Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze
Analýza směsí a kvantitativní NMR ●
NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích jednotlivých atomových skupin – navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin
●
●
NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek
integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit – u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině – u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek
• Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně
Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qNMR) 90y
integrální intenzita NMR signálu, S k c B90 T
●
●
●
●
●
●
konstanta přístroje koncentrace vzorku (měřených jader) délka π/2-pulsu teplota
úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d1 = 5–10x T1) stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů)
zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce–NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů) dostatečný poměr signál/šum konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)
akvizice
d1
90y 13C
1H
akvizice
d1 ozařování
dekapling
počet bodů
Zpracování a vyhodnocení spekter ●
pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí – hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí – pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze
●
překryv signálů – dekonvoluce – integrace celé skupiny signálů
Zpracování a vyhodnocení spekter ●
●
při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících k signálu koncentrační standardy
– bez přidaného standardu o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací o zjištění relativního zastoupení složek – vnější standard o zatavená kapilára s referenční látkou – vnitřní standard o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem ●
lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5–20 mM)
Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek ●
Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu
●
molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb
●
translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D – Stokesova-Einsteinova rovnice k T η RH
Boltzmannova konstanta termodynamická teplota visozita rozpouštědla hydrodynamický poloměr molekuly
– platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně – nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem ●
vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole – metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole (PGSE, pulse gradient spin echo)
●
aplikace – rozlišení molekul ve směsi
– oligomerizace molekul (proteiny) – výpočet translačního difusního koeficientu
Spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole, PGSE kódování molekul podle pozice v ose z
excitace
90
τ
y
vývoj, volná difuse
180 y
dekódování
akvizice
τ
1
H
δ
Δ
δ
g z
intenzita signálů:
D 3
měření série spekter za různých intenzit gz
D 2
D
z
1 D
B = B0+ g zz koherentní magnetizace všech spinů
ztráta koherence vlivem gradientu magnetického pole v ose z
3
D2 úbytek (kódované) magnetizace v jednotlivých zvrstvách vlivem difuse
> D1 >
obnovení koherence aplikací stejného gradientu po spinovém echu
Analýza naměřených spekter – metoda DOSY ●
Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY – série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu gz
gz
– pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2D spektru na příslušné pozici D 1H
(ppm)
4. 7
7. 9
1. 3
10− 4
10− 5
7
8
6
4 (ppm)
1H
2
0
10− 8
Inverzní laplaceova transformace
© Carlos Cobas, http://nmranalysis.blogspot.com
10−
D
6
(cm2 s−1)
10−
DOSY – náhradní sladidlo Canderel
M-A.Delsuc (2008) 23rd NMR Valtice
Překryv signálů vede k jejich špatnému rozlišení podle difusního koeficientu. K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování.
LC-NMR ●
propojení kapalinové chromatografie (HPLC, GPC) a NMR spektroskopie – Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru. – speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek – Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo. – dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku – měří se 1H spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2D formě
čas [min] 1
H [ppm]
LC-NMR – analýza oleje ze semínek černého rybízu kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5 ml/min CH3CN–CDCl3 90:10 (v/v); 1–28 min AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s
k. stearová
k. palmitová
k. olejová Jan Sýkora, ÚCHP, AV ČR,
k. linolová
k. γ-linolenová
k. α-linolenová
Průmyslové aplikace – obsah vody/oleje – NMR relaxometrie ●
●
●
●
●
Využívá výrazně odlišné doby relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi Není potřeba vysoké rozlišení – stačí levný spektrometr s trvalým magnetem
Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15% Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá)
emulze „olej ve vodě“ – Relaxační čas T2 volného oleje je mnohem kratší než T2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG), – Po odečtení převažující dlouhorelaxující komponenty (H2O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor.
Relaxometr fi. Bruker
Průmyslové aplikace – kvalita džusu ●
současné sledování mnoha ukazatelů
●
identifikace a kvantifikace – – – –
●
ověření země původu – viz SNIF-NMR
cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa…) kyselin (citronová, jablečná…) indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná) způsobu zpracování ○phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-D-glukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů
z
y x
http://www.bruker-biospin.com
NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy ●
●
Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) Hlavní využití: – Průkaz zakázané látky o Návykové látky o Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí) o Problém „legálních drog“ (látky účinné, ale dosud nezakázané) – Průkaz falšování potravin o Ověření původu o Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky
Průkaz zakázaných látek ●
Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)
●
Prokázání přítomnosti látky
●
Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl o
Použití při vyšetřování původu látky
●
Klasické experimenty 1H,
13C,
●
Knihovny spekter známých látek
vícerozměrné experimenty, posunová činidla
Fencyklidin
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR
●
●
sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/H vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování H2O a HDO.
V.SMOW = Vienna Standard Mean Ocean Water
●
SNIF-NMR: určení poměru D/H
●
odchylka isotopů (isotope deviation), δ
●
alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení
●
použití: ověření pravosti a původu potravin Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. Havelec z Celní laboratoře MF ČR.
13C/12C)
Distribuce isotopů
13C
a 2H v přírodě
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR ●
Metoda schválena pro (H/D): – Ovocné šťávy o Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol
o Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin – Víno – Vanilin – Kyselina octová • V kombinaci s tequilly)
13C/12C
je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování
• Měření 2D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu
• Při zjišťování zastoupení
13C/12C
integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru
• Alternativa – MS spektroskopie (hlavně 13C/12C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější
Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR
• Příklad 2D spektra ethanolu • Při zjišťování zastoupení
13C/12C
integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru
