VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ CENTRUM MATERIÁLOVÉHO VÝZKUMU FACULTY OF CHEMISTRY MATERIALS RESEARCH CENTRE
STUDIUM POPULACE BAKTERIÍ POMOCÍ METOD OBRAZOVÉ ANALÝZY
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE AUTHOR
BRNO 2014
JAN ŠEVČÍK
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ CENTRUM MATERIÁLOVÉHO VÝZKUMU FACULTY OF CHEMISTRY MATERIALS RESEARCH CENTRE
STUDIUM POPULACE BAKTERIÍ POMOCÍ METOD OBRAZOVÉ ANALÝZY STUDY POPULATION OF BACTERIA BY IMAGE ANALYSIS METHODS
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE
JAN ŠEVČÍK
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2014
prof. Ing. OLDŘICH ZMEŠKAL, CSc.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-BAK0813/2013 Akademický rok: 2013/2014 Centrum materiálového výzkumu Jan Ševčík Chemie a chemické technologie (B2801) Chemie pro medicínské aplikace (2808R031) prof. Ing. Oldřich Zmeškal, CSc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D.
Název bakalářské práce: Studium populace bakterií pomocí metod obrazové analýzy
Zadání bakalářské práce: 1. Rešerše na téma studium populace bakterií, využití obrazové analýzy při studiu populace 2. Experimentální práce: pořízení mikroskopického záznamu buněk, zpracování mikrofotografií meodami obrazové analýzy 3. Interpretace výsledků obrazové analýzy 4. Zpracování bakalářské práce:
Termín odevzdání bakalářské práce: 23.5.2014 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.
----------------------Jan Ševčík Student(ka)
V Brně, dne 31.1.2014
----------------------prof. Ing. Oldřich Zmeškal, CSc. Vedoucí práce
----------------------prof. Ing. Miloslav Pekař, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Bakalářská práce je zaměřena na sledování a uplatnění metod obrazové analýzy na bakteriích druhu Bacillus megaterium a Cupriavidus necator. V úvodu práce jsou popsány obecné znalosti o bakteriích, mikroskopických metodách a metodách obrazové analýzy. K pozorování buněk bakterií, bylo nutné nejprve připravit vhodné mikroskopické preparáty pomocí metody Gramova barvení. Obrazy jednotlivých snímků bakterií byly zaznamenány pomocí CCD kamery a mikroskopu a potom analyzovány. Nejprve byla metodou Box– Counting zjištěna optimální hodnota prahu a jí odpovídající fraktální míry (resp. plochy pokryté bakteriemi) a fraktální dimenze (resp. entropie jejich uspořádání na ploše). Prahované obrázky byly dále zpracovány pomocí metody Mass–Radius, která umoţnila zjistit distribuci bakterií vzhledem k těţišti jejich shluku.
ABSTRACT This bachelor thesis is focused on monitoring and application of image analysis methods on Bacillus megaterium and Cupriavidus necator bacteria. The introduction describes a general knowledge about bacteria, microscopic and image analysis methods. At first it was necessary to prepare suitable microscopic specimens using Gram staining for the observation of a bacteria cell. Every picture of bacteria was taken using a CCD camera and a microscope. Box–Counting method was used to identify the optimal threshold value, corresponding to their fractal measure (or surface areas covered with bacteria) and fractal dimension (or entropy of their arrangement on the surface area). After thresholding, the images were further processed using the Mass–Radius method, which defines a distribution of bacteria relative to the centroid of a cluster.
KLÍČOVÁ SLOVA Bacillus megaterium, Cupriavidus necator, obrazová analýza, fraktální analýza, prahování, Box–Counting metoda, Mass–Radius metoda
KEYWORDS Bacillus megaterium, Cupriavidus necator, image analysis, fractal analysis, thresholding, Box–Counting method, Mass–Radius method
3
ŠEVČÍK, J. Studium populace bakterií pomocí metod obrazové analýzy. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 44 s. Vedoucí bakalářské práce prof. Ing. Oldřich Zmeškal, CSc.
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a ţe všechny pouţité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a můţe být vyuţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT. ………………………………… podpis studenta
Poděkování Rád bych věnoval poděkování mému vedoucímu bakalářské práce, panu prof. Ing. Oldřichu Zmeškalovi, CSc. za jeho odborné rady, cenné připomínky a hlavně za jeho čas, který mi věnoval při konzultacích. Dále bych chtěl poděkovat mému bratrovi Jonáši Ševčíkovi za korekturu textu.
4
OBSAH 1.
ÚVOD
6
2.
TEORETICKÁ ČÁST
7
2.1 BAKTERIE 2.1.1 Tvary bakterií 2.1.2 Příjem potravy bakterií 2.1.3 Růst a rozmnoţování bakterií 2.1.4 Bacillus megaterium 2.1.5 Cupriavidus necator 2.2 O PTICKÁ MIKROSKOPIE 2.2.1 Mikroskop 2.2.2 Základní zobrazovací metody vyuţívané v optické mikroskopii 2.3 O BRAZOVÁ ANALÝZA 2.3.1 Proces záznamu obrazu 2.3.2 Barevné separace 2.3.3 Korekce obrazu 2.3.4 Filtrace obrazu 2.3.5 Teorie fraktálů 2.3.6 Integrální transformace 2.3.6.1 Periodické transformace 2.3.6.2 Vlnkové transformace 2.3.6.3 Transformace využívaná při fraktální analýze 2.3.7 Metody stanovení fraktálních parametrů 2.3.7.1 Box–Counting metoda 2.3.7.2 Mass–Radius metoda 2.3.8 Program HarFA 3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 POUŢITÉ DRUHY BAKTERIÍ 3.2 PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ 3.3 BARVENÍ PREPARÁTŮ 3.4 MĚŘENÍ A MĚŘÍCÍ APARATURA 3.5 FRAKTÁLNÍ ANALÝZA 3.5.1 Stanovení statistických parametrů a entropie struktury 3.5.2 Stanovení distribučních funkcí podle velikosti 3.5.3 Vliv rozlišení mikroskopu na výsledky směsi BM a CN 3.5.4 Porovnání distribučních funkcí směsi BM, CN a jejich směsi
7 7 8 8 10 11 12 12 13 16 16 17 20 22 22 24 24 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 32 35 37
4.
ZÁVĚR
40
5.
SEZNAM POUŢITÝCH ZDROJŮ
41
5
1. ÚVOD Obrazová analýza je analytická metoda, mezi jejíţ výhody patří především rychlost, spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků. V dnešní době nacházející široké uplatnění snad ve všech vědních oborech. Dnes je tato metoda vyuţívána ve vesmírném výzkumu, medicíně aţ po chemický průmysl. Optická mikroskopie je jedna z nejdůleţitějších metod pro zkoumání ţivých mikroskopických struktur. Se stále větším rozvojem mikroskopie, bylo důleţité dané pozorované obrazy zaznamenat například CCD kamerami nebo digitálními fotoaparáty. Tato data následně převést do počítače a následně zpracovat pomocí specializovaných programů. Spojení mikroskopie s obrazovou analýzou nám umoţňuje zisk informací jako identifikace, počet objektů v zorném poli, měření jejich velikosti nebo zařazování podle podmínek do jednotlivých tříd. Pořízené snímky pro obrazovou analýzu je třeba zaznamenat v co nejvyšší kvalitě (volba formátu ukládaných dat – nejvhodnější je ukládat data v podobě bezztrátové komprese TIFF nebo v nekomprimované podobě BMP). Jelikoţ nekvalitní obraz lze jiţ velmi obtíţně analyzovat. Důleţitým faktorem před kaţdým pozorováním je nastavení parametrů optické soustavy (jas, kontrast, optické filtry, zvětšení). Tyto parametry bychom měli dodrţet, pokud sledujeme mikroorganismy za určitých neměnných podmínek a byli tak schopni reprodukovat svoje výsledky. Jedna z metod obrazové analýzy je fraktální analýza, pomocí níţ se určuje fraktální dimenze a fraktální míra. Tuto metodu lze nejčastěji realizovat pomocí Box–Counting (metoda počítání čtverců) nebo Mass–Radius metody (metoda počítání plochy resp. hmotnosti). Jednotlivé výpočty fraktálních parametrů lze pak optimalizovat vyuţitím periodických a vlnkových transformací. V dnešní době existuje celá řada programů pro obrazovou analýzu, které umoţňují úpravu obrázku a jejich barvení (program CorelDRAW) aţ po sofistikovanější programy, které jsou speciálně upravené pro získání určitých informací z obrázku (program HarFA).
6
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Bakterie Jsou autotrofní nebo heterotrofní prokaryotické mikroorganismy, které z evolučního hlediska tvoří jednu ze tří domén (Bakterie, Archea, Eukaryota). Velice lehce a ekonomicky se pěstují, poskytují tak bohatou biomasu, tudíţ jsou vhodné pro celou řadu výzkumných oborů a aplikací. Soustavu bakterií v ţivém roztoku lze zařadit mezi heterogenní, polydisperzní hrubé disperze a podle tvaru částic mezi jako globulárně disperzní systémy. Bakteriální buňka s výjimkou mykoplazmat se skládá z buněčné stěny, jejímţ chemickým základem je peptidoglykan neboli murein a cytoplazmatické membrány obsahují řadu membránových struktur a nukleoidů [1, 2].
Obr.1
Schéma bakteriální buňky[3]
2.1.1 Tvary bakterií Základní tvar bakterií je důleţitý pro klasifikaci do systematických skupin. Obecně se podle tvaru rozlišují na bakterie kulovitého tvaru neboli koky; bakterie tyčkového tvaru neboli tyčky či tyčinky a zakřivené bakterie. Tyto zakřivené bakterie mohou být tvaru vibrioidního (vibria), spirálovitého (spirily) nebo šroubovicovitého či helikálního (spirochety) [2].
