UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-PMETOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI
SKRIPSI
EKO WAHYUDI 1111102000028
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2015
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-PMETOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI
SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
EKO WAHYUDI 1111102000028
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2015 ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS
Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.
Nama NIM Tanda Tangan
: EKO WAHYUDI : 1111102000028 :
Tanggal
: 30 Juni 2015
iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING
Nama NIM Program Studi Judul
: : : :
Eko Wahyudi 1111102000028 Farmasi STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-PMETOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI
Disetujui oleh :
Pembimbing I
Supandi, M.Si, Apt
Pembimbing II
Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc NIP. 197711292006041009
iv
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI
Skripsi ini diajukan oleh : Nama NIM Program Studi Judul
: : : :
Eko Wahyudi 1111102000028 Farmasi STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-PMETOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI
Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyartan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
DEWAN PENGUJI Pembimbing I
: Supandi, M.Si, Apt
(…………………..)
Pembimbing II
: Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc.
(….……………….)
Penguji I
: Ismiarni Komala, Ph.D., Apt.
(…………………..)
Penguji II
: Drs. Umar Mansyur, M.Sc., Apt
(….……………….)
Ditetapkan di : Ciputat Tanggal
: 13 Juli 2015 v
HALAMAN PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK
Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tanfan dibawah ini : Nama NIM Program Studi Fakultas Jenis Karya
: : : : :
Eko Wahyudi 1111102000028 Farmasi Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Skripsi
Demi perkermbangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :
STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-P-METOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI Untuk dipublikasi atau disampaikan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sesuai Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya Dibuat di Pada tanggal
Yang Menyatakan,
(Eko Wahyudi)
vi
: Jakarta : 20 Juni 2015
ABSTRAK
Nama Program Studi Judul
: Eko Wahyudi : Farmasi : STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIVITAS DARI AMIDASI SENYAWA ETIL-PMETOKSISINAMAT SEBAGAI ANTIINFLAMASI DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN KOMPUTASI
Telah dilakukan studi hubungan kuantitatif struktur aktivitas (HKSA) antiinflamasi dari 10 senyawa turunan asam sinamat dengan pendekatan Hansch berdasarkan analisis multiregresi linier dan penambatan molekul terhadap enzim COX-2. Deskriptor digunakan untuk mewakili parameter hidrofobisitas (log P), sterik (indeks Harary, indeks Randic, dan molar refraksi), dan elektronik (polarisabilitas, EHUMO, ELOMO, dan selisih EHUMO-LOMO). Hasil HKSA berdasarkan analisis multiregresi linier (MLR) adalah: Log 1/IC50 = -6.559 + 0.017 [Log P] – 0.025 [Indeks Harary] + 0.039 [MR] + 0.016 [Polarisabilitas] - 0.396 [ELUMO] + 0.427 [∆EHOMO-LUMO] Dari persamaan, didapatkan prediksi potensi tertinggi sebagai antiinflamasi dari senyawa amidasi etil p-metoksisinamat, yaitu senyawa dengan log 1/IC50 sebesar 0.677. Proses inflamasi terjadi dengan adanya enzim siklooksigenasie. Enzim siklooksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi, dan produk metabolisme asam arakidonat. COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi oleh sitokin, endotoksin, dan faktor pertumbuhan (growth factors). Interaksi dari senyawa amidasi EPMS dengan COX-2 dapat dilakukan dengan cara penambatan molekul. Penambatan molekul antara senyawa uji dari amidasi EPMS dengan molekul COX2 (PDB:1CX2), diperoleh senyawa dengan energi ikatan sebesar -7.5 kkal/mol dengan membandingkan energy ikatan ibuprofen (-7.5 kkal/mol). Kata kunci : HKSA, Antiinflamasi, COX-2, Penambatan molekul
vii
ABSTRACT
Nama Major Title
: Eko Wahyudi : Pharmacy : STUDY QUANTITATIVE STRUCTURE ACTIVITY RELATIONSHIP OF COMPOUNDS AMIDATION ETHYL p-METHOXYCINNAMATE AS ANTIINFLAMMATORY HANSCH APPROACH AND COMPUTATION
Study quantitative structure activity relationship (QSAR) of 10 derivatives cinnamic acid compound as anti-inflammatory has been carried out by Hansch approach based multiple linier regression (MLR) and molecular docking to COX-2 enzym. Descriptor used to represent parameter hydrophobicity (Log P), steric (index Harary, index Randic and Molar refractivity (MR), and electronic (EHUMO, ELOMO, ΔEHUMO-LUMO, and Polarizability). Best QSAR equationby applying analysis MLR as follows : Log 1/IC50 = -6.559 + 0.017 [Log P] – 0.025 [Index Harary] + 0.039 [MR] + 0.016 [Polarizability] - 0.396 [ELUMO] + 0.427 [∆EHOMO-LUMO] Following equation, obtained high prediction activity as anti-inflammatory from amidation ethyl p-methoxycinnamate (EPMS) compound is compound 1B with substituent aniline is -0.677. Inflammation occurred process by cyclooxygenase enzyme. Cyclooxygenase enzyme is enzyme to catalyst prostaglandin formation, inflammatory mediator, and metabolic product arachidonate acid. COX-2 is and enzyme to induced inflammatory cells by cytokines, endotoxin, and growth factors. Interaction of amidation EPMS compound with COX-2 molecule can be carried out by molecular docking. Docking amidation compound with COX-2 molecule obtained binding energy of -7.5 kcal/mol with compared energy binding ibuprofen (-7.5 kcal/mol). Kata kunci : QSAR, Antiinflammatory, COX-2, Molecular Docking
viii
KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Allah SWT., karena atas berkat dan rahmat-Nya proses penelitian hingga penulisan skripsi ini dapat berjalan. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada : 1. Kepada kedua orang tua tercinta, Ibu Sriyati dan Bapak Tukimin, yang selalu mengingatkan untuk fokus belajar, jangan pulang larut malam, jaga kondisi tubuh, dan lulus kulias. Tak lupa ucapan terima kasih yang sedalam-dalam atas kontribusi yang selama ini diberikan berupa dukungan moril, finansial, dan doa yang selalu diberikan kepada penulis dan adik tercinta Dwi Puji Astuti yang selalu memberikan dukungan kepada penulis 2. Bapak Supandi, M.Si, Apt., selaku pembimbing pertama dan Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc., selaku pembimbing kedua, yang tak lelah memberikan kontribusi nyata berupa masukan, bimbing, dan kritik terhadap penulis dalam menyelesaikan skripsi. Penulis hanya bisa berdoa, semoga mendapatkan berkah, kesehatan jasmani dan rohani dari Allah S.W.T. 3. Bapak Drs. Arief Sumantri, S.KM., M.KM selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Bapak Yardi, Ph. D., Apt., selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta dan selaku pembimbing akademik kelas A farmasi 2011 yang tak henti-hentinya memberikan dorongan moril, motivasi dan bantuan belajar kepada mahasiswa/i.
ix
5. Seluruh dosen – dosen di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan studi hingga saat ini.
6. Bapak Drs. Umar Mansyur, M.Sc., Apt., selaku dosen terfavorit penulis di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta yang selalu memberikan nasihat dan bimbingan agar mahasiswa/I dapat lulus tepat waktu dan menjadi teman curhat penulis ketika sedang kesulitan.
7. Kak Fikri, yang saat ini sedang melanjutkan program apoteker, yang telah menjadi mentor dalam skripsi penulis dan tim docking sehingga dapat mengerjakan skripsi ini dengan lancar dan Docking Team berisi Arsyad (cacad), Wahidin (dindin),
Mazaya, Fitri, Haidar, Wahyu, yang menjadi teman sharing skripsi dan tempat bertukar ilmu dan sekaligus menjadi teman curhat. 8. Rekan-rekan di Program Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2011 yang
telah menjadi teman sekaligus menjadi keluarga besar penulis selama ini. Kemudian teman-teman pengurus BEM FKIK periode 2013 – 2014, serta teman-teman di HMI KOMFAKDIK. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari pembaca yang bersifat membangun dan dapat memacu penulis untuk berkarya lebih baik di masa yang akan datang. Akhir kata, saya berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis khususnya, dan dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan bagi semua pihak. Ciputat, Juni 2015
Penulis
x
DAFTAR ISI HALAMAN SAMPUL …………………………………………………………………..ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................................iv HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................................... v HALAMAN PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................vi ABSTRAK ........................................................................................................................vii ABSTRACT ..................................................................................................................... viii KATA PENGANTAR .......................................................................................................ix DAFTAR ISI......................................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ........................................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................... xv BAB I PENDAHULUAN ................................................................................................. 1 1.1. Latar Belakang ................................................................................................. 1 1.2. Rumusan Masalah ............................................................................................ 2 1.3. Hipotesis ............................................................................................................ 3 1.4. Tujuan Penelitian ............................................................................................. 3 1.5. Manfaat Penelitian ........................................................................................... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................... 4 2.1. Hubungan Kuantitatif Struktur – Aktivitas (HKSA) ................................... 4 2.2. Analisis Statistik HKSA model Hansch ........................................................ 11 2.3. Asam Sinamat ................................................................................................. 13 2.4. Etil p-metoksisinamat ..................................................................................... 16 2.5. Ester ................................................................................................................. 17 2.6. Amida............................................................................................................... 18 2.7. Inflamasi .......................................................................................................... 20 2.8. Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2) ................................................................ 22 2.9. Protein dan Asam Amino ............................................................................... 22 2.10. Interaksi Protein dengan Ligan..................................................................... 25 2.11. Molecular docking (Penambatan Molekul) ................................................... 27 2.12. Protein Data Bank (PDB)............................................................................... 30 2.13. PubChem ......................................................................................................... 30 2.14. Autodock.......................................................................................................... 30 2.15. Autodock Vina ................................................................................................ 31 2.16. Pymol ............................................................................................................... 31 2.17. Marvin Skecth ................................................................................................. 31 BAB III METODE PENELITIAN ................................................................................ 32
xi
Tempat dan Waktu Penelitian....................................................................... 32 Alat ................................................................................................................... 32 3.2.1. Perangkat Keras.............................................................................. 32 3.2.2. Perangkat Lunak............................................................................. 32 3.3. Bahan ............................................................................................................... 32 3.3.1. Training Set dan Test Set ............................................................... 32 3.3.2. Molekul Tiga Dimensi (3D) ............................................................ 32 3.3.3. Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan Amidasi EMPS ..................... 33 3.4. Cara Kerja....................................................................................................... 33 3.4.1. Penyiapan Model HKSA ................................................................ 33 3.4.2. Penambatan Molekul ...................................................................... 34 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 36 3.1. 3.2.
Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) .................................... 36 4.1.1. Pemilihan Data Set .......................................................................... 36 4.1.2. Pemilihan Deskriptor Training set dan Test set .............................. 39 4.1.3. Analisa Korelasi Deskriptor dengan Aktivitas Biologis .............. 46 4.1.4. Pemodelan Persamaan HKSA dengan metode MLR .................. 47 4.1.5. Validasi Persamaan HKSA ............................................................ 49 4.2. Penambatan Molekul (Molecular Docking) .................................................. 53 4.2.1. Penyiapan Molekul ......................................................................... 53 4.2.2. Penyiapan Ligan.............................................................................. 54 4.2.3. Penambatan Molekul ...................................................................... 55 4.2.4. Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekul ............................. 56 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 67 4.1.
5.1. Kesimpulan...................................................................................................... 67 5.2. Saran ................................................................................................................ 67 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 68 LAMPIRAN..................................................................................................................... 69
xii
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1. Hubungan antara aktivitas biologis dengan log P……………… 7 Gambar 2.2. Struktur umum senyawa etil p-metoksisinamat........................... 17 Gambar 2.3. Struktur umum senyawa ester ...................................................... 17 Gambar 2.4. Contoh penamaan amida.............................................................. 18 Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida ............................................................. 18 Gambar 2.6. Reaksi pembuatan amina primer ................................................. 19 Gambar 2.7. Reaksi pembuatan amina sekunder .............................................. 19 Gambar 2.8. Mekanisme inflamasi melalui jalur asam arakidonat ............................ 21 Gambar 2.9. Asam amino alifatik bersifat hidrofobik ...................................... 26 Gambar 2.10. Asam amino aromatik bersifat hidrofobik ................................. 24 Gambar 2.11. Asam amino aromatik bersifat ionic .......................................... 24 Gambar 2.12. Asam amino aromatik bersifat polar.......................................... 24 Gambar 4.1. Struktur Caffeic acid oktil ester yang telah dioptimasi .................. 37 Gambar 4.2. Grafik korelasi antara aktivitas prediksi dan eksperimen ........... 45
xiii
DAFTAR TABEL Tabel 2.1. Turunan Asam sinamat dengan sifat antiinflamasi ............................. 14 Tabel 4.1. Data set dari 15 senyawa turunan asam sinamat ................................. 37 Tabel 4.2. Training set .......................................................................................... 40 Tabel 4.3. Test Set ................................................................................................ 40 Tabel 4.4. Data deskriptor hidrofobik dan sterik dari 15 senyawa turunan asam sinamat ................................................................................................ 41 Tabel 4.5. Data deskriptor elektronik dari 15 senyawa turunan asam sinamat .... 46 Tabel 4.6. Nilai Korelasi antara deskriptor dengan nilai aktivitas ....................... 48 Tabel 4.7. Model Persamaan HKSA dengan metode MLR ................................. 49 Tabel 4.8. Perbandingan aktivitas eksperimen dan prediksi training set ............. 51 Tabel 4.9. Nilai RMSD test set ............................................................................ 51 Tabel 4.10. Hasil prediksi aktivitas antiinflamasi dengan HKSA ...................... 53 Tabel 4.11. Hasil visualisai penambatan molekul (3D dan 2D) dengan ligan uji dan kontrol positif (Ibuprofen) .......................................................... 58 Tabel 4.12. Interaksi molekul ligan dengan asam amino terikat .......................... 63 Tabel 4.13. Jenis asam amino yang terikat pada ligan ......................................... 66 Tabel 4.14. Tabel Rule of Five Lipinski’s ligan yang di dockings ....................... 68
xiv
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Alur penelitian HKSA dan penambatan molekul ............................65 Lampiran 2. Tabel rekapitulasi perhitungan deskriptor hidrofobik, sterik, dan elektronik 15 senyawa turunan asam sinamat ................................67 Lampiran 3. Hasil analisi korelasi antara deskriptor dengan aktivitas biologis ...68 Lampiran 4. Hasil analisis MLR dengan Training Set .........................................69 Lampiran 5. Struktur 3D protein COX-2 .............................................................71 Lampiran 6. Prosedur kerja penambatan molekul (molecular docking) ..............72 Lampiran 7. Data hasil docking Autodock Vina ..................................................83
xv
BAB I PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang Inflamasi secara sederhana dapat diartikan sebagai respon jaringan terhadap sel yang rusak. Inflamasi masuk dalam keadaan patologis yang sering menyebabkan kelainan sel rusak atau nekrosis, itu berarti inflamasi (peradangan) biasa dianggap sebagai penyakit, kisarannya mulai dari gigitan serangga hingga menimbulkan banyak komplikasi dan keadaan serius seperti kanker. Inflamasi kronik berhubungan dengan berbagai penyakit seperti penyakit infeksi, kanker atau kelainan autoimun yang menghasilkan immunosupressan oleh terhambatnya sel natural killer dan sel T, sehingga menyebabkan penyakit (Umar et al, 2012). Enzim yang berperan dalam terjadinya inflamasi adalah enzim siklooksigenase 2 (COX2). COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi oleh sitokin, endotoksin, dan faktor pertumbuhan (growth factors). COX-2 juga berperan dalam proliferase sel kanker. Ekspresi berlebihan ditemukan pada kebanyakan tumor (Zullies et al, 2006). Penelitian yang dilakukan untuk menemukan senyawa yang mempunyai antiinflamasi, salah satunya adalah adalah etil p-metoksisinamat (EPMS). Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), dan telah banyak digunakan sebagai pengobatan nyeri dan peradangan, senyawa ini juga menunjukan aktivitas penghambat proliferasi sel tumor pada jaringan epidermis tikus dan papiloma (Ekowati et al, 2012). Umar et al (2012) melaporkan bahwa senyawa EPMS dapat menghambat karagenan penginduksi edema dengan MIC 100 mg/kg. EPMS non selektif menghambat aktifitas siklooksigenasi 1 dan 2, dengan nilai IC50 1.12 μm dan 0.83 μm. Sirisangtragul et al (2011) melaporkan bahwa efek ekstrak diklorometan K. galanga L dan komponen utama etil p-metoksisinamat (EPMS) menunjukan aktivitas mikrosomal hepatic pada enzim sitokrom P450. Untuk menemukan aktivitas dari suatu senyawa amidasi EPMS yang akan dapat dilakukan dengan beberapa metode, salah satunya metode in 1
2
silico (komputasi), yakni : Hubungan Kuantitatif Struktur Aktivitas (HKSA) dan Penambatan Molekul (Molecular Docking). Hubungan
Kuantitatif
Aktivitas
Struktur
Aktivitas
adalah
pendekatan yang menghubungkan struktur dan akvitas biologi didalam tubuh yang dinyatakan secara matematis. Metode HKSA yang banyak diketahui adalah Metode Free-Wilson dan Hansch. Namun, metode yang banyak digunakan adalah metode Hansch, dimana metode lebih sederhana; konsepnya secara langsung berhubungan dengan prinsip-prinsip kimia fisika organik yang sudah ada; data parameter sifat fisika kimia substituen sudah banyak tersedia; penggunaan pendekatan model Hansch telah banyak menjelaskan hubungan struktur – aktivitas suatu turunan obat (Siswandono, 2000). Interaksi dari suatu ligan terhadap molekul dapat dilakukan dengan metode penambatan molekul. Penambatan molekul merupakan metode yang memprediksi satu atau dua molekul ketika mengikat satu sama lain membentuk komplek stabil yang digunakan untuk memprediksi kekuatan ikatan atau afinitas bidding antara dua molekul digunakan untuk penentuan nilai sampel (Bachwani Mukesh et al, 2011). Pada penelitian ini menggunakan senyawa etil pmetoksisinamat yang dimodifikasi dengan amidasi, kemudian dilakukan analisa hubungan kuantitatif struktur aktivitas dengan pendekatan Hansch dilanjutkan dengan penambatan molekul. Metode penambatan molekul ini dipilih karena secara cepat meramalkan atau memprediksi aktifitas ligan yang ditambatkan melalui hasil scoring dari tiap-tiap ligan sehingga hasil yang didapat lebih memudahkan membandingkannya. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan gambaran dan membandingkan interaksi antara senyawa amidasi etil p-metoksisinamat (EPMS) dengan COX-2. 1.2.
Rumusan Masalah a. Apakah metode pendekatan Hansch dapat menunjukan hubungan kuantitatif struktur aktivitas antiinflmasi dari struktur senyawa amidasi etil p-metoksisinamat ? b. Apakah senyawa dari proses amidasi etil p-metoksisinamat memiliki interaksi terhadap enzim siklooksigenase-2 (COX-2) ?
3
c. Bagaimanakah perbandingan aktivitas dari masing-masing molekul ligan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat terhadap enzim siklooksigenase-2 (COX-2) ?
1.3.
Hipotesis Parameter Hidrofobik (Log P), Elektronik (EHOMO, ELUMO, ΔEHOMOLOMO,
Polarisabilitas), dan Sterik (Indeks Harary, Indeks Randic, Molar
refraksi) mempunyai pengaruh terhadap aktivitas antiinflamasi. 1.4.
Tujuan Penelitian a. Memperoleh model persamaan HKSA Hansch dan prediksi aktivitas senyawa amidasi etil p-metoksisinamat. b. Menganalisis interaksi penambatan molekul ligan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat terhadap enzim COX-2.
1.5.
