VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION
STANOVENÍ LÉČIV V KALECH Z ČISTÍREN ODPADNÍCH VOD
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE AUTHOR
BRNO 2013
RADEK HÁJEK
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION
STANOVENÍ LÉČIV V KALECH Z ČISTÍREN ODPADNÍCH VOD ASSESSMENT OF DRUGS IN SETTLINGS WITH WASTE WATER TREATMENT
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR´S THESIS
AUTOR PRÁCE
RADEK HÁJEK
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2013
prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc.
ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá problematikou stanovení léčiv v čistírenských kalech. Stanovovány byly látky erythromycin a clarithromycin ze skupiny makrolidových antibiotik a ibuprofen, naproxen a diklofenak ze skupiny nesteroidních protizánětlivých látek. Analýze byl podroben vzorek kalu z městské čistírny odpadních vod v Brně-Modřicích. Pro izolaci analytů z matrice byly zvoleny metody extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (PSE) a extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Přečištění a zakoncentrování extraktů bylo provedeno metodou extrakce tuhou fází (SPE). Pro kvantitativní stanovení zkoumaných látek byla použita ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) s detekcí pomocí diodového pole (UV-VIS-DAD).
ABSTRACT This bachelor thesis is focused on asessment of pharmaceuticals in wastewater treatment plant sludge. Two macrolide antibiotics (erythromycin and clarithromycin) and three nonsteroidal anti-inflammatory drugs (ibuprofen, naproxen and diclofenac) were assessed. Sample of sludge was taken in municipal wastewater treatment plant in Brno-Modřice. Analytes were obtained using pressurized solvent extraction (PSE) or ultrasonic solvent extraction (USE). Clean-up was performed by solid phase extraction (SPE). Ultra high performance liquid chromatography followed by UV-VIS diode array detection was used for quantitative determination of the analytes.
KLÍČOVÁ SLOVA UHPLC, kal, makrolidy, nesteroidní protizánětlivé látky
KEYWORDS UHPLC, sewage sludge, macrolides, non-steroidal anti-inflammatory drugs
-3-
HÁJEK, R. Stanovení léčiv v kalech z čistíren odpadních vod. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2013. 49 s. Vedoucí bakalářské práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana FCH VUT. ............................................. podpis studenta
Poděkování: Rád bych poděkoval paní prof. RNDr. Miladě Vávrové, CSc. za její vstřícnost, cenné rady a přípomínky. Velký dík patří rovněž Ing. Janě Oborné za vlídné slovo a pomoc při řešení problémů v experimentální části.
-4-
1
Úvod ............................................................................................................................... 7
2
Teoretická část................................................................................................................ 8 2.1
Léčiva – definice základních pojmů....................................................................... 8
2.2 Léčiva v životním prostředí.................................................................................... 8 2.3 Antibiotika a antibakteriální látky........................................................................ 10 2.3.1 Historie antibiotik......................................................................................... 11 2.3.2 Rozdělení antibiotik ..................................................................................... 11 2.3.3 Nežádoucí účinky......................................................................................... 13 2.3.4 Rezistence..................................................................................................... 13 2.4 Makrolidy ............................................................................................................. 14 2.4.1 Mechanismus účinku.................................................................................... 14 2.4.2 2.4.3
Farmakokinetika........................................................................................... 15 Charakteristika vybraných makrolidů .......................................................... 15
2.5 Analgetika ............................................................................................................ 16 2.5.1 Historie analgetik ......................................................................................... 16 2.5.2 Rozdělení analgetik ...................................................................................... 17 2.6 Nesteroidní protizánětlivé látky ........................................................................... 18 2.6.1 Mechanismus účinku.................................................................................... 19 2.6.2 Farmakokinetika........................................................................................... 19 2.6.3 Charakteristika vybraných nesteroidních protizánětlivých látek ................. 20 2.7 Mechanismy odstranění........................................................................................ 21 2.7.1 Fotodegradace .............................................................................................. 21 2.7.2 Sorpce........................................................................................................... 21 2.7.3 Biodegradace ................................................................................................ 22 2.7.4 Chemická oxidace ........................................................................................ 22 2.7.5 Membránové metody.................................................................................... 22 2.7.6 Aktivní uhlí .................................................................................................. 22 2.7.7 Fytoremediace, kořenové ČOV.................................................................... 22 2.8 Stanovení léčiv v čistírenských kalech................................................................. 23
3
2.8.1 Extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku ....................................................... 23 2.8.2 Extrakce pomocí ultrazvuku......................................................................... 24 2.8.3 Extrakce tuhou fází....................................................................................... 24 2.8.4 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie................................................... 25 Experimentální část ...................................................................................................... 29 3.1 3.2
Použité přístroje a zařízení ................................................................................... 29 Software použitý ke zpracování a prezentaci dat ................................................. 29
-5-
3.3 Použité chemikálie a standardy ............................................................................ 30 3.3.1 Chemikálie ................................................................................................... 30 3.3.2 Standardy...................................................................................................... 30 3.4 Analyzovaná matrice............................................................................................ 30 3.5 Sledované analyty ................................................................................................ 30 3.6 Postup stanovení................................................................................................... 30 3.6.1 Odběr vzorků................................................................................................ 30 3.6.2 3.6.3
Příprava vzorků a izolace analytu ................................................................ 31 Přečištění a zakoncentrování extraktu, SPE................................................. 31
3.6.4 Identifikace a kvantifikace analytů .............................................................. 32 4 Výsledky a diskuze....................................................................................................... 34 4.1 Optimalizace chromatografických podmínek ...................................................... 34 4.1.1 Stanovení makrolidů .................................................................................... 34 4.1.2 Nesteroidní protizánětlivé látky ................................................................... 35 4.2 Porovnání použitých extrakčních metod .............................................................. 36 4.3 Analýza reálného vzorku...................................................................................... 38 5 Závěr............................................................................................................................. 40 6 Seznam použitých zdrojů ............................................................................................. 41 7 8
Seznam použitých zkratek............................................................................................ 46 Přílohy .......................................................................................................................... 47
-6-
1
ÚVOD Léčiva jsou přirozenou součástí lidského bytí. Pokrok v medicínských oborech každým
dnem přináší nové objevy, na což je farmaceutický průmysl nucen reagovat vývojem nových účinných látek. Zlepšující se diagnostické možnosti a neustále se zvyšující střední délka lidského života přitom vede k rostoucí spotřebě léčiv v humánní medicíně. Nelze však opomenout ani používání veterinárních léčiv. Do životního prostředí se tak dostává velké množství látek, jejichž komplexní vliv na ekosystém není dopředu znám. Charakter léčivých látek a jejich metabolitů vede k tomu, že byly po boku nechvalně proslulých xenobiotik typu polychlorovaných bifenylů (PCB) nebo chlorovaných pesticidů zařazeny mezi tzv. perzistentní organické polutanty (POPs). Vzhledem k rostoucímu zájmu o tyto látky byla vytvořena nová kategorie, kdy se hovoří o tzv. PPCPs (Pharmaceutical and Personal Care Products as Pollutants), mezi něž kromě léčiv patří např. syntetické vonné látky (MUSK) nebo látky používané v kosmetickém průmyslu. Detekovaná množství těchto látek zpravidla nepřesahují hodnotu 1 mg·l-1. Zato jsou rezidua léčiv zjišťována prakticky ve všech složkách prostředí a také téměř na všech místech planety. V nejvyšších koncentracích se nacházejí v odpadních vodách, přičemž v čistírnách odpadních vod (ČOV), jejichž technologie není selektivně přizpůsobena pro odstraňování kontaminantů, nedochází k jejich úplnému odstranění. ČOV se tak stávají významným bodovým zdrojem znečištění životního prostředí. Cílem této bakalářské práce je zjistit, zda jsou rezidua léčiv schopna sorbovat se na čistírenských kalech. Pro posouzení tohoto problému byly vybrány látky ze skupiny makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých látek. Analyzován byl vzorek kalu z ČOV odebraný v Brně-Modřicích, který byl extrahován metodou extrakce za zvýšeného tlaku (PSE) a metodou extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Množství detekovaných analytů bylo stanoveno pomocí kapalinového chromatografu s detektorem diodového pole (UHPLCDAD).
-7-
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Léčiva – definice základních pojmů Léčiva (též farmaka) jsou látky nebo jejich směsi, případně léčivé přípravky určené pro podání lidem nebo zvířatům, a to za účelem prevence chorob, k léčení chorob a mírnění jejich příznaků, případně k diagnostice a ovlivňování fyziologických funkcí [1]. Léčivé látky (substance) jsou látky přírodního nebo syntetického původu, které způsobují farmakologický nebo imunologický účinek léčivého přípravku nebo látky ovlivňující metabolismus [1, 2]. Léčivé přípravky jsou produkty získané technologickým zpracováním účinných substancí a pomocných látek (excipientů) do určité lékové formy. Dělí se na humánní a veterinární. Léčivý přípravek podaný osobě nebo zvířeti z důvodu preventivního, terapeutického nebo diagnostického se nazývá lék [1, 2]. Léková forma je způsob úpravy léčiva do formy vhodné pro léčebné použití (tablety, želatinové tobolky, dražé, čípky, implantáty, injekce, infuze, kapky a roztoky, masti, krémy nebo gely). Podle způsobu podání lze lékové formy rozdělit na enterální (podáváné prostřednictvím trávicí trubice), parenterální (podávané mimo trávicí trubici) a topické (aplikované lokálně, např. na kůži nebo sliznice) [1]. Z hlediska původu se léčiva dělí na dva typy: Originální léčivo bylo vyvinuto původním výzkumem tzv. inovativních farmaceutických společností a vztahuje se na něj časově omezená patentová ochrana. Generické léčivo (generikum) je legální „kopie“ originálního léčiva, která může být volně vyráběna ostatními firmami, a to až po vypršení patentové ochrany. Výroba generik má výrazný vliv na snížení ceny léčiv [1]. Rezidua léčiv jsou zbytky aktivních látek nebo jejich metabolitů.