Obr. 2 Tvary bakteriálních buněk1 - diplokok, 2 - streptokok, 3 - stafylokok, 4 - sarcina, 5 vibrio, 6 - mykobakterie, 7 – spirocheta[4]
7
2.1.2 Příjem potravy bakterií Na základě zdroje potravy se bakterie dělí na autotrofní či litotrofní (jsou schopné pro zdroj uhlíku vyuţívat oxid uhličitý) a heterotrofní či organotrofní (zdrojem uhlíku je vţdy organická látka). Buňka přenesená do nového ţivného média si musí nejprve zvyknout na nové podmínky a musí načerpat látky, aby si udělala zásobu energie pro své budoucí rozmnoţování. Prostředí, v němţ bakterie rostou a mnoţí se, musí obsahovat zdroje všech biogenních prvků, z nichţ především je nutno zdůraznit zdroje: uhlíku, dusíku, síry fosforu, energie a růstové faktory (vitamíny, aminokyseliny) [2]. 2.1.3 Růst a rozmnoţování bakterií Bakterie jsou nejrychleji rostoucí organismy na Zemi. Růstem populace bakterií se rozumí zvyšování počtu buněk bakterií způsobené jejich mnoţením. Bakterie se rozmnoţují pouze nepohlavně. Převáţně se rozmnoţují binárním dělením a menší část bakterií se rozmnoţuje pučením [2, 5]. Binární dělení bakterií Binární dělení nese název od toho, ţe z jedné mateřské bakteriální buňky vznikají dvě bakteriální buňky dceřiné. Mateřská buňka se nejprve prodlouţí ve směru své podélné osy a to aţ na dvojnásobek své původní délky, a však její tloušťka zůstává stejná. Ještě před započetím dělení se zreplikuje její chromozom, po zreplikování chromozomu je mateřská buňka připravena k dělení. Uprostřed buňky se začne tvořit příčná přehrádka, coţ je plazmatická membrána a buněčná stěna, která rozděluje mateřskou buňku na dvě stejné dceřiné buňky. Do kaţdé z těchto dceřiných buněk se začleňuje jedna kopie mateřského chromozomu. V poslední fázi se dokončí tvorba přehrádky a mateřská buňka se oddělí od dceřiné a vznikají dvě totoţné bakteriální buňky [2].
Obr. 3
Schéma binárního dělení bakterií[2]
8
Pučení Jen velmi málo bakterií se mnoţí tímto způsobem. Tento způsob je charakteristický tím, ţe jakmile mateřská buňka doroste do své normální velikosti a dozraje k reprodukci, začne se tvořit na určitém místě jejího povrchu nová buňka. Buněčná stěna nově vznikající dceřiné buňky se nově syntetizuje, zato mateřská buňka si svou buněčnou stěnu ponechává. Jakmile mateřská buňka vyšle své rozdělené jádro do dceřiné, dceřiná buňka se oddělí a dorůstá do velikosti mateřské buňky [2].
Obr. 4
Schéma pučení[2]
Dynamika růstu bakteriální populace Specifickou vlastností bakterií je rychlost mnoţení. Bakterie se mnoţí tak dlouho, dokud ve svém prostředí nacházejí podmínky potřebné k dělení buněk. Tudíţ můţeme prohlásit, ţe rychlost jejich dělení je závislá jak na vnitřních, tak i na vnějších podmínkách. Bakterie ve svém prostředí tvoří jednolitý systém, který můţe být otevřený nebo uzavřený. Uzavřený systém je specifický tím, ţe bakterie rostoucí v tomto systému mění jeho vlastnosti a sloţení v závislosti na své ţivotní činnosti. Zajímavé je, ţe mnoţení bakterií nemá vzestupnou tendenci, ale pozorujeme charakteristické fáze vzestupu a poklesu. Tohoto prostředí se dosahuje takzvané statické kultivace, při které bakterie rostou při konstantním objemu ţivné půdy, dokud se metabolickou činností bakterií tato půda nezmění, tudíţ pak není vhodná pro jejich růst. S tímto systémem se běţně setkáváme v laboratořích, kdy jsou bakterie kultivovány v ţivných roztocích či gelech. Otevřeného systému se dosahuje kontinuální kultivací, kdy bakterie rostou při konstantním objemu ţivné půdy, do kterého se postupně přidává nová a odčerpává stará půda [2].
9
Obr. 5
Růstová křivka bakterií v podmínkách statické kultivace [2]
2.1.4 Bacillus megaterium V roce 1884, De Bary pojmenoval Bacillus megaterium "big beast" díky své velikosti, která je aţ stokrát větší neţ Escherichia coli (s délkou buněk aţ do 4 um a o průměru 1,5 um). Právě díky své velikosti je Bacillus megaterium vhodná pro studování struktury buněk, proteinové lokalizace, sorpce a v neposlední řadě membrán [6, 7].
Obr. 6
Snímek z elektronového mikroskopu Bacillusmegaterium a Escherichia coli [7]
Charakteristika Bacillus megaterium Bacillus megaterium má tyčinkovitý tvar. Bacillus megaterium je gram pozitivní bakterie, coţ znamená, ţe na konci barvení podle Gramovy metody má Bacillus megaterium modrofialovou barvu. Tato barva je zapříčiněna vysokým obsahem peptidoglikanu v buněčné stěně a absencí vnější membrány v liposacharidové vrstvě. Jedná se o aerobní bakterie tvořící spory, které byly objeveny ve velice rozmanitých biotopech například v: mořské vodě nebo v medu, ve kterém většina mikroorganismů neroste. Optimální teploty pro růst jsou mezi 3 a 45°C, kdy nejvhodnější teplota pro jejich růst a mnoţení je okolo 30°C. Bacillus megaterium byly však objeveny v geotermálních jezerech, kdy jejich teplota přesahovala 63°C. S délkou v řádech jednotek µm se Bacillus megaterium řadí mezi největší známé bakterie [7]. 10
2.1.5 Cupriavidus necator Cupriavidus necator, prošla řadou změn názvů. Nejprve v první polovině 20. století nesla název Hydrogenomonas euthropus podle schopnosti vyuţívat vodík. Další změna nastala v době, kdy se začala charakterizovat buněčná morfologie a metabolismus. Stará nomenklatura byla nahrazena, jelikoţ zahrnovala mnoho druhů mikroorganismů. V této době se Cupriavidus necator jmenovala Alcaligenes eutropha. Zkoumáním fenotypu, sloţení lipidů, mastných kyselin a rRNA analýzy bylo zjištěno, ţe Alacaligenes eutropha patří do rodu Ralstonia, tudíţ došlo k dalšímu přejmenování na Ralstonia eutropha. Při další studii bylo zjištěno, ţe Ralstonia má dva shluky. Nový rod Wautersia byl vytvořen právě z jednoho z těchto shluků, které obsahovaly Ralstonia eutropha, tudíţ došlo k další změně názvu a to na Wautersia eutropha. Při zkoumání DNA-DNA hybridizace a fenotypu k porovnání s Cupriavidus necator se ukázalo, ţe jsou stejného druhu, proto podle zákona č. 23 podle ICNB (International Code of Nemonclature of Bacteria) byla Ralstonia eutropha označena jako Cupriavidus necator, jelikoţ Cupriavidus necator byla pojmenována v roce 1987 tedy dříve neţ změna názvu Ralstonia eutropha a Wautersia eutropha [8].
Obr. 7
Snímek z elektronového mikroskopu Cupriavidus necator [9]
Charakteristika Cupriavidus necator Cupriavidus necator má tyčinkovitý tvar. Cupriavidus necator je gram negativní bakterie, coţ znamená, ţe mají buněčnou stěnu tvořenou převáţně liposacharydy a jsou překryty druhou membránou, proto se na snímcích mikroskopu při pouţití metody Gramova barvení zbarvují do růţova. Cupriavidus necator je vodíkovo-oxidační bakterie schopná růstu na rozhraní anaerobních a aerobních podmínek. Proto se Cupriavidus necator jednoduše adaptuje jak na heterotrofní tak na autotrofní přísun ţivin. Cupriavidus necator můţe provádět aerobní nebo anaerobní dýchání podle denitrifikace dusičnanů nebo dusitanů na plynný dusík. Cupriavidus necator můţe vyuţívat vodík jako zdroj energie [8].
11
2.2 Optická mikroskopie Pro pozorování bakterií, jejich růstu a zániku, je vhodná optická mikroskopie. Díky svému rozlišení je tato technika zcela dostačující. Optická mikroskopie vyuţívá viditelného světla (vlnová délka 400 nm – 700 nm). Principem vzniku zvětšeného obrazu v optickém mikroskopu, je ţe kaţdý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln. Podle optických vlastností jednotlivých bodů objektu se dopadající světlo v kaţdém z bodů transformuje (ohýbá se, láme, mění se jeho amplituda, fáze) a vznikají sekundární vlny. Ty spolu interferují, jako po průchodu světla štěrbinou nebo optickou mříţkou. Výsledné vlnění, které obsahuje informaci o vzhledu objektu, vstupuje do objektivu. V jednotlivých bodech zadní ohniskové roviny objektivu se setkávají sekundární vlny, které opustily rovinu předmětu rovnoběţně. Dochází k jejich interferenci a v souladu s Huygensovým principem se stávají zdrojem nových vln, které v obrazové rovině mikroskopu skládají zvětšený a převrácený obraz [10]. 2.2.1 Mikroskop Mikroskop je optický přístroj, který je vyuţíván k rozlišení malých objektů. Historicky první mikroskop byl sestrojen holandským optikem Hansem Janssenem a jeho synem, kteří si při své práci všimli, ţe pomocí čočky jsou předměty vnímány větší. Proto s tímto poznatkem začali operovat a jiţ roku 1590 vyrobili první jednoduchý mikroskop, který se skládal pouze ze dvou čoček. Další, kdo napomohl ke zdokonalení mikroskopu, byl jednoznačně Antoine van Leeuwenhoek, coţ byl taktéţ Holanďan. Vymyslel dokonalejší výbrus čočky, za pomocí kterého byl schopen aţ třistakrát zvětšit obraz. Díky tomuto zvětšení byl pak v roce 1674 schopen v dešťové kapce pozorovat mikroorganismy a tím vyvolal značný rozruch ve vědecké společnosti. Optický mikroskop dosáhl ve 30. letech 19. století své teoretického maxima, které je ovlivněno vlnovou délkou světla. Tudíţ se vědci museli ubírat jiným směrem, a bylo tedy třeba zkonstruovat odlišný typ mikroskopu. Nástupcem optického mikroskopu se stal mikroskop elektronový vyuţívající tok rychlých elektronů. Byl vyvinut v Německu v roce 1931 [11].