Manfaat Penelitian Memberikan informasi perbandingan dari tiap-tiap senyawa uji yang dapat digunakan dalam pertimbangan pembuatan obat anti-inflamasi baru.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1.
Hubungan Kuantitatif Struktur – Aktivitas (HKSA) Aktivitas biologis suatu obat diperoleh setelah terjadi interaksi senyawa dengan molekul spesifik dalam objek biologis. Interaksi tersebut ditunjangn dengan spesifitas sifat kimia fisika senyawa yang tinggi. Aktivitas obat berhubungan dengan sifat kimia obat, dan merupakan fungsi dari struktur molekul obat. Hubungan struktur kimia dan aktivitas biologis yang tidak baik dapat disebabkan oleh kurang baiknya metode penelitian yang digunakan. Konsep bahwa aktivitas biologis suatu senyawa berhubungan dengan struktur kimia, pertama kali dikemukakan oleh Crum, Brown dan Fraser pada tahun 1869. Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktivitas biologis obat merupakan bagian terpenting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan suatu oobat baru dengan aktivitas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model HKSA, akan lebih menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktivitas yang dikehendaki (Siswandono, 2000). Kajian hubungan kuantitatif struktur aktivitas (HKSA) menjabarkan suatu model persamaan yang menghubungkan ketergantungan harga aktivitas suatu senyawa secara eksperimen dengan struktur molekul. Menurut Kubinyi, struktur suatu senyawa tersebut dapat direpresentasikan sebagai parameter fisik dan kimiawi (analisis Hansch), variable indikator (analisis Free-Wilson) atau dengan peninjauan sifat molekul secara tiga dimensi (HKSA – 3D) (Tahir et al, 2003). A.
Model Pendekatan Free-Wilson Free dan Wilson (1964), mengembangkan suatu konsep hubungan struktur dan aktivitas biologis obat, yang dinamakan model de
novo
atau
model
matematika
Free-Wilson.
Mereka
mengemukakan bahwa respon biologis merupakan sumbangan
4
5
aktivitas dari gugus-gugus substituent terhadap aktivitas biologis senyawa induk, yang dinyatakan melalui persamaan : Metode Free-Wilson digunakan jika cara kerja obat tidak diketahui, uji biologis lambat daripada sintesis senyawa turunannya, dan atau sifat-sifat fisika kimia substituen tidak diketahui. Model ini didasarkan pada perkiraan bahwa masing-masing substituen pada struktur senyawa induk memberikan sumbangan tetap pada aktivitas bilogis. Perkiraan dasar pada model Free-Wilson adalah semua obat yang diuji harus mempunyai struktur induk sama dan substituen harus memberikan aktivitas biologis secara aditif dalam kedudukan yang sama dengan jumlah tetapan yang bebas dari ada atau tidaknya substituen (Leach, 1996). Model de novo ini kurang berkembang karena tidak dapat digunakan bila efek substituent bersifat tidak linier atau bila ada interaksi antar substituent. Selain itu model ini memerlukan banyak senyawa dengan kombinasi substituen yang bervariasi untuk dapat menarik kesimpulan yang benar. Meskipun demikian model ini juga mempunyai
keuntungan karena dpat
menghubungan
secara
kuantitatif struktur kimia dan aktivitas biologus dari turunan senywa dengan bermacam-macam gugus substituent pada berbagai zona (Siswandono, 2000). B.
Model Pendekatan HKSA Hansch Hansch (1963) mengemukakan suatu konsep bahwa hubungan struktur kimia dengan aktivitas biologi (log 1/C) suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui parameter-parameter sifat kimia fisika dari substituent yaitu parameter hidrofobik (π), eletronik (σ), dan sterik (Es). Model pendekatan ini disebut model hubungan energy bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau pendekatan ekstra termodinamik. pendekatan hubungan struktur-aktivitas melalui parameter sifat kimia fisika oleh Hansch dinyatakan melalui persamaa regresi linier dibawah ini :
6
Log 1/C = a Σ π + b Σ σ + c Σ Es – d C
: Kadar untuk respon biologis baku
Σ π, Σ σ dan Σ Es
: Sumbangan sifat-sifat lipofilik, eletronik dan sterik dari gugus-gugus terhadap sifatsifat senyawa induk yang berhubungan dengan aktivitas biologis.
a, b, c dan d
: Bilangan (tetapan) yang didapat dari perhitungan analisis regresi linier.
Dalam
hubungan
struktur-aktivitas,
model
Hansch
lebih
berkembang dan lebih banyak digunakan dibanding model de novo Free-Wilson oleh karena: a)
Lebih sederhana
b)
Konsepnya secara langsung berhubungan dengan prinsipprinsip kima fisika organic yang sudah ada
c)
Data parameter sifat kimia fisika substituent sudah banyak tersedia dalam tabel-tabel.
d)
Penggunaan
pendekatan
model
Hansh
telah
banyak
menjelaskan hubungan struktur dan aktivitas suatu turunan obat. Parameter sifat kimia fisika yang digunakan dalam pemodelan HKSA Hansch adalah parameter hidrofobik (π), elektronik (σ) dan sterik (Es). a.
Parameter hidrofobik Karakter hidrofobik suatu obat dapat dinilai secara eksperimen dengan menguji sebaran distribusi obat didalam campuran n-oktanol/air. Molekul hidrofobik akan lebih terlarut dalam lapisan n-oktanol dalam sistem dua fase, dimana molekul hidropilik akan lebih ke lapisan air. Distribusi relatif diketahui sebagai koefisien pastisi (P) dan diperoleh dari suatu persamaan: 𝑃=
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑜𝑏𝑎𝑡 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑜𝑘𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑜𝑏𝑎𝑡 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑎𝑖𝑟
7
Senyawa hidrofobik dengan nilai P tinggi, dan dimana senyawa hidrofilik mempunyai nilai P rendah. Variasi substituen pada senyawa penuntun akan memproduksi seri analog yang mempunyai perbedaan hidrofobisitas dan perbedaan nilai P. Dengan memplot atau membandingkan nilai P dengan aktivitas biologis obat, maka mungkin untuk melihat jika adanya hubungan antara kedua sifat tersebut. Normalnya aktivitas obat ditunjukan sebagai 1/C, dimana C adalah konsentrasi obat yang diperlukan untuk mencapai tingkat aktivitas biologis. Hubungan timbal-balik konsentrasi (1/C) digunakan, sejak obat yang lebih aktif akan mencapai aktivitas biologis pada konsentrasi yang rendah (Patrick, 2009). Pada grafik (gambar 2.1) plot log (1/C) dengan log P, dimana rentang nilai log P adalah terbatas pada rentang yang kecil (log P = 1 – 4), garis lurus pada grafik yang diperoleh menunjukan bahwa hubungan antara hidrofobisitas dan aktivitas biologis.
Gambar 2.1. Hubungan antara aktivitas biologis dengan log P Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi (log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f RekkerMannhold dan tetapan kromatografi Rm. b.
Parameter elektronik Efek elektronik pada berbagai subtituen akan jelas mempunyai efek ionisasi atau kelarutan pada obat. Efek
8
elektronik memungkinkan mempunyai efek bagaiman obat dengan mdah melewati membran sel atau seberapa kuat efek tersebut dapat berinteraksi dengan lokasi ikat. Untuk itu efek tersebut berguna untuk menilai efek elektronik pada substituen. Deskriptor elektronik telah banyak digunakan untuk membuat persamaan HKSA maupun HKSS (Hubungan Kuantitatif SifatStruktur). Deskriptor tersebut dibedakan dari nilai tunggal konstanta elektronik substituen yang diberikan senyawa. Jumlah
deskriptor
elektronik
dapat
dibedakan
berdasarkan dari efek atau kekuatan interaksi intermolekular. Secara luas dikenal dari kekuatan interaksi intermolekulat mengikuti: ion-ion, ion-dipol, dipol-dipol, dipol-induksi dipol, dispersi, dan ikatan hidrogen. Interaksi ion telah dikodekan didalam studi potensi obat melalu penggunan konstanta ionisasi. Sebagai
deskriptor,
konstanta ionisasi menyajikan informasi tentang tingkat ionisasi, yang diketahui termasuk absorbsi dan distribusi dari obat. Menurut Lien et al yang meriview penggunaan deskriptor pada HKSA bahwa momen dipole menyandikan kekuatan interaksi kepolaran. Molekular
polarisabilitas
dan
refraksi
molar
mempunyai kedekatan hubungan sifat pengukuran pada kerentanan molekul menjadi polar. Deskriptor tersebut sering digunakan pada kondisi dimana dipol-induksi dipole dan dispersi memainkan peranan penting dalam interaksi. Indeks reaktifitas biasanya dikategorikan sebagai elektrofilik atau nukleofilik tergantung dari kereaktifan dari tarikan yang melibatkan serangan elektrofilik atau nukleofilik. Metode yang berdasarkan medan gaya molekular klasik dan metode kimia kuantum, masing-masing dapat digunakan untuk meminimalkan energi potensial struktur molekul. Kedua pendekatan tersebut dapat digunakan untuk perhitungan secara
9
trmodinamik dan momen dwikutub tetapi hanya metode kimia kuantum yang dapat memperkirakan muatan-muatan atom, energi orbital molekul, dan beberapa deskriptor elektronik lainnya dalam studi HKSA. Metode kimia kuantum dapat diaplikasikan dalam HKSA dengan menurunkan deskriptor elektronik secara langsung dari fungsi gelombang molekular (Katritzky et al, 1996). Energi HOMO (Highest Occupied Molecul Orbital) dan LUMO (Lowest Occupied Molecul Orbital),
merupakan
deskriptor yang sangat populer dalam kimia kuantum. Orbitalorbital ini memainkan peran yang sangat penting dalam menentukan berbagai reaksi kimia dan dalam penentuan celah pita elektronik. Energi HOMO berhubungan langsung dengan potensial ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan
terhadap
elektrofil.
