APLIKACE NMR SPEKTROSKOPIE V METABOLOMICE

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie

APLIKACE NMR SPEKTROSKOPIE V METABOLOMICE DISERTAČNÍ PRÁCE

autor:

RNDr. Helena Pelantová

studijní obor:

analytická chemie

vedoucí práce:

prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.

Olomouc 2015

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně katedry analytické chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci.

V Olomouci dne

Úvodem bych ráda poděkovala svému školiteli prof. Ing. Vladimíru Havlíčkovi, Dr., za jeho podporu a užitečné rady v průběhu celého postgraduálního studia. Svým kolegům z NMR laboratoře Ing. Marku Kuzmovi, Ph.D., Ing. Simoně Bártové a Mgr. Martině Bugáňové děkuji za spolupráci při objevování tajů metabolomiky. Za pomoc a odborný dohled při statistickém zpracování dat vděčím Ing. Jiřímu Anýžovi (Fakulta elektronická ČVUT Praha) a RNDr. Blance Šedivé, Ph.D. (Západočeská univerzita Plzeň). Mé velké díky patří RNDr. Lence Maletínské, CSc., a Ing. Blance Železné, CSc., ze skupiny Antiobezitních peptidů ÚOCHB AVČR za jejich vytrvalou podporu a pomoc při diskusi nad výsledky a Mgr. Martině Holubové, Ph.D., z téže skupiny za provedení a vyhodnocení všech biochemických experimentů. Za odborné rady k interpretaci našich výsledků děkuji prof. MUDr. Martinu Haluzíkovi, DrSc., (3. interní klinika, 1. LF UK, Praha) a RNDr. Jaroslavu Kunešovi, DrSc. (Fyziologický ústav AVČR) Ráda bych také poděkovala ostatním spolupracovníkům: Hedvice Vysušilové (ÚOCHB AVČR) za péči o laboratorní zvířata, RNDr. Zdeně Lacinové a Miloslavě Čechové (3. interní klinika, 1. LF UK, Praha) za stanovení exprese mRNA, doc. Dr. RNDr. Davidu Sýkorovi a Ing. Janě Zemenové (Ústav analytické chemie, VŠCHT Praha) za LC-MS analýzu a doc. RNDr. Miroslavu Šulcovi, Ph.D., (MBÚ AVČR) za stanovení proteinů v moči.

Svůj velký vděk bych nakonec ráda vyjádřila celé své rodině a především manželovi, neboť bez jejich pochopení a trvalé podpory by tato práce nemohla vzniknout.

Summary This doctoral thesis is focused on the study of mouse models of obesity and diabetes using NMR-based metabolomics. At first, the three parameters of the experimental protocol were optimized in the set of 19 metabolites in real samples: urine collection protocol, pulse sequence for proton spectra acquisition, and normalization method. The 24h urine collection on mice with no access to food, followed by Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulse sequence for spectra acquisition and their normalization to the total spectral area was determined as the most advantageous in mouse models with induced obesity. Acquired NMR data were subsequently evaluated using the combination of multivariate statistical methods with parametric and nonparametric tests. The most significant metabolites were identified by comparison with spectral databases. NMR metabolomics applied in the model of monosodium glutamate (MSG) - induced obesity revealed numerous changes in urine of MSG-treated mice, mainly the altered metabolism of nicotinamide and polyamines, attenuated excretion of major urinary proteins, and fluctuating concentrations of allantoin, phenylacetylglycine, and methylamine. Altered levels of creatine, citrate, acetate, and succinate iterated to the values of control mice during aging. The development of obesity and insulin resistance at the age of six months was confirmed by biochemical parameters and manifested by changes in mRNA expressions of the corresponding enzymes in adipose tissue. Antidiabetic therapy with metformin, vildagliptin and their combination attenuated the levels of plasma glucose and reduced liver weight in mice with diet-induced obesity. Multivariate analysis of NMR data revealed substantial changes mainly in concentration of acylglycines, glucose, N-carbamoyl-β-alanine and N-methylnicotinamide metabolites. Correlation of significant metabolites with the results of glucose tolerance test indicated suitable markers of diabetes for this model. In this study N-carbamoyl-β-alanine was for the first time reported as a potential marker of diabetes. NMR-based metabolomics enabled us to evaluate the effectiveness of different therapies and the combined treatment has been identified as the most effective one. The results of these studies can contribute to our understanding of the molecular basis of obesity and diabetes and to possible optimization of therapeutic approaches.

Obsah 1

Úvod .............................................................................................................................. 1

2

Teoretická část ............................................................................................................. 2 2.1

Metabolomika .......................................................................................................... 2

2.1.1

Předmět metabolomiky ..................................................................................... 2

2.1.2

Základní metabolomické postupy...................................................................... 3

2.1.3

Analytické platformy používané v metabolomice .............................................. 4

2.2

Průběh NMR metabolomické analýzy ...................................................................... 7

2.2.1

2.2.1.1

Plasma a sérum .......................................................................................... 7

2.2.1.2

Moč ........................................................................................................... 8

2.2.1.3

Tkáňové extrakty ....................................................................................... 9

2.2.2

NMR experimenty ............................................................................................ 9

2.2.2.1

Příprava vzorku pro NMR experimenty ..................................................... 9

2.2.2.2

Potlačení signálu rozpouštědla ................................................................. 10

2.2.2.3

Základní pulsní sekvence používané v metabolomice ............................... 10

2.2.3

Předúprava dat ................................................................................................ 12

2.2.3.1

Synchronizace píků .................................................................................. 12

2.2.3.2

„Binning“ ................................................................................................ 13

2.2.3.3

Normalizace ............................................................................................ 14

2.2.3.4

Škálování ................................................................................................. 15

2.2.4

Multivariační statistická analýza ..................................................................... 16

2.2.4.1

Analýza hlavních komponent (PCA) ........................................................ 16

2.2.4.2

Diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (PLS-DA) ............ 18

2.2.5

Identifikace metabolitů ................................................................................... 20

2.2.6

Kvantifikace metabolitů .................................................................................. 20

2.3

NMR metabolomika při studiu obezity a diabetu – využití myších modelů ............ 22

2.3.1

Metabolomický přístup k obezitě a diabetu ..................................................... 22

2.3.2

Myší modely obezity a diabetu v NMR metabolomice .................................... 22

2.3.2.1

Modely geneticky modifikovaných myší.................................................. 23

2.3.2.2

Model chemicky indukované obezity ....................................................... 24

2.3.2.3

Model obezity navozené vysokotukovou dietou ....................................... 24

2.3.3 3

Odběr a úprava vzorku ...................................................................................... 7

Studium antidiabetické terapie na myších modelech........................................ 26

Cíle práce .................................................................................................................... 27

4

Experimentální část.................................................................................................... 29 4.1

Chemikálie a přístrojové vybavení použité v NMR metabolomice ......................... 29

4.2

Optimalizace experimentálního protokolu .............................................................. 30

4.2.1

Experimentální zvířata .................................................................................... 30

4.2.2

Odběr vzorků moči ......................................................................................... 30

4.2.3

NMR experimenty .......................................................................................... 30

4.2.4

Analýza NMR dat ........................................................................................... 31

4.3

4.3.1


4.3.2

Biochemické experimenty ............................................................................... 33

4.3.3

NMR experimenty .......................................................................................... 34

4.3.4

Analýza NMR dat ........................................................................................... 35

4.4

5

Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou............................................ 32

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou ...................... 35

4.4.1


4.4.2

Biochemické experimenty ............................................................................... 37

4.4.3

NMR experimenty .......................................................................................... 38

4.4.4

Analýza NMR dat ........................................................................................... 39

Výsledky a diskuse ..................................................................................................... 41 5.1


5.1.1

Vliv protokolu odběru moči ............................................................................ 43

5.1.2

Vliv pulsní sekvence ....................................................................................... 47

5.1.3

Vliv normalizace............................................................................................. 51

5.2


5.2.1

5.2.1.1

Biochemické parametry, exprese mRNA ................................................. 53

5.2.1.2

NMR metabolomika ................................................................................ 56

5.2.2 5.3

Diskuse ........................................................................................................... 65

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou ...................... 70

5.3.1

Výsledky ........................................................................................................ 70

5.3.1.1

Biochemické parametry ........................................................................... 70

5.3.1.2

Výsledky NMR metabolomiky ................................................................ 72

5.3.2 6

Výsledky ........................................................................................................ 53

Diskuse ........................................................................................................... 84

Závěry ......................................................................................................................... 87 6.1


6.2


6.3

Vliv antidiabetické léčby na model s dietou indukovanou obezitou ........................ 88

6.4

Shrnutí ................................................................................................................... 89

7

Souhrn ........................................................................................................................ 90

8

Seznam použitých zkratek ......................................................................................... 91

9

Literatura ................................................................................................................... 94

10 Přílohy ...................................................................................................................... 110

1 Úvod Metabolomika je relativně mladý obor, který vstoupil na scénu zhruba na přelomu tisíciletí [1,2]. K jejímu prudkému rozvoji došlo k době, kdy se pozornost vědců začala přesouvat od genomiky a proteomiky směrem k metabolitům. Je totiž zřejmé, že metabolom na rozdíl od genomu či proteomu dokáže lépe zaznamenat aktuální stav organismu. Na jeho složení se neprojevují pouze genetické predispozice, ale odráží také věk, výživu, životní styl, momentální fyziologický stav i všechny vlivy vnějšího prostředí. Rozvoj metabolomiky je podporován zejména jejím uplatněním v oblasti biomedicíny [3]. Sledování aktuálních metabolických procesů v organismu prostřednictvím současné detekce metabolitů umožňuje nejen lépe pochopit molekulární podstatu některých onemocnění, ale pomáhá hledat i jejich klinické a prognostické molekulární značky (markery). Současný biomedicínský výzkum se neobejde bez využití myších modelů [4], u kterých je možné velmi dobře kontrolovat jak jejich genetické pozadí, tak veškeré vnější podmínky, kterým jsou vystaveny. Tímto způsobem lze výrazně omezit variabilitu mezi vzorky a model přesně přizpůsobit na míru konkrétnímu studovanému problému. Protože se metabolomika zabývá studiem velmi komplexních a proměnlivých směsí, je zapotřebí zvolit takovou analytickou metodu, která by co nejlépe zvládla tuto diverzitu zachytit v plné šíři. Velká výhoda nukleární magnetické resonance spočívá zejména v její schopnosti detekovat současně látky odlišných fyzikálně-chemických vlastností, a to v různém koncentračním zastoupení. Je to metoda kvantitativní, robustní, s minimálními požadavky na úpravu vzorku. Může poskytnout kompletní spektrální data i od neznámých či neočekávaných sloučenin, proto je výborným nástrojem necílené metabolomické analýzy. Paralelní vyhodnocování velkého množství proměnných na početné sadě vzorků však vyžaduje specifické postupy multivariační statistické analýzy, které pomohou v obrovském objemu generovaných dat vyhledat pouze relevantní informace. Předkládaná disertační práce se věnuje studiu myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky. Po optimalizaci experimentálního protokolu bude charakterizován metabolický stav modelu chemicky indukované obezity kombinací metabolických dat z moči a biochemických parametrů. V poslední části práce bude na metabolickém profilu moči studován vliv antidiabetické léčby na myši s dietou indukovanou obezitou s cílem porovnat vliv různých druhů terapie a nalézt potenciální markery diabetu pro tento model. 1

2 Teoretická část

2.1 Metabolomika 2.1.1 Předmět metabolomiky Metabolomika je obor zabývající se kvalitativním i kvantitativním popisem všech metabolitů přítomných ve zkoumaném biologickém vzorku [2]. Metabolity jsou vstupní látky, intermediáty nebo koncové produkty metabolismu. Jedná se o nízkomolekulární sloučeniny (s molekulovou hmotností < 1000 Da), které se podle role v organismu někdy rozdělují do dvou základních skupin. Primární metabolity jsou součástí univerzálních metabolických drah zajišťujících základní životní funkce, jako je např. růst, vývoj a výživa. Vykazují menší strukturní variabilitu, patří většinou k několika základním skupinám látek (sacharidy, organické kyseliny, aminokyseliny, apod.). Protože většina organismů sdílí stejné základní metabolické dráhy, v jejich vzorcích jsou často detekovány podobné sady primárních metabolitů. Na druhou stranu sekundární metabolity nejsou přímo nezbytné pro přežití organismu, jsou specifické pro určité skupiny organismů a zahrnují širokou škálu strukturně rozmanitých sloučenin. Metabolom je tedy komplexní směsí nízkomolekulárních látek různé chemické povahy, zastoupených v koncentračním rozsahu přesahujícím šest řádů. Složení metabolomu je charakteristické pro daný genotyp, fyziologický stav nebo podmínky, kterým je organismus vystaven. Metabolomika tak na rozdíl od statické genomiky či proteomiky odráží okamžitý vliv nejrůznějších vnějších i vnitřních faktorů a poskytuje tudíž určitý záznam stavu organismu v daný okamžik. V biomedicínském prostředí se souběžně setkáváme s příbuzným pojmem metabonomika, definovaným prof. Nicholsonem jako „kvantitativní měření dynamické multi-parametrické odezvy živých organismů na patofyziologické podněty nebo genetické modifikace“ [1]. K prudkému rozvoji metabolomiky v posledních letech přispívají také široké možnosti jejího uplatnění. Metabolomika se používá při studiu rostlin [5,6] či mikroorganismů [7,8], ve farmaceutickém průmyslu [9], při sledování identity a autenticity potravin [10], ale hlavní pole působnosti nachází poslední dobou zejména v biomedicínském výzkumu [11–14]. Možnost zaznamenat aktuální stav organismu prostřednictvím změn metabolického složení odebraných vzorků umožňuje studovat molekulární charakter procesů probíhajících 2

v organismu a zároveň také hledat prognostické a diagnostické markery nejrůznějších onemocnění. 2.1.2 Základní metabolomické postupy Metabolomika pro naplnění svých cílů používá tři základní strategie: metabolomický otisk prstu (fingerprinting), metabolomické profilování a cílenou analýzu [2]. Metabolomický fingerprinting usiluje o co nejkompletnější popis celého metabolomu, aniž by byl omezen apriorní představou o povaze zkoumaných látek či změn. Protože metabolom se zde posuzuje jako celek bez předchozí identifikace či kvantifikace jednotlivých složek, je při jeho vyhodnocování zapotřebí použít metody vícerozměrné statistické analýzy. Na spektrum zkoumaného vzorku, získané jakoukoliv vhodnou analytickou metodou, se nahlíží jako na otisk jasně definovaného stavu studované entity. Po vyhodnocení dostatečného počtu takovýchto fingerprintů je možné zjistit charakteristiky daného stavu a na jejich základě vytvořit model, který ho dostatečně popisuje. Pomocí těchto modelů lze potom předpovědět příslušnost vzorku k dané skupině, například odlišit zdravé jedince od nemocných, apod. Metabolické profilování se vztahuje k předem vybrané skupině metabolitů, buď strukturně podobných či spojených s určitou metabolickou dráhou. Zkoumané metabolity jsou ve vzorcích identifikovány a kvantifikovány většinou na základě srovnání naměřených spekter s knihovnou nebo databází spekter čistých látek. Takto lze snadno identifikovat běžné primární metabolity, zatímco tvorba databází sekundárních metabolitů je kvůli jejich strukturní variabilitě a specifickému výskytu mnohem problematičtější. Cílená metabolická analýza se omezuje na kvantitativní a kvalitativní analýzu pouze jednoho či několika málo metabolitů, většinou vázaných na určitou předem známou konkrétní reakci. Kvůli zvýšení citlivosti a zmenšení překryvu signálů ve spektru bývá do analýzy zařazen chromatografický separační krok. V NMR metabolomice je stanovení založeno na strategiích používaných v klasickém NMR přístupu, přičemž identifikace málo koncentrovaných metabolitů vyžaduje extenzivní využití nejen 1D a 2D NMR experimentů, ale často i doplňující informace získané jinými analytickými metodami. Metabolomické studie většinou výše míněné postupy různě kombinují. Výchozí fingerprinting poskytuje základní klasifikaci vzorků a označí skupinu metabolitů nejvíce přispívajících k rozdělení podskupin. V dalším kroku jsou tyto významné metabolity identifikovány a kvantifikovány metabolickým profilováním s využitím dostupných databází.

3

Následná cílená analýza pak může případně odhalit přítomnost neznámých látek a označit biomarkery studovaného stavu. 2.1.3 Analytické platformy používané v metabolomice Je zřejmé, že práce s komplexními vzorky klade extrémně vysoké nároky na volbu analytické techniky – žádná z metod nemůže být považována za zcela univerzální a ideální. Optimální metoda by měla být schopna simultánně detekovat velký počet metabolitů různých fyzikálně-chemických vlastností, vyskytujících se v širokém koncentračním rozpětí. Vzhledem k rozsahu studií je vyžadován robustní režim s vysokou reprodukovatelností, citlivostí a průchodností. Ačkoliv se objevují i metabolomické studie založené například na infračervené a Ramanově spektroskopii [15] nebo kapilární elektroforéze s ultrafialovou detekcí [16], jsou v současné metabolomice preferovány dvě základní analytické techniky: nukleární magnetická resonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie (MS) [17–19]. MS analýza většinou vyžaduje před separační krok, proto bývá spojována s některou ze separačních metod: s kapilární elektroforézou (CE-MS) [20,21] nebo metodami chromatografickými: s plynovou (GC-MS) [22–24], ovšem častěji s kapalinovou (LC-MS) [25,26], vysokoúčinnou kapalinovou (HPLC-MS) [27,28] nebo ultra účinnou kapalinovou (UPLC-MS) chromatografií [29–31]. Hlavní výhodou metod založených na MS je vysoká citlivost, která umožňuje detekci látek ve femto- až attomolárních koncentracích [32]. Protože zvolený separační krok redukuje komplexitu vzorku, MS metabolomika se výborně uplatní především v metabolomickém profilování předem zvolené skupiny látek [17]. Slabinou MS metod je kvantifikace metabolitů, neboť detekované koncentrace jsou ovlivněny jak ionizovatelností jednotlivých látek, tak vlivem komplexní matrice (plasma, moč). Výsledky jsou také citlivé na nastavení experimentálních podmínek separace či detekce, proto jsou MS data poněkud méně reprodukovatelná než u NMR [19]. NMR je vysoce selektivní nedestruktivní technika s pouze minimálními nároky na úpravu vzorku. NMR spektra odrážejí výhradně fyzikální vlastnosti studované látky a jsou jen minimálně ovlivněna vnějšími faktory, experimenty jsou tedy velmi dobře reprodukovatelné [33] a k identifikaci lze snadno použít databáze spekter. NMR analýza je obvykle rychlá, snadno přizpůsobitelná pro režim s vysokou průchodností („high-throughput“), a jelikož

4

nevyžaduje žádnou předchozí informaci o povaze zkoumaných látek, může poskytnout kompletní spektrální data i od neznámých či neočekávaných sloučenin. Výše zmíněné charakteristiky dělají z NMR nezastupitelnou metodu pro metabolický fingerprinting. Další předností NMR je její kvantitativnost. Protože intenzita signálu v protonovém spektru je přímo úměrná počtu jaderných spinů a tedy i molární koncentraci, v ideálním případě dobře rozlišených signálů může být absolutní koncentrace vypočtená přímo ze spektra pomocí vnitřního standardu; kalibrační křivky pro jednotlivé metabolity nejsou nezbytné. Na druhou stranu je NMR velmi málo citlivou metabolomickou technikou, s citlivostí o několik řádů menší než MS [34]. Tato zásadní nevýhoda NMR je postupně překonávána vylepšením instrumentace. Většina publikovaných metabolomických prací je nyní měřena na 600 MHz magnetech; přechod k vyšším magnetickým polím (700-900 MHz) pomůže zvýšit rozlišení signálů. Citlivost NMR dále roste se zavedením chlazených sond (kryosond) [35] a postupným rozvojem mikrosond, umožňujícím měření v objemech jednotek mikrolitrů [36,37]. NMR i MS jsou velmi všestranné analytické metody, které se svými přednostmi a slabinami doplňují [32]. Na NMR je cenný její univerzální a necílený přístup, daný schopností detekovat najednou ve vzorku veškeré látky nesoucí vodík. Postupy založené na MS metabolomice jsou naopak cílenější kvůli selektivitě separace a ionizačních technik. Sady metabolitů detekovanými pomocí těchto metod nemívají velký překryv, takže informace o složení vzorku získané oběma způsoby jsou komplementární. Protože NMR a MS data lze vyhodnocovat společnými statistickými postupy a vzájemně je korelovat [38], propojení obou platforem poskytuje obvykle komplexnější a ucelenější pohled na povahu studovaného problému [39–41]. Zajímavým příkladem studie, která kombinuje použití několika metod, je výzkum metabolomu lidské moči [42]. Na základě intenzivního průzkumu dříve publikovaných metabolických dat autoři zjistili, že metabolom lidské moči obsahuje minimálně 2651 detekovatelných metabolitů. Autorům této práce se podařilo v několika vzorcích identifikovat 445 z nich, když postupně využili šest analytických technik: NMR, GC-MS, MS s indukčně vázanou plasmou (ICP-MS), tandemovou hmotnostní spektrometrii s přímým nástřikem vzorku (DFI/LC-MS/MS) a HPLC s ultrafialovou (UV) nebo fluorescenční detekcí (FD). Srovnání úspěšnosti jednotlivých metod v detekci jednotlivých metabolitů je znázorněné na obrázku 1.

5

Obr. 1 Vennův diagram, znázorňující překryv metabolitů detekovaných v moči pomocí šesti analytických technik: NMR, GC-MS, DFI/LC-MS/MS, ICP-MS, HPLC-UV a HPLC-FD (podle cit. [42])

6

2.2

Průběh NMR metabolomické analýzy Celý proces NMR metabolomické analýzy lze rozdělit do několika po sobě jdoucích

kroků: odběr vzorku a jeho přípravu pro analýzu, měření NMR spekter, úpravu naměřených dat a vlastní statistickou analýzu následovanou identifikací a případnou kvantifikací významných metabolitů. Biologické vzorky v sobě již nesou značnou variabilitu, ke které se přidává i variabilita způsobená drobnými odchylkami v experimentálních podmínkách. Pro správnou interpretaci statistických dat je nezbytné v maximální míře zredukovat tyto nežádoucí zdroje variability tak, aby hlavní rozdíly mezi vzorky pocházely výhradně ze studovaného jevu (např. typ diety, věk, genetická modifikace, konkrétní nemoc). V praxi tento požadavek znamená dodržení naprosto stejných experimentálních podmínek pro každý vzorek a každý krok analýzy.

2.2.1 Odběr a úprava vzorku Jako primární zdroj metabolických dat většinou slouží tělní tekutiny a buněčné nebo tkáňové extrakty [43]. V biomedicínských studiích se nejvíce využívá moč, krevní plasma nebo sérum, které obsahují stovky metabolitů a jsou relativně snadno dostupné [41,42,44,45]. Neurologická onemocnění se často studují na mozkomíšním moku [46], jehož odběr je ovšem značně invazivní. Byly publikovány také studie založené na detekci metabolitů v plodové vodě [47], žluči [48], potu [49], slinách [50], spermatu [51], slzách [52], dechovém kondenzátu [53], apod. 2.2.1.1 Plasma a sérum Pro odběr krve bylo vypracováno několik standardních protokolů [54–56]. Krev pro získání plasmy je obvykle odebírána ze žíly do zkumavek, obsahujících jako antikoagulační

činidlo

heparin

nebo

ethylendiamintetraoctovou

kyselinu

(EDTA).

Antikoagulanty se ve spektru projevují dodatečnými signály; v případě heparinu je ve spektru pozorováno široké pozadí signálů polysacharidů, v případě EDTA se ve spektru objevují charakteristické intenzivní multiplety, překrývající především signály citrátu, cholinu a dimethylaminu. Po odběru se centrifugací oddělí krevní elementy od plasmy. Sérum se získává odstředěním sražené krve. Ke srážení dochází po 15-30 minutách při pokojové teplotě přechodem fibrinogenu na vláknitou síť fibrinu. V současné době neexistuje jasné kritérium pro volbu plasmy či séra u metabolomických studií; zdá se však, že v NMR metabolomice převažují práce používající plasmu. Nedávno byly porovnány metabolické profily lidské 7

plasmy a séra získané metodou GC/MS [57] a pomocí komerčně dostupných metabolomických kitů [58]. Obě skupiny autorů dospěly ke shodnému závěru, že metabolomické výsledky z plasmy jsou poněkud robustnější a reprodukovatelnější (neboť složení séra je velmi citlivé na podmínky při srážení plné krve), avšak většina metabolitů poskytovala v séru intenzivnější signály ve srovnání s plasmou. Plasma i sérum obsahují velké množství proteinů, jejichž široké signály v celé oblasti spektra téměř znemožňují identifikaci a kvantifikaci nízkomolekulárních metabolitů. V literatuře je popsáno několik základních postupů, jak ze vzorků odstranit proteiny před NMR experimenty [59]; jedná se hlavně o extrakci směsí vody a metanolu, extrakce acetonem či acetonitrilem, srážení proteinů kyselinou chloristou nebo o ultrafiltraci nízkomolekulárních látek s 3 kDa dělícím rozsahem („cut off“ filtrem). Elegantní a nejrozšířenější variantou, jak potlačit nežádoucí signály proteinů ve spektru, je využití vhodné pulsní sekvence ke snímání spekter. Tento postup nevyžaduje žádnou předchozí úpravu vzorku a nevnáší tak riziko dodatečných experimentálních chyb. Příslušná pulsní sekvence bude popsána a diskutována v odstavci 3.2.2.3

2.2.1.2 Moč Moč představuje vůbec nejkomplexnější a co do složení zřejmě nejvariabilnější směs metabolitů [42,44]. Existuje řada protokolů a studií, zabývajících se odběrem, skladováním a další úpravou vzorků moči [54,55,60–62]. Díky zcela neinvazivnímu odběru se výborně hodí i pro dlouhodobější studie zejména u zvířecích modelů [63], kde např. průběžné odběry krve nejsou vhodné. K analýze se využívá moč odebraná jednorázově (obvykle ráno ve stejnou dobu) nebo sbíraná po delší časový úsek, většinou 24 hodin. Druhá z variant má nespornou výhodu v kompenzaci cirkadiánních rytmů, avšak – především při práci se zvířaty – je experimentálně náročnější a vyžaduje použití metabolických klecí. Moč klade na úpravu vzorku pouze minimální nároky. K odebraným vzorkům se přidává NaN3 pro zabránění růstu bakterií a někdy jsou již přímo po odběru centrifugací odstraněny nerozpustné částečky a zbytky buněk [60]. Až do vlastní NMR analýzy jsou takto upravené vzorky moči (i plasmy či séra) standardně uchovávány při -80 °C.

8

2.2.1.3 Tkáňové extrakty Složení a koncentrace metabolitů detekovaných v biologickém materiálu jsou výrazně ovlivněny způsobem přípravy vzorku. Protože každý další krok během přípravy snižuje diverzitu látek přítomných ve finálním vzorku a zvyšuje riziko vnesení nežádoucí variability, je snahou celý proces maximálně zjednodušit. V první řadě je třeba zabránit enzymatické degradaci odebrané tkáně, např. prudkým zchlazením vzorku v kapalném dusíku a poté homogenizací vzorku a denaturací kyselinami či organickými rozpouštědly; lyofilizace pak zbaví vzorek zbytků vody. Volba rozpouštědla pro následnou extrakci je klíčovým momentem a závisí na chemické povaze metabolitů [64,65]. Lze použít extrakci vodou či pufrem, kyselinou chloristou, směsí vody s acetonitrilem, acetonem či metanolem. Doporučovanou univerzální metodou je extrakce směsí voda/metanol/chloroform, při které lze získat po oddělení frakcí hydrofilní i hydrofobní metabolity [54].

2.2.2 NMR experimenty 2.2.2.1 Příprava vzorku pro NMR experimenty Před vlastními NMR experimenty procházejí vzorky ještě další úpravou: kromě nezbytného přídavku deuterovaného rozpouštědla a referenčního standardu se vzorky kvůli snížení viskozity někdy ředí a je také zapotřebí sjednotit jejich pH. Krev má pH dostatečně regulováno in vivo, takže jednotlivé vzorky se v tomto ohledu příliš neliší a některé laboratoře při přípravě vzorků plasmu místo pufrem ředí fyziologickým roztokem [54]. Ředění snižuje viskozitu vzorku a napomáhá uvolnit metabolity vázané na proteiny v plasmě. pH moči je velmi variabilní, například u myší v rozsahu řádově 6-9 [66], proto je nezbytné ho regulovat. K tomuto účelu se nejčastěji využívá fosfátový pufr, který nemá vlastní signály v protonovém spektru a stabilizuje pH přibližně na hodnotu 7,4. V některých studiích je pH upravováno přídavkem NaOH či HCl. Protože k variabilitě chemických posunů ve vzorcích moči přispívají také nestejné koncentrace dvojmocných kationtů, především Ca2+ a Mg2+, doporučují někteří autoři přidat ke vzorku také EDTA [67]. Výsledný vzorek moči nebo plasmy (séra) je připraven tak, aby obsahoval H2O a D2O v poměru 9 : 1; tkáňové extrakty se měří ve vhodných deuterovaných rozpouštědlech. Jako referenční činidlo se obvykle přidává sodná sůl kyseliny 3-(trimethylsilyl)propansulfonové (DSS) nebo 3-(trimethylsilyl)propionové (TSP).

9

Vzorky jsou převážně měřeny ve standardních 5mm NMR kyvetách, menší objemy v kyvetách o průměru 3 nebo 1,7 mm. Velmi malé objemy vzácných tělních tekutin lze také měřit v průtočných celách nebo v 1mm kapilárních kyvetách s objemem 5 µl [68]. Všechny NMR experimenty se provádějí při konstantní teplotě, která bývá obvykle 298 nebo 300 K pro moč a 310 K pro plasmu. Po zavedení kyvety do NMR sondy je nezbytné zařadit před vlastní experimenty minimálně desetiminutovou prodlevu k dosažení teplotní rovnováhy ve vzorku, což je důležité obzvláště pro vzorky moči s vysokou osmolalitou. Všechny experimenty vyžadují přesné nastavení frekvence vysílače pro potlačení signálu rozpouštědla (offsetu), kalibraci 90° sklápěcího pulsu, naladění pozorovacího kanálu sondy (wobbling) a pečlivé naladění homogenity magnetického pole (shimming) s pološířkou signálu TSP či DSS pod 0,8 Hz. Kvůli vyloučení systematické experimentální chyby je žádoucí měřit vzorky v náhodném pořadí.

2.2.2.2 Potlačení signálu rozpouštědla Metabolický fingerprinting vyžaduje robustní a rychlé experimenty pro režim s vysokou průchodností, z tohoto důvodu většina aplikací spoléhá pouze na 1D protonové experimenty. Intenzivní signál rozpouštědla (většinou vody) je nutné vhodnou metodou potlačit, aby bylo možné v jeho přítomnosti detekovat i rezonance málo koncentrovaných metabolitů [69]. Nejjednodušší a nejčastěji používanou metodou je presaturace, založená na selektivní eliminaci signálu rozpouštědla selektivním pulsem o nízkém výkonu v době relaxační prodlevy. Hlavní nevýhodou uvedené metody je určité potlačení signálů rezonujících blízko signálu vody a saturace vyměnitelných protonů prostřednictvím chemické výměny a křížové relaxace.

Další

varianty

pulsních

sekvencí

k potlačení

signálu

vody,

vhodných

pro kvantitativní metabolomiku, jsou shrnuty v přehledném článku [70].

2.2.2.3 Základní pulsní sekvence používané v metabolomice Základní standardní metodou, používanou pro měření ve vzorcích moči, je 1D-NOESY experiment s presaturací [71]. Tato technika poskytuje ve vodných vzorcích dobře reprodukovatelná spektra vysoké kvality, použitelná pro semikvantitativní analýzu. Experiment je vlastně prvním řádkem (přírůstkem) z 2D NOESY experimentu s presaturací během relaxační prodlevy a směšovacího času. Faktor potlačení signálu vody je přibližně 105. 10

Významnou výhodou této sekvence je špičková selektivita chemického posunu a pozitivní vliv na plochou základní linii spektra, navíc se jedná o poměrně robustní experiment s malými nároky na optimalizaci parametrů [72]. Přidání pulsních gradientů magnetického pole zlepšuje tvar čáry a potlačuje artefakty ve spektru. Přesnost kvantifikace je v 1D-NOESY spektrech snížená kvůli částečné saturaci vyměnitelných protonů během presaturace v dlouhé relaxační prodlevě. NMR experimenty v plasmě a séru musí uspokojivě řešit problémy s intenzivními širokými signály proteinů přes celou šíři spektra, které komplikují detekci metabolitů. Řešení je založeno na využití rozdílných časů podélné relaxace T2 u rigidních vysokomolekulárních sloučenin (proteinů) a malých pohyblivých molekul metabolitů. Typickým experimentálním schématem se zabudovaným T2 filtrem je Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulsní sekvence [73,74], která je v metabolomice začleněná do standardní 1D pulsní sekvence s presaturací rozpouštědla. Ve výsledných spektrech jsou pozorovány pouze signály nízkomolekulárních metabolitů a jen zbytkové signály vysokomolekulárních látek.

Obr. 2 Schéma pulsní sekvence 1D-NOESY a CPMG s presaturací (noesygppr1d a cpmgpr1d v katalogu sekvencí Bruker)

J-rozlišený (J-resolved) experiment [75] je jedinou 2D pulsní sekvencí, která bývá rutinně zařazená do metabolomické analýzy. V 2D J-rozlišeném experimentu je štěpení signálů vyvolané spin-spinovými interakcemi separováno od vlivu chemického posunu, takže v 1D projekci tohoto experimentu každý signál odpovídá pouze singletu. Tento přístup se dobře 11

uplatní hlavně v oblastech s velkým překryvem signálů, neboť poskytuje v relativně krátkém akvizičním čase jednodušší spektra v porovnání s klasickými protonovými 1D spektry. Informace o multiplicitě signálů, která je zachována v druhé dimenzi J-rozlišeného experimentu, přitom poskytuje užitečné doplňující parametry pro přiřazení metabolitů. Pro lepší analýzu protonových spekter a spolehlivější identifikaci metabolitů bývají pro některé vybrané vzorky naměřeny i standardní 2D experimenty, často s presaturací. COSY a TOCSY experimenty pomáhají charakterizovat jednotlivé spinové systémy, zatímco HMQC, HSQC a HMBC experimenty využívají při řešení překryvu lepší disperzi signálů v uhlíkové dimenzi. Informace získané z těchto časově náročných experimentů, zejména pak chemické posuny atomů uhlíku odečtené z heterokorelovaných experimentů, lze použít pro potvrzení identifikace metabolitů, přiřazených na základě 1D spekter.

2.2.3 Předúprava dat Předúprava

dat

(„preprocessing“)

zahrnuje

procedury,

které

jsou

nezbytné

pro transformaci NMR spekter do podoby vhodné k dalšímu statistickému zpracování. Jedná se o soubor několika vzájemně navazujících kroků (operace nejsou asociativní a záleží tedy na jejich pořadí): korekce fáze a základní linie (baseline), synchronizace píků („peak alignment“), „binning“, normalizace, transformace a škálování. Mnohé z těchto funkcí jsou integrovány jako součásti softwarových balíčků, kterými jsou např. Amix tool-kits (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo), Chenomx NMR Suite (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Kanada), Automics [76], Metabonomic [77], ProMetab [78], MetaboLab [79], MetaboAnalyst [80], MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Španělsko), apod. Možnosti v metabolomice nejčastěji využívaných programů jsou přehledně shrnuty v review [81].

2.2.3.1 Synchronizace píků Spektrům získaným na základě Fourierovy transformace je nejprve nutno opravit fázi a základní linii spektra (baseline), ať už manuálně nebo pomocí automatických algoritmů [82]. Automatická korekce fáze a baseline bývá součástí komerčního software NMR spektrometru,

12

přesto se však po automatickém zpracování spekter doporučuje jejich vizuální kontrola, aby bylo možné ještě odstranit případně vzniklé artefakty. I malé výkyvy pH, teploty či iontové síly ve vzorcích vyvolávají drobné změny v chemických posunech jednotlivých signálů. Tento „poziční šum“ se projevuje u každého metabolitu v jiné míře, ani všechny signály jednoho metabolitu nejsou ovlivněny stejným způsobem, což poněkud komplikuje jejich identifikaci a hlavně kvantifikaci. V prvním kroku jsou spektra obvykle srovnána pomocí signálu interního standardu. V případě plasmy dochází k rozšíření a posunu referenčního signálu nespecifickou vazbou TSP či DSS na proteiny přítomné ve vzorku, proto se někdy spektra referencují na signál laktátu nebo jiného vhodného metabolitu. Mírná variabilita chemických posunů je potlačena pomocí tzv. „binningu“ (viz následující odstavec 3.2.3.2). V případě potřeby je možné dále uplatnit některý z matematických algoritmů pro synchronizaci píků („peak alignment“), které jsou shrnuty v několika přehledných článcích [83,84]. Z takto upravených spekter se následně odstraňují ty úseky, ve kterých signály metabolitů nejsou nebo jsou tyto signály zkreslené. Z důvodu snazšího fázování a korekce baseline jsou spektra snímána v šířce 20-30 ppm. Pro další zpracování se vybírá obvykle interval 0,2-10,0 ppm, který spolehlivě obsáhne všechny signály přítomných metabolitů. Pokud měření probíhá ve vodných roztocích, odstraňuje se ze spekter zbytkový signál vody v oblasti cca 4,6-4,9 ppm. Močovina, nejkoncentrovanější metabolit v moči, rezonuje jako široký singlet v oblasti 5,5-5,9 ppm. Jeho poloha je závislá na pH vzorku a jeho intenzita je silně ovlivněna presaturací vody, proto se tento signál ze spektra také odstraňuje.

2.2.3.2 „Binning“ Další důležitou procedurou je takzvaný „binning“, který významně napomáhá snížit dimenzionalitu dat [85] a také eliminuje malé změny v polohách jednotlivých píků. Spočívá v rozdělení spekter na malé úseky – „biny“ (někdy též „buckets“), pro každý bin je vypočítán integrál jeho spektrální oblasti a tato hodnota potom představuje novou proměnnou. V NMR metabolomice se nejčastěji používá ekvidistantní binning s typickou šířkou 0,04 ppm, takže celé spektrum je zredukováno na přibližně 230 proměnných. Při pevně nastavených hranicích binů dochází k rozštěpení některých signálů mezi sousední biny, což bývá zdrojem artefaktů v následující statistické analýze. Tento problém lze řešit zavedením vylepšených metod binningu, nazvaných „adaptive binning“ [86–88], „optimized bucketing“ [89], „Gaussian

13

binning“ [90]. Data získaná z binovaných spekter mohou být používána pouze pro statistické účely; standardní identifikace biomarkerů vyžaduje analýzu plně rozlišených spekter. Výsledkem binningu je matice dat, ve které každý řádek odpovídá jednomu vzorku (spektru) a každý sloupec jedné proměnné (binu).

2.2.3.3 Normalizace Normalizace je operace na řádcích matice, která potlačuje nežádoucí rozdíly mezi vzorky a umožňuje tak jejich přímé srovnávání [91]. Tento krok je klíčový především u vzorků moči, kde – na rozdíl např. od plasmy nebo tkáňových extraktů - nemá operátor i při dodržení standardního protokolu kontrolou nad výchozím zředěním odebíraného vzorku [92]. K dispozici je podle účelu analýzy několik normalizačních metod [93,94]. Nejčastěji používaná je normalizace na celkovou plochu spektra. Vychází z předpokladu, že celkový integrál spektra je přímo úměrný zředění vzorku, a intenzita každého binu je vyjádřena jako podíl jeho plochy dělený plochou celého spektra. Tato metoda výborně slouží v situaci, kdy metabolické složení vzorků je celkem podobné, avšak selhává, pokud některé ze vzorků obsahují extrémně vysoké množství určitého metabolitu. Pro tyto případy byla vyvinuta velmi robustní metoda pravděpodobnostní kvocientové normalizace („probabilistic quotient normalization“, PQN) [95]. Při tomto postupu jsou pro všechny biny nejprve vypočítány poměry mezi testovaným a zvoleným referenčním vzorkem a medián těchto poměrů je pak použit jako normalizační faktor, kterým se testované spektrum vynásobí. Nedávno byla také navržena „supervised group aggregating“ metoda normalizace [96], při které je do procesu normalizace začleněna informace o klasifikaci vzorků do skupin a data jsou poté normalizována tak, aby se shlukovala do středů jednotlivých skupin v prostoru hlavních komponent (viz kapitola 3.2.4.2). Dalším možným řešením je normalizace na známou koncentraci interního standardu nebo na koncentraci vhodného metabolitu přítomného ve vzorku; u biomedicínských studií v moči se takto využívá signál kreatininu [42,44,97,98]. Pokud vylučovací soustava pracuje správně, je koncentrace kreatininu v moči konstantní a může sloužit jako vhodný standard pro korekce různých objemů moči. Protože ovšem metabolické změny spojené s obezitou a diabetem zvyšují riziko poruchy funkce ledvin, je třeba použití kreatininu jako standardu v těchto případech pečlivě zvážit. Technické problémy může způsobit i překryv obou signálů kreatininu v NMR spektru signály jiných metabolitů, např. kreatininový singlet u 3,05 ppm bývá překryt singletem kreatinu.

14

U metabolomických studií tkáňových extraktů se někdy jednotlivé vzorky normalizují na objem tkáně nebo na váhu sušiny. Standardně používané statistické metody většinou předpokládají normální (Gaussovo) rozdělení výchozích dat, proto se u biologických dat někdy provádí logaritmická nebo mocninná transformace, která jejich původně zešikmenou distribuci přibližuje Gaussovu rozdělení [99].

2.2.3.4 Škálování Škálování je matematická operace prováděná na sloupcích matice dat, tj. na binech [92] [99]. Protože změny koncentrovaných metabolitů ve vzorku se projeví v absolutní hodnotě výrazněji nežli změny minoritních složek, mají tyto metabolity větší vliv na celkové výsledky statistických modelů. Z tohoto důvodu je důležité normalizovat data tak, aby se vyrovnal odlišný vliv metabolitů zastoupených v různých koncentracích. K tomuto účelu se používá několik metod škálování. Nejprve se data centrují odečtením průměru („mean centering“) nebo mediánu sloupce. Často používané autoškálování [100] („autoscaling“, někdy též „unit variance scaling“) škáluje centrované signály na jednotkový rozptyl vydělením hodnoty sloupce směrodatnou odchylkou. Nevýhodou této metody je fakt, že k výsledkům přispívají stejnou měrou signály metabolitů i biny obsahující pouze šum. „Range scaling“ využívá jako škálovací faktor biologický rozsah. Protože k odhadu rozsahu jsou použity pouze dvě krajní hodnoty, je tato metoda velmi citlivá na odlehlá data. V NMR metabolomice je pravděpodobně nejrozšířenější Pareto škálování [101], kde se na rozdíl od autoškálování hodnota binu dělí odmocninou ze směrodatné odchylky. Tímto postupem sice také dochází k určitému vyrovnání vlivu různě intenzivních proměnných, ale přesto je zachována jistá proporcionalita výchozích hodnot (proporčně větší proměnná zůstane i po škálování o trochu větší než původně menší proměnná), takže hodnoty šumu v datech se nezvyšují až na úroveň signálu.

15

2.2.4 Multivariační statistická analýza Pro interpretaci naměřených dat se nabízejí různé statistické přístupy. Vzhledem k tomu, že v metabolomice paralelně sledujeme a vyhodnocujeme velké množství proměnných, nacházejí zde uplatnění především vícerozměrné (multivariační) metody. Konečným cílem analýzy je najít a popsat vztah mezi metabolickým složením vzorku a stavem organismu a identifikovat ty metabolity, které jsou za studovaný stav (tj. například určitou nemoc, způsob diety, vnější podmínky, jimž byl organismus vystaven, apod.) přímo odpovědné. Statistika poskytuje pro tyto účely celou řadu metod [46,102–104], které lze rozdělit do dvou základních skupin, známých pod názvem „supervised“ a „unsupervised“.

2.2.4.1 Analýza hlavních komponent (PCA) Prvním úkolem analýzy dat je přehlédnout a prozkoumat jejich celkovou strukturu a uspořádání z hlediska vzájemné podobnosti jednotlivých vzorků. Je zapotřebí přehledně vizualizovat původně komplexní data tak, aby bylo možno sledovat potenciální trendy a shlukování a identifikovat odlehlé hodnoty. Tomuto účelu nejlépe vyhovují „unsupervised“ metody, které nepředpokládají žádnou předchozí informaci o struktuře dat, nepracují s

klasifikací vzorků a dovolují tak nepředpojatý pohled na data. Nejpoužívanější

„unsupervised“ metodou je určitě Analýza hlavních komponent (Principal component analysis – PCA). Ta redukuje mnohorozměrný prostor experimentálních proměnných do jednoduššího modelového prostoru hlavních komponent (PC). Tyto nové souřadnice jsou vytvořeny jako lineární kombinace původních binů tak, aby první hlavní komponenta měla směr největší variability dat a každá následující komponenta popsala co největší množství zbytkové variability,

nevysvětlené

v

komponentách

předchozích.

K uspokojivé

reprezentaci

spektrálních dat obvykle postačují první dvě či tři PC. Výsledky PCA jsou vizualizovány pomocí dvou matic známých jako skóre (score) a zátěže (loadings). V rozptylovém grafu komponentních skóre (score plotu) jsou zobrazeny průměty jednotlivých spekter do rovin zvolených PC a vzdálenosti mezi nimi odrážejí podobnost mezi vzorky. Grafické znázornění zátěží (loading plot) indikuje, nakolik který signál (bin) v původním spektru přispívá k dané PC – bin vzdálenější od centra modelu se ve směru daného PC projevuje výrazněji. Protože směry ve score plotu odpovídají směrům v loading plotu, lze seskupení spekter ve score plotu interpretovat zkoumáním odpovídajících loadingů. Loading plot tak uživateli dovoluje přímo vizualizovat význačné metabolické změny. Hlavní předností PCA metody je názorná 16

vizualizace rozdělení dat a uživatelská jednoduchost. Její podstatná nevýhoda (tak jako u všech „unsupervised“ metod) však tkví v tom, že variabilita dat odpovědná za rozdíl mezi zkoumanými skupinami může být relativně malá a může zůstat překrytá variabilitou způsobenou jinými faktory, takže se nepromítne do žádné z hlavních komponent a PCA tak neposkytne uspokojivé řešení problému. Z dalších „unsupervised“ metod lze ještě zmínit například shlukovou analýzu („cluster analysis“, CA), která vytváří z objektů v multidimezionálním prostoru shluky (klastry) na základě jejich vzdálenosti, měřené určitým předem definovaným způsobem [102]. Objekty uvnitř jednotlivých shluků by měly být co nejpodobnější a naopak objekty v různých shlucích co nejvíce rozdílné. Tento postup je výhodný zejména tam, kde mají objekty přirozenou tendenci seskupovat se do tříd. Grafickým výstupem tohoto postupu je dendrogram, zaznamenávající postupné shlukování dat.