Obr. 8
Mikroskop Asahi (1920) [12]
12
2.2.2 Základní zobrazovací metody vyuţívané v optické mikroskopii Metoda světlého pole Jedná se o nejjednodušší metodu optické mikroskopovací techniky, právě díky své jednoduchosti je tato metoda velice populární. Má typický vzhled, kdy na obrazu je tmavý vzorek na světlém pozadí. Principiálně pracuje tato metoda tak, ţe světelný kuţel prochází (v procházejícím světle) nebo se odráţí (v odráţejícím světle) a vstupuje do objektivu [13, 14].
Obr. 9
Snímek gram negativní campylobacter bakterie metodou světlého pole [15]
Metoda tmavého pole Tato metoda pracuje na principu, při kterém jsou jasné předměty lépe viditelné na tmavém podkladu. Je enormně zvýšena jejich viditelnost, proto při dopadu je z obrazu vyloučeno světlo, které by dopadalo přímo do objektivu. Pouze to světlo, které dopadne na preparát, částečně prochází objektivem a vytváří obraz objektu. Tato metoda je výhodná v tom, ţe nemusíme vzorky barvit. Objekty, které pozorujeme, mají často index lomu velmi blízko jejich okolí (vodní organismy), tudíţ je obtíţné tento objekt sledovat pomocí metody světlého pole [16, 17].
Obr. 10
Snímek části krve pořízená ve světlém a tmavém poli [18] 13
Metoda fázového kontrastu Metoda je totiţ postavena na principu, kdy pozorované objekty při průchodu světla poskytují jenom velmi malé, nebo dokonce ţádné rozdíly v absorpci světelného záření. Jenţe tyto objekty se liší v indexu lomu a v různých bodech tak mění fázi procházejícího světelného vlnění. Tedy můţeme říci, ţe procházející paprsky se liší ve fázi světelné vlny (objekty nazýváme jako fázové). Pomocí změny amplitudy procházejícího světla jsme schopni určit detaily kontrastů intenzity i barev. Změna světelné fáze vlny vznikající při průchodu je však zrakem neviditelná (objekty vnímáme jako průhledné). Proto byl pro jejich pozorování vyvinut fázový mikroskop, který převádí fázové změny na amplitudové, a jsme tedy schopni dané objekty pozorovat. Výhodou této metody je, ţe daný preparát nemusíme barvit [14, 17, 19].
Obr. 11
Snímek granulového válce pomocí fázového kontrastu a světlého pole [20]
Ultrafialová mikroskopie Ultrafialová mikroskopie pouţívá jako světelný zdroj UV záření. Tudíţ se posouvá rozlišovací schopnost mikroskopu do oblasti UV (400 nm – 10 nm). UV záření však člověk není schopen vnímat, proto výsledný záznam z ultrafialové mikroskopie musí být prováděn fotograficky nebo pomocí speciálních CCD kamer. Ultrafialová mikroskopie se pouţívá k pozorování objektů absorbujících v UV oblasti (nukleové kyseliny, proteiny) [14, 19]. Infračervená mikroskopie Infračervená mikroskopie vyuţívá infračerveného záření pro zobrazování předmětů, tudíţ se rozlišovací schopnost mikroskopu opět posouvá do infračervené oblasti (760 nm – 1100 nm). Výhodou infračervené mikroskopie je to, ţe snadněji penetruje do silnějších objektů (analýza sloţek směsí) [19]. Cytofotometrie Jedná se o speciální metodu temného pole, kdy velmi malé částice v průhledném prostředí odráţejí a rozptylují světlo (Tyndalův jev). Metoda kombinuje mikroskop s jednopaprskovým absorpčním spektrofotometrem [14, 21].
14
Fluorescenční mikroskopie Fluorescenčním mikroskopem se rozumí ten, který ke generování obrazu pouţívá fluorescenci. Rozlišujeme dva druhy fluorescenčních mikroskopů, tzn. epifluorescenční mikroskopy (pozorování odraţeného světla) a diafluorescenční mikroskopy (pozorování procházejícího světla). Diafluorescenční mikroskopy se dnes jiţ skoro nepouţívají. Vzorek je osvětlen světlem specifické vlnové délky, která je absorbována fluorofory, způsobujícími emitování viditelného záření. Toto emitované záření musí být ještě odděleno od zdroje osvětlení (xenonová výbojka, rtuťová výbojka, lasery nebo LED diody) za pomocí speciálních emisních filtrů [14, 22].
Obr. 12
Snímek Medaka juveniles pomocí fluorescenčního mikroskopu [23]
Interferenční mikroskopie Jako metoda fázového kontrastu taktéţ slouţí k pozorování bezbarvých fázových objektů. Díky své vyšší účinnosti a potlačení tzv. „halo efektu― je tato metoda mnohem pouţívanější. Umoţnuje totiţ pozorování mnohem tlustších objektů neţ metoda fázového kontrastu [19]. Ultramikroskopie Je metoda temného pole, která je zaloţena na rozptylu světla. Na objekt soustředíme paprsky ze strany, kolmo k optické ose mikroskopu. Díky této metodě jsme schopni pozorovat objekty, které bychom nebyli normálními optickými metodami schopni pozorovat (pod nebo v blízkosti viditelného světla) [14]. Polarizační mikroskopie Polarizační mikroskopie vyuţívá schopnosti preparátu stáčet rovinu polarizovatelného světla. Polarizační mikroskop je totoţný s optickým mikroskopem (kombinuje optický mikroskop a polarimetr). Do optické dráhy jsou mu včleněny dva polarizační filtry. Paprsky nejprve procházejí polarizátorem (zde dochází k polarizování světla), následně procházejí pozorovaným objektem a druhým polarizačním filtrem (analyzátorem). Jestliţe zkoumaný objekt leţí mezi těmito dvěma filtry a má polarizační filtry, dojde po průchodu tímto objektem ke stočení polarizační roviny a vzniká obraz [19]. Konfokální mikroskopie Konfokální metoda vyuţívá bodového osvětlení (okolní signály jsou omezeny otvorem), ke zvýšení optického rozlišení a kontrastu mikroskopu pouze z ohniskové roviny mikroskopu. Tímto způsobem se tato metoda vypořádává s neostrostmi vznikající převáţně při fluorescenční mikroskopii. Výhodou této metody je schopnost vytvářet optické řezy vzorkem a snímáním těchto řezů následně skládat trojrozměrné obrazy (měření objemu povrchu buněk) [24].
15
2.3 Obrazová analýza Dnešní digitální fotoaparáty a kamery jsou schopny zajít tam, kde se lidské oko nedostane. Vytvářejí kontrastnější obrazy a zaznamenávají mnohem menší intenzity světla. Obraz snímaný digitálním fotoaparátem nebo kamerou má elektronickou podobu, coţ je velice výhodné a umoţňuje pozdější úpravy snímků a automatizované vyhodnocování metodami obrazové analýzy. Obrazová analýza byla vyvinuta pro kvantitativní vyhodnocení vlastností obrazu. Podstatou obrazové analýzy je digitalizace obrazu a jeho následné zpracování v počítači. Do obrazové analýzy lze zahrnout všechny postupy, které umoţňují kvantitativně vyhodnotit obrazovou informaci a také porovnávat s jinými soubory dat a určovat míru shodnosti (Obr. 13). Jednotlivé zkoumané objekty lze následně popsat prostřednictvím parametrů jejich hranice (tvarové charakteristiky) nebo prostřednictvím obrazových bodů objekty tvořících (barva, hustota, textura) [25, 26].
Obr. 13
Schéma při postupu obrazové analýzy [26]
2.3.1 Proces záznamu obrazu K digitalizaci a pořízení obrazových dat se vyuţívají různá zařízení podle druhu aplikace a to pomocí skenerů, digitálních fotoaparátů, digitálních kamer, mikroskopů či dalekohledů. Společným prvkem všech těchto zařízení je jejich záznamový prvek CCD (Charge Coupled Devices) nebo CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconduktors) senzor. Proces záznamu obrazu oběma technologiemi lze rozdělit do šesti kroků:
vytvoření a transformace obrazu pomocí čoček, zrcadel, svazků optických vláken separace barevných sloţek pomocí vhodných optických filtrů (např. RGB, CMY) zaznamenání barevných sloţek obrazu pomocí světlocitlivých senzorů (CCD nebo CMOS) generace elektrických signálů pro jednotlivé obrazové body (pixely) a barevné sloţky transformace elektrických signálů na digitální data kvantováním na definovaný počet úrovní (A/D převodníky) uloţení digitálních dat na paměťovém médiu (paměťové karty, magnetická páska, pevné a kompaktní disky, apod.) Všech těchto šest kroků ovlivňuje kvalitu digitálního záznamu. Dochází ke zkreslování, které je způsobeno vlastnostmi optické soustavy a samotným transformačním procesem. Naopak nám tyto kroky mohou přispět ke zvýraznění některých (námi pozorovaných) vlastností obrazu, které chceme analyzovat, výsledkem obrazové analýzy by pak měly být základní informace o struktuře obrazu a jeho atributech [25]. 16
2.3.2 Barevné separace Barevná separace je proces, při kterém je původní předloha rozdělena na jednotlivé barevné sloţky. Například u profesionálních digitálních zařízení se provádí barevné separace (do sloţek RGB) pomocí polopropustných zrcadel nebo hranolů a záznam se provádí pomocí tří oddělených světlocitlivých senzorů [27]. Barvový prostor CIE 1931 Je jeden z prvních matematicky popsaných barvových prostorů, který popisuje metody barev, jejich systemizaci a standardy. Tento model popisuje funkce standardního pozorovatele jeho citlivost oka na tři základní barvy – červenou, zelenou a modrou, jejichţ kombinací lze vytvořit libovolnou viditelnou barvu [28].
Obr. 14
Kolorimetrický trojúhelník CIE 1931 [29]
17
Barvový prostor RGB Název barvového prostoru je odvozen od jeho tří primárních barev červené (R – red), zelené (G – green) a modré (B – blue). Aditivním mícháním těchto barev vznikne jakákoli barva. Hlavním vyuţitím tohoto barvového prostoru je zobrazení barevných obrázků v elektronických systémech [30].