Sedangkan
LUMO
berhubungan dengan afinitas elektron. Selisih antara energi HOMO dan LUMO (celah HOMO-LUMO) penting dalam penentuan ukuran stabilitas molekul. Molekul dengan celah HOMO-LUMO yang besar berarti molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi, sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksi-reaksi kimia. Celah ini juga digunakan pada perkiraan energi eksitasi terendah molekul (Katritzky et al, 1996). Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model LFER Hansch, yaitu : 1. Pengaruh berbagai substituent terhadap reaktivitas bagian molekul yang tidak mengalami perubahan. 2. Sifat elektronik yang berikatan dengan tetapan ionisasi (pKa) dan berhubungan dengan bentuk terionkan dan tak terionkan dari suatu senyawa pada pH yang tertentu. 3. Sifat oksidasi-reduksi atau reaktivitas senyawa. c.
Parameter sterik
10
Bulk, ukuran dan bentuk suatu obat akan mempengaruhi bagaimana obat mudah berikatan dan berinteraksi dengan situs aktif. Substituen bulk dapat bertindak sebagai pelindung yang cocok berinteraksi antara obat dan situs aktifnya. Sebagai alternatif, substituen bulk dapat membantu obat berorientasi dengan maksimum pada situs aktif dan meningkatkan aktivitas. Sifat sterik sangat sulit untuk dihitung dibanding sifat hidrofobik dan elektronik. Perhitungan sifat sterik bisa dilakukan dengan metode molar refraksi, faktor sterik Taft’s, parameter sterik Verloop dan indeks topologi (Patrick, 2009). Deskriptor yang digunakan pada penelitian ini adalah indeks topologi dan refraksi molar (MR). Indeks topologi banyak digunakan sebagai deskriptor struktur pada model hubungan kuantitatif struktur-aktifitas (HKSA) dan hubungan kuantitatif sifat-struktur (HKSS). Indeks topologi menawarkan cara yang mudah dalam pengukuran cabang molekul, bentuk, ukuran, siklisitas, simetri, sentrisitas, dan kompleksitas (Devillers, 1997). Indeks topologi menjelaskan bahwa suatu struktur kimia, disebut sebagai grafik kimia, yaitu suatu model kimia yang digunakan untuk menjelaskan sifat interaksi antara obyek-obyek kimia (atom, ikatan, gugusan atom, molekul, pasangan molekul, dan sebagainya). Pada penelitian ini digunakan, yakni: Indeks Randic dan Indeks Harary dan Molar Refraksi (MR). a.
Indeks Harary Indeks Harary yang dinyatakan dengan
H
diturunkan dari hubungan timbal balik (resiprokal) matriks jarak dan memiliki sejumlah sifat-sifat yang menarik. Indeks ini berdasarkan pada dugaan para kimiawan bahwa situs-situs yang terletak berjauhan dalam suatu struktur seharusnya memiliki pengaruh yang lebih kecil antara satu
11
dengan lainnya daripada situs-situs yang letaknya berdekatan. b. Indeks Randic Indeks Randic atau indeks konektivitas molekular Randic sangat mirip dengan indeks Zagreb, namun lebih dapat diterima dan digunakan secara luas. Sesuai dengan definisi yang diberikan, maka semakin rapat grafik, maka akan semakin rendah harga χ (Ivanciuc dan Balaban, 1998). c. Molar refraksi (MR) Selain itu, pengukuran sterik yang diketahui dengan refraksi molar. MR mengukur volume yang diisi oleh suatu atom atau gugus atom. MR diperoleh dari persamaan:
Dimana n adalah indeks refraksi, MW adalah berat molekul, dan d adalah berat jenis. MW/d didefinisakn sebagai volume, dan (n2 – 1)/(n2 + 2) merupakan faktor koreksi yang didefinisikan bagaimana suatu substituen dapat dengan mudah berpolar. Faktor koreksi menunjukan signifikan jika substituen memiliki π elektron atau pasangan elekron bebas (Patrick, 2000). Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugusgugus dan efek gugus pada kontak obat dengan sisi reseptor yang berlekatan. 2.2.
Analisis Statistik HKSA model Hansch Perhitungan statistik yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan aktivitas melalui parameter kimia fisika adalah regresi linier dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan aktivitas biologis melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan statistik dengan bantuan komputer, menggunakan program
12
SPSS, MICROSAT, ABSTAT, QSAR, STATGRAPICH, SIGMASTAT, atau program statistik lain (Siswandono. 1995). Penggunaan analisa statistik pada HKSA bertujuan untuk melihat hubungan atau pengaruh deskriptor terhadap aktivitas dan hubungan antara deskriptor dengan aktivitas adalah linier. Analisa regresi merupakan suatu model matematis yang dapat digunakan untuk mengetahui bentuk hubungan anatara dua atau lebih variabel. Tujuan analisa regresi adalah untuk membuat perkiraan (prediksi) nilai suatu variabel bebas dengan variabel terikat (Sutanto. 2011). Regresi linier merupakan persamaan yang melibatkan dua variabel bebas dan terikat. Metode analisa regresi dibagi menjadi dua yaitu analisa regresi linier sederhana dan analisa regresi berganda/multilinier atau analisa multi regression linier. Analisa statistik Multiple Linier Regression (MLR) merupakan suatu analisa statistik yang melibatkan dua atau lebih variabel bebas (independen) terhadap satu variabel terikat (dependent). Analisa suatu persamaan regresi ditentukan oleh beberapa kriteria statistik untuk memperoleh keabsahan atau validitas persamaan yang diperoleh, yakni: 1.
Nilai r (koefisien korelasi) menunjukan tingkat hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisis regresi. Koefisien korelasi adalah angka yang bervariasi mulai dari -1 sampai 1. Semakin tinggi nilainya semakin baik hubungannya. Untuk mendapatkan nilai korelasi yang dapat diterima tergantung jumlah data penelitian. Semakin banyak jumlah data semakin rendah koefisien korelasi atau nilai r yang dapat diterima.
2.
Nilai r2 menunjukan berapa % aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan parameter sifat kimia fisika yang digunakan. Contoh : suatu hubungan yang mempunyai koefisien korelasi (r) = 0.990 berarti dapat menjelaskan (0.990)2 x 100% = 98 % dari antar data.
3.
Nilai F menunjukan kemaknaan hubungan bila dibandingkan dengan tabel F. Makin besar nilai F makin besar derajat kemaknaan hubungan. Nilai F adalah indikator bilangan untuk menunjukan bahwa hubungan,
13
yang dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah benar atau merupakan kejadian kebetulan. 4.
Nilai t menunjukan perbedaan koefisien regresi a, b, c dan d dari persamaan regresi bila dibandingkan dengan tabel t.
5.
Nilai SE (simpang baku) menunjukan nilai variasi kesalahan dalam percobaan.
6.
PRESS (Prediction Residual Sum of Square) menggambarkan suatu persamaan dapat memprediksi aktivitas. Semakin kecil suatu nilai PRESS pada suatu persamaan atau model maka dipilih sebagai persamaan terbaik untuk memprediksi nilai aktivitas.
2.3.
Asam Sinamat Dalam kimia biologi, asam sinamat merupakan kunci kunci intermediet pada jalur sikimat dan phenylpropanoid. Asam sikimat merupakan precursor dari banyak turunanan alkaloid, asam amino aromatic, dan indol. Asam sikimat ditemukan dalam bentuk bebas, dan terutama dalam bentuk ester (etil, cinamil, benzyl), dalam jenis minyak esensial, resin dan balsam, minyak cinnamon, balsam Peru dan balsam Tolu, dll. Asam sinamat memainkan peran vital dalam sintesis senyawa penting. Sebagai contoh, turunan asam sinamat dapat diubah menjadi senyawa yang penting termasuk stiren dan stilbn melalui reaksi dekarboksilasi. Turunan asam sinamat dikategorikan berdasarkan profil farmakologinya, yakni : Anti TB, antidiabetis, antioksidan, antimikroba, hepatoprotektif, despresan CNS, Antikolesterolemik,
antijamur
dan
fungitoksik,
antihiperglikemik,
antimalaria, antiviral, anxiolitik, sitotoksik, antiinflamasi (Sharma, 2011). Beberapa turunan asam sinamat mempunyai aktivitas antiinflamasi yang telah banyak diketahui, yakni: Etil p-metoksisinamat, turunan caffeic acid, turunan ferulic acid, turunan hidroksisinamat, dll. Berikut turunan asam sinamat yang memiliki aktivitas antiinflamasi yang diperoleh dari penelitian yang dilakukan Nguyen et al Da Cunha et al [3] (2004).
[1]
(2015), Liu et al
[2]
(2014), dan
14
Tabel 2.1. Turunan Asam sinamat dengan sifat antiinflamasi IC50 Nama dan Struktur senyawa
No
Kode
µM
Caffeic Acid Octyl Ester [3]
1
A1
2.4
A2
3.7
A3
4.1
A4
4.8
A5
5.0
A6
5.2
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4-fluorophenyl)acrylamide [2]
2 (E)-N-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
3 Caffeic acid phenetyl ester [3]
4 (E)-N-(2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
5 (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4-methoxyphenyl)acrylamide
6 [2]
15
(E)-N,N-Dibutyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
7
A7
6.1
A8
6.7
A9
7.9
A10
8.4
A11
10.7
A12
11.9
(E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
8
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(3(trifluoromethyl)phenyl)acrylamide [2]
9 Caffeic acid butil ester [3]
10 Caffeic acid benzyl ester [3]
11 Caffeic acid ethyl ester [3]
12
16
1-O-caffeoylglycerol [1]
13
A13
18.5
A14
21.4
A15
29
Caffeic acid methyl ester [1]
14
Caffeoylglycolic acid methyl ester [1]
15
2.4.
Etil p-metoksisinamat Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), dan telah banyak digunakan sebagai pengobatan nyeri dan peradangan, senyawa ini juga menunjukan aktivitas penghambat proliferasi sel tumor pada jaringan epidermis tikus dan papiloma (Ekowati et al, 2012). EPMS termasuk kedalam senyawa ester yang mengandung cincin benzene dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar (Rosbina, 2009). EPMS telah dilaporkan mempunyai anti-tuberkolosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastic dan potensi anti microbial (Umar et al, 2014).
Gambar 2.2. Struktur umum senyawa etil p-metoksisinamat
17
2.5.