2.2 Léčiva v životním prostředí Do životního prostředí se léčiva nebo produkty jejich přeměny dostávají dvěma základními cestami. V lidském organismu se určitý podíl léčivé látky metabolizuje, přebytek prochází tělem v nezměněné podobě a z těla odchází prostřednictvím moči nebo exkrementů. Nepoužité léky často nesprávně končí ve směsném komunálním odpadu. V odpadních vodách ze zdravotnických zařízení a domácností tyto polutanty putují do čistírny odpadních vod, kde část z nich degraduje (především v biologickém stupni čištění), část zůstává zachycena v kalech a část odtéká s přečištěnou vodou do recipientu. Kaly mohou být použity jako hnojivo pro zlepšení vlastností povrchové vrstvy půdy. Působením dešťových srážek dochází k vymývání svrchní vrstvy půdy a transportu ve vodě rozpustných látek do povrchových nebo podzemních vod. Neméně zanedbatelným zdrojem znečištění je aplikace veterinárních léčiv,
-8-
kdy část odchází přímo do odpadních vod, část se díky hnojení trusem dostává do půdy a dále do vod. Moderní farmakochemie produkuje celou škálu léčivých přípravků, které je možné rozdělit do skupin podle indikace. Tyto léčivé přípravky jsou obsaženy v běžně dostupných lécích, a proto je jejich zastoupení v životním prostředí nejvýznamnější, což znázorňuje Obrázek 1.
β2-Adrenergika 3% Veterinární léčiva 3%
Antidiabetika 3% Ostatní 1%
Rentgenověkontrastní látky 3% Antacida 3% Cytostatika 4% Antihypertenziva 4% Antidepresiva 4% Anxiolytika 4% β-Antiadrenergika 8% Antiepileptika 8%
Analgetika 16%
Antibiotika 15%
Hypolipidemika 12% Hormony 9%
Obrázek 1: Relativní zastoupení látek detekovaných v životním prostředí (podle 134 článků publikovaných od roku 1997 do roku 2009) [3] • • •
Analgetika jsou látky primárně užívané pro potlačení bolesti. Antibiotika jsou látky působící proti bakteriálním infekcím. Hypolipidemika jsou látky snižující hladinu lipoproteinů, především cholesterolu, v krevní plazmě. Ukládání tuků v cévních stěnách způsobuje většinu kardiovaskulárních onemocnění. Podle mechanismu účinku se tato léčiva dělí do několika skupin: pryskyřice schopné vázat žlučové kyseliny, léčiva ovlivňující
•
syntézu lipoproteinů, léčiva podporující vylučování lipoproteinů, inhibitory HMGCoA-reduktázy a léčiva potlačující absorpci cholesterolu z tenkého střeva. Mezi nejvýznamnější účinné látky patří simvastatin (obsažen v léčivém přípravku SIMVACARD) nebo atorvastatin (SORTIS, TORVACARD) [1]. Hormony jsou látky, které se tvoří v endokrinních žlázách. Společně tvoří endokrinní systém, který řídí a ovlivňuje periferní systém a řadu dalších funkcí lidského těla (např. růst, metabolismus) [1]. Z pohledu ochrany životního prostředí
-9-
přináší největší riziko používání hormonální antikoncepce u žen. V publikovaných studiích je poukazováno na to, že estrogenní hormony obsažené ve splaškových
•
vodách mohou způsobit nevratné poruchy sexuálního vývoje u vodních živočichů, zejména u ryb [4]. Antiepileptika jsou látky určené k léčbě epilepsie. Tato nemoc se projevuje opakovaným výskytem záchvatů vyvolaných abnormálními výboji v šedé kůře mozkové. U postiženého dochází ke stavům zmatenosti až ke ztrátě vědomí, které často doplňují křeče kosterního svalstva. Epilepsií trpí přibližně 1 % světové populace [1].
•
β-Antiadrenergika (Beta-Blockers) působí tak, že potlačují stimulační vliv katecholaminů na srdeční činnost, přičemž dochází ke snížení síly a frekvence srdečních kontrakcí. Používají se k léčbě hypertenze, glaukomu, anginy pectoris a při srdečních arytmiích. Patří mezi ně látky ze skupiny aryloxyaminopropanololů nebo arylethylaminů. β2-Adrenergika (β2-Sympathomimmetics) jsou uplatňována především v terapii průduškového astmatu. Jejich zástupcem je např. klenbuterol
•
• •
(BRONCODIL, CONTRASPASMIN) [1, 5]. Antidepresiva a anxiolytika patří mezi psychofarmaka, což jsou látky ovlivňující lidskou psychiku; používají k léčení duševních poruch. Potlačují deprese a stavy sklíčenosti, odstraňují duševní napětí, úzkost a strach [1]. Antihypertenziva jsou látky, které jsou aplikovány při zvýšeném krevním tlaku (hypertenzi). Rentgenově-kontrastní látky (X-ray contrast media) se používají při vyšetřování
pomocí rentgenových paprsků. Většinu z nich tvoří deriváty 2,4,6-trijodobenzoové kyseliny. Tyto látky patří k nejvíce odolným polutantům, protože více než 99 % se vyloučí z těla v nezměněné podobě [6]. Relativně méně zastoupené skupiny léčiv detekovaných v životním prostředí tvoří cytostatika (Antineoplastics), používaná k léčbě onkologických onemocnění a antacida, která se podávají při chorobách gastrointestinálního traktu, dále veterinární léčiva a přípravky pro léčbu cukrovky.
2.3 Antibiotika a antibakteriální látky Antibiotika a antibakteriální látky se používají při léčbě infekčních chorob vyvolaných patogenními mikroorganismy. Princip jejich účinku spočívá ve zničení nebo zpomalení růstu původce onemocnění, přičemž, pokud možno, nedochází k poškození hostitelského organismu. Antibiotika jsou látky primárně produkované mikroorganismy, zasahující do růstu jiných mikroorganismů. Naproti tomu se chemoterapeutika syntetického původu označují jako antibakteriální látky. Přesto se za antibiotika považují i některé substance získané syntetickými postupy, které však strukturně vycházejí z původních přírodních látek. Proto není toto terminologické rozdělení v běžné praxi striktně dodržováno [1, 5]. - 10 -
2.3.1
Historie antibiotik
Chemické látky byly užívány lidmi k léčení odnepaměti, aniž by však byla známa podstata jejich účinku. Základním kamenem pro hlubší vědecké poznání se stal van Leeuwenhoekův vynález mikroskopu, který umožnil zkoumání látek a organismů pouhým okem neviditelných. Pojmenování bakterie zavedl r. 1838 německý vědec Christian Gottfried Ehrenberg (1795– 1876). Vycházel z řeckého výrazu bakterion, který označoval tyčinku nebo hůlku (první pozorované bakterie měly podobu malých tyčinek) [7]. Roku 1877 popsal Louis Pasteur (1822–1895) antagonistické působení některých anaerobních bakterií na růst bacilu B. anthracis a poukázal na možnost využití tohoto poznatku v medicíně. Zanedlouho potom německý organický chemik Paul Ehrlich (1854– 1915) formuloval tuto zásadní hypotézu: pokud lze nalézti chemikálii, která se selektivně váže na bakterie a nikoliv na lidské buňky, mohla by se na tyto bakterie vázat látka jedovatá a tak zabíjet bakterie bez poškození buněk lidského těla. Tato myšlenka je podstatou chemoterapie a většiny oblastí moderního farmakologického výzkumu. Ehrlichovy výzkumy v oblasti vývoje nových textilních barviv zúročil r. 1935 Gerhard Domagk (1895–1964), který objevil červené barvivo Prontosil rubrum, obsahující účinnou část sulfanilamid – strukturní základ sulfonamidů. Skutečným milníkem se však stal r. 1929 Flemingův proslulý objev penicilinu a jeho antibiotických účinků. Jeho příprava byla technologicky zdokonalena Howardem Walterem Floreym (1898–1968) a Ernstem Borisem Chainem (1906–1979). Díky tomuto objevu se společně stali v roce 1945 laureáty Nobelovy ceny. Následovaly další zásadní objevy v této oblasti: streptomycin (1944), bacitracin (1945), chloramfenikol (1947), chlortetracyklin (1948), erythromycin (1952) a dalších. Dnes jsou známy stovky izolovaných a charakterizovaných antibiotik. Většímu využití v medicíně však zpravidla brání jejich vysoká toxicita [1, 8]. 2.3.2
Rozdělení antibiotik
Antibiotika tvoří velmi rozmanitou skupinu látek. Na základě jejich vlastností je možné rozdělit je do určitých kategorií. 2.3.2.1 Podle spektra účinnosti Antibiotika s úzkým spektrem účinku – působí jen na malý počet mikrobiálních druhů (např. antituberkulotika). Antibiotika se širokým spektrem účinku – působí proti většímu počtu patogenních kmenů (např. tetracykliny, chloramfenikol aj.) [5, 9]. 2.3.2.2 Podle struktury Existuje několik základních strukturních typů antibiotik:
- 11 -
Makrolidy obsahují makrocyklický laktonový kruh složený nejčastěji ze 14 až 16 atomů, ke kterému jsou navázány dva sacharidy. β-laktamová antibiotika mají ve své struktuře β-laktamový kruh kondenzovaný s heterocyklem – např. thiazolidinem (peniciliny), dihydrothiazinem (cefalosporiny, cefamyciny) a thiazolinem (penemy). Tetracykliny a anthracykliny jsou širokospektrá antibiotika produkovaná houbami rodu Streptomyces. Strukturně se jedná o částečně hydrogenované deriváty naftacenu. Protože se u nich mohou projevit vedlejší nežádoucí účinky, nedoporučuje se jejich dlouhodobé podávání malým dětem a těhotným ženám. Aminoglykosidy patří mezi oligosacharidová antibiotika modifikovaná navázanou aminoskupinou. Patrně nejvýznamnějším zástupcem aminoglykosidů je streptomycin, který se osvědčil jako lék proti tuberkulóze a dalším gramnegativním bakteriím. Peptidová antibiotika jsou tvořena nízkomolekulárními proteiny a oligopeptidy, často sestávajícími z aminokyselin, které se v běžných živočišných a rostlinných proteinech nevyskytují. Jejich zástupci bacitracin (FRAMYKOIN), polymyxiny a gramicidiny jsou zpravidla ve formách mastí nebo zásypů určených k zevnímu použití [1]. 2.3.2.3 Podle typu a mechanismu účinku Jestliže léčivá látka inhibuje další množení původce, hovoří se o bakteriostatickém účinku. Pokud látka mikrobiální buňky usmrcuje, hovoří se o baktericidním účinku [5, 9]. Tabulka 1: Účinky antibakteriálních látek [5, 9] Mechanismus účinku
Typ účinku
Příklad
Inhibice syntézy buněčné stěny
baktericidní
penicilin cefalosporiny
Poškození buněčné membrány
baktericidní
polypeptidy (polymyxin)
Inhibice syntézy kyseliny tetrahydrolistové většinou bakteriostatický
sulfonamidy trimethoprim diaminopyridin
Interference s bakteriální DNA
Inhibice proteosyntézy
baktericidní
bakteriostatický
chinolony nitroimidazol rifampicin makrolidy chloramfenikol tetracykliny
baktericidní
aminoglykosidy
- 12 -
Obrázek 2: Místa působení antibakteriálních látek v buňce [5] 2.3.3
Nežádoucí účinky
Kromě léčivých vlastností mohou antibiotika vykazovat celou řadu nežádoucích účinků. Jako u jiných druhů léčiv je požadován velký rozdíl mezi dávkou účinnou a dávkou toxickou. Z toho důvodu dochází k intoxikaci buď při předávkování, nebo v případě, že pacient trpí postižením jater nebo ledvin. Po podání některých druhů antibiotik může dojít k alergické reakci, která se projevuje kožní vyrážkou, ve vážných případech až anafylaktickým šokem. Běžná je alergie např. na peniciliny (asi 3 % populace), cefalosporiny nebo sulfonamidy. Z biologických nežádoucích účinků stojí za zmínku ovlivnění přirozené mikroflóry organismů, což se projevuje průjmy nebo vaginálními infekcemi [9]. 2.3.4
Rezistence
Vznik
rezistence
lze
považovat za významný problém provázející používání antibakteriálních látek. Vlivem léčby dochází k rozvoji rezistentních kmenů mikrobů, a proto
- 13 -
je nutné vyvíjet stále nové účinné látky. Přehled mechanismů vedoucích ke vzniku rezistence uvádí Tabulka 2 [5, 9].