Obr. 15
Aditivní míchání barev [31]
Barvový prostor CMYK Název barvového prostoru je odvozen od jeho čtyř primárních barev azurové (C – cyan), purpurové (M – magenta), ţluté (Y – yellow) a černé (K – black). CMYK je zaloţený na subtraktivním míchání barev, coţ znamená, ţe barvy jejich mícháním tmavnou. CMYK se vyuţívá v reprodukčních zařízeních [30, 32].
Obr. 16
Subtraktivní míchání barev [33]
Odstíny šedi Odstíny šedi jsou řada monochromatických odstínů od černé aţ po bílou. Obraz obsahuje pouze odstíny šedé a ţádné jiné barvy. Obrázky pořízené pomocí RGB lze převést na odstíny šedé. Tento převod se s ohledem na citlivost lidského oka (nejcitlivější je na zelenou barvu) provádí podle vztahu (1). U obrázku upravených pomocí odstínů šedé kaţdý pixel nese informace pouze o intenzitě, kdy černá barva má nejniţší intenzitu a barva bílá má intenzitu nejvyšší. Jelikoţ v obrazu u jednotlivých pixelů nejsou zaznamenány barvy, dochází k trojnásobnému zmenšení dat [25, 34].
I 0,229 R 0,587 G 0,114 B
(1)
18
Obr. 17
Převedení obrázku z RGB na stupně šedi [35]
Barvový prostor HLS Prostorový model HLS je opět odvozen z modelu RGB. Jeho základními komponentami jsou odstín (H – hue), jas (L – lightness) a sytost (S – saturation). Má tvar dvou kuţelů obrácených podstavami k sobě. Barevný tón je vyjádřen úhlovou hodnotou (0 - 360°), světlost se mění od nuly (black, dolní vrchol) do jedné (white, horní vrchol). Sytost nabývá na povrchu kuţelu hodnoty jedna a klesá na nulu směrem k ose kuţelů. Nejjasnější čisté barvy leţí na obvodu podstav kuţelů. Tvar prostoru HLS plně odpovídá skutečnosti, ţe nejvíce různých barev vnímáme při průměrném osvětlení (oblast podstav). Schopnost rozlišit barvy klesá jak při velkém ztmavení, tak při přesvětlení [30].
Obr. 18
Složky barvového prostoru HLS [30]
Barvový prostor HSB Prostorový model HSB je odvozen z modelu RGB. Jeho základními komponentami jsou odstín (H – hue), sytost (S – saturation) a světlost (B – brightness). Barevný tón označuje převládající spektrální barvu, sytost určuje příměsi jiných barev a jasová hodnota mnoţství bílého světla. Tento model má tvar šestibokého jehlanu, jehoţ vrchol má černou barvu (K). Jasová hodnota roste směrem k podstavě, střed podstavy tvoří bílá barva. Sytost je dána vzdáleností bodu od osy jehlanu. Dominantní barvy leţí na plášti jehlanu, čisté barvy jsou u obvodu podstavy. V literatuře se tento prostor často označuje jako HSV (V - value) [30]. 19
Obr. 19
Složky barvového prostoru HSB [30]
2.3.3 Korekce obrazu Při práci s optickými přístroji dochází k řadě rušivých jevů, které ovlivňují zpracování obrazu. U optických soustav je nevýhoda v jejich nehomogenitě osvětlení. U digitálních fotoaparátů je nevýhoda v jejich nelineární přesnosti jasů. Při delších expozicích je zaznamenaný obraz rovněţ zkreslen takzvaným teplotním šumem. Proto musí být všechny tyto jevy odstraněny, abychom dostali co nejpřesnější data [25]. Nehomogenita osvětlení Nehomogenita osvětlení je způsobena nedokonalostí optických prvků (objektivu a okuláru), které zapříčiňují ztrátu světelnosti snímaného obrazu mimo osu optické soustavy. Vlastní korekce obrazu spočívá ve zjištění průměrných hodnot všech tří barevných kanálů (RAVG, GAVG a BAVG) obrazu rozostřeného nehomogenně osvětleného papíru a v provedení úpravy obrazu (RKOR, GKOR a BKOR) pomocí následujících vztahů (2), kde RN x, y , G N x, y a BN x, y jsou hodnoty příslušných barevných kanálů pixelu o souřadnicích x, y opravovaného obrazu RP x, y , GP x, y a BP x, y jsou hodnoty barvových kanálů obrazu pixelu o souřadnicích x, y obrazu rozostřeného papíru [25, 36].
RKOR x, y RAVG
RN x, y G x, y B x, y , GKOR x, y GAVG N , BKOR x, y BAVG N RP x, y GP x, y BP x, y
(2)
Korekce nelineárního přenosu jasů Korekce nelineárního přenosu jasu je číslo vyjadřující vztah mezi hodnotami signálu na vstupu a hodnotami na výstupu optické soustavy, proto je nutné provést takzvanou gamma korekci, která zlinearizuje přenos signálu. Závislost intenzity výstupního signálu na vstupním je dána vztahem (3), aby mohly být získané obrazy objektivně vyhodnoceny, musí se tedy nejprve provést jejich gamma korekce pomocí vztahu (4). Z důvodů zvýraznění některých efektů je moţné zavádět gamma korekci obrazu nebo jeho sloţek záměrně [25, 36].
I Y k RGB Y0 255
(3)
20
1
I RGB
Y Y0 255 k
(4)
Proces gamma korekce je následovný. Nejprve se barevný obraz převede na obraz v odstínech šedé podle vztahu (1). Pro kaţdé políčko denzitometrického klínu se zjistí střední intenzita a tyto výsledné hodnoty se normalizují na rozsah v intervalu 0 , 1 . Šedý klín se proměří reflexním denzitometrem a výsledné hodnoty D (density) se přepočítají na reflektanci podle vztahu (5).
Y 10 D
(5)
Následně se vynese závislost hodnot reflektancí naexponovaných obrazů na hodnotách reflektancí zjištěných densitometricky a data se proloţí mocninnou křivnou (exponent této mocninné závislosti představuje gamma hodnotu. Gamma korekce se poté převede podle vztahu (4) [36].
0 vstupní intenzita
1
Lineární odezva
1
výstupní intenzita
1
0
Obr. 20
Gamma korekce
výstupní intenzita
výstupní intenzita
Skutečná odezva
0 0
vstupní intenzita
1
1
0 0
vstupní intenzita
1
Znázornění gamma korekce [25]
Teplotní šum Teplotní šum vzniká jako důsledek šumu temnostního proudu nebo také při transportu elektrického náboje z pixelů senzoru. Teplotní šum lze sníţit chlazením kapalným chladícím médiem (například glycerol/voda), prouděním vzduchu (ventilátory) nebo termoelektricky (Peltierův jev). Temnostní šum (DN – Dark Noise) je způsoben tepelnými kmity krystalické mříţky senzoru. Temnostní šum je především závislý na teplotě senzoru a na době expozice. Čtecí šum (RN – Reading Noise) je způsoben fluktuacemi při čtení dat (při generaci páru elektron/díra a při přenosu dat senzorem). Čtecí šum je především závislý na teplotě, frekvenci čtení dat, avšak nezávisí na době expozice. Celkový šum (TN – Total Noise) pro krátké expoziční časy ovlivněn především čtecím šumem, pro dlouhé expoziční časy je dominantní temnostní šum. Celkový šum je vyjádřen jako (6) [25].
TN RN 2 DN 2
(6)
21
Obr. 21
Teplotní šum [25]
2.3.4 Filtrace obrazu Filtrace obrazu spočívá v modifikaci obsahu pixelu (jeho barevné informace) s ohledem na nejbliţší v okolí, jehoţ výsledkem je nový změněný obrázek. Tato modifikace se nejčastěji provádí pomocí čtvercové matice (takzvané filtrační matice). Výsledek operace se zapisuje do místa, kde se nachází střed matice. Příkladem a zároveň nejjednodušším způsobem operace je diskrétní konvoluce, kdy se násobí prvky filtrační matice s prvky nejbliţšího okolí upravovaného pixelu, viz názorný příklad (7). Filtr, který tuto operaci provádí, se nazývá konvoluční filtr. V praxi se pouţívají různé typy filtrů, například vyhlazovací, hranové, derivační integračně derivační atd. Kaţdý z těchto filtrů má jinou funkci, kvůli které je vyuţíván. Vyhlazovací filtry jsou určeny ke zjemnění hran analyzovaných struktur. Hranové filtry jsou určeny k vyhledávání hran v obraze. Derivační filtry umoţňují vyhledávání diskontinuit v obraze. Mohou být aplikovány ve všech směrech (zleva doprava, zprava doleva) a to ve svislém i horizontálním směru. Integračně derivační filtry výrazné hrany zdůrazňují a jemné potlačují. Lze je tedy vyuţít jak pro odstranění šumu, tak současně ke zvýraznění hran [25].
39 33 35 36 31 1 34 2 36 1 33 34 33 36 34 32 2 4 2 2 33 4 36 2 34 139 278 142 559 1 36 2 35 1 36 1 2 1 32 36 35 36 35 33 31 34 31 32 35 34 36 33 34
1 2 1
(7)
2.3.5 Teorie fraktálů Fraktály se zabývá samostatná vědní disciplína nazývaná fraktální geometrie. Za jejího zakladatele je povaţován Benoit B. Mandelbrot, který v roce 1975 definoval pojem fraktál. Fraktál pochází z latinského slova „fractus“ – rozbitý [39, 40]. Fraktál Fraktál je geometrický objekt, který po rozdělení na menší části vykazuje tvarovou podobnost s těmito částmi. Fraktál můţeme definovat jako nekonečně členitý útvar. Opakem fraktálu je geometricky hladký útvar, který je popisován Euklidovskou geometrií. Příkladem fraktálního objektu je Kochova křivka, coţ je jedna z prvních fraktálních křivek. Kochova křivka vzniká nekonečným opakováním stejného postupu, kdy na začátku je úsečka rozdělena na třetiny, nad prostřední třetinou se sestrojí rovnostranný trojúhelník. Posledním krokem je odstranění základny trojúhelníku. Spojením tří Kochových křivek vznikne takzvaná Kochova vločka [37, 38, 39, 40].