A

B

Obr. 3 Ukázka dvou způsobů vizualizace dat stejného modelu: A. score plot PCA, B. dendrogram CA. (data tříměsíčních kontrolních myší, červené skupině byl dva týdny injikován fyziologický roztok)

17

2.2.4.2 Diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (PLS-DA) „Supervised“ metody jsou naproti tomu metodami klasifikačními, takže dopředu vyžadují informaci o charakteru vzorku, např. dodatečný biochemický parametr (hmotnost, krevní tlak, apod.) nebo příslušnost k určité skupině (např. zdravý versus nemocný, geneticky modifikovaný versus původní). Informace o charakteru vzorku jsou shrnuty v matici prediktorů. Nejčastěji se v metabolomice při klasifikaci využívá diskriminační analýza, zejména diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (metoda PLS-DA). Tento přístup kombinuje klasifikační metody diskriminační analýzy a metody redukce mnohorozměrného prostoru experimentálních proměnných. Při tomto postupu se hledá vztah mezi maticí původních proměnných (binů), resp. jejich hlavních komponent, a odezvou, maticí prediktorů popisující klasifikaci vzorků. Při uplatnění v metabolomice však „supervised“ metody narážejí na zásadní problém, kdy počet řádků (tj. vzorků či spekter) v matici dat je řádově menší než počet sloupců (tj. proměnných, binů). Celý systém je tak přeurčený („over-fitted“), tj. algoritmus vždy dokáže najít vazbu mezi výchozími vzorky a zvolenými prediktory nehledě na to, jestli takový vztah v datech reálně existuje. Z tohoto důvodu každý model vytvořený PLS-DA vyžaduje důkladnou validaci. V ideálním „supervised“ postupu je tedy nejprve na cvičné („training“) sadě dat vytvořen model předpovídající třídu každého vzorku a tento model je posléze testován na jiné nezávislé validační sadě vzorků. Metabolomické studie bohužel často nenabízejí dostatek vzorků k vytvoření nezávislých tréninkových a validačních sad, takže je nutné použít jiné validační postupy, například křížové validace („cross-validation“) [105,106]. V případě studií na zvířecích modelech nebývá většinou k dispozici více než deset vzorků na skupinu, takže pro validaci PLS-DA modelů se využívá tzv. „vynechej jednoho“ („leave-one-out“, LOO) křížová validace. Při této metodě je ze skupiny odebrán jeden vzorek, na kterém se otestuje prediktivní schopnost modelu zbudovaného ze zbývajících N-1 vzorků; tento proces se opakuje na všech vzorcích ve skupině. V rámci tohoto postupu jsou analyzovány různé modely, lišící se počtem hlavních komponent zahrnutých do klasifikačních procedur. Potřebný počet hlavních komponent se potom určuje podle úspěšnosti predikce. Křížová validace však ne vždy podchytí problémy přeurčenosti systému, její výsledky je třeba přijímat s opatrností [107] a doporučuje se doplnit ji permutačním testem [106,108]. Při tomto testu se vzorkům přiřadí příslušnost ke skupinám zcela náhodně a na takto rozdělených vzorcích se provede PLS-DA. Tento proces náhodného přiřazení a následného modelování se opakuje

18

řádově tisíckrát. Následně se vyhodnocuje, jestli PLS-DA model založený na reálném rozdělení vzorků do tříd se signifikantně liší od modelů založených na náhodném přiřazení. Výsledky PLS-DA modelu bývají opět znázorněny pomocí score plotu a jedno- či dvourozměrného loading plotu. Dalším užitečným nástrojem vizualizace dat je takzvaný S-plot, ve kterém nezávislou proměnnou představuje hodnota loadingu příslušného binu a závislou proměnnou je jeho korelační koeficient. Shluk binů vytváří sigmoid (proto název S-plot), kde významné biny jsou umístěny na jeho okrajích a jsou tak snadno identifikovatelné.

A

B

Obr. 4 Dva různé způsoby vizualizace dat stejného PLS-DA modelu 2měsíčních myší s chemicky indukovanou obezitou: A. dvourozměrný loading plot, B. S-plot. V loading plotu jsou barevně rozlišeny biny patřící významným metabolitům.

Jiným způsobem interpretace výsledných dat je takzvané Variable importance (VIP) skóre [109]. VIP hodnota binu shrnuje jeho celkový příspěvek k PLS modelu, sečtený pro všechny komponenty, zvážený loading faktory. Biny s VIP skóre > 1 se považují pro daný model za významné, zatímco biny s VIP skóre výrazně menším než 1 je možné zanedbat.

19

2.2.5 Identifikace metabolitů Metabolomická analýza je v naprosté většině případů založena výhradně na 1D protonových NMR experimentech, což znamená, že k identifikaci metabolitů se často využívají spektra s velkým překryvem desítek až stovek různě intenzivních signálů. Přítomnost předpokládaných metabolitů se potvrzuje vyhledáváním pro ně typických multipletů především v méně „zaplněných“ oblastech spektra. Pozorované signály (chemické posuny, multiplicita) se potom srovnávají buď s dříve publikovanými spektrálními daty hledaných sloučenin, nebo častěji s údaji v databázích. V současné době je k dispozici celá řada databází obsahujících stovky až tisíce známých metabolitů, z nichž nejznámější jsou Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) [110], Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD) [111], Birmingham Metabolite Library (BML-NMR) [112], Human Metabolome Database (HMDB) [113] nebo dvě komerční databáze: Chenomx Metabolite Database (Chenomx, Inc.) [114] a BBIOREFCODE (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo). V ideálním případě by měly být ve spektru identifikovány všechny signály, příslušející danému metabolitu. Vzhledem k silnému překryvu signálů (např. ve spektrech moči) je tato situace často nedosažitelná a přiřazení tak bývá založeno na nejvýraznějších signálech hledané látky. Pro jednoznačnou identifikaci je proto žádoucí naměřit pro vybrané vzorky také 2D experimenty (COSY, TOCSY, HSQC) a využít takto dodatečně získané informace. V některých situacích, především u cílené metabolomické analýzy, se používá přídavek čistého metabolitu ke vzorku a hledá se shoda mezi chemickými posuny přidané sloučeniny a původního spektra. Jinou, experimentálně náročnější možností identifikace specifického metabolitu je pak zařazení separačního kroku před vlastní NMR analýzu, jako např. LC-NMR či LC-SPE-NMR.

2.2.6 Kvantifikace metabolitů Jednou z hlavních výhod NMR spektroskopie oproti jiným analytickým metodám je snadnost kvantifikace, neboť koncentrace látky je přímo úměrná integrální intenzitě odpovídajících signálů ve spektru. Přesto však přesná kvantitativní měření kladou určité speciální nároky na experimentální parametry, obzvláště na relaxační čas (minimálně pětkrát delší než čas podélné relaxace nejpomaleji relaxujícího jádra) a počet skenů nezbytných k získání uspokojivého poměru signál/šum [115]. Zvláštní pozornost při měření ve vodných

20

roztocích musí být také věnována výběru vhodného presaturačního schématu kvůli snížení intenzity signálů rezonujících blízko vody a signálů vyměnitelných protonů. Tradičně je plocha vybraného signálu porovnávána s plochou signálu referenční sloučeniny o známé koncentraci. Jako standard se ve vodných roztocích běžně používá TSP nebo DSS. Ve vzorcích plasmy dochází k nespecifické vazbě přítomných proteinů na molekuly TSP či DSS; větší relaxační čas těchto komplexů vede ke snížení a rozšíření referenčního signálu. V těchto případech bylo navrženo použít jako referenční látku kyselinu mravenčí [116]. Další alternativou je takzvaná ERETIC metoda (Electronic Reference To access In vivo Concentrations) [117], kde jako vnitřní standard slouží elektronicky generovaný referenční signál. Tato metoda umožňuje absolutní kvantifikaci bez nutnosti přidávat ke vzorku další látky; díky volbě parametrů elektronického signálu ani nehrozí jeho překryv se signály látek ve spektru. Je zřejmé, že výše zmíněné metody jsou vhodné spíše pro jednoduché směsi látek s minimálním překryvem signálů, což ovšem nebývá případ komplexních metabolomických vzorků. Vhodným řešením překryvu signálů je změření 2D spekter. Metodou první volby je J-rozlišený experiment, v jehož 1D projekci jsou výchozí multiplety zredukovány na singlety, přičemž intenzita signálů zůstává zachována. Pro kvantitativní účely byly vyvinuty zlepšené pulsní sekvence bez artefaktů vzniklých silnými spin-spinovými interakcemi [118,119]. Jinou možností je využít větší disperzi uhlíkových rezonancí v HSQC experimentech. Byly navrženy pulsní sekvence, které zvyšují kvantitativnost tohoto typu experimentu [120]. Protože je však problematické přímo korelovat intenzity krospíků v HSQC spektrech s koncentrací jednotlivých metabolitů, je zapotřebí sestrojit kalibrační křivky a porovnávat píky v původních vzorcích s píky ve spektrech s přidanými metabolity o známých koncentracích. Kvantifikace se tedy provádí na skupině předem známých metabolitů, a proto se tento postup spíše hodí k přijetí či zamítnutí dané hypotézy než pro průzkumovou analýzu dat [121]. Zásadní nevýhodou 2D experimentů ovšem zůstává jejich dlouhý akviziční čas. Většinou je tento problém řešen zkrácením relaxačního času na 5-10 s, což nestačí na úplnou relaxaci všech jader a výsledná spektra jsou pak vhodná pouze pro relativní semikvantitativní studie. Novou perspektivu pro širší uplatnění 2D experimentů v rutinních metabolomických měřeních otevírá zavedení nelineárního vzorkování dat, které významně snižuje čas potřebný k akvizici spekter [122].

21

2.3 NMR metabolomika při studiu obezity a diabetu – využití myších modelů

2.3.1 Metabolomický přístup k obezitě a diabetu Obezita je vnímána jako jeden z hlavních globálních zdravotních problémů s prudkým nárůstem prevalence. Je charakterizována nadměrným hromaděním tuku, plynoucím z dlouhodobé nerovnováhy mezi příjmem a výdejem energie [123]. Obezita představuje významné zdravotní riziko, neboť je spojena s řadou dalších chorob, jako je insulinová rezistence a diabetes mellitus 2. typu (T2DM), kardiovaskulární onemocnění (hypertenze, ateroskleróza, infarkt myokardu, mozkové cévní příhody) či některé typy nádorových onemocnění [124]. V současnosti je obezita považována za onemocnění s komplexní etiologií a patogenezí, na kterém se podílejí jak genetické faktory, tak vliv prostředí i životního stylu včetně způsobu stravování [125]. Protože obezita i T2DM představují souborné poruchy celého organismu spojené s četnými změnami na metabolické úrovni, objasnění jejich patofyziologie vyžaduje detailní znalost molekulárních mechanismů s nimi spojených. Strategie založená na NMR spektroskopii v kombinaci s multivariační statistickou analýzou se ukázala jako užitečný nástroj k uchopení obezity na metabolické úrovni [126–128]. NMR a MS metabolomika odhalila v souvislosti s obezitou a diabetem četné změny především v metabolismu mastných kyselin, aminokyselin, sacharidů, citrátového cyklu, žlučových kyselin a cholinových intermediátů [129]; současné poznatky jsou shrnuty v mnoha přehledných článcích, například [125,129–131].

2.3.2 Myší modely obezity a diabetu v NMR metabolomice Při studiu obezity a s ní spojených komplikací se výborně uplatňují vhodné zvířecí modely [4,132–136]. Myši představují společně s potkany dva základní druhy savců, využívané v metabolomickém výzkumu [63].V myších modelech je již v horizontu týdnů či několika měsíců možné pozorovat změny, které by v lidském organismu probíhaly v řádu několika let. Myši mají dobře definované genetické linie, mezi kterými lze podle zaměření studie vybrat vhodný genetický model [133]; při použití inbredních kmenů jsou k dispozici geneticky téměř jednotná zvířata. Zároveň je možné mít pod kontrolou i vnější podmínky,

22

kterým je model vystaven, ať už jde například o příjem stravy či denní režim, a tak podstatně zmenšit nežádoucí variabilitu ve skupině sledovaných jedinců. Všechny tyto faktory umožňují vytvoření vnitřně homogenních studovaných i kontrolních skupin, což dovoluje omezit počet vzorků nezbytných pro relevantní statistické vyhodnocení. Výzkumy na myších modelech se tak velmi často provádějí v počtu deseti zvířat na skupinu, zatímco lidské studie zahrnují stovky až tisíce jedinců. Myší modely obezity můžeme rozdělit podle způsobu jejího vzniku do několika základních skupin: monogenní modely s obezitou vzniklou spontánní genetickou mutací nebo cíleným vyřazením („knockoutováním“) určitého vhodného genu a polygenní modely s obezitou vyvolanou chirurgickým zásahem, chemicky či potravou [137–140].

2.3.2.1 Modely geneticky modifikovaných myší Často používanými monogenními modely jsou myši s mutacemi v leptinové dráze. Jedním z příkladů jsou ob/ob myši se spontánní mutací v leptinové dráze, která zabraňuje sekreci biologicky aktivního leptinu a vede tak k nekontrolovanému příjmu potravy, obezitě, T2DM a insulinové rezistenci s hyperinsulinemií [137,140]. NMR metabolomika v moči a séru na ob/ob myším modelu [141] ukázala signifikantní rozdíly v hladinách několika desítek metabolitů ve srovnání se štíhlými C57BL/6J kontrolami. Změny u obézních samců byly spojeny především s insulinovou signalizací, zatímco u obézních samic s metabolismem tuků. Roberts a kol. studovali na tomto modelu pomocí NMR a MS roli PPAR γ a δ (receptorů aktivovaných proliferátory peroxisomů) při regulaci insulinové sensitivity [142]. Diabetickou mutaci u db/db myší způsobuje porucha leptinové signalizace (mutace leptinového receptoru) v hypothalamu, vedoucí k morbidní obezitě s hyperleptinemií a insulinovou rezistencí [137,143]. V komplexní studii srovnávající metabolismus lidí, diabetických Zucker fatty potkanů a db/db myší [144] byla využita NMR metabolomika v moči s následnou multivariační statistickou analýzou; pozorovány byly především změny v citrátovém cyklu a metabolismu methylaminu a nukleotidů. Porovnání metabolického profilu moči db/db myší se štíhlými kontrolami odhalilo zvýšenou aktivitu citrátového cyklu a utlumení metabolismu větvených aminokyselin [145]. Specifičtějším modelem jsou s/s myši, u nichž je poškozen pouze jeden z transkripčních faktorů leptinové signalizační dráhy. Tyto myši jsou obézní, ale méně hyperglykemické než

23

ob/ob myši [140]. Saadat a kol. [146] detekovali v NMR spektrech moči dvou myších modelů, db/db a s/s, rozdíly v metabolismu glycinu, serinu a homocysteinu. Protože však dosud není znám přesný molekulární mechanismus patogeneze obezity a diabetu u lidí, mohou vést extrapolace výsledků z myších modelů na lidský metabolismus k mylným závěrům [147]. Jako problematické se jeví

právě modely geneticky

modifikovaných myší, neboť pozorované výsledky bývají kmenově specifické. Je proto velmi obtížné odlišit metabolické změny přímo vyvolané obezitou či diabetem od změn souvisejících výhradně s rozdílným genetickou výbavou modelových a kontrolních zvířat.

2.3.2.2 Model chemicky indukované obezity Obezita vyvolaná podkožními injekcemi

L-glutamanu

monosodného

(MSG)

novorozeným myším představuje užitečný myší model chemicky indukované obezity a insulinové rezistence [148,149]. Podávání MSG vyvolává vznik specifických lézí v nucleus arcuatus (ARC) v hypothalamu, který je hlavním centrem regulace příjmu potravy. Zásah vede k poškození většiny neuronů ARC [150], zatímco ostatní jádra v hypothalamu zůstávají po podání MSG nedotčena [151,152]. Kvůli poškození zraku mají MSG myši narušený cyklus příjmu potravy, řízený střídáním světla a tmy [153,154]. Rozvíjí se u nich adipozita [155], která je spíše důsledkem nižší metabolické aktivity nežli zvýšeného příjmu potravy. V nedávné práci se ukázalo, že myši s MSG obezitou mají snížený příjem potravy v porovnání se štíhlými kontrolami [156]. Dalšími rysy, kterými se MSG model podobá lidské obezitě, jsou hyperinsulinemie a insulinová rezistence [157]. Na druhou stranu hladiny glukosy u obézních MSG samců zůstávají i přes detekovanou hyperinsulinemii celkem v normě [158]. MSG myši jsou tak vhodným modelem obezity kombinované s insulinovou rezistencí avšak bez projevů diabetu, což je velmi běžná kombinace u pacientů po celém světě. Ačkoliv biochemickou charakterizací MSG modelu se postupně zabývalo několik skupin autorů [158–160], na úrovni metabolomiky nebyl tento model dosud popsán.

2.3.2.3 Model obezity navozené vysokotukovou dietou K vyvolání obezity se často využívá podávání potravy s vysokým obsahem tuku (HF) vhodným kmenům experimentálních zvířat [137]. Pro dobrou charakterizaci modelu dietou indukované obezity (DIO) je důležitý přesný popis složení HF diety [138]. K navození dietou 24

indukované obezity u myší a měření insulinové rezistence a senzitivity byl vytvořen a publikován protokol [161]. Někteří autoři používají k vyvolání obezity tzv. „bufetovou“ stravu („cafeteria diet“), která kromě tuku obsahuje i zvýšené množství sacharidů a napodobuje tak složení potravy obyvatel západního světa [162]. Protože obezita se v DIO modelu rozvíjí postupně, jak jsou myši krmeny vysokotukovou dietou, a průběžně se také snižuje fyzická aktivita zvířat, je tento model velmi podobný lidské obezitě vyvolané nevhodným stravováním v kombinaci se sedavým způsobem života. V závislosti na myším kmenu, pohlaví a složení HF diety roste u DIO myší adipozita, vedoucí zhruba po osmi týdnech HF diety k hyperleptinemii. Leptinem porušená regulace příjmu potravy postupně způsobuje centrální leptinovou rezistenci. Bylo pozorováno, že některé myší kmeny jsou k vyvolání dietou indukované obezity podstatně náchylnější. Jako nejvhodnější pro rozvoj metabolického syndromu se jeví kmen C57BL/B6, u kterého se vyvíjí mnoho lidem podobných patologických rysů, jako např. viscerální obezita, insulinová rezistence, hyperleptinemie a hyperinsulinemie [163–165]. První pokus o metabolomickou charakterizaci C57BL/B6 DIO modelu provedl Shearer a spol. [166]. Cílem práce bylo zjistit, zda metabolomické profilování lze použít jako diagnostický nástroj k detekci insulinové rezistence vyvolané DIO. PLS-DA modely na vzorcích plasmy, odebrané myším po 12 týdnech HF diety, ukázaly signifikantní změny lysinu, glycinu, citrátu, leucinu, suberátu a acetátu. Při studiu téhož modelu obezity stejný tým výzkumníků ukázal, že výsledný metabolický profil plasmy výrazně ovlivní změna diety týden před odběrem více než předchozích 12 týdnů nízkotukové (LF) či HF stravy [167]. Dále byl sledován vliv cvičení různé intenzity na metabolický profil myší plasmy a byl porovnáván s vlivem HF a LF diety [168]. První NMR metabolomickou studii na moči C57BL/6 kmenu provedl Jung a kol. [169]. Pomocí PCA byly srovnány metabolické profily moči myší krmené HF a vysokosacharidovou (HC) dietou. Vliv HF diety se projevil především zvýšenou hladinou metabolitů nikotinamidu, zatímco HC strava aktivovala citrátový cyklus (nárůst citrátu a sukcinátu). Podrobnější studie dietou indukované obezity na myších kmene C57BL/6 se kromě vlivu diety na složení moči zaměřila i na charakterizaci myší, které na HF dietu reagovaly výrazně či naopak téměř vůbec [170]. V této souvislosti byly především podrobně diskutovány změny v hladinách derivátů větvených aminokyselin.

25

2.3.3 Studium antidiabetické terapie na myších modelech Ačkoliv rozvoj obezity a diabetu byl u myší modelů na metabolické úrovni často popsán (viz odstavec 2.3.2), v literatuře se téměř nevyskytují práce, které by na takto zavedených modelech pomocí NMR metabolomiky sledovaly průběh antidiabetické léčby. Jedinou studií, týkající se metabolomiky moči, je publikace Zhu a kol., mapující vliv metforminové terapie na DIO myším modelu pomocí UPLC-TOF/MS [31]. Autoři po dobu 16 týdnů sledovali tři skupiny C57BL/6 myší: na standardní dietě, na HF dietě a na HF dietě s metforminovou léčbou. Statistická analýza dat na konci pokusu označila 21 pravděpodobných biomarkerů, které se vztahovaly především ke změněnému metabolismu citrátového cyklu, aminokyselin a mastných kyselin. Zatímco metformin je široce akceptován jako lék první volby pro všechny pacienty s diabetem 2. typu, stále chybí dostatečné informace o optimální volbě léčby druhé linie, která by se kombinovala s metforminem u pacientů s neuspokojivou kompenzací diabetu [171]. V posledních letech byly uvedeny do praxe nové antidiabetické terapie založené na modulaci hladiny endogenních inkretinových hormonů (GLP-1, glucagon-like peptid 1) nebo stimulaci jeho receptorů [172]. Protože GLP-1 je v organismu velmi rychle deaktivován dipeptidyl peptidasou 4 (DPP-4), jednou z možností je využít k léčbě inhibitory DPP-4, takzvané gliptiny, mezi něž patří i vildagliptin [173]. Přestože podávání metforminu i vildagliptinu patří k zavedeným terapeutickým postupům, mechanismus jejich účinku není doposud plně objasněn [174,175].

26

3 Cíle práce Náplní předkládané disertační práce je studium myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky moči. Vlastní práce má tři dílčí cíle: 1. Optimalizace experimentálního protokolu NMR analýzy moči u myších modelů Pro NMR experimenty v moči sice existuje doporučený postup, univerzální protokol ale nemusí vyhovovat specifickým myším vzorkům. Cílem této části práce bylo na myším modelu obezity ověřit volbu těch faktorů, které zásadním způsobem ovlivní kvalitu výsledných dat: způsobu odběru vzorků moči, volbu pulsní sekvence pro snímání protonových spekter a způsobu normalizace naměřených dat. 2. Charakterizace metabolického stavu modelu myší s chemicky indukovanou obezitou Ačkoliv byl model myší s obezitou indukovanou L-glutamanem monosodným (MSG) v literatuře vícekrát popsán a použit, neexistuje doposud žádná práce zabývající se MSG modelem z pohledu metabolomiky. Cílem bylo charakterizovat tento model obezity pomocí NMR metabolomiky moči a získaná data porovnat s biometrickými, biochemickými a hormonálními parametry. 3. Metabolické profilování moči myší s dietou indukovanou obezitou a diabetem, léčených metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací Model myší s dietou indukovanou obezitou (DIO) je pro svoji podobu s lidskou obezitou často používán. Cílem této části práce bylo sledovat na metabolickém profilu DIO myší vliv tří variant antidiabetické léčby, srovnat efektivitu jednotlivých terapií a pokusit se označit vhodné markery diabetu pro tento model.

27

Některé části teoretického úvodu práce jsou volně upraveny podle publikované kapitoly: Advanced Techniques for NMR Analysis of Complex Biological Mixtures—From Simple NMR to Hyphenated Techniques Pelantová, H., Bártová, S., Kuzma, M. In Natural Products Analysis: Instrumentation, Methods, and Applications (Havlíček, V., and Spížek, J., eds.), 2014, John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, 239–284

Výsledky optimalizace NMR analýzy moči (cíl 1) byly publikovány v práci: Strategy for NMR metabolomic analysis of urine in mouse models of obesity— from sample collection to interpretation of acquired data Pelantová, H., Bugáňová, M., Anýž, J., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Haluzík, M., Kuzma, M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2015, 115, 225-235

Výsledky charakterizace MSG modelu (cíl 2) byly publikovány v práci: Metabolomic profiling of urinary changes in mice with monosodium glutamate-induced obesity Pelantová, H., Bártová, S., Anýž, J., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Lacinová, Z., Šulc, M., Haluzík, M., Kuzma, M. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2015, DOI 10.1007/s00216-015-9133-0, v tisku

Výsledky studie vlivu antidiabetik na DIO model myší (cíl 3) jsou citovány z připravovaného rukopisu: Urinary metabolic profile in mice with diet-induced obesity and type 2 diabetes mellitus after treatment with metformin and vildagliptin Pelantová, H., Bugáňová, M., Šedivá, B., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Zemenová, J., Sýkora, D., Lacinová, Z., Kaválková, P., Haluzík, M., Kuneš, J., Kuzma, M. pro časopis Endocrinology

28

4 Experimentální část 4.1 Chemikálie a přístrojové vybavení použité v NMR metabolomice K přípravě pufru pro vzorky moči byly použity: dihydrogenfosforečnan draselný (Lachema, Brno, ČR), azid sodný (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), sodná sůl kyseliny 3-(trimethylsilyl)propansulfonové-d4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a D2O (100.00 % D, ARMAR Chemicals, Döttingen, Švýcarsko) Vzorky moči outbredního NMRI kmene a inbredního C57BL/6 kmene myší (oba z Charles River, Sulzfeld, Německo) byly uchovávány v mrazícím boxu (-80 °C) Ultra Low (Revco, USA) a před použitím odstředěny na centrifuze Hermle Z233 MK-2 (Hermle Labortechnik, Wehingen, Německo). Vzorky moči pro studium antidiabetické léčby byly připraveny automaticky robotickým systémem Gilson Liquid Handler 215 (Gilson, Inc., Middleton, WI, USA). Všechny vzorky byly změřeny na NMR spektrometru Bruker AVANCE III 600 MHz, vybaveném trojrezonanční Z-gradientní TCI kryosondou a software Topsin 3.2 (vše Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo). Naměřená spektra byla binována programem AMIX (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo) a následně statisticky vyhodnocena buď programem MATLAB, verze 8.1.0.604 (R2013a)

(The

MathWorks

Inc.,

Natick,

MA,

USA)

nebo

MetaboAnalyst

(http://www.metaboanalyst.ca/). Metabolity byly identifikovány programem Chenomx NMR Suite 7.6 (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Canada) a pomocí databází BBIOREFCODE 2-0-3 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo) a HMDB (http://hmdb.ca).

29

4.2 Optimalizace experimentálního protokolu 4.2.1 Experimentální zvířata Studie byla prováděna na modelu outbredních NMRI myší (Charles River, Sulzfeld, Německo). Pro vyvolání obezity byl novorozeným myším samcům podkožně injikován L-glutaman monosodný (MSG – Sigma, St. Louis, USA) v dávce 4 mg/g tělesné váhy podle postupu Maletínské a kol. [156]. Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Myši byly chovány v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů Akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2 °C a rytmu světlo/tma 12/12 hodin (začátek světla 6:00) s volným přístupem k pitné vodě. Krmeny byly standardní dietou St-1 (Mlýn Kocanda, Jesenice, ČR), která obsahovala 66 % sacharidů, 25 % proteinů a 9 % tuků a jejíž energetická hodnota byla 3,4 kcal/g. Kromě myší s chemicky indukovanou dietou (MSG skupina) byly za stejných experimentálních podmínek chovány i kontrolní samci NMRI myší.

4.2.2 Odběr vzorků moči Metodická studie byla provedena u zvířat ve věku dvou měsíců. Moč byla odebrána MSG a kontrolním myším (počet myší na skupinu n = 10) pomocí tří různých odběrových protokolů. Přímý odběr ranní moči byl proveden v 8 h ráno jemným tlakem na břicho (protokol A). Pro 24hodinový odběr moči byly myši umístěny jednotlivě do metabolických klecí (Tecniplast, Itálie) s volným přístupem k vodě, a to buď bez přístupu k potravě (protokol B) nebo s volným přístupem k potravě (protokol C). K odebraným vzorkům byl přidán NaN3 pro zabránění bakteriální infekce a do NMR analýzy byly uchovávány při -80 °C.

4.2.3 NMR experimenty Před vlastní NMR analýzou byly vzorky ponechány volně rozmrznout při pokojové teplotě a poté byly odstředěny při 12 000 rpm po dobu 5 minut. 200 µl supernatantu bylo zředěno 340 µl destilované vody a smícháno s 60 µl fosfátového pufru (1,5 M KH2PO4 v D2O obsahující 2 mM NaN3 a 0,1% TSP, pH 7,4). Výsledný vzorek, obsahující H2O a D2O v poměru 9 : 1, byl přenesen do standardní 5mm NMR kyvety. Přímo odebíraná moč (protokol A) a jeden alikvot vzorku podle B protokolu byly měřeny v 3mm NMR kyvetách

30

naplněných 50 µl supernatantu a 150 µl zředěného fosfátového pufru. Všechny NMR experimenty byly naměřeny při teplotě 300 K na 600 MHz spektrometru Bruker Avance III (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo) vybaveném 5mm TCI kryosondou a software Topspin 3.2 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo). Pro každý vzorek bylo v automatickém režimu provedeno naladění pozorovacího kanálu sondy i homogenity magnetického pole a byla automaticky nakalibrována délka sklápěcího 90° pulsu. 1D-NOESY spektra (standardní pulsní sekvence firmy Bruker noesygppr1d) byla snímána s následujícími parametry: počet skenů NS = 32 (NS = 64 v 3 mm kyvetách), počet datových bodů TD = 64k, šířka spektra SW = 20 ppm. Signál vody byl potlačen v průběhu relaxační prodlevy 4 s a směšovacího času 100 ms pomocí 25 Hz saturačního pulsu umístěného do středu signálu vody. CPMG spektra s presaturací (pulsní sekvence cpmgpr1d) byla naměřena s parametry: NS = 64, TD = 64k, SW = 20 ppm, relaxační prodleva 4 s s presaturací signálu vody, echo 0,3 ms, smyčka pro T2 filtr 126. Krátký 2D J-rozlišený experiment s presaturací (pulsní sekvence jresgpprqf, NS = 2, SW = 16 ppm, TD = 8k, počet inkrementů NI = 40, SW v nepřímé dimenzi 78.125 Hz, relaxační prodleva s presaturací 2 s) sloužil pro lepší identifikaci metabolitů a také jako dodatečný zdroj dat pro vícerozměrnou statistickou analýzu. Signály volně doznívající indukce (FIDy) byly zváženy pomocí umělého rozšíření čáry (line broadening 0,3 Hz). Spektrům byla automaticky upravena fáze a základní linie a byla referencována na signál TSP (0,00 ppm). U vybraných vzorků byl naměřen také COSY a HMQC experiment s presaturací.

4.2.4 Analýza NMR dat Metabolity byly identifikovány porovnáním 1D protonových spekter (1D-NOESY nebo CPMG) s databázemi Chenomx NMR Suite 7.6 (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Kanada), BBIOREFCODE 2-0-3 (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Německo) a s dříve publikovanými spektrálními daty. Před vlastní multivariační statistickou analýzou byla spektra v rozsahu -1,00 – 10,00 ppm rozdělena na pravidelné biny se šířkou 0,04 ppm, přičemž byly vyloučeny úseky odpovídající signálu vody (4,68-4,90 ppm), močoviny (5,65-5,90 ppm) a TSP (-0,12-0,12 ppm). Pro kompenzaci různého zředění výchozích vzorků moči byly použity tři způsoby normalizace: normalizace na celkovou plochu spektra, pravděpodobnostní kvocientová 31

normalizace a normalizace na signál kreatininu. Aby se předešlo rozštěpení důležitých signálů mezi sousední biny a tím zkreslení jejich intenzit, byly v rámci binningu připraveny 4 matice dat s šířkou binu 0,04 ppm, vzájemně posunuté o 0,01 ppm, takže každý studovaný signál mohl být umístěn do středu vhodného binu. Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) byla provedena pomocí standardního algoritmu [176] v programu MATLAB, data byla předem centrována odečtením průměru a Pareto škálována dělením odmocninou ze směrodatné odchylky. Následně byla provedena standardní PLS-DA analýza se stejným centrováním a škálováním dat jako v případě PCA. Kvalita jednotlivých modelů a volba správného počtu hlavních komponent byla posouzena LOO křížovou validací; testované modely byly hodnoceny pomocí podílu vysvětleného rozptylu („fraction of explained variation“) R2 a podílu predikovaného rozptylu („fraction of predicted variation“) Q2. Vybraná skupina devatenácti metabolitů, na které byl studován vliv jednotlivých experimentálních parametrů popsaných a diskutovaných v kapitole 6.1 (Tab. I), byla dále analyzována pomocí Studentova t-testu, aby bylo možné pro dané biny vyhodnotit signifikanci detekovaných změn.

4.3 Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou 4.3.1 Experimentální zvířata Studie byla prováděna na modelu outbredních NMRI myší (Charles River, Sulzfeld, Německo), kterým byl pro vyvolání obezity v prvním týdnu věku podkožně injikován L-glutaman monosodný (MSG). Tento model byl ve 2 měsících věku použit k metodické studii, experimentální podmínky chovu myší jsou popsány v odstavci 4.2.1. Kromě myší s chemicky indukovanou obezitou (MSG skupina) byly za stejných experimentálních podmínek chovány i kontrolní NMRI myši. Tělesná hmotnost myší byla monitorována jednou týdně až do devíti měsíců věku. Ve dvou, šesti a devíti měsících věku byly hladové MSG obézní myši a jim odpovídající kontroly (10 zvířat ve skupině) usmrceny dekapitací. Z plné krve byla připravena plasma, která byla uchována při -80 °C. Myším byla odebrána bílá tuková tkáň (WAT, tj. podkožní SCAT a intraperitoneální IPAT), hnědá tuková tkáň (BAT) a játra. Tkáně byly zváženy, zmrazeny v kapalném dusíku a do RNA extrakce uchovány při -70 °C. Míra adipozity byla vyjádřena jako poměr hmotnosti tukové tkáně a celkové tělesné hmotnosti. 32

Pro metabolomickou charakterizaci modelu byly MSG myši a jejich kontroly ve dvou, šesti a devíti měsících věku jednotlivě umístěny do metabolických klecí (Tecniplast, Italy) bez přístupu k potravě a byla jim odebrána 24hodinová moč. Ke vzorkům byl přidán NaN3 a až do vlastních NMR experimentů byly uchovávány při -80 °C.

4.3.2 Biochemické experimenty Intraperitoneální glukosový toleranční test Šestiměsíční MSG myši a jejich kontroly byly ponechány přes noc bez přístupu k potravě. Ráno byla změřena bazální glukosa (odběrem krve z ocasu) glukometrem (Glucocard, Arkray, Kyoto, Japonsko). Poté byl myším injikován intraperitoneálně roztok glukosy rozpuštěné ve fyziologickém roztoku v dávce 2 g/kg tělesné hmotnosti myši. Glukosa byla měřena v krvi myší v čase 0, 15, 30, 60, 90, 120 a 180 minut po injekci. Stanovení hormonálních a biochemických parametrů Plasmatické hladiny insulinu byly stanoveny pomocí RIA kitů (Millipore, St. Charles, MI, USA a Linco Research, St. Charles, MI, USA), plasmatické hladiny leptinu pomocí ELISA kitu (Millipore, St. Charles, MI, USA). Hladiny glukosy byly měřeny glukometrem Glucocard. Všechna stanovení byla prováděna v souladu s protokoly doporučenými výrobci. Glukosový toleranční test a stanovení hormonálních a biochemických parametrů provedla Mgr. Martina Holubová, Ph.D., z výzkumné skupiny Antiobezitních peptidů ÚOCHB AVČR, v.v.i. v Praze. Stanovení exprese mRNA v tukové tkáni a v játrech Exprese mRNA byly stanoveny u šestiměsíčních myší. Vzorky tukové tkáně a jater byly zpracovány podle dříve publikovaného postupu [177]. Byly sledovány exprese následujících genů: nikotinamid-N-methyltransferasa (NNMT) v játrech, IPAT, SCAT a BAT, receptory aktivované proliferátory peroxisomů PPARα a PPARγ (IPAT, SCAT, BAT), adiponektin, leptin (IPAT, SCAT) a hlavní močový protein 1 (MUP-1) v játrech. Experimenty byly prováděny na přístroji ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Jako vnitřní standard pro kompenzaci množství RNA spotřebovaného v reakci a pro korekci účinnosti reverzní transkripce a polymerasové řetězové reakce byl použit β2-mikroglobulin

33

(B2M), při expresi NNMT navíc ještě glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa (GADPH) a betaglukuronidasa (GUSB). Exprese mRNA stanovily RNDr. Zdena Lacinová a M. Čechová v Laboratoři molekulární diabetologie a obezitologie na 3. interní klinice 1. Lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Statistické vyhodnocení biochemických parametrů a expresí mRNA Získané hodnoty jsou uvedeny jako průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM). Data byla vyhodnocena t-testem s použitím programu GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA); za statisticky významné byly považovány rozdíly s p-hodnotou < 0,05. Stanovení proteinů v moči Koncentrace proteinů v moči byla stanovena pomocí reakce s bicinchoninovou (2,2´-bichinolin-4,4´-dikarboxylovou) kyselinou (Sigma) [178]; jako standard pro sestrojení kalibrační křivky byl použit hovězí sérový albumin (Sigma). Stanovení provedl doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D., z Laboratoře charakterizace molekulární struktury Mikrobiologického ústavu AVČR, v.v.i v Praze.

4.3.3 NMR experimenty Vzorky moči pro NMR analýzu byly připraveny do standardních 5mm NMR kyvet způsobem popsaným v metodické části v odstavci 4.2.3. Pro odstranění intenzivního pozadí širokých proteinových signálů byla protonová spektra snímána Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulsní sekvencí s presaturací (cpmgpr1d v katalogu Bruker). Pro lepší identifikaci metabolitů byl zařazen krátký 2D J-rozlišený experiment s presaturací (jresgpprqf). Všechny experimentální procedury včetně nastavení parametrů jednotlivých pulsních sekvencí se shodují s postupem uvedeným v odstavci 4.2.3. U několika vybraných vzorků byly naměřeny také COSY a HMQC experimenty s presaturací (pulsní sekvence cosygpprqf a hmqcphpr).

34

4.3.4 Analýza NMR dat Metabolity byly identifikovány porovnáním 1D protonových spekter (1D-NOESY nebo CPMG) s databázemi Chenomx NMR Suite 7.6 (Chenomx Inc., Edmonton, AB, Kanada), BBIOREFCODE 2-0-3 (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Německo) a s dříve publikovanými spektrálními daty. Multivariační analýza dat byla provedena postupem popsaným v experimentální části metodické studie kap. 4.2.4. Před vlastní multivariační statistickou analýzou byla spektra v rozsahu -1,00 – 10,00 ppm rozdělena na pravidelné biny se šířkou 0,04 ppm, přičemž byly vyloučeny úseky odpovídající signálu vody (4,68-4,90 ppm), močoviny (5,65-5,90 ppm) a TSP (-0,12-0,12 ppm). Spektra byla normalizována na celkovou plochu a rozdělena na pravidelné biny se šířkou 0,04 ppm; byly připraveny 4 matice dat s šířkou binu 0,04 ppm vzájemně posunuté o 0,01 ppm. Na centrovaných a Pareto škálovaných datech byly v programu MATLAB provedeny PCA a PLS-DA analýzy. Kvalita jednotlivých modelů a volba správného počtu latentních proměnných byla posouzena LOO validací. V PLS-DA modelech

byly

z příslušných

s-plotů

odečteny

významné

biny

s korelačním

koeficientem > 0,5 a loading faktorem > 0,05. Každý signál odpovídající, signifikantnímu binu odečtenému z PLS-DA modelů, pak byl situován doprostřed vhodného 0,04 ppm širokého binu, vybraného ze čtyř výše popsaných vzájemně posunutých datových matic, a podroben Studentovu t-testu.

4.4 Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou 4.4.1 Experimentální zvířata Myší samci inbredního kmene C57BL/6 (Charles River, Sulzfeld, Německo) byli od tří týdnů věku chováni v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů Akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2 °C, relativní vlhkosti 45-65 % a stabilním rytmu denního světla (6-18h), 5 myší v kleci. Se zvířaty bylo zacházeno podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Myši měly volný přístup k vodě a byly krmeny standardní dietou ssniff® R/M-H, které obsahovala 33 % proteinů, 9 % tuků a 58 % sacharidů (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Německo). Od 8 týdnů věku byla zvířata pro vyvolání obezity krmena vysokotukovou (HF) dietou složenou ze 40 % standardní diety doplněné 34 %

35

sušeného mléka (Sunar), 25 % vepřového sádla a 1 % kukuřičného škrobu [179]. Energetický obsah diety byl tvořen ze 13 % proteiny, z 27 % sacharidy a z 60 % tuky; její energetická hodnota činila 5,3 kcal/g (energetická hodnota standardní diety byla 3,4 kcal/g). Po šesti týdnech konzumace HF diety byla zahájena perorální aplikace antidiabetických látek, přičemž stále pokračovalo podávání HF stravy. Myší samci byli rozděleni do čtyř experimentálních skupin, každá čítala na začátku pokusu 10 zvířat: A. voda, B. metformin v denní dávce 250 mg/kg tělesné hmotnosti myši, C. vildagliptin 20 mg/kg/den, D. metformin 250 mg/kg/den + vildagliptin 20 mg/kg/den. Antidiabetika byla rozpuštěna v pitné vodě. Dávkování bylo průběžně upravováno podle objemu spotřebované vody, monitorovaného každý týden. Kromě uvedených experimentálních skupin byla vytvořena ještě kontrolní LF („low fat“) skupina z 10 samců, kteří byli po celou dobu experimentu stále krmeni pouze standardní dietou. Všem myším byla v průběhu experimentu monitorována každý týden tělesná hmotnost v intervalech vyznačených ve schématu experimentu.

Obr. 5 Schéma uspořádání experimentu antidiabetické léčby

Odběr moči pro NMR analýzu Pro odběr moči na metabolomickou analýzu byly myši umístěny samostatně do metabolických klecí (Tecniplast, Itálie) s volným přístupem k vodě a bez přístupu k potravě, moč byla sbírána přes noc (17h-8h). V tomto bodě jsme se na základě pilotních experimentů odchýlili od původního 24hodinového protokolu, protože odběrem vyvolaný 36

pokles tělesné hmotnosti by v průběhu antidiabetické terapie zkreslil její výsledky. Moč byla během experimentu odebrána celkem čtyřikrát: před začátkem podávání vysokotukové diety, před zahájením antidiabetické léčby, po dvou týdnech terapie a na konci experimentu. K vzorkům byl přidán NaN3 pro zabránění bakteriální infekce a až do NMR analýzy byly uchovávány při -80 °C.

4.4.2 Biochemické experimenty Orální glukosový toleranční test Orální glukosový toleranční test (OGTT) byl proveden v 50.–52. dni experimentu na myších, které byly ponechány přes noc bez přístupu k potravě. V 9h ráno byla změřena v čase 0 bazální glukosa (odběrem krve z ocasu) glukometrem (Glucocard, Arkray, Kyoto, Japonsko). Poté byl myším podán orálně roztok glukosy (0,2 g/ml) v dávce 2 g/kg tělesné hmotnosti myši a glukosa byla měřena z plné krve v čase 15, 30, 60, 90, 120 a 180 minut po injekci. Stanovení hormonálních a biochemických parametrů V 50.–51. dnu experimentu byla hladovým zvířatům ještě před provedením OGTT odebrána krev do zkumavek obsahujících EDTA; centrifugací byla oddělena plasma a uchována při -20 °C. Plasmatické hladiny insulinu byly stanoveny pomocí RIA kitů (Millipore, St. Charles, MI, USA) a plasmatické hladiny leptinu pomocí ELISA kitu (Millipore, St. Charles, MI, USA). Hladiny glukosy byly měřeny glukometrem Glucocard. Plasmatické hladiny triglyceridů byly stanoveny kvantitativní enzymatickou reakcí (Sigma, St. Louis, USA) a hladiny volných mastných kyselin (FFA) kolorimetricky (Roche, Mannheim, Německo). Všechna stanovení byla prováděna v souladu s protokoly doporučenými výrobci. Glukosový toleranční test a stanovení hormonálních a biochemických parametrů provedla Mgr. Martina Holubová, Ph.D., z výzkumné skupiny Antiobezitních peptidů ÚOCHB AVČR, v.v.i. v Praze

37

Stanovení koncentrace antidiabetických léčiv v plasmě Po dvou týdnech antidiabetických intervencí byly odebrány vzorky krve na stanovení koncentrace antidiabetik v krvi. Plasmatické koncentrace metforminu a vildagliptinu byly stanoveny LC-MS analýzou na systému tvořeném kapalinovým chromatografem Dionex Ultimate 3000 UHPLC a hmotnostním spektrometrem AB Sciex 3200 QTRAP. Jako mobilní fáze byla použita směs acetonitril:voda, 80/20 (v/v) s 0,1 % kyselinou mravenčí a 3 mmol/l mravenčanu amonného. K chromatografické separaci byla použita kolona HILIC Atlantis TM Silica (velikost částic sorbentu 3 μm, vnitřní rozměry kolony 2,1x150 mm) s předkolonou; teplota byla nastavena na 40 °C, průtok mobilní fáze byl 0,2 ml/min [180]. Stanovení léčiv v plasmě provedla Ing. Jana Zemenová na Ústavu analytické chemie VŠCHT Praha. MRM metodu pro kvantifikaci metabolitů vyvinul doc. RNDr. Dr. David Sýkora tamtéž. Statistické vyhodnocení biochemických dat Výsledné hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± střední chyba průměru (SEM). Pro jejich statistické vyhodnocení byl použit dvouvýběrový t-test nebo ANOVA s opakovanými měřeními a následným Bonferroniho post-hoc testem (program GraphPad Prism 5). Rozdíly byly považovány za statisticky významné, pokud p < 0,05.

4.4.3 NMR experimenty Vzorky moči pro NMR analýzu byly připraveny do standardních 5 mm NMR kyvet způsobem popsaným pro MSG model v odstavci 4.2.3. Pro odstranění intenzivního pozadí širokých proteinových signálů byla protonová spektra snímána Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulsní sekvencí s presaturací (cpmgpr1d v katalogu Bruker). Pro lepší identifikaci metabolitů byl zařazen krátký 2D J-rozlišený experiment s presaturací (jresgpprqf). Všechny experimentální procedury včetně nastavení parametrů jednotlivých pulsních sekvencí se shodují s postupem uvedeným v odstavci 4.2.3. U několika vybraných vzorků byl naměřen také COSY a HMQC experiment s presaturací (pulsní sekvence cosygpprqf a hmqcphpr).

