Samenvatting
Belangrijke pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis en Plasmodium falciparum, de ziekteverwekkers van respectievelijk tuberculose en malaria, maken gebruik van de 2-Cmethyl-D-erythritol 4-fosfaat (MEP) route voor de biosynthese van isopentenyl difosfaat (IDP) en dimethylallyl difosfaat (DMADP), universele bouwstenen van isoprenoïden. Aangezien mensen uitsluitend de alternatieve mevalonaat route benutten voor de synthese van IDP en DMADP, in combinatie met het feit dat de MEP route onmisbaar is voor veel organismen, maakt dat de enzymen van de MEP route aantrekkelijke doelwitten zijn voor de ontwikkeling van ontstekingsremmende medicijnen. De ontwikkeling van verschillende multi- en superresistente stammen van M. tuberculosis en P. falciparum in het bijzonder, maakt dat er een groeiende noodzaak is voor het ontwikkelen van nieuwe ontstekingsremmers met een nieuw werkingsmechanisme. Bovendien, aangezien planten ook gebruik maken van de MEP route om de bouwstenen van isoprenoïden te synthetiseren, zijn de enzymen van deze route ook interessante doelwitten voor de ontwikkeling van onkruidverdelgers. In hoofdstuk 1 van dit proefschrift geven we een overzicht van de meest actieve remmers die gepubliceerd zijn voor elk enzym van de MEP route en bediscussieren we het biologische doelwit van dit proefschrift, 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat synthase (DXS), in detail. DXS katalyseert de eerste en snelheidsbepalende stap van de MEP route, waarbij thiamine difosfaat (TDP) als cofactor wordt gebruikt. Het feit dat DXS zowel bij de biosynthese van het microbiële thiamine (vitamine B1), als bij de vitamine-B6 biosynthese betrokken is, maakt het een bijzonder interessant doelwit, aangezien op deze manier drie cruciale biosynthetische routes tegelijkertijd verhinderd kunnen worden. De twee kristalstructuren van DXS in een complex met TDP die beschikbaar zijn in de Protein Data Bank, zijn niet afkomstig van pathogene organismen, wat de ontwikkeling van remmers voor dit enzym een uitdaging maakt. Dit heeft tot resultaat dat er maar weinig voorbeelden van remmers voor DXS in de literatuur gepubliceerd zijn. In dit proefschrift presenteren we meerdere hit-identificatie strategieën gericht op de ontwikkeling van remmers voor DXS, hierbij gebruik makend van computationele studies en biofysische methoden. In hoofdstuk 2 beschrijven we de eerste toepassing van een innovatieve NMR methodologie op een fragmentgebaseerd ontwerp project. Allereerst hebben we de novo een serie fragmenten ontworpen, met als doel om in de TDP-bindingsholte van DXS te binden en de mogelijkheid om deze fragmenten in de richting van de substraat- en difosfaatholte te laten groeien. Hiervoor hebben we een driestaps NMR methodologie gebruikt, die ons in staat heeft gesteld om de bindingsmodus van de fragmenten in oplossing te valideren en de nieuwe fragment-optimisatiecyclus in te leiden, aangezien er geen betrouwbaar protocol voor eiwit kristallisatie beschikbaar was. 194
In hoofdstuk 3 passen we een simpele maar effectieve hit-identificatie methodologie, namelijk faagdisplay, toe om de eerste peptidische remmers voor DXS te ontwikkelen met laagmicromolaire activiteit tegen D. radiodurans DXS. We beschrijven tevens de identificatie van kernmotieven die verantwoordelijk zijn voor de activiteit van de remmers, en delen van de α-aminozuurvolgorde die verder aangepast kunnen worden om de activiteit van het peptide te verbeteren. Dit project opent de deur voor het toepassen van peptiden als potentiële ontstekingsremmers, wat vooral interessant is