Ester Ester adalah suatu senyawa organik yang terbentuk melalui pergantian satu (atau lebih) atom hidrogen pada gugus karboksil dengan suatu gugus organik. Kebanyakan ester tersebar luas pada semua senyawa alam. Sebagai contoh, metil butanoat ditemukan pada minyak nanas dan isopentil asetat merupakan senyawa pokok minyak pisang (Mc Murry, 2008). Penamaan ester terdiri dari dua kata, kata pertama adalah nama gugus alkil yang terikat pada oksigen ester sedangkan kata kedua berasal dari nama asam karboksilatnya, dengan membuang kata asam (Inggris: -ic acid menjadi –ate) (Siswandono, 2000). Pada dasarnya ester merupakan asam karboksilat dengan menghilangkan gugus hidrogen dan digantikan oleh gugus R dan ester merupakan senyawa yang mempunyai aroma yang enak dan aroma yang tercium dari buah-buahan, misalnya : propil pentanoat (nanas), etil butanoat (Winter, A., 2005).
Gambar 2.3, Struktur umum senyawa ester Esterifikasi adalah reaksi pembentukan ester. Reaksi ini dapat dilakukan dengan berbagai cara: 1. Reaksi antara asam karboksilat dengan alcohol RCOOH + R’OH → RCOOR’ + H2O 2. Reaksi antara halide asam dengan alcohol RCOCl + R’OH → RCOO’R + HCl 3. Reaksi antara anhidrida dan alcohol (RCO)2O + R’OH → RCOOR’ + RCOOH 4. Reaksi antara suatu karboksilat dan alkil halid relatif RCOOH + R’X → RCOOR’ + HX Esterifikasi yang melibatkan alcohol dan asam karboksilat dengan adanya katalis asam dan basa, hanya akan memberikan hasil yang baik terhadap alcohol primer, sedangkan dengan alcohol sekunder dan tersier tidak memberikan hasil yang diharapkan (Kammoun, dkk. 1997).
18
2.6.
Amida Suatu amida ialah suatu senyawa yang mempunyai nitrogen trivalent yang terikat pada suatu gugus karbonil. Suatu amida diberi nama dari asam karboksilat induknya, dengan mengubah imbuhan asam …-oat (atau –at) menjadi –amida.
Gambar 2.4, Contoh penamaan Amida Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia atau amina yang sesuai. Reaksi pembentukan sebagai berikut:
R’2NH
O R’2NH
RCNR’2
R’2NH
Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida (Sumber: Fessenden & Fessenden, 1999)
Reaksi pembentukan amida dapat dilakukan secara industry maupun secara laboratorium. Amida asam lemak pada industri oleokimia dapat dibuat dengan mereaksikan asam lemak atau metil ester dengan suatu amina (Maag, 1984). Amida asam lemak dibuat secara sintesis pada industri oleokimia dalam proses batch, dimana ammonia dan asam lemak bebas bereaksi pada suhu 200oC dan tekanan 345 – 690 kpa selama 10 – 12 jam. Dengan proses tersebutlah dibuat amida primer seperti lauramida, stearamida, dll.
19
Amida primer juga dibuat dengan mereaksikan ammonia dengan metil ester asam lemak. Reaksi ini mengikuti konsep HSAB dimana H+ dari ammonia merupakan hard acid yang mudah bereaksi dengan hard base CH3O- untuk membentuk metanol. Sebaliknya NH2- lebih soft-base dibandingkan dengan CH3O- akan terikan dengan R-CO- yang lebih soft acid dibandingkan H+ membentuk amida.
Gambar 2.6. Reaksi pembuatan amina primer Pembuatan amida sekunder dilakukan dengan mereaksikan asam lemak dengan amina.
Gambar 2.7. Reaksi pembuatan amina sekunder Senyawa amina yang digunakan untuk reaksi tersebut antara lain etanolamin, urea, anilin, dietanolamin, asetamid, dll yang jika direaksikan dengan asam lemak ada suhu tinggi, 150o C – 200oC akan membentuk suatu amida dan melepaskan air. Senyawa amida mempunyai banyak kegunaan dalam bidang-bidang tertentu, salah satu contoh yang paling nyata adalah senywa sulfonamida. Sulfonamida adalah suatu senyawa kemoterapeutik yang digunakan didalam pengobatan untuk mengobati bermacam-macam penyakit infeksi, antara lain disentri baksiler yang akut, radang usus dan untuk mengobati infeksi yang telah resisten terhadap antibiotikan (Nuraini, W., 1998) dan juga N-Steroyl Glutamida yang berguna sebagai surfaktan dan antimikroba (Miranda, 2003). Amida berperan untuk mempengaruhi polimer yang melebur agar terlepas dari permukaan wadah logam pengolahan resin. Sebagai pelumas internal, amida berperan untuk mengurangi gaya kohesi dari polimer dan meningkatkan aliran polimer pada proses pengolahanya (Reck, 1984).
20
2.7.
Inflamasi Inflamasi merupakan respon imun yang terjadi secara imunologi saat sel diaktifkan untuk merespon organisme asing asing atau melepaskan antigen yang menghasilkan respon inflamasi akut atau kronik (Kaztung, 2006). Mekanisme pertahanan merupakan bagian dari host yang diketahui membawa reaksi inflamasi seperti pelepasan histamin, bradykinin dan prostaglandin (Siju et al., 2012). Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme perlindungan dimana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaan untuk perbaikan jaringan (Joyce & Eveyln, 1996). Respon inflamasi terjadi dalam tiga fase dan diperantarai mekanisme yang berbeda: (1) Fase akut, dengan ciri vasodilatasi lokal dan peningkatan permeabilitas kapiler, (2) Reaksi lambat, tahap subakut dengan ciri infiltrasi sel leukosit dan fagosit; dan (3) Fase proliferatife kronik, saat degenerasi dan fibrosis terjadi (Dept. Farmakologi dan Teurapetik, 2007). Lima ciri khas dari inflamasi, dikenal sebagai tanda-tanda utama inflamasi, adalah kemerahan, panas, pembengkakan (edema), nyeri dan hilangnya fungsi.
21
Gambar 2.8, Mekanisme inflamasi melalui jalur asam arakidonat (Sumber: Claria, 2003)
Secara in vitro terbukti bahwa prostaglandin E2 (PGE2) dan protasiklin (PGI2) dalam jumlah nanogram, menimbulkan eritema, vasodilatasi dan peningkatam aliran darah lokal. Histamin dan bradikinin dapat meningkatkan permeabilitas vascular, tetapi efek vasodilatasinya tidak besar. Dengan penambahan sedikit PG, efek eksudasi histamine plasma dan bradikinin menjadi lebih jelas. Migrasi leukosit ke jaringan radang merupakan aspek penting dalam proses inflamasi. (Ganiswarna, 1995). Prostaglandin mempunyai efek yang bermacam-macam terhadap pembuluh darah, terhadap ujung saraf (nerve ending), dan terhadap sel yang terlibat dalam peradangan. Leukotriene mempunyai efek kemotaktik yang kuat terhadapp eosinophil, neutrophil, dan makrofag serta meningkatkan bronkokonstriksi dan perubahan permeabilitas vascular (Katzung. 2006).
22
2.8.
Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2) Enzim adalah suatu kelompok protein yang menjalankan dan mengatur perubahan-perubahan kimia dalam sistem biologi, zat ini dihasilkan oleh organ-organ hewan dan tanaman, yang secara katalitik menjalankan berbagai reaksi, seperti pemecahan hidrolisis, oksidasi, reduksi, isomerasi, adisi, transfer radikal dan kadang-kadang pemutusan rantai karbon (Hammes & Hopper, 2005). Enzim siklooksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi, dan produk metabolisme asam arakidonat. Enzim COX terdiri dari 2 iso-enzim yaitu COX-1 dan COX-2. Enzim COX-1 ber-sifat konstitutif untuk memelihara fisiologi normal dan homeostasis, sedangkan COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi oleh sitokin, endotoksin, dan faktor per-tumbuhan (growth factors). COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel kanker. Ekspresi berlebihan COX-2 ditemukan pada kebanyakan tumor. Penemuan isoform COX-2 membuka lem-baran baru penelitian yang didasarkan pada asum-si bahwa patologis prostaglandin (PG) diproduksi oleh induktif yang isoform, sedangkan fisiologis prostaglandin diproduksi oleh konstitutif COX-1 (Zukhurullah, 2012).
2.9.
Protein dan Asam Amino Asam amino merupakan suatu susunan protein. Protein dari semua spesies, dari bakteri sampai manusia, terdiri dari kumpulan dari 20 asam amino standar yang sama. Sembilan belas di antaranya adalah asam α-amino dengan gugus amino primer (-NH3+) dan asam karboksilat (karboksil; COOH) yang terikat pada atom karbon pusat, yang disebut atom α-karbon (Cα) karena berdekatan dengan gugus karboksil dan juga terikat pada atom Cα yaitu atom hidrogen dan variabel rantai samping atau gugus 'R'. Namanama asam amino sering disingkat menjadi tiga huruf atau satu huruf. Contoh: prolin disingkat Pro atau P (Hammes & Hopper, 2005). Asam amino adalah struktur penyusun polimer protein. Asam amino merupakan senyawa yang memiliki atom hidrogen, gugus karboksil, dan gugusamino yang terikat pada atom karbon yang sama (karbon-α). Selain
23
tiga gugus tersebut, terdapat juga gugus R yang merupakan rantai samping yang akan membedakan tiap asam amino dalam hal struktur, ukuran, dan muatan listrik. Terdapat 20 jenis asam amino umum yang menyusun protein (Gambar 2.6). Asam amino yang pertama kali ditemukan adalah asparagin pada tahun 1806, sedangkan asam amino yang terakhir kali ditemukan adalah treonin, yang belum teridentifikasi hingga 1938 (Nelson & Cox, 2008). Ada 20 asam amino standar yang hanya berbeda dalam struktur rantai samping atau gugus 'R'. Asam amino tersebut dapat dibagi menjadi kelompok-kelompok kecil berdasarkan kesamaan dalam sifat-sifat rantai sampingnya. (Hammes & Hopper, 2005).