38

4.4.4 Analýza NMR dat Aby se snížila dimenzionalita dat a byly potlačeny odchylky v chemických posunech, byla spektra v rozsahu 0,10-10,00 ppm v programu AMIX (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo) rozdělena na pravidelné biny se šířkou 0.04 ppm. Úseky odpovídající signálu vody (4,60-4,90 ppm) a močoviny (5,60-6,00 ppm) byly ze spekter odstraněny. Zároveň byl z analýzy vyloučen bin 3,04-3,08 ppm, ve kterém byl pozorován signál metforminu. Vícerozměrná statistická analýza NMR dat Binovaná spektra, uspořádaná do matice dat, byla dále zpracovávána v programu MetaboAnalyst [80,181]. Pro kompenzaci vlivu různého ředění odebraných vzorků moči byla spektra nejprve normalizována na celkovou plochu. Analýza hlavních komponent PCA, provedená na centrovaných a Pareto škálovaných spektrech, sloužila k lepší vizualizaci seskupení spekter a k detekci odlehlých hodnot. Úkolem následující PLS-DA metody bylo nalézt metabolity, které nejvýznamněji přispívají k rozdělení skupin léčených a kontrolních myší. Pro každou variantu antidiabetické léčby (metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací) byly na základě vzorků odebraných po dvou a sedmi týdnech léčby vytvořeny PLS-DA modely. Kvalita modelů a počet postačujících hlavních komponent byly určeny pomocí LOO křížové validace; modely byly hodnoceny pomocí podílu vysvětleného a predikovaného rozptylu R2 a Q2. Validace modelů byla doplněna ještě permutačními testy s 2000 permutacemi. Výsledky PLS-DA modelů agregované ve Variable Importance Projection (VIP) score jednotlivých binů byly využity při identifikaci binů nejvíce přispívající k rozdělení skupin léčených a kontrolních myší. V úvahu bylo vzato prvních 30 binů, jejichž VIP skóre bylo větší než 1,5. Aby byla určena statistická významnost detekovaných metabolických změn, všechna binovaná spektra byla analyzována Studentovým t-testem a také neparametrickým WilcoxonMann-Whitney testem. Byly porovnávány jednotlivé biny léčených a kontrolních myší a jako statisticky významné byly vybrány ty, které měly v obou testech p-hodnotu < 0,05. Identifikace a kvantifikace metabolitů Významné biny určené jak z PLS-DA modelů, tak z parametrického i neparametrického testu byly přiřazeny k odpovídajícím metabolitům. Přiřazení bylo dosaženo srovnáním protonových spekter s databázemi Chenomx NMR Suite 7.6 (Chenomx Inc., Edmonton, AB,

39

Kanada), BBIOREFCODE 2-0-3 (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Německo) a HMDB [113], a také s dříve publikovanými spektrálními daty. Identifikace byla dále podpořena J-rozlišenými a COSY experimenty a potvrzena hodnotami chemických posunů uhlíků, odečtených z HMQC spektra. Aby se eliminovalo rozštěpení signálů mezi sousední biny a zároveň se zpřesnila jejich kvantifikace, byla všechna spektra znovu binována se šířkou binu 0,01 ppm. Plochy signálů všech významných metabolitů, odečtených v PLS-DA pomocí VIP skóre a označených v parametrickém i neparametrickém testu, byly vyjádřeny jako součet vhodného počtu sousedících 0,01 binů. Tento postup vyřešil jak problém se štěpením signálů mezi více binů (rozšířením nebo posunutím původního 0,04 ppm binu), tak s překryvem více signálů v některých binech (zúžením původního binu). Normalizované intenzity signálů pak byly vyjádřeny jako takto vypočtené plochy signálů, vztažené na celkovou plochu spektra.

40

5 Výsledky a diskuse 5.1 Optimalizace experimentálního protokolu Ve vzorcích moči bylo jednoznačně identifikováno více než 40 metabolitů. Vliv jednotlivých experimentálních parametrů byl studován na stále stejné skupině 19 metabolitů, vybraných podle následujících kritérií: Zvolené metabolity jsou v protonových NMR spektrech

spolehlivě

detekovatelné

a

kvantifikovatelné

pomocí

dobře

rozlišených

nepřekrývajících se signálů, jejichž chemické posuny pokrývají celý rozsah spektra. Jsou zastoupené metabolity v širokém koncentračním rozmezí dvou řádů. Změny koncentrací vybraných metabolitů byly v literatuře citovány v souvislosti s obezitou či diabetem [40,125,182]. Každý metabolit zahrnutý do studie byl reprezentován jedním signálem, vycentrovaným v binu o šíři 0,04 ppm. Koncentrace metabolitu pak byla vyjádřena jako intenzita odpovídajícího binu normalizovaná buď na celkovou plochu spektra, na signál kreatininu či pomocí pravděpodobnostní kvocientové normalizace.

Obr. 6 Typické CPMG spektrum MSG myši s přiřazením vybraných reprezentativních signálů

41

Tab. I Seznam metabolitů použitých ve studii včetně vybraných reprezentativních signálů

metabolit (používaná zkratka)

reprezentativní signál [ppm]

N1-methylnicotinamid (MNA) N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid (4-PY) N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PY) PY(posiopfuiaospdf((4 ((4-PY) hippurát fenylacetylglycin (PAG) allantoin glukosa kreatinin kreatin glycin taurin trimethylamin (TMA) dimethylamin (DMA) citrát methylamin (MA) 2-oxoglutarát (2-OG) sukcinát acetát laktát

9,29 (s) 8,55 (d) 8,34 (d) 7,84 (dd) 7,46 (t) 5,39 (s) 5,25 (d) 4,06 (s) 3,93 (s) 3,54 (s) 3,43 (t) 2,88 (s) 2,72 (s) 2,68 (d) 2,61 (s) 2,45 (t) 2,41 (s) 1,92 (s) 1,34 (d)

s … singlet; d … dublet; t … triplet; dd … dublet dubletu

42

5.1.1 Vliv protokolu odběru moči Prvním experimentálním faktorem, který může zásadním způsobem ovlivnit výsledné metabolické složení moči, je způsob jejího odběru. V rámci této studie jsme porovnávali tři různé protokoly. V ideálním případě by odběr vzorku moči neměl zasáhnout do metabolismu sledovaných zvířat. Z tohoto pohledu by se jako nejlepší volba jevil odběr vzorku v metabolických klecích s volným přístupem k vodě i potravě (protokol C). Kvůli podstatnému riziku kontaminace odebrané moči částečkami potravy není tato metoda v praxi často používaná. Při přímém odběru moči (protokol A), který je většinou spojený s manipulací se zvířetem nebo jemným tlakem na břicho, množství odebrané moči výrazně kolísá mezi 50-100 µl a v některých případech je i odběr zcela neúspěšný. Složení moči je navíc ovlivněno cirkadiánními rytmy a individuálním stravovacím rytmem každého zvířete. Nejběžnější a v literatuře doporučovaný postup je 24hodinový odběr moči v metabolických klíckách s volným přístupem k vodě, ale nikoliv k potravě (protokol B). Zde je ovšem třeba mít na zřeteli, že celodenní hladovění může výrazně zasáhnout do metabolismu malých hlodavců a tak negativně ovlivnit výsledky studií, zaměřených na obezitu a příjem potravy. Malé objemy přímo odebrané ranní moči (protokol A) bylo nutno měřit v 3mm kyvetách. Abychom se ujistili, že data získaná z těchto kyvet nejsou zatížena chybou ladění (vzorky byly měřeny v 5mm sondě) a jsou přímo srovnatelná s výsledky z 5mm kyvet, vzorky moči podle protokolu B byly paralelně připraveny do obou typů kyvet. Statistické vyhodnocení potvrdilo zcela zanedbatelný efekt průměru kyvety na výsledné hodnoty (data nejsou prezentována). Od každého dvouměsíčního zvířete tedy byly odebrány tři vzorky moči (protokol A, B a C) a změřeny pomocí standardní 1D-NOESY pulsní sekvence. Prosté vizuální srovnání PCA score plotů naznačuje, že nejlepšího rozdělení MSG a kontrolní skupiny bylo dosaženo pomocí standardního B protokolu.

43

Obr. 7 PCA modely pro MSG a kontrolní myši: srovnání score plotů modelů založených na protokolu A, B a C. Variabilita vysvětlená prvními dvěma PC je vyznačena v obrázku.

Obr. 8 Vliv cirkadiánních rytmů na studované metabolity (vyjádřený jako poměr koncentrací detekovaných ve vzorcích A a C), vyhodnocený nezávisle pro MSG i kontrolní myši. Signifikance metabolických změn mezi odběry A a C podle t-testu: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

44

Aby mohl být vliv protokolu posouzen detailněji, byly následně porovnány normalizované koncentrace všech devatenácti vybraných metabolitů. Budeme-li považovat protokol C za přibližný obraz 24hodinového metabolismu, poměr koncentrací jednotlivých metabolitů detekovaných ve vzorcích A (ranní odběr) a C (24h odběr s potravou) může odrážet potenciální změny vybraných metabolitů vyvolané cirkadiánními rytmy (Obr. 8). Pro kontrolní skupinu byly v ranní moči (A) oproti celodennímu odběru (C) zaznamenány zvýšené hladiny glukosy, TMA, citrátu a 2-OG a snížená hladina laktátu. Ranní moč MSG skupiny vykazovala v porovnání s protokolem C vyšší koncentrace MNA, citrátu a 2-OG a snížené koncentrace DMA, acetátu a laktátu. Ačkoliv některé změny (převážně v MSG skupině) nejsou statisticky významné a lze je těžko odlišit od přirozené variability metabolitů mezi jednotlivými zvířaty, odpovídají pozorované trendy změnám již dříve popsaným v literatuře. Gavaghan a spol. [183] studovali cirkadiánní rytmy myší ze dvou kmenů C57BL10J a Alpk:ApfCD, u kterých pozorovali zvýšené hladiny TMA, DMA, citrátu, 2-OG a sukcinátu v ranní moči ve srovnání s močí odpolední. Williams a spol. [28] detekovali nárůst taurinu, kreatininu, allantoinu a 2-OG ve večerní moči Zucker fatty potkanů. Bollard a spol. [184] popisují analogické rozdíly mezi ranní a večerní močí pro Sprague-Dawley potkany: zvýšené hladiny citrátu, glycinu, kreatinu a glukosy v ranní moči a snížené koncentrace taurinu, kreatininu a hippurátu v moči večerní. Jelikož celodenní odběr moči podle protokolu B a C se liší pouze přístupem myší k potravě, poměr koncentrací jednotlivých metabolitů ve vzorcích B a C odráží vliv omezení příjmu potravy na složení moči (viz Obr. 9). MSG myši z tohoto srovnání vycházejí jako méně tolerantní k hladovění, což je zřejmé z významných odchylek u téměř všech studovaných metabolitů. Zamezení přístupu k potravě především výrazně zvýšilo koncentrace MNA, 2-PY, 4-PY a PAG a snížilo hladinu glukosy u MSG myší. Silnější reakce MSG myší na hladovění je také pravděpodobně hlavním důvodem pro lepší oddělení MSG a kontrolní skupiny, pozorované v PCA modelu založeném na B protokolu (Obr. 7).

45

Obr. 9 Vliv hladovění během odběru moči (vyjádřený jako poměr koncentrací detekovaných ve vzorcích B a C), vyhodnocený nezávisle pro MSG i kontrolní myši. Signifikance změn koncentrací mezi odběry B a C podle t-testu: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Odlišná reakce metabolismu na omezení přístupu k potravě během odběru moči u zkoumané a kontrolní skupiny tak může překrýt nebo zkreslit ty metabolické změny, které přímo souvisejí se studovaným jevem. Tento fakt považujeme za největší riziko standardního B protokolu. Pokud totiž ve studii nejsou modelová zvířata geneticky identická s kontrolami (např. původní versus geneticky modifikované myši), je zapotřebí předem pro každou skupinu zvlášť vyhodnotit efekt hladovění během odběru. Na druhou stranu u modelů s chemicky nebo dietou indukovanou obezitou je jediným rozdílem mezi obézními a kontrolními zvířaty pouze obezitu vyvolávající zásah (např. MSG injekce nebo vysokotuková dieta), takže všechny změny způsobené hladověním mohou být posuzovány společně s metabolickými změnami způsobenými obezitou a tak přímo využity jako markery v rámci studovaného modelu. V námi studovaném modelu lze například pomocí B protokolu studovat změny metabolismu nikotinamidu (MNA a jeho oxidační produkty 2-PY a 4-PY), které by se při použití protokolu A nebo C jevily jako zanedbatelné.

46

5.1.2 Vliv pulsní sekvence Vliv pulsní sekvence na kvalitu spekter a tím i na detekované koncentrace jednotlivých metabolitů byl srovnáván na 24hodinových vzorcích moči protokolu B. Všechny vzorky byly naměřeny nejprve pomocí pulsní sekvence 1D-NOESYv souladu s klasickým protokolem pro měření v moči [54], ve spektrech však byly pozorovány široké signály odpovídající přítomnosti

proteinů

ve

vzorcích.

Proto

byl

k potlačení

nežádoucího

pozadí

vysokomolekulárních látek následně změřen i CPMG experiment, obvykle doporučovaný pro vzorky séra a plasmy. Dále byla naměřena i J-rozlišená spektra, jejichž 1D projekce (pJRES) byla také použita k analýze dat. Pro protonová data získaná pomocí tří různých pulsních sekvencí (1D-NOESY, CPMG, pJRES) byly nejdříve vytvořeny a validovány PLS-DA modely.

Obr. 10 Srovnání PLS-DA modelů založených na datech z 1D-NOESY, CPMG a pJRES spekter. Podíly vysvětleného a predikovaného rozptylu pro jednotlivé modely: R2 = 0,97 a Q2 = 0,87 pro 1D-NOESY; R2 = 0,98 a Q2 = 0,93 pro CPMG; R2 = 0,97 a Q2 = 0,92 pro pJRES

Poněkud horší oddělení skupin v 1D-NOESY modelu ve srovnání s CPMG a pJPES, které je viditelné ve score plotech, se odráží i v charakteristice odpovídajících PLS modelů: zatím co pJRES a CPMG modely jsou dostatečně přesné i s jednou latentní proměnou, 1D-NOESY model vyžaduje tyto proměnné tři. Horší charakteristika 1D-NOESY modelu je také pozorována i v parametrech vysvětleného a predikovaného rozptylu (Obr. 10).

47

Všechny tři PLS-DA modely se tedy sice zdají být vyhovující z hlediska separace skupin, avšak ve výchozích spektrech jsou patrné rozdíly. Vliv použité pulsní sekvence lze dobře demonstrovat na expandované aromatické části spektra (Obr. 11).

Obr. 11 Srovnání 1D-NOESY (A), CPMG (B) a pJRES (C) spekter na reprezentativním vzorku kontrolní myši – expanze aromatické oblasti se signály méně koncentrovaných metabolitů

Výrazné pozadí proteinových rezonancí (modrá křivka A) překrývá méně intenzivní signály metabolitů a znemožňuje tak jejich kvantifikaci. pJRES spektra (zelená křivka B) sice vykazují plochou základní linii a jen velmi malý překryv signálů, avšak málo koncentrované metabolity rezonující okolo 9 ppm nejsou touto pulsní sekvencí, optimalizovanou pro rychlé měření, vůbec detekovány. V CPMG spektru (červená křivka C) jsou naproti tomu pozorovány dobře rozlišené signály všech metabolitů s uspokojivým poměrem signál/šum a plochou základní linií. Přestože je využití myších modelů v NMR metabolomických studiích obezity a diabetu běžné, zaznamenali jsme jen velmi málo publikací, kde by byl kvůli potlačení signálů proteinů cíleně použit CPMG experiment místo standardního 1D-NOESY [145,185]. Například při metabolomické studii moči myší, potkanů a lidí při T2DM [144] byla zmíněna vysoká koncentrace proteinů v moči db/db myší, negativně ovlivňující jejich 1D-NOESY spektra; autoři ji zde vysvětlili proteinurií spojenou s diabetem. Z tohoto důvodu jsme se

48

zaměřili na srovnání hladin metabolitů detekovaných pomocí 1D-NOESY a CPMG experimentů ve vzorcích moči obsahující proteiny. Kromě již zmiňovaného překryvu signálů pramení zásadní problémy 1D-NOESY spekter MSG modelu z faktu, že množství proteinů vylučovaných močí je výrazně vyšší u štíhlých kontrolních než u obézních MSG myší a navíc se mění také s věkem myší.

Obr. 12 Srovnání 1D-NOESY spekter typického vzorku kontrolní a MSG myši – expanze pravého (A) a levého (B) okraje spektra

Průměrný pokles intenzity signálů odečtený u 9,45 ppm je 26 %, u 0,80 ppm dokonce 40 %. Snížené hladiny močových proteinů byly v souvislosti s porušeným metabolismem glukosy pozorovány v několika studiích [186–188], například u db/db obézních myší nebo u myší s dietou indukovanou obezitou. Je tedy pravděpodobné, že pozorovaný problém u 1D-NOESY spekter může být společný pro více modelů myší obezity.

49

Pro vyhodnocení výstupů obou pulsních sekvencí byly změny metabolitů vyjádřeny jako poměry koncentrací MSG a kontrolních myší, a to jak na základě 1D-NOESY spekter, tak CPMG spekter. Rozdíly v datech získaných pomocí 1D-NOESY a CPMG pulsní sekvence jsou znázorněny na Obr. 13.

Obr. 13 Srovnání výsledků z dat získaných 1D-NOESY a CPMG experimentů: relativní změny koncentrací jsou vyjádřeny podíly koncentrací MSG a kontrolní skupiny. Signifikance změn mezi MSG a kontrolní skupinou: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Model založený na 1D-NOESY experimentu vykazuje výrazně menší změny hladin MNA, 4-PY, 2-PY, acetátu a laktátu než výsledky CPMG modelu. Tento rozdíl je způsoben překryvem signálů uvedených metabolitů se širokými rezonancemi proteinů v 1D-NOESY spektrech. Protože množství proteinů v moči MSG myší je výrazně nižší než u kontrolních zvířat, příspěvek signálů proteinů k celkové intenzitě jednotlivých binů u MSG vzorků klesá. Tímto způsobem může být v modelu založeném na 1D-NOESY skutečný nárůst jednotlivých metabolitů kompenzován poklesem koncentrace proteinů. Tento experimentální efekt se opět významně projevuje u málo intenzivních metabolitů v aromatické oblasti (MNA, 2-PY, 4-PY), jejichž změněný metabolismus by pomocí standardní 1D-NOESY sekvence nebyl zaznamenán.

50

5.1.3 Vliv normalizace Spektra moči je nezbytné před samotným statistickým vyhodnocením nějakým způsobem normalizovat, protože příjem vody během celodenního odběru moči se u jednotlivých zvířat liší a tyto odchylky dané různým zředěním vzorků je nutné vykompenzovat. Na 1D-NOESY a CPMG modelech byly porovnány výsledky tří nejběžnějších metod používaných v NMR metabolomice: normalizace na celkovou plochu spektra (TSA), pravděpodobnostní kvocientové normalizace („probabilistic quotient normalization“, PQN) a normalizace na signál kreatininu. Obrázek 14 shrnuje výsledky všech tří typů normalizace, aplikovaných na datech z CPMG i 1D-NOESY pulsních sekvencí. V případě CPMG modelu poskytují všechny tři postupy celkem konsistentní výsledky; průměrná odchylka dat získaných normalizací TSA a PQN ve srovnání s kreatininem činí 6 % a 2 %. V případě 1D-NOESY modelu ovšem dosahuje odchylka TSA od kreatininové normalizace 12 %, a svou hodnotou se tak přibližuje důležitým změnám metabolických hladin. Nižší obsah proteinů v MSG moči totiž snižuje celkovou plochu jejich spekter ve srovnání s kontrolami, což vede k vyšším hodnotám poměru MSG/kontroly. Obecně lze říci, že čím vyšší je pokles proteinů u obézní skupiny v porovnání s kontrolami, tím budou (u 1D-NOESY modelu) hodnoty získané pomocí TSA normalizace více lišit od normalizace na kreatinin. PQN metoda je schopna naproti tomu dostatečně vykompenzovat i široké signály proteinů a s přibližně 3% odchylkou od normalizace na kreatinin může být použita i v 1D-NOESY modelu.

51

Obr. 14 Relativní změny koncentrací metabolitů (vyjádřené jako poměry koncentrací v MSG a kontrolní skupině) při normalizaci na TSA, PQN a kreatinin, vyhodnocené nezávisle pro model založený na CPMG a 1D-NOESY experimentu. Signifikance změn koncentrací mezi MSG a kontrolní skupinou: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

52

5.2 Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou 5.2.1 Výsledky 5.2.1.1 Biochemické parametry, exprese mRNA Biochemické parametry Ve dvou, šesti a devíti měsících věku byly u MSG myší a odpovídajících kontrol změřeny tělesná hmotnost, hmotnost tuku a metabolické parametry (Tab. II). Tab. II Metabolické parametry dvou-, šesti- a devítiměsíčních MSG a kontrolních myší

Myš

Hmotnost [g]

Bílá tuková tkáň [% hmotnosti]

Glukosa [mmol/l]

Insulin [ng/ml] 0,98 ± 0,15

Leptin [ng/ml]

kontrola 2m

40,38 ± 0,94

4,19 ± 0,42

6,68 ± 0,44

1,92 ± 0,41

MSG 2m

42,42 ± 0,56

11,53 ± 0,62 ***

8,47 ± 0,38 ** 3,61 ± 0,59 ***

28,75 ± 3,95 ***

kontrola 6m

46,53 ± 1,08

4,48 ± 0,37

6,55 ± 0,39

0,97 ± 0,20

4,02 ± 0,56

MSG 6m

53,08 ± 2,11 * 9,08 ± 0,89 ***

6,48 ± 0,42

1,57 ± 0,19 *

23,10 ± 4,06 ***

kontrola 9m

56,54 ± 1,27

7,22 ± 0,60

6,87 ± 0,35

2,44 ± 0,63

16, 65 ± 2,50

MSG 9m

61,53 ± 1,89 * 6,10 ± 0,62

6,67 ± 0,73

3,96 ± 0,41

33,25 ± 4,69 **

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, n = 10 zvířat ve skupině. Signifikance: * p < 0,05, ** p < 0,01 and *** p < 0,001 vs. odpovídající kontrolní skupina

Ve dvou měsících se hmotnost MSG myší podstatně nelišila od kontrol, avšak hmotnost WAT byla ve srovnání s kontrolami signifikantně vyšší. V šesti měsících oproti kontrolám signifikantně vzrostla celková hmotnost MSG myší i hmotnost jejich WAT. V devíti měsících byla sice hmotnost MSG myší významně vyšší než kontrol, avšak hmotnosti WAT byly srovnatelné. Hodnoty glukosy nalačno byly významně zvýšené pouze u dvouměsíčních MSG myší. Hodnoty leptinu a insulinu byly signifikantně vyšší u dvou- a šestiměsíčních MSG myší, avšak u devítiměsíčních MSG myší byly pozorovány zvýšené hodnoty pouze pro leptin (Tab. II). MSG myši tedy ve dvou a šesti měsících vykazovaly významnou akumulaci tuku, vedoucí ke zvýšení hladiny leptinu, a podmínky typické pro prediabetes (mírný nárůst glukosy a zvýšená hladinou insulinu); v devíti měsících se naopak koncentrace glukosy a

53

insulinu významně nelišily od věkově odpovídajících kontrol.

Zajímavé je, že

v plasmatických hladinách volných mastných kyselin a triglyceridů nebyl mezi MSG skupinou a kontrolami po celou dobu experimentu pozorován podstatný rozdíl. V glukosovém tolerančním testu nevykazovaly ani hladiny glukosy ani plocha pod křivkou (AUC) mezi šestiměsíční MSG a kontrolní skupinou žádné významné rozdíly (data nejsou prezentována). Exprese mRNA v játrech a tukové tkáni u 6 měsíčních MSG myší Obezita a insulinová rezistence ovlivňují expresi mRNA enzymů spojených s metabolismem lipidů v podkožní (IPAT) a viscerální (SCAT) tukové tkáni a v játrech. V tukové tkáni je exprese leptinu, hlavního adipokinu produkovaného touto tkání, přímo úměrná hmotnosti tuku. Pro MSG myši byla ve srovnání s kontrolami pozorována zvýšená exprese leptinu ve SCAT (Obr. 15), avšak nikoliv v IPAT. Protože u MSG myší je hmotnost SCAT oproti IPAT dvojnásobná, nárůst koncentrace cirkulujícího leptinu u MSG myší lze přičíst především jeho zvýšené expresi ve SCAT. Snížená exprese adiponektinu, markeru nepřímo úměrného diabetickému stavu, v intraperitoneálním i subkutánním tuku MSG myší poukazuje na vznik diabetu. Také exprese PPAR-γ ve SCAT a IPAT byla u MSG myší snížená. V této studii nebyla pozorována zvýšená exprese NNMT v intraperitoneální, subkutánní ani hnědé tukové tkáni. NNMT exprese v játrech (kompenzované na B2M, GADPH i GUSB) vykazují pro všechny tři experimenty společný trend – nesignifikantní nárůst. mRNA exprese jiného markeru diabetu – MUP-1 – v játrech 6měsíčních myší byla o třetinu větší u MSG skupiny ve srovnání s kontrolami.

54

Obr. 15 Vybrané exprese mRNA pro kontrolní and MSG skupinu v šesti měsících věku: leptin ve SCAT, adiponektin ve SCAT a IPAT, MUP-1 v játrech, PPAR-γ ve SCAT a IPAT Signifikance je * p < 0,05, ** p < 0,01 a *** p < 0,001 vs. kontrolní skupina

55

5.2.1.2 NMR metabolomika MSG myším a jim odpovídajícím kontrolám byla ve věku dvou, šesti a devíti měsíců změřena protonová spektra vzorků moči. Kvůli intenzivním signálům vysokomolekulárních látek v 1D-NOESY spektrech byla pro veškeré analýzy použita data z CPMG spekter. V souladu s uspořádáním experimentu byly vytvořeny tři podobné PLS-DA modely, korelující spektra MSG a kontrolní skupiny ve věku dvou, šesti a devíti měsíců. Pro určení kvality modelů a počtu potřebných hlavních komponent byla použita LOO křížová validace, jejíž výsledky jsou prezentovány v Tabulce III. PLS-DA score ploty pro dvou-, šesti- a devítiměsíční myši spolu s odpovídajícími S-ploty jsou znázorněny na obrázku 16.

Tab. III Výsledky LOO křížové validace pro dvou-, šesti- a devítiměsíční PLS-DA modely

Model

počet PC

přesnost validace

R2

Q2

2měsíční

1

1

0,98

0,93

6měsíční

2

1

0,94

0,89

9měsíční

1

1

0,93

0,84

56

Obr. 16 Score ploty (vlevo) a odpovídající S-ploty (vpravo) PLS-DA modelů pro dvou-, šesti- a devítiměsíční myši

57

Významné biny byly vybrány na základě informací z S-plotu a t-testu a musely vyhovět parametrům popsaným v odstavci 4.2.4: korelační koeficient > 0,5, loading faktor > 0,05, phodnota < 0,05 a relativní změna koncentrace mezi MSG a kontrolní skupinou > ± 20 %. Následně byly metabolity odpovídající signifikantním binům identifikovány postupem popsaným v experimentální části. Obrázek 17 představuje reprezentativní CPMG spektrum s vyznačenými významnými metabolity, které jsou včetně relativních změn jejich intenzit shrnuty v tabulce IV.

Obr. 17 Reprezentativní CPMG spektrum dvouměsíční MSG myši s přiřazením signálů statisticky významných metabolitů

58

Tab. IV Relativní změny signifikantních metabolitů mezi MSG skupinou a věkově odpovídajícími kontrolami ve 2, 6 a 9 měsících věku (statistická signifikance změn z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001)

2 měs.

6 měs.

9 měs.

N1-methylnikotinamid (MNA) Trigonellin

H a 9,29 (s) 9,13 (s)

↑↑ ↓↓**

*

↑ ↓*

↑** ↓*

Nikotinamid N-oxid

8,76 (m)

↓**

↓**

↓*

N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid (4-PY)

8,55 (d)

↑↑***

↑↑**

↑↑**

N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PY)

8,34 (d)

↑↑***

↑*

↑**

Fenylaceltylglycin (PAG)

7,43 (m)

↑

↑**

↑**

Allantoin

5,39 (s)

↑

↑***

↑***

Glukosa

5,25 (d)

↑↑

↑↑

x

3,94 (s)

↓

x

x

2,68 (d)

↑↑

Methylamin

2,61 (s)

↓

Sukcinát

2,41 (s)

↑*

N-isovalerylglycin (IVG)

2,18 (d)

↓↓

N-acetyly glykoproteinů

2,06 (s)

↓***

↓***

↓***

Acetát

1,93 (s)

↑↑*

x

x

Putrescin

1,78 (m)

↓

↓

Nepřiřazené kyseliny

1,50 (m)

↓***

↓***

↓**

Laktát

1,34 (d)

↑

x

x

0,74 (br m)

↓↓

Metabolit

Kreatin Citrát

Zbytkové signály proteinů

reprezentativní bin použitý pro kvantifikaci ↑ nebo ↓: relativní změna metabolitu větší než ± 20 % ↑↑ nebo ↓↓: relativní změna metabolitu větší než ± 40 % x : relativní změna metabolitu menší než ± 20 % a

59

***

*** **

x

***

↓

x ***

x ***

***

***

↓*** x

↓↓

***

***

↓↓

***

↓↓***

↓***

↓↓***

V modelu dvouměsíčních MSG myší byly identifikovány signifikantní změny u těchto metabolitů: zvýšená koncentrace N1-methylnikotinamidu (MNA), N1-methyl-4-pyridon3-karboxamidu (4-PY), N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamidu (2-PY), citrátu, sukcinátu, acetátu, a snížení hladin trigonellinu, nikotinamid N-oxidu, kreatinu, methylaminu, N-isovalerylglycinu (IVG), putrescinu, nepřiřazených acetylů, alifatických kyselin a vysokomolekulárních látek. Ve spektrech byl identifikován i hexanoylglycin, jehož signály ovšem rezonují společně se signály dalších nepřiřazených alifatických kyselin a proto byl do této skupiny také zahrnutý. Stejný postup aplikovaný na modely šesti- a devítiměsíčních myší ukázal na změny u podobné sady metabolitů: nárůst MNA, 4-PY, 2-PY, fenylacetylglycinu (PAG) a allantoinu, a pokles trigonellinu, nikotinamid N-oxidu, kreatinu, methylaminu, IVG, putrescinu, nepřiřazených acetylů, alifatických kyselin a vysokomolekulárních látek. Kvůli potvrzení povahy vysokomolekulárních látek, zodpovědných za široké signály ve spektrech, bylo provedeno stanovení proteinů bicinchoninovou kyselinou ve vzorcích tří MSG a tří kontrolních myší ve věku dvou, šesti a devíti měsíců. Tyto experimenty prokázaly významně snížený obsah proteinů vyloučených v moči MSG myší v porovnání s kontrolami; koncentrace proteinů v moči MSG myší poklesy oproti kontrolám o 34 % ve věku dvou měsíců, o 30 % v šesti měsících a o 47 % v devíti měsících. Výsledky stanovení shrnuje tabulka V.

Tab. V Koncentrace proteinů v [mg/ml] v moči 2, 6 a 9měsíčních MSG myší a jim odpovídajících kontrol

koncentrace proteinů [mg/ml] 2 měsíce

6 měsíců

9 měsíců

MSG

8.05 ± 0.39

5.29 ± 0.93

5.44 ± 0.54

kontroly

12.15 ± 1.85

7.50 ± 1.92

10.28 ± 2.18

skupina

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, 3 zvířata ve skupině. Pro malý počet vzorků a jejich nekontrolovatelné ředění nebyla počítána statistická významnost změn.

60

Porovnání koncentrací jednotlivých metabolitů u myší ve věku devíti a dvou měsíců umožnilo sledovat vliv stárnutí nezávisle pro MSG i kontrolní skupinu. K tomuto účelu byly pro obě skupiny vytvořeny další PLS-DA modely, korelující CPMG spektra s věkem myši. Obrázek 18 znázorňuje score ploty pro PLS-DA modely, výsledky jejich LOO validace jsou shrnuty v tabulce VI.

Obr. 18 Modely stárnutí: PLS-DA score ploty pro kontrolní a MSG myši

Tab. VI Výsledky LOO křížové validace modelů stárnutí

Model

počet PC

přesnost validace

R2

Q2

MSG

3

1,00

0,97

0,79

Kontroly

2

0,95

0,90

0,80

61

Kontrolní skupina myší měla v devíti měsících signifikantně zvýšenou hladinu MNA a taurinu a sníženou koncentraci 2-OG, proteinů a kreatinu v porovnání se stejnými zvířaty ve věku dvou měsíců. Obdobné srovnání devíti- a dvouměsíčních MSG myší ukázala významně sníženou koncentraci citrátu, 2-OG, proteinů a sukcinátu u starších zvířat. Statisticky významné změny koncentrace metabolitů s věkem jsou pro obě skupiny shrnuty do tabulky VII.

Tab. VII Relativní změny signifikantních metabolitů mezi 9měsíčními a 2měsíčními myšmi (vyjádřené jako poměr koncentrací 9měs/2měs) pro MSG i kontrolní skupinu. Statistická signifikance změn z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 MSG

kontroly

N1-methylnikotinamid (MNA) Glukosa

H a 9,29 (s) 5,25 (d)

x ↓

↑↑** x

Kreatin

3,94 (s)

x

↓***

Taurin

3,43 (t)

x

↑**

Citrát

2,68 (d)

↓↓*

↓

2-oxoglutarát (2-OG)

2,45 (t)

↓

↓**

Sukcinát

2,41 (s)

↓*

0,74 (br m)

↓↓

metabolit

Zbytkové signály proteinů

*

x **

↓***

reprezentativní bin použitý pro kvantifikaci ↑ nebo ↓: relativní změna metabolitu větší než ± 20 % ↑↑ nebo ↓↓: relativní změna metabolitu větší než ± 40 % x : relativní změna metabolitu menší než ± 20 % a

Vývoj koncentrací statisticky signifikantních metabolitů (viz Tab. IV) pro MSG a kontrolní myši je shrnutý v grafech na obrázcích 19a a 19b.

62

Obr. 19a Normalizované koncentrace významných metabolitů ve věku 2, 6 a 9 měsíců pro MSG a kontrolní myši. Signifikance změn mezi MSG a kontrolní skupinou z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

63

Obr. 19b Normalizované koncentrace významných metabolitů ve věku 2, 6 a 9 měsíců pro MSG a kontrolní myši. Signifikance změn mezi MSG a kontrolní skupinou z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

64

5.2.2 Diskuse Biochemické a hormonální parametry, exprese mRNA Vyhodnocení biochemických a hormonálních parametrů potvrdilo, že u MSG myší ve věku dvou a šesti měsíců došlo k rozvinutí obezity s hyperleptinemií a hyperinsulinemií. Tento fenotyp se velmi podobá obézním pacientům s vysokým rizikem rozvoje pokročilých komplikací, což potvrzuje přínos MSG myšího modelu ke studiu lidské obezity. Protože rozvoj obezity a insulinové rezistence se odráží i v mRNA expresích enzymů zapojených do metabolismu lipidů, byly studovány také změny mRNA expresí v tukové tkáni, vyvolané

MSG

obezitou.

Poškozená

insulinová

sensitivita

a

změny

v

metabolismu šestiměsíčních myší byly indikovány výrazně sníženou expresí adiponektinu v subkutánním tuku, což ukazuje na prediabetický stav. Zvýšená exprese leptinu spolu s vyšší hladinou leptinu v séru, která byla pozorována v naší studii a byla také detekována u MSG modelu myší kmene CD-1 [160], je pravděpodobně důsledkem leptinové rezistence, popsané u četných modelů obezity. Tento stav může být vysvětlen sníženou expresí PPAR-γ v tukové tkáni MSG myší (SCAT, IPAT i BAT) v porovnání s kontrolami. PPAR-γ je považován za transkripční faktor krom jiného i pro adiponektin, jehož exprese byla v tukové tkáni MSG myší také snížena.

NMR metabolomika Po charakterizaci MSG modelu pomocí biochemických parametrů a mRNA expresí se naše práce zaměřila na sledování změn v metabolickém složení moči pomocí NMR metabolomiky. Prvním důležitým zjištěním NMR studie byly významně vyšší hladiny MNA a jeho oxidačních produktů 2-PY a 4-PY v moči obézních MSG myší ve srovnání se štíhlými kontrolami. MNA a jeho metabolity se tvoří primárně v játrech a nárůst jejich koncentrace v moči se ukázal jako pozitivní biomarker proliferace peroxisomů [189,190], která je spojena se zánětem, obezitou a metabolickým syndromem [191,192]. Moč MSG myší naopak obsahovala nižší množství nikotinamid N-oxidu, oxidačního produktu nikotinamidu, a trigonelinu (N-methylnikotinátu), methylačního produktu kyseliny nikotinové. Naše NMR metabolomická data tedy naznačují, že nikotinamid u MSG obézních myší podléhá spíše methylaci než oxidaci. Zvýšení koncentrace MNA a 2-PY a snížení hladiny trigonelinu bylo také popsáno u T2DM pacientů, db/db myší a fa/fa potkanů [144].

65

Obr. 20 Schéma metabolismu nikotinamidu Nikotinamid je methylován S-adenosinmethioninem (SAM) za katalýzy nikotinamid N-methyltransferasou

(NNMT).

SAM

dále

poskytuje

propylamin

v metabolismu

propylaminů. Protože jsme detekovali nižší hladinu polyaminu putrescinu, na rozdíl od nikotinamidu se využití SAM v metabolismu propylaminů zdá být u MSG myší snížené. Putrescin, jeden z hlavních močových produktů myších samců, může být syntetizován z ornithinu ornithindekarboxylasou (ODC) a/nebo polyaminoxidasou z acetylspermidinu. Naše NMR data ukazují na výrazně sníženou exkreci putrescinu v MSG skupině, což může

66

být připisováno utlumenému katabolismu polyaminů. Polyaminy hrají důležitou roli v metabolismu glukosy a kontrolují rozšiřování tukové tkáně. V literatuře byl také popsán vliv spermidin/spermin N1-acetyltransferasy (SSAT) na tvorbu tukové tkáně myší [193]. Ukázalo se, že zvýšená exprese SSAT u myší vede ke zvýšení metabolické aktivity, redukci tuku a ke zvýšení citlivosti k insulinu. Navíc zpomalený metabolismus polyaminů prostřednictvím inhibice ODC 2-difluoromethylornithinem zvyšoval hladinu adenosintrifosfátu v tukové tkáni a měl podstatný vliv na SSAT fenotyp myší. Podobně se prokázalo, že aktivovaný metabolismus polyaminů je spojen se zmenšením bílé tukové tkáně a poklesem koncentrace v ní obsažených acetyl-CoA a malonyl-CoA [194]. Souhrnně tato data podporují hypotézu, že aktivace katabolismu polyaminů má silný vliv na WAT a kontrolu metabolismu glukosy. Naše výsledky u obézních MSG myší ukazují, že redukce metabolismu polyaminů může souviset s akumulací WAT a rozvojem obezity stejně tak jako s poškozenou endokrinní funkcí a insulinovou rezistencí tukové tkáně, což také dokládá zvýšená exprese leptinu a snížená exprese adiponektinu. V předchozích studiích korelovala exprese NNMT v tukové tkáni s adipozitou u různých kmenů myší s DIO [195]. NNMT exprese byla zvýšena ve WAT a játrech u geneticky modifikovaných, DIO a diabetických myší. Inhibice NNMT zvýšila hladiny SAM a NAD+, expresi a aktivitu ODC a SSAT v tukové tkáni a vylučování polyaminů v moči [196]. Byla vyslovena hypotéza, že inhibice NNMT by mohla sloužit jako ochrana před dietou indukovanou obezitou prostřednictvím rostoucího toku polyaminů [196]. V našem modelu jsme pozorovali nesignifikantní tendenci zvýšení NNMT exprese v játrech u MSG myší, ale nikoliv v jejich tukové tkáni. Jiným zajímavým faktem, pozorovaným v NMR spektrech a potvrzeným také stanovením bicinchoninovou kyselinou, je vysoký obsah proteinů v moči kontrolních myší, který se výrazně snížil u MSG myší. Na rozdíl od lidské moči, ve které se za normálních podmínek bílkoviny nevyskytují, myší moč přirozeně obsahuje velké množství proteinů patřících do třídy hlavních močových proteinů (MUP). MUP jsou syntetizovány především v játrech, cirkulují v krevním řečišti a mohou být díky své nízké molekulární hmotnosti snadno vylučovány močí [197]. Jejich role v organismu nebyla dosud plně objasněna. Je známo, že MUP na sebe vážou těkavé feromonové složky a tak se jako močové pachové stopy podílejí na chemické komunikaci hlodavců [198]. Vliv MUP na energetický metabolismus myší byl intenzivně studován na myších modelech geneticky a vysokotukovou dietou indukované

67

obezity [187, 188]. Exprese MUP-1 a jeho cirkulující koncentrace byly u db/db a DIO myší ve srovnání se štíhlými kontrolami podstatně nižší. Zvýšená exprese MUP-1 výrazně snižovala hyperglykemii a glukosovou intoleranci v obou modelech [188]. Podávání MUP-1 diabetickým db/db myším zvyšovalo jejich energetický výdej a zlepšilo glukosovou toleranci [187]. Hladiny MUP-5 v krvi a moči byly kromě toho u myší regulovány omezením potravy [186]. Znatelné snížení exprese mRNA a koncentrace MUP v moči MSG myší pozorované v naší práci jsou ve shodě s výše zmíněnými výsledky a mohou být přisouzeny vyvolané MSG obezitě a z ní plynoucí insulinové rezistenci. Lze tedy shrnout, že změněné koncentrace MUP u myší mohou hrát roli v metabolismu glukosy a energetické rovnováze. U MSG myší jsme také zaznamenali zvýšené hladiny PAG a snížené koncentrace MA. Oba tyto metabolity jsou ovlivněny střevní mikroflórou, jak již dříve ukázaly jejich změny při obezitě a T2DM [199]. Během studie na modelu geneticky modifikovaných AHNAK myší byly hladiny PAG a MA u standardních („wild-type“) myší na vysokotukové dietě také v porovnání se standardní dietou sníženy [200]. Naopak zvýšené koncentrace PAG v potkaním modelu dietou indukované obezity [201] autoři vysvětlovali tím, že nadprodukce PAG u zvířat s nadváhou může prostřednictvím střevních bakterií souviset s obezitou. Protože v naší studii jsme se střevní mikroflórou nezabývali, mechanismus nárůstu PAG musí být teprve objasněn. Zvýšené hladiny acetátu, citrátu a sukcinátu, markerů Krebsova cyklu, v moči MSG myší jsou pravděpodobně výsledkem metabolického stresu za anaerobních podmínek. Je zajímavé, že tyto změny byly výrazné u 2měsíčních MSG myší, zatímco u starších myší už nebyly téměř patrné. Snížená koncentrace IVG u MSG myší je ve shodě s poklesem IVG pozorovaným v lidském modelu obezity [202]. Kromě toho byly pozorovány zvýšené koncentrace allantoinu v moči MSG myší, což je v souladu s výzkumem T2DM pacientů [203]. Studie označují allantoin jako marker oxidativního stresu [204], často vyvolávajícího zánět [205]. Zvýšené hladiny allantoinu u MSG myší tak mohou ukazovat na zvýšený oxidační stres a subklinický zánět vedoucí k metabolickým poruchám [206]. Protože však allantoin u myší může být produkován nejenom chemickou oxidací kyseliny močové, ale také enzymatickou reakcí s urát-oxidasou [207], mechanismus zvýšení hladiny allantoinu u MSG myší není zcela zřejmý. Nárůst koncentrace allantoinu byl například popsán u myšího modelu Alzheimerovy nemoci [208] a u atherosklerotických myší léčených captoprilem [185]. Allantoin byl také uveden jako

68

biomarker zánětu střev u myšího modelu Crohnovy choroby [209]. V modelu geneticky obézních a diabetických db/db myší byl allantoin v moči naopak snížený [144]. Význam allantoinu byl také zkoumán u DIO myší [210], kde jeho podávání vedlo k redukci hmotnosti obézních myší a snižovalo hyperleptinemii indukovanou vysokotukovou dietou. Všechna tato pozorování ukazují, že allantoin hraje komplexní roli v regulaci energetické bilance. U dvou- a šestiměsíčních MSG myší byly zaznamenány také zvýšené hladiny glukosy v moči, které ale v devíti měsících dosáhly normálních hodnot kontrolní skupiny. Ačkoliv tato změna není statisticky významná kvůli velkému rozptylu dat u MSG myší, zmíněný trend je v souladu s normalizací hodnot krevní glukosy, pozorovanou v šesti měsících. Kromě vlivu obezity sledovala naše studie i změny metabolitů vyvolané stárnutím, které se neprojevovaly u obou skupin stejně. U kontrolních i MSG myší byly pozorovány v souvislosti s věkem snížené koncentrace MUP, citrátu a 2-OG. U kontrolních zvířat byl detekován také nárůst hladin MNA a taurinu a pokles kreatinu, zatímco u MSG skupiny zůstaly tyto metabolity téměř neovlivněny. Podobně byly popsané zvýšené hladiny MNA u BALB/c myší, které odlišovaly staré samce od mladých [211]. Pokles koncentrace sukcinátu jsme pozorovali pouze u MSG myší a nikoliv u kontrol. Analogicky pokles citrátu a 2-OG přispíval k charakterizaci starších diabetických myší a potkanů, zatímco tento trend nebyl pozorován u kontrolních skupin [144]. Vývoj metabolitů během stárnutí u kontrolních a MSG myší je znázorněn na obrázcích 19a a 19b. Je zřejmé, že počáteční signifikantní rozdíl v hladinách kreatinu, citrátu, sukcinátu a acetátu mezi MSG a kontrolními zvířaty, zjištěný ve dvou měsících, se výrazně snížil u šesti- a devítiměsíčních zvířat.

69

5.3 Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou 5.3.1 Výsledky 5.3.1.1 Biochemické parametry Dopad antidiabetické léčby na tělesnou hmotnost a stavbu DIO myší Konzumace HF diety způsobila v prvních týdnech experimentu signifikantní nárůst tělesné hmostnosti (BW); na začátku léčby (po 6 týdnech LF/HF diety) byla průměrná hmotnost myší na LF dietě 28,93 ± 0,64 g, zatímco myši krmené HF dietou vážily průměrně 45,54 ± 1,27 g (p < 0,001). Také na konci experimentu byla tělesná hmotnost myší s HF dietou stále signifikantně vyšší oproti skupině s LF dietou, stejně tak jako hmotnost jater, podíl tukové tkáně či koncentrace leptinu v plasmě (Tab. VIII A). Podávání metforminu, vildagliptinu ani jejich kombinace signifikantně nezměnilo tělesnou hmotnost ani celkový tuk DIO myší, hladina plasmatického leptinu byla kombinovanou terapií nesignifikantně snížena. Antidiabetická terapie však signifikantně snížila hmotnost jater ve všech léčených skupinách v porovnání s HF kontrolami na vodě (Tab. VIII B)

Tab. VIII Tělesná hmotnost (BW), hmotnost jater a tukové tkáně a hladiny leptinu u myší na konci experimentu. A. Srovnání skupin na LF a HF dietě. B. Vliv 7týdenní léčby antidiabetickými látkami.