Tabulka 2: Mechanismy vzniku rezistence na antibiotika Mechanismus
Zástupci
změna cílové molekuly
β-laktamy, makrolidy, linkosamidy
zhoršený průnik do buňky
aminoglykosidy, tetracykliny, chinolony
aktivní vyčerpávání z buňky
aminoglykosidy, tetracykliny, chinolony
inaktivace vlivem enzymů
aminoglykosidy, β-laktamy
2.4 Makrolidy Z chemického hlediska se jedná o makrocyklické laktony. Základem jejich struktury je makrolidový kruh, který je tvořen 14-16 atomy. Na tento cyklus se vážou dvě molekuly méně obvyklých deoxysacharidů, které jsou zodpovědné za antibiotický účinek. Erytromycin produkují bakterie Sacharopolyspora erythraea (dříve mylně považované za bakterie rodu Streptomyces). Používá se jako alternativa při rezistenci nebo alergii vůči penicilinu, a to při infekcích vyvolaných grampozitivními koky (stafylokoky, streptokoky, pneumokoky). Je relativně málo toxický, nesmí se však kombinovat s protichůdně působícími léky (β-laktamová antibiotika nebo linkosamidy). Novějšími semisyntetickými analogy erythromycinu jsou roxithromycin (RULID, SURLID) a clarithromycin (KLACID), které mají oproti svému předchůdci lepší účinnost proti některým mikrobům. Strukturu i podobné spektrum účinků jako erythromycin má azithromycin (SUMAMED). Za zmínku stojí jeho poměrně dlouhý biologický poločas (60 hodin). Proti houbovým infekcím se používají polyenová antibiotika, jejichž zástupcem je amfotericin B (FUNGIZONE). Chemickou modifikací erythromycinu vzniká nový typ léčiv – ketolidy. Jejich nejvýznamnější zástupce telithromycin je účinnější než starší účinné látky ze skupiny makrolidů. Působí i proti těm mikrobům, u nichž se vyvinula rezistence na erythromycin nebo clarithromycin [1, 5, 9]. Ve veterinární medicíně se používá širokospektrální antibiotikum tylosin. 2.4.1
Mechanismus účinku
Makrolidová antibiotika patří do skupiny antibakteriálních látek, které tlumí proteosyntézu. Princip spočívá v blokování posunu ribozomu na mRNA po vzniku peptidové vazby, tj. v nemožnosti navázání na následující triplet komplex tRNA + aminokyselina. Makrolidy působí v důsledku toho bakteriostaticky, spektrum účinku se podobá spektru penicilinu G [5, 9].
- 14 -
2.4.2
Farmakokinetika
K eliminaci erythromycinu v lidském organismu dochází převážně žlučí. Biologický poločas činí 1,5 až 2,5 hodiny. Vzhledem ke svým acidobazickým vlastnostem (volná báze) je nestálý v kyselém prostředí. Působením žaludečních šťáv se vytváří mezi šestým a devátým atomem uhlíku enolether, čímž dochází ke ztrátě antibakteriálních vlastností. Záměrným vytvořením esteru (erythromycin-ethylsukcinát) nebo soli vyšší mastné kysliny (erythromycin-stearát) se brání inaktivaci v žaludeční šťávě. U ostatních analogů erythromycinu není kyselinou podmíněná transformace možná. Obecně lze říci, že se ostatní makrolidy eliminují pomaleji, což umožňuje dávkování léků ve větších časových intervalech. Velmi pomalu se vylučuje azithromycin (pro udržení čtrnáct dnů trvající antibakteriální koncentrace postačuje podávání v prvních třech dnech) [5]. 2.4.3 •
Charakteristika vybraných makrolidů Erythromycin
Obrázek 3: Strukturní vzorec erythromycinu • •
Sumární vzorec: C37H67NO13 Registrační číslo CAS: 114-07-8
• •
Relativní molekulová hmotnost: Mr = 733,92 bílá nebo lehce nažloutlá krystalická látka, hořká, bez zápachu, volně rozpustný v ethanolu, methanolu, acetonitrilu aj. [10]
- 15 -
•
Clarithromycin
Obrázek 4: Strukturní vzorec clarithromycinu • • •
Sumární vzorec: C38H69NO13 Registrační číslo CAS: 81103-11-9 Relativní molekulová hmotnost: Mr = 747,95
•
bílá krystalická látka, bez zápachu, stabilní při kyselém pH, rozpustná v methanolu aj. [10]
2.5 Analgetika Analgetika patří mezi nejstarší používaná léčiva. Tyto látky snižují pocit bolesti, aniž by však výrazně ovlivňovaly smyslové vnímání a vědomí. Bolest je reakce těla na impulz (popálení, pořezání apod.), který aktivuje příslušné nervové receptory. Impulz přechází nervovými vlákny do míchy a do mozku, kde dochází k uvědomění si bolesti. Vznik impulzu lze potlačit snížením vnímavosti receptorů bolesti (podáním inhibitorů syntézy prostaglandinů) nebo potlačením procesu podráždění podáním lokálních anestetik. Zvládání těžších stavů (např. bolestivých tumorů) usnadňují opiáty, jejichž podání snižuje míru uvědomění si bolesti [5]. Podněty způsobující poškození tkání způsobují bolest dvojího druhu. „Prvá“ bolest se váže k určitému místu poškození a vyvolává okamžitou reakci (např. odtažení dlaně z rozpálených kamen). Impulz je veden do míchy rychlostí asi 10 m·s-1. Jako „druhá“ bolest se označuje stav, kdy dochází k uvědomění si nepříjemných pocitů s několikasekundovým zpožděním, neboť se vzruch odpovědnými nervovými vlákny šíří nižší rychlostí, asi 1 m·s-1. Jejím smyslem je upoutání pozornosti postiženého za účelem ošetření poškozené tkáně [8]. 2.5.1
Historie analgetik
Příznaky bolesti se lidé snažili potlačit odnepaměti. Proto není příliš překvapující, že léky proti bolesti patří mezi nejstarší používaná léčiva vůbec. Oblibu si získaly především různé přírodní látky nebo jejich směsi. Již staří Řekové používali ke zmírnění horečky a pocitů bolesti šťávu z vrbové kůry obsahující účinnou látku kyselinu salicylovou, jejíž deriváty se ve značném množství používají dodnes. Její název pochází z latinského označení pro vrbu – salix. Oblibě se těšilo též opium, což je bílá, na vzduchu tuhnoucí šťáva, která vytéká - 16 -
z naříznutých nezralých makovic tropických odrůd máku. Známý německo-švýcarský středověký lékař Paracelsus (1493–1541) objevil přípravek zvaný laudanum, který získával rozpuštěním opia v alkoholu. Problém s rozdílnou mírou účinnosti u různých vzorků opia napomohl vyřešit tehdy šestnáctiletý Němec Friedrich Sertürner (1783–1841), který jako první izoloval z opia bílý prášek, později nazvaný morfin (podle řeckého boha snů Morphea). Surové opium se dnes již v lékařství nepoužívá, čistý morfin se získává syntetickou cestou. Koncem devatenáctého století uvedla německá firma Bayer na trh látku heroin vyrobenou pozměněním struktury přírodního morfinu. Tato látka však vyvolává silnou psychickou i fyzickou závislost, doplněnou velmi nepříjemnými abstinenčními příznaky po přerušení přívodu opiátu, což její analgetické účinky poněkud přebíjí. Počátek moderní éry nenarkotických analgetik se datuje do první poloviny devatenáctého století, kdy byla izolována již zmíněná kyselina salicylová. Její nežádoucí účinky na žaludeční sliznici podnítily objev acetylsalicylové kyseliny, k pacientům příznivější. Pod názvem ASPIRIN se jí v USA denně spotřebuje asi padesát tun. Alternativou k aspirinu se stal paracetamol, který byl do praxe zaveden firmou Sterling-Winthorp v roce 1953. Nedlouho poté byla patentována látka ibuprofen (1961), objeven byl také naproxen (1976) a diklofenak [8]. Poměrně novou skupinou nesteroidních protizánětlivých látek jsou oxikamy, které byly na trh uvedeny koncem sedmdesátých let [1].
2.5.2
Rozdělení analgetik
Podle míry a mechanismu účinku se dělí na: • •
narkotická (opioidní) analgetika nenarkotická analgetika
Nenarkotická analgetika se dále dělí na: • analgetika-antipyretika • nesteroidní protizánětlivé látky (antiflogistika) • antirevmatika Jako narkotická analgetika neboli opiáty (někdy označované též jako anodyna) se označují léčiva, jejichž účinek lze srovnat s účinkem hlavního opiového alkaloidu – morfinu. Používají se ke zvládnutí silné bolesti. Ve vyšších dávkách mají narkotické účinky. Při dlouhodobém užívání může dojít ke vzniku závislosti, a proto smí být podávány jen krátkodobě (maximálně po dobu 2 týdnů). Z přírodních látek se nejčastěji používají morfin a kodein (CODEIN), ze syntetických např. tramadol (TRAMAL). Nenarkotická analgetika se používají k tlumení mírnější bolesti, kromě toho však působí i antipyreticky (proti horečce) nebo antiflogisticky (protizánětlivě). Mezi nejpoužívanější antipyretika patří deriváty p-aminofenolu, jejichž zástupcem je hojně užívaná látka paracetamol (PARALEN, PANADOL). V naléhavých případech se podávají pyrazolonové deriváty, které však mají celou škálu nežádoucích účinků. Jejich zástupcem je metamizol. - 17 -
Druhá zmíněná skupina farmak – antiflogistika – se dnes také označuje jako nesteroidní protizánětlivé látky, protože se pro jejich pojmenování uvádí zkratka NSAID (= NonSteroidal Anti-Inflamatory Drugs). V některých publikacích jsou mezi analgetika zařazována také antirevmatika, což jsou léčiva, která se obvykle podávají dlouhodobě, ve snaze zpomalit nebo zastavit revmatický proces [1, 5].