22
Obr. 22
Kochova vločka [41]
Soběpodobnost Je jedním z hlavních znaků fraktálních útvarů. Soběpodobnost se matematicky nazývá invariance vůči změně měřítka, znamená to, ţe objekt či jeho část vypadá podobně při pohledů v různém zvětšení. Soběpodobnost lze matematicky zapsat jako: sobě podobná mnoţina A z n-dimenzionálního Euklidovského prostoru En je taková mnoţina, pro kterou existuje konečně mnoho kontrahujících zobrazení 1 aţi takových, ţe A vznikne jako (8). Mnoţina definovaná vztahem (8) má vlastnosti, které jsou typické pro většinu fraktálních objektů. Vzniká opakováním sebe sama při určité transformaci (opakováním téhoţ základního motivu) [40]. n
A i A
(8)
i 1
Fraktální dimenze Fraktální dimenze „D“ popisuje trend změny pokrytí v závislosti na velikosti měřené buňky. Fraktální dimenze se můţe pohybovat mezi dvěma mezními hodnotami a to: pro D = 0 bude změna fraktální struktury jako funkce velikosti (například hmotný bod) pro D = E, kde E je euklidovský rozměr a změna fraktální struktury nebude záviset na změně míry (například tuhé těleso) Fraktální dimenze umoţňuje popsat stupeň sloţitosti objektu podle toho, jak rychle roste jeho délka, obsah či objem v závislosti na velikosti měřítka, při kterém měříme. Existuje několik forem této dimenze [42, 43]: soběpodobnostní dimenze (Self–Similarity dimension) mříţová dimenze (Box–Counting dimension) Hausdorffova dimenze (Hausdorff dimension) Fraktální míra Fraktální míra „K“ nám udává zaplněnost prostoru pomocí procenta pokrytí (veličina o jednotkové délce počet jednotek, pomocí níţ jsme sestavili daný útvar) [42].
23
2.3.6 Integrální transformace Integrální transformace jsou prováděny pomocí komplexní analýzy obrazových dat. Výhoda komplexní analýzy spočívá především v tom, ţe nepracuje s jednotlivými pixely obrázků, ale s celým obrazem nejednou (hodnotí obrázek z pohledu opakujících se motivů, jejich zmenšených, popřípadě pootočených kopií). Integrální (lineární) transformace obrazu přiřazuje pomocí definované báze jiný obraz. V tomto obrazu jednotlivé pixely odráţejí různé vlastnosti (definované bází) celého původního obrázku. Důvodem pro pouţití integrálních transformací je v jejich jednodušší analýze spekter, jednodušším provádění některých operací, snadnějším vyloučení redundantních sloţek a zvýšení odolnosti při přenosu dat. Bitovými operacemi obrazu získaného pomocí integrálních transformací lze odfiltrovat šum vysoké či nízké frekvence a tím sníţit mnoţství dat popisující daný obraz (na tomto principu jsou zaloţeny ztrátové komprese dat). Komplexní analýza obrazu je prováděna pomocí diskrétních periodických funkcí (například Fourierova transformace, kosinová nebo Walsh–Hadamardova transformace) nebo pomocí prostorově omezených funkcí (například Haarova transformace nebo transformace vyuţívaná při fraktální analýze metodou Box–Counting) [25]. 2.3.6.1 Periodické transformace Diskrétní Fourierova transformace Diskrétní Fourierova transformace je lineární ortogonální transformace v oboru komplexních čísel, její bázi tvoří harmonická funkce (9), kde x a y jsou takzvané prostorové frekvence [25].
f x , y e
j x x y y
(9)
Kosinová transformace Kosinová transformace je modifikace diskrétní Fourierovy transformace pro obor reálných čísel, jejíţ bázi tvoří funkce (10).
f x , y cos x x cos y y
(10)
Kosinová transformace je zaloţena na opakování zmenšené harmonické funkce. Výhodou kosinové transformace je to, ţe pro obecná obrazová data velmi pomalu konverguje, tudíţ sníţení obrazových dat nemusí být výrazné [25].
24
Obr. 23
Příklad harmonických funkcí pomocí kosinové transformace [25]
Walsh–Hadamardova transformace Walsh–Hadamardova transformace je zaloţena na opakování diskrétních Walshových funkcí, které nabývají hodnot +1, −1, kdy vyšší Walshovy funkce se získají z niţších, změnou měřítka [25]. 2.3.6.2 Vlnkové transformace Haarova transformace Haarova transformace vychází ze systému ortogonálních Haarových funkcí, které nabývají hodnot +1, 0, −1, násobených mocninou čísla 2 i / 2 , kde i = 0, 1, 2 …, kdy první dvě Haarovy funkce jsou totoţné s Walshovými [25]. 2.3.6.3 Transformace vyuţívaná při fraktální analýze Všechny uvedené transformace mohou být vyuţity k výpočtu fraktálních dimenzí. V další části bude diskutována ta nejčastěji vyuţívaná Haarova transformace, která je také podstatou metody Box–Counting. Nabývá hodnot +1, 0, −1. U černobílých obrázků lze pomocí jejich koeficientů určit počty černých NB, částečně černých NBW a bílých NW čtverců pro různé velikosti sítě (1×1, 2×2, 3×3, … pixelů). Z jejich mocninné závislosti na velikosti měřítka můţeme určit základní parametry struktury, takzvanou fraktální dimenzi D a fraktální míru K černé a bílé plochy a jejich rozhraní. Tyto parametry jsou následně vyuţívány k hodnocení uspořádanosti obrázků, zjišťování počtu definovaných objektů (bez toho aniţ by je bylo nutno počítat) [25].
Obr. 24
Příklad vlnkové transformace [25] 25
2.3.7 Metody stanovení fraktálních parametrů 2.3.7.1 Box–Counting metoda Box–Counting (metoda počítání čtverců) je jednou z metod ke stanovení fraktálních dimenzí, které charakterizují vlastnosti struktur černobílých digitalizovaných obrazů. Princip metody spočívá v pokrytí analyzovaného obrazu čtverci různé velikosti. Hodnotí se, kolik čtverců je potřeba k pokrytí celého fraktálního objektu. Opakováním tohoto měření s různými velikostmi čtverců získáme závislost logaritmu počtu čtverců log N(ε) na logaritmu jejich velikosti log(ε). Směrnice této závislosti vyjadřuje fraktální dimenzi. Zdokonalení této metody se provádí v programu HarFA, kde je analyzována pouze vybraná část obrazu, jsou stanovovány tři fraktální dimenze (bílé plochy, černé plochy a rozhraní), k výpočtu jsou vyuţity integrální transformace (vlnková – Haarova transformace) [44, 45]. 2.3.7.2 Mass–Radius metoda Mass–Radius metoda (metoda počítání plochy resp. hmotnosti) je další metoda pro výpočet fraktální dimenze, zaloţená na stanovení závislosti mezi počtem černých a bílých pixelů (obrazových bodů) v kruhové rovině různé velikosti vzhledem k těţišti (hmotnostnímu středu) soustavy. Směrnice závislosti logaritmu počtu čtverců log N(r) na logaritmu poloměru analyzované oblasti určuje opět fraktální dimenzi. Výsledek pomocí Mass–Radius metody by měl být téměř srovnatelný s výsledkem Box–Counting metody [44, 45]. 2.3.8 Program HarFA Je program vyvíjený na FCH VUT v Brně. Jeho název pochází z anglického označení Harmonic and Fractal Image Analyzer. Tento program byl primárně vytvořen k provádění harmonické a vlnkové analýzy digitalizovaných obrázků a výpočtů jejich fraktálních parametrů. V programu lze provádět harmonickou analýzu pomocí 1D a 2D Fourierovy transformace obrázků (viz kapitola 2.3.6.2 vlnkové transformace). Harmonická analýza je prováděna pomocí algoritmu Cooley–Tukey diskrétní Fourierovy transformace (DFFT). V programu je také vlnková 1D a 2D analýza (Wavelet Analysis), která je uskutečněna pomocí Haarovy transformace (viz kapitola 2.3.6.1 periodické transformace) a fraktální analýza (Fractal Analysis), která spočívá ve stanovení fraktální dimenze D a fraktální míry K, které jsou získány pomocí modifikace Box–Counting metody (viz kapitola 2.3.7.1 Box–Counting metoda) [48].
26
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Náplní experimentální práce byla obrazová analýza bakteriálních buněk druhu Bacillus megaterium a Cupriavidus necator a jejich směsi. Byla pouţita fraktální analýza, která byla prováděna pomocí Box–Counting a Mass–Radius metod. Pomocí Box–Counting metody byly zjištěny vhodné podmínky prahování (Thresholding) tak, aby bylo moţno provést reprezentativní analýzu, tj. např. odlišit oba typy bakterií. Pomocí Mass–Radius metody byly stanovené distribuční funkce v závislosti na vzdálenosti od těţiště shluku bakterií.
3.1 Pouţité druhy bakterií K experimentu byly vybrány druhy bakterií Bacillus megaterium (kmen QM B1551) a Cupriavidus necator (kmen H16) převáţně díky schopnosti růst v jednoduchém ţivném médiu a svým rozdílným velikostem.
3.2 Příprava preparátů K úspěšnému naočkování a vykultivování bakterií bylo třeba nejdříve připravit vhodná ţivná média. Pro Bacillus megaterium byla vţdy připravována ţivná média o objemu 100 dm3 , do kterých bylo naváţeno 0,5 gramu peptonu, 0,3 gramu Yeast Autolysatu a 0,1 gramu MnSO4 ∙4H2 O. Pro Cupriavidus necator byla připravována média také o objemu 100 dm3 pouze s naváţkou komplexního ţivného média Nutrien Broth. Příklad takovýchto ţivných médií je na Obr. 25.
Obr. 25
Erlenmeyerovy baňky s živnými médii (vlevo Nutrien Broth, vpravo směs peptonu, Yeast Autolysatu a MnSO4 ∙4H2 O)
Jakmile byla připravena ţivná média, pro kaţdý druh bakterií byla pomocí kličky zjednotlivých kultivačních šarţí na Petriho miskách z lednice naočkována kříţovým roztěrem a umístěna na laboratorní třepačky. Po pěti dnech se původní ţivné roztoky zakalily a byly připraveny pro měření (pořízení mikroskopických snímků).