Tělesná hmotnost [g]

Celkový tuk [% z BW]

Leptin [ng/ml]

Játra [g]

Játra [% z BW]

voda HF

53.91±0.61

15.73±0.47

31.24±6.01

2.17±0.12

4.31±0.21

voda LF

33.16±0.99 *** 4.60±0.82 ***

2.32±0.57 *** 1.27±0.21 **

4.45±0.22

voda HF

53.91±0.61

15.73±0.47

31.24±6.01

2.17±0.12

4.31±0.21

metformin HF

52.51±0.83

16.98±0.60

30.89±1.73

1.63±0.10 **

3.31±0.18 **

vildagliptin HF

52.73±1.14

16.36±0.56

34.81±1.92

1.74±0.10 *

3.54±0.15 **

met + vilda HF

50.33±1.67

16.93±1.01

24.93±2.37

1.48±0.09 *** 3.09±0.11 ***

A. Dieta

B. Léčba

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Statistická signifikance změn z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 proti HF skupině na vodě.

70

Vliv léčby na metabolické parametry v krvi Konzumace HF diety vyvolala v porovnání s LF dietou signifikantní zvýšení hladiny glukosy nalačno, insulinu a triglyceridů. Byl pozorován také nesignifikantní nárůst koncentrace volných mastných kyselin (FFA) u HF myší v porovnání s LF kontrolami (Tab. IX A). Podávání antidiabetik signifikantně snižovalo hladiny glukosy nalačno v porovnání s HF kontrolní skupinou, které byla podávána pouze voda; největší efekt vykazovala kombinace metforminu s vildagliptinem. Kombinace obou antidiabetik také způsobovala nesignifikantní snížení hladin insulinu, volných mastných kyselin a triglyceridů (Tab. IX B).

Tab. IX Metabolické parametry v krvi DIO myší. A. Srovnání skupin na LF a HF dietě. B. Vliv sedmitýdenní léčby antidiabetickými látkami.

Glukosa [mmol/l]

Insulin [ng/ml]

FFA [mmol/l]

Triglyceridy [mg/ml]

voda HF

14.87±1.31

1.10±0.21

0.48±0.03

0.80±0.09

voda LF

6.02±0.49 ***

0.06±0.01 **

0.38±0.05

0.43±0.02 ***

voda HF

14.87±1.31

1.10±0.21

0.48±0.03

0.80±0.09

metformin HF

11.45±0.85 *

1.18±0.10

0.52±0.03

0.81±0.06

vildagliptin HF

10.91±0.48 *

1.73±0.30

0.45±0.03

0.81±0.04

met + vilda HF

9.54±0.38 ***

0.73±0.09

0.43±0.04

0.68±0.04

A. Dieta

B. Léčba


Vliv léčby na glukosovou toleranci Signifikantní zvýšení hladiny krevní glukosy během OGTT u myší s HF dietou oproti LF skupině ukazuje na rozvoj T2DM u DIO myší. Antidiabetická terapie snížila výsledné hladiny glukosy v OGTT ve všech léčených skupinách. Pokles byl nejvíce patrný při kombinované léčbě, která snížila hladiny glukosy v průběhu celého testu na hodnoty srovnatelné se skupinou na LF dietě (Obr. 21). 71

Obr. 21 Orální glukosový toleranční test u DIO myší. Data pro hladinu glukosy (A) a AUCglukosa (B) jsou prezentována jako průměr ± SEM. Statistická signifikance byla vyhodnocena pomocí ANOVA s opakováním a Bonferroni post hoc testem (A) nebo dvouvýběrovým t-testem (B) oproti HF skupině na vodě (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001).

Koncentrace antidiabetických léčiv v plasmě Plasmatické koncentrace antidiabetických léků byly měřeny po dvou týdnech léčby. Koncentrace v metforminové skupině byla 398.7 ± 41.6 ng/ml, ve vildagliptinové skupině 13.6 ± 5.5 ng/ml a ve skupině s kombinovanou léčbou 271.7 ± 5.5 ng/ml pro metformin a 18.0 ± 7.8 ng/ml pro vildagliptin. Tato měření prokázala přítomnost léčiv v krvi během experimentu.

5.3.1.2 Výsledky NMR metabolomiky Necílená vícerozměrná statistická analýza Jako zdroj dat pro metabolomickou analýzu byla použita CPMG spektra vzorků moči, dále upravená binningem, normalizací a škálováním popsaným v odstavci 4.4.4. Takto připravená data byla nejprve analyzována metodou hlavních komponent (PCA). V PCA modelech, znázorňujících distribuci vzorků odebraných před léčbou a po dvou a sedmi týdnech léčby, byly identifikovány dvě myši, jejichž vzorky byly odlehlé ve všech odběrech (jedna myš z kontrolní HF skupiny, jedna ze skupiny léčené vildagliptinem; data 72

nejsou prezentována), tyto vzorky byly vyloučeny jak ze statistického vyhodnocení NMR experimentů, tak i ze stanovení biochemických a hormonálních parametrů. Cílem následující PLS-DA analýzy bylo identifikovat a popsat spektrální charakteristiky, na základě kterých lze identifikovat rozdělení vzorků na skupiny léčených a kontrolních myší na HF dietě. PLS-DA score ploty pro všechny druhy terapie v krátkodobém i dlouhodobém horizontu jsou prezentovány na Obr. 22, výsledky validace PLS-DA modelů shrnuje Tab. X.

Obr. 22 Srovnání score plotů PLS-DA modelů vypočítaných pro jednotlivé typy terapie po dvou a sedmi týdnech léčby

73

Tab. X Výsledky LOO křížové validace a permutačního testu (2000 opakování) pro PLS-DA modely dvou- a sedmitýdenní léčby

počet komponent

přesnost validace

R2

Q2

p-hodnota permut. testu

metformin – 2 týdny

5

0,95

0,95

0,50

0,83

vildagliptin – 2 týdny

4

0,94

0,96

0,71

0,72

kombinace – 2 týdny

2

1,00

0,84

0,66

0,03

metformin – 7 týdnů

4

0,79

0,92

0,55

0,67

vildagliptin – 7 týdnů

2

0,78

0,80

0,50

0,07

kombinace – 7 týdnů

2

0,94

0,85

0,74

0,01

PLS-DA model

Pro nalezení nejdůležitějších metabolitů v modelech krátko- i dlouhodobé léčby bylo vybráno prvních třicet binů s nejvyššími hodnotami VIP skóre (všechny vybrané biny měly VIP hodnoty ≥ 1,5). V dalším kroku byla určena statistická významnost změn všech binů ve spektru pomocí parametrického i neparametrického testu, jak je popsáno v experimentální části, a označili biny, které mají současně v obou testech p-hodnotu < 0,05. Biny vybrané pomocí VIP skóre a obou testů byly s pomocí databází a dříve publikovaných spektrálních dat přiřazeny k potenciálním metabolitům a shrnuty do Tabulky XI.

74

metformin

vildagliptin

kombinace

75

2 týdny 7 týdnů 2 týdny 7 týdnů 2 týdny 7 týdnů ovlivněné biny metabolit VIP test VIP test VIP test VIP test VIP test VIP test ↑ — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 0.86, 0.90, 1.30, 1.58, 1.62, 2.30 deriváty BCAA a oxo-kyselin ↑ — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ — ↑ ↑ 0.94, 2.02, 2.18 N-isovaleroylglycin, 2-oxovalerát ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 1.34 laktát, 2-hydroxyisobutyrát — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 1.86, 1.90, 6.82 vinylacetylglycin — — — — ↑ ↑ ↑ — — ↑ — 1.94 acetát — — — — ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ 2.06 nepřiřazené acetyly — — ↑ ↑ — — ↑ ↑ — — ↑ ↑ 2.38, 3.30 N-karbamoyl-β-alanin ↓ ↓ — — ↓ — ↓ — ↓ ↓ — — 2.42 sukcinát — — ↑ — ↓ ↓ — — ↓ — ↑ — 2.46, 3.02 2-oxoglutarát ↓ — ↓ — ↓ — — — ↓ — — — 2.54, 2.58, 2.66, 2.70 citrát ↑ ↑ ↑ ↑ — — — — — — — ↑ 2.62 methylamin x x ↓ ↓ ↑ — — — x x ↓ ↓ 2.86, 2.90 trimethylamin ↑ ↑ — ↑ — ↑ — — ↑ ↑ — ↑ 2.94 dimethylglycin ↑ — ↑ — — — — — — — — — 3.14 cis-aconitát, ethanolamin ↑ — — — — — ↑ ↑ — — — — 3.26, 3.42, 3.46 taurin — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 3.66, 3.74, 7.34, 7.38, 7.42 fenylacetylglycin — — — — ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ 3.82 guanidoacetát — — — — ↑ ↑ — — — — ↓ ↓ 3.94 kreatin — — — — — — — — — — ↓ ↓ 4.06 kreatinin — — — ↓ — — ↓ ↓ — — — ↓ 5.22, 5.26 glukosa, galaktosa ↓ — — — — — — — — — — — 5.38 allantoin — — — — — ↓ — — — ↓ — — 6.54 fumarát — — — — ↑ ↑ — ↑ ↑ ↑ — ↑ 7.18, 7.22, 7.26, 7.30, 7.50, 7.70 3-indoxylsulfát — — ↓ ↓ — — — — — ↓ — — 7.54, 7.58, 7.62, 7.66, 7.82, 7.86 hippurát — — — — — — — ↓ — ↓ — ↓ 7.98, 8.54 N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid — — — — — — — ↓ — ↓ — ↓ 8.34 N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid — — — — — x — — — x — ↓ 8.90, 8.98, 9.26, 9.30 N1-methylnicotinamid ↑ signifikantní nárůst koncentrace; ↓ signifikantní pokles koncentrace; x sousední biny se signifikantně mění opačným směrem; BCAA větvené aminokyseliny

Tab. XI Výsledky VIP skóre, t-testu i Wilcoxon-Mann-Whitney testu pro jednotlivé terapie po 2 a 7 týdnech léčby: souhrn signifikantně změněných binů. Jsou vyznačeny biny s VIP skóre ≥ 1,5 (VIP), signifikantně změněné v parametrickém i neparametrickém testu (test)

Z tabulky XI je zřejmé, že u mnoha metabolitů byly signifikantní změny nezávisle potvrzeny oběma uvedenými postupy. Pareto škálování, standardně používané pro NMR data, však i přes určitou kompenzaci rozdílů v zastoupeních jednotlivých metabolitů stále ponechává koncentrovanějším metabolitům větší vliv na výsledný PLS-DA model. Proto byly na jednu stranu pomocí VIP hodnot identifikovány i nesignifikantní změny intenzivních signálů (např. citrátu) a na druhou stranu statisticky významné změny málo koncentrovaných metabolitů (např. 2-PY a 4-PY) se do hlavních latentních proměnných a do výsledného rozdělení skupin nepromítly. Identifikace a kvantifikace metabolitů Vizuální kontrola CPMG spekter potvrdila, že mnohé signály přesahují hranice binů a naopak na ploše určitých binů se podílí více signálů, proto byly u metabolitů identifikovaných v tabulce XI upřesněny intenzity jejich signálů pomocí binů o šířce 0,01 ppm, jak je popsáno v experimentální části. Grafy na obrázcích 23a-d znázorňují vývoj koncentrací všech metabolitů, které léčba signifikantně změnila. Výsledný stav na konci pokusu je zobrazen pomocí box-plotů, kam byly připojeny i odpovídající hodnoty štíhlých myší na LF dietě. Informace z obrázků 23a-d doplněné o údaje z tabulky XI tak poskytují celkový přehled o velikosti a signifikanci metabolických změn, vyvolaných různými druhy antidiabetické terapie v horizontu dvou a sedmi týdnů. Při hodnocení grafů a box-plotů je nutné si uvědomit, že i léčeným skupinám myší byla po celou dobu experimentu podávána HF dieta, takže do hladin jednotlivých metabolitů se promítá kromě efektu antidiabetické terapie také vliv dále se rozvíjející obezity. Z tohoto důvodu se ve vývojovém grafu antidiabetický zásah projeví většinou pouze potlačením nebo zesílením stávajícího trendu.

76

Obr. 23a Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Vývoj koncentrace v průběhu terapie (vlevo) a box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby (vpravo). Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

77

Obr. 23b Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Vývoj koncentrace v průběhu terapie (vlevo) a box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby (vpravo). Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

78

Obr. 23c Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Vývoj koncentrace v průběhu terapie (vlevo) a box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby (vpravo). Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

79

Obr. 23d Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Vývoj koncentrace v průběhu terapie (vlevo) a box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby (vpravo). Data jsou znázorněna jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

80

V alifatické části spektra 0,80 – 2,20 ppm byly detekovány signifikantní změny signálů patřících derivátům aminokyselin a alifatických kyselin. Za pomoci dodatečných informací z COSY a HMQC experimentů byl sice jednoznačně identifikován hexanoylglycin, N-isovaleroylglycin a 2-oxovalerát, avšak kvůli vzájemnému překryvu jejich signálů v protonových spektrech nebylo možné vybrat vhodný signál pro jejich individuální kvantifikaci. Jelikož se ale všechny alifatické signály těchto metabolitů (dotčené biny jsou vypsány v Tab. XI) měnily stejnou měrou, celá skupina byla posuzována společně. Hladiny všech identifikovaných metabolitů (hexanoylglycin, N-isovaleroylglycin, vinylacetylglycin a 2-oxovalerát) v průběhu experimentu klesaly. U léčených skupin obézních myší byl však pozorován mírnější pokles a v důsledku toho vyšší závěrečné koncentrace ve srovnání s obézními neléčenými kontrolami. Nejvyšší koncentrace těchto látek byly detekovány ve skupině myší na standardní dietě, ovšem byly doprovázeny zároveň i nejvyšším rozptylem hodnot. Opačné trendy byly pozorovány u N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamidu (2-PY) a N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamidu (4-PY), jejichž koncentrace u všech HF skupin během experimentu rostla. Antidiabetická terapie snižovala hladiny 2-PY a 4-PY směrem k hodnotám štíhlých myší, největší vliv měla léčba kombinací metforminu s vildagliptinem. Podobný průběh byl zaznamenán i při vývoji hladin N-karbamoyl-β-alaninu s tím rozdílem, že výsledná separace léčených a neléčených HF skupin byla na konci experimentu podstatně výraznější. Léčba vildagliptinem a kombinací zvýšila již tak rostoucí koncentrace 3-indoxylsulfátu, ovšem jejich výsledná hodnota u myší na LF dietě byla naopak výrazně nižší. Ačkoliv hladiny acetátu u štíhlých a kontrolních obézních myší byly v průběhu pokusu zcela srovnatelné, dlouhodobá léčba vildagliptinem výrazně zvedla jeho koncovou koncentraci. Ve skupině léčené kombinovanou terapií byla zvýšená hladina acetátu vyvolána jeho několikanásobným nárůstem u dvou myší. Podobně vychýlila antidiabetická terapie hladiny fenylacetylglycinu; které se mezi HF a LF skupinou na vodě nelišily: léčbou došlo ke zvýšení průměrných koncentrací, avšak spojenému zároveň i se zvýšeným rozptylem dat. Dlouhodobá léčba zejména vildagliptinem signifikantně snižovala hladinu glukosy v moči obézních myší. Průběžně rostoucí koncentrace cis-akonitátu byly také sníženy sedmitýdenní vildagliptinovou nebo kombinovanou léčbou směrem k hodnotám myší na LF dietě.

81

Všechny léčené skupiny měly na konci experimentu signifikantně zvýšený signál u 1,34

ppm (data nejsou prezentována). Analýza 2D NMR spekter potvrdila, že

v protonovém spektru dochází k překryvu levého píku dubletu laktátu a singletu 2-hydroxyisovalerátu a na pozorovaném nárůstu se tedy podílejí potenciální změny obou metabolitů. Druhý signál laktátu – kvartet u 4,12 ppm - nebylo možné ve většině spekter kvůli překryvu ani identifikovat a protože tyto metabolity nemají v protonovém spektru další signály, nebyl vliv terapie na jejich hladiny dále diskutován. Léčené skupiny myší se také oproti neléčeným obézním kontrolám na konci terapie významně lišily v koncentracích dimethylglycinu, kreatininu, karnitinu, methylaminu, sukcinátu a 2-oxoglutarátu. Hladiny těchto metabolitů však bohužel výrazně kolísaly již před zahájením antidiabetické léčby, takže jejich výsledný stav po terapii má jenom velmi omezenou vypovídací hodnotu. Korelace koncentrací metabolitů v moči s biochemickými daty PLS-DA analýzou byly identifikovány metabolity, jejichž změny nejvíce přispívají k rozlišení jednotlivých skupin. Aby však bylo možné určit, které z nich souvisejí přímo s diabetem a neodrážejí pouze vliv dalších faktorů, byly koncentrace signifikantních metabolitů u všech HF myší korelovány s jejich hladinami plasmatické glukosy, vyjádřenými pomocí parametru AUC z OGTT. Protože s rozvojem obezity a diabetu se často pojí také steatosa jater, stejným způsobem byly u všech myší korelovány hladiny metabolitů i s hmotností jater, vztaženou na celkovou hmotnost myši. V tabulce XII jsou shrnuty metabolity, které byly signifikantně ovlivněny léčbou a zároveň je jejich Pearsonův korelační koeficient s AUC nebo relativní hmotností jater signifikantně větší než ± 0,40 (p < 0,05).

82

Tab. XII Korelace významných metabolitů s hodnotami AUC z OGTT a relativní hmotností jater

glukosa v plasmě (AUC z OGTT) metabolit

korelační koeficient

játra/BW

p hodnota

korelační koeficient

p hodnota

N-karbamoyl-β-alanin

0,76

<0,0005

0,79

<0,0005

2-PY

0,55

<0,0005

0,74

<0,0005

4-PY

0,52

0,001

0,70

<0,0005

IVG + 2-oxovalerát

-0,44

0,005

-0,25

0,133

hexanoylglycin

-0,43

0,007

-0,37

0,024

vinylacetylglycin

-0,41

0,011

-0,29

0,074

3-indoxylsulfát

-0,40

0,013

-0,25

0,123

0,40

0,014

0,08

0,616

-0,59

<0,0005

-0,56

<0,0005

0,49

0,002

0,65

<0,0005

1

<0,0005

0,73

<0,0005

cis-akonitát dimethylglycin glukosa glukosa v plasmě (AUC z OGTT)

83

5.3.2 Diskuse Biochemické parametry V této studii nebyl pozorován statisticky významný vliv podávání antidiabetických léčiv na tělesnou hmotnost DIO myší, na celkové množství tukové tkáně ani na hladiny leptinu v plasmě. Na druhou stranu však léčba metforminem, vildagliptinem i jejich kombinací signifikantně snižovala hmotnost jater, což by naznačovalo zvrat ve steatose jater. Signifikantní snížení hladiny glukosy nalačno stejně tak jako normalizace glykemické křivky OGTT vlivem všech tří typů antidiabetické léčby ukazuje na zlepšení glukosové tolerance a tudíž i zlepšení prediabetického stavu DIO myší.

NMR metabolomika Nárůst koncentrace derivátů N1-methyl nikotinamidu včetně 2-PY a 4-PY byl popsán u několika myších modelů obezity: u DIO modelu [170], modelu chemicky indukované obezity [212] a u db/db myší [144]. Nárůst metabolitů MNA v moči se ukázal jako pozitivní biomarker proliferace peroxisomů [189,190], který souvisí se zánětem, obezitou a metabolickým syndromem [191,192]. Srovnání změn v moči diabetických myší, potkanů a lidí [144] a jejich korelace s klinickými daty diabetických pacientů ukázalo, že MNA a 2-PY může sloužit jako vhodný marker pro sledování T2DM. V naší studii byl také pozorován postupný růst koncentrací 2-PY a 4-PY během rozvoje obezity u všech skupin krmených HF dietou. Tento trend signifikantně snižovala antidiabetická terapie směrem k hodnotám štíhlých myší, přičemž kombinace metforminu s vildagliptinem se jevila účinnější než monoterapie. Koncentrace 2-PY a 4-PY v moči všech myší na HF dietě vykázaly pozitivní korelaci se dvěma důležitými parametry, s krevní glukosou vyjádřenou jako AUC pro OGTT a relativní hmotností jater. Tyto korelace potvrzují, že 2-PY a 4-PY lze využít jako markery při studiu diabetu. N-karbamoyl-β-alanin je další metabolit výrazně ovlivněný všemi typy antidiabetické léčby, avšak o jeho funkci v metabolismu je toho dosud jen málo známo. Jung a spol. pozorovali zvýšené koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu u stejného kmenu C57BL/6 při

podávání

vysokotukové

diety

ve

srovnání

se

stejnými

zvířaty

krmenými

vysokosacharidovou dietou [169]. Významně vyšší hladiny N-karbamoyl-β-alaninu byly zaznamenány u LDLR-/- myší krmených Western dietou [213] a také u db/db myší [144]. Zajímavým zjištěním je role β-alaninu při ochraně jater před poškozením hypoxií v modelu

84

Wistar potkanů [214]. Zvýšená koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu v moči obézních myší tak může být vnímána jako kompenzační reakce na zhoršující se steatosu jater v průběhu rozvoje obezity a T2DM, zatímco její pokles v léčených skupinách může odrážet zlepšení funkce jater vlivem antidiabetické terapie. Tato domněnka je navíc podpořena významnou pozitivní korelací hladiny N-karbamoyl-β-alaninu s relativní hmotností jater na konci pokusu. Protože je koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu silně korelována též s koncentrací plasmatické glukosy při OGTT, lze hladiny tohoto metabolitu v moči považovat za slibný marker diabetu. Vlivem terapie došlo také ke změně hladin některých acyglycinů. Protože acylglyciny vznikají z acyl-koenzymuA produkovaného v průběhu β-oxidace mastných kyselin, mohou zvýšené koncentrace hexanoylglycinu, N-isovaleroylglycinu a vinylacetylglycinu v moči léčených obézních myší znamenat zvýšenou rychlost β-oxidace. Martin a kol. definovali zvýšení hladiny N-isovaleroyglycinu v moči jako indikátor pravděpodobné rezistence vůči HF dietě a jí vyvolanému nárůstu váhy [215]. Podobný mechanismus by mohl stát i v pozadí zvýšených koncentrací N-isovaleroylglycinu během léčby obézních myší v naší studii, tuto domněnku by podporovala i námi pozorovaná signifikantně vyšší koncentrace zmiňovaných acylglycinů v moči štíhlých myší na LF dietě oproti obézním myším. Zároveň byla potvrzena středně silná negativní korelace mezi koncentrací acyglycinů v moči a AUC z OGTT. Také v naší nedávno publikované práci [212] byly popsány signifikantně nižší hladiny N-isovaleroylglycinu, hexanoylglycinu a dalších derivátů alifatických kyselin v moči myší s MSG indukovanou obezitou v porovnání se štíhlými kontrolami. Detailní kontrola informací v suplementu publikace [144] odhalila stejné trendy i v datech db/db myší, pokles hladiny N-isovaleroylglycinu byl publikován též v moči obézních pacientů [202]. Koncentrace acetátu, konečného produktu β-oxidace, se v této studii vlivem HF diety a rozvoje obezity nijak nezměnila, nebyla pozorována ani jeho korelace s AUC v OGTT. Jeho hladinu však významně zvedlo podávání vildagliptinu samotného; zvýšení koncentrace při léčbě vildagliptinem v kombinaci s metforminem je způsobeno dvěma odlehlými hodnotami. Mechanismus této odezvy organismu na vildagliptinovou monoterapii není uspokojivě objasněn. Zajímavým zjištěním této studie je snížená koncentrace glukosy v moči vlivem všech variant antidiabetické terapie, která je pozitivně korelovaná nejen s hodnotami plasmatické glukosy v OGTT, ale výrazněji i s relativní hmotností jater.

85

Hladiny některých metabolitů citrátového cyklu výrazně fluktuovaly během terapie, nebylo tedy možné jednoznačně odlišit přirozenou variabilitu těchto metabolitů mezi jednotlivými zvířaty od případného efektu krátko- či dlouhodobé antidiabetické léčby. Jedinou výjimkou byl cis-akonitát, jehož koncentrace se terapií výrazně snížila.

86

6 Závěry 6.1 Optimalizace experimentálního protokolu Vyhodnocení vlivu způsobu odběru moči, volby pulsní sekvence a normalizace dat potvrdilo, že doporučovaný a hojně používaný standardní protokol není pro myší modely indukované obezity optimální. Kromě cirkadiánních rytmů ovlivňuje hladiny většiny studovaných metabolitů především omezený přístup k potravě po dobu odběru vzorku. Zatímco v modelech s indukovanou obezitou se ukázalo výhodné používat 24hodinový odběr bez přístupu k potravě, u modelů geneticky modifikovaných bude nutné předem ověřit vliv hladovění pro modelovou a kontrolní skupinu zvlášť. Detekce metabolitů ve standardních 1D-NOESY spektrech moči je výrazně zkomplikována velkým a průběžně se měnícím množstvím přirozeně se vyskytujících proteinů. Z tohoto důvodu bylo navrženo metabolomické studie moči založit na CPMG experimentech, jejichž spektra dovolují identifikaci a přesnější kvantifikaci málo koncentrovaných metabolitů například v aromatické oblasti. V těchto spektrech také poskytují normalizace na celkovou plochu, na signál kreatininu i pravděpodobnostní kvocientová normalizace celkem srovnatelné výsledky. Při studiu myších modelů s indukovanou obezitou byl tedy doporučen 24hodinový odběr moči bez přístupu k potravě, následovaný CPMG experimentem a normalizací naměřených dat na celkovou plochu spektra.

6.2 Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou Tato studie odhalila četné odchylky v metabolickém složení moči obézních MSG myší ve srovnání s močí štíhlých kontrol a ukázala výrazný vliv stárnutí na obě skupiny zvířat. Výsledky standardních biochemických parametrů prokázaly, že u MSG myší ve věku dvou a šesti měsíců došlo k rozvinutí obezity s hyperleptinemií a hyperinsulinemií. Nejdůležitějším zjištěním NMR metabolomické studie byly změny v metabolismu nikotinamidu a polyaminů a potlačená exkrece močových proteinů u MSG myší; tato pozorování byla podpořena také odpovídajícími trendy v expresích mRNA pro enzymy NNMT a MUP-1. Kromě toho byly detekovány také změny v koncentracích allantoinu, methylaminu a fenylacetylglycinu. V průběhu 9 měsíců bylo pozorováno sblížení původně odlišných hladin kreatinu, citrátu, acetátu a sukcinátu.

87

Přestože biochemické parametry, indikující rozvoj obezity a insulinové rezistence, byly v devíti měsících věku u MSG myší normalizovány na úroveň štíhlých kontrol, NMR metabolomika i v tomto věku pozorovala přetrvávající změnu metabolického složení moči MSG myší. Ukazuje se tedy, že metabolomický přístup může reflektovat změny v metabolických procesech i za stavu, kdy standardní parametry rozdíly nejsou schopny zaznamenat.

6.3 Vliv antidiabetické léčby na model s dietou indukovanou obezitou NMR metabolomika prokázala signifikantní vliv sedmitýdenní léčby metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací na hladiny některých metabolitů v moči obézních DIO myší, přičemž efekt terapie se začal projevovat už po dvou týdnech podávání antidiabetických léků. Účinek terapie byl nezávisle potvrzen zlepšením biochemických parametrů: snížením hladiny glukosy nalačno a normalizací glykemické křivky v OGTT; bylo též zjištěno snížení hmotnosti jater. Nejvýznamnějším výsledkem metabolomické studie je signifikantní pokles koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu a derivátů nikotinamidu 2-PY a 4-PY působením všech tří variant antidiabetické terapie. Přímá souvislost změny těchto metabolitů s projevem diabetu byla potvrzena korelací s AUC v OGTT, zajímavá je i jejich korelace s hmotností jater. Zatímco vliv diabetu na hladiny 2-PY a 4-PY byl již dříve v literatuře popsán, N-karbamoyl-β-alanin byl v této studii poprvé představen jako možný marker diabetu. Porovnání výsledků jednotlivých terapií ukazuje, že největší vliv na hladiny sledovaných metabolitů měla kombinovaná léčba; léčba samotným vildagliptinem pak byla účinnější než metforminová monoterapie. Přínos této studie k terapii diabetu spočívá v propojení standardních biochemických parametrů s informací o změně metabolických procesů vyvolané podáním jednotlivých antidiabetik. Získané výsledky mohou do budoucna přispět k vytvoření tzv. personalizované medicíny, kdy vhodná léčba bude jednotlivým pacientům indikována na základě znalosti jejich individuálních metabolických parametrů.

88

6.4 Shrnutí Z experimentálního hlediska lze říci, že větším problémem než často zmiňovaná malá citlivost NMR spektroskopie se jeví výrazný překryv signálů ve spektrech moči. Tato skutečnost sice nikterak neovlivní výsledné statistické modely, vybudované v rámci necílené analýzy z binovaných spekter, ale výrazně komplikuje následnou identifikaci a znemožňuje kvantifikaci celé řady významných metabolitů. Situaci by mohlo mírně zlepšit zařazení algoritmů pro synchronizaci píků, ale řešení přinese zřejmě až využití vylepšených kvantitativních 2D pulsních sekvencí. Zároveň se také prokázalo, že pro spolehlivé vyhodnocení NMR dat a výběr relevantních informací je nezbytné kombinovat více statistických přístupů. Výsledky PLS-DA modelů potvrzené parametrickými a neparametrickými testy označí signifikantní rozdíly ve spektrech, ale velikost změny takto určených metabolitů stanoví až kvantitativní analýza. Teprve korelace s nezávislým biochemickým parametrem může poté ukázat, nakolik metabolické změny, identifikované a kvantifikované výše zmíněným postupem, přímo souvisejí se studovaným jevem. Výsledky disertační práce potvrdily, že NMR metabolomika je vhodný nástroj ke studiu a charakterizaci myších modelů. Srovnání se standardními biochemickými parametry prokázalo, že NMR spektra moči dobře odrážejí probíhající metabolické procesy. Po vyhodnocení multivariačními statistickými metodami lze na základě získaných metabolických dat nejen rozlišit jednotlivé skupiny sledovaných zvířat, ale i označit potenciální markery studovaného stavu. Tyto poznatky mohou přispět jak pochopení molekulární podstaty obezity a diabetu, tak v budoucnu k rozvoji personalizované medicíny.

89

7 Souhrn Předložená disertační práce se zabývá studiem myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky na vzorcích moči. V první části byly na sadě 19 metabolitů v reálných vzorcích optimalizovány tři parametry experimentálního protokolu: způsob odběru moči, pulsní sekvence pro snímání protonových spekter a způsob jejich normalizace. Pro myší modely s indukovanou obezitou se ukázal jako nejvýhodnější 24hodinový odběr moči bez přístupu k potravě, vzhledem k výskytu proteinů v myší moči následovaný Car-PurcellMeiboom-Gill pulsní sekvencí a normalizací spekter na celkovou plochu. Takto naměřená NMR data byla v dalších studiích vyhodnocována kombinací metod multivariační statistické analýzy a parametrických i neparametrických testů; statisticky významné metabolity byly identifikovány srovnáním s databázemi spekter. NMR metabolomika na modelu obezity indukované glutamanem monosodným (MSG) prokázala četné změny v moči MSG myší, zejména změněný metabolismus nikotinamidu a polyaminů, sníženou sekreci močových proteinů a rozdíly v koncentracích allantoinu, methylaminu a fenylacetylglycinu. V průběhu stárnutí bylo pozorováno přiblížení hladin kreatinu, citrátu, acetátu a sukcinátu hodnotám kontrolních myší. Rozvoj obezity a insulinové rezistence byl ve věku šesti měsíců potvrzen biochemickými parametry a indikován také změnami expresí mRNA odpovídajících enzymů v tukové tkáni. Antidiabetická léčba metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací se u myší s dietou indukovanou obezitou projevila poklesem hladiny plasmatické glukosy a snížením hmotnosti jater. Multivariační analýza NMR dat identifikovala významné rozdíly především v hladinách N-karbamoyl-β-alaninu, acylglycinů, glukosy a metabolitů N-methylnikotiamidu. Korelace těchto signifikantních metabolitů s biochemickými parametry označila vhodné markery diabetu pro tento model. Nejdůležitější z nich, N-karbamoyl-β-alanin, byl v této souvislosti jako potenciální biomarker popsán poprvé. NMR metabolomika umožnila také vyhodnotit efektivitu jednotlivých terapií; jako nejúčinnější potvrdila léčbu kombinovanou. Výsledky této práce mohou přispět k pochopení molekulární podstaty obezity a diabetu a posléze k optimalizaci účinných terapeutických postupů.

90

8 Seznam použitých zkratek 1D

jednorozměrný

2D

dvourozměrný

2-OG

2-oxoglutarát

2-PY

N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid

4-PY

N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid

ANOVA

analýza rozptylu (analysis of variance)

B2M

β2-mikroglobulin

BAT

hnědá tuková tkáň

BCAA

aminokyseliny s rozvětveným řetězcem (branched chain amino acids)

CE

kapilární elektroforéza

COSY

correlation spectroscopy

CPMG

Carr-Purcell-Meiboom-Gill

DFI

metoda přímého nástřiku (direct flow injection)

DIO

dietou indikovaná obezita

DMA

dimethylamin

DMG

dimethylglycin

DPP-4

dipeptidyl peptidasa 4

DSS

trimethylsilyl propansulfonová kyselina

EDTA

kyselina ethylediamintetraoctová

ELISA

enzyme-linked immuno sorbent assay

ERETIC

electronic reference to access in vivo concentrations

FFA

volné mastné kyseliny (free fatty acids)

FID

pokles volné indukce (free induction decay)

GADPH

glyceraldehyd 3 fosfát dehydrogenasa

GC

plynová chromatografie

GLP-1

glucagon-like peptid 1

GUSB

betaglukuronidasa

HF

vysokotuková (high-fat)

HMDB

human metabolome database

HMQC

heteronuclear multiple-quantum correlation spectroscopy

91

HMBC

heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HSQC

heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy

IGTT

intraperitoneální glukosový toleranční test

IPAT

intraperitoneální tuková tkáň

IVG

N-isovaleroylglycin

LC

kapalinová chromatografie

LF

nízkotuková (low-fat)

LOO

leave-one-out

MA

methylamin

MNA

N1-methylnikotinamid

MRM

multiple reaction monitoring

mRNA

informační ribonukleová kyselina

MSG

L-glutaman monosodný monohydrát (monosodium glutamate)

MUP

hlavní močový protein (major urinary protein)

NNMT

nikotinamid-N-methyltransferasa

NOESY

nuclear Overhauser effect spectroscopy

NS

počet scanů

ODC

ornithin dekarboxylasa

OGTT

orální glukosový toleranční test

PAG

fenylacetylglycin

PC

hlavní komponenta (principle component)

PCA

analýza hlavních komponent (principle component analysis)

pJRES

projekce J-rozlišeného experimentu

PLS-DA

diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců

PPAR

receptory aktivované proliferátory peroxisomů

PQN

pravděpodobnostní kvocientová normalizace (probabilistic quotient normalization)

RIA

radioimmunoassay

SAM

S-adenosinmethionin

SCAT

podkožní tuková tkáň

SEM

střední chyba průměru

SPE

extrakce pevným sorbentem

92

SSAT

spermidin/spermin N1-acetyltransferasa

SW

šířka spektra

T2DM

diabetes mellitus 2. typu

TD

počet datových bodů

TMA

trimethylamin

TOCSY

total correlation spectroscopy

TOF

průletový analyzátor (time of flight)

TSA

celková plocha spektra (total spectral area)

TSP

trimethylsilyl propionová kyselina

UPLC

ultra účinná kapalinová chromatografie

VIP

variable importance in projection

WAT

bílá tuková tkáň

93

9 Literatura 1.

Nicholson, J. K., Lindon, J. C. and Holmes, E. (1999) “Metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29, 1181–1189.

2.

Fiehn, O. (2002) Metabolomics--the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol. Biol. 48, 155–171.

3.

Ellis, D. I., Dunn, W. B., Griffin, J. L., Allwood, J. W. and Goodacre, R. (2007) Metabolic fingerprinting as a diagnostic tool. Pharmacogenomics 8, 1243–1266.

4.

Gulston, M. K., Titman, C. M. and Griffin, J. L. (2007) Applications of metabolomics to understanding obesity in mouse and man. Biomark. Med. 1, 575–582.

5.

Leiss, K. A., Choi, Y. H., Verpoorte, R. and Klinkhamer, P. G. L. (2011) An overview of NMR-based metabolomics to identify secondary plant compounds involved in host plant resistance. Phytochem. Rev. 10, 205–216.

6.

Kim, H. K., Choi, Y. H. and Verpoorte, R. (2010) NMR-based metabolomic analysis of plants. Nat. Protoc. 5, 536–549.

7.

Merlo, M. E., Jankevics, A., Takano, E. and Breitling, R. (2011) Exploring the metabolic state of microorganisms using metabolomics. Bioanalysis 3, 2443–2458.

8.

Mapelli, V., Olsson, L. and Nielsen, J. (2008) Metabolic footprinting in microbiology: methods and applications in functional genomics and biotechnology. Trends Biotechnol. 26, 490–497.

9.

Reily, M. D. and Tymiak, A. A. (2015) Metabolomics in the pharmaceutical industry. Drug Discov. Today. Technol. 13, 25–31.

10.

Mannina, L., Sobolev, A. P. and Viel, S. (2012) Liquid state 1H high field NMR in food analysis. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 66, 1–39.

11.

Gowda, G. A. N., Zhang, S., Gu, H., Asiago, V., Shanaiah, N. and Raftery, D. (2008) Metabolomics-based methods for early disease diagnostics. Expert Rev. Mol. Diagn. 8, 617-633.

12.

Spratlin, J. L., Serkova, N. J. and Eckhardt, S. G. (2009) Clinical applications of metabolomics in oncology: a review. Clin. Cancer Res. 15, 431–440.

13.

Emwas, A.-H. M., Salek, R. M., Griffin, J. L. and Merzaban, J. (2013) NMR-based metabolomics in human disease diagnosis: applications, limitations, and recommendations. Metabolomics 9, 1048–1072.

14.

Mamas, M., Dunn, W. B., Neyses, L. and Goodacre, R. (2011) The role of metabolites and metabolomics in clinically applicable biomarkers of disease. Arch. Toxicol. 85, 5-17.

15.

Ellis, D. I. and Goodacre, R. (2006) Metabolic fingerprinting in disease diagnosis: biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy. Analyst, The Royal Society of Chemistry 131, 875–885.

94

16.

Barbas, C., Moraes, E. P. and Villaseñor, A. (2011) Capillary electrophoresis as a metabolomics tool for non-targeted fingerprinting of biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 55, 823–831.

17.

Alonso, A., Marsal, S. and Julià, A. (2015) Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Front. Bioeng. Biotechnol. 3, article 23.

18.

Zhang, A., Sun, H., Wang, P., Han, Y. and Wang, X. (2012) Modern analytical techniques in metabolomics analysis. Analyst 137, 293–300.

19.

Dunn, W. B., Broadhurst, D. I., Atherton, H. J., Goodacre, R. and Griffin, J. L. (2011) Systems level studies of mammalian metabolomes: the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chem. Soc. Rev. 40, 387–426.

20.

Ortiz-Villanueva, E., Jaumot, J., Benavente, F., Piña, B., Sanz-Nebot, V. and Tauler, R. (2015) Combination of CE-MS and advanced chemometric methods for high-throughput metabolic profiling. Electrophoresis 36, 2324–2335.

21.

Hirayama, A., Wakayama, M. and Soga, T. (2014) Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. TrAC Trends Anal. Chem. 61, 215–222.

22.

Jonsson, P., Johansson, A. I., Gullberg, J., Trygg, J., A, J., Grung, B., Marklund, S., Sjöström, M., Antti, H. and Moritz, T. (2005) High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Anal. Chem. 77, 5635-5642.

23.

Peterson, A. C., Balloon, A. J., Westphall, M. S. and Coon, J. J. (2014) Development of a GC/Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer, part II: new approaches for discovery metabolomics. Anal. Chem. 86, 10044–10051.

24.

Koek, M. M., Jellema, R. H., van der Greef, J., Tas, A. C. and Hankemeier, T. (2011) Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: status and perspectives. Metabolomics 7, 307–328.

25.

Berg, M., Vanaerschot, M., Jankevics, A., Cuypers, B., Breitling, R. and Dujardin, J.-C. (2013) LC-MS metabolomics from study design to data-analysis - using a versatile pathogen as a test case. Comput. Struct. Biotechnol. J. 4, e201301002.

26.

Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L. and Ressom, H. W. (2012) LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8, 470–481.

27.

Hopfgartner, G. and Varesio, E. (2013) Tandem Mass Spectrometry Hyphenated with HPLC and UHPLC for Targeted Metabolomics. Metabolomics Pract. Success. Strateg. to Gener. Anal. Metab. Data 21–37.

28.

Williams, R. E., Lenz, E. M., Evans, J. A., Wilson, I. D., Granger, J. H., Plumb, R. S. and Stumpf, C. L. (2005) A combined (1)H NMR and HPLC-MS-based metabonomic study of urine from obese (fa/fa) Zucker and normal Wistar-derived rats. J. Pharm. Biomed. Anal. 38, 465–471.

95

29.

Want, E. J., Wilson, I. D., Gika, H., Theodoridis, G., Plumb, R. S., Shockcor, J., Holmes, E. and Nicholson, J. K. (2010) Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nat. Protoc. 5, 1005–1018.

30.

Sun, H., Zhang, S., Zhang, A., Yan, G., Wu, X., Han, Y. and Wang, X. (2014) Metabolomic analysis of diet-induced type 2 diabetes using UPLC/MS integrated with pattern recognition approach. PLoS One 9, e93384.

31.

Zhu, Y., Feng, Y., Shen, L., Xu, D., Wang, B., Ruan, K. and Cong, W. (2013) Effect of metformin on the urinary metabolites of diet-induced-obese mice studied by ultra performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (UPLC-TOF/MS). J. Chromatogr. B. 925, 110–116.

32.

Veenstra, T. D. (2012) Metabolomics: the final frontier? Genome Med. 4, 40.

33.

Ward, J. L., Baker, J. M., Miller, S. J., Deborde, C., Maucourt, M., Biais, B., Rolin, D., Moing, A., Moco, S., Vervoort, J., et al. (2010) An inter-laboratory comparison demonstrates that [H]-NMR metabolite fingerprinting is a robust technique for collaborative plant metabolomic data collection. Metabolomics 6, 263–273.

34.

Clarke, C. J. and Haselden, J. N. (2008) Metabolic profiling as a tool for understanding mechanisms of toxicity. Toxicol. Pathol. 36, 140–147.

35.

Kovacs, H., Moskau, D. and Spraul, M. (2005) Cryogenically cooled probes—a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46, 131–155.

36.

Grimes, J. H. and O’Connell, T. M. (2011) The application of micro-coil NMR probe technology to metabolomics of urine and serum. J. Biomol. NMR 49, 297–305.

37.

Schlotterbeck, G., Ross, A., Hochstrasser, R., Senn, H., Kühn, T., Marek, D. and Schett, O. (2002) High-Resolution Capillary Tube NMR. A Miniaturized 5-μL High-Sensitivity TXI Probe for Mass-Limited Samples, Off-Line LC NMR, and HT NMR. Anal. Chem. 74, 4464-4471.

38.

Crockford, D. J., Holmes, E., Lindon, J. C., Plumb, R. S., Zirah, S., Bruce, S. J., Rainville, P., Stumpf, C. L. and Nicholson, J. K. (2006) Statistical heterospectroscopy, an approach to the integrated analysis of NMR and UPLC-MS data sets: application in metabonomic toxicology studies. Anal. Chem. 78, 363–371.

39.

Jankevics, A., Liepinsh, E., Liepinsh, E., Vilskersts, R., Grinberga, S., Pugovics, O. and Dambrova, M. (2009) Metabolomic studies of experimental diabetic urine samples by 1H NMR spectroscopy and LC/MS method. Chemom. Intell. Lab. Syst. 97, 11–17.

40.

Lanza, I. R., Zhang, S., Ward, L. E., Karakelides, H., Raftery, D. and Nair, K. S. (2010) Quantitative metabolomics by H-NMR and LC-MS/MS confirms altered metabolic pathways in diabetes. PLoS One 5, e10538.

41.

Psychogios, N., Hau, D. D., Peng, J., Guo, A. C., Mandal, R., Bouatra, S., Sinelnikov, I., Krishnamurthy, R., Eisner, R., Gautam, B., et al. (2011) The human serum metabolome. PLoS One 6, e16957.

96

42.

Bouatra, S., Aziat, F., Mandal, R., Guo, A. C., Wilson, M. R., Knox, C., Bjorndahl, T. C., Krishnamurthy, R., Saleem, F., Liu, P., et al. (2013) The human urine metabolome. PLoS One 8, e73076.

43.

Zhang, A., Sun, H., Wang, P., Han, Y. and Wang, X. (2012) Recent and potential developments of biofluid analyses in metabolomics. J. Proteomics75, 1079–1088.

44.

Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T. and Sykes, B. D. (2007) Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics 3, 439–451.

45.

Duarte, I. F., Diaz, S. O. and Gil, A. M. (2014) NMR metabolomics of human blood and urine in disease research. J. Pharm. Biomed. Anal. 93, 17–26.

46.

Smolinska, A., Blanchet, L., Buydens, L. M. C. and Wijmenga, S. S. (2012) NMR and pattern recognition methods in metabolomics: from data acquisition to biomarker discovery: a review. Anal. Chim. Acta 750, 82–97.

47.

Menon, R., Jones, J., Gunst, P. R., Kacerovsky, M., Fortunato, S. J., Saade, G. R. and Basraon, S. (2014) Amniotic fluid metabolomic analysis in spontaneous preterm birth. Reprod. Sci. 21, 791–803.

48.

Xu, X., Cheng, S., Ding, C., Lv, Z., Chen, D., Wu, J. and Zheng, S. (2015) Identification of bile biomarkers of biliary tract cancer through a liquid chromatography/mass spectrometrybased metabolomic method. Mol. Med. Rep. 11, 2191–2198.

49.

Calderón-Santiago, M., Priego-Capote, F., Jurado-Gámez, B. and Luque de Castro, M. D. (2014) Optimization study for metabolomics analysis of human sweat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in high resolution mode. J. Chromatogr. A 1333, 70–78.

50.

Barnes, V. M., Kennedy, A. D., Panagakos, F., Devizio, W., Trivedi, H. M., Jönsson, T., Guo, L., Cervi, S. and Scannapieco, F. A. (2014) Global metabolomic analysis of human saliva and plasma from healthy and diabetic subjects, with and without periodontal disease. PLoS One 9, e105181.