2.6 Nesteroidní protizánětlivé látky Do skupiny nesteroidních protizánětlivých látek patří různé chemické sloučeniny. Jejich společným znakem je to, že mají v molekule obsaženu karboxylovou skupinu COOH, jedná se proto o karboxylové kyseliny. Výjimku tvoří skupina novějších antiflogistik ze skupiny oxikamů (aniontických enolátů), které však při fyziologickém pH vytvářejí anionty a mají proto také kyselý charakter. Kyselina salicylová se vzhledem ke svým nepříznivým účinkům na žaludeční sliznici k léčbě bolesti již nepoužívá. Zato její deriváty, především pak kyselina acetylsalicylová (ASPIRIN, ACYLPYRIN), patří k volně dostupným analgetikům a antipyretikům první volby. Ve vyšších dávkách vykazuje též antiflogistický účinek. Dlouhodobé používání však přináší zvýšené riziko vedlejších nežádoucích účinků, zejména tvorbu žaludečních a dvanáctníkových vředů nebo zvýšenou krvácivost, a proto byla při léčbě revmatizmu nahrazena modernějšími nesteroidními antirevmatiky. Nedoporučuje se také dlouhodobé pravidelné podávání tohoto léku těhotným ženám. Snížení agregační schopnosti krevních destiček se využívá při prevenci infarktu myokardu a mozkové mrtvice (ANOPYRIN – směs kyseliny acetylsalicylové s uhličitanem vápenatým).
Obrázek 5: Kyselina acetylsalicylová Skupinu amfifilních, arylalkanových kyselin zastupují diklofenak (VOLTAREN, DOLMINA) a 2-arylpropanové kyseliny, mezi něž patří masově oblíbený, volně prodejný ibuprofen (IBALGIN, NUROFEN, BRUFEN, DOLGIT), naproxen (NAPROSYN, NAXEN), případně ketoprofen (KETOFEN, MEPROFEN). Spektrum analgetických, antiflogistických, antipyretických, ale také nežádoucích účinků se u těchto léčivých látek velmi podobá. Výběr vhodného farmaka závisí v daném případě na poměru mezi terapeutickým a nežádoucím účinkem látky.
- 18 -
Syntéza ibuprofenu z isobutylbenzenu probíhá v několika krocích:
Obrázek 6: Syntéza ibuprofenu [1] Oxikamy se strukturně řadí mezi aniontické enoláty. Terapeutické spektrum je sice výrazně menší než u výše jmenovaných kyselin, jejich výhodu však lze spatřit ve vyšší účinnosti a dlouhém biologickém poločasu rozpadu (přibližně 40 hodin). Nejznámnějšími zástupci jsou piroxikam (ARTHREMIN) nebo novější meloxikam (MOBIC) [1, 5]. 2.6.1
Mechanismus účinku
Mechanismus účinku nesteroidních protizánětlivých látek spočívá v inhibici cyklooxygenázy (COX-1 a COX-2). U kyseliny acetylsalicylové probíhá inhibice COX tak, že se její snadno uvolnitelná acetátová skupina kovalentně váže na makromolekulu COX, čímž dojde k její trvalé inaktivaci. Protizánětlivého účinku je dosaženo blokací COX-2. Inhibice COX-1 naproti tomu způsobuje podráždění žaludku a další komplikace. Snahou je proto objevit takové léčivo, které selektivně inhibuje pouze COX-2 [5]. 2.6.2
Farmakokinetika
Do krve se kyselina acetylsalicylová dostává prostřednictvím žaludeční a střevní sliznice, přitom dochází k rychlému odštěpení acetátové skupiny. Uvolněná kyselina salicylová se váže na bílkoviny, v játrech se konjuguje s glycinem a kyselinou glukuronovou nebo se oxiduje na kyselinu gentisovou. Při běžném dávkování činí eliminační poločas kyseliny salicylové asi 3 hodiny. Eliminace naproxenu probíhá (pomalou) demethylací v poloze 6 a uvolněním OH skupiny pro konjugaci. Stejným způsobem dochází k eliminaci ibuprofenu, liší se pouze rychlostí. V důsledku toho se ibuprofen používá pro terapii akutních bolestivých stavů. Krátký eliminační poločas má rovněž diklofenak (1 až 2 hodiny) [5].
- 19 -
2.6.3 •
Charakteristika vybraných nesteroidních protizánětlivých látek Ibuprofen
Obrázek 7: Strukturní vzorec ibuprofenu
•
•
Sumární vzorec: C13H18NO2
•
Systematický název: (RS)-2-(4-(2-methylpropyl)fenyl)propanová kyselina
• • •
Registrační číslo CAS: 15687-27-1 Relativní molekulová hmotnost: Mr = 206,28 bílý krystalický prášek, dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech
Naproxen
Obrázek 8: Strukturní vzorec naproxenu • • • •
Sumární vzorec: C14H14O3 Systematický název: (+)-(S)-2-(6-methoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina Registrační číslo CAS: 22204-53-1 Relativní molekulová hmotnost: Mr = 230,259
•
bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu
- 20 -
•
Diklofenak
Obrázek 9: Strukturní vzorec diklofenaku •
Sumární vzorec: C14H11Cl2NO2
• • •
Systematický název: 2-(2-(2,6-dichlorofenylamino)fenyl)octová kyselina Registrační číslo CAS: 15307-86-5 Relativní molekulová hmotnost: Mr = 296,148
•
bílý nebo lehce nažloutlý prášek, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu, slabě hygroskopický
2.7 Mechanismy odstranění Děje vedoucí k odstranění reziduí léčiv z povrchových vod odpovídají eliminacím ostatních organických látek a dají se v principu rozdělit na dva druhy, na degradace (biotické nebo abiotické) nebo sorpce [11]. 2.7.1
Fotodegradace
Abiotickou fotochemickou degradaci lze považovat za hlavní mechanismus vedoucí k odstranění farmak z povrchových vod. Lze ji rozlišit na dva základní typy. Příčinou přímé fotolýzy je absorpce slunečního záření molekulou léčiva, přičemž dochází k rozpadu na jednodušší látky. Účinnost závisí na absorpčním spektru dané molekuly, na intenzitě slunečního záření a na případném zákalu vody. Radikálový rozpad probíhá v důsledku působení hydroxylového radikálu ( • OH), alkylperoxidového radikálu ( • RO2) nebo atomárního kyslíku [11]. Komplexy makrolidů s trojmocným železem podléhají přímé fotolýze s poločasem rozpadu 40 dnů. Vlivem strukturních změn pravděpodobně mizí jejich toxicita, protože pseudoerythromycinové deriváty vykazují velmi nízkou antibakteriální aktivitu [12]. 2.7.2
Sorpce
Sorpce na aktivovaný kal nebo sediment je dána dvěma základními mechanismy. Při adsorpci se vlivem působení elektrostatických sil mezi nabitými skupinami léčiv a pevnou
- 21 -
matricí zvyšuje koncentrace látek na jejím povrchu. Při absorpci pronikají látky dovnitř matrice, kde jsou vlivem hydrofobní interakce vázány k lipofilním částem kalu. Sorpční schopnosti dané látky charakterizuje distribuční koeficient KD, který je definován jako poměr koncentrací v pevné a kapalné fázi [13, 14]. Tento mechanismus se uplatňuje v běžných evropských čistírnách odpadních vod [11]. 2.7.3
Biodegradace
Biodegradace se definuje jako biologicky katalyzované snížení komplexity chemických sloučenin. Organické látky jsou rozkládány až na jednoduché anorganické sloučeniny uhlíku, dusíku, fosforu a síry, které se uvolňují do prostředí [15]. V čistírnách odpadních vod se tento proces uplatňuje díky mikrobiální aktivitě aktivovaného kalu. Vzhledem k nízkým koncentracím reziduí léčiv v odpadních vodách však nedochází k úplné degradaci. Stupeň degradace závisí na stáří kalu v aktivaci, dostupnosti farmak, pH a dalších faktorech [11]. 2.7.4
Chemická oxidace
Principem je tvorba silných oxidačních činidel ( • OH, O3) během čištění a jejich následná reakce s přítomnými polutanty. Degradace farmak pomocí chemické oxidace se podobá fotodegradaci, neboť probíhá rovněž radikálově. Výhodné je použití této techniky u již vyčištěné vody, tj. na odtoku do recipientu, kde díky ozonizaci dochází navíc k dezinfekci [14]. 2.7.5
Membránové metody
Pomocí mikrofiltrace nebo ultrafiltrace lze zlepšit kvalitu vyčištěné vody tak, aby mohla být použita jakou užitková voda v zemědělství. Díky výhodným sorpčním vlastnostem prokazují sice vysokou účinnost především při odstraňování estrogenních hormonů, nejsou však schopny zachytit většinu ostatních skupin léčiv, pro jejichž účinnou separaci je nutné použít nanofiltraci nebo reverzní osmózu, tj. metody, které zatím nacházejí uplatnění spíše při úpravě pitné vody [14]. 2.7.6
Aktivní uhlí
Aktivní uhlí v podobě prášku nebo granulí se používá k zachycení organických polutantů zejména nepolárního charakteru. Výhoda této metody spočívá v tom, že při ní nevznikají žádné vedlejší produkty. K oxidační degradaci látek dochází při vystavení adsorbentu teplotě převyšující 650 °C [14]. 2.7.7
Fytoremediace, kořenové ČOV
Fytoremediace využívá zelených rostlin a s nimi asociovaných mikroorganismů pro odstranění nebo transformaci kontaminantů ze životního prostředí. U povrchových nebo splaškových vod se uplatňuje tzv. rhizofiltrace, kdy dochází k precipitaci nebo k absorpci
- 22 -
přímo v kořenech vodních nebo mokřadních rostlin (orobinec, různé druhy řas). Tato relativně levná metoda je velmi výhodná v případě znečištění velkých objemů vody malým množstvím kontaminantů. Používá se k odstranění těžkých kovů, hydrofobních organických látek nebo radionuklidů [16].