27
3.3 Barvení preparátů Před pořízením snímků bylo preparáty nutno nejprve nabarvit, abychom byli schopni pozorované bakterie na snímcích rozlišit. K barvení preparátů bylo pouţito metody barvení podle Grama, které se skládalo z následujících kroků: do středu podloţních sklíček se připravil nátěr kultur grampozitivních Bacillus megaterium, gramnegativních Cupriavidus necator a jejich směsi po vysušení na vzduchu a fixování nad plamenem se preparát převrstvil na 20 sekund roztokem krystalové violeti po skončení barvení se krystalová violet opatrně slila a preparáty byly opláchnuty tekoucí vodou dále byly preparáty převrstveny asi 1 minutu Lugolovým roztokem po 1 minutě působení byl Lugolův roztok opatrně slit a znovu opláchnut tekoucí vodou následně byly preparáty odbarvovány 30 sekund pomocí 96% etanolu, oplachování bylo prováděno, dokud barvivo odcházelo, pak se preparáty ihned opláchly vodou dobarvování se provádělo zředěným karbolfuchsinem po dobu 1 minuty po skončení dobarvování následovalo opláchnutí preparátů a po sušení na vzduchu bylo jiţ moţné preparáty pozorovat pod mikroskopem, kdy grampozitivní bakterie byly obarveny krystalovou violetí tmavě fialově aţ modročerně a gramnegativní bakterie byly růţové, protoţe se odbarvily etanolem a dobarvily se kontrastním barvivem (karbolfuchsinem)
3.4 Měření a měřící aparatura Pro záznam obrazu bylo pouţito spojení světelného mikroskopu L1100A a CCD kamery SONY Exwave HAD SSC-DC50AP na Obr. 26. K záznamu a sledování obrazů byl pouţit program Lucia. Byly vytvořeny snímky Bacillus megaterium (BM01 aţ BM10), Cupriavidus necator (CN01 aţ CN10) a jejich směsí (BMCN01 aţ BMCN10), pro pětadvacetinásobné, čtyřicetinásobné a stonásobné zvětšení. Získané obrázky byly ukládány ve formátu TIFF. Pro tyto obrázky byla následně zjištěna hodnota optimálního prahu. Prahované obrázky byly vyuţity pro získání statických parametrů a distribučních funkcí.
Obr. 26
Fotografie měřící aparatury. Mikroskop L1100A s CCD kamerou SONY Exwave HAD SSC-DC50AP 28
3.5 Fraktální analýza V následující části jsou uvedeny výsledky fraktální analýzy bakterií Bacillus megaterium a Cupriavidus necator a jejich směsi. Analýza sestávala ze dvou kroků: stanovení vhodné hodnoty prahu pomocí Box–Counting metody určení statistických parametrů velikosti bakterií pomocí Mass–Radius metody 3.5.1 Stanovení statistických parametrů a entropie struktury V této části bude hledána optimální hodnota prahu ze závislostí na fraktální dimenzi D (entropii S), fraktální míře K (ploše A). Pro lepší názornost byl pořízen Obr. 27, kde je zobrazeno menu pro nastavení programu HarFA. Vyhodnocování hodnoty prahu se provádělo na výřezech snímků o rozměrech 512×512 pixelů (výběr oblasti Area Size). V nabídce Process byl vybrán reţim Intensity, který se ukázal pro analýzu černobílých snímků jako nejvhodnější. Následně byla zpracovávána data (Wiew – Processed Data). Poslední nabídka (Range Analysis) nám umoţňuje analyzovat průběh všech naměřených dat pro různé hodnoty prahu (Threshold), který byl analyzován v celém rozsahu (Full Range) po kroku 1 (Step). Výsledky analýzy byly vyuţity ke stanovení – ploch A, entropie S a statistických parametrů.
Obr. 27
Nastavení programu HarFA pro stanovení vhodného prahu
Příklad fraktální analýzy je demonstrován na mikroskopickém snímku bakterie Bacillus megaterium, šarţe BM08 Obr. 28, vlevo. Napravo je uveden výřez černobílého snímku o rozměrech 512×512 pixelů vytvořeného prahováním na hodnotě 152.
29
Obr. 28
Snímky buněk bakterií Bacillus megaterium (BM08)
Pro stanovení entropie struktury S, ploch KB, KW, KBW a statistických parametrů AVG, BED byla pouţita Box–Counting metoda. Pro výpočet byly pouţity následující vztahy. Fraktální dimenze D je obecně definována vztahem
D
d(log N ) , d(log )
(11)
kde N je celkový počet čtverců (bílých, černých a černobílých), ε je velikost čtverců. Z této rovnice vyplývá za předpokladu, ţe se jedná o jednoduchou fraktální strukturu (D = konst.), vztah
log N log K D log ,
(12)
kde K je fraktální míra struktury, resp. vztah
N K D .
(13)
Z experimentálních dat lze fraktální dimenze a fraktální míru stanovit pomocí lineární regrese závislosti počtu čtverců na jejich velikosti (12), ( y a bx ), jejíţ koeficienty a, b lze pouţít k určení obou fraktálních parametrů. Entropie S (SBBW , SWBW , SBW ) fraktální struktury lze stanovit z fraktálních dimenzí D (DBBW , DWBW , DBW ) pomocí vztahu [46, 47]
S D log .
(14)
Velikosti ploch A (ABBW , AWBW , ABW ) fraktální struktury lze stanovit z fraktálních mír K (KBBW , KWBW , KBW ) pomocí vztahů
AB
K BBW K BW , K BBW K WBW K BW
(15)
AW
K WBW K BW , K BBW K WBW K BW
(16)
30
ABW
K BBW
K BW , K WBW K BW
(17)
kde KBBW je fraktální míra černých čtverců včetně rozhraní, KBW je fraktální míra čtverců křivky, KWBW je fraktální míra bílých čtverců včetně rozhraní. Pro součet všech tří ploch platí
AB AW ABW 1 .
(18)
resp. pro prahovaný obrázek o velikosti strany 512 pixelů je K B K W K BW K max (512 512) pixelů .
(19)
V grafu na Obr. 29 je uvedena závislost všech tří fraktálních dimenzí D (DWBW – bílý povrch zahrnující rozhraní, DBBW – černý povrch zahrnující rozhraní, a DBW – rozhraní) na hodnotě prahu, kdy pravá osa (entropie S) byla přepočítaná podle vztahu (14) a velikost oblasti r 1 512 pixelů . V dalším grafu (Obr. 30) je uvedena závislost tří fraktálních mír K (KB, KW , KBW ), resp. relativních ploch A (AB - černý povrch nezahrnující rozhraní, AW - bílý povrch nezahrnující rozhraní, a ABW - povrch rozhraní, který je úměrný délce rozhraní) na hodnotě prahu (AB + AW + ABW = 1).
Obr. 29
Závislost fraktálních dimenzí (resp. entropií) na hodnotě prahu
31
Vyhodnocování se provádělo pro různé výřezy, pro všechny pořízené snímky Bacillus megaterium, Cupriavidus necator a jejich směsí, u kterých bylo dosaţeno obdobných výsledků. Zjištěná optimální hodnota prahu snímku byla 152. Tento výsledek je zřejmý i z Obr. 29, kde můţeme pozorovat za prahem 160 pokles DWBW a DBW a náhlý nárůst DBBW , proto za tímto prahem nejsme schopni daný snímek rozlišit.
Obr. 30
Závislost fraktálních mír (resp. ploch) na hodnotě prahu
3.5.2 Stanovení distribučních funkcí podle velikosti V této kapitole bude provedeno stanovení distribučních funkcí na modelovém snímku bakterie Bacillus megaterium BM09 a závislost fraktálních dimenzí D Bacillus megaterium BM07 aţ BM10 na poloměru r v logaritmickém měřítku. Na Obr. 31 nalevo je uveden výřez mikroskopického snímku bakterie Bacillus megaterium BM09 při čtyřicetinásobném zvětšení pro fraktální analýzu o rozměrech (512×512) pixelů. Napravo je tento stejný snímek uveden v grafu, pomocí bodů zjištěných z programu HarFA, kde je značkou zobrazeno těţiště snímku, který byl vyuţit pro stanovení distribučních funkcí Obr. 32 a 33.
32
Obr. 31
Snímek Bacillus megaterium (BM09)
Distribuční funkce bakterií byly stanovovány pomocí Mass–Radius metody, kde pro základní charakteristiky černobílých snímků byli pouţity obdobné vztahy jako u Box– Counting metody (11–19) pro 1 / r . V tomto případě jsou stanovovány intervalovou četnosti pixelů n určitých vlastností (černých – B a bílých – W) oblasti definované mezikruţím o poloměru r a r + r, kde velikost kroku byla zvolena r = 10 pixelů. Na Obr. 32 je vynesena logaritmická závislost četností n na logaritmu poloměru r, kdy strmost závislosti je log(n) = 0,21 · log(r) + 2,25.
Obr. 32
Graf závislosti četnosti n na poloměru r v logaritmickém měřítku
33
Na Obr. 33 je logaritmická závislost kumulativní četnosti ns na logaritmu poloměru kruţnice r vzorku BM09. Strmost závislosti log(ns) = 1,05 · log(r) + 2.33 (červená přímka) určuje fraktální dimenzi D bílých pixelů (tj. prahovaného obrázku bakterií). Ze vztahu vyplývá, ţe střední fraktální dimenze D = 1,05, fraktální míra K =102,33 pixelů2 = 214 pixelů2 (plná plocha kruhu o poloměru 10 pixelů je 314 pixelů2 ). Ve skutečnosti se však jedná o multifraktální strukturu, coţ je zřejmé z derivace logaritmické závislosti kumulativní četnosti na logaritmu poloměru (11). To je vyneseno v grafu na obrázku Obr. 32. Uvedená struktura má dvě minima – stabilní fáze, v blízkosti těţiště je větší počet bakterií, ve větší vzdálenosti je menší počet. První poloměr má velikost 50 pixelů (4,1 µm, maximální fraktální dimenze 1) a druhý 200 pixelů (16,5 µm, maximální fraktální dimenze 1).