Gambar 2.9. Asam amino alifatik bersifat hidrofobik (Sumber: Hammes & Hopper, 2005).
24
Gambar 2.10. Asam amino aromatik bersifat hidrofobik (Sumber: Hammes & Hopper, 2005).
Gambar 2.11, Asam amino bermuatan bersifat ionik (Sumber: Hammes & Hopper, 2005).
Gambar 2.12, Asam amino tak bermuatan bersifat polar (Sumber: Hammes & Hopper, 2005). Urutan linear asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida disebut struktur primer protein. Posisi ikatan kovalen disulfida antara residu
25
sistein juga termasuk dalam struktur primer. Gabungan antara dua struktur primer membentuk struktur protein sekunder. Struktur sekunder protein ini mengacu pada lipatan teratur daerah dari rantai polipeptida. Dua jenis struktur sekunder adalah α-helix dan β-pleated sheet. α-helix berbentuk silinder, rangkaian heliks asam amino seperti batang dalam rantai polipeptida yang ditahan oleh ikatan hidrogen yang sejajar dengan sumbu helix. Dalam β-pleated sheet, ikatan hidrogen terbentuk antara bagian yang berdekatan dari polipeptida yang baik berjalan di arah yang sama (β-pleated sheet paralel) atau dalam arah yang berlawanan (β-pleated sheet antiparalel). β-membalikkan arah rantai polipeptida dan seringkali ditemukan terhubung dengan ujung β-pleated sheet antiparallel (Hammes & Hopper, 2005). Protein dapat diklasifikasikan berdasarkan kelarutan, bentuk, fungsi biologis, atau struktur tiga dimensinya. Berdasarkan fungsi biologis tersebut, protein dapat diklasifikasikan sebagai enzim (dehidrogenase, kinase), protein penyimpanan (feritin, mioglobin), protein pengatur (protein pengikat DNA, hormon polipeptida), protein struktural (kolagen, proteoglikan), protein pelindung (faktor pembekuan darah, imunoglobulin), protein pengangkut (hemoglobin, lipoprotein plasma), dan protein kontraktil/ motil (aktin, tubulin) (Murray et al, 2003). 2.10.
Interaksi Protein dengan Ligan A. Ikatan Hidrogen Ikatan hidrogen adalah interaksi antara atom hidrogen bermuatan positif parsial dalam dipol molekuler dengan elektron tidak berpasangan dari atom lain, baik pada molekul yang sama maupun molekul yang lain. Secara normal, atom hidrogen membentuk ikatan hidrogen hanya dengan satu atom lainnya, namun atom hidrogen yang terikat secara kovalen dengan atom donor elektronegatif dapat berinteraksi membentuk ikatan hidrogen dengan atom akseptor. Ikatan hidrogen yang terkuat memiliki susunan atom donor, atom hidrogen, dan atom akseptor pada garis lurus (Lodish, et al., 2008). Atom yang mengikat atom hidrogen dinamakan atom donor,
26
pasangannya adalah atom akseptor. Jika salah satu atau kedua atom pada ikatan hidogen bermuatan penuh, maka interaksi keduanya akan lebih kuat. Jika keduanya bermuatan penuh, energi ikatan diantaranya sangat tinggi dan pasangan ion ikatan hidrogen tersebut dinamakan jembatan garam (Petsko & Ringe, 2003). Secara umum, ikatan hidrogen didasari dengan donor X-H dan akseptor A, yakni X–H---A. Jika ikatan hidrogen diperpanjang di sisi akseptor sebagai X–H---A–Y, sudut akseptor H---A–Y juga dapat didefinisikan (Desiraju & Steiner, 1999). B. Ikatan Ionik Ikatan ion terbentuk antara gugus – gugus yang memiliki muatan yang berlawanan dan sangat penting untuk beberapa interaksi ikatan obat-target. Beberapa pengantar pesan kimia alami tubuh berinteraksi melalui ikatan ion (Patrick, 2001). C. Ikatan van der Waals Interaksi van der waals adalah interaksi lemah yang muncul diantara gugus – gugus hidrofobik seperti cincin aromatik dan gugus alkil. Interaksi ini muncul disebabkan adanya fluktuasi acak dalam densitas elektron sehingga membentuk daerah sementara yang kaya elektron atau sedikit elektron. Daerah kaya elektron pada satu molekul akan menarik daerah yang elektronnya sedikit pada molekul lain. Interaksi ini lebih lemah dari ikatan ion dan ikatan hidrogen dan melibatkan molekul hidrogen netral (Patrick, 2001). Energi ikatan van der Waals terbilang kecil, yaitu sekitar 2-4 kJ/mol per-pasang atom (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2007). Interaksi van der Waals berkurang ketika jarak antar atom menjauh, maka hanya atom yang saling berdekatan (hanya terpisah 5 Ǻ atau kurang) yang memungkinkan terjadinya interaksi ini Interakasi var der Waals yang ada pun biasanya lemah, namun jumlahnya yang banyak pada protein memberikan peran yang cukup besar (Petsko & Ringe, 2003). D. Ikatan Hidrofobik
27
Hidrokarbon adalah molekul yang terdiri atas karbon dan hidrogen dan tidak larut dalam air. Ikatan kovalen antara dua atom karbon dan antara atom karbon dan atom hidrogen adalah ikatan nonpolar yang paling umum dalam sistem biologis. Molekul nonpolar tidak mengandung gugus bermuatan, momen dipol, atau terhidrasi, sehingga tidak larut atau hampir tidak larut dalam air. Karenanya, mereka disebut hidrofobik (Lodish, et al., 2008). Interaksi hidrofobik merujuk pada kecenderungan senyawa nonpolar untuk bergabung satu sama lain dalam lingkungan encer (Murray, Granner, Mayes, & Rodwell, 2003). Molekul nonpolar juga dapat bergabung melalui interaksi van der Waals walaupun lemah. Gabungan antara interaksi hidrofobik dan van der Waals membuat molekul hidrofobik cenderung berinteraksi dengan satu sama lainnya, bukan dengan air. Sederhananya, sesuai kaidah like dissolves like, molekul polar terlarut dalam pelarut polar seperti air, sementara molekul nonpolar terlarut dalam pelarut nonpolar seperti heksan (Lodish, et al., 2008). 2.11.
Molecular docking (Penambatan Molekul) Penambatan molekul atau molecular docking adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksikan ikatan non-kovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan struktur yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain (Arry Yanuar, 2012). Molecular docking adalah metode yang memprediksi orientasi sebuah molekul ketika berikatan satu sama lain membentuk kompleks yang stabil. Orientasi dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan asosiasi atau afinitas bidding antara dua molekul yang digunakan sebagai contoh scoring function. (Bachwani Mukesh et al, 2011). Penambatan molekuler digunakan untuk memprediksi struktur kompleks intermolekuler yang terbentuk antara dua atau lebih molekul. Kasus paling menarik adalah interaksi ligan dan protein karena
28
penerapannya pada bidang kedokteran. Ligan adalah molekul kecil yang berinteraksi dengan lokasi ikatan protein. Lokasi ikatan adalah daerah protein yang diketahui aktif dalam pembentukkan senyawa. Ada beberapa konformasi mutual yang memungkinkan di mana ikatan dapat terjadi. Hal tersebut dinamakan model ikatan. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal. Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam desain obat secara rasional (Bachwani Rakesh, 2011). Fokus
Penambatan
molekul
untuk
mensimulasikan
secara
komputasi proses pengenalan molekul. Tujuan dari Penambatan molekul adalah untuk mencapai konformasi yang optimal untuk kedua protein dan ligan serta orientasi relatif antara protein dan ligan sehingga energi bebas dari sistem secara keseluruhan diminimalkan. Proses komputasi mencari ligan yang cocok baik secara geometris dan energi ke situs pengikatan protein ini disebut penambatan molekul. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari obat / ligan atau interaksi reseptor / protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, mendapatkan geometri terbaik dari ligan - kompleks reseptor, dan menghitung energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk merancang ligan yang lebih efektif (Bachwani Mukesh, 2011). Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-X, atau spektroskopi NMR. Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan program
29
docking tergantung pada dua komponen: pencarian algoritma dan fungsi scoring (Bachwani Mukesh, 2011). Beberapa algoritma penambatan yang umum digunakan antara lain dinamika molekuler, metode Monte Carlo, algoritma genetika, Fragmentbased methods, point complementary methods, distance geometry methods, tabu searches, dan systematic searches. Dua pendekatan yang paling populer adalah metode Monte Carlo dan algoritma genetika (Kitchen, Decornez, Furr, & Bajorath, 2004). Setelah melalui beberapa metode algoritma penambatan seperti yang dijelaskan di atas, proses penambatan molekuler dilanjutkan dengan fungsi penilaian untuk memperkirakan energi bebas dari ligan dalam model ikatannya. Fungsi penilaian dikelompokkan menjadi beberapa bagian yaitu berdasarkan empiris, berdasarkan force field, dan berdasarkan pengetahuan (knowledge-based) (Tiikkainen, 2010). Proses penambatan molekuler menyangkut prediksi konformasi ligan dan orientasi (penentuan posisi) dengan sisi penambatan yang ditargetkan. Aspek teoritis mengenai penambatan molekuler dilakukan dengan memprediksikan posisi suatu ligan [I] pada suatu makromolekul protein [E] dibawah kondisi ekuilibrum (conformational search). Fungsi
scoring
dapat
memprediksi
afinitas
ikatan
antara
makromolekul dengan ligan. Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007). Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu: -
Docking protein / ligan kecil
-
Docking protein / peptida
-
Docking protein / protein
30
2.12.