2.8 Stanovení léčiv v čistírenských kalech Vzorky pro stanovení léčiv se odebírají zpravidla do polyethylenových lahví, ve kterých se uchovávají při teplotě do 5 °C. Následně se provádí extrakce sledovaných analytů z matrice; výsledný extrakt se přečistí a zakoncentruje. Jak makrolidová antibiotika, tak také nesteroidní protizánětlivé látky patří mezi semivolatilní látky. K jejich stanovení se proto obvykle používá kapalinová chromatografie se spektrometrickou detekcí [20, 21, 23, 24, 26]. Množství zkoumaného analytu se nejčastěji detekuje pomocí hmotnostního spektrometru (HPLC-MS, HPLC-MS-MS), vzhledem k jeho univerzálnosti a nízkým detekčním limitům. Také je možné použít spektrofotometrické nebo fluorescenční detektory. V této práci bylo použito stanovení ultra-vysoce účinným kapalinovým chromatografem s UV-VIS spektrofotometrickou detekcí pomocí diodového pole (UPLC-DAD). 2.8.1
Extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku
Extrakce je důležitou součástí při stanovení léčiv v čistírenských kalech. Pro extrakci z pevné matrice byla dříve vesměs používána extrakce Soxhletova. Tato metoda se sice vyznačuje poměrně vysokou účinností, jejími hlavními nevýhodami jsou však relativně vysoká spotřeba převážně toxických organických rozpouštědel a především dlouhá doba extrakce (několik hodin). Proto byly vyvinuty modernější metody, jakými jsou mikrovlnná extrakce (MAE), extrakce pomocí ultrazvuku (USE), superkritická fluidní extrakce (SFE) a především extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (PSE, PLE, ASE, PFE) [18]. Soxhletova extrakce však nadále zůstává metodou referenční [19]. První zmínky o PSE pochází z roku 1996. Richter a spol. aplikovali tuto novou metodu pro stanovení PAU a PCB z pevných vzorků [17]. Alikvotní množství vzorku smíchané s tzv. hydromatrix se vloží do extrakční patrony a ta se přemístí do pícky. Hydromatrix brání agregaci částeček vzorku v cele a redukuje volný objem mezi nimi. Po předehřátí se cela naplní rozpouštědlem, následně dojde k nárůstu teploty a tlaku a jejich udržení na konstantní hodnotě podle požadavků zadaných operátorem. Hodnoty teploty a tlaku mohou dosahovat až 200 °C, resp. 200 bar. Po uplynutí nastaveného času je extrakt přemístěn do sběrné vialky, kde je shromažďován společně s čistým rozpouštědlem použitým k vypláchnutí extrakční patrony. Tento cyklus je možné několikrát opakovat. Obvyklá délka celé extrakce se pohybuje v rozmezí 15-45 minut. Při PSE dochází ke zvýšení tlaku v extrakční cele, díky čemuž je možné dosáhnout vyšší teploty, než je teplota varu rozpouštědla při atmosférickém tlaku. Použití PSE je ekonomičtější i ekologičtější než použití Soxhletovy metody. V porovnání s požadavky extrakce prostřednictvím MAE není PSE omezena použitím solventů, které - 23 -
absorbují mikrovlnné záření. Na charakteru vzorku však závisí i selektivita extrakce, protože společně s cílovými analyty mohou být vyextrahovány různé interferující látky. Při použití většího množství extrakčních cyklů může dojít ke zředění extraktu [18, 19]. Proto je zpravidla nutné extrakt zakoncentrovat, např. odpařením přebytečného rozpouštědla na vakuové odparce a přečistit (clean-up), k čemuž se nejčastěji používá extrakce tuhou fází (SPE) [20, 21, 22, 23, 24, 25, 26], gelová permeační chromatografie (GPC) nebo kolonová chromatografie.
Obrázek 10: Schéma tlakového kapalinového extraktoru [17] 2.8.2
Extrakce pomocí ultrazvuku
Alternativní extrakční metodou je extrakce pomocí ultrazvuku (USE). Ta je založena na působení ultrazvukových vln na matrici suspendovanou v solventu. Použití USE usnadňuje přechod analytů z pevných environmentálních vzorků do rozpouštědla. Mechanickým vymýváním dochází ke kombinaci abrazivního efektu na povrchu částeček matrice a zároveň k efektivnějšímu prostupu solventu dovnitř částeček, což napomáhá k separaci cílených látek [27]. 2.8.3
Extrakce tuhou fází
Extrakce tuhou fází (SPE) slouží k přečištění a zakoncentrování extraktu získaného během PSE na základě jeho fyzikálních a chemických vlastností. Kolonka připomínající plastovou injekční stříkačku bez pístu je naplněna pevnými částečkami (např. práškový silikagel), na které se chemicky navážou hydrofobní organické funkční skupiny. Nejběžnější je použití uhlíkového řetězce s 18 uhlíky (oktadecylsilikagel). Dostupné jsou však i iontoměničové náplně nebo adsorbenty (florisil, alumina).
- 24 -
Před použitím je nutno SPE kolonku kondicionovat malým množstvím (5 ml) rozpouštědla. K tomu se používá např. methanol [20, 24, 25] nebo acetonitril [26], doplněný malým množstvím (5ml) miliQ vody. Potom se extrakt z PSE aplikuje na kolonku. K zajištění konstantního průtoku slouží přetlak vzniklý působením pístu nebo podtlak produkovaný vývěvou. Potenciálně interferující látky je možné z kolonky odstranit promytím miliQ vodou, zatímco hydrofobní organické látky zůstanou navázané na náplni kolonky. Pokud se promývací činidlo a eluent vzájemně nemísí, je nutné kolonku před elucí vysušit proudem plynu. Nakonec se analyty eluují z kolonky vhodným rozpouštědlem a eluát se podle potřeby zakoncentruje [19, 28]. Nakonec se eluát vysuší proudem dusíku a rekonstituuje přidáním rozpouštědla na objem přibližně 1 ml [20].
Obrázek 11: Princip extrakce tuhou fází [29] 2.8.4
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Tradičně se makrolidy analyzovaly pomocí mikrobiologických metod, které se však obvykle vyznačují nízkou specifitou nebo citlivostí. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se proto stala preferovanou technikou pro stanovení nízkých koncentrací této skupiny antibiotik [30]. Univerzálnost této metody umožňuje její využití pro relativně jednoduché a rychlé stanovení širokého spektra léčiv [25, 31].
- 25 -
2.8.4.1 Princip vysokoúčinné kapalinové chromatografie Chromatografie je separační technika, která je založena na distribuci analyzovaných látek mezi mobilní a stacionární fázi na základě jejich fyzikálně-chemických vlastností. Ačkoli se retenční mechanismy u různých typů chromatografie liší, všechny jsou založeny na vytvoření formální rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. V případě vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se vzorek nadávkuje do kolony naplněné částečkami stacionární fáze a solventem. Mobilní fáze prochází kolonou, přičemž dochází k interakcím přítomných analytů s oběma fázemi. Pokud je distribuce analytů mezi obě fáze dostatečně rozdílná, dochází k jejich separaci. Na separaci mají vliv i případné interakce mezi mobilní a stacionární fází. Existují čtyři základní typy separačních mechanismů: • adsorpce • rozdělování • výměna iontů • sítový efekt Účinnost separace může být vyjádřena pomocí počtu tzv. teoretických pater. Teoretické patro reprezentuje pomyslnou část kolony, ve které dochází k ustavení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Výškový ekvivalent teoretického patra je roven délce kolony podělené počtem teoretických pater. Vysokou účinnost separace podmiňuje velký počet výškových ekvivalentů teoretického patra [28]. Chromatografické kolony jsou zpravidla vyrobeny z nerezové oceli. Běžně dostupné kolony pro HPLC mají délku v rozmezí od 50 mm do 300 mm, jejich vnitřní průměr činí obvykle 2 mm až 5 mm. Nejčastější rozměry částeček náplně jsou 3,5 µm, 5 µm nebo 10 µm [33]. Důležitá je rovněž volba použité mobilní fáze. Pro makrolidy se používá například gradient binární směsi octan amonný a acetonitrilu [21, 26] nebo miliQ voda s přídavkem kyseliny octové (pH 2,9) a acetonitrilu [22].
- 26 -
Obrázek 12: Schéma HPLC: 1-zásobníky mobilní fáze, 2-odplyňovač, 3-ventil pro řízení gradientu mobilní fáze, 4-směšovací nádoba, 5-vysokotlaká pumpa, 6-dělicí ventil, 7dávkovací smyčka, 8-předkolona (ochranná kolona), 9-kolona, 10-detektor, 11-PC pro vyhodnocení dat, 12-odpadní nádoba [32] 2.8.4.1 Detektory používané při vysokoúčinné kapalinové chromatografii Při HPLC je nutné sledovat složení eluátu kontinuálně. V detektorech dochází k převodu určité vlastnosti eluátu (absorbance, vodivosti apod.) na elektrický signál, který se následně pomocí počítače vyhodnotí. • UV-VIS spektrofotometrický detektor – založený na měření absorpce záření v oblasti ultrafialového a viditelného světla. Jako zdroje záření slouží deuteriová
• • •
•
(UV) a wolframová (VIS) lampa. Kombinace s detekcí pomocí diodového pole (UV-VIS-DAD) umožňuje měření spojitých spekter. Fluorescenční detektor – selektivnější a citlivější než UV-VIS detektor (detekční limity až 10 −12 gramů v 1 litru). Měří se intenzita fluorescence. FTIR detektor – selektivní, zpracovává infračervená spektra látek v eluátu. Refraktometrický detektor – univerzální detektor založený na měření indexu lomu. Nevýhodou je nižší citlivost, závislost na teplotě a nemožnost využití gradientové eluce. Elektrochemický detektor (ECD) – založený na měření elektrických veličin (elektrodový potenciál, proud). Citlivostí je srovnatelný s fluorescenčním detektorem používá se pro detekci elektroaktivních látek.
• Vodivostní detektor – založený na měření vodivosti eluátu [28]. V současnosti se pro determinaci environmentálních polutantů hojně využívá též detekce pomocí
jednoduché
nebo
tandemově
zapojené
hmotnostní
spektrometrie
[20, 21, 23, 24, 25, 26, 31].