Obr. 33
Graf závislosti kumulativní četnosti ns na poloměru r v logaritmickém měřítku
Na souhrnném grafu (Obr. 34) je uvedena závislost fraktální dimenze D na logaritmu poloměru r bakterií Bacillus megaterium snímcích BM07 aţ BM10 při čtyřicetinásobném zvětšení. Snímek BM07 má dvě minima – první stabilní fáze do vzdálenosti 90 pixelů (7,4 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 265 pixelů (21,9 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8). Snímek BM08 má dvě minima – první stabilní fáze do vzdálenosti 104 pixelů (8,6 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,9) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 266 pixelů (22,0 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,6). Snímek BM09 má dvě minima – první stabilní fáze do vzdálenosti 50 pixelů (4,1 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 200 pixelů (16,5 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8. Snímek BM10 má dvě minima – stabilní fáze první je do vzdálenosti 86 pixelů (7,0 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 1,1) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 232 pixelů (19,2 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8). Porovnáním všech těchto křivek fraktálních dimenzí D je zjistíme, ţe mají podobný charakter. U všech jsou zřejmá dvě 34
minima – stabilní fáze přibliţně ve stejné poloze, jejichţ střední hodnota je 81,6 pixelů a 240,0 pixelů. Ze souhrnného grafu snímků BM07 aţ BM10 tedy můţeme usoudit, ţe v roztoku Bacillus megaterium se nacházejí dvě velikosti bakterií.
Obr. 34
Graf závislosti fraktální dimenze D na poloměru r v logaritmickém měřítku pro různé snímky Bacillus megaterium
3.5.3 Vliv rozlišení mikroskopu na výsledky směsi BM a CN Zde se budeme zabývat vlivem rozlišení mikroskopu při pětadvacetinásobném, čtyřicetinásobném a stonásobném zvětšení na výsledky směsi Bacillus megaterium a Cupriavidus necator (BMCN03 – stonásobně zvětšen, BMCN10 – čtyřicetinásobně zvětšen, BMCN14 – pětadvacetinásobně zvětšen). Na Obr. 35 nalevo je uveden výřez mikroskopických snímků směsi bakterií Bacillus megaterium a Cupriavidus necator při stonásobném zvětšení (BMCN03), při čtyřicetinásobném zvětšení (BMCN10) a při pětadvacetinásobném zvětšení (BMCN14) pro fraktální analýzu obrázku o rozměrech (512×512) pixelů. Napravo je tento stejný snímek uveden v grafu, pomocí bodů, které byly zjištěny pomocí programu HarFA, vyuţitých pro stanovení distribučních funkcí Mass–Radius metodou Obr. 36, kde je značkou zobrazeno těţiště soustavy.
35
Obr. 35
Snímky směsi Bacillus megaterium a Cupriavidus necator
Na souhrnném grafu (Obr. 36) je uvedena závislost fraktální dimenze D na logaritmu poloměru r bakterií směsi Bacillus megaterium a Cupriavidus necator na BMCN03, BMCN10 a BMCN14. Snímek BMCN03 má tři minima – první stabilní fáze je do vzdálenosti 121 pixelů (10,0 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,9), druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 238 pixelů (19,6 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,4) a třetí stabilní fáze je do vzdálenosti 286 pixelů (23,6 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,2. Snímek BMCN10 má dvě minima – první stabilní fáze je do vzdálenosti 78 pixelů (6,5 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 1,8) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 265 pixelů 36
(21,9 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,6. Snímek BMCN14 má pouze jedno minimum – stabilní fáze je do vzdálenosti 262 pixelů (20,8 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,3). Z výsledků je tedy zřejmé, ţe pro analýzu je nejvhodnější co největší rozlišení, kdy s rostoucím zvětšením nejsme schopni rozlišit jednotlivé stabilní fáze. Tento fakt je také zřejmý z Obr. 35, kdy na snímku při pětadvacetinásobném zvětšení jsou jiţ patrné shluky bakterií.
Obr. 36
Graf závislosti fraktální dimenze D na poloměru r v logaritmickém měřítku pro směs Bacillus megaterium a Cupriavidus necator v různých rozlišeních
3.5.4 Porovnání distribučních funkcí směsi BM, CN a jejich směsi V poslední kapitole budou porovnávány zjištěné distribuční funkce Bacillus megaterium, Cupriavidus necator a jejich směsi. Na Obr. 37 jsou nalevo snímky o výřezu (512×512) pixelů při čtyřicetinásobném zvětšení (první snímek BM10, druhý snímek CN08 a třetí snímek BMCN10). Napravo jsou pak tyto snímky převedeny do grafu, které byly pouţity pro stanovení distribučních funkcí Mass–Radius metodou.
37
Obr. 37
Snímek Bacillus megaterium a Cupriavidus necator a jejich směsi
Na souhrnném grafu (Obr. 38) je uvedena závislost fraktální dimenze D na logaritmu poloměru r bakterií směsi Bacillus megaterium, Cupriavidus necator a jejich směsi při čtyřicetinásobném zvětšení. Snímek BM10 má dvě minima – první stabilní fáze je do vzdálenosti 86 pixelů (7,0 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 1,1) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 232 pixelů (19,2 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8). Snímek CN08 má dvě minima – první stabilní fáze je do vzdálenosti 107 pixelů (8,8 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 1,9) a druhá stabilní fáze je do vzdálenosti 257 pixelů (21,2 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,8). Snímek BMCN10 má dvě minima – první stabilní fáze je do vzdálenosti 78 pixelů (6,5 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 1,8) a první stabilní fáze je do vzdálenosti 265 pixelů (21,9 µm) od těţiště (maximální fraktální dimenze 0,6. Porovnáním všech těchto křivek fraktálních dimenzí D jsme zjistili, ţe ve směsi na snímku BMCN10 bylo více bakterií Cupriavidus necator o stejné velikosti, jelikoţ první hlavní minimum – stabilní fáze je posunuta blíţe k ploše odpovídající CN08.
38
Obr. 38
Graf závislosti fraktální dimenze D na poloměru r v logaritmickém měřítku pro směs Bacillus megaterium, Cupriavidus necator a jejich směsi
39
4. ZÁVĚR Bakalářská práce byla zaměřena na studium populací bakterií pomocí metod obrazové analýzy. Ke studiu byla zvolena fraktální analýza. Studovaným subjektem byly bakterie druhu Bacillus megaterium a Cupriavidus necator. V teoretické části (kap. 2) byla provedena rešerše zaměřená na studované objekty (bakterie), moţné mikroskopické metody a metody obrazové analýzy vycházející z integrálních transformací. V úvodu experimentální práce (kap. 3) jsou uvedeny vlastnosti bakterií, se kterými byl experiment prováděn, popsána příprava ţivných roztoků, postup barvení preparátů a příprava preparátů pro měření. V kapitole, která se zabývala fraktální analýzou bakterií (kap. 3.5.1) byla stanovena pomocí Box–Counting metody optimální hodnota prahu ze závislostí fraktální dimenze D (resp. entropie S) a fraktální míry K (resp. plochy A) na hodnotě prahu (152). V následující kapitole (kap. 3.5.1) byly stanoveny pomocí Mass–Radius metody distribuční funkce. V práci jsou demonstrovány na modelovém snímku bakterie Bacillus megaterium BM09. Bylo zjištěno, ţe uvedená struktura má dvě minima – stabilní fáze, v blízkosti těţiště je větší počet bakterií, ve větší vzdálenosti je menší počet. Tato minima odpovídají změně distribuce bakterií na ploše, tj. změně fraktálního charakteru rozloţení bakterií. Dále byla zkoumána závislost fraktálních dimenzí D Bacillus megaterium BM07 aţ BM10 na vzdálenosti od těţiště. Ze souhrnného grafu (Obr. 34) jsme zjistili, ţe na snímcích BM07 aţ BM10 se nacházejí dvě velikosti bakterií. V další kapitole (kap. 3.5.3) pojednává o vlivu rozlišení mikroskopu na výsledky směsi Bacillus megaterium a Cupriavidus necator. Bylo zjištěno, ţe pro obrazovou analýzu je nejvhodnější stonásobné zvětšení. Pro pětadvacetinásobné zvětšení, je na analyzované ploše příliš mnoho shluků bakterií, tudíţ není moţné rozlišit minima, tj. jednotlivé stabilní fáze. V závěrečné kapitole (kap. 3.5.3) jsou porovnány distribuční fukce Bacillus megaterium, Cupriavidus necator a jejich směsi. Porovnáním křivek fraktálních dimenzí D jsme zjistili, ţe směs na snímku BMCN10 obsahovala více bakterií Cupriavidus necator o stejné velikosti, jelikoţ minimum – stabilní fáze křivky CN08 je posunuta blíţe ke křivce BMCN10. Výsledky bakalářské práce slouţí jako základní data pro optimalizaci metod obrazové analýzy pro zjišťování počtu bakterií, jejich ploch, růstu a dělení. V budoucnu v tomto výzkumu bude pokračováno.
40
5. SEZNAM POUŢITÝCH ZDROJŮ [1]
BEDNÁŘ, Marek. Lékařská mikrobiologie: bakteriologie, virologie, parazitologie. Vyd. 1. Praha: Marvil, 1996, 558 s, ISBN 80-238-0297-6.
[2]
ROSYPAL, Stanislav. Nový přehled biologie. 1. vyd. Praha: Scientia, 2003, xxii, 797 s. ISBN 80-718-3268-5.
[3]
Fytopatologie cvičení / Bakterie (Prokaryota) [online]. 2013-07-18 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://WEB2.MENDELU.CZ/AF_291_PROJEKTY2/ VSEO/STRANKA .PHP?KOD=130
[4]
Pohlavně přenosné choroby [online]. 2013-01-11 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://WWW .004.CZ/RSERVICE.PHP?AKCE=TISK& CISLOCLANKU=2005082003
[5]
Výukový portál University J. E. Purkyně - rozmnoţování mikroorganismů [online]. [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://FZP.UJEP.CZ/~TROGL/3ROZMNZOVANI.PDF
[6]
PAUL DE VOS. Bergey's manual of systematic bacteriology. 2 vyd. Dordrecht: Springer, 2009, ISBN 978-038-7684-895.