51.

Gilany, K., Moazeni-Pourasil, R. S., Jafarzadeh, N. and Savadi-Shiraz, E. (2014) Metabolomics fingerprinting of the human seminal plasma of asthenozoospermic patients. Mol. Reprod. Dev. 81, 84–86.

52.

Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P. and Del Boccio, P. (2015) Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics. Clin. Appl. 9, 169–186.

53.

Carraro, S., Rezzi, S., Reniero, F., Héberger, K., Giordano, G., Zanconato, S., Guillou, C. and Baraldi, E. (2012) Metabolomics Applied to Exhaled Breath Condensate in Childhood Asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 986–990.

54.

Beckonert, O., Keun, H. C., Ebbels, T. M. D., Bundy, J., Holmes, E., Lindon, J. C. and Nicholson, J. K. (2007) Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692–2703.

97

55.

Bernini, P., Bertini, I., Luchinat, C., Nincheri, P., Staderini, S. and Turano, P. (2011) Standard operating procedures for pre-analytical handling of blood and urine for metabolomic studies and biobanks. J. Biomol. NMR 49, 231–243.

56.

Pinto, J., Domingues, M. R. M., Galhano, E., Pita, C., Almeida, M. do C., Carreira, I. M. and Gil, A. M. (2014) Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst 139, 1168–1177.

57.

Yu, Z., Kastenmüller, G., He, Y., Belcredi, P., Möller, G., Prehn, C., Mendes, J., Wahl, S., Roemisch-Margl, W., Ceglarek, U., et al. (2011) Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One 6, e21230.

58.

Liu, L., Aa, J., Wang, G., Yan, B., Zhang, Y., Wang, X., Zhao, C., Cao, B., Shi, J., Li, M., et al. (2010) Differences in metabolite profile between blood plasma and serum. Anal. Biochem. 406, 105–112.

59.

Daykin, C. A., Foxall, P. J. D., Connor, S. C., Lindon, J. C. and Nicholson, J. K. (2002) The comparison of plasma deproteinization methods for the detection of low-molecular-weight metabolites by (1)H nuclear magnetic resonance spectroscopy. Anal. Biochem. 304, 220–230.

60.

Schreier, C., Kremer, W., Huber, F., Neumann, S., Pagel, P., Lienemann, K. and Pestel, S. (2013) Reproducibility of NMR analysis of urine samples: Impact of sample preparation, storage conditions, and animal health status. Biomed Res. Int. 2013, 878374.

61.

Saude, E. and Sykes, B. (2007) Urine stability for metabolomic studies: effects of preparation and storage. Metabolomics 3, 19–27.

62.

Emwas, A.-H., Luchinat, C., Turano, P., Tenori, L., Roy, R., Salek, R. M., Ryan, D., Merzaban, J. S., Kaddurah-Daouk, R., Zeri, A. C., et al. (2014) Standardizing the experimental conditions for using urine in NMR-based metabolomic studies with a particular focus on diagnostic studies: a review. Metabolomics 11, 872-894.

63.

Kurien, B. T., Everds, N. E. and Scofield, R. H. (2004) Experimental animal urine collection: a review. Lab. Anim. 38, 333–361.

64.

Wu, H., Southam, A. D., Hines, A. and Viant, M. R. (2008) High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212.

65.

Lin, C. Y., Wu, H., Tjeerdema, R. S. and Viant, M. R. (2007) Evaluation of metabolite extraction strategies from tissue samples using NMR metabolomics. Metabolomics 3, 55–67.

66.

Miyataka, H., Ozaki, T. and Himeno, S. (2007) Effect of pH on 1H-NMR spectroscopy of mouse urine. Biol. Pharm. Bull. 30, 667–670.

67.

Jiang, L., Huang, J., Wang, Y. and Tang, H. (2012) Eliminating the dication-induced intersample chemical-shift variations for NMR-based biofluid metabonomic analysis. Analyst 137, 4209–4219.

98

68.

Ross, A., Schlotterbeck, G., Dieterle, F. and Senn, H. (2007) NMR Spectroscopy Techniques for Application to Metabonomics. In The Handbook of Metabonomics and Metabolomics (Lindon, J. C., Nicholson, J. K., and Holmes, E., eds.), pp 55–112, Elsevier Science B.V., Amsterdam.

69.

Zheng, G. and Price, W. S. (2010) Solvent signal suppression in NMR. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 56, 267–288.

70.

Giraudeau, P., Silvestre, V. and Akoka, S. (2015) Optimizing water suppression for quantitative NMR-based metabolomics: a tutorial review. Metabolomics 11, 1041-1055.

71.

Nicholson, J. K., Foxall, P. J., Spraul, M., Farrant, R. D. and Lindon, J. C. (1996) 750 MHz 1H and 1H-l3C NMR Spectroscopy of Human Blood Plasma. Anal. Chem. 67, 793–811.

72.

Mckay, R. T. (2011) How the 1D-NOESY suppresses solvent signal in metabonomics NMR spectroscopy: An examination of the pulse sequence components and evolution. Concepts Magn. Reson. Part A 38A, 197–220.

73.

Carr, H. and Purcell, E. (1954) Effects of Diffusion on Free Precession in Nuclear Magnetic Resonance Experiments. Phys. Rev. 94, 630–638.

74.

Meiboom, S. and Gill, D. (1958) Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation Times. Rev. Sci. Instrum. 29, 688–691.

75.

Aue, W. P., Karhan, J. and Ernst, R. R. (1976) Homonuclear broad band decoupling and two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy. J. Chem. Phys. 64, 4226–4227.

76.

Wang, T., Shao, K., Chu, Q., Ren, Y., Mu, Y., Qu, L., He, J., Jin, C. and Xia, B. (2009) Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics 10, 83.

77.

Izquierdo-García, J. L., Rodríguez, I., Kyriazis, A., Villa, P., Barreiro, P., Desco, M. and Ruiz-Cabello, J. (2009) A novel R-package graphic user interface for the analysis of metabonomic profiles. BMC Bioinformatics 10, 1–10.

78.

Viant, M. R. (2003) Improved methods for the acquisition and interpretation of NMR metabolomic data. Biochem. Biophys. Res. Commun. 310, 943–948.

79.

Ludwig, C. and Günther, U. L. (2011) MetaboLab--advanced NMR data processing and analysis for metabolomics. BMC Bioinformatics 12, 366.

80.

Xia, J., Psychogios, N., Young, N. and Wishart, D. S. (2009) MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 37, W652-660.

81.

Izquierdo-García, J. L., Villa, P., Kyriazis, A., del Puerto-Nevado, L., Pérez-Rial, S., Rodriguez, I., Hernandez, N. and Ruiz-Cabello, J. (2011) Descriptive review of current NMR-based metabolomic data analysis packages. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 59, 263–270.

82.

Xi, Y. and Rocke, D. M. (2008) Baseline correction for NMR spectroscopic metabolomics data analysis. BMC Bioinformatics 9, 324.

99

83.

Vu, T. and Laukens, K. (2013) Getting Your Peaks in Line: A Review of Alignment Methods for NMR Spectral Data. Metabolites 3, 259–276.

84.

Forshed, J., Torgrip, R. J. O., Aberg, K. M., Karlberg, B., Lindberg, J. and Jacobsson, S. P. (2005) A comparison of methods for alignment of NMR peaks in the context of cluster analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 38, 824–832.

85.

Spraul, M., Neidig, P., Klauck, U., Kessler, P., Holmes, E., Nicholson, J. K., Sweatman, B. C., Salman, S. R., Farrant, R. D. and Rahr, E. (1994) Automatic reduction of NMR spectroscopic data for statistical and pattern recognition classification of samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 12, 1215–1225.

86.

De Meyer, T., Sinnaeve, D., Van Gasse, B., Tsiporkova, E., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Gillebert, T. C., Bekaert, S., Martins, J. C. and Van Criekinge, W. (2008) NMR-based characterization of metabolic alterations in hypertension using an adaptive, intelligent binning algorithm. Anal. Chem., American Chemical Society 80, 3783–3790.

87.

Davis, R. A., Charlton, A. J., Godward, J., Jones, S. A., Harrison, M. and Wilson, J. C. (2007) Adaptive binning: An improved binning method for metabolomics data using the undecimated wavelet transform. Chemom. Intell. Lab. Syst. 85, 144–154.

88.

Anderson, P. E., Mahle, D. a., Doom, T. E., Reo, N. V., DelRaso, N. J. and Raymer, M. L. (2010) Dynamic adaptive binning: an improved quantification technique for NMR spectroscopic data. Metabolomics 7, 179–190.

89.

Sousa, S. A. A., Magalhães, A. and Ferreira, M. M. C. (2013) Optimized bucketing for NMR spectra: Three case studies. Chemom. Intell. Lab. Syst. 122, 93–102.

90.

Anderson, P. E., Reo, N. V., DelRaso, N. J., Doom, T. E. and Raymer, M. L. (2008) Gaussian binning: a new kernel-based method for processing NMR spectroscopic data for metabolomics. Metabolomics 4, 261–272.

91.

Kohl, S. M., Klein, M. S., Hochrein, J., Oefner, P. J., Spang, R. and Gronwald, W. (2012) State-of-the art data normalization methods improve NMR-based metabolomic analysis. Metabolomics 8, 146–160.

92.

Craig, A., Cloarec, O., Holmes, E., Nicholson, J. K. and Lindon, J. C. (2006) Scaling and normalization effects in NMR spectroscopic metabonomic data sets. Anal. Chem. 78, 2262-2267.

93.

Warrack, B. M., Hnatyshyn, S., Ott, K.-H., Reily, M. D., Sanders, M., Zhang, H. and Drexler, D. M. (2009) Normalization strategies for metabonomic analysis of urine samples. J. Chromatogr. B 877, 547–552.

94.

Giraudeau, P., Tea, I., Remaud, G. S. and Akoka, S. (2014) Reference and normalization methods: Essential tools for the intercomparison of NMR spectra. J. Pharm. Biomed. Anal. 93, 3–16.

95.

Dieterle, F., Ross, A., Schlotterbeck, G. and Senn, H. (2006) Probabilistic quotient normalization as robust method to account for dilution of complex biological mixtures. Application in 1H NMR metabonomics. Anal. Chem. 78, 4281–4290.

100

96.

Dong, J., Cheng, K.-K., Xu, J., Chen, Z. and Griffin, J. L. (2011) Group aggregating normalization method for the preprocessing of NMR-based metabolomic data. Chemom. Intell. Lab. Syst. 108, 123–132.

97.

Garde, A. H., Hansen, A. M., Kristiansen, J. and Knudsen, L. E. (2004) Comparison of Uncertainties Related to Standardization of Urine Samples with Volume and Creatinine Concentration. Ann. Occup. Hyg. 48, 171–179.

98.

Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D. and Kendall, M. (2011) Recent and potential developments in the analysis of urine: A review. Anal. Chim. Acta 684, 17–29.

99.

Van den Berg, R. A., Hoefsloot, H. C. J., Westerhuis, J. A., Smilde, A. K. and van der Werf, M. J. (2006) Centering, scaling, and transformations: improving the biological information content of metabolomics data. BMC Genomics 7, 142.

100.

Jackson, J. E. (1991) A User’s Guide to Principal Components, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.

101.

Eriksson, L., Johansson, E., Kettaneh-Wold, M. and Wold, S. (1999) Introduction to Multi- and Megavariate Data Analysis using Projection Methods (PCA & PLS). Umetrics, Umeå, Sweden

102.

Iorio, M. De, Ebbels, T. M. D. and Stephens, D. A. (2003) Statistical Techniques in Metabolic Profiling. Handbook of statistical genetics. Balding, D. J. et al., editors, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK.

103.

Lindon, J. C., Holmes, E. and Nicholson, J. K. (2001) Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 39, 1–40.

104.

Ebbels, T. M. D. and Cavill, R. (2009) Bioinformatic methods in NMR-based metabolic profiling. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 361–374.

105.

Baumann, K. (2003) Cross-validation as the objective function for variable-selection techniques. TrAC Trends Anal. Chem. 22, 395–406.

106.

Westerhuis, J. A., Hoefsloot, H. C. J., Smit, S., Vis, D. J., Smilde, A. K., Velzen, E. J. J., Duijnhoven, J. P. M. and van Dorsten, F. A. (2008) Assessment of PLSDA cross validation. Metabolomics 4, 81–89.

107.

Anderssen, E., Dyrstad, K., Westad, F. and Martens, H. (2006) Reducing over-optimism in variable selection by cross-model validation. Chemom. Intell. Lab. Syst. 84, 69–74.

108.

Bijlsma, S., Bobeldijk, I., Verheij, E. R., Ramaker, R., Kochhar, S., Macdonald, I. A., van Ommen, B. and Smilde, A. K. (2006) Large-scale human metabolomics studies: a strategy for data (pre-) processing and validation. Anal. Chem. 78, 567–574.

109.

Mehmood, T., Liland, K. H., Snipen, L. and Sæbø, S. (2012) A review of variable selection methods in Partial Least Squares Regression. Chemom. Intell. Lab. Syst. 118, 62–69.

110.

Ulrich, E. L., Akutsu, H., Doreleijers, J. F., Harano, Y., Ioannidis, Y. E., Lin, J., Livny, M., Mading, S., Maziuk, D., Miller, Z., et al. (2008) BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402–408.

101

111.

Cui, Q., Lewis, I. A., Hegeman, A. D., Anderson, M. E., Li, J., Schulte, C. F., Westler, W. M., Eghbalnia, H. R., Sussman, M. R. and Markley, J. L. (2008) Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162–164.

112.

Ludwig, C., Easton, J. M., Lodi, A., Tiziani, S., Manzoor, S. E., Southam, A. D., Byrne, J. J., Bishop, L. M., He, S., Arvanitis, T. N., et al. (2011) Birmingham Metabolite Library: a publicly accessible database of 1-D 1H and 2-D 1H J-resolved NMR spectra of authentic metabolite standards (BML-NMR). Metabolomics 8, 8–18.

113.

Wishart, D. S., Jewison, T., Guo, A. C., Wilson, M., Knox, C., Liu, Y., Djoumbou, Y., Mandal, R., Aziat, F., Dong, E., et al. (2013) HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801–807.

114.

Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E. and Slupsky, C. M. (2006) Targeted profiling: quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Anal. Chem. 78, 4430-4442.

115.

Schripsema, J. Application of NMR in plant metabolomics: techniques, problems and prospects. Phytochem. Anal. 21, 14–21.

116.

Kriat, M., Confort-Gouny, S., Vion-Dury, J., Sciaky, M., Viout, P. and Cozzone, P. J. (1992) Quantitation of metabolites in human blood serum by proton magnetic resonance spectroscopy. A comparative study of the use of formate and TSP as concentration standards. NMR Biomed. 5, 179–184.

117.

Akoka, S., Barantin, L. and Trierweiler, M. (1999) Concentration Measurement by Proton NMR Using the ERETIC Method. Anal. Chem. 71, 2554–2557.

118.

Thrippleton, M. J., Edden, R. A. E. and Keeler, J. (2005) Suppression of strong coupling artefacts in J-spectra. J. Magn. Reson. 174, 97–109.

119.

Parsons, H. M., Ludwig, C. and Viant, M. R. (2009) Line-shape analysis of J-resolved NMR spectra: application to metabolomics and quantification of intensity errors from signal processing and high signal congestion. Magn. Reson. Chem. 47 Suppl 1, S86–95.

120.

Koskela, H., Heikkilä, O., Kilpeläinen, I. and Heikkinen, S. (2010) Quantitative two-dimensional HSQC experiment for high magnetic field NMR spectrometers. J. Magn. Reson. 202, 24–33.

121.

Lewis, I. A., Schommer, S. C., Hodis, B., Robb, K. a, Tonelli, M., Westler, W. M., Sussman, M. R. and Markley, J. L. (2007) Method for determining molar concentrations of metabolites in complex solutions from two-dimensional 1H-13C NMR spectra. Anal. Chem. 79, 9385–9390.

122.

Rai, R. K. and Sinha, N. (2012) Fast and accurate quantitative metabolic profiling of body fluids by nonlinear sampling of 1H–13C two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Anal. Chem. 84, 10005–10011.

123.

Hainer, V. a kol. (2011) Základy klinické obezitologie, Grada Publishing, Praha.

124.

Qatanani, M. and Lazar, M. A. (2007) Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21, 1443–1455.

102

125.

Xie, B., Waters, M. J. and Schirra, H. J. (2012) Investigating potential mechanisms of obesity by metabolomics. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 805683.

126.

Chen, P. and Liu, J. (2007) Metabonomics and diabetes mellitus. Adv. Ther. 24, 1036-1045.

127.

Faber, J. H., Malmodin, D., Toft, H., Maher, A. D., Crockford, D., Holmes, E., Nicholson, J. K., Dumas, M. E. and Baunsgaard, D. (2007) Metabonomics in diabetes research. J. Diabetes Sci. Technol. 1, 549–557.

128.

Bain, J. R., Stevens, R. D., Wenner, B. R., Ilkayeva, O., Muoio, D. M. and Newgard, C. B. (2009) Metabolomics applied to diabetes research: moving from information to knowledge. Diabetes 58, 2429–2443.

129.

Abu Bakar, M. H., Sarmidi, M. R., Cheng, K.-K., Ali Khan, A., Suan, C. L., Zaman Huri, H. and Yaakob, H. (2015) Metabolomics - the complementary field in systems biology: a review on obesity and type 2 diabetes. Mol. Biosyst. 11, 1742–1774.

130.

Park, S., Sadanala, K. C. and Kim, E.-K. (2015) A Metabolomic Approach to Understanding the Metabolic Link between Obesity and Diabetes. Mol. Cells 38, 587-596.

131.

Du, F., Virtue, A., Wang, H. and Yang, X.-F. (2013) Metabolomic analyses for atherosclerosis, diabetes, and obesity. Biomark. Res. 1, 17.

132.

Thibault, L. (2013) Animal Models in Dietary-Induced Obesity. in Animal Models for the Study of Human Disease, Elsevier, 277-303

133.

Griffin, J. L. (2006) Understanding mouse models of disease through metabolomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 309–315.

134.

Srinivasan, K. and Ramarao, P. (2007) Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J. Med. Res. 125, 451–72.

135.

Chatzigeorgiou, A., Halapas, A., Kalafatakis, K. and Kamper, E. (2009) The use of animal models in the study of diabetes mellitus. In Vivo 23, 245–258.

136.

Speakman, J., Hambly, C., Mitchell, S. and Król, E. (2008) The contribution of animal models to the study of obesity. Lab. Anim. 42, 413–432.

137.

Kanasaki, K. and Koya, D. (2011) Biology of obesity: lessons from animal models of obesity. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 197636.

138.

Buettner, R., Schölmerich, J. and Bollheimer, L. C. (2007) High-fat diets: modeling the metabolic disorders of human obesity in rodents. Obesity 15, 798–808.

139.

Carroll, L., Voisey, J. and van Daal, A. (2004) Mouse models of obesity. Clin. Dermatol. 22, 345–349.

140.

Lutz, T. A. and Woods, S. C. (2012) Overview of animal models of obesity. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, Unit5.61.

103

141.

Won, E.-Y., Yoon, M.-K., Kim, S.-W., Jung, Y., Bae, H.-W., Lee, D., Park, S. G., Lee, C.-H., Hwang, G.-S. and Chi, S.-W. (2013) Gender-specific metabolomic profiling of obesity in leptin-deficient ob/ob mice by 1H NMR spectroscopy. PLoS One 8, e75998.

142.

Roberts, L. D., Murray, A. J., Menassa, D., Ashmore, T., Nicholls, A. W. and Griffin, J. L. (2011) The contrasting roles of PPARδ and PPARγ in regulating the metabolic switch between oxidation and storage of fats in white adipose tissue. Genome Biol. 12, R75.

143.

Chen, H., Charlat, O., Tartaglia, L. A., Woolf, E. A., Weng, X., Ellis, S. J., Lakey, N. D., Culpepper, J., More, K. J., Breitbart, R. E., et al. (1996) Evidence That the Diabetes Gene Encodes the Leptin Receptor: Identification of a Mutation in the Leptin Receptor Gene in db/db Mice. Cell 84, 491–495.

144.

Salek, R. M., Maguire, M. L., Bentley, E., Rubtsov, D. V, Hough, T., Cheeseman, M., Nunez, D., Sweatman, B. C., Haselden, J. N., Cox, R. D., et al. (2007) A metabolomic comparison of urinary changes in type 2 diabetes in mouse, rat, and human. Physiol. Genomics 29, 99–108.

145.

Connor, S. C., Hansen, M. K., Corner, A., Smith, R. F. and Ryan, T. E. (2010) Integration of metabolomics and transcriptomics data to aid biomarker discovery in type 2 diabetes. Mol. Biosyst. 6, 909–921.

146.

Saadat, N., IglayReger, H. B., Myers, M. G., Bodary, P. and Gupta, S. V. (2012) Differences in metabolomic profiles of male db/db and s/s, leptin receptor mutant mice. Physiol. Genomics 44, 374–381.

147.

Chandrasekera, P. C. and Pippin, J. J. (2014) Of rodents and men: species-specific glucose regulation and type 2 diabetes research. ALTEX 31, 157–176.

148.

Bunyan, J., Murrell, E. A. and Shah, P. P. (2008) The induction of obesity in rodents by means of monosodium glutamate. Br. J. Nutr. 35, 25.

149.

Nagata, M., Suzuki, W., Iizuka, S., Tabuchi, M., Maruyama, H., Takeda, S., Aburada, M. and Miyamoto, K. (2006) Type 2 diabetes mellitus in obese mouse model induced by monosodium glutamate. Exp. Anim. 55, 109–115.

150.

Olney, J. W. (1969) Brain Lesions, Obesity, and Other Disturbances in Mice Treated with Monosodium Glutamate. Science 164, 719–721.

151.

Elefteriou, F., Takeda, S., Liu, X., Armstrong, D. and Karsenty, G. (2003) Monosodium glutamate-sensitive hypothalamic neurons contribute to the control of bone mass. Endocrinology 144, 3842–3847.

152.

Zelezná, B., Maixnerová, J., Matysková, R., Haugvicová, R., Blokesová, D. and Maletínská, L. (2009) Anorexigenic effect of cholecystokinin is lost but that of CART (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript) peptide is preserved in monosodium glutamate obese mice. Physiol. Res. 58, 717–23.

153.

Edelstein, K., Pfaus, J. G., Rusak, B. and Amir, S. (1995) Neonatal monosodium glutamate treatment prevents effects of constant light on circadian temperature rhythms of adult rats. Brain Res. 675, 135–142.

104

154.

Mistlberger, R. E. and Antle, M. C. (1999) Neonatal monosodium glutamate alters circadian organization of feeding, food anticipatory activity and photic masking in the rat. Brain Res. 842, 73–83.

155.

Djazayery, A., Miller, D. S. and Stock, M. J. (1979) Energy Balances in Obese Mice. Ann. Nutr. Metab. 23, 357–367.

156.

Maletínská, L., Toma, R. S., Pirnik, Z., Kiss, A., Slaninová, J., Haluzík, M. and Zelezná, B. (2006) Effect of cholecystokinin on feeding is attenuated in monosodium glutamate obese mice. Regul. Pept. 136, 58–63.

157.

Remke, H., Wilsdorf, A. and Müller, F. (1988) Development of hypothalamic obesity in growing rats. Exp. Pathol. 33, 223–232.

158.

Matysková, R., Maletínská, L., Maixnerová, J., Pirník, Z., Kiss, a and Zelezná, B. (2008) Comparison of the obesity phenotypes related to monosodium glutamate effect on arcuate nucleus and/or the high fat diet feeding in C57BL/6 and NMRI mice. Physiol. Res. 57, 727-734.

159.

Hernández-Bautista, R. J., Alarcón-Aguilar, F. J., Del C Escobar-Villanueva, M., Almanza-Pérez, J. C., Merino-Aguilar, H., Fainstein, M. K. and López-Diazguerrero, N. E. (2014) Biochemical alterations during the obese-aging process in female and male monosodium glutamate (MSG)-treated mice. Int. J. Mol. Sci. 15, 11473–11494.

160.

Roman-Ramos, R., Almanza-Perez, J. C., Garcia-Macedo, R., Blancas-Flores, G., Fortis-Barrera, A., Jasso, E. I., Garcia-Lorenzana, M., Campos-Sepulveda, A. E., Cruz, M. and Alarcon-Aguilar, F. J. (2011) Monosodium glutamate neonatal intoxication associated with obesity in adult stage is characterized by chronic inflammation and increased mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptors in mice. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 108, 406–413.

161.

Wang, C.-Y. and Liao, J. K. (2012) A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol. Biol. 821, 421–433.

162.

Higa, T. S., Spinola, A. V, Fonseca-Alaniz, M. H. and Evangelista, F. S. A. (2014) Comparison between cafeteria and high-fat diets in the induction of metabolic dysfunction in mice. Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol. 6, 47–54.

163.

Hoffler, U., Hobbie, K., Wilson, R., Bai, R., Rahman, A., Malarkey, D., Travlos, G. and Ghanayem, B. I. (2009) Diet-induced obesity is associated with hyperleptinemia, hyperinsulinemia, hepatic steatosis, and glomerulopathy in C57Bl/6J mice. Endocrine 36, 311– 25.

164.

Lin, S., Thomas, T. C., Storlien, L. H. and Huang, X. F. (2000) Development of high fat dietinduced obesity and leptin resistance in C57Bl/6J mice. Int. J. Obes. 24, 639-646.

165.

Thupari, J. N. (2004) Chronic C75 treatment of diet-induced obese mice increases fat oxidation and reduces food intake to reduce adipose mass. AJP Endocrinol. Metab. 287, E97–E104.

105

166.

Shearer, J., Duggan, G., Weljie, A., Hittel, D. S., Wasserman, D. H. and Vogel, H. J. (2008) Metabolomic profiling of dietary-induced insulin resistance in the high fat-fed C57BL/6J mouse. Diabetes. Obes. Metab. 10, 950–958.

167.

Duggan, G. E., Hittel, D. S., Sensen, C. W., Weljie, A. M., Vogel, H. J. and Shearer, J. (2011) Metabolomic response to exercise training in lean and diet-induced obese mice. J. Appl. Physiol. 110, 1311–1318.

168.

Duggan, G. E., Hittel, D. S., Hughey, C. C., Weljie, A., Vogel, H. J. and Shearer, J. (2011) Differentiating short- and long-term effects of diet in the obese mouse using (1) H-nuclear magnetic resonance metabolomics. Diabetes. Obes. Metab. 13, 859–862.

169.

Jung, J.-Y., Kim, I.-Y., Kim, Y.-N., Kim, J.-S., Shin, J.-H., Jang, Z.-H., Lee, H.-S., Hwang, G.-S. and Seong, J.-K. (2012) 1 H NMR-based metabolite profiling of diet-induced obesity in a mouse mode. BMB Rep. 45, 419–424.

170.

Boulangé, C. L., Claus, S. P., Chou, C. J., Collino, S., Montoliu, I., Kochhar, S., Holmes, E., Rezzi, S., Nicholson, J. K., Dumas, M. E., et al. (2013) Early metabolic adaptation in C57BL/6 mice resistant to high fat diet induced weight gain involves an activation of mitochondrial oxidative pathways. J. Proteome Res. 12, 1956–1968.

171.

Inzucchi, S. E., Bergenstal, R. M., Buse, J. B., Diamant, M., Ferrannini, E., Nauck, M., Peters, A. L., Tsapas, A., Wender, R. and Matthews, D. R. (2014) Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes, 2015: A Patient-Centered Approach: Update to a Position Statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes. Diabetes Care 38, 140–149.

172.

Davidson, J. A. The placement of DPP-4 inhibitors in clinical practice recommendations for the treatment of type 2 diabetes. Endocr. Pract. 19, 1050–1061.

173.

Stamataros, G. and Schneider, S. H. (2011) Vildagliptin in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Expert Opin. Pharmacother. 12, 1967–1973.

174.

Scheen, A. J. (2015) Safety of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors for treating type 2 diabetes. Expert Opin. Drug Saf. 14, 505–524.

175.

Viollet, B., Guigas, B., Sanz Garcia, N., Leclerc, J., Foretz, M. and Andreelli, F. (2012) Cellular and molecular mechanisms of metformin: an overview. Clin. Sci. (Lond). 122, 253-270.

176.

Jolliffe, I. T. (2002) Principal Component Analysis, Second Edition, Springer, New York.

177.

Maletínská, L., Matyšková, R., Maixnerová, J., Sýkora, D., Pýchová, M., Spolcová, A., Blechová, M., Drápalová, J., Lacinová, Z., Haluzík, M., et al. (2011) The Peptidic GHS-R antagonist [D-Lys(3)]GHRP-6 markedly improves adiposity and related metabolic abnormalities in a mouse model of postmenopausal obesity. Mol. Cell. Endocrinol. 343, 55–62.

178.

Wiechelman, K. J., Braun, R. D. and Fitzpatrick, J. D. (1988) Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal. Biochem. 175, 231–237.

106

179.

Kopecký, J., Hodný, Z., Rossmeisl, M., Syrový, I. and Kozak, L. P. (1996) Reduction of dietary obesity in aP2-Ucp transgenic mice: physiology and adipose tissue distribution. Am. J. Physiol. 270, E768–75.

180.

Pontarolo, R., Gimenez, A. C., de Francisco, T. M. G., Ribeiro, R. P., Pontes, F. L. D. and Gasparetto, J. C. (2014) Simultaneous determination of metformin and vildagliptin in human plasma by a HILIC-MS/MS method. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 965, 133–141.

181.

Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B. and Wishart, D. S. (2015) MetaboAnalyst 3.0--making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Res. 43, W251–257.

182.

Messana, I., Forni, F., Ferrari, F., Rossi, C., Giardina, B. and Zuppi, C. (1998) Proton nuclear magnetic resonance spectral profiles of urine in type II diabetic patients. Clin. Chem. 44, 1529-1534.

183.

Gavaghan, C. L., Wilson, I. D. and Nicholson, J. K. (2002) Physiological variation in metabolic phenotyping and functional genomic studies: use of orthogonal signal correction and PLS-DA. FEBS Lett. 530, 191–196.

184.

Bollard, M. E., Holmes, E., Lindon, J. C., Mitchell, S. C., Branstetter, D., Zhang, W. and Nicholson, J. K. (2001) Investigations into biochemical changes due to diurnal variation and estrus cycle in female rats using high-resolution (1)H NMR spectroscopy of urine and pattern recognition. Anal. Biochem. 295, 194–202.

185.

Leo, G. C. and Darrow, A. L. (2009) NMR-based metabolomics of urine for the atherosclerotic mouse model using apolipoprotein-E deficient mice. Magn. Reson. Chem. 47 Suppl 1, S20–25.

186.

Giller, K., Huebbe, P., Doering, F., Pallauf, K. and Rimbach, G. (2013) Major urinary protein 5, a scent communication protein, is regulated by dietary restriction and subsequent re-feeding in mice. Proc. Biol. Sci. 280, 20130101.

187.

Hui, X., Zhu, W., Wang, Y., Lam, K. S. L., Zhang, J., Wu, D., Kraegen, E. W., Li, Y. and Xu, A. (2009) Major urinary protein-1 increases energy expenditure and improves glucose intolerance through enhancing mitochondrial function in skeletal muscle of diabetic mice. J. Biol. Chem. 284, 14050–14057.

188.

Zhou, Y., Jiang, L. and Rui, L. (2009) Identification of MUP1 as a regulator for glucose and lipid metabolism in mice. J. Biol. Chem. 284, 11152–11159.

189.

Delaney, J., Hodson, M. P., Thakkar, H., Connor, S. C., Sweatman, B. C., Kenny, S. P., McGill, P. J., Holder, J. C., Hutton, K. a, Haselden, J. N., et al. (2005) Tryptophan-NAD+ pathway metabolites as putative biomarkers and predictors of peroxisome proliferation. Arch. Toxicol. 79, 208–223.

190.

Ringeissen, S., Connor, S. C., Brown, H. R., Sweatman, B. C., Hodson, M. P., Kenny, S. P., Haworth, R. I., McGill, P., Price, M. a, Aylott, M. C., et al. (2003) Potential urinary and plasma biomarkers of peroxisome proliferation in the rat: identification of N-methylnicotinamide and N-methyl-4-pyridone-3-carboxamide by 1H nuclear magnetic resonance and high performance liquid chromatography. Biomarkers 8, 240-71.

107

191.

Kersten, S. (2002) Peroxisome proliferator activated receptors and obesity. Eur. J. Pharmacol. 440, 223–234.

192.

Stienstra, R., Mandard, S., Patsouris, D., Maass, C., Kersten, S. and Müller, M. (2007) Peroxisome proliferator-activated receptor alpha protects against obesity-induced hepatic inflammation. Endocrinology 148, 2753–2763.

193.

Pirinen, E., Kuulasmaa, T., Pietilä, M., Heikkinen, S., Tusa, M., Itkonen, P., Boman, S., Skommer, J., Virkamäki, A., Hohtola, E., et al. (2007) Enhanced polyamine catabolism alters homeostatic control of white adipose tissue mass, energy expenditure, and glucose metabolism. Mol. Cell. Biol. 27, 4953–4967.

194.

Jell, J., Merali, S., Hensen, M. L., Mazurchuk, R., Spernyak, J. a, Diegelman, P., Kisiel, N. D., Barrero, C., Deeb, K. K., Alhonen, L., et al. (2007) Genetically altered expression of spermidine/spermine N1-acetyltransferase affects fat metabolism in mice via acetyl-CoA. J. Biol. Chem. 282, 8404–8413.

195.

Grubb, S. C., Maddatu, T. P., Bult, C. J. and Bogue, M. A. (2009) Mouse phenome database. Nucleic Acids Res. 37, D720–730.

196.

Kraus, D., Yang, Q., Kong, D., Banks, A. S., Zhang, L., Rodgers, J. T., Pirinen, E., Pulinilkunnil, T. C., Gong, F., Wang, Y., et al. (2014) Nicotinamide N-methyltransferase knockdown protects against diet-induced obesity. Nature 508, 258-62.

197.

Zhou, Y. and Rui, L. (2010) Major urinary protein regulation of chemical communication and nutrient metabolism. in Litwack, G. (ed) Vitam. Horm. 1st ed., 83, Elsevier Inc., 151-163

198.

Beynon, R. J. and Hurst, J. L. (2004) Urinary proteins and the modulation of chemical scents in mice and rats. Peptides 25, 1553–1563.

199.

Holmes, E., Li, J. V, Athanasiou, T., Ashrafian, H. and Nicholson, J. K. (2011) Understanding the role of gut microbiome-host metabolic signal disruption in health and disease. Trends Microbiol. 19, 349–359.

200.

Kim, I. Y., Jung, J., Jang, M., Ahn, Y. G., Shin, J. H., Choi, J. W., Sohn, M. R., Shin, S. M., Kang, D.-G., Lee, H.-S., et al. (2010) 1H NMR-based metabolomic study on resistance to dietinduced obesity in AHNAK knock-out mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 428–34.

201.

Kim, S.-H., Yang, S.-O., Kim, H.-S., Kim, Y., Park, T. and Choi, H.-K. (2009) 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy-based metabolic assessment in a rat model of obesity induced by a high-fat diet. Anal. Bioanal. Chem. 395, 1117–1124.

202.

Newgard, C. B., An, J., Bain, J. R., Muehlbauer, M. J., Stevens, R. D., Lien, L. F., Haqq, A. M., Shah, S. H., Arlotto, M., Slentz, C. A, et al. (2009) A branched-chain amino acid-related metabolic signature that differentiates obese and lean humans and contributes to insulin resistance. Cell Metab. 9, 311–326.

203.

Chung, W. Y. and Benzie, I. F. F. (2013) Plasma allantoin measurement by isocratic liquid chromatography with tandem mass spectrometry: Method evaluation and application in oxidative stress biomonitoring. Clin. Chim. Acta 424, 237–244.

108

204.

Kand’ár, R. and Záková, P. (2008) Allantoin as a marker of oxidative stress in human erythrocytes. Clin. Chem. Lab. Med. 46, 1270–1274.

205.

Yardim-Akaydin, S., Sepici, A., Ozkan, Y., Simşek, B. and Sepici, V.(2006) Evaluation of allantoin levels as a new marker of oxidative stress in Behçet’s disease. Scand. J. Rheumatol. 35, 61–64.

206.

Esser, N., Legrand-Poels, S., Piette, J., Scheen, A. J. and Paquot, N. (2014) Inflammation as a link between obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes. Diabetes Res. Clin. Pract. 105, 141–150

207.

Serkova, N., Fuller, T. F., Klawitter, J., Freise, C. E. and Niemann, C. U. (2005) H-NMR-based metabolic signatures of mild and severe ischemia/reperfusion injury in rat kidney transplants. Kidney Int. 67, 1142–1151.

208.

Fukuhara, K., Ohno, A., Ota, Y., Senoo, Y., Maekawa, K., Okuda, H., Kurihara, M., Okuno, A., Niida, S., Saito, Y., et al. (2013) NMR-based metabolomics of urine in a mouse model of Alzheimer’s disease: identification of oxidative stress biomarkers. J. Clin. Biochem. Nutr. 52, 133–138.

209.

Dryland, P. A., Love, D. R., Walker, M. F., Dommels, Y., Rowan, D., Roy, N. C., Helsby, N., Browning, B. L., Zhu, S., Copp, B. R., et al. (2008) Allantoin as A Biomarker of Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model : NMR Analysis of Urine, TOBCJ 1, 1–6.

210.

Chung, H.-H., Lee, K. S. and Cheng, J.-T. (2013) Decrease of Obesity by Allantoin via Imidazoline I 1 -Receptor Activation in High Fat Diet-Fed Mice. Evid. Based. Complement. Alternat. Med. 2013, 589309.

211.

Calvani, R., Brasili, E., Praticò, G., Capuani, G., Tomassini, A., Marini, F., Sciubba, F., Finamore, A., Roselli, M., Marzetti, E., et al. (2014) Fecal and urinary NMR-based metabolomics unveil an aging signature in mice. Exp. Gerontol. 49, 5–11.

212.

Pelantová, H., Bártová, S., Anýž, J., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Lacinová, Z., Šulc, M., Haluzík, M., et al. (2015) Metabolomic profiling of urinary changes in mice with monosodium glutamate-induced obesity. Anal. Bioanal. Chem.

213.

Li, D., Zhang, L., Dong, F., Liu, Y., Li, N., Li, H., Lei, H., Hao, F., Wang, Y., Zhu, Y., et al. (2015) Metabonomic Changes Associated with Atherosclerosis Progression for LDLR-/- Mice. J. Proteome Res. 14, 2237–2254.

214.

Vairetti, M., Carini, R., De Cesaris, M. G., Splendore, R., Richelmi, P., Bertè, F. and Albano, E. (2002) Beta-alanine protection against hypoxic liver injury in the rat. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1587, 83–91.

215.

Martin, F., Boulange, C., Montoliu Roura, I., Collino, S., Dumas, M., Holmes, E., Rezzi, S., Nicholson, J. and Kochhar, S. (2014, June 12) Isovalerylglycine as biomarker for the predisposition for weight gain and obesity. patent WO 2014/086605 A1

109

10 Přílohy CURRICULUM VITAE – RNDr. Helena Pelantová Pod Lysinami 476/2 147 00 Praha 4 Česká republika +420 296 442 646 [email protected]

ZAMĚSTNÁNÍ 2004 - dosud

vědecký pracovník Laboratoř charakterizace molekulární struktury, Mikrobiologický ústav AVČR NMR metabolomika, strukturní analýza přírodních látek, využití NMR při analýze komplexních směsí

1988 - 2002

vědecký pracovník NMR laboratoř, ÚOCHB AVČR strukturní analýza organických sloučenin

1985 - 1988

pomocná vědecká síla Oddělení teoretické chemie, ÚFCHE J. Heyrovského ČSAV

VZDĚLÁNÍ 2009 - dosud

postgraduální stadium katedra analytické chemie Přírodovědecké fakulty UP Olomouc zaměření disertace: „Aplikace NMR spektroskopie v metabolomice“

1983 - 1988

katedra analytické chemie Přírodovědecké fakulty UK Praha diplomová práce: „Interakce tetrazinu s acetylenem – teoretická studie“

ODBORNÉ ZAMĚŘENÍ

aplikace NMR v metabolomice, strukturní analýza přírodních látek, analýza směsí pomocí NMR 33 původních prací v impaktovaných časopisech h-index: 12

110

Seznam publikací za dobu postgraduálního studia

publikace související s tématem disertace: 1.

Pelantová, H., Bártová, S., Anýž, J., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Lacinová, Z., Šulc, M., Haluzík, M., et al. (2015) Metabolomic profiling of urinary changes in mice with monosodium glutamate-induced obesity. Anal. Bioanal. Chem. DOI 10.1007/s00216-015-9133-0, in print

2.

Pelantová, H., Bugáňová, M., Anýž, J., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Haluzík, M. and Kuzma, M. (2015) Strategy for NMR metabolomic analysis of urine in mouse models of obesity- from sample collection to interpretation of acquired data. J. Pharm. Biomed. Anal. 115, 225–35.

3.

Pelantová, H., Bártová, S., Kuzma, M. (2014) Advanced Techniques for NMR Analysis of Complex Biological Mixtures—From Simple NMR to Hyphenated Techniques. In Natural Products Analysis: Instrumentation, Methods, and Applications (Havlíček, V., and Spížek, J., eds.), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, 239–284

publikace nesouvisející s tématem disertace: (ve všech publikacích vyjma citací 17 a 21 je HP autorkou veškerých NMR dat a jejich interpretace) 1.

Šimčíková, D., Kotik, M., Weignerová, L., Halada, P., Pelantová, H., Adamcová, K. and Křen, V. (2015) α- L -Rhamnosyl-β- D -glucosidase (Rutinosidase) from Aspergillus niger : Characterization and Synthetic Potential of a Novel Diglycosidase. Adv. Synth. Catal. 357, 107–117.

2.

Hermannová, M., Iordache, A.-M., Slováková, K., Havlíček, V., Pelantová, H. and Lemr, K. (2015) Arrival time distributions of product ions reveal isomeric ratio of deprotonated molecules in ion mobility-mass spectrometry of hyaluronan-derived oligosaccharides. J. Mass Spectrom. 50, 854–63.

3.

Purchartová, K., Valentová, K., Pelantová, H., Marhol, P., Cvačka, J., Havlíček, L., Křenková, A., Vavříková, E., Biedermann, D., Chambers, C. S., et al. (2015) Prokaryotic and Eukaryotic Aryl Sulfotransferases: Sulfation of Quercetin and Its Derivatives. ChemCatChem 7, 3152-3162.

4.

De Winter, K., Dewitte, G., Dirks-Hofmeister, M. E., De Laet, S., Pelantová, H., Kren, V. and Desmet, T. (2015) Enzymatic glycosylation of phenolic antioxidants: phosphorylase mediated synthesis and characterization. J. Agric. Food Chem., American Chemical Society.

5.

De Winter, K., Van Renterghem, L., Wuyts, K., Pelantová, H., Křen, V., Soetaert, W. and Desmet, T. (2015) Chemoenzymatic Synthesis of β- D -Glucosides using Cellobiose Phosphorylase from Clostridium thermocellum. Adv. Synth. Catal. 357, 1961–1969.

111

6.

Slámová, K., Krejzová, J., Marhol, P., Kalachova, L., Kulik, N., Pelantová, H., Cvačka, J. and Křen, V. (2015) Synthesis of Derivatized Chitooligomers using Transglycosidases Engineered from the Fungal GH20 β- N -Acetylhexosaminidase. Adv. Synth. Catal. 357, 1941–1950.

7.

Šimonová, A., Kupper, C. E., Böcker, S., Müller, A., Hofbauerová, K., Pelantová, H., Elling, L., Křen, V. and Bojarová, P. (2014) Chemo-enzymatic synthesis of LacdiNAc dimers of varying length as novel galectin ligands. J. Mol. Catal. B Enzym. 101, 47–55.

8.

Krejzová, J., Simon, P., Kalachova, L., Kulik, N., Bojarová, P., Marhol, P., Pelantová, H., Cvačka, J., Ettrich, R., Slámová, K., et al. (2014) Inhibition of GlcNAc-processing glycosidases by C-6-azido-NAG-thiazoline and its derivatives. Molecules, Multidisciplinary Digital Publishing Institute 19, 3471–88.

9.

Krejzová, J., Kalachova, L., Šimon, P., Pelantová, H., Slámová, K. and Křen, V. (2014) Inhibition of microbial β-N-acetylhexosaminidases by 4-deoxy- and galacto-analogues of NAG-thiazoline. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, 5321–3.

10.

De Winter, K., Desmet, T., Devlamynck, T., Van Renterghem, L., Verhaeghe, T., Pelantová, H., Křen, V. and Soetaert, W. (2014) Biphasic Catalysis with Disaccharide Phosphorylases: Chemoenzymatic Synthesis of α- d -Glucosides Using Sucrose Phosphorylase. Org. Process Res. Dev., American Chemical Society 18, 781–787.

11.

De Winter, K., Šimčíková, D., Schalck, B., Weignerová, L., Pelantová, H., Soetaert, W., Desmet, T. and Křen, V. (2013) Chemoenzymatic synthesis of α-L-rhamnosides using recombinant α-L-rhamnosidase from Aspergillus terreus. Bioresour. Technol. 147, 640–4.

12.

Krejzová, J., Šimon, P., Vavříková, E., Slámová, K., Pelantová, H., Riva, S., Spiwok, V. and Křen, V. (2013) Enzymatic synthesis of new C-6-acylated derivatives of NAG-thiazoline and evaluation of their inhibitor activities towards fungal β-N-acetylhexosaminidase. J. Mol. Catal. B Enzym. 87, 128–134.

13.

Veselá, A. B., Pelantová, H., Sulc, M., Macková, M., Lovecká, P., Thimová, M., Pasquarelli, F., Pičmanová, M., Pátek, M., Bhalla, T. C., et al. (2012) Biotransformation of benzonitrile herbicides via the nitrile hydratase-amidase pathway in rhodococci. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, 1811–9.

14.

Kupper, C. E., Rosencrantz, R. R., Henßen, B., Pelantová, H., Thönes, S., Drozdová, A., Křen, V. and Elling, L. (2012) Chemo-enzymatic modification of poly-N-acetyllactosamine (LacNAc) oligomers and N,N-diacetyllactosamine (LacDiNAc) based on galactose oxidase treatment. Beilstein J. Org. Chem., Beilstein-Institut 8, 712–25.

15.

Uhnáková, B., Ludwig, R., Pěknicová, J., Homolka, L., Lisá, L., Šulc, M., Petříčková, A., Elzeinová, F., Pelantová, H., Monti, D., et al. (2011) Biodegradation of tetrabromobisphenol A by oxidases in basidiomycetous fungi and estrogenic activity of the biotransformation products. Bioresour. Technol. 102, 9409–15.

16.