- 27 -
Obrázek 13: UV-VIS-DAD detektor kapalinového chromatografu Agilent 1290 Infinity [34] 2.8.4.2 Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie Cílem kapalinové chromatografie je separovat pokud možno co nejvíce analytů v co nejkratším čase. Proto v současnosti dochází k rozvoji moderní výkonné separační metody, ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UPLC, UHPLC). Základním rozdílem proti klasické HPLC je použití menších částeček stacionární fáze (< 2 µm, ideálně okolo 1,7 µm), což znesnadňuje průtok mobilní fáze kolonou. Z tohoto důvodu je nutné zvýšení pracovního tlaku v koloně (maximálně na 1200 bar). Tyto podmínky umožňují zkrácení kolony (oproti HPLC kolonám) při současném zachování nebo dokonce zvýšení účinnosti kolony [35]. Hlavními přednostmi UPLC jsou: • kratší doba analýzy • snížení spotřeby mobilní fáze • • •
zvýšení účinnosti kolony snížení meze detekce zvýšení meze citlivosti Převod metody z HPLC na UPLC je poměrně jednoduchý, je pouze třeba přizpůsobit objemový průtok mobilní fáze, nástřik a dobu analýzy (gradient) [36].
- 28 -
3
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1 Použité přístroje a zařízení • •
Analytické váhy HR-120-EC, A&D Instruments, Japonsko pH metr inoLab® 730, WTW Series, WTW, Německo
• • • •
Zařízení pro přípravu miliQ vody Mili-Q® Academic, Millipore, Francie Ultrazvuková vodní lázeň Teson 4, Tesla, Česká republika PSE extraktor onePSE, Applied Separations, USA Rotační vakuová odparka Büchi Rotavapor® R-205 s vyhřívanou lázní B-409
• • •
a elektronickým regulátorem vakua V-800, Büchi Labortechnik, Švýcarsko SPE extraktor SPE kolonky Oasis® HLB (60 mg) Extraction Cartridge, Waters, USA SPE kolonky Oasis® HLB (200 mg) Extraction Cartridge, Waters, USA
•
Stříkačkové filtry LUT Syringe Filters PTFE; 13 mm, 0,45 µm, pk/100, Labicom,
• •
Česká republika Stříkačkové filtry Cronus Syringe Filters PTFE; 4 mm, 0,2 µm, pk/100, SMI-LabHut, Velká Británie Kapalinový chromatograf Agilent 1290 Infinity, Agilent, USA • • • •
binární pumpa automatický dávkovač termostat kolon In-Line Filtr 0,3 µm
•
kolona ZORBAX Eclipse Plus C18, Rapid Resolution HD 2,1x50 mm; velikost částic 1,8 µm, Agilent, USA DAD-detektor: zdroj UV-VIS záření – deuteriová lampa, rozsah vlnových délek
•
190-640 nm, diodové pole (1024 prvků) • Běžné laboratorní vybavení
3.2 Software použitý ke zpracování a prezentaci dat • • • •
ChemStation for LC & LC/MS Systems, version 32.1, Agilent, USA ChemSketch, version 10.0, ACD/Labs, Kanada Microsoft Office Word 2003, Microsoft, USA Microsoft Office Excel 2003, Microsoft, USA
•
Kreslení, Microsoft, USA
- 29 -
3.3 Použité chemikálie a standardy 3.3.1 •
Chemikálie
• •
Acetonitril, CHROMASOLV® čistota gradient grade for HPLC, ≥ 99,9 %, SigmaAldrich, Německo Amoniumacetát, čistota p. a., for HPLC, > 99,0 %, Fluka, Německo Dusík stlačený, čistota 4.7, SIAD, Česká republika
• • • •
Kyselina chlorovodíková 35 %, čistota p. a., Penta, Česká republika Kyselina mravenčí ≥ 98 %, čistota p. a., Sigma-Aldrich, Německo Methanol absolutní, LC-MS, čistota min. 99,95 %, Biosolve, Nizozemsko Deionizovaná voda upravená přístrojem Mili-Q® Academic o specifické vodivosti 0,055 µS·cm-1 při teplotě 24 °C
3.3.2
Standardy
•
Clarithromycin, čistota ≥ 95 % (HPLC), Sigma-Aldrich, Německo
• •
Diklofenak, sodná sůl, Sigma-Aldrich, Německo Erythromycin, Biotechnology Performance Certified, Sigma-Aldrich, Německo
• •
Ibuprofen, sodná sůl, Sigma-Aldrich, Německo Naproxen, Pharmaceutical Secondary Standard, Fluka, Německo
3.4 Analyzovaná matrice Pro analýzu byl zvolen vyhnilý stabilizovaný kal z ČOV Brno-Modřice. Po odvodnění, které se provádí pomocí odstředivek, je kal transportován šnekovým dopravníkem do sušárny. Teplota v sušárně (100 °C po dobu více než 3 hodin) zajišťuje jeho pasterizaci a hygienizaci.
3.5 Sledované analyty Pro posouzení problematiky kontaminace čistírenských kalů rezidui léčiv byla vybrána léčiva ze skupiny makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých látek. První skupinu zastupují látky erythromycin a clarithromycin, druhou skupinu reprezentují hojně používaná léčiva ibuprofen, naproxen a diklofenak.
3.6 Postup stanovení 3.6.1
Odběr vzorků
Vzorek kalu byl odebrán ve čtvrtek 14. března 2013 v 11.30 v ČOV Brno-Modřice. Vzorek byl umístěn do polyethylenové vzorkovnice o objemu 1 litr a uzavřen víkem rovněž z polyethylenu. Po odběru byl vzorek uchován v chladicím boxu při teplotě 5 °C.
- 30 -
3.6.2
Příprava vzorků a izolace analytu
Vysušený kal bylo nutné před samotnou extrakcí nejprve rozmělnit. K tomuto účelu byl použit hmoždíř a třecí miska se zdrsněným povrchem. Jako metoda izolace analytů ze vzorku byla zvolena tlaková extrakce kapalinou (PSE) následovaná extrakcí tuhou fází (SPE). Do spodní části extrakční patrony byl nejprve nasypán nerozetřený hydromatrix. Vrstva o výšce přibližně 1 cm eliminovala riziko ucpávání patrony při extrakci. Dále bylo smícháno 10 g kalu s 10 g rozetřeného hydromatrixu a tato směs byla kvantitativně převedena do extrakční patrony. Jako extrakční činidlo byl zvolen methanol. Podmínky pro PSE jsou uvedeny v Tabulka 3. Vyzkoušena byla rovněž metoda extrakce pomocí ultrazvuku (USE). V tomto případě bylo 5 g kalu suspendováno ve 25 ml methanolu a extrahováno po dobu 30 minut v ultrazvukové lázni. Vzniklá suspenze byla zfiltrována. Dále bylo s přefiltrovaným extraktem zacházeno jako při použití PSE, pouze s vynecháním kroku zakoncentrování a přečištění pomocí SPE. Tabulka 3: Podmínky pro PSE Množství vzorku
10 g
Extrakční činidlo
methanol
Teplota Tlak Počet cyklů
3.6.3
40 °C 140 bar 3
Pre-heat
5 min
Statická fáze
5 min
Proplach rozpouštědlem
1 min
Sušení dusíkem
4 min
Přečištění a zakoncentrování extraktu, SPE
Extrakt získaný metodou PSE byl zfiltrován přes hladký filtr a odpařen na rotační vakuové odparce. Vzniklý odparek byl rozpuštěn ve 2 ml methanolu a 50 ml okyselené miliQ vody (pH bylo upraveno pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 2). Rozpouštění bylo podpořeno ponořením baňky do ultrazvukové lázně. K zakoncentrování extraktu získaného metodou PSE byla použita metoda extrakce tuhou fází (SPE). Kolonky s nižším obsahem sorbentu vykazovaly tendenci k ucpávání. Na základě toho byly použity větší SPE kolonky Oasis® HLB (200 mg). Kolonky byly nejprve aktivovány 15 ml methanolu a 10 ml 0,01 M HCl. Potom byl na kolonku kvantitativně převeden připravený extrakt (pH = 2). Následovalo promytí 10 ml miliQ vody a vysušení proudem vzduchu. Analyty byly eluovány 15 ml methanolu. Eluáty byly odpařeny právě dosucha na rotační vakuové odparce, rekonstituovány 2 ml methanolu a vysušeny pod
- 31 -
dusíkem. Zbytek po sušení byl rozpuštěn v 1 ml methanolu. Nerozpuštěné látky byly odstraněny filtrací přes stříkačkové filtry (0,45 µm a 0,2 µm). Takto upravený vzorek byl analyzován pomocí UHPLC. Tabulka 4: Podmínky pro SPE Kolonka
Oasis® HLB (200 mg)
Aktivace
15 ml methanolu
Promytí
10 ml 0,01 M HCl Nanesení vzorku
3.6.4
Promytí
10 ml miliQ vody
Eluce
15 ml methanolu
Identifikace a kvantifikace analytů
Přečištěný extrakt byl analyzován metodou ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie na přístroji Agilent 1290 Infinity. K separaci byla použita kolona ZORBAX Eclipse Plus C18. Analyty byly detkovny pomocí detektoru diodového pole. Pro kvalitativní analýzu byly sledovány retenční časy jednotlivých analytů, jejich množství pak bylo určeno integrací ploch příslušných píků při charakteristických vlnových délkách. Kvantifikace byla provedena metodou kalibrační křivky. Analýza probíhala za následujících podmínek: • • • • •
Mobilní fáze Nástřik vzorku Průtok mobilní fáze Teplota Doba analýzy
methanol / 10 mM amoniumacetát (pH = 2,96) 0,5 µl 0,3 ml·min-1 40 °C 8,5 min
Tabulka 5: Gradient mobilní fáze t (min)
MeOH (%)
CH3COONH4 (%)
0
50
50
5,0
50
50
6,0
70
30
8,3
80
20
- 32 -
Tabulka 6: Parametry sledovaných analytů Analyt
Vlnová délka (nm)
Retenční čas (min)
Ibuprofen
214
6,839
Naproxen
230
3,027
Diklofenak
275
6,609
Erythromycin
215
---
Clarithromycin
288
---
- 33 -
VÝSLEDKY A DISKUZE 3.7 Optimalizace chromatografických podmínek Pro stanovení jednotlivých druhů léčiv bylo nejprve zapotřebí optimalizovat podmínky chromatografické separace a analýzy pomocí UV-VIS-DAD detektoru. Bylo zjištěno, že vzhledem k vlastnostem zástupců makrolidových antibiotik a nesteroidních protizánětlivých látek je vhodnější metodu optimalizovat pro každou skupinu zvlášť. 3.7.1
Stanovení makrolidů