Docking protein / nukleotida (Bachwani Mukesh, 2011)
Protein Data Bank (PDB) Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/) adalah sebuah dokumen atau kumpulan data eksperimental struktur tiga dimensi dari makromolekul biologis, yang sekarang berjumlah lebih dari 32.500 (Berman, et al., 2000), termasuk protein dan asam nukleat. Molekul – molekul tersebut adalah molekul yang ditemukan di semua organisme termasuk bakteri, ragi, tanaman, lalat, hewan lain, dan manusia. Informasi ini dapat digunakan untuk membantu menyimpulkan peran struktur dalam kesehatan manusia dan penyakit, dan dalam pengembangan obat. Struktur yang terdapat dalam arsip ini mulai dari protein kecil dan potonganpotongan DNA sampai molekul kompleks seperti ribosom (RCSB, 2014).
2.13.
PubChem PubChem
(http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)
adalah
gudang
informasi molekuler untuk umum, sebuah karya ilmiah dari Institut Kesehatan Nasional Amerika (US National Institutes of Health / NIH). Basis data PubChem memiliki lebih dari 27 juta catatan struktur kimia khusus dari senyawa yang berasal dari hampir 70 juta senyawa endapan, dan berisi lebih dari 449.000 catatan bioassay dengan lebih dari ribuan biokimia in vitro dan skrining berbasis sel, dengan menargetkan lebih dari 7000 protein dan gen yang terhubung dengan lebih dari 1,8 juta senyawa (Xie, 2010). Pada situs PubChem ini dapat diunduh struktur kimia dari suatu senyawa secara gratis yang dibutuhkan dalam studi penambatan molekul. 2.14.
Autodock Autodock merupakan program penambatan molekuler yang efektif yang secara cepat dan akurat dapat memprediksi konformasi dan energi dari suatu ikatan antara ligan dan target makromolekul. Autodock terdiri dari dua program utama, yaitu Autodock dan Autodock grid. Autodock untuk melakukan penambatan molekuler ligan dan protein target dengan set grid yang telah terdeskripsi. Pendeskripsian ini dilakukan sebelumnya dengan Autogrid. Untuk memungkinkan pencarian konformasi, Autodock membutuhkan ruang pencarian dalam sistem koordinat dimana posisi ligan dianggap akan terikat (Morris et al., 2009).
31
2.15.
Autodock Vina AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line (Sandeep, Nagasree, Hanisha, Murali, & Kumar, 2011).
2.16.
Pymol PyMOL merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul. Perangkat lunak ini dikomersilkan oleh DeLano Scientific LLC (Delano & Bromberg, 2004).
2.17.
Marvin Skecth Marvin sketch merupakan suatu program yang dapat digunakan untuk menggambar dan mengedit struktur, reaksi, atau menghitung struktur data kimia dengan operasi yang intuitif. MarvinSketch juga dapat menetapkan stereokimia, charge, valensi, radikal dan isotop untuk setiap atom. Marvin Sketch juga dapat digunakan untuk penambahan hidrogen dan membuat struktur 2 dimensi dan 3 dimensi.
BAB III METODE PENELITIAN
3.1.
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan bertempat di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan Februari hingga Mei 2015.
3.2. Alat 3.2.1. Perangkat Keras Notebook Acer (4750z Aspire series) dengan spesifikasi Intel® pentium® CPU (B940 @ 2.00GHz (2 CPUS), ~2.00 GHz), RAM (Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan Graphic Card (Intel® HD Graphics Family) 798 megabyte. Notebook terhubung dengan AC/DC adapter dan terkoneksi internet. 3.2.2. Perangkat Lunak Sistem operasi menggunakan Windows 7 Ultimate 32 bit, Autodock Tools, Python 2.5.2 dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Hyperchem 8.0, Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol (De Lano Scitientific LLC), SPSS 16.0.0, LigPlot+ 1.4.5, Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com), ACD/Labs 2012 (www.acdlabs.com), Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb). 3.3. Bahan 3.3.1. Training Set dan Test Set Training set dan test set didapatkan dari literatur dari pengujian secara in vitro. Data training set dan test yang digunakan harus seragam dari segi jenis pengujian, aktivitas dan kemiripan struktur. 3.3.2. Molekul Tiga Dimensi (3D) Molekul tiga dimensi COX-2 diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb. Molekul protein yang dipilih adalah dengan kode 1CX2 dan diunggah dengan format text (gz) atau .pdb
32
33
3.3.3. Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan Amidasi EMPS Ligan yang digunakan adalah ligan dari amidasi etil pmetoksisinamat (EPMS) yang dibuat dengan Marvin Sketch dengan format .mol. 3.4. Cara Kerja 3.4.1. Penyiapan Model HKSA a. Pemodelan Training Set dan Test Set Training set dan test set yang didapatkan dari literatur dan dibuat ke dalam bentuk 2 dimensi menggunakan Marvin Skecth, kemudian optimasi ke dalam bentuk 3 dimensi pada menu structure → clean 3d dan disimpan kedalam format .mol. Training set yang digunakan untuk membangun persamaan sebanyak 11 struktur yang dipilih secara acak dan sisanya digunakan untuk Test set untuk mevalidasi persamaan. b. Pemilihan Deskriptor Pemilihan deskriptor berdasarkan parameter hidrofobitas, parameter elektronik, dan parameter sterik. Parameter hidrofobik menggunakan deskriptor Log P, parameter elektronik menggunakan descriptor EHOMO, ELUMO, Selisih EHOMO-LUMO dan Polarisabilitas, parameter sterik menggunakan deskriptor indeks topologi menggunakan indeks Randic dan Harary serta molar refraksi (MR). Kemudian, masing-masing training set dan test dihitung nilai deskriptor menggunakan software Marvin Skecth untuk menghitung deskriptor log P dan indeks topologi, ACD Labs untuk menghitung MR dan Polarisabilitas dan Hyperchem 8.0 untuk menghitung EHOMO dan ELUMO. c. Analisa Korelasi Statistik Nilai dari tiap-tiap deskriptor dari training set yang sudah dihitung
(variabel
bebas),
kemudian
dianalisa
korelasi
atau
hubungannya dengan nilai aktivitas biologis (variabel tergantung) pada tingkat kepercayaan 95% (0.05) dengan menggunakan software SPSS 16.0.0. Analyze → correlate → bivariate d. Analisa Multiple Linies Regression (MLR) Rekapitulasi nilai dari tiap-tiap deskriptor training set dan nilai dari aktivitas biologis, kemudian diinputkan ke dalam tabel yang dibuat
34
di program SPSS 16.0.0. Masukan varibel dependent adalah aktivitas biologis dan variabel independent adalah deskriptor Setelah itu dilakukan analisa multiregresi untuk mendapatkan prediksi model dengan metode backward. Pemilihan akhir model ditentukan dengan nilai R dan R2 > 0.8, Fhit > Ftab. Analyze → regression →linier. e. Validasi Persamaan HKSA Validasi persamaan HKSA dengan menggunakan test set untuk menghitung nilai dari RMSD (Root Mean Square Deviation) < 1 dan PRESS (Prediction Residual Sum of Square) < 1. 3.4.2. Penambatan Molekul A. Penyiapan Struktur Molekul COX-2 Pengunduhan makromolekul COX-2 dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul yaitu 1CX2. Data makromolekul diunduh dalam format text (gz). 1. Pemisahan Makromolekul Air dan Ligan Makromolekul protein yang telah diunggah, dipisahkan dari ligan dan pelarut dan molekul air. Pemisahan menggunakan Discovery Studio 3.5 Visualizer. Setelah dipisahankan, kemudian simpan dalam format .pdb. 2. Optimasi Molekul Optimasi makromolekul dilakukan dengan menggunakan Autodock Tool dan buka makromolekul yang disimpan dalam format .pdb (file → read molecule → .pdb). 3. Menentukan Lokasi Penambatan Molekul – Ligan Penentuan lokasi penambatan molekul dilakukan berdasarkan jurnal atau buku referensi dengan menggunakan Autodock Tools. Pengaturan dilakukan dengan grid box (grid → grid box) yang meliputi ukuran (size x, y, z), kordinat (center x, y, z) dan, besarnya ukuran (amstrong) dan simpan (file → close saving current). B. Penyiapan Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan Ligan yang digunakan adalah Ibuprofen diunggah melalui PubChem (http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov)
sebagai pembanding dan senyawa
35
amidasi yang dibuat dengan menggunakan Marvin Sketch yang disimpan dengan format .pdb. Struktur ligan yang telah dibuat, kemudian dioptimasi dengan menggunakan Autodock Tools. Kemudian, buka ligan yang telah dibuat (ligand → input → open), setelah itu simpan dalam bentuk .pdbqt (ligand → output → save as pdbqt →save). C. Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Ligan dan Protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dikopi atau dipindah kedalam folder Vina. Kemudian buat konfigurasi file vina yang diketik pada notepad yang disimpan dengan nama conf.txt. Jalankan Vina melalui Command prompt. D. Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekul Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format out.pdbqt atau bentuk notepad. Hasil docking dilakukan dengan memilih ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah, nilai ikatan dapat dilihat di ‘log.txt’. Posisi ligan-ligan pada makromolekul, serta asam amino yang terikat pada ligan divisualisasikan dengan perangkat lunak PyMol untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatanya. E. Analisa Interaksi Ligan dan Molekul Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka dengan menggunakan Wordpad. Kopi isi dalam output.pdbqt dan tambahkan kedalam makromolekul dan simpan dalam format .pdb. Visualisi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan Ligplot untuk melihat kekuatan interaksi dan ikatan pada asam amino dalam bentuk dua dimensi dan masukan file .pdb (output makromolekul dan ligan).