Drozdová, A., Bojarová, P., Křenek, K., Weignerová, L., Henssen, B., Elling, L., Christensen, H., Jensen, H. H., Pelantová, H., Kuzma, M., et al. (2011) Enzymatic synthesis of dimeric glycomimetic ligands of NK cell activation receptors. Carbohydr. Res. 346, 1599–609.

112

17.

Bojarová, P., Slámová, K., Křenek, K., Gažák, R., Kulik, N., Ettrich, R., Pelantová, H., Kuzma, M., Riva, S., Adámek, D., et al. (2011) Charged Hexosaminides as New Substrates for β-N-Acetylhexosaminidase-Catalyzed Synthesis of Immunomodulatory Disaccharides. Adv. Synth. Catal. 353, 2409–2420.

18.

Rech, C., Rosencrantz, R. R., Křenek, K., Pelantová, H., Bojarová, P., Römer, C. E., Hanisch, F.-G., Křen, V. and Elling, L. (2011) Combinatorial One-Pot Synthesis of Poly-Nacetyllactosamine Oligosaccharides with Leloir-Glycosyltransferases. Adv. Synth. Catal. 353, 2492–2500.

19.

Cerna, I., Kluson, P., Bendova, M., Floris, T., Pelantová, H. and Pekarek, T. (2011) Intensification of the use of ionic liquids as efficient reaction co-solvents in asymmetric hydrogenations. Chem. Eng. Process. Process Intensif. 50, 264–272.

20.

Veselá, A. B., Franc, M., Pelantová, H., Kubác, D., Vejvoda, V., Sulc, M., Bhalla, T. C., Macková, M., Lovecká, P., Janů, P., et al. (2010) Hydrolysis of benzonitrile herbicides by soil actinobacteria and metabolite toxicity. Biodegradation 21, 761–70.

21.

Slámová, K., Gazák, R., Bojarová, P., Kulik, N., Ettrich, R., Pelantová, H., Sedmera, P. and Kren, V. (2010) 4-Deoxy-substrates for beta-N-acetylhexosaminidases: how to make use of their loose specificity. Glycobiology 20, 1002–9.

22.

Weignerová, L., Pelantová, H., Manglová, D., Michálková, K. and Křen, V. (2010) Condensation reactions catalyzed by α-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger yielding α-N-acetylgalactosaminides. Biocatal. Biotransformation 28, 150–155 .

23.

Floris, T., Kluson, P., Muldoon, M. J. and Pelantová, H. (2010) Notes on the Asymmetric Hydrogenation of Methyl Acetoacetate in Neoteric Solvents. Catal. Letters 134, 279–287.

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie

APLIKACE NMR SPEKTROSKOPIE V METABOLOMICE AUTOREFERÁT K DISERTAČNÍ PRÁCI

autor: studijní obor: vedoucí práce:

RNDr. Helena Pelantová analytická chemie prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.

Olomouc 2015

Summary This doctoral thesis is focused on the study of mouse models of obesity and diabetes using NMR-based metabolomics. At first, the three parameters of the experimental protocol were optimized in the set of 19 metabolites in real samples: urine collection protocol, pulse sequence for proton spectra acquisition, and normalization method. The 24h urine collection on mice with no access to food, followed by Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulse sequence for spectra acquisition and their normalization to the total spectral area was determined as the most advantageous in mouse models with induced obesity. Acquired NMR data were subsequently evaluated using the combination of multivariate statistical methods with parametric and nonparametric tests. The most significant metabolites were identified by comparison with spectral databases. NMR metabolomics applied in the model of monosodium glutamate (MSG) - induced obesity revealed numerous changes in urine of MSG-treated mice, mainly the altered metabolism of nicotinamide and polyamines, attenuated excretion of major urinary proteins, and fluctuating concentrations of allantoin, phenylacetylglycine, and methylamine. Altered levels of creatine, citrate, acetate, and succinate iterated to the values of control mice during aging. The development of obesity and insulin resistance at the age of six months was confirmed by biochemical parameters and manifested by changes in mRNA expressions of the corresponding enzymes in adipose tissue. Antidiabetic therapy with metformin, vildagliptin and their combination attenuated the levels of plasma glucose and reduced liver weight in mice with diet-induced obesity. Multivariate analysis of NMR data revealed substantial changes mainly in concentration of acylglycines, glucose, N-carbamoyl-β-alanine and N-methylnicotinamide metabolites. Correlation of significant metabolites with the results of glucose tolerance test indicated suitable markers of diabetes for this model. In this study N-carbamoyl-β-alanine was for the first time reported as a potential marker of diabetes. NMR-based metabolomics enabled us to evaluate the effectiveness of different therapies and the combined treatment has been identified as the most effective one. The results of these studies can contribute to our understanding of the molecular basis of obesity and diabetes and to possible optimization of therapeutic approaches.

Souhrn Předložená disertační práce se zabývá studiem myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky na vzorcích moči. V první části byly na sadě 19 metabolitů v reálných vzorcích optimalizovány tři parametry experimentálního protokolu: způsob odběru moči, pulsní sekvence pro snímání protonových spekter a způsob jejich normalizace. Pro myší modely s indukovanou obezitou se ukázal jako nejvýhodnější 24hodinový odběr moči bez přístupu k potravě, vzhledem k výskytu proteinů v myší moči následovaný Car-Purcell-Meiboom-Gill pulsní sekvencí a normalizací spekter na celkovou plochu. Takto naměřená NMR data byla v dalších studiích vyhodnocována kombinací metod multivariační statistické analýzy a parametrických i neparametrických testů; statisticky významné metabolity byly identifikovány srovnáním s databázemi spekter. NMR metabolomika na modelu obezity indukované glutamanem monosodným (MSG) prokázala četné změny v moči MSG myší, zejména změněný metabolismus nikotinamidu a polyaminů, sníženou sekreci močových proteinů a rozdíly v koncentracích allantoinu, methylaminu a fenylacetylglycinu. V průběhu stárnutí bylo pozorováno přiblížení hladin kreatinu, citrátu, acetátu a sukcinátu hodnotám kontrolních myší. Rozvoj obezity a insulinové rezistence byl ve věku šesti měsíců potvrzen biochemickými parametry a indikován také změnami expresí mRNA odpovídajících enzymů v tukové tkáni. Antidiabetická léčba metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací se u myší s dietou indukovanou obezitou projevila poklesem hladiny plasmatické glukosy a snížením hmotnosti jater. Multivariační analýza NMR dat identifikovala významné rozdíly především v hladinách N-karbamoylβ-alaninu, acylglycinů, glukosy a metabolitů N-methylnikotiamidu. Korelace těchto signifikantních metabolitů s biochemickými parametry označila vhodné markery diabetu pro tento model. Nejdůležitější z nich, N-karbamoyl-β-alanin, byl v této souvislosti jako potenciální biomarker popsán poprvé. NMR metabolomika umožnila také vyhodnotit efektivitu jednotlivých terapií; jako nejúčinnější potvrdila léčbu kombinovanou. Výsledky této práce mohou přispět k pochopení molekulární podstaty obezity a diabetu a posléze k optimalizaci účinných terapeutických postupů.

Obsah 1

Úvod ................................................................................................................................................1

2

Teoretická část .................................................................................................................................2

3

Cíle práce .........................................................................................................................................6

4

Experimentální část .........................................................................................................................7

5

4.1

Optimalizace experimentálního protokolu a charakterizace MSG modelu ..............................7

4.2

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou ......................................9

Výsledky a diskuse ........................................................................................................................12 5.1

Optimalizace experimentálního protokolu .............................................................................12

5.2

Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou ..........................................................16

5.3

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou ....................................25

6

Závěry ............................................................................................................................................34

7

Literatura .......................................................................................................................................36

1

Úvod

Metabolomika je relativně mladý obor, který vstoupil na scénu zhruba na přelomu tisíciletí [1,2]. K jejímu prudkému rozvoji došlo k době, kdy se pozornost vědců začala přesouvat od genomiky a proteomiky směrem k metabolitům. Je totiž zřejmé, že metabolom na rozdíl od genomu či proteomu dokáže lépe zaznamenat aktuální stav organismu. Na jeho složení se neprojevují pouze genetické predispozice, ale odráží také věk, výživu, životní styl, momentální fyziologický stav i všechny vlivy vnějšího prostředí. Rozvoj metabolomiky je podporován zejména jejím uplatněním v oblasti biomedicíny [3]. Sledování aktuálních metabolických procesů v organismu prostřednictvím současné detekce metabolitů umožňuje nejen lépe pochopit molekulární podstatu některých onemocnění, ale pomáhá hledat i jejich klinické a prognostické molekulární značky (markery). Současný biomedicínský výzkum se neobejde bez využití myších modelů [4], u kterých je možné velmi dobře kontrolovat jak jejich genetické pozadí, tak veškeré vnější podmínky, kterým jsou vystaveny. Tímto způsobem lze výrazně omezit variabilitu mezi vzorky a model přesně přizpůsobit na míru konkrétnímu studovanému problému. Protože se metabolomika zabývá studiem velmi komplexních a proměnlivých směsí, je zapotřebí zvolit takovou analytickou metodu, která by co nejlépe zvládla tuto diverzitu zachytit v plné šíři. Velká výhoda nukleární magnetické resonance spočívá zejména v její schopnosti detekovat současně látky odlišných fyzikálně-chemických vlastností, a to v různém koncentračním zastoupení. Je to metoda kvantitativní, robustní, s minimálními požadavky na úpravu vzorku. Může poskytnout kompletní spektrální data i od neznámých či neočekávaných sloučenin, proto je výborným nástrojem necílené metabolomické analýzy. Paralelní vyhodnocování velkého množství proměnných na početné sadě vzorků však vyžaduje specifické postupy multivariační statistické analýzy, které pomohou v obrovském objemu generovaných dat vyhledat pouze relevantní informace. Předkládaná disertační práce se věnuje studiu myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky. Nejprve bude optimalizován experimentální protokol s ohledem na specifické podmínky měření vzorků myší moči. V další části bude charakterizován metabolický stav modelu chemicky indukované obezity pomocí NMR dat získaných z moči a biometrických, biochemických a hormonálních parametrů. V poslední části práce bude na metabolickém profilu moči myší s dietou indukovanou obezitou studován vliv antidiabetické léčby metforminem a vildagliptinem s cílem porovnat vliv různých druhů terapie a nalézt potenciální markery diabetu pro tento model.

1

2

Teoretická část

Metabolomika je obor zabývající se kvalitativním i kvantitativním popisem všech metabolitů přítomných ve zkoumaném biologickém vzorku [2]. Metabolom je tedy komplexní směsí nízkomolekulárních látek různé chemické povahy a jeho složení je charakteristické pro daný genotyp, fyziologický stav nebo podmínky, kterým je organismus vystaven. Pro popis metabolomu používá metabolomika tři základní strategie: metabolomický otisk prstu (fingerprinting), metabolomické profilování a cílenou analýzu [2]. Data naměřená vhodnou technikou se vyhodnocují metodami vícerozměrné statistické analýzy. Zkoumané metabolity jsou ve vzorcích identifikovány a kvantifikovány většinou na základě srovnání naměřených spekter s knihovnou nebo databází spekter čistých látek. V současné metabolomice jsou preferovány dvě základní analytické platformy: nukleární magnetická resonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie (MS) [5–7]. MS analýza většinou vyžaduje před separační krok, proto bývá spojována s některou ze separačních metod: s kapilární elektroforézou (CE-MS) [8,9] nebo metodami chromatografickými: s plynovou (GC-MS) [10–12], ovšem častěji s kapalinovou (LC-MS) [13,14], vysokoúčinnou kapalinovou (HPLC-MS) [15,16] nebo ultra účinnou kapalinovou (UPLC-MS) chromatografií [17–19]. Největší předností MS metod je jejich vysoká citlivost, zařazení separačního kroku naopak poněkud omezuje diverzitu měřených látek. Hlavní výhodou NMR spektroskopie je možnost měřit vzorky s pouze minimální úpravou bez předchozí separace, rychlost, dobrá reprodukovatelnost experimentů [20] a především kvantitativnost. Na druhou stranu je NMR velmi málo citlivou metabolomickou technikou, s citlivostí o několik řádů menší než MS [21]. Tato zásadní nevýhoda NMR je postupně překonávána vylepšením instrumentace: přechodem k vyšším magnetickým polím, zavedením chlazených sond (kryosond) [22] a postupným rozvojem mikrosond [23,24].

NMR metabolomická analýza moči Moč představuje vůbec nejkomplexnější a co do složení zřejmě nejvariabilnější směs metabolitů s minimálními nároky na úpravu vzorku [25–27]. Existuje řada protokolů a studií, zabývajících se odběrem, skladováním a další úpravou vzorků moči [28–32]. K odebraným vzorkům se přidává NaN3 pro zabránění růstu bakterií, někdy jsou již přímo po odběru centrifugací odstraněny nerozpustné částečky a zbytky buněk [30]. Před vlastní NMR analýzou je regulováno pH vzorků nejčastěji pomocí fosfátového pufru. Výsledné vzorky upraveny tak, aby obsahovaly H2O a D2O v poměru 9:1. Metabolický fingerprinting vyžaduje robustní a rychlé experimenty pro režim s vysokou průchodností, z tohoto důvodu většina aplikací spoléhá pouze na 1D protonové experimenty. Vhodnou metodou je nutné potlačit signál vody [33]. Nejjednodušší a nejčastěji používaná je presaturace; další varianty potlačení signálu vody jsou shrnuty v přehledném článku [34]. Základním experimentem ve vzorcích moči je 1D-NOESY experiment s presaturací během relaxační prodlevy a směšovacího času [35]. Případné signály vysokomolekulárních látek jsou ze spekter odstraněny za základě jejich kratších relaxačních časů T2. Typickým schématem je Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulsní sekvence [36,37], začleněná do standardní 1D pulsní sekvence s presaturací rozpouštědla. J-rozlišený experiment [38] je jediným 2D experimentem, který bývá rutinně zařazen do metabolomické analýzy. Jeho 1D projekce poskytuje jednodušší spektra, kde každý signál odpovídá pouze singletu. Předúprava dat Předúprava dat („preprocessing“) zahrnuje procedury, které jsou nezbytné pro transformaci NMR spekter do podoby vhodné k dalšímu statistickému zpracování. Mnohé z těchto funkcí jsou 2

integrovány jako součásti softwarových balíčků [39–43]. Spektrům získaným na základě Fourierovy transformace je nejprve nutno opravit fázi a základní linii spektra (baseline) [44]. Drobné změny v chemických posunech jednotlivých signálů lze potlačit některým z matematických algoritmů pro synchronizaci píků („peak alignment“) [45,46] nebo pomocí tzv. „binningu“, který zároveň významně snižuje dimenzionalitu dat [47]. Spočívá v rozdělení spekter na malé úseky (biny), pro každý bin je vypočítán integrál jeho spektrální oblasti a tato hodnota potom představuje novou proměnnou. V NMR metabolomice se nejčastěji používá ekvidistantní binning s typickou šířkou 0,04 ppm. Problém artefaktů vzniklých rozštěpením signálů mezi sousední biny lze řešit zavedením vylepšených binningových metod [48–52]. Výsledkem binningu je matice dat, ve které každý řádek odpovídá jednomu spektru a každý sloupec jedné proměnné (binu). Normalizace je operace na řádcích matice, která potlačuje nežádoucí rozdíly mezi vzorky a umožňuje tak jejich přímé srovnávání [53,54]. K dispozici je několik normalizačních metod [55,56], nejčastěji používaná je normalizace na celkovou plochu spektra nebo novější metoda pravděpodobnostní kvocientové normalizace (PQN) [57]. Dalším možným řešením je u biomedicínských studií normalizace na signál kreatininu [26,27,58,59]. Standardně používané statistické metody většinou předpokládají normální (Gaussovo) rozdělení výchozích dat, proto se u biologických dat někdy provádí logaritmická nebo mocninná transformace, která jejich původně zešikmenou distribuci přibližuje Gaussovu rozdělení [60]. Škálování je matematická operace prováděná na sloupcích matice dat [54,60], která vyrovnává odlišný vliv různě koncentrovaných metabolitů na celkové výsledky statistických modelů. Data se centrují odečtením průměru („mean centering“). Autoškálování [61] („unit variance scaling“) škáluje centrované signály na jednotkový rozptyl vydělením hodnoty sloupce směrodatnou odchylkou. „Range scaling“ využívá jako škálovací faktor biologický rozsah. V NMR metabolomice je pravděpodobně nejrozšířenější Pareto škálování [62], kde se hodnota binu dělí odmocninou ze směrodatné odchylky. Multivariační statistická analýza V metabolomice paralelně sledujeme a vyhodnocujeme velké množství proměnných. Konečným cílem analýzy je najít a popsat vztah mezi metabolickým složením vzorku a stavem organismu a identifikovat ty metabolity, které jsou za studovaný stav přímo odpovědné. Statistika poskytuje pro tyto účely celou řadu metod [63–66], které lze rozdělit do dvou základních skupin. „Unsupervised“ metody nepředpokládají žádnou předchozí informaci o struktuře dat a pomáhají především vizualizovat původně komplexní data tak, aby bylo v nich možno sledovat potenciální trendy a shlukování a identifikovat odlehlé hodnoty. Nejpoužívanější metodou je analýza hlavních komponent (Principal component analysis – PCA). Ta redukuje mnohorozměrný prostor experimentálních proměnných do jednoduššího modelového prostoru hlavních komponent (PC). Výsledky PCA jsou vizualizovány pomocí dvou matic známých jako skóre (score) a zátěže (loadings). Z dalších „unsupervised“ metod lze ještě zmínit například shlukovou analýzu („cluster analysis“, CA), která vytváří z objektů v multidimezionálním prostoru shluky (klastry) na základě jejich vzdálenosti, měřené určitým předem definovaným způsobem [63]. „Supervised“ metody jsou naproti tomu metodami klasifikačními, takže dopředu vyžadují informaci o charakteru vzorku. Nejčastěji se v metabolomice při klasifikaci využívá diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (metoda PLS-DA). Při tomto postupu se hledá vztah mezi maticí původních proměnných (binů) a odezvou, popisující klasifikaci vzorků. Protože však algoritmus často dokáže najít vazbu mezi výchozími vzorky a odezvou nehledě na to, jestli takový vztah v datech reálně existuje, každý PLS-DA model vyžaduje důkladnou validaci. Metabolomické studie nejčastěji používají metody křížové validace („cross-validation“) [67,68]. jejichž výsledky je ovšem třeba přijímat s opatrností [69] a doporučuje se doplnit je permutačním testem [68,70]. Výsledky PLS-DA modelu bývají opět znázorněny pomocí score plotu a jedno- či dvourozměrného 3

loading plotu. Dalším užitečným nástrojem vizualizace dat je takzvaný S-plot, ve kterém nezávislou proměnnou představuje hodnota loadingu příslušného binu a závislou proměnnou je jeho korelační koeficient. Jiným způsobem interpretace výsledných dat je takzvané Variable importance (VIP) skóre [71].

NMR metabolomika při studiu obezity a diabetu – využití myších modelů Obezita je v současnosti považována za onemocnění s komplexní etiologií a patogenezí, na kterém se podílejí jak genetické faktory, tak vliv prostředí i životního stylu včetně způsobu stravování [72]. Představuje významné zdravotní riziko, neboť je spojena s řadou dalších chorob, jako je insulinová rezistence a diabetes mellitus 2. typu (T2DM), kardiovaskulární onemocnění či některé typy nádorových onemocnění [73]. Strategie založená na NMR spektroskopii v kombinaci s multivariační statistickou analýzou se ukázala jako užitečný nástroj k uchopení obezity na metabolické úrovni [74–76]. NMR a MS metabolomika odhalila v souvislosti s obezitou a diabetem četné změny především v metabolismu mastných kyselin, aminokyselin, sacharidů, citrátového cyklu, žlučových kyselin a cholinových intermediátů [77]; současné poznatky jsou shrnuty v mnoha přehledných článcích, například [72,77–79]. Při studiu obezity a s ní spojených komplikací se výborně uplatňují vhodné zvířecí modely [4,80– 84]. V myších modelech je již v horizontu týdnů či několika měsíců možné pozorovat změny, které by v lidském organismu probíhaly v řádu několika let. Dobře definované genetické linie i kontrola vnějších podmínek, kterým je model vystaven, umožňují zmenšit nežádoucí variabilitu ve skupinách a omezit počet vzorků nezbytných pro relevantní statistické vyhodnocení. Myší modely obezity lze rozdělit podle způsobu jejího vzniku do několika základních skupin: modely s obezitou vzniklou spontánní genetickou mutací nebo cíleným vyřazením určitého genu a modely s obezitou vyvolanou chirurgickým zásahem, chemicky či potravou [85–88]. Často používanými monogenními modely jsou myši s mutacemi v leptinové dráze, například ob/ob myši se spontánní mutací v leptinové dráze [85,88], db/db myši s mutací leptinového receptoru v hypothalamu [85,89] nebo s/s myši, u nichž je poškozen pouze jeden z transkripčních faktorů leptinové signalizační dráhy [88]. NMR metabolomika v moči a séru na ob/ob myším modelu [90] ukázala signifikantní rozdíly v hladinách několika desítek metabolitů ve srovnání se štíhlými C57BL/6J kontrolami. Roberts a kol. studovali na tomto modelu pomocí NMR a MS roli PPAR γ a δ (receptorů aktivovaných proliferátory peroxisomů) při regulaci insulinové sensitivity [91]. V komplexní studii srovnávající metabolismus lidí, diabetických Zucker fatty potkanů a db/db myší [92] byla využita NMR metabolomika v moči s následnou multivariační statistickou analýzou; pozorovány byly především změny v citrátovém cyklu a metabolismu methylaminu a nukleotidů. Porovnání metabolického profilu moči db/db myší se štíhlými kontrolami odhalilo zvýšenou aktivitu citrátového cyklu a utlumení metabolismu větvených aminokyselin [93]. Saadat a kol. [94] detekovali v NMR spektrech moči db/db a s/s modelů rozdíly v metabolismu glycinu, serinu a homocysteinu. Obezita vyvolaná podkožními injekcemi L-glutamanu monosodného (MSG) novorozeným myším představuje užitečný model chemicky indukované obezity a insulinové rezistence [95,96]. Podávání MSG vede k poškození většiny neuronů v nucleus arcuatus (ARC) [97], zatímco ostatní jádra v hypothalamu zůstávají nedotčena [98,99]. MSG myši mají narušený cyklus příjmu potravy [100,101] a rozvíjí se u nich adipozita [102], ačkoliv mají snížený příjem potravy v porovnání se štíhlými kontrolami [103]. Dalšími rysy, kterými se MSG model podobá lidské obezitě, jsou hyperinsulinemie a insulinová rezistence [104]. Na druhou stranu hladiny glukosy u obézních MSG samců zůstávají i přes detekovanou hyperinsulinemii celkem v normě [105]. MSG myši jsou tak 4

vhodným modelem obezity kombinované s insulinovou rezistencí avšak bez projevů diabetu. Přestože biochemickou charakterizací MSG modelu se postupně zabývalo několik skupin autorů [105–107], na úrovni metabolomiky nebyl tento model dosud popsán. K vyvolání obezity se často využívá podávání potravy s vysokým obsahem tuku (HF) vhodným kmenům experimentálních zvířat [85]. Pro dobrou charakterizaci modelu dietou indukované obezity (DIO) je důležitý přesný popis složení HF diety [86]. K navození dietou indukované obezity u myší a měření insulinové rezistence a senzitivity byl vytvořen a publikován protokol [108]. Protože obezita se v DIO modelu rozvíjí postupně, jak jsou myši krmeny vysokotukovou dietou, a průběžně se také snižuje fyzická aktivita zvířat, je tento model velmi podobný lidské obezitě vyvolané nevhodným stravováním v kombinaci se sedavým způsobem života. Jako nejvhodnější pro rozvoj metabolického syndromu se jeví kmen C57BL/B6, u kterého se vyvíjí mnoho lidem podobných patologických rysů, jako např. viscerální obezita, insulinová rezistence, hyperleptinemie a hyperinsulinemie [109–111]. Při prvním pokusu o metabolomickou charakterizaci C57BL/B6 DIO modelu potvrdil Shearer a spol. [112], že metabolomické profilování vzorků plasmy je vhodný diagnostický nástroj k detekci insulinové rezistence vyvolané DIO. Při studiu na témže modelu se ukázalo, že výsledný metabolický profil plasmy výrazně ovlivní změna diety týden před odběrem více než předchozích 12 týdnů nízkotukové (LF) či HF stravy [113]. Dále byl sledován vliv cvičení různé intenzity na metabolický profil myší plasmy a byl porovnáván s vlivem HF a LF diety [114]. První NMR metabolomickou studii na moči C57BL/6 kmenu provedl Jung a kol. [115]. Pomocí PCA byly srovnány metabolické profily moči myší krmené HF a vysokosacharidovou (HC) dietou. Vliv HF diety se projevil především zvýšenou hladinou metabolitů nikotinamidu, zatímco HC strava aktivovala citrátový cyklus (nárůst citrátu a sukcinátu). Podrobnější studie dietou indukované obezity na myších kmene C57BL/6 se kromě vlivu diety na složení moči zaměřila i na charakterizaci myší, které na HF dietu reagovaly výrazně či naopak téměř vůbec [116]. Ačkoliv rozvoj obezity a diabetu byl u myší modelů na metabolické úrovni často popsán, v literatuře se téměř nevyskytují práce, které by na takto zavedených modelech pomocí NMR metabolomiky sledovaly průběh antidiabetické léčby. Jedinou studií, týkající se metabolomiky moči, je publikace Zhu a kol., mapující vliv metforminové terapie na DIO myším modelu pomocí UPLC-TOF/MS [19]. Autoři po dobu 16 týdnů sledovali tři skupiny C57BL/6 myší: na standardní dietě, na HF dietě a na HF dietě s metforminovou léčbou. Statistická analýza dat na konci pokusu označila 21 pravděpodobných biomarkerů, které se vztahovaly především ke změněnému metabolismu citrátového cyklu, aminokyselin a mastných kyselin. Zatímco metformin je široce akceptován jako lék první volby pro všechny pacienty s diabetem 2. typu, stále chybí dostatečné informace o optimální volbě léčby druhé linie, která by se kombinovala s metforminem u pacientů s neuspokojivou kompenzací diabetu [117]. V posledních letech byly uvedeny do praxe nové antidiabetické terapie založené na modulaci hladiny endogenních inkretinových hormonů (GLP-1, glucagon-like peptid 1) nebo stimulaci jeho receptorů [118]. Protože GLP-1 je v organismu velmi rychle deaktivován dipeptidyl peptidasou 4 (DPP-4), jednou z možností je využít k léčbě inhibitory DPP-4, takzvané gliptiny, mezi něž patří i vildagliptin [119]. Přestože podávání metforminu i vildagliptinu patří k zavedeným terapeutickým postupům, mechanismus jejich účinku není doposud plně objasněn [120,121].

5

3

Cíle práce

Náplní předkládané disertační práce je studium myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky moči. Vlastní práce má tři dílčí cíle: 1. Optimalizace experimentálního protokolu NMR analýzy moči u myších modelů Pro NMR experimenty v moči sice existuje doporučený postup, univerzální protokol ale nemusí vyhovovat specifickým myším vzorkům. Cílem této části práce bylo na myším modelu obezity ověřit volbu těch faktorů, které zásadním způsobem ovlivní kvalitu výsledných dat: způsobu odběru vzorků moči, volbu pulsní sekvence pro snímání protonových spekter a způsobu normalizace naměřených dat. 2. Charakterizace metabolického stavu modelu myší s chemicky indukovanou obezitou Ačkoliv byl model myší s obezitou indukovanou L-glutamanem monosodným (MSG) v literatuře vícekrát popsán a použit, neexistuje doposud žádná práce zabývající se MSG modelem z pohledu metabolomiky. Cílem bylo charakterizovat tento model obezity pomocí NMR metabolomiky moči a získaná data porovnat s biometrickými, biochemickými a hormonálními parametry. 3. Metabolické profilování moči myší s dietou indukovanou obezitou a diabetem, léčených metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací Model myší s dietou indukovanou obezitou (DIO) je pro svoji podobu s lidskou obezitou často používán. Cílem této části práce bylo sledovat na metabolickém profilu DIO myší vliv tří variant antidiabetické léčby, srovnat efektivitu jednotlivých terapií a pokusit se označit vhodné markery diabetu pro tento model.

Některé části teoretického úvodu práce jsou volně upraveny podle publikované kapitoly: Pelantová, H., Bártová, S., Kuzma, M. (2014) Advanced Techniques for NMR Analysis of Complex Biological Mixtures—From Simple NMR to Hyphenated Techniques. In Natural Products Analysis: Instrumentation, Methods, and Applications (Havlíček, V., and Spížek, J., eds.), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, 239–284 Výsledky optimalizace NMR analýzy moči (cíl 1) byly publikovány v práci: Pelantová, H., Bugáňová, M., Anýž, J., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Haluzík, M. and Kuzma, M. (2015) Strategy for NMR metabolomic analysis of urine in mouse models of obesity- from sample collection to interpretation of acquired data. J. Pharm. Biomed. Anal. 115, 225–35. Výsledky charakterizace MSG modelu (cíl 2) byly publikovány v práci: Pelantová, H., Bártová, S., Anýž, J., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Novák, D., Lacinová, Z., Šulc, M., Haluzík, M., et al. (2015) Metabolomic profiling of urinary changes in mice with monosodium glutamate-induced obesity. Anal. Bioanal. Chem. DOI 10.1007/s00216-015-9133-0 Výsledky studie vlivu antidiabetik (cíl 3) jsou citovány z připravovaného rukopisu: Pelantová, H., Bugáňová, M., Šedivá, B., Holubová, M., Železná, B., Maletínská, L., Zemenová, J., Sýkora, D., Lacinová, Z., Kaválková, P., Haluzík, M., Kuneš, J., Kuzma, M,: Urinary metabolic profile in mice with diet-induced obesity and type 2 diabetes mellitus after treatment with metformin and vildagliptin, pro časopis Endocrinology

6

4 4.1

Experimentální část Optimalizace experimentálního protokolu a charakterizace MSG modelu

Experimentální zvířata a odběr vzorků moči Studie byla prováděna na modelu outbredních NMRI myší (Charles River, Sulzfeld, Německo). Pro vyvolání obezity byl novorozeným myším samcům podkožně injikován L-glutaman monosodný (MSG – Sigma, St. Louis, USA) v dávce 4 mg/g tělesné váhy podle postupu Maletínské a kol. [103]. Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Myši byly chovány v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů Akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2 °C a rytmu světlo/tma 12/12 hodin (začátek světla 6:00) s volným přístupem k pitné vodě. Krmeny byly standardní dietou St-1 (Mlýn Kocanda, Jesenice, ČR), která obsahovala 66 % sacharidů, 25 % proteinů a 9 % tuků a jejíž energetická hodnota byla 3,4 kcal/g. Kromě myší s chemicky indukovanou dietou (MSG skupina) byly za stejných experimentálních podmínek chovány i kontrolní samci NMRI myší. V metodické části byla odebrána MSG a kontrolním myším ve věku 2 měsíců (počet myší na skupinu n = 10) moč pomocí tří různých odběrových protokolů. Přímý odběr ranní moči byl proveden v 8 h ráno jemným tlakem na břicho (protokol A). Pro 24hodinový odběr moči byly myši umístěny jednotlivě do metabolických klecí (Tecniplast, Itálie) s volným přístupem k vodě, a to buď bez přístupu k potravě (protokol B) nebo s volným přístupem k potravě (protokol C). K odebraným vzorkům byl přidán NaN3 pro zabránění bakteriální infekce a do NMR analýzy byly uchovávány při -80 °C. Pro metabolomickou charakterizaci MSG modelu byla odebrána moč MSG a kontrolním myším také ve věku 6 a 9 měsíců podle výše popsaného protokolu B. Ve dvou, šesti a devíti měsících věku byly hladové MSG obézní myši a jim odpovídající kontroly (10 zvířat ve skupině) usmrceny dekapitací. Z plné krve byla připravena plasma, která byla uchována při -80 °C. Myším byla odebrána bílá tuková tkáň (WAT, tj. podkožní SCAT a intraperitoneální IPAT), hnědá tuková tkáň (BAT) a játra. Tkáně byly zváženy, zmrazeny v kapalném dusíku a do RNA extrakce uchovány při -70 °C. Míra adipozity byla vyjádřena jako poměr hmotnosti tukové tkáně a celkové tělesné hmotnosti. Biochemické experimenty pro charakterizaci modelu Intraperitoneální glukosový toleranční test, stanovení hormonálních a biochemických parametrů Šestiměsíční MSG myši a jejich kontroly byly ponechány přes noc bez přístupu k potravě. Ráno byla změřena bazální glukosa (odběrem krve z ocasu) glukometrem (Glucocard, Arkray, Kyoto, Japonsko). Poté byl myším injikován intraperitoneálně roztok glukosy rozpuštěné ve fyziologickém roztoku a v čase 0, 15, 30, 60, 90, 120 a 180 minut po injekci byla měřena hladina glukosy v krvi. Plasmatické hladiny insulinu byly stanoveny pomocí RIA kitů (Millipore, St. Charles, MI, USA a Linco Research, St. Charles, MI, USA), plasmatické hladiny leptinu pomocí ELISA kitu (Millipore, St. Charles, MI, USA). Hladiny glukosy byly měřeny glukometrem Glucocard. Všechna stanovení provedla v souladu s protokoly doporučenými výrobci Mgr. Martina Holubová, Ph.D., z výzkumné skupiny Antiobezitních peptidů ÚOCHB AVČR. Stanovení exprese mRNA v tukové tkáni a v játrech Exprese mRNA byly stanoveny u šestiměsíčních myší. Vzorky tukové tkáně a jater byly zpracovány podle dříve publikovaného postupu [122]. Byly sledovány exprese následujících genů: nikotinamid-N-methyltransferasa (NNMT) v játrech, IPAT, SCAT a BAT, receptory aktivované proliferátory peroxisomů PPARα a PPARγ (IPAT, SCAT, BAT), adiponektin, leptin (IPAT, SCAT) a hlavní močový protein 1 (MUP-1) v játrech. Experimenty byly prováděny na přístroji ABI PRISM 7

7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Jako vnitřní standard byl použit β2-mikroglobulin (B2M), při expresi NNMT navíc ještě glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa (GADPH) a betaglukuronidasa (GUSB). Exprese mRNA stanovily RNDr. Zdena Lacinová a M. Čechová v Laboratoři molekulární diabetologie a obezitologie na 3. interní klinice 1. Lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Stanovení proteinů v moči Koncentrace proteinů v moči byla stanovena pomocí reakce s bicinchoninovou (2,2´-bichinolin4,4´-dikarboxylovou) kyselinou (Sigma) [123]; jako standard pro sestrojení kalibrační křivky byl použit hovězí sérový albumin (Sigma). Stanovení provedl doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D., z Laboratoře charakterizace molekulární struktury Mikrobiologického ústavu AVČR.

NMR experimenty Před vlastní NMR analýzou byly vzorky ponechány volně rozmrznout při pokojové teplotě a poté byly odstředěny při 12 000 rpm po dobu 5 minut. 200 µl supernatantu bylo zředěno 340 µl destilované vody a smícháno s 60 µl fosfátového pufru (1,5 M KH2PO4 v D2O obsahující 2 mM NaN3 a 0,1% TSP, pH 7,4). Výsledný vzorek, obsahující H2O a D2O v poměru 9 : 1, byl přenesen do standardní 5mm NMR kyvety. Přímo odebíraná moč (protokol A) a jeden alikvot vzorku podle B protokolu byly měřeny v 3mm NMR kyvetách naplněných 50 µl supernatantu a 150 µl zředěného fosfátového pufru. Všechny NMR experimenty byly naměřeny při teplotě 300 K na 600 MHz spektrometru Bruker Avance III vybaveném 5mm TCI kryosondou a software Topspin 3.2 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Německo). Pro každý vzorek bylo v automatickém režimu provedeno naladění pozorovacího kanálu sondy i homogenity magnetického pole a byla automaticky nakalibrována délka sklápěcího 90° pulsu. 1D-NOESY spektra (standardní pulsní sekvence firmy Bruker noesygppr1d) byla snímána s následujícími parametry: počet skenů NS = 32 (NS = 64 v 3 mm kyvetách), počet datových bodů TD = 64k, šířka spektra SW = 20 ppm. Signál vody byl potlačen v průběhu relaxační prodlevy 4 s a směšovacího času 100 ms pomocí 25 Hz saturačního pulsu umístěného do středu signálu vody. CPMG spektra s presaturací (pulsní sekvence cpmgpr1d) byla naměřena s parametry: NS = 64, TD = 64k, SW = 20 ppm, relaxační prodleva 4 s s presaturací signálu vody, echo 0,3 ms, smyčka pro T2 filtr 126. Krátký 2D J-rozlišený experiment s presaturací (pulsní sekvence jresgpprqf, NS = 2, SW = 16 ppm, TD = 8k, počet inkrementů NI = 40, SW v nepřímé dimenzi 78.125 Hz, relaxační prodleva s presaturací 2 s) sloužil pro lepší identifikaci metabolitů a také jako dodatečný zdroj dat pro vícerozměrnou statistickou analýzu. Signály volně doznívající indukce (FIDy) byly zváženy pomocí umělého rozšíření čáry (line broadening 0,3 Hz). Spektrům byla automaticky upravena fáze a základní linie a byla referencována na signál TSP (0,00 ppm). U vybraných vzorků byl naměřen také COSY a HMQC experiment s presaturací. Analýza NMR dat Metabolity byly identifikovány porovnáním 1D protonových spekter (1D-NOESY nebo CPMG) s databázemi Chenomx NMR Suite 7.6 (Chenomx Inc., Edmonton, Kanada), BBIOREFCODE 2-0-3 (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Německo) a s dříve publikovanými spektrálními daty. Před vlastní multivariační statistickou analýzou byla spektra v rozsahu -1,00 – 10,00 ppm rozdělena na pravidelné biny se šířkou 0,04 ppm, přičemž byly vyloučeny úseky odpovídající signálu vody (4,68-4,90 ppm), močoviny (5,65-5,90 ppm) a TSP (-0,12-0,12 ppm). Pro kompenzaci různého zředění výchozích vzorků moči byly použity tři způsoby normalizace: normalizace na celkovou plochu spektra, pravděpodobnostní kvocientová normalizace a normalizace na signál kreatininu. Aby se předešlo rozštěpení důležitých signálů mezi sousední biny a tím zkreslení jejich intenzit, byly v rámci 8

binningu připraveny 4 matice dat s šířkou binu 0,04 ppm, vzájemně posunuté o 0,01 ppm, takže každý studovaný signál mohl být umístěn do středu vhodného binu. PCA analýza byla provedena pomocí standardního algoritmu [124] v programu MATLAB, data byla předem centrována odečtením průměru a Pareto škálována dělením odmocninou ze směrodatné odchylky. Následně byla provedena standardní PLS-DA analýza se stejným centrováním a škálováním dat jako v případě PCA. Kvalita jednotlivých modelů a volba správného počtu hlavních komponent byla posouzena „leave-one-out“ (LOO) křížovou validací; testované modely byly hodnoceny pomocí podílu vysvětleného a predikovaného rozptylu R2 a Q2. Vybraná skupina devatenácti metabolitů, na které byl studován vliv jednotlivých experimentálních parametrů, byla dále analyzována pomocí Studentova t-testu, aby bylo možné pro dané biny vyhodnotit signifikanci detekovaných změn. Při charakterizaci MSG modelu byly v PLS-DA modelech myší ve věku 2, 6 a 9 měsíců z příslušných s-plotů odečteny významné biny s korelačním koeficientem > 0,5 a loading faktorem > 0,05. Každý signál, odpovídající signifikantnímu binu určenému podle těchto modelů, pak byl situován doprostřed vhodného 0,04 ppm širokého binu, vybraného ze čtyř výše popsaných vzájemně posunutých datových matic, a podroben Studentovu t-testu.

4.2

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou

Experimentální zvířata a odběr vzorků moči Myší samci inbredního kmene C57BL/6 (Charles River, Sulzfeld, Německo) byli od tří týdnů věku chováni v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů Akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2 °C, relativní vlhkosti 45-65 % a stabilním rytmu denního světla (6-18h), 5 myší v kleci. Se zvířaty bylo zacházeno podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon č. 246/1992 Sb.). Myši měly volný přístup k vodě a byly krmeny standardní dietou ssniff® R/M-H, které obsahovala 33 % proteinů, 9 % tuků a 58 % sacharidů (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Německo). Od 8 týdnů věku byla zvířata pro vyvolání obezity krmena vysokotukovou (HF) dietou složenou ze 40 % standardní diety doplněné 34 % sušeného mléka (Sunar), 25 % vepřového sádla a 1 % kukuřičného škrobu [125]. Energetický obsah diety byl tvořen ze 13 % proteiny, z 27 % sacharidy a z 60 % tuky; její energetická hodnota činila 5,3 kcal/g (energetická hodnota standardní diety byla 3,4 kcal/g). Po šesti týdnech konzumace HF diety byla zahájena perorální aplikace antidiabetických látek, přičemž stále pokračovalo podávání HF stravy. Myší samci byli rozděleni do čtyř experimentálních skupin, každá čítala na začátku pokusu 10 zvířat: A. voda, B. metformin v denní dávce 250 mg/kg tělesné hmotnosti myši, C. vildagliptin 20 mg/kg/den, D. metformin 250 mg/kg/den + vildagliptin 20 mg/kg/den. Antidiabetika byla rozpuštěna v pitné vodě. Dávkování bylo průběžně upravováno podle objemu spotřebované vody, monitorovaného každý týden. Kromě uvedených experimentálních skupin byla vytvořena ještě kontrolní LF („low fat“) skupina z 10 samců, kteří byli po celou dobu experimentu stále krmeni pouze standardní dietou. Všem myším byla v průběhu experimentu monitorována každý týden tělesná hmotnost v intervalech vyznačených ve schématu experimentu. Pro odběr moči na metabolomickou analýzu byly myši umístěny samostatně do metabolických klecí (Tecniplast, Itálie) s volným přístupem k vodě a bez přístupu k potravě, moč byla sbírána přes noc (17h-8h). Moč byla během experimentu odebrána celkem čtyřikrát: před začátkem podávání vysokotukové diety, před zahájením antidiabetické léčby, po dvou týdnech terapie a na konci 9

experimentu. K vzorkům byl přidán NaN3 pro zabránění bakteriální infekce a až do NMR analýzy byly uchovávány při -80 °C.

Obr. 1 Schéma uspořádání experimentu antidiabetické léčby

Biochemické experimenty Orální glukosový toleranční test, stanovení hormonálních a biochemických parametrů Orální glukosový toleranční test (OGTT) byl proveden v 50.–52. dni experimentu na myších, které byly ponechány přes noc bez přístupu k potravě. V 9h ráno byla změřena v čase 0 bazální glukosa (odběrem krve z ocasu) glukometrem (Glucocard, Arkray, Kyoto, Japonsko). Poté byl myším podán orálně roztok glukosy a glukosa byla měřena z plné krve v čase 15, 30, 60, 90, 120 a 180 minut po injekci. Plasmatické hladiny insulinu byly stanoveny pomocí RIA kitů (Millipore, St. Charles, MI, USA) a plasmatické hladiny leptinu pomocí ELISA kitu (Millipore, St. Charles, MI, USA). Hladiny glukosy byly měřeny glukometrem Glucocard. Plasmatické hladiny triglyceridů byly stanoveny kvantitativní enzymatickou reakcí (Sigma, St. Louis, USA) a hladiny volných mastných kyselin (FFA) kolorimetricky (Roche, Mannheim, Německo). Všechna stanovení provedla v souladu s protokoly doporučenými výrobci Mgr. Martina Holubová, Ph.D., z výzkumné skupiny Antiobezitních peptidů ÚOCHB AVČR. Stanovení koncentrace antidiabetických léčiv v plasmě Po dvou týdnech antidiabetických intervencí byly odebrány vzorky krve na stanovení koncentrace antidiabetik v krvi. Plasmatické koncentrace metforminu a vildagliptinu byly stanoveny LC-MS analýzou na systému tvořeném kapalinovým chromatografem Dionex Ultimate 3000 UHPLC a hmotnostním spektrometrem AB Sciex 3200 QTRAP. Stanovení léčiv provedla Ing. Jana Zemenová na Ústavu analytické chemie VŠCHT Praha. MRM metodu pro kvantifikaci metabolitů vyvinul doc. RNDr. Dr. David Sýkora tamtéž.

NMR experimenty a analýza NMR dat Vzorky moči pro NMR analýzu byly připraveny způsobem popsaným pro MSG model. Protonová spektra snímána CPMG pulsní sekvencí s presaturací (cpmgpr1d v katalogu Bruker). Pro lepší identifikaci metabolitů byl zařazen krátký 2D J-rozlišený experiment s presaturací (jresgpprqf). Všechny experimentální procedury včetně nastavení parametrů jednotlivých pulsních sekvencí se shodují s postupem uvedeným pro MSG model. Spektra v rozsahu 0,10-10,00 ppm byla v programu AMIX rozdělena na 0.04 ppm široké biny. Ze spekter byly odstraněny úseky odpovídající signálu vody (4,60-4,90 ppm), močoviny (5,606,00 ppm) a metforminu (3,04-3,08 ppm). Binovaná spektra byla dále zpracovávána v programu

10

MetaboAnalyst [126,127]. Pro kompenzaci vlivu různého ředění odebraných vzorků moči byla spektra nejprve normalizována na celkovou plochu. PCA analýza, provedená na centrovaných a Pareto škálovaných spektrech, sloužila k lepší vizualizaci seskupení spekter a k detekci odlehlých hodnot. Pro každou variantu antidiabetické léčby byly na základě vzorků odebraných po dvou a sedmi týdnech terapie vytvořeny PLS-DA modely. Kvalita modelů a počet postačujících hlavních komponent byly určeny pomocí LOO křížové validace; modely byly hodnoceny pomocí podílu vysvětleného a predikovaného rozptylu R2 a Q2. Validace modelů byla doplněna ještě permutačními testy s 2000 permutacemi. Výsledky PLS-DA modelů agregované ve Variable Importance Projection (VIP) score jednotlivých binů byly využity při identifikaci binů nejvíce přispívající k rozdělení skupin léčených a kontrolních myší. V úvahu bylo vzato prvních 30 binů, jejichž VIP skóre bylo větší než 1,5. Aby byla určena statistická významnost detekovaných metabolických změn, všechna binovaná spektra byla analyzována Studentovým t-testem a také neparametrickým Wilcoxon-Mann-Whitney testem; jako statisticky významné byly vybrány ty, které měly v obou testech p-hodnotu < 0,05. Významné biny určené jak z PLS-DA modelů, tak z parametrického i neparametrického testu byly přiřazeny k odpovídajícím metabolitům. Přiřazení bylo dosaženo srovnáním protonových spekter s databázemi Chenomx NMR Suite 7.6, BBIOREFCODE 2-0-3 a HMDB [128], a také s dříve publikovanými spektrálními daty. Identifikace byla dále podpořena J-rozlišenými a COSY experimenty a potvrzena hodnotami chemických posunů uhlíků, odečtených z HMQC spektra. Aby se eliminovalo rozštěpení signálů mezi sousední biny a zároveň se zpřesnila jejich kvantifikace, byla všechna spektra znovu binována se šířkou binu 0,01 ppm. Plochy signálů všech významných metabolitů, odečtených v PLS-DA pomocí VIP skóre a označených v parametrickém i neparametrickém testu, byly vyjádřeny jako součet vhodného počtu sousedících 0,01 binů. Tento postup vyřešil jak problém se štěpením signálů mezi více binů (rozšířením nebo posunutím původního 0,04 ppm binu), tak s překryvem více signálů v některých binech (zúžením původního binu). Normalizované intenzity signálů pak byly vyjádřeny jako takto vypočtené plochy signálů, vztažené na celkovou plochu spektra.