Pro stanovení makrolidových antibiotik byly připraveny roztoky standardů erythromycinu a clarithromycinu o koncentraci 1 mg·ml-1 v methanolu a také v acetonitrilu. Jako mobilní fáze byla nejprve použita binární směs acetonitrilu s 10 mM amoniumacetátem, potom rovněž s 1% kyselinou mravenčí. Kromě toho byla také vyzkoušena směs methanolu a kyseliny mravenčí, a to v různé koncentraci. Makrolidy však při zvolených vlnových délkách (erythromycin 215 nm, clarithromycin 275 nm a 288 nm) nevykazovaly takřka žádnou odezvu na detektoru, base-line byla velmi kostrbatá a šum převyšoval samotný signál. V souladu s již publikovanou studií se prokázalo, že použití UHPLC ke stanovení makrolidů je nevhodné, neboť tyto látky postrádají vhodný chromofor, který by umožnil jejich detekci pomocí UVVIS-DAD detektoru [30]. Tyto látky však je možné analyzovat jinými metodami, např. s využitím hmotnostní spektrometrie. Tabulka 7: Vyzkoušené mobilní fáze pro stanovení makrolidů 1. složka
2. složka
acetonitril
10 mM amoniumacetát
acetonitril
1% kyselina mravenčí
methanol
0,1% kyselina mravenčí
methanol
0,01 M kyselina mravenčí
methanol
0,1 M kyselina mravenčí
- 34 -
DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_03_27_RH\STANDARD000004.D) mAU 5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
min
Obrázek 14: Příklad chromatogramu clarithromycinu (mobilní fáze acetonitril + 10 mM amoniumacetát, vlnová délka 275 nm) 3.7.2
Nesteroidní protizánětlivé látky
Standardy nesteroidních protizánětlivých látek (NSAID) byly rozpuštěny v methanolu. Byly vyzkoušeny dvě hodnoty nástřiku: 0,7 µl a 0,5 µl. Při menším nástřiku došlo k zeslabení tendence k chvostování píků, proto byl pro analýzu vhodnější. Jako mobilní fáze se osvědčila směs methanolu a amoniumacetátu. Pro potřeby UHPLC byla upravena metoda stanovení NSAID, která byla vypracována v rámci dizertační práci Ing. Vydrové na ÚCHTOŽP FCH VUT v BRNĚ [37]. Byly ověřovány dva gradienty mobilní fáze. Tabulka 8: Gradient mobilní fáze – varianta č. 1 t (min) methanol (%) amoniumacetát (%) 0
35
65
2,3
50
50
5,0
50
50
6,6
70
30
8,3
80
20
- 35 -
Tabulka 9: Gradient mobilní fáze – varianta č. 2 t (min) methanol (%) amoniumacetát (%) 0
50
50
5,0
50
50
6,0
70
30
8,3
80
20
Optimálního tvaru píků byl dosaženo při použití první varianty gradientu, kterou popisuje Tabulka 9. DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1AF-0601.D) mAU
Diklofenak 700
600
500
400
300
200
100
0 1
2
3
4
5
6
7
8
min
Obrázek 15: Chromatogram diklofenaku při použití mobilní fáze methanol + 10 mM amoniumacetát, vlnová délka 275 nm
3.8 Porovnání použitých extrakčních metod Pro izolaci sledovaných analytů z matrice byla použita nejprve metoda extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (PSE) následovaná přečištěním a zakoncentrováním pomocí extrakce tuhou fází (SPE). Výtěžnost této metody však byla velmi nízká. U ibuprofenu a naproxenu ve většině případů nepřesáhla 35 %, u diklofenaku došlo (s jednou výjimkou) ke ztrátám větším než 80 %. Ztráty lze přičíst jak významnému matričnímu efektu, tak také nedostatečně optimalizované metodě. Z důvodů technické závady na přístroji PSE, resp. z důvodů časových v případě SPE, nemohla být metoda zcela její optimalizována. V případě použití PSE se navíc vyskytly potíže s ucpáváním frity v extrakční patroně jemnými částečkami kalu. Řešení problému spočívalo v nasypání vrstvy nerozetřené hydromatrix do spodní části extrakční patrony, čímž se ucpávání frity zamezilo.
- 36 -
Druhou použitou metodu představovala extrakce ultrazvukem (USE). Výtěžnost této metody byla v porovnání s kombinací PSE+SPE lepší. Za nevýhodu lze považovat menší čistotu extraktu. Tento problém by bylo možné vyřešit použitím optimalizované metody SPE. Ibuprofen - PSE
Ibuprofen - USE
Výtěžnost
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0,01
0,05
0,10
0,25
0,50
1,00
2,00
4,00
2,00
4,00
c (mg/ml)
Obrázek 16: Ibuprofen - porovnání výtěžností PSE a USE Naproxen - PSE
Naproxen - USE
100%
Výtěžnost
80% 60% 40% 20% 0% 0,01
0,05
0,10
0,25
0,50
1,00
c (mg/ml)
Obrázek 17: Naproxen - porovnání výtěžností PSE a USE
- 37 -
Diklofenak - PSE
Diklofenak - USE
60%
Výtěžnost
50% 40% 30% 20% 10% 0% 0,01
0,05
0,10
0,25
0,50
1,00
2,00
4,00
c (mg/ml)
Obrázek 18: Diklofenak - porovnání výtěžností PSE a USE
3.9 Analýza reálného vzorku Pro určení koncentrace léčiv ve vzorku byly sestrojeny kalibrační křivky. Pomocí ovládacího softwarového programu bylo stanoveno množství analytů ve vzorku. Ze šumu základní linie byly vypočteny hodnoty meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ). Nejprve byla odečtena výška píku sledovaného analytu z nejnižšího bodu kalibrace, která odpovídá výšce signálu S. Dále bylo náhodně vybráno 15 píků reprezentujících šum, jejichž průměrná výška odpovídá výšce signálu šumu N. Mez detekce představuje koncentraci analytu, jejíž odezva na detektoru bude mít poměr signálu k šumu větší než 3 a mez stanovitelnosti představuje koncentraci analytu, jejíž odezva na detektoru bude mít poměr signálu k šumu větší než 10. c mg ⋅ ml −1 (1) LOD mg ⋅ ml −1 = 3 ⋅ S N
(
)
(
)
(
c mg ⋅ ml −1 = 10 ⋅ S N
LOQ mg ⋅ ml −1
)
(
)
(2)
Tabulka 10: Meze detekce a meze stanovitelnosti mez detekce -1
mez stanovitelnosti
LOD (mg·ml )
LOQ (mg·ml-1)
Ibuprofen
0,0048
0,0161
Naproxen
0,0003
0,0011
Diklofenak
0,0012
0,0041
- 38 -
Naproxen
Diklofenak
Ibuprofen
25000
Plocha píku
20000
y = 22305x + 30,912 R2 = 0,9968
15000 y = 2790,5x + 60,404 R2 = 0,9978
10000
y = 2431x - 2,9141 R2 = 0,9996
5000
0 0
1
2
3
4
5
c (mg/ml)
Obrázek 19: Kalibrační křivka pro nesteroidní protizánětlivé látky
- 39 -
4
ZÁVĚR
Tato práce byla zaměřena na stanovení léčiv v kalech z čistíren odpadních vod. Na základě zpracované rešerše byly zvoleny dvě skupiny nejvíce používaných léčiv. Makrolidová antibiotika byla zastoupena erythromycinem a clarithromycinem, z nesteroidních protizánětlivých látek (NSAID) byly vybrány ibuprofen, naproxen a diklofenak. Izolace analytů z matrice byla provedena pomocí extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku (PSE) a paralelně také metodou extrakce ultrazvukem (USE). Účinnost extrakčních metod byla posuzována metodou standardního přídavku. K přečištění a zakoncentrování extraktu získaného pomocí metody PSE byla použita metoda extrakce tuhou fází (SPE). K finálnímu stanovení léčiv byla použita metoda ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC) s detekcí pomocí diodového pole (UV-VIS-DAD). Byla provedena optimalizace podmínek pro chromatografickou separaci NSAID. Kromě toho byly vypočteny meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ) těchto látek. Pro makrolidy nebyla metoda UHPLC s UV-VIS-DAD detektorem vhodná, protože tyto látky postrádají chromoforovou skupinu, která by umožnila jejich detekci. Jejich stanovení je však možné pomocí jiných typů detektorů, z nichž jako optimální lze doporučit hmotnostní spektrometr. Kal z ČOV vykazuje jako matrice značný matriční efekt. Nízká výtěžnost prokázána při extrakci pomocí PSE byla pravděpodobně způsobena následným zařazením čisticího kroku kroku SPE. Dodatečně provedenou optimalizací by bylo možné ztráty zmenšit; bohužel však došlo k poruše přístroje. Proto nebylo jednoznačně možné posoudit jejich případnou kontaminaci léčivy. Nesporné výhody lze zjištěné při řešení této bakalářské práce lze spatřovat v nahrazení dříve používané vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) jejím modernějším nástupcem v podobě UHPLC. Za zmínku stojí především zkrácení doby analýzy, zvýšení účinnosti separace a snížení množství použitých rozpouštědel pro mobilní fáze.
- 40 -
5
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ
[1] HAMPL, F., RÁDL S., PALEČEK J. Farmakochemie. 2. rozš. vyd. Praha: VŠCHT, 2007, 450 s. ISBN 978-80-7080-639-5. [2] Česká republika. Zákon o léčivech: o léčivech a o změnách některých souvisejících zákonů. In: Sbírka zákonů České republiky. 2007, č. 378. [3] SANTOS, L., ARAÚJO, A. N., FACHINI, A., PENA, A., DELERUE-MATOS, C., MONTENEGRO, M. C. B. S. M. Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of Hazardous Materials. roč. 175, 1-3, s. 45-95. ISSN 03043894. [4] PURDOM, C. E., HARDIMAN, P. A., BYE, V. V. J., ENO, N. C., TYLER C. R., SUMPTER, J. P. Estrogenic Effects of Effluents from Sewage Treatment Works. Chemistry and Ecology. roč. 8, č. 4, s. 275-285. ISSN 0275-7540. [5] LÜLLMANN, H., MOHR K., WEHLING, M. Farmakologie a toxikologie: překlad 15., zcela přepracovaného vydání. Vyd. 2. české. Praha: Grada, 2004, 725 s. ISBN 80-247-08361. [6] TERNES, T. A., HIRSCH, R. Occurrence and Behavior of X-ray Contrast Media in Sewage Facilities and the Aquatic Environment. Environmental Science. roč. 34, č. 13, s. 2741-2748. ISSN 0013-936x. [7] HARPER, D. Bacteria (n.). The Online Etymology Dictionary [online]. © 2001-2012 [cit. 2013-02-20]. Dostupné z: http://www.etymonline.com/index.php?term=bacteria [8] STONE, T., DARLINGTONOVÁ G. Léky, drogy, jedy. Vyd. 1. Překlad Vratislav Schreiber. Praha: Academia, 2003, 440 s. ISBN 80-200-1065-3. [9] VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie obecná. 2., přepr. vyd. Brno: Neptun, 2005, 351 s. ISBN 80-868-5000-5. [10] The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biological. 13th Ed. S.l.: Merck and Co., INC., 2001, Přer.str. ISBN 0-911910-13-1.