[7]
VARY, Patricia S., Rebekka BIEDENDIECK, Tobias FUERCH, Friedhelm MEINHARDT, Manfred ROHDE, Wolf-Dieter DECKWER a Dieter JAHN. Bacillus megaterium—from simple soil bacterium to industrial protein production host. Applied Microbiology and Biotechnology. 2007-9-14, s. 957-967, DOI: 10.1007/s00253-007-1089-3. Dostupné z: HTTP://LINK.SPRINGER.COM /10.1007/S00253-007-1089-3
[8]
REINECKE, Frank a Alexander STEINBÜCHEL. Ralstonia eutropha Strain H16 as Model Organism for PHA Metabolism and for Biotechnological Production of Technically Interesting Biopolymers. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2008-10-29, č. 108, DOI: 10.1159/000142897.
[9]
Snímek Cupriavidus necator [online]. 2001-01-17 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://AEM .ASM .ORG/CONTENT/67/4/1964/F1.EXPANSION.HTML
[10]
Optická mikroskopie [online]. [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: HTTP://WEB.NATUR.CUNI.CZ/~PARAZIT/PARPAGES/MIKROSKOPICKATECHNIKA /SVETELN AMIKROSKOPIE.HTM
[11]
ASENBAUM, Karl-Heins. Objevy: světová kronika. 1. vyd. Meidenbauer. Čestlice: Rebo, 2005, 400 s, ISBN 80-723-4410-2.
[12]
Mikroskop Asahi [online]. [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: HTTP://WWW .FOTOGRAFOVANI.CZ/OLD- IDIF/FOTOGRAFOVANI/IMAGES 3/ASAHI_V.JPG
[13]
BRADBURY, Savile a Brian BRACEGIRDLE. Introduction to light microscopy. Digital printing 2005. Oxford: BIOS Scientific Publ, 1998. ISBN 18-599-6121-5.
[14]
ZMEŠKAL, Oldřich. Zobrazovací metody v optické mikroskopii [online]. [cit. 201404-25]. Dostupné z:
Redaktor Jörg
HTTP://WWW .FCH.VUTBR.CZ/~ZMESKAL/OBRING/PREDNASKY_2004/MIKROSKOPIE_2%
20(MARTIN%20JULINEK).PDF 41
[15]
Campylobacter bakterie [online]. [cit. 2014-04-25]. Dostupné HTTP://WWW 2.WMIN.AC.UK/~REDWAYK/LECTURES/IMAGES/LECTUR8. GIF
z:
[16]
ABRAMOWITZ, Mortimer. Metoda temného pole [online]. 1999 [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: HTTP://MICRO.MAGNET.FSU.EDU/PRIMER/TECHNIQUES/DARKFIELD.HTML
[17]
HEJTMÁNEK, Milan. Úvod do světelné mikroskopie. 3. přeprac. a dopl. vyd. Olomouc: Vydavatelství University Palackého, 1993, 65 s, ISBN 80-706-7308-7.
[18]
Fotografie části krve pořízená ve světlém a tmavém poli [online]. [cit. 2014-04-25]. Dostupné z: HTTP://WWW .ZDRAVIVKRVI.CZ/SOUBORY/ROZDILY_-_SVETLE_A _TEMNE_POLE.JPG
[19]
NAVRÁTIL, Leoš. Medicínská biofyzika. Vyd. 1. Praha: Grada, 2005, 524 s. ISBN 80-247-1152-4.
[20]
Veterinární klinika Dostupné z:
Štrossovka
-
fázový
kontrast [online].
[cit.
2014-04-27].
HTTP://VETKLINIKA - LABORATOR.BLOG.CZ/GALERIE/MOCOVYSEDIMENT/OBRAZEK/78879408
[21]
KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky : vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2006, 120 s. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze, ISBN 80-246-1069-8.
[22]
SPRING, Kenneth a Michael DAVIDSON. Introduction to Fluorescence Microscopy [online]. 2008-09-28 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://WWW .MICROSCOPYU.COM /ARTICLES/FLUORESCENCE/FLUORESCENCEINTRO.HT ML
[23]
Snímek Medaka juveniles [online]. 2009 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://WWW .EMBL.DE/ABOUTUS/COMMUNICATION_OUTREACH/MEDIA _RELATIONS/20 09/090224_HEIDELBERG- PIC/
[24]
PAWLEY, James B. Handbook of biological confocal microscopy. 3. vyd. New York, NY: Springer, 2006, 985 s, ISBN 03-872-5921-X.
[25]
ZMEŠKAL, Oldřich. Metody obrazové analýzy dat, Digitální zobrazování v biologii a medicíně 2002: sborník přednášek a abstraktů konference konané v Českých Budějovicích 13. května 2002. České Budějovice: Entomologický ústav AV ČR, 2002, ISBN 80-901-2508-5.
[26]
Výukový portál University Palackého [online]. 2004-02-22 [cit. 2014-04-27]. Dostupné z: HTTP://BIOLOGIE.UPOL.CZ /MIKROSKOPIE/OBRAZOVA %20ANALYZA .HTM
[27]
ZMEŠKAL, Oldřich. Principy digitálního záznamu obrazu, XXIII. International Symposium of Phototechnic, Komora fotografů ČR, Hradec Králové: Listopad 4. - 6., 2001, ISBN 80-02-01458-8.
[28]
POYNTON, Charles. Digital video and HDTV: algorithms and interfaces. San Francisco: Morgan Kaufmann Publishers, 2003, 602 s, ISBN 15-586-0792-7.
42
[29]
Kolorimetrický trojúhelník [online].[cit. 2014-04-25]. HTTP://EN.WIKIPEDIA .ORG/WIKI/FILE:CIEXY1931.PNG
Dostupné
[30]
ZMEŠKAL, Oldřich. Barevné prostory a správa barev, XXIV. International Symposium of Phototechnic, Komora fotografů ČR, Roţnov pod Radhoštěm: Říjen 20. - 22., 2002.
[31]
Aditivní míchání barev [online].[cit. 2014-05-3]. HTTP://I.IDNES.CZ/07/063/ CL/JLB1 C00 ED_RGB_BARVY.JPG
[32]
The Tech Terms Computer Dictionary [online]. [cit. 2014-05-3]. Dostupné z: HTTP://WWW .TECHTERMS.COM /DEFINITION/CMYK
[33]
Subtraktivní míchání barev [online].[cit. 2014-05-3]. Dostupné HTTP://WWW .HILAND.COM /FILES/2512/6598/4619/COLOUR- SPACE-CMYK.JPG
[34]
JOHNSON, Stephen. Stephen Johnson on digital photography. Sebastopol: O'Reilly, 2006, 305 s. ISBN 05-965-2370-X.
[35]
Převedení z RGB na stupně šedi [online].[cit. 2014-05-3]. Dostupné z: HTTP://WWW .MATHWORKS.COM /MATLABCENTRAL/FILEEXCHANGE/SCREENSHOTS/8313 /ORIGINAL.JPG
[36]
ZMEŠKAL, Oldřich. Vyuţití fraktální analýzy při hodnocení kvality tisku, IV. Polygraphic Conference, Univerzita Pardubice, Září 12. - 13., 2001, 92 – 101s, ISBN 80-7194-372-X.
[37]
MANDELBROT, B. Fractal geometry of nature. Vyd. 3. New York: Freeman and company, 1983, 468 s. ISBN 07-167-1186-9.
[38]
VICSEK, Tamás. Fractal growth phenomena. Vyd. 2. New Jersey: World Scientific, 1992, 488 s. ISBN 98-102-0669-0.
[39]
NIGEL LESMOIR-GORDON, Will Rood and Ralph Edney. Introducing fractal geometry. Reprinted. Cambridge: Icon Books [u.a.], 2000. ISBN 978-184-0461-237.
[40]
PETYOVSKÝ, Petr. Linearizované systémy iterovaných funkcí [online]. 2003 [cit. 2014-05-7]. Dostupné z: HTTP://WWW .ELEKTROREVUE.CZ/ CLANKY/03019/INDEX.HTM
[41]
Kochova vločka [online].[cit. 2014-05-8]. Dostupné HTTP://WWW .MATHAWARE.ORG/MAM /00/MASTER/ESSAYS/B3D/2/JPG/FIGURE23.JP
[42]
ZMEŠKAL, Oldřich, Nezadal M., Buchnicek M.: Fractal-Cantorian Geometry, Hausdorff Dimension and the Fundamenal Laws of Physics, Chaos, Solitons & Fractals, 17(1), 2003, s. 1013-1022. ISSN 0960-0779
[43]
PAUŠ, Petr. Počítačové generování fraktálních množin [online]. 2003 [cit. 2014-059]. Dostupné z: HTTP://GERALDINE.FJFI.CVUT.CZ/~PAUSP/FILES/RESERSE.PDF
[44]
ZMEŠKAL, Oldřich. Fractal Analysis of Image Structures [online]. 2001 [cit. 201405-9]. Dostupné z: HTTP://WWW .FCH.VUTBR.CZ/LECTURES /IMAGESCI/ DOWNLOAD_EJOURNAL/01_O.ZMES KAL.PDF
Dostupné
z:
z:
z:
z:
43
[45]
MORENCY, C. Fractal geometry for the characterisation of urban-related stats: Greater Montreal Case [online]. 2001 [cit. 2014-05-9]. Dostupné z: HTTP://WWW .FCH.VUTBR.CZ/LECTURES/IMAGESCI/DOWNLOAD_EJOURNAL/09_C.MORE NCY.PDF.
[46]
ZMEŠKAL, Oldřich., DZIK, P., VESELÝ, M.: Entropy of Fractal Systems. Computers and mathematics with applications (2013), DOI 10.1016/j.camwa.2013.01.017.
[47]
ZMEŠKAL, Oldřich., VESELÝ, M., DZIK, P., VALA, M.: Energy and Entropy of Fractal Objects: Application to Gravitational Field. Nostradamus: Modern Methods of Prediction, Modeling and Analysis of Nonlinear Systems (2013), DOI 10.1007/978-3-642-33227-2.
[48]
ZMEŠKAL Oldřich., NEŢÁDAL M., BŢATEK T. HarFA – Harmonic and Fractal Image Analyser. Ver. 5.5. Brno, 2011. Dostupné z: HTTP://WWW .FCH.VUTBR.CZ/LECTURES /IMAGESCI.
44