až z vypočtených struktur

-sheet-antiparalelní

N

N

C



NMR experimenty










Jak vše poskládat dohromady ???? Omezení vzdáleností (NOEs)

Info o kovalentní struktuře

Omezení dihedrálních úhlů (interakční konst.)

Cray T3E

Etot  Ekin  E pot Výpočetní algoritmus: Molekulární mechanika simulované žíhání s experimentálními omezeními (vzdálenosti, dihedrální úhly…) - molekula se ohřeje na vysokou teplotu (2000 – 50 000 K) - pomalu se ochladí na teplotu blízkou nule

simulované žíhání v Kartézském prostoru (Newtonovy pohybové rovnice) simulované žíhání v prostoru torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

Simulované žíhání (simulated annealing) typický průběh

teplota [K]

vysokoteplotní perioda

perioda postupného ochlazování minimalizace potenciálové energie

časová osa [ns]

Jak vše poskládat dohromady ???? Etot  Ekin  E pot E pot   kvdW D 2   k kov D 2   k NOE D 2   k DIH D 2 ..... vdW

D 2  (d exp  d 0 ) 2

kov

NOE

DIH

dexp je experimentální nebo aktuální hodnota d0 je ideální hodnota

Ekin je kinetická energie vypočítávaná v každém kroku z teploty molekuly Epot je součet energií produkovaných penalizačními funkcemi Molekulární parametry (hmotnost atomů, délka vazby, vazebné úhly… vstupují do výpočtu ve formě tzv „force fields“ Př: penalizační fukce pro NOE:

ENOE

dolní mez (1,8 Å) horní mez (< 6 Å)

Cílem je minimalizovat Epot 0

d

Soubor struktur vyhovující nejlépe získaným experimentálním omezením

Prezentace vypočtených struktur helix III

helix II

helix IV

helix I

C

N

C

N

N C

N

C



NMR experimenty










Charakterizace vypočtených struktur 1. Shoda vypočtených struktur s experimentálními daty - velikost potenciálová energie - počet a velikost neshod s experimentálními parametry (NOE, dihedrální úhly…. - počet a velikost špatných kontaktů mezi atomy (van der Waalsovský příspěvek) - počet a velikost neshod s ideálními hodnotami kovalentních parametrů (délky vazeb, vazebné úhly, planarita aromatických kruhů…)

2. Rozptyl struktur v souboru n

RMSD 

2   x  x  i i 1

n

- mezi jednotlivými strukturami a průměrnou strukturou (mean) - mezi jednotlivými strukturami navzájem - počítá se buď pro celou molekulu, jednotlivé části nebo jednotlivé aminokyseliny

Charakterizace vypočtených struktur 3. Porovnání strukturních parametrů vypočtených struktur s parametry v databázích software Procheck, Whatif… http://biotech.embl-heidelberg.de:8400 Ramachandranův diagram

 f/y diagram je charakteristický pro konformaci páteře proteinu - takto lze porovnávat i ostatní dihedrální úhly, vazebné úhly, délky vazeb… - lze vytypovat problémové oblasti

Malate synthase, 723 AA, 82 kDa

Tugarinov V., Choy W.Y., Orekhov, V.Y., Kay L.E.(2005) PNAS, 102, 622-627

Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie

Recommend Documents