- 41 -
[11] KOTYZA, J., SOUDEK, P., KAFKA, Z., VANĚK, T. Léčiva - „nový“ environmentální polutant. Chemické listy. Praha: Česká společnost chemická, 2009, roč. 103, č. 7, s. 540-547. ISSN 0009-2770. [12]
VIONE,
D.,
FEITOSA-FELIZZOLA,
J.,
MINERO,
C.,
CHIRON,
S.
Phototransformation of selected human-used macrolides in surface water: Kinetics, model predictions and degradation pathways. Water Research. roč. 43, č. 7, s. 1959-1967. ISSN 00431354. [13] SCHWARZENBACH, R., GSCHWEND, P., IMBODEN, D. Environmental Organic Chemistry. 2nd ed. Hoboken: John Wiley, 2005. ISBN 04-717-4399-2. [14] SUÁREZ, S., CARBALLA, M., OMIL, F., LEMA, J. M. How are pharmaceutical and personal care products (PPCPs) removed from urban wastewaters?. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. roč. 7, č. 2, s. 125-138. ISSN 1569-1705. [15] HORÁKOVÁ, D. Bioremediace [online]. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2007 [cit. 2013-04-24]. Elportál. ISSN 1802-128X. [16] SOUDEK, P., PETROVÁ, Š., BENEŠOVÁ, D., KOTYZA, J., VANĚK, T. Fytoremediace a možnosti zvýšení jejich účinnosti. Chemické listy. Praha: Česká společnost chemická, 2008, roč. 102, č. 5, s. 346-352. ISSN 0009-2770. [17] RICHTER, B. E., JONES, B. A., EZZELL, J. L., PORTER, N. L., AVDALOVIC, N., POHL, Ch. Accelerated Solvent Extraction: A Technique for Sample Preparation. Analytical Chemistry. 1996, roč. 68, č. 6, s. 1033-1039. ISSN 0003-2700. [18] NIETO, A., BORRULL, F., POCURULL, E., MARCÉ, R. M. Pressurized liquid extraction: A useful technique to extract pharmaceuticals and personal-care products from sewage sludge. Trends in Analytical Chemistry. 2010, roč. 29, č. 7, s. 752-764. ISSN 01659936. [19] REEVE, R. N. Introduction to Environmental Analysis. Chichester: John Wiley and Sons Ltd., 2002, 301 s. ISBN 04-714-9295-7. [20] JELIĆ, A., PETROVIĆ, M., BARCELÒ, D. Multi-residue method for trace level determination of pharmaceuticals in solid samples using pressurized liquid extraction
- 42 -
followed by liquid chromatography/quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. Talanta. 2009-11-15, roč. 80, č. 1, s. 363-371. ISSN 00399140. [21] GÖBEL, A., THOMSEN, A., MCARDELL, C. S., ALDER, A. C., GIGER, W., THEIß, N., LÖFFLER, D., TERNES, T. A. Extraction and determination of sulfonamides, macrolides, and trimethoprim in sewage sludge. Journal of Chromatography A. 2005, roč. 1085, č. 2, s. 179-189. ISSN 00219673. [22] NIETO, A., BORRULL, F., MARCÉ, R. M., POCURULL, E. Selective extraction of sulfonamides, macrolides and other pharmaceuticals from sewage sludge by pressurized liquid extraction. Journal of Chromatography A. 2007, roč. 1174, 1-2, s. 125-131. ISSN 00219673. [23] RADJENOVIĆ, J., JELIĆ, A., PETROVIĆ, M., BARCELÓ, D. Determination of pharmaceuticals in sewage sludge by pressurized liquid extraction (PLE) coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2009, roč. 393, 6-7, s. 1685-1695. ISSN 1618-2642. [24] GROS, M., RODRÍGUEZ-MOZAZ, S., BARCELÒ, D. Fast and comprehensive multiresidue analysis of a broad range of human and veterinary pharmaceuticals and some of their metabolites in surface and treated waters by ultra-high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole-linear ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2012, roč. 1248, s. 104-121. ISSN 00219673. [25] GÓMEZ, M. J., PETROVIĆ, M., FERNÁNDEZ-ALBA, A. R., BARCELÓ, D. Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatographyâ tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters. Journal of Chromatography A. 2006, roč. 1114, č. 2, s. 224-233. ISSN 00219673. [26] ABUIN, S, CODONY, R., COMPAÑÓ, R., GRANADOS, M., DOLORS PRAT, M. Analysis of macrolide antibiotics in river water by solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2006, roč. 1114, s. 73-81. ISSN 00219673. [27] MASON, T. Sonic and ultrasonic removal of chemical contaminants from soil in the laboratory and on a large scale. Ultrasonics Sonochemistry. 2004, vol. 11, 3-4, s. 205-210.
- 43 -
[28] CHRISTIAN, G. D. Analytical chemistry. 5th ed. New York: John Wiley, 1994, 812 s. ISBN 04-715-9761-9. [29] LUCCI, P., PACETTI, D., NÚÑEZ, O., FREGA, N. G. Chromatography - The Most Versatile Method of Chemical Analysis: Current Trends in Sample Treatment Techniques for Environmental and Food Analysis [online]. InTech, 24. October, 2012 [cit. 2013-04-01]. ISBN 978-953-51-0813-9. Dostupné z: http://www.intechopen.com/books/chromatographythe-most-versatile-method-of-chemical-analysis/current-trends-in-sample-treatmenttechniques-for-environmental-and-food-analysis [30] GONZÁLEZ DE LA HUEBRA, M.J., VINCENT, U. Analysis of macrolide antibiotics by liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005, roč. 39, 3-4, s. 376-398. ISSN 07317085. [31] GRABIC, R., FICK, J., LINDBERG, R. H., FEDOROVA, G., TYSKLIND, M. Multiresidue method for trace level determination of pharmaceuticals in environmental samples using liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry. Talanta. 2012, roč. 100, s. 183-195. ISSN 00399140. [32] HPLC apparatus. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2013-04-02]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus.svg [33] Chromatografická kolona a kapiláry. DOUŠA, M. HPLC.CZ [online]. [2011] [cit. 201304-03]. Dostupné z: http://www.hplc.cz/Tip/column_capilar.htm [34] AGILENT TECHNOLOGIES, Inc. Performance characteristics of the Agilent 1290 Infinity Diode Array Detector: Technical Overview [online]. April 1, 2010 [cit. 4.4.2013]. Dostupné z: http://www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5990-5601 EN .pdf [35] MAJORS, R. E. Fast and Ultrafast HPLC on sub-2 µm Porous Particles – Where Do We Go From Here?. LC GC Europe. 2006, vol. 19, issue 6. ISSN 1471-6577. [36] Základy UPLC. DOUŠA, M. HPLC.CZ [online]. [2011] [cit. 2013-04-03]. Dostupné z: http://www.hplc.cz/UPLC/
- 44 -
[37] VYDROVÁ, Lucie Využití separačních metod pro studium biologicky aktivních látek ve vodách: The Usage of separation methods for research of biologically active substances in waters. Brno: Vysoké učení technické, Fakulta chemická, 2011. 118 s. Dizertační práce. Vedoucí práce Milada Vávrová.
- 45 -
6
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ČOV
čistírna odpadních vod
DAD detektor diodového pole ECD elektrochemický detektor GPC gelová permeační chromatografie HMG-CoA -reduktáza 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreduktáza,
HPLC FTIR MAE
klíčový enzym syntézy cholesterolu vysokoúčinná kapalinová chromatografie detektor zpracovávající infračervené záření extrakce mikrovlnným zářením
mRNA MS MUSK
mediátorová ribonukleová kyselina hmotnostní spektrometrie syntetické vonné látky
NSAID PAU
nesteroidní protizánětlivé látky polycyklické aromatické uhlovodíky
PCB POP PPCP PSE
polychlorované bifenyly perzistentní organické polutanty léčiva a produkty osobní potřeby extrakce kapalinou za zvýšeného tlaku (synonyma: PLE, ASE, PFE)
SFE SPE tRNA UHPLC
superkritická fluidní extrakce extrakce tuhou fází transferová ribonukleová kyselina
(UPLC) ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie USE extrakce pomocí ultrazvuku ÚCHTOŽP Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí, Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně
- 46 -
7
PŘÍLOHY *DAD1, 7.408 (150 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D mAU 140
120
100
80
60
40
20
0 220
240
260
280
300
320
340
360
380
nm
360
380
nm
Obrázek 20: UV spektrum ibuprofenu
*DAD1, 4.128 (477 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D mAU
400
300
200
100
0 220
240
260
280
300
320
340
Obrázek 21: UV spektrum naproxenu
- 47 -
*DAD1, 7.141 (415 mAU, - ) Ref=0.001 & 8.495 of 1AD-0401.D mAU 400 350 300 250 200 150 100 50 0 220
240
260
280
300
320
340
360
nm
380
Obrázek 22: UV spektrum diklofenaku
DAD1 C, Sig=214,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D) mAU
2500
2000
1500
1000
Ibuprofen 500
0 1
2
3
4
5
6
7
8
min
Obrázek 23: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 214 nm
- 48 -
DAD1 D, Sig=230,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D) mAU
Naproxen
1200
1000
800
600
400
200
0 1
2
3
4
5
6
7
8
min
8
min
Obrázek 24: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 230 nm
DAD1 E, Sig=275,4 Ref=360,100 (13_05_02_RH\13_05_02_RH 2013-05-02 11-26-23\1BE-1301.D) mAU 1200
1000
800
600
Diklofenak 400
200
0 1
2
3
4
5
6
7
Obrázek 25: Chromatogram modelového vzorku při vlnové délce 275 nm
- 49 -