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) 4.1.1. Pemilihan Data Set Data set yang digunakan harus memenuhi beberapa parameter agar data yang digunakan seragam, parameter tersebut adalah keseragaman pengujian (bahan dan cara pengujian), keseragaman aktivitas, dan senyawa yang diuji (turunan asam sinamat). Data turunan asam sinamat yang digunakan adalah berasal dari hasil penelitian secara in vitro yang dilakukan oleh Nguyen et al
[1]
(2015), Liu et al
[2]
(2014), Da Cunha et al
[3]
(2004)
terhadap penghambatan aktifitas inflamasi atau konsentrasi hambat 50% (IC50). Kemudian data senyawa dari 15 asam sinamat dibagi menjadi 2 bagian yakni 10 training set dan 9 test set. Tabel 4.1. Data set dari 15 senyawa turunan asam sinamat IC50 No
Nama dan Struktur senyawa
Kode
µM
Caffeic Acid Octyl Ester [3]
1
A1
2.4
A2
3.7
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4-
fluorophenyl)acrylamide [2]
2
36
37
(E)-N-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
3 A3
4.1
A4
4.8
A5
5.0
A6
5.2
A7
6.1
Caffeic acid phenetyl ester [3]
4 (E)-N-(2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
5 (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4methoxyphenyl)acrylamide [2]
6
(E)-N,N-Dibutyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
7
38
(E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide [2]
8
A8
6.7
A9
7.9
A10
8.4
A11
10.7
A12
11.9
A13
18.5
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(3(trifluoromethyl)phenyl)acrylamide [2]
9
Caffeic acid butil ester [3]
10
Caffeic acid benzyl ester [3]
11 Caffeic acid ethyl ester [3]
12
1-O-caffeoylglycerol [1] 13
39
Caffeic acid methyl ester [1]
14
A14
21.4
A15
29
Caffeoylglycolic acid methyl ester [1]
15
*Catatan : Untuk mempermudah input data maka nama senyawa akan digantikan dengan kode.
Tabel 4.2. Training Set No. Kode
Tabel 4.3.Test Set
µM
No.
Kode
µM
1
A1
2.4
1
A3
4.1
2
A2
3.7
2
A8
6.7
3
A3
4.8
3
A11
10.7
4
A5
5.0
4
A15
29
5
A6
5.2
6
A7
6.1
7
A9
7.9
8
A10
8.4
9
A12
11.9
10
A13
18.5
11
A14
21.4
4.1.2. Pemilihan Deskriptor Training set dan Test set A. Parameter Hidrofobik Deskriptor yang dipilih adalah deskriptor yang dapat mewakili atau menjelaskan parameter dari persamaan Hansch, yakni: hidrofobik, elektronik, dan sterik. Deskriptor yang mewakili parameter hidrofobik adalah Log P atau koefisien partisi karena Log P dapat menjelaskan
40
kelarutan suatu obat didalam molekul yang diperoleh secara eksperimen dengan menguji sebaran distribusi obat dalam campuran n-oktanol/air (Patrick, 2000). Data deskriptor hidrofobik berupa nilai log P disajikan pada tabel 4.1. Log P sendiri berkaitan dengan distribusi obat kedalam tubuh, dimana nilai log P menunjukan kelarutan senyawa tersebut antara larutan nonpolar dan polar (Widyaningsih. dkk, 2007) dan memliki kelarutan yang buruk pada fase air sedangkan nilai log P semakin kecil menunjukan bahwa kecenderungan suatu obat memiliki kelarutan berada pada fase polar dan mempunyai permeabilitas yang buruk pada lipid bilayer (Kerns and Li di, 2008). Perhitungan Log P menggunakan program yang tersedia pada Marvin Skecth. Tabel 4.4. Data deskriptor hidrofobik dan sterik 15 senyawa turunan asam sinamat Rekapitulasi Deskriptor Hidrofobik dan Sterik Indeks Sinamat
Log P
Indeks
Harary Randic
MR
Caffeic Acid Octyl Ester (A1)
4.84
61.80
19.70
84.74
3.23
65.37
15.97
80.24
3.11
67.05
14.82
75.10
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4fluorophenyl)acrylamide (A2)
(E)-N-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A3)
41
Caffeic acid phenetyl ester (A4)
3.53
64.77
16.88
81.43
2.73
75.68
18.04
87.72
3.16
65.37
17.11
84.70
2.34
47.21
15.14
68.06
3.06
20.74
19.23
95.55
3.65
76.79
16.03
80.55
(E)-N-(2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethyl)-3(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide (A5)
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4methoxyphenyl)acrylamide (A6)
(E)-N,N-Dibutyl-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A7)
(E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A8)
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(3(trifluoromethyl)phenyl)acrylamide (A9)
42
Caffeic acid butil ester (A10)
2.96
47.21
14.70
66.21
3.75
51.94
14.55
73.30
1.95
40.09
12.20
56.94
0.71
44.14
12.07
55.34
1.59
36.53
10.95
52.31
1.71
46.99
13.72
64.52
Caffeic acid benzyl ester (A11)
Caffeic acid ethyl ester (A12)
1-O-caffeoylglycerol (A13)
Caffeic acid methyl ester (A14)
Caffeoylglycolic acid methyl ester (A15)
Hasil perhitungan log P dari 15 senyawa asam sinamat dapat dilihat pada tabel 4.4. dan gambar pada tabel 4.1. Pada tabel nilai log P terbesar adalah pada senyawa dengan kode A1 (Caffeic Acid Octyl Ester) sebesar 4.48 dan yang terkecil adalah pada senyawa dengan kode A13
43
(1-O-caffeoylglycerol) sebesar 0.71. Suatu senyawa memiliki rantai C yang panjang akan sifat dari suatu senyawa tersebut akan bersifat sangat non-polar dan kelarutan terjadi dilemak (non-polar). Nilai log P yang kecil mengindikasikan bahwa kelarutan bersifat sangat polar dan kelarutan terjadi di air (polar). Hubungan antara hidrofobik terhadap aktifitas adalah terhadap absorpsi dan penetrasi obat kedalam membran. Jika suatu senyawa tersebut memiliki sifat yang sangat polar maka absorpsi akan cenderung pada fase air, sedangan suatu senyawa memilik sifat yang sangat nonpolar makan kecenderungan absorpsi obat pada lemak. B. Parameter Sterik Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter sterik adalah indeks Randic, indeks Harary dan molar refracitivity (MR). MR mengukur volume yang diisi oleh atom atau gugus atom, sedangkan indeks Randic dan indeks Harary merupakan bagian dari indeks topologi, dimana pengukuran indeks topologi berdasarkan jumlah atom dan jumlah ikatan. Hasil perhitungan nilai indeks topologi dan MR dapat dilihat pada tabel 4.4. Perhitungan nilai indeks Harary, indeks Randic, dan MR dengan menggunakan program Marvinskecth. Calculations → Geometry/Other → Topology/Reactivity. Nilai indeks Harary dan Randic menunjukan keruahan/bentuk dari suatu senyawa, jika nilai suatu indeks besar maka keruahan suatu senyawa besar dan jika nilai suatu indeks kecil maka keruahan suatu senyawa kecil. Nilai indeks Harary dan Randic terkecil yang ditunjukan pada senyawa dengan kode A8 ((E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide) dan A14 (Caffeic acid methyl ester) masing-
masing sebesar 20.74 dan 10.95, sedangkan nilai terbesar ditunjukan pada senyawa dengan kode A5 ((E)-N-(2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethyl)3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide) dan senyawa dengan kode A1 (Caffeic Acid Octyl Ester) adalah 75.68 dan 19.70. Perbedaan harga antara indeks
Harary dan Randic dari teknik perhitungan yang digunakan dalam menentukan keruahan molekul (sterik).
44
Nilai MR (molar refraction) terbesar ditunjukan pada senyawa dengan
kode
A8
((E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3-(3,4-
dihydroxyphenyl)acrylamide) sebesar 101.93 dan nilai terkecil ditunjukan
pada senyawa dengan kode A14 (Caffeic acid methyl ester) adalah 55.18. Besar dan kecilnya MR tergantung pada substituen yang memiliki pasangan elektron bebas sehingga memungkinkan mudah atau tidaknya struktur tersebut berpolarisasi. Kaitan sterik pada hubungan strukturaktifitas adalah terhadap interaksi pada bidding site (lokasi tambat) antara struktur dengan molekul. C. Parameter Elektronik Deskriptor
yang
digunakan
untuk
mewakili
parameter
elektronik, pada penelitian ini deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter tersebut adalah Polarisabilitas, EHomo, ELumo, dan selisih ∆EHomo-Lumo. Perhitungan dengan Ehomo, Elumo, dan ∆EHomo-Lumo dengan cara menghitung energi pada setiap orbital molekul. Pengukuran deskriptor Ehomo dan Elumo dengan menghitung kekuatan orbital pada tiap ujung atom dan deskriptor ini berguna dalam membantu menjelaskan interaksi obat dengan reseptor. Ehumo berhubungan dengan potensial ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap elektrofil, Elumo berhubungan dengan dengan afinitas elektron dan celah atau selisih Ehomo-lumo berhubungan dalam penentuan ukuran stabilitas molekul. Jadi, semakin besar selisih Ehomo-lumo maka memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksi-reaksi kimia. Nilai deskriptor dari masing-masing deskriptor tersaji pada tabel 4.5. Perhitungan deskriptor elektronik dilakukan dengan menggunakan program Hyperchem 7. Struktur yang telah dioptimasi selanjutnya dihitung nilai secara mekanika kuantum. Mekanika kuantum menggunakan kuantum fisik untuk menghitung sifat molekul yang mempertimbangkan interaksi antara elektron dan molekul nukleat (Patrick, 2000). Mekanika kuantum yang dipilih adalah semi-empirik AM1, dengan batas konvergensi 0.001 kkal/Ȧ dengan algoritma Polak-
45
Riberiero. Keadaan struktur yang paling stabil ditandai dengan didapatkan energi total terendah (Husna et al, 2013). Tabel 4.5. Data deskriptor elektronik dari 15 senyawa turunan asam sinamat Rekapitulasi Deskriptor Sterik EHOMO
ELUMO
∆E(homo-lumo)
Polarisabilitas
Caffeic Acid Octyl Ester (A1)
-8.938
-0.789
8.149
33.59
(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-
-9.010
-0.756
8.254
31.80
-9.076
-0.875
8.201
29.77
Caffeic acid phenetyl ester (A4)
-8.950
-0.811
8.139
33.28
(E)-N-(2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-
-8.887
-0.477
8.410
34.77
-8.370
-0.529
7.841
33.58
-8.849
-0.575
8.274
26.98
-8.378
-0.554
7.824
37.88
-9.094
-0.854
8.240
31.75
Caffeic acid butil ester