11

5 5.1

Výsledky a diskuse Optimalizace experimentálního protokolu

Ve vzorcích moči bylo jednoznačně identifikováno více než 40 metabolitů. Vliv jednotlivých experimentálních parametrů byl studován na stále stejné skupině 19 metabolitů, vybraných podle následujících kritérií: Zvolené metabolity jsou v protonových NMR spektrech spolehlivě detekovatelné a kvantifikovatelné pomocí dobře rozlišených nepřekrývajících se signálů, jejichž chemické posuny pokrývají celý rozsah spektra. Jsou zastoupené metabolity v širokém koncentračním rozmezí dvou řádů. Změny koncentrací vybraných metabolitů byly v literatuře citovány v souvislosti s obezitou či diabetem [72,129,130]. Každý metabolit zahrnutý do studie byl reprezentován jedním signálem, vycentrovaným v binu o šíři 0,04 ppm. Koncentrace metabolitu pak byla vyjádřena jako intenzita odpovídajícího binu normalizovaná buď na celkovou plochu spektra, na signál kreatininu či pomocí pravděpodobnostní kvocientové normalizace. Seznam metabolitů použitých ve studii včetně vybraných reprezentativních signálů: N1-methylnicotinamid (MNA; 9,29 s), N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid (4-PY; 8,55 d), N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PY; 8,34 d), hippurát (7,84 dd), fenylacetylglycin (PAG; 7,46 t), allantoin (5,39 s), glukosa (5,25 d), kreatinin (4,06 s), kreatin (3,93 s), glycin (3,54 s), taurin (3,43 t), trimethylamin (TMA; 2,88 s), dimethylamin (DMA; 2,72 s), citrát (2,68 d), methylamin (MA; 2,61 s), 2-oxoglutarát (2-OG; 2,45 t), sukcinát (2,41 s), acetát (1,92 s), laktát (1,34 d). chemické posuny jsou uvedeny v ppm; s … singlet; d … dublet; t … triplet; dd … dublet dubletu Vliv protokolu odběru moči Protože odběr vzorku by v ideálním případě neměl zasáhnout do metabolismu sledovaných zvířat, jako nejlepší volba by se jevil celodenní odběr moči s volným přístupem k vodě i potravě (protokol C). Kvůli podstatnému riziku kontaminace odebrané moči částečkami potravy se tato metoda v praxi příliš nepoužívá. Při přímém odběru moči (protokol A) kolísá množství vzorku mezi 50-100 µl a v některých případech je i odběr zcela neúspěšný, složení moči je navíc ovlivněno cirkadiánními rytmy a individuálním stravovacím rytmem každého zvířete. Nejběžnější a v literatuře doporučovaný postup je 24hodinový odběr moči v metabolických klíckách s volným přístupem k vodě, ale nikoliv k potravě (protokol B). Zde je ovšem třeba mít na zřeteli, že celodenní hladovění může výrazně zasáhnout do metabolismu malých hlodavců a tak negativně ovlivnit výsledky studií, zaměřených na obezitu a příjem potravy. Ačkoliv malé objemy vzorků A bylo nutné měřit ve 3mm kyvetách, statistické vyhodnocení potvrdilo zcela zanedbatelný efekt průměru kyvety na výsledné hodnoty. Od každého dvouměsíčního zvířete tedy byly odebrány tři vzorky moči (protokol A, B a C) a změřeny pomocí standardní 1D-NOESY pulsní sekvence. Prosté vizuální srovnání PCA score plotů naznačilo, že nejlepšího rozdělení MSG a kontrolní skupiny bylo dosaženo pomocí standardního B protokolu. Aby mohl být vliv protokolu posouzen detailněji, byly následně porovnány normalizované koncentrace všech devatenácti vybraných metabolitů. Budeme-li považovat protokol C za přibližný obraz 24hodinového metabolismu, poměr koncentrací jednotlivých metabolitů detekovaných ve vzorcích A (ranní odběr) a C (24h odběr s potravou) může odrážet potenciální změny vybraných metabolitů vyvolané cirkadiánními rytmy (Obr. 2). Pro kontrolní skupinu byly v ranní moči (A) oproti celodennímu odběru (C) zaznamenány zvýšené hladiny glukosy, TMA, citrátu a 2-OG a snížená hladina laktátu. Ranní moč MSG skupiny vykazovala v porovnání s protokolem C vyšší koncentrace MNA, citrátu a 2-OG a snížené koncentrace DMA, acetátu a laktátu. Ačkoliv některé změny (převážně v MSG skupině) nejsou statisticky významné a lze je těžko odlišit od přirozené variability metabolitů mezi jednotlivými zvířaty, odpovídají pozorované trendy změnám již dříve popsaným v literatuře. 12

Gavaghan a spol. [131] studovali cirkadiánní rytmy myší ze dvou kmenů C57BL10J a Alpk:ApfCD, u kterých pozorovali zvýšené hladiny TMA, DMA, citrátu, 2-OG a sukcinátu v ranní moči ve srovnání s močí odpolední. Williams a spol. [16] detekovali nárůst taurinu, kreatininu, allantoinu a 2-OG ve večerní moči Zucker fatty potkanů. Bollard a spol. [132] popisují analogické rozdíly mezi ranní a večerní močí pro Sprague-Dawley potkany: zvýšené hladiny citrátu, glycinu, kreatinu a glukosy v ranní moči a snížené koncentrace taurinu, kreatininu a hippurátu v moči večerní.

Obr. 2 Vliv cirkadiánních rytmů na studované metabolity (vyjádřený jako poměr koncentrací detekovaných ve vzorcích A a C), vyhodnocený nezávisle pro MSG i kontrolní myši. Signifikance metabolických změn mezi odběry A a C podle t-testu: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Obr. 3 Vliv hladovění během odběru moči (vyjádřený jako poměr koncentrací detekovaných ve vzorcích B a C), vyhodnocený nezávisle pro MSG i kontrolní myši. Signifikance změn koncentrací mezi odběry B a C podle t-testu: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Jelikož celodenní odběr moči podle protokolu B a C se liší pouze přístupem myší k potravě, poměr koncentrací jednotlivých metabolitů ve vzorcích B a C odráží vliv omezení příjmu potravy na složení moči (viz Obr. 3). MSG myši z tohoto srovnání vycházejí jako méně tolerantní k hladovění, což je zřejmé z významných odchylek u téměř všech studovaných metabolitů. Zamezení přístupu k potravě především výrazně zvýšilo koncentrace MNA, 2-PY, 4-PY a PAG a snížilo hladinu glukosy 13

u MSG myší. Odlišná reakce metabolismu na omezení přístupu k potravě během odběru moči u zkoumané a kontrolní skupiny tak může překrýt nebo zkreslit ty metabolické změny, které přímo souvisejí se studovaným jevem. Tento fakt považujeme za největší riziko standardního B protokolu. Pokud totiž ve studii nejsou modelová zvířata geneticky identická s kontrolami (např. původní versus geneticky modifikované myši), je zapotřebí předem pro každou skupinu zvlášť vyhodnotit efekt hladovění během odběru. Na druhou stranu u modelů s chemicky nebo dietou indukovanou obezitou je jediným rozdílem mezi obézními a kontrolními zvířaty pouze obezitu vyvolávající zásah (např. MSG injekce nebo vysokotuková dieta), takže všechny změny způsobené hladověním mohou být posuzovány společně s metabolickými změnami způsobenými obezitou a tak přímo využity jako markery v rámci studovaného modelu. V námi studovaném modelu lze například pomocí B protokolu studovat změny metabolismu nikotinamidu (MNA a jeho oxidační produkty 2-PY a 4-PY), které by se při použití protokolu A nebo C jevily jako zanedbatelné.

Vliv pulsní sekvence Vliv pulsní sekvence na kvalitu spekter a tím i na detekované koncentrace jednotlivých metabolitů byl srovnáván na vzorcích moči protokolu B. Všechny vzorky byly naměřeny nejprve pomocí pulsní sekvence 1D-NOESYv souladu s klasickým protokolem [28], ve spektrech však byly pozorovány široké signály odpovídající přítomnosti proteinů ve vzorcích. Proto byl k potlačení nežádoucího pozadí vysokomolekulárních látek následně změřen i CPMG experiment, obvykle doporučovaný pro vzorky séra a plasmy. Dále byla naměřena i J-rozlišená spektra, jejichž 1D projekce (pJRES) byla také použita k analýze dat. Pro protonová data získaná pomocí tří různých pulsních sekvencí (1D-NOESY, CPMG, pJRES) byly nejdříve vytvořeny a validovány PLS-DA modely. Ve score plotech 1D-NOESY modelu bylo pozorováno poněkud horší oddělení skupin, což se odrazilo i v charakteristice modelu: v počtu latentních proměnných a v parametrech vysvětleného a predikovaného rozptylu. Všechny tři PLS-DA modely se sice zdály být vyhovující z hlediska separace skupin, avšak ve výchozích spektrech jsou patrné podstatné rozdíly.

Obr. 4 Srovnání 1D-NOESY (A), CPMG (B) a pJRES (C) spekter na reprezentativním vzorku kontrolní myši – expanze aromatické oblasti se signály méně koncentrovaných metabolitů

14

Vliv použité pulsní sekvence lze dobře demonstrovat na expandované aromatické části spektra (Obr. 4). Výrazné pozadí proteinových rezonancí (modrá křivka A) překrývá méně intenzivní signály metabolitů a znemožňuje tak jejich kvantifikaci. pJRES spektra (zelená křivka B) sice vykazují plochou základní linii a jen velmi malý překryv signálů, avšak málo koncentrované metabolity rezonující okolo 9 ppm nejsou touto pulsní sekvencí, optimalizovanou pro rychlé měření, vůbec detekovány. V CPMG spektru (červená křivka C) jsou naproti tomu pozorovány dobře rozlišené signály všech metabolitů s uspokojivým poměrem signál/šum a plochou základní linií. Přestože je využití myších modelů v NMR metabolomických studiích obezity a diabetu běžné, zaznamenali jsme jen velmi málo publikací, kde by byl kvůli potlačení signálů proteinů cíleně použit CPMG experiment místo standardního 1D-NOESY [93,133]. Například při metabolomické studii moči myší, potkanů a lidí při T2DM [92] byla zmíněna vysoká koncentrace proteinů v moči db/db myší, negativně ovlivňující jejich 1D-NOESY spektra; autoři ji zde vysvětlili proteinurií spojenou s diabetem. Z tohoto důvodu jsme se zaměřili na srovnání hladin metabolitů detekovaných pomocí 1D-NOESY a CPMG experimentů ve vzorcích moči obsahující proteiny. Kromě již zmiňovaného překryvu signálů pramení zásadní problémy 1D-NOESY spekter MSG modelu z faktu, že množství proteinů vylučovaných močí je výrazně vyšší u štíhlých kontrolních než u obézních MSG myší a navíc se mění také s věkem myší. Průměrný pokles intenzity signálů odečtený u 9,45 ppm je 26 %, u 0,80 ppm dokonce 40 %. Snížené hladiny močových proteinů byly v souvislosti s porušeným metabolismem glukosy pozorovány v několika studiích [134–136], například u db/db obézních myší nebo u myší s dietou indukovanou obezitou. Je tedy pravděpodobné, že pozorovaný problém u 1D-NOESY spekter může být společný pro více modelů myší obezity.

Obr. 5 Srovnání výsledků z dat získaných 1D-NOESY a CPMG experimentů: relativní změny koncentrací jsou vyjádřeny podíly koncentrací MSG a kontrolní skupiny. Signifikance změn mezi MSG a kontrolní skupinou: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Pro vyhodnocení výstupů obou pulsních sekvencí byly změny metabolitů vyjádřeny jako poměry koncentrací MSG a kontrolních myší, a to jak na základě 1D-NOESY spekter, tak CPMG spekter. Rozdíly v datech získaných pomocí 1D-NOESY a CPMG pulsní sekvence jsou znázorněny na Obr. 5. Model založený na 1D-NOESY experimentu vykazuje výrazně menší změny hladin MNA, 4-PY, 2-PY, acetátu a laktátu než výsledky CPMG modelu. Tento rozdíl je způsoben překryvem signálů uvedených metabolitů se širokými rezonancemi proteinů v 1D-NOESY spektrech. Protože množství proteinů v moči MSG myší je výrazně nižší než u kontrolních zvířat, příspěvek signálů proteinů k celkové intenzitě jednotlivých binů u MSG vzorků klesá. Tímto způsobem může být v modelu založeném na 1D-NOESY skutečný nárůst jednotlivých metabolitů kompenzován poklesem 15

koncentrace proteinů. Tento experimentální efekt se opět významně projevuje u málo intenzivních metabolitů v aromatické oblasti (MNA, 2-PY, 4-PY), jejichž změněný metabolismus by pomocí standardní 1D-NOESY sekvence nebyl zaznamenán.

Vliv normalizace NMR dat Na 1D-NOESY a CPMG modelech byly porovnány výsledky tří nejběžnějších metod používaných v NMR metabolomice: normalizace na celkovou plochu spektra (TSA), pravděpodobnostní kvocientové normalizace („probabilistic quotient normalization“, PQN) a normalizace na signál kreatininu. V případě CPMG modelu poskytují všechny tři postupy celkem konsistentní výsledky; průměrná odchylka dat získaných normalizací TSA a PQN ve srovnání s kreatininem činí 6 % a 2 %. V případě 1D-NOESY modelu ovšem dosahuje odchylka TSA od kreatininové normalizace 12 %, a svou hodnotou se tak přibližuje důležitým změnám metabolických hladin. Nižší obsah proteinů v MSG moči totiž snižuje celkovou plochu jejich spekter ve srovnání s kontrolami, což vede k vyšším hodnotám poměru MSG/kontroly. Obecně lze říci, že čím vyšší je pokles proteinů u obézní skupiny v porovnání s kontrolami, tím budou (u 1D-NOESY modelu) hodnoty získané pomocí TSA normalizace více lišit od normalizace na kreatinin. PQN metoda je schopna naproti tomu dostatečně vykompenzovat i široké signály proteinů a s přibližně 3% odchylkou od normalizace na kreatinin může být použita i v 1D-NOESY modelu.

5.2

Charakterizace modelu s MSG indukovanou obezitou

Biochemické parametry Tab. I Metabolické parametry dvou-, šesti- a devítiměsíčních MSG a kontrolních myší Myš kontrola 2m MSG 2m kontrola 6m MSG 6m kontrola 9m MSG 9m

Hmotnost [g] 40,38 ± 0,94 42,42 ± 0,56 46,53 ± 1,08 53,08 ± 2,11 * 56,54 ± 1,27 61,53 ± 1,89 *

Bílá tuková tkáň [% hmotnosti] 4,19 ± 0,42 11,53 ± 0,62 *** 4,48 ± 0,37 9,08 ± 0,89 *** 7,22 ± 0,60 6,10 ± 0,62

Glukosa [mmol/l] 6,68 ± 0,44 8,47 ± 0,38 ** 6,55 ± 0,39 6,48 ± 0,42 6,87 ± 0,35 6,67 ± 0,73

Insulin [ng/ml] 0,98 ± 0,15 3,61 ± 0,59 *** 0,97 ± 0,20 1,57 ± 0,19 * 2,44 ± 0,63 3,96 ± 0,41

Leptin [ng/ml] 1,92 ± 0,41 28,75 ± 3,95 *** 4,02 ± 0,56 23,10 ± 4,06 *** 16, 65 ± 2,50 33,25 ± 4,69 **

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, n = 10 zvířat ve skupině. Signifikance: * p < 0,05, ** p < 0,01 and *** p < 0,001 vs. odpovídající kontrolní skupina

Ve dvou, šesti a devíti měsících věku byly u MSG myší a odpovídajících kontrol změřeny tělesná hmotnost, hmotnost tuku a metabolické parametry (Tab. I). MSG myši ve dvou a šesti měsících vykazovaly významnou akumulaci tuku, vedoucí ke zvýšení hladiny leptinu, a podmínky typické pro prediabetes (mírný nárůst glukosy a zvýšená hladinou insulinu); v devíti měsících se naopak koncentrace glukosy a insulinu významně nelišily od věkově odpovídajících kontrol. Zajímavé je, že v plasmatických hladinách volných mastných kyselin a triglyceridů nebyl mezi MSG skupinou a kontrolami po celou dobu experimentu pozorován podstatný rozdíl. V glukosovém tolerančním testu 16

nevykazovaly ani hladiny glukosy ani plocha pod křivkou (AUC) mezi šestiměsíční MSG a kontrolní skupinou žádné významné rozdíly (data nejsou prezentována). Exprese mRNA v játrech a tukové tkáni u 6 měsíčních MSG myší Obezita a insulinová rezistence ovlivňují expresi mRNA enzymů spojených s metabolismem lipidů v podkožní (IPAT) a viscerální (SCAT) tukové tkáni a v játrech. V tukové tkáni je exprese leptinu, hlavního adipokinu produkovaného touto tkání, přímo úměrná hmotnosti tuku. Pro MSG myši byla ve srovnání s kontrolami pozorována zvýšená exprese leptinu ve SCAT (Obr. 6), avšak nikoliv v IPAT. Protože u MSG myší je hmotnost SCAT oproti IPAT dvojnásobná, nárůst koncentrace cirkulujícího leptinu u MSG myší lze přičíst především jeho zvýšené expresi ve SCAT. Snížená exprese adiponektinu, markeru nepřímo úměrného diabetickému stavu, v intraperitoneálním i subkutánním tuku MSG myší poukazuje na vznik diabetu. Také exprese PPAR-γ ve SCAT a IPAT byla u MSG myší snížená. V této studii nebyla pozorována zvýšená exprese NNMT v intraperitoneální, subkutánní ani hnědé tukové tkáni. NNMT exprese v játrech (kompenzované na B2M, GADPH i GUSB) vykazují pro všechny tři experimenty společný trend – nesignifikantní nárůst. mRNA exprese jiného markeru diabetu – MUP-1 – v játrech 6měsíčních myší byla o třetinu větší u MSG skupiny ve srovnání s kontrolami.

Obr. 6 Vybrané exprese mRNA pro kontrolní and MSG skupinu v šesti měsících věku: leptin ve SCAT, adiponektin ve SCAT a IPAT, MUP-1 v játrech, PPAR-γ ve SCAT a IPAT Signifikance je * p < 0,05, ** p < 0,01 a *** p < 0,001 vs. kontrolní skupina

NMR metabolomika MSG myším a jim odpovídajícím kontrolám byla ve věku dvou, šesti a devíti měsíců změřena protonová spektra vzorků moči. Kvůli intenzivním signálům vysokomolekulárních látek v 1D-NOESY spektrech byla pro veškeré analýzy použita data z CPMG spekter. V souladu s uspořádáním experimentu byly vytvořeny tři podobné PLS-DA modely (Obr. 7), korelující spektra MSG a kontrolní skupiny ve věku dvou, šesti a devíti měsíců. Pro určení kvality modelů a počtu potřebných hlavních komponent byla použita LOO křížová validace. Významné biny byly vybrány na základě informací z S-plotu a t-testu a musely vyhovět stanoveným parametrům: korelační koeficient > 0,5, loading faktor > 0,05, p-hodnota < 0,05 a relativní změna koncentrace mezi MSG a kontrolní skupinou > ± 20 %. Následně byly metabolity odpovídající signifikantním binům identifikovány postupem popsaným v experimentální části. Obrázek 8 představuje reprezentativní CPMG spektrum s vyznačenými významnými metabolity, které jsou včetně relativních změn jejich intenzit shrnuty v tabulce II.

17

Obr. 7 Score ploty a pod nimi odpovídající S-ploty PLS-DA modelů pro dvou-, šesti- a devítiměsíční myši (Podíly vysvětleného a predikovaného rozptylu pro jednotlivé modely: R2 = 0,98 a Q2 = 0,93 pro 2 měsíce; R2 = 0,94 a Q2 = 0,89 pro 6 měsíců; R2 = 0,93 a Q2 = 0,84 pro 9 měsíců)

Obr. 8 Reprezentativní CPMG spektrum dvouměsíční MSG myši s přiřazením signálů statisticky významných metabolitů 18

Tab. II Relativní změny signifikantních metabolitů mezi MSG skupinou a věkově odpovídajícími kontrolami ve 2, 6 a 9 měsících věku (statistická signifikance změn z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) Metabolit N1-methylnikotinamid (MNA) Trigonellin Nikotinamid N-oxid N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid (4-PY) N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PY) Fenylaceltylglycin (PAG) Allantoin Glukosa Kreatin Citrát Methylamin Sukcinát N-isovalerylglycin (IVG) N-acetyly glykoproteinů Acetát Putrescin Nepřiřazené kyseliny Laktát Zbytkové signály proteinů a reprezentativní bin použitý pro kvantifikaci ↑ nebo ↓: relativní změna metabolitu větší než ± 20 % ↑↑ nebo ↓↓: relativní změna metabolitu větší než ± 40 % x : relativní změna metabolitu menší než ± 20 %

H a 9,29 (s) 9,13 (s) 8,76 (m) 8,55 (d) 8,34 (d) 7,43 (m) 5,39 (s) 5,25 (d) 3,94 (s) 2,68 (d) 2,61 (s) 2,41 (s) 2,18 (d) 2,06 (s) 1,93 (s) 1,78 (m) 1,50 (m) 1,34 (d) 0,74 (br m)

2 měs. ↑↑*** ↓↓** ↓** ↑↑*** ↑↑*** ↑ ↑ ↑↑ ↓*** ↑↑** ↓*** ↑* ↓↓*** ↓*** ↑↑* ↓*** ↓*** ↑ ↓↓***

6 měs. ↑* ↓* ↓** ↑↑** ↑* ↑** ↑*** ↑↑ x x ↓*** x ↓↓*** ↓*** x ↓*** ↓*** x ↓↓***

9 měs. ↑** ↓* ↓* ↑↑** ↑** ↑** ↑*** x x x ↓*** x ↓↓*** ↓*** x ↓*** ↓** x ↓↓***

V modelu dvouměsíčních MSG myší byly identifikovány signifikantní změny u těchto metabolitů: zvýšená koncentrace N1-methylnikotinamidu (MNA), N1-methyl-4-pyridon3-karboxamidu (4-PY), N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamidu (2-PY), citrátu, sukcinátu, acetátu, a snížení hladin trigonellinu, nikotinamid N-oxidu, kreatinu, methylaminu, N-isovalerylglycinu (IVG), putrescinu, nepřiřazených acetylů, alifatických kyselin a vysokomolekulárních látek. Ve spektrech byl identifikován i hexanoylglycin, jehož signály ovšem rezonují společně se signály dalších nepřiřazených alifatických kyselin a proto byl do této skupiny také zahrnutý. Stejný postup aplikovaný na modely šesti- a devítiměsíčních myší ukázal na změny u podobné sady metabolitů: nárůst MNA, 4-PY, 2-PY, fenylacetylglycinu (PAG) a allantoinu, a pokles trigonellinu, nikotinamid N-oxidu, kreatinu, methylaminu, IVG, putrescinu, nepřiřazených acetylů, alifatických kyselin a vysokomolekulárních látek. Kvůli potvrzení povahy vysokomolekulárních látek, zodpovědných za široké signály ve spektrech, bylo provedeno stanovení proteinů bicinchoninovou kyselinou ve vzorcích tří MSG a tří kontrolních myší ve věku dvou, šesti a devíti měsíců. Tyto experimenty prokázaly významně snížený obsah proteinů vyloučených v moči MSG myší v porovnání s kontrolami; koncentrace proteinů v moči MSG myší poklesy oproti kontrolám o 34 % ve věku dvou měsíců, o 30 % v šesti měsících a o 47 % v devíti měsících.

19

Porovnání koncentrací jednotlivých metabolitů u myší ve věku devíti a dvou měsíců umožnilo sledovat vliv stárnutí nezávisle pro MSG i kontrolní skupinu. K tomuto účelu byly pro obě skupiny vytvořeny další PLS-DA modely, korelující CPMG spektra s věkem myši. Obrázek 9 znázorňuje score ploty pro PLS-DA modely, tabulka III shrnuje relativní změny signifikantních metabolitů

Obr. 9 Modely stárnutí: PLS-DA score ploty pro kontrolní a MSG myši Podíly vysvětleného a predikovaného rozptylu pro jednotlivé modely: R2 = 0,97 a Q2 = 0,79 pro MSG skupinu; R2 = 0,90 a Q2 = 0,80 pro kontrolní skupinu

Tab. III Relativní změny signifikantních metabolitů mezi 9měsíčními a 2měsíčními myšmi (vyjádřené jako poměr koncentrací 9měs/2měs) pro MSG i kontrolní skupinu. Statistická signifikance změn z t-testu: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 metabolit H a N1-methylnikotinamid (MNA) 9,29 (s) Glukosa 5,25 (d) Kreatin 3,94 (s) Taurin 3,43 (t) Citrát 2,68 (d) 2-oxoglutarát (2-OG) 2,45 (t) Sukcinát 2,41 (s) Zbytkové signály proteinů 0,74 (br m) a reprezentativní bin použitý pro kvantifikaci ↑ nebo ↓: relativní změna metabolitu větší než ± 20 % ↑↑ nebo ↓↓: relativní změna metabolitu větší než ± 40 % x : relativní změna metabolitu menší než ± 20 %

MSG x ↓ x x ↓↓* ↓* ↓* ↓↓**

kontroly ↑↑** x ↓*** ↑** ↓ ↓** x ↓***

Vývoj koncentrací statisticky signifikantních metabolitů pro MSG a kontrolní myši v průběhu devíti měsíců je shrnutý v grafech na obrázku 10.

20

Obr. 10 Normalizované koncentrace významných metabolitů ve věku 2, 6 a 9 měsíců pro MSG a kontrolní myši. Signifikance změn MSG vs. kontrolní skupina: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001

21

Diskuse Biochemické a hormonální parametry, exprese mRNA Vyhodnocení biochemických a hormonálních parametrů potvrdilo, že u MSG myší ve věku dvou a šesti měsíců došlo k rozvinutí obezity s hyperleptinemií a hyperinsulinemií. Tento fenotyp se velmi podobá obézním pacientům s vysokým rizikem rozvoje pokročilých komplikací, což potvrzuje přínos MSG myšího modelu ke studiu lidské obezity. Poškozená insulinová sensitivita a změny v metabolismu šestiměsíčních myší byly indikovány výrazně sníženou expresí adiponektinu v subkutánním tuku, což ukazuje na prediabetický stav. Zvýšená exprese leptinu spolu s vyšší hladinou leptinu v séru, která byla pozorována v naší studii a byla také detekována u MSG modelu myší kmene CD-1 [107], je pravděpodobně důsledkem leptinové rezistence, popsané u četných modelů obezity. Tento stav může být vysvětlen sníženou expresí PPAR-γ v tukové tkáni MSG myší (SCAT, IPAT i BAT) v porovnání s kontrolami. PPAR-γ je považován za transkripční faktor krom jiného i pro adiponektin, jehož exprese byla v tukové tkáni MSG myší také snížena. NMR metabolomika Po charakterizaci MSG modelu pomocí biochemických parametrů a mRNA expresí se naše práce zaměřila na sledování změn v metabolickém složení moči pomocí NMR metabolomiky. Prvním důležitým zjištěním NMR studie byly významně vyšší hladiny MNA a jeho oxidačních produktů 2-PY a 4-PY v moči obézních MSG myší ve srovnání se štíhlými kontrolami. MNA a jeho metabolity se tvoří primárně v játrech a nárůst jejich koncentrace v moči se ukázal jako pozitivní biomarker proliferace peroxisomů [137,138], která je spojena se zánětem, obezitou a metabolickým syndromem [139,140]. Moč MSG myší naopak obsahovala nižší množství nikotinamid N-oxidu, oxidačního produktu nikotinamidu, a trigonelinu (N-methylnikotinátu), methylačního produktu kyseliny nikotinové. Naše NMR metabolomická data tedy naznačují, že nikotinamid u MSG obézních myší podléhá spíše methylaci než oxidaci. Zvýšení koncentrace MNA a 2-PY a snížení hladiny trigonelinu bylo také popsáno u T2DM pacientů, db/db myší a fa/fa potkanů [92]. Nikotinamid je methylován S-adenosinmethioninem (SAM) za katalýzy nikotinamid N-methyltransferasou (NNMT). SAM dále poskytuje propylamin v metabolismu propylaminů. Protože jsme detekovali nižší hladinu polyaminu putrescinu, na rozdíl od nikotinamidu se využití SAM v metabolismu propylaminů zdá být u MSG myší snížené. Putrescin, jeden z hlavních močových produktů myších samců, může být syntetizován z ornithinu ornithindekarboxylasou (ODC) a/nebo polyaminoxidasou z acetylspermidinu. Naše NMR data ukazují na výrazně sníženou exkreci putrescinu v MSG skupině, což může být připisováno utlumenému katabolismu polyaminů. Polyaminy hrají důležitou roli v metabolismu glukosy a kontrolují rozšiřování tukové tkáně. V literatuře byl také popsán vliv spermidin/spermin N1-acetyltransferasy (SSAT) na tvorbu tukové tkáně myší [141]. Ukázalo se, že zvýšená exprese SSAT u myší vede ke zvýšení metabolické aktivity, redukci tuku a ke zvýšení citlivosti k insulinu. Navíc zpomalený metabolismus polyaminů prostřednictvím inhibice ODC 2-difluoromethylornithinem zvyšoval hladinu adenosintrifosfátu v tukové tkáni a měl podstatný vliv na SSAT fenotyp myší. Podobně se prokázalo, že aktivovaný metabolismus polyaminů je spojen se zmenšením bílé tukové tkáně a poklesem koncentrace v ní obsažených acetyl-CoA a malonyl-CoA [142]. Souhrnně tato data podporují hypotézu, že aktivace katabolismu polyaminů má silný vliv na WAT a kontrolu metabolismu glukosy. Naše výsledky u obézních MSG myší ukazují, že redukce metabolismu polyaminů může souviset s akumulací WAT a rozvojem obezity stejně tak jako s poškozenou endokrinní funkcí a insulinovou rezistencí tukové tkáně, což také dokládá zvýšená exprese leptinu a snížená exprese adiponektinu. V předchozích studiích korelovala exprese NNMT v tukové tkáni s adipozitou u různých kmenů myší s DIO [143]. NNMT exprese byla zvýšena ve WAT a játrech u geneticky modifikovaných, DIO 22

a diabetických myší. Inhibice NNMT zvýšila hladiny SAM a NAD+, expresi a aktivitu ODC a SSAT v tukové tkáni a vylučování polyaminů v moči [144]. Byla vyslovena hypotéza, že inhibice NNMT by mohla sloužit jako ochrana před dietou indukovanou obezitou prostřednictvím rostoucího toku polyaminů [144]. V našem modelu jsme pozorovali nesignifikantní tendenci zvýšení NNMT exprese v játrech u MSG myší, ale nikoliv v jejich tukové tkáni. Jiným zajímavým faktem, pozorovaným v NMR spektrech a potvrzeným také stanovením bicinchoninovou kyselinou, je vysoký obsah proteinů v moči kontrolních myší, který se výrazně snížil u MSG myší. Na rozdíl od lidské moči, ve které se za normálních podmínek bílkoviny nevyskytují, myší moč přirozeně obsahuje velké množství proteinů patřících do třídy hlavních močových proteinů (MUP). MUP jsou syntetizovány především v játrech, cirkulují v krevním řečišti a mohou být díky své nízké molekulární hmotnosti snadno vylučovány močí [145]. Jejich role v organismu nebyla dosud plně objasněna. Je známo, že MUP na sebe vážou těkavé feromonové složky a tak se jako močové pachové stopy podílejí na chemické komunikaci hlodavců [146]. Vliv MUP na energetický metabolismus myší byl intenzivně studován na myších modelech geneticky a vysokotukovou dietou indukované obezity [187, 188]. Exprese MUP-1 a jeho cirkulující koncentrace byly u db/db a DIO myší ve srovnání se štíhlými kontrolami podstatně nižší. Zvýšená exprese MUP-1 výrazně snižovala hyperglykemii a glukosovou intoleranci v obou modelech [136]. Podávání MUP-1 diabetickým db/db myším zvyšovalo jejich energetický výdej a zlepšilo glukosovou toleranci [135]. Hladiny MUP-5 v krvi a moči byly kromě toho u myší regulovány omezením potravy [134]. Znatelné snížení exprese mRNA a koncentrace MUP v moči MSG myší pozorované v naší práci jsou ve shodě s výše zmíněnými výsledky a mohou být přisouzeny vyvolané MSG obezitě a z ní plynoucí insulinové rezistenci. Lze tedy shrnout, že změněné koncentrace MUP u myší mohou hrát roli v metabolismu glukosy a energetické rovnováze. U MSG myší jsme také zaznamenali zvýšené hladiny PAG a snížené koncentrace MA. Oba tyto metabolity jsou ovlivněny střevní mikroflórou, jak již dříve ukázaly jejich změny při obezitě a T2DM [147]. Během studie na modelu geneticky modifikovaných AHNAK myší byly hladiny PAG a MA u standardních („wild-type“) myší na vysokotukové dietě také v porovnání se standardní dietou sníženy [148]. Naopak zvýšené koncentrace PAG v potkaním modelu dietou indukované obezity [149] autoři vysvětlovali tím, že nadprodukce PAG u zvířat s nadváhou může prostřednictvím střevních bakterií souviset s obezitou. Protože v naší studii jsme se střevní mikroflórou nezabývali, mechanismus nárůstu PAG musí být teprve objasněn. Zvýšené hladiny acetátu, citrátu a sukcinátu, markerů Krebsova cyklu, v moči MSG myší jsou pravděpodobně výsledkem metabolického stresu za anaerobních podmínek. Je zajímavé, že tyto změny byly výrazné u 2měsíčních MSG myší, zatímco u starších myší už nebyly téměř patrné. Snížená koncentrace IVG u MSG myší je ve shodě s poklesem IVG pozorovaným v lidském modelu obezity [150]. Kromě toho byly pozorovány zvýšené koncentrace allantoinu v moči MSG myší, což je v souladu s výzkumem T2DM pacientů [151]. Studie označují allantoin jako marker oxidativního stresu [152], často vyvolávajícího zánět [153]. Zvýšené hladiny allantoinu u MSG myší tak mohou ukazovat na zvýšený oxidační stres a subklinický zánět vedoucí k metabolickým poruchám [154]. Protože však allantoin u myší může být produkován nejenom chemickou oxidací kyseliny močové, ale také enzymatickou reakcí s urát-oxidasou [155], mechanismus zvýšení hladiny allantoinu u MSG myší není zcela zřejmý. Nárůst koncentrace allantoinu byl například popsán u myšího modelu Alzheimerovy nemoci [156] a u atherosklerotických myší léčených captoprilem [133]. Allantoin byl také uveden jako biomarker zánětu střev u myšího modelu Crohnovy choroby [157]. V modelu geneticky obézních a diabetických db/db myší byl allantoin v moči naopak snížený [92]. Význam allantoinu byl také zkoumán u DIO myší [158], kde jeho podávání vedlo k redukci hmotnosti obézních myší a snižovalo

23

hyperleptinemii indukovanou vysokotukovou dietou. Všechna tato pozorování ukazují, že allantoin hraje komplexní roli v regulaci energetické bilance. U dvou- a šestiměsíčních MSG myší byly zaznamenány také zvýšené hladiny glukosy v moči, které ale v devíti měsících dosáhly normálních hodnot kontrolní skupiny. Ačkoliv tato změna není statisticky významná kvůli velkému rozptylu dat u MSG myší, zmíněný trend je v souladu s normalizací hodnot krevní glukosy, pozorovanou v šesti měsících. Kromě vlivu obezity sledovala naše studie i změny metabolitů vyvolané stárnutím, které se neprojevovaly u obou skupin stejně. U kontrolních i MSG myší byly pozorovány v souvislosti s věkem snížené koncentrace MUP, citrátu a 2-OG. U kontrolních zvířat byl detekován také nárůst hladin MNA a taurinu a pokles kreatinu, zatímco u MSG skupiny zůstaly tyto metabolity téměř neovlivněny. Podobně byly popsané zvýšené hladiny MNA u BALB/c myší, které odlišovaly staré samce od mladých [159]. Pokles koncentrace sukcinátu jsme pozorovali pouze u MSG myší a nikoliv u kontrol. Analogicky pokles citrátu a 2-OG přispíval k charakterizaci starších diabetických myší a potkanů, zatímco tento trend nebyl pozorován u kontrolních skupin [92]. Vývoj metabolitů během stárnutí u kontrolních a MSG myší (Obr. 10) ukazuje, že počáteční signifikantní rozdíl v hladinách kreatinu, citrátu, sukcinátu a acetátu mezi MSG a kontrolními zvířaty, zjištěný ve dvou měsících, se výrazně snížil u šesti- a devítiměsíčních zvířat.

24

5.3

Vliv antidiabetické terapie na model s dietou indukovanou obezitou

Dopad antidiabetické léčby na tělesnou hmotnost a stavbu DIO myší Konzumace HF diety způsobila v prvních týdnech experimentu signifikantní nárůst tělesné hmostnosti (BW); na začátku léčby (po 6 týdnech LF/HF diety) byla průměrná hmotnost myší na LF dietě 28,93 ± 0,64 g, zatímco myši krmené HF dietou vážily průměrně 45,54 ± 1,27 g (p < 0,001). Také na konci experimentu byla tělesná hmotnost myší s HF dietou stále signifikantně vyšší oproti skupině s LF dietou, stejně tak jako hmotnost jater, podíl tukové tkáně či koncentrace leptinu v plasmě (Tab. IV A). Podávání metforminu, vildagliptinu ani jejich kombinace signifikantně nezměnilo tělesnou hmotnost ani celkový tuk DIO myší, hladina plasmatického leptinu byla kombinovanou terapií nesignifikantně snížena. Antidiabetická terapie však signifikantně snížila hmotnost jater ve všech léčených skupinách v porovnání s HF kontrolami na vodě (Tab. IV B) Tab. IV Tělesná hmotnost (BW), hmotnost jater a tukové tkáně a hladiny leptinu u myší na konci experimentu. A. Srovnání skupin na LF a HF dietě. B. Vliv 7týdenní léčby antidiabetickými látkami. Tělesná hmotnost [g]

Celkový tuk [% z BW]

Leptin [ng/ml]

Játra [g]

Játra [% z BW]

A. Dieta voda HF voda LF

53.91±0.61 33.16±0.99 ***

15.73±0.47 4.60±0.82 ***

31.24±6.01 2.32±0.57 ***

2.17±0.12 1.27±0.21 **

4.31±0.21 4.45±0.22

B. Léčba voda HF metformin HF vildagliptin HF met + vilda HF

53.91±0.61 52.51±0.83 52.73±1.14 50.33±1.67

15.73±0.47 16.98±0.60 16.36±0.56 16.93±1.01

31.24±6.01 30.89±1.73 34.81±1.92 24.93±2.37

2.17±0.12 1.63±0.10 ** 1.74±0.10 * 1.48±0.09 ***

4.31±0.21 3.31±0.18 ** 3.54±0.15 ** 3.09±0.11 ***


Vliv léčby na metabolické parametry v krvi Konzumace HF diety vyvolala v porovnání s LF dietou signifikantní zvýšení hladiny glukosy nalačno, insulinu a triglyceridů. Byl pozorován také nesignifikantní nárůst koncentrace volných mastných kyselin (FFA) u HF myší v porovnání s LF kontrolami. Podávání antidiabetik signifikantně snižovalo hladiny glukosy nalačno v porovnání s HF kontrolní skupinou, které byla podávána pouze voda; největší efekt vykazovala kombinace metforminu s vildagliptinem. Kombinace obou antidiabetik také způsobovala nesignifikantní snížení hladin insulinu, FFA a triglyceridů. Vliv léčby na glukosovou toleranci Signifikantní zvýšení hladiny krevní glukosy během OGTT u myší s HF dietou oproti LF skupině ukazuje na rozvoj T2DM u DIO myší. Antidiabetická terapie snížila výsledné hladiny glukosy v OGTT ve všech léčených skupinách. Pokles byl nejvíce patrný při kombinované léčbě, která snížila hladiny glukosy v průběhu celého testu na hodnoty srovnatelné se skupinou na LF dietě (Obr. 11).

25

Obr. 11 Orální glukosový toleranční test u DIO myší. Data pro hladinu glukosy (A) a AUCglukosa (B) jsou prezentována jako průměr ± SEM. Statistická signifikance byla vyhodnocena pomocí ANOVA s opakováním a Bonferroni post hoc testem (A) nebo dvouvýběrovým t-testem (B) oproti HF skupině na vodě (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). Koncentrace antidiabetických léčiv v plasmě Plasmatické koncentrace antidiabetických léků, naměřené po dvou týdnech léčby, prokázaly přítomnost léčiv v krvi během experimentu.

Výsledky NMR metabolomiky Necílená vícerozměrná statistická analýza Jako zdroj dat pro metabolomickou analýzu byla použita CPMG spektra vzorků moči, dále upravená binningem, normalizací a škálováním popsaným v experimentální části. V PCA modelech, znázorňujících distribuci vzorků odebraných před léčbou a po dvou a sedmi týdnech léčby, byly identifikovány dvě myši, jejichž vzorky byly odlehlé ve všech odběrech, tyto vzorky byly vyloučeny z vyhodnocení všech NMR i biochemických experimentů. Cílem následující PLS-DA analýzy bylo identifikovat a popsat spektrální charakteristiky, na základě kterých lze identifikovat rozdělení vzorků na skupiny léčených a kontrolních myší na HF dietě. PLS-DA score ploty pro všechny druhy terapie v krátkodobém i dlouhodobém horizontu jsou prezentovány na Obr. 12. Pro nalezení nejdůležitějších metabolitů v modelech krátko- i dlouhodobé léčby bylo vybráno prvních třicet binů s nejvyššími hodnotami VIP skóre (všechny vybrané biny měly VIP hodnoty ≥ 1,5). V dalším kroku byla určena statistická významnost změn všech binů ve spektru pomocí parametrického i neparametrického testu, jak je popsáno v experimentální části, a označili biny, které mají současně v obou testech p-hodnotu < 0,05. Biny vybrané pomocí VIP skóre a obou testů byly s pomocí databází a dříve publikovaných spektrálních dat přiřazeny k potenciálním metabolitům a shrnuty do Tab. V. Z této tabulky je zřejmé, že u mnoha metabolitů byly signifikantní změny nezávisle potvrzeny oběma uvedenými postupy. Pareto škálování, standardně používané pro NMR data, však i přes určitou kompenzaci rozdílů v zastoupeních jednotlivých metabolitů stále ponechává koncentrovanějším metabolitům větší vliv na výsledný PLS-DA model. Proto byly na jednu stranu pomocí VIP hodnot identifikovány i nesignifikantní změny intenzivních signálů (např. citrátu) a na druhou stranu statisticky významné změny málo koncentrovaných metabolitů (např. 2-PY a 4-PY) se do hlavních latentních proměnných a do výsledného rozdělení skupin nepromítly.

26

Obr. 12 Srovnání score plotů PLS-DA modelů vypočítaných pro jednotlivé typy terapie po dvou a sedmi týdnech léčby

Identifikace a kvantifikace metabolitů Vizuální kontrola CPMG spekter potvrdila, že mnohé signály přesahují hranice binů a naopak na ploše určitých binů se podílí více signálů, proto byly u metabolitů identifikovaných v tabulce V upřesněny intenzity jejich signálů pomocí binů o šířce 0,01 ppm, jak je popsáno v experimentální části. Grafy na Obr. 13a,b znázorňují vývoj koncentrací všech metabolitů, které léčba signifikantně změnila. Výsledný stav na konci pokusu je zobrazen pomocí box-plotů, kam byly připojeny i odpovídající hodnoty štíhlých myší na LF dietě. Informace z obrázků 13a,b doplněné o údaje z tabulky V tak poskytují celkový přehled o velikosti a signifikanci metabolických změn, vyvolaných různými druhy antidiabetické terapie v horizontu dvou a sedmi týdnů. Při hodnocení grafů a box-plotů je nutné si uvědomit, že i léčeným skupinám myší byla po celou dobu experimentu podávána HF dieta, takže do hladin jednotlivých metabolitů se promítá kromě efektu antidiabetické terapie také vliv dále se rozvíjející obezity. Z tohoto důvodu se ve vývojovém grafu antidiabetický zásah projeví většinou pouze potlačením nebo zesílením stávajícího trendu.