aangezien gedurende het afgelopen decennium het gebruik van peptiden als potentiële medicijnen steeds meer aangemoedigd en nagestreefd werd, met als resultaat dat een aantal van hen op de markt gebracht is. In hoofdstuk 4, onderzoeken we thiamine analoga als remmers voor D. radiodurans en M. tuberculosis DXS en rationaliseren we de opgemerkte verschillen in activiteit tussen de twee orthologen. Met behulp van geavanceerde docking experimenten hebben we een homologiemodel van M. tuberculosis DXS ontwikkeld en gevalideerd, dat gebruikt kan worden voor rationeel ontwerp van remmers van M. tuberculosis DXS in de afwezigheid van kristallografische informatie. Daarnaast hebben we onderzocht of suikers gebruikt kunnen worden ter vervanging van de difosfaat groep van TDP. In hoofdstuk 5, beschrijven we de ontwikkeling en het gebruik van een internetgebaseerde software genaamd TPPQuery, dat het mogelijk maakt om een farmacofoor zoektocht van anker-georiënteerde virtuele bibliotheken uit te voeren en tevens helpt om potentiële TDPcompetitieve remmers, die via multi-component reacties gesynthetiseerd kunnen worden, te identificeren. We bediscussiëren de vermeende bindingsmodi van een selectie van kernstructuren en hun synthese via de Zhu, Van Leusen en Groebke reacties. In hoofdstuk 6 demonstreren we de kracht van ligandgebaseerde virtuele screening (LBVS) als hit-identificatie methodologie, met name wanneer er zeer weinig structurele informatie beschikbaar is voor het doelwit. Uitgaand van de basisstructuren van enige fragmenten die we ontworpen en getest hebben in hoofdstuk 2, hebben we meerdere cycli van LVBS uitgevoerd om (een gedeelte van) de ZINC database te screenen. Hiermee hebben we remmers met laagmicromolaire activiteit tegen zowel D. radiodurans en M. tuberculosis DXS ontdekt, die goede activiteit vertonen tegen multi- en superresistente stammen van M. tuberculosis in celgebaseerde assays. Onze meest actieve remmers zijn tevens in hoge mate selectief voor DXS ten opzichte van pyruvaatdehydrogenase kinase, een TDP-afhankelijk zoogdier-enzym, en één van hen vertoont een zwakke activiteit tegen malariaparasieten, waarbij de parasitemie met ongeveer 20% werd gereduceerd in een celgebaseerd assay met P.falciparum 3D7.
195
Voor een uitdagend en weinig onderzocht doelwit zoals DXS, bleek de strategie om meerdere hit-identificatie en optimalisatie strategieën in parallel uit te voeren, zeer effectief. De meeste strategieën die we toegepast hebben, bleken elkaar zelfs goed aan te vullen. Bijvoorbeeld, de fragmenten die we de novo ontworpen hebben zoals gepresenteerd in hoofdstuk 2, zijn zwakke remmers van D.radiodurans DXS, maar dienen als referentie voor de LBVS campagne. De afwezigheid van (co)-kristallografische informatie wordt gezien als groot struikelblok voor een medicinale chemie project. Echter, we hebben laten zien dat deze barrière overwonnen kan worden, door bijvoorbeeld geavanceerde NMR technieken toe te passen, of door screening methoden te gebruiken waarvoor deze informatie niet noodzakelijk is, zoals faagdisplay. Het gebruik van structuurgebaseerde (SB)
aanpakken
(bijv.
de
novo
ontwerp,
SB-farmacofoor
zoektochten) alleen is risicovol, vooral wanneer de enige beschikbare kristalstructuur die van een model enzym is. Desalniettemin, het gebruik van software zoals TPPQuery, heeft ons in staat gesteld om de TDP-holte te onderzoeken met ongehoorde en zeer diverse basisstructuren. Echter, de combinatie van SB- en LB-aanpakken maximaliseert de kans op succes en verkleint het risico dat geassocieerd is met onvoldoende structurele informatie.
196
197
198