27

metformin

vildagliptin

kombinace

28

2 týdny 7 týdnů 2 týdny 7 týdnů 2 týdny 7 týdnů ovlivněné biny metabolit VIP test VIP test VIP test VIP test VIP test VIP test ↑ — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 0.86, 0.90, 1.30, 1.58, 1.62, 2.30 deriváty BCAA a oxo-kyselin ↑ — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ — ↑ ↑ 0.94, 2.02, 2.18 N-isovaleroylglycin, 2-oxovalerát ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 1.34 laktát, 2-hydroxyisobutyrát — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 1.86, 1.90, 6.82 vinylacetylglycin — — — — ↑ ↑ ↑ — — ↑ — 1.94 acetát — — — — ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ 2.06 nepřiřazené acetyly — — ↑ ↑ — — ↑ ↑ — — ↑ ↑ 2.38, 3.30 N-karbamoyl-β-alanin ↓ ↓ — — ↓ — ↓ — ↓ ↓ — — 2.42 sukcinát — — ↑ — ↓ ↓ — — ↓ — ↑ — 2.46, 3.02 2-oxoglutarát ↓ — ↓ — ↓ — — — ↓ — — — 2.54, 2.58, 2.66, 2.70 citrát ↑ ↑ ↑ ↑ — — — — — — — ↑ 2.62 methylamin x x ↓ ↓ ↑ — — — x x ↓ ↓ 2.86, 2.90 trimethylamin ↑ ↑ — ↑ — ↑ — — ↑ ↑ — ↑ 2.94 dimethylglycin ↑ — ↑ — — — — — — — — — 3.14 cis-aconitát, ethanolamin ↑ — — — — — ↑ ↑ — — — — 3.26, 3.42, 3.46 taurin — — ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 3.66, 3.74, 7.34, 7.38, 7.42 fenylacetylglycin — — — — ↑ ↑ ↑ ↑ — — ↑ ↑ 3.82 guanidoacetát — — — — ↑ ↑ — — — — ↓ ↓ 3.94 kreatin — — — — — — — — — — ↓ ↓ 4.06 kreatinin — — — ↓ — — ↓ ↓ — — — ↓ 5.22, 5.26 glukosa, galaktosa ↓ — — — — — — — — — — — 5.38 allantoin — — — — — ↓ — — — ↓ — — 6.54 fumarát — — — — ↑ ↑ — ↑ ↑ ↑ — ↑ 7.18, 7.22, 7.26, 7.30, 7.50, 7.70 3-indoxylsulfát — — ↓ ↓ — — — — — ↓ — — 7.54, 7.58, 7.62, 7.66, 7.82, 7.86 hippurát — — — — — — — ↓ — ↓ — ↓ 7.98, 8.54 N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid — — — — — — — ↓ — ↓ — ↓ 8.34 N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid — — — — — x — — — x — ↓ 8.90, 8.98, 9.26, 9.30 N1-methylnicotinamid ↑ signifikantní nárůst koncentrace; ↓ signifikantní pokles koncentrace; x sousední biny se signifikantně mění opačným směrem; BCAA větvené aminokyseliny

Tab. V Výsledky VIP skóre, t-testu i Wilcoxon-Mann-Whitney testu pro jednotlivé terapie po 2 a 7 týdnech léčby: souhrn signifikantně změněných binů. Jsou vyznačeny biny s VIP skóre ≥ 1,5 (VIP), signifikantně změněné v parametrickém i neparametrickém testu (test)

29 Obr. 13a Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Je znázorněn vývoj koncentrace v průběhu terapie a odpovídající box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

30 Obr. 13b Metabolity signifikantně ovlivněné antidiabetickou léčbou. Je znázorněn vývoj koncentrace v průběhu terapie a odpovídající box-plot pro konečný stav po 7 týdnech léčby. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, signifikance z t-testu vůči kontrolní HF skupině: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. m ... metformin, v ... vildagliptin, m+v ... kombinace, HF ... HF kontroly na vodě, LF ... LF kontroly

V alifatické části spektra 0,80 – 2,20 ppm byly detekovány signifikantní změny signálů patřících derivátům aminokyselin a alifatických kyselin. Za pomoci dodatečných informací z COSY a HMQC experimentů byl sice jednoznačně identifikován hexanoylglycin, N-isovaleroylglycin a 2-oxovalerát, avšak kvůli vzájemnému překryvu jejich signálů v protonových spektrech nebylo možné vybrat vhodný signál pro jejich individuální kvantifikaci. Jelikož se ale všechny alifatické signály těchto metabolitů (dotčené biny jsou vypsány v Tab. V) měnily stejnou měrou, celá skupina byla posuzována společně. Hladiny 2-oxovalerátu a všech identifikovaných acylglycinů v průběhu experimentu klesaly, u léčených skupin obézních myší byl však pozorován mírnější pokles a v důsledku toho vyšší závěrečné koncentrace ve srovnání s obézními neléčenými kontrolami. Opačné trendy byly pozorovány u N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamidu (2-PY) a N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamidu (4-PY), jejichž koncentrace u všech HF skupin během experimentu rostla. Antidiabetická terapie snižovala hladiny 2-PY a 4-PY směrem k hodnotám štíhlých myší, největší vliv měla léčba kombinací metforminu s vildagliptinem. Podobný průběh byl zaznamenán i při vývoji hladin N-karbamoyl-βalaninu s tím rozdílem, že výsledná separace léčených a neléčených HF skupin byla na konci experimentu podstatně výraznější. Léčba vildagliptinem a kombinací zvýšila již tak rostoucí koncentrace 3-indoxylsulfátu, ovšem jejich výsledná hodnota u myší na LF dietě byla naopak výrazně nižší. Ačkoliv hladiny acetátu u štíhlých a kontrolních obézních myší byly v průběhu pokusu zcela srovnatelné, dlouhodobá léčba vildagliptinem výrazně zvedla jeho koncovou koncentraci. Ve skupině léčené kombinovanou terapií byla zvýšená hladina acetátu vyvolána jeho několikanásobným nárůstem u dvou myší. Podobně vychýlila antidiabetická terapie hladiny fenylacetylglycinu; které se mezi HF a LF skupinou na vodě nelišily: léčbou došlo ke zvýšení průměrných koncentrací, avšak spojenému zároveň i se zvýšeným rozptylem dat. Dlouhodobá léčba zejména vildagliptinem signifikantně snižovala hladinu glukosy v moči obézních myší. Průběžně rostoucí koncentrace cis-akonitátu byly také sníženy sedmitýdenní vildagliptinovou nebo kombinovanou léčbou směrem k hodnotám myší na LF dietě. Všechny léčené skupiny měly na konci experimentu signifikantně zvýšený signál u 1,34 ppm (data nejsou prezentována). Analýza 2D NMR spekter potvrdila, že v protonovém spektru dochází k překryvu levého píku dubletu laktátu a singletu 2-hydroxyisovalerátu a na pozorovaném nárůstu se tedy podílejí potenciální změny obou metabolitů. Druhý signál laktátu – kvartet u 4,12 ppm - nebylo možné ve většině spekter kvůli překryvu ani identifikovat a protože tyto metabolity nemají v protonovém spektru další signály, nebyl vliv terapie na jejich hladiny dále diskutován. Léčené skupiny myší se také oproti neléčeným obézním kontrolám na konci terapie významně lišily v koncentracích dimethylglycinu, kreatininu, karnitinu, methylaminu, sukcinátu a 2-oxoglutarátu. Hladiny těchto metabolitů však bohužel výrazně kolísaly již před zahájením antidiabetické léčby, takže jejich výsledný stav po terapii má jenom velmi omezenou vypovídací hodnotu. Korelace koncentrací metabolitů v moči s biochemickými daty Aby bylo možné určit, které metabolické změny souvisejí přímo s diabetem a neodrážejí pouze vliv dalších faktorů, byly koncentrace signifikantních metabolitů u všech HF myší korelovány s jejich hladinami plasmatické glukosy, vyjádřenými pomocí parametru AUC z OGTT. Protože s rozvojem obezity a diabetu se často pojí také steatosa jater, stejným způsobem byly u všech myší korelovány hladiny metabolitů i s hmotností jater, vztaženou na celkovou hmotnost myši. V tabulce VI jsou shrnuty metabolity, které byly signifikantně ovlivněny léčbou a zároveň je jejich Pearsonův korelační koeficient s AUC nebo relativní hmotností jater signifikantně větší než ± 0,40 (p < 0,05).

31

Tab. VI Korelace významných metabolitů s hodnotami AUC z OGTT a relativní hmotností jater játra/BW

AUC z OGTT metabolit N-karbamoyl-β-alanin 2-PY 4-PY IVG + 2-oxovalerát hexanoylglycin vinylacetylglycin 3-indoxylsulfát cis-akonitát dimethylglycin glukosa glukosa v plasmě (AUC z OGTT)

korelační koeficient 0,76 0,55 0,52 -0,44 -0,43 -0,41 -0,40 0,40 -0,59 0,49 1,00

p hodnota <0,0005 <0,0005 0,001 0,005 0,007 0,011 0,013 0,014 <0,0005 0,002 <0,0005

korelační koeficient 0,79 0,74 0,70 -0,25 -0,37 -0,29 -0,25 0,08 -0,56 0,65 0,73

p hodnota <0,0005 <0,0005 <0,0005 0,133 0,024 0,074 0,123 0,616 <0,0005 <0,0005 <0,0005

Diskuse Biochemické parametry V této studii nebyl pozorován statisticky významný vliv podávání antidiabetických léčiv na tělesnou hmotnost DIO myší, na celkové množství tukové tkáně ani na hladiny leptinu v plasmě. Na druhou stranu však léčba metforminem, vildagliptinem i jejich kombinací signifikantně snižovala hmotnost jater, což by naznačovalo zvrat ve steatose jater. Signifikantní snížení hladiny glukosy nalačno stejně tak jako normalizace glykemické křivky OGTT vlivem všech tří typů antidiabetické léčby ukazuje na zlepšení glukosové tolerance a tudíž i zlepšení prediabetického stavu DIO myší. NMR metabolomika Nárůst koncentrace derivátů N1-methyl nikotinamidu včetně 2-PY a 4-PY byl popsán u několika myších modelů obezity: u DIO modelu [116], modelu chemicky indukované obezity [160] a u db/db myší [92]. Nárůst metabolitů MNA v moči se ukázal jako pozitivní biomarker proliferace peroxisomů [137,138], který souvisí se zánětem, obezitou a metabolickým syndromem [139,140]. Srovnání změn v moči diabetických myší, potkanů a lidí [92] a jejich korelace s klinickými daty diabetických pacientů ukázalo, že MNA a 2-PY může sloužit jako vhodný marker pro sledování T2DM. V naší studii byl také pozorován postupný růst koncentrací 2-PY a 4-PY během rozvoje obezity u všech skupin krmených HF dietou. Tento trend signifikantně snižovala antidiabetická terapie směrem k hodnotám štíhlých myší, přičemž kombinace metforminu s vildagliptinem se jevila účinnější než monoterapie. Koncentrace 2-PY a 4-PY v moči všech myší na HF dietě vykázaly pozitivní korelaci se dvěma důležitými parametry, s krevní glukosou vyjádřenou jako AUC pro OGTT a relativní hmotností jater. Tyto korelace potvrzují, že 2-PY a 4-PY lze využít jako markery při studiu diabetu. N-karbamoyl-β-alanin je další metabolit výrazně ovlivněný všemi typy antidiabetické léčby, avšak o jeho funkci v metabolismu je toho dosud jen málo známo. Jung a spol. pozorovali zvýšené koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu u stejného kmenu C57BL/6 při podávání vysokotukové diety 32

ve srovnání se stejnými zvířaty krmenými vysokosacharidovou dietou [115]. Významně vyšší hladiny N-karbamoyl-β-alaninu byly zaznamenány u LDLR-/- myší krmených Western dietou [161] a také u db/db myší [92]. Zajímavým zjištěním je role β-alaninu při ochraně jater před poškozením hypoxií v modelu Wistar potkanů [162]. Zvýšená koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu v moči obézních myší tak může být vnímána jako kompenzační reakce na zhoršující se steatosu jater v průběhu rozvoje obezity a T2DM, zatímco její pokles v léčených skupinách může odrážet zlepšení funkce jater vlivem antidiabetické terapie. Tato domněnka je navíc podpořena významnou pozitivní korelací hladiny N-karbamoyl-β-alaninu s relativní hmotností jater na konci pokusu. Protože je koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu silně korelována též s koncentrací plasmatické glukosy při OGTT, lze hladiny tohoto metabolitu v moči považovat za slibný marker diabetu. Vlivem terapie došlo také ke změně hladin některých acyglycinů. Protože acylglyciny vznikají z acyl-koenzymuA produkovaného v průběhu β-oxidace mastných kyselin, mohou zvýšené koncentrace hexanoylglycinu, N-isovaleroylglycinu a vinylacetylglycinu v moči léčených obézních myší znamenat zvýšenou rychlost β-oxidace. Martin a kol. definovali zvýšení hladiny N-isovaleroyglycinu v moči jako indikátor pravděpodobné rezistence vůči HF dietě a jí vyvolanému nárůstu váhy [163]. Podobný mechanismus by mohl stát i v pozadí zvýšených koncentrací N-isovaleroylglycinu během léčby obézních myší v naší studii, tuto domněnku by podporovala i námi pozorovaná signifikantně vyšší koncentrace zmiňovaných acylglycinů v moči štíhlých myší na LF dietě oproti obézním myším. Zároveň byla potvrzena středně silná negativní korelace mezi koncentrací acyglycinů v moči a AUC z OGTT. Také v naší nedávno publikované práci [160] byly popsány signifikantně nižší hladiny N-isovaleroylglycinu, hexanoylglycinu a dalších derivátů alifatických kyselin v moči myší s MSG indukovanou obezitou v porovnání se štíhlými kontrolami. Detailní kontrola informací v dodatku publikace [92] odhalila stejné trendy i v datech db/db myší, pokles hladiny N-isovaleroylglycinu byl publikován též v moči obézních pacientů [202]. Koncentrace acetátu, konečného produktu β-oxidace, se v této studii vlivem HF diety a rozvoje obezity nijak nezměnila, nebyla pozorována ani jeho korelace s AUC v OGTT. Jeho hladinu však významně zvedlo podávání vildagliptinu samotného; zvýšení koncentrace při léčbě vildagliptinem v kombinaci s metforminem je způsobeno dvěma odlehlými hodnotami. Mechanismus této odezvy organismu na vildagliptinovou monoterapii není uspokojivě objasněn. Zajímavým zjištěním této studie je snížená koncentrace glukosy v moči vlivem všech variant antidiabetické terapie, která je pozitivně korelovaná nejen s hodnotami plasmatické glukosy v OGTT, ale výrazněji i s relativní hmotností jater. Hladiny některých metabolitů citrátového cyklu výrazně fluktuovaly během terapie, nebylo tedy možné jednoznačně odlišit přirozenou variabilitu těchto metabolitů mezi jednotlivými zvířaty od případného efektu krátko- či dlouhodobé antidiabetické léčby. Jedinou výjimkou byl cis-akonitát, jehož koncentrace se terapií výrazně snížila.

33

6

Závěry

Vyhodnocení vlivu způsobu odběru moči, volby pulsní sekvence a normalizace dat potvrdilo, že doporučovaný a hojně používaný standardní protokol není pro myší modely indukované obezity optimální. Zatímco v modelech s indukovanou obezitou se ukázalo výhodné používat 24hodinový odběr bez přístupu k potravě, u modelů geneticky modifikovaných bude nutné předem ověřit vliv hladovění pro modelovou a kontrolní skupinu zvlášť. Detekce metabolitů ve standardních 1D-NOESY spektrech moči je výrazně zkomplikována velkým a průběžně se měnícím množstvím přirozeně se vyskytujících proteinů. Z tohoto důvodu bylo navrženo metabolomické studie moči založit na CPMG experimentech, jejichž spektra dovolují identifikaci a přesnější kvantifikaci málo koncentrovaných metabolitů například v aromatické oblasti. V těchto spektrech také poskytují normalizace na celkovou plochu, na signál kreatininu i pravděpodobnostní kvocientová normalizace celkem srovnatelné výsledky. Studie modelu s MSG indukovanou obezitou odhalila četné odchylky v metabolickém složení moči obézních MSG myší ve srovnání s močí štíhlých kontrol a ukázala výrazný vliv stárnutí na obě skupiny zvířat. Výsledky standardních biochemických parametrů prokázaly, že u MSG myší ve věku dvou a šesti měsíců došlo k rozvinutí obezity s hyperleptinemií a hyperinsulinemií. Nejdůležitějším zjištěním NMR metabolomické studie byly změny v metabolismu nikotinamidu a polyaminů a potlačená exkrece močových proteinů u MSG myší; tato pozorování byla podpořena také odpovídajícími trendy v expresích mRNA pro enzymy NNMT a MUP-1. Kromě toho byly detekovány také změny v koncentracích allantoinu, methylaminu a fenylacetylglycinu. Během stárnutí bylo pozorováno sblížení původně odlišných hladin kreatinu, citrátu, acetátu a sukcinátu. Přestože biochemické parametry, indikující rozvoj obezity a insulinové rezistence, byly v devíti měsících věku u MSG myší normalizovány na úroveň štíhlých kontrol, NMR metabolomika i v tomto věku pozorovala přetrvávající změnu metabolického složení moči MSG myší. Ukazuje se tedy, že metabolomický přístup může reflektovat změny v metabolických procesech i za stavu, kdy standardní parametry rozdíly nejsou schopny zaznamenat. NMR metabolomika prokázala signifikantní vliv sedmitýdenní léčby metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací na hladiny některých metabolitů v moči obézních DIO myší, přičemž efekt terapie se začal projevovat už po dvou týdnech podávání antidiabetických léků. Účinek terapie byl nezávisle potvrzen zlepšením biochemických parametrů: snížením hladiny glukosy nalačno a normalizací glykemické křivky v OGTT; bylo též zjištěno snížení hmotnosti jater. Nejvýznamnějším výsledkem metabolomické studie je signifikantní pokles koncentrace N-karbamoyl-β-alaninu a derivátů nikotinamidu 2-PY a 4-PY působením všech tří variant antidiabetické terapie. Přímá souvislost změny těchto metabolitů s projevem diabetu byla potvrzena korelací s AUC v OGTT, zajímavá je i jejich korelace s hmotností jater. Zatímco vliv diabetu na hladiny 2-PY a 4-PY byl již dříve v literatuře popsán, N-karbamoyl-β-alanin byl v této studii poprvé představen jako možný marker diabetu. Porovnání výsledků jednotlivých terapií ukazuje, že největší vliv na hladiny sledovaných metabolitů měla kombinovaná léčba; léčba samotným vildagliptinem pak byla účinnější než metforminová monoterapie. Přínos této studie k terapii diabetu spočívá v propojení standardních biochemických parametrů s informací o změně metabolických procesů vyvolané podáním jednotlivých antidiabetik. Získané výsledky mohou do budoucna přispět k vytvoření tzv. personalizované medicíny, kdy vhodná léčba bude jednotlivým pacientům indikována na základě znalosti jejich individuálních metabolických parametrů.

34

Z experimentálního hlediska lze říci, že větším problémem než často zmiňovaná malá citlivost NMR spektroskopie se jeví výrazný překryv signálů ve spektrech moči. Tato skutečnost sice nikterak neovlivní výsledné statistické modely, vybudované v rámci necílené analýzy z binovaných spekter, ale výrazně komplikuje následnou identifikaci a znemožňuje kvantifikaci celé řady významných metabolitů. Situaci by mohlo mírně zlepšit zařazení algoritmů pro synchronizaci píků, ale řešení přinese zřejmě až využití vylepšených kvantitativních 2D pulsních sekvencí. Zároveň se také prokázalo, že pro spolehlivé vyhodnocení NMR dat a výběr relevantních informací je nezbytné kombinovat více statistických přístupů. Výsledky PLS-DA modelů potvrzené parametrickými a neparametrickými testy označí signifikantní rozdíly ve spektrech, ale velikost změny takto určených metabolitů stanoví až kvantitativní analýza. Teprve korelace s nezávislým biochemickým parametrem může poté ukázat, nakolik metabolické změny, identifikované a kvantifikované výše zmíněným postupem, přímo souvisejí se studovaným jevem. Výsledky disertační práce potvrdily, že NMR metabolomika je vhodný nástroj ke studiu a charakterizaci myších modelů. Srovnání se standardními biochemickými parametry prokázalo, že NMR spektra moči dobře odrážejí probíhající metabolické procesy. Po vyhodnocení multivariačními statistickými metodami lze na základě získaných metabolických dat nejen rozlišit jednotlivé skupiny sledovaných zvířat, ale i označit potenciální markery studovaného stavu. Tyto poznatky mohou přispět jak pochopení molekulární podstaty obezity a diabetu, tak v budoucnu k rozvoji personalizované medicíny.

35

7 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20]

[21] [22] [23] [24] [25] [26] [27]

[28] [29] [30] [31]

Literatura J.K. Nicholson, J.C. Lindon, E. Holmes, Xenobiotica. 29 (1999) 1181. O. Fiehn, Plant Mol. Biol. 48 (2002) 155. D.I. Ellis, W.B. Dunn, J.L. Griffin, J.W. Allwood, R. Goodacre, Pharmacogenomics 8 (2007) 1243. M.K. Gulston, C.M. Titman, J.L. Griffin, Biomark. Med. 1 (2007) 575. A. Alonso, S. Marsal, A. Julià, Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (2015) 23. A. Zhang, H. Sun, P. Wang, Y. Han, X. Wang, Analyst 137 (2012) 293. W.B. Dunn, D.I. Broadhurst, H.J. Atherton, R. Goodacre, J.L. Griffin, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 387. E. Ortiz-Villanueva, J. Jaumot, F. Benavente, B. Piña, V. Sanz-Nebot, R. Tauler, Electrophoresis 36 (2015) 2324. A. Hirayama, M. Wakayama, T. Soga, TrAC Trends Anal. Chem. 61 (2014) 215. P. Jonsson, A.I. Johansson, J. Gullberg, J. Trygg, J. A, B. Grung, S. Marklund, M. Sjöström, H. Antti, T. Moritz, Anal. Chem. 77 (2005) 5635. A.C. Peterson, A.J. Balloon, M.S. Westphall, J.J. Coon, Anal. Chem. 86 (2014) 10044. M.M. Koek, R.H. Jellema, J. van der Greef, A.C. Tas, T. Hankemeier, Metabolomics 7 (2011) 307. M. Berg, M. Vanaerschot, A. Jankevics, B. Cuypers, R. Breitling, J.-C. Dujardin, Comput. Struct. Biotechnol. J. 4 (2013) e201301002. B. Zhou, J.F. Xiao, L. Tuli, H.W. Ressom, Mol. Biosyst. 8 (2012) 470. G. Hopfgartner, E. Varesio, Metabolomics Pract. Success. Strateg. to Gener. Anal. Metab. Data (2013) 21. R.E. Williams, E.M. Lenz, J.A. Evans, I.D. Wilson, J.H. Granger, R.S. Plumb, C.L. Stumpf, J. Pharm. Biomed. Anal. 38 (2005) 465. E.J. Want, I.D. Wilson, H. Gika, G. Theodoridis, R.S. Plumb, J. Shockcor, E. Holmes, J.K. Nicholson, Nat. Protoc. 5 (2010) 1005. H. Sun, S. Zhang, A. Zhang, G. Yan, X. Wu, Y. Han, X. Wang, PLoS One 9 (2014) e93384. Y. Zhu, Y. Feng, L. Shen, D. Xu, B. Wang, K. Ruan, W. Cong, J. Chromatogr. B 925 (2013) 110. J.L. Ward, J.M. Baker, S.J. Miller, C. Deborde, M. Maucourt, B. Biais, D. Rolin, A. Moing, S. Moco, J. Vervoort, A. Lommen, H. Schäfer, E. Humpfer, M.H. Beale, Metabolomics 6 (2010) 263. C.J. Clarke, J.N. Haselden, Toxicol. Pathol. 36 (2008) 140. H. Kovacs, D. Moskau, M. Spraul, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2005) 131. J.H. Grimes, T.M. O’Connell, J. Biomol. NMR 49 (2011) 297. G. Schlotterbeck, A. Ross, R. Hochstrasser, H. Senn, T. Kühn, D. Marek, O. Schett, Anal. Chem. 74 (2002) 4464. A. Zhang, H. Sun, P. Wang, Y. Han, X. Wang, J. Proteomics 75 (2012) 1079. E.J. Saude, D. Adamko, B.H. Rowe, T. Marrie, B.D. Sykes, Metabolomics 3 (2007) 439. S. Bouatra, F. Aziat, R. Mandal, A.C. Guo, M.R. Wilson, C. Knox, T.C. Bjorndahl, R. Krishnamurthy, F. Saleem, P. Liu, Z.T. Dame, J. Poelzer, J. Huynh, F.S. Yallou, N. Psychogios, E. Dong, R. Bogumil, C. Roehring, D.S. Wishart, PLoS One 8 (2013) e73076. O. Beckonert, H.C. Keun, T.M.D. Ebbels, J. Bundy, E. Holmes, J.C. Lindon, J.K. Nicholson, Nat. Protoc. 2 (2007) 2692. P. Bernini, I. Bertini, C. Luchinat, P. Nincheri, S. Staderini, P. Turano, J. Biomol. NMR 49 (2011) 231. C. Schreier, W. Kremer, F. Huber, S. Neumann, P. Pagel, K. Lienemann, S. Pestel, Biomed Res. Int. 2013 (2013). E. Saude, B. Sykes, Metabolomics 3 (2007) 19.

36

[32]

[33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67]

A.-H. Emwas, C. Luchinat, P. Turano, L. Tenori, R. Roy, R.M. Salek, D. Ryan, J.S. Merzaban, R. Kaddurah-Daouk, A.C. Zeri, G.A. Nagana Gowda, D. Raftery, Y. Wang, L. Brennan, D.S. Wishart, Metabolomics 11 (2014). G. Zheng, W.S. Price, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 56 (2010) 267. P. Giraudeau, V. Silvestre, S. Akoka, Metabolomics 11 (2015) 1041. R.T. Mckay, Concepts Magn. Reson. Part A 38A (2011) 197. H. Carr, E. Purcell, Phys. Rev. 94 (1954) 630. S. Meiboom, D. Gill, Rev. Sci. Instrum. 29 (1958) 688. W.P. Aue, J. Karhan, R.R. Ernst, J. Chem. Phys. 64 (1976) 4226. T. Wang, K. Shao, Q. Chu, Y. Ren, Y. Mu, L. Qu, J. He, C. Jin, B. Xia, BMC Bioinformatics 10 (2009) 83. J.L. Izquierdo-García, I. Rodríguez, A. Kyriazis, P. Villa, P. Barreiro, M. Desco, J. Ruiz-cabello, BMC Bioinformatics 10 (2009) 1. M.R. Viant, Biochem. Biophys. Res. Commun. 310 (2003) 943. C. Ludwig, U.L. Günther, BMC Bioinformatics 12 (2011) 366. J.L. Izquierdo-García, P. Villa, A. Kyriazis, L. del Puerto-Nevado, S. Pérez-Rial, I. Rodriguez, N. Hernandez, J. Ruiz-Cabello, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 59 (2011) 263. Y. Xi, D.M. Rocke, BMC Bioinformatics 9 (2008) 324. T. Vu, K. Laukens, Metabolites 3 (2013) 259. J. Forshed, R.J.O. Torgrip, K.M. Aberg, B. Karlberg, J. Lindberg, S.P. Jacobsson, J. Pharm. Biomed. Anal. 38 (2005) 824. M. Spraul, P. Neidig, U. Klauck, P. Kessler, E. Holmes, J.K. Nicholson, B.C. Sweatman, S.R. Salman, R.D. Farrant, E. Rahr, J. Pharm. Biomed. Anal. 12 (1994) 1215. T. De Meyer, D. Sinnaeve, B. Van Gasse, E. Tsiporkova, E.R. Rietzschel, M.L. De Buyzere, T.C. Gillebert, S. Bekaert, J.C. Martins, W. Van Criekinge, Anal. Chem. 80 (2008) 3783. R.A. Davis, A.J. Charlton, J. Godward, S.A. Jones, M. Harrison, J.C. Wilson, Chemom. Intell. Lab. Syst. 85 (2007) 144. P.E. Anderson, D. a. Mahle, T.E. Doom, N. V. Reo, N.J. DelRaso, M.L. Raymer, Metabolomics 7 (2010) 179. S.A.A. Sousa, A. Magalhães, M.M.C. Ferreira, Chemom. Intell. Lab. Syst. 122 (2013) 93. P.E. Anderson, N. V. Reo, N.J. DelRaso, T.E. Doom, M.L. Raymer, Metabolomics 4 (2008) 261. S.M. Kohl, M.S. Klein, J. Hochrein, P.J. Oefner, R. Spang, W. Gronwald, Metabolomics 8 (2012) 146. A. Craig, O. Cloarec, E. Holmes, J.K. Nicholson, J.C. Lindon, Anal. Chem. 78 (2006) 2262. B.M. Warrack, S. Hnatyshyn, K.-H. Ott, M.D. Reily, M. Sanders, H. Zhang, D.M. Drexler, J. Chromatogr. B 877 (2009) 547. P. Giraudeau, I. Tea, G.S. Remaud, S. Akoka, J. Pharm. Biomed. Anal. 93 (2014) 3. F. Dieterle, A. Ross, G. Schlotterbeck, H. Senn, Anal. Chem. 78 (2006) 4281. A. H. Garde, A.M. Hansen, J. Kristiansen, L.E. Knudsen, Ann. Occup. Hyg. 48 (2004) 171. D. Ryan, K. Robards, P.D. Prenzler, M. Kendall, Anal. Chim. Acta 684 (2011) 17. R.A. van den Berg, H.C.J. Hoefsloot, J.A. Westerhuis, A.K. Smilde, M.J. van der Werf, BMC Genomics 7 (2006) 142. J.E. Jackson, A User’s Guide to Principal Components, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 1991. L. Eriksson, E. Johansson, M. Kettaneh-Wold, S. Wold, Introd. to Multi- Megavariate Data Anal. Using Proj. Methods (PCA PLS) (1986) Umetrics, Umea, Sweden. M. De Iorio, T.M.D. Ebbels, D. A Stephens, Order A J. Theory Ordered Sets Its Appl. (2003) 1. J.C. Lindon, E. Holmes, J.K. Nicholson, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 39 (2001) 1. A. Smolinska, L. Blanchet, L.M.C. Buydens, S.S. Wijmenga, Anal. Chim. Acta 750 (2012) 82. T.M.D. Ebbels, R. Cavill, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (2009) 361. K. Baumann, TrAC Trends Anal. Chem. 22 (2003) 395. 37

[68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105]

J. A. Westerhuis, H.C.J. Hoefsloot, S. Smit, D.J. Vis, A.K. Smilde, E.J.J. Velzen, J.P.M. Duijnhoven, F. A. Dorsten, Metabolomics 4 (2008) 81. E. Anderssen, K. Dyrstad, F. Westad, H. Martens, Chemom. Intell. Lab. Syst. 84 (2006) 69. S. Bijlsma, I. Bobeldijk, E.R. Verheij, R. Ramaker, S. Kochhar, I.A. Macdonald, B. van Ommen, A.K. Smilde, Anal. Chem. 78 (2006) 567. T. Mehmood, K.H. Liland, L. Snipen, S. Sæbø, Chemom. Intell. Lab. Syst. 118 (2012) 62. B. Xie, M.J. Waters, H.J. Schirra, J. Biomed. Biotechnol. 2012 (2012) 805683. M. Qatanani, M.A. Lazar, Genes Dev. 21 (2007) 1443. P. Chen, J. Liu, Adv. Ther. 24 (2007) 1036. J.H. Faber, D. Malmodin, H. Toft, A.D. Maher, D. Crockford, E. Holmes, J.K. Nicholson, M.E. Dumas, D. Baunsgaard, J. Diabetes Sci. Technol. 1 (2007) 549. J.R. Bain, R.D. Stevens, B.R. Wenner, O. Ilkayeva, D.M. Muoio, C.B. Newgard, Diabetes 58 (2009) 2429. M.H. Abu Bakar, M.R. Sarmidi, K.-K. Cheng, A. Ali Khan, C.L. Suan, H. Zaman Huri, H. Yaakob, Mol. Biosyst. 11 (2015) 1742. S. Park, K.C. Sadanala, E.-K. Kim, Mol. Cells 38 (2015) 587. F. Du, A. Virtue, H. Wang, X.-F. Yang, Biomark. Res. 1 (2013) 17. L. Thibault, Animal Models for the Study of Human Disease, Elsevier, 2013. J.L. Griffin, Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (2006) 309. K. Srinivasan, P. Ramarao, Indian J. Med. Res. 125 (2007) 451. A. Chatzigeorgiou, A. Halapas, K. Kalafatakis, E. Kamper, In Vivo 23 (2009) 245. J. Speakman, C. Hambly, S. Mitchell, E. Król, Lab. Anim. 42 (2008) 413. K. Kanasaki, D. Koya, J. Biomed. Biotechnol. 2011 (2011) 197636. R. Buettner, J. Schölmerich, L.C. Bollheimer, Obesity 15 (2007) 798. L. Carroll, J. Voisey, A. van Daal, Clin. Dermatol. 22 (2004) 345. T. A Lutz, S.C. Woods, Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5 (2012) Unit5.61. H. Chen, O. Charlat, L.A. Tartaglia, E.A. Woolf, X. Weng, S.J. Ellis, N.D. Lakey, J. Culpepper, K.J. More, R.E. Breitbart, G.M. Duyk, R.I. Tepper, J.P. Morgenstern, Cell 84 (1996) 491. E.-Y. Won, M.-K. Yoon, S.-W. Kim, Y. Jung, H.-W. Bae, D. Lee, S.G. Park, C.-H. Lee, G.-S. Hwang, S.-W. Chi, PLoS One 8 (2013) e75998. L.D. Roberts, A.J. Murray, D. Menassa, T. Ashmore, A.W. Nicholls, J.L. Griffin, Genome Biol. 12 (2011) R75. R.M. Salek, M.L. Maguire, E. Bentley, D. V Rubtsov, T. Hough, M. Cheeseman, D. Nunez, B.C. Sweatman, J.N. Haselden, R.D. Cox, S.C. Connor, J.L. Griffin, Physiol. Genomics 29 (2007) 99. S.C. Connor, M.K. Hansen, A. Corner, R.F. Smith, T.E. Ryan, Mol. Biosyst. 6 (2010) 909. N. Saadat, H.B. IglayReger, M.G. Myers, P. Bodary, S. V Gupta, Physiol. Genomics 44 (2012) 374. J. Bunyan, E.A. Murrell, P.P. Shah, Br. J. Nutr. 35 (2008) 25. M. Nagata, W. Suzuki, S. Iizuka, M. Tabuchi, H. Maruyama, S. Takeda, M. Aburada, K. Miyamoto, Exp. Anim. 55 (2006) 109. J.W. Olney, Science. 164 (1969) 719. F. Elefteriou, S. Takeda, X. Liu, D. Armstrong, G. Karsenty, Endocrinology 144 (2003) 3842. B. Zelezná, J. Maixnerová, R. Matysková, R. Haugvicová, D. Blokesová, L. Maletínská, Physiol. Res. 58 (2009) 717. K. Edelstein, J.G. Pfaus, B. Rusak, S. Amir, Brain Res. 675 (1995) 135. R.E. Mistlberger, M.C. Antle, Brain Res. 842 (1999) 73. A. Djazayery, D.S. Miller, M.J. Stock, Ann. Nutr. Metab. 23 (1979) 357. L. Maletínská, R.S. Toma, Z. Pirnik, A. Kiss, J. Slaninová, M. Haluzík, B. Zelezná, Regul. Pept. 136 (2006) 58. H. Remke, A. Wilsdorf, F. Müller, Exp. Pathol. 33 (1988) 223. R. Matysková, L. Maletínská, J. Maixnerová, Z. Pirník, A Kiss, B. Zelezná, Physiol. Res. 57 (2008) 727. 38

[106]

[107]

[108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128]

[129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137]

R.J. Hernández-Bautista, F.J. Alarcón-Aguilar, M. Del C Escobar-Villanueva, J.C. AlmanzaPérez, H. Merino-Aguilar, M.K. Fainstein, N.E. López-Diazguerrero, Int. J. Mol. Sci. 15 (2014) 11473. R. Roman-Ramos, J.C. Almanza-Perez, R. Garcia-Macedo, G. Blancas-Flores, A. Fortis-Barrera, E.I. Jasso, M. Garcia-Lorenzana, A.E. Campos-Sepulveda, M. Cruz, F.J. Alarcon-Aguilar, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 108 (2011) 406. C.-Y. Wang, J.K. Liao, Methods Mol. Biol. 821 (2012) 421. U. Hoffler, K. Hobbie, R. Wilson, R. Bai, A. Rahman, D. Malarkey, G. Travlos, B.I. Ghanayem, Endocrine 36 (2009) 311. S. Lin, T.C. Thomas, L.H. Storlien, X.F. Huang, Int. J. Obes. 24 (2000) 639. J.N. Thupari, AJP Endocrinol. Metab. 287 (2004) E97. J. Shearer, G. Duggan, A. Weljie, D.S. Hittel, D.H. Wasserman, H.J. Vogel, Diabetes. Obes. Metab. 10 (2008) 950. G.E. Duggan, D.S. Hittel, C.W. Sensen, A.M. Weljie, H.J. Vogel, J. Shearer, J. Appl. Physiol. 110 (2011) 1311. G.E. Duggan, D.S. Hittel, C.C. Hughey, A. Weljie, H.J. Vogel, J. Shearer, Diabetes. Obes. Metab. 13 (2011) 859. J.-Y. Jung, I.-Y. Kim, Y.-N. Kim, J.-S. Kim, J.-H. Shin, Z.-H. Jang, H.-S. Lee, G.-S. Hwang, J.-K. Seong, BMB Rep. 45 (2012) 419. C.L. Boulangé, S.P. Claus, C.J. Chou, S. Collino, I. Montoliu, S. Kochhar, E. Holmes, S. Rezzi, J.K. Nicholson, M.E. Dumas, F.-P.J. Martin, J. Proteome Res. 12 (2013) 1956. S.E. Inzucchi, R.M. Bergenstal, J.B. Buse, M. Diamant, E. Ferrannini, M. Nauck, A.L. Peters, A. Tsapas, R. Wender, D.R. Matthews, Diabetes Care 38 (2014) 140. J.A. Davidson, Endocr. Pract. 19 1050. G. Stamataros, S.H. Schneider, Expert Opin. Pharmacother. 12 (2011) 1967. A.J. Scheen, Expert Opin. Drug Saf. 14 (2015) 505. B. Viollet, B. Guigas, N. Sanz Garcia, J. Leclerc, M. Foretz, F. Andreelli, Clin. Sci. (Lond). 122 (2012) 253. L. Maletínská, R. Matyšková, J. Maixnerová, D. Sýkora, M. Pýchová, A. Spolcová, M. Blechová, J. Drápalová, Z. Lacinová, M. Haluzík, B. Zelezná, Mol. Cell. Endocrinol. 343 (2011) 55. K.J. Wiechelman, R.D. Braun, J.D. Fitzpatrick, Anal. Biochem. 175 (1988) 231. I.T. Jolliffe, Principal Component Analysis, Second Edition, Springer, New York, 2002. J. Kopecký, Z. Hodný, M. Rossmeisl, I. Syrový, L.P. Kozak, Am. J. Physiol. 270 (1996) E768. J. Xia, N. Psychogios, N. Young, D.S. Wishart, Nucleic Acids Res. 37 (2009) W652. J. Xia, I. V. Sinelnikov, B. Han, D.S. Wishart, Nucleic Acids Res. 43 (2015) W251. D.S. Wishart, T. Jewison, A.C. Guo, M. Wilson, C. Knox, Y. Liu, Y. Djoumbou, R. Mandal, F. Aziat, E. Dong, S. Bouatra, I. Sinelnikov, D. Arndt, J. Xia, P. Liu, F. Yallou, T. Bjorndahl, R. PerezPineiro, R. Eisner, F. Allen, V. Neveu, R. Greiner, A. Scalbert, Nucleic Acids Res. 41 (2013) D801. I.R. Lanza, S. Zhang, L.E. Ward, H. Karakelides, D. Raftery, K.S. Nair, PLoS One 5 (2010) e10538. I. Messana, F. Forni, F. Ferrari, C. Rossi, B. Giardina, C. Zuppi, Clin. Chem. 44 (1998) 1529. C.L. Gavaghan, I.D. Wilson, J.K. Nicholson, FEBS Lett. 530 (2002) 191. M.E. Bollard, E. Holmes, J.C. Lindon, S.C. Mitchell, D. Branstetter, W. Zhang, J.K. Nicholson, Anal. Biochem. 295 (2001) 194. G.C. Leo, A.L. Darrow, Magn. Reson. Chem. 47 Suppl 1 (2009) S20. K. Giller, P. Huebbe, F. Doering, K. Pallauf, G. Rimbach, Proc. Biol. Sci. 280 (2013) 20130101. X. Hui, W. Zhu, Y. Wang, K.S.L. Lam, J. Zhang, D. Wu, E.W. Kraegen, Y. Li, A. Xu, J. Biol. Chem. 284 (2009) 14050. Y. Zhou, L. Jiang, L. Rui, J. Biol. Chem. 284 (2009) 11152. J. Delaney, M.P. Hodson, H. Thakkar, S.C. Connor, B.C. Sweatman, S.P. Kenny, P.J. McGill, J.C. Holder, K. A Hutton, J.N. Haselden, C.J. Waterfield, Arch. Toxicol. 79 (2005) 208. 39

[138]

[139] [140] [141]

[142] [143] [144]

[145] [146] [147] [148]

[149] [150]

[151] [152] [153] [154] [155] [156] [157] [158] [159] [160] [161] [162] [163]

S. Ringeissen, S.C. Connor, H.R. Brown, B.C. Sweatman, M.P. Hodson, S.P. Kenny, R.I. Haworth, P. McGill, M. a Price, M.C. Aylott, D.J. Nunez, J.N. Haselden, C.J. Waterfield, Biomarkers 8 (2003) 240. S. Kersten, Eur. J. Pharmacol. 440 (2002) 223. R. Stienstra, S. Mandard, D. Patsouris, C. Maass, S. Kersten, M. Müller, Endocrinology 148 (2007) 2753. E. Pirinen, T. Kuulasmaa, M. Pietilä, S. Heikkinen, M. Tusa, P. Itkonen, S. Boman, J. Skommer, A. Virkamäki, E. Hohtola, M. Kettunen, S. Fatrai, E. Kansanen, S. Koota, K. Niiranen, J. Parkkinen, A.-L. Levonen, S. Ylä-Herttuala, J.K. Hiltunen, L. Alhonen, U. Smith, J. Jänne, M. Laakso, Mol. Cell. Biol. 27 (2007) 4953. J. Jell, S. Merali, M.L. Hensen, R. Mazurchuk, J. a Spernyak, P. Diegelman, N.D. Kisiel, C. Barrero, K.K. Deeb, L. Alhonen, M.S. Patel, C.W. Porter, J. Biol. Chem. 282 (2007) 8404. S.C. Grubb, T.P. Maddatu, C.J. Bult, M.A. Bogue, Nucleic Acids Res. 37 (2009) D720. D. Kraus, Q. Yang, D. Kong, A.S. Banks, L. Zhang, J.T. Rodgers, E. Pirinen, T.C. Pulinilkunnil, F. Gong, Y. Wang, Y. Cen, A. a Sauve, J.M. Asara, O.D. Peroni, B.P. Monia, S. Bhanot, L. Alhonen, P. Puigserver, B.B. Kahn, Nature 508 (2014) 258. Y. Zhou, L. Rui, Major Urinary Protein Regulation of Chemical Communication and Nutrient Metabolism., 1st ed., Elsevier Inc., 2010. R.J. Beynon, J.L. Hurst, Peptides 25 (2004) 1553. E. Holmes, J. V Li, T. Athanasiou, H. Ashrafian, J.K. Nicholson, Trends Microbiol. 19 (2011) 349. I.Y. Kim, J. Jung, M. Jang, Y.G. Ahn, J.H. Shin, J.W. Choi, M.R. Sohn, S.M. Shin, D.-G. Kang, H.-S. Lee, Y.S. Bae, D.H. Ryu, J.K. Seong, G.-S. Hwang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 403 (2010) 428. S.-H. Kim, S.-O. Yang, H.-S. Kim, Y. Kim, T. Park, H.-K. Choi, Anal. Bioanal. Chem. 395 (2009) 1117. C.B. Newgard, J. An, J.R. Bain, M.J. Muehlbauer, R.D. Stevens, L.F. Lien, A.M. Haqq, S.H. Shah, M. Arlotto, C. a Slentz, J. Rochon, D. Gallup, O. Ilkayeva, B.R. Wenner, W.S. Yancy, H. Eisenson, G. Musante, R.S. Surwit, D.S. Millington, M.D. Butler, L.P. Svetkey, Cell Metab. 9 (2009) 311. W.Y. Chung, I.F.F. Benzie, Clin. Chim. Acta 424 (2013) 237. R. Kand’ár, P. Záková, Clin. Chem. Lab. Med. 46 (2008) 1270. S. Yardim-Akaydin, A. Sepici, Y. Ozkan, B. Simşek, V. Sepici, Scand. J. Rheumatol. 35 (2006) 61. N. Esser, S. Legrand-Poels, J. Piette, A.J. Scheen, N. Paquot, Diabetes Res. Clin. Pract. (2014). N. Serkova, T.F. Fuller, J. Klawitter, C.E. Freise, C.U. Niemann, Kidney Int. 67 (2005) 1142. K. Fukuhara, A. Ohno, Y. Ota, Y. Senoo, K. Maekawa, H. Okuda, M. Kurihara, A. Okuno, S. Niida, Y. Saito, O. Takikawa, J. Clin. Biochem. Nutr. 52 (2013) 133. P.A. Dryland, D.R. Love, M.F. Walker, Y. Dommels, D. Rowan, N.C. Roy, N. Helsby, B.L. Browning, S. Zhu, B.R. Copp, L.R. Ferguson, (2008) 1. H.-H. Chung, K.S. Lee, J.-T. Cheng, Evid. Based. Complement. Alternat. Med. 2013 (2013) 589309. R. Calvani, E. Brasili, G. Praticò, G. Capuani, A. Tomassini, F. Marini, F. Sciubba, A. Finamore, M. Roselli, E. Marzetti, A. Miccheli, Exp. Gerontol. 49 (2014) 5. H. Pelantová, S. Bártová, J. Anýž, M. Holubová, B. Železná, L. Maletínská, D. Novák, Z. Lacinová, M. Šulc, M. Haluzík, M. Kuzma, Anal. Bioanal. Chem. (2015). D. Li, L. Zhang, F. Dong, Y. Liu, N. Li, H. Li, H. Lei, F. Hao, Y. Wang, Y. Zhu, H. Tang, J. Proteome Res. 14 (2015) 2237. M. Vairetti, R. Carini, M.G. De Cesaris, R. Splendore, P. Richelmi, F. Bertè, E. Albano, Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1587 (2002) 83. F. Martin, C. Boulange, I. Montoliu Roura, S. Collino, M. Dumas, E. Holmes, S. Rezzi, J. Nicholson, S. Kochhar, (2014) patent WO 2014/086605 A1.

40

CURRICULUM VITAE – RNDr. Helena Pelantová Pod Lysinami 476/2 147 00 Praha 4 Česká republika +420 296 442 646 [email protected]

ZAMĚSTNÁNÍ 2004 - dosud

vědecký pracovník Laboratoř charakterizace molekulární struktury, Mikrobiologický ústav AVČR NMR metabolomika, strukturní analýza přírodních látek, využití NMR při analýze komplexních směsí

1988 - 2002

vědecký pracovník NMR laboratoř, ÚOCHB AVČR strukturní analýza organických sloučenin

1985 - 1988

pomocná vědecká síla Oddělení teoretické chemie, ÚFCHE J. Heyrovského ČSAV

VZDĚLÁNÍ 2009 - dosud

postgraduální studium katedra analytické chemie Přírodovědecké fakulty UP Olomouc zaměření disertace: „Aplikace NMR spektroskopie v metabolomice“

1983 - 1988

katedra analytické chemie Přírodovědecké fakulty UK Praha diplomová práce: „Interakce tetrazinu s acetylenem – teoretická studie“ školitel prof. Ing. R. Zahradník, Dr.Sc.

ODBORNÉ ZAMĚŘENÍ

aplikace NMR v metabolomice, strukturní analýza přírodních látek, analýza směsí pomocí NMR 33 původních prací v impaktovaných časopisech h-index: 12

41

APLIKACE NMR SPEKTROSKOPIE V METABOLOMICE

Recommend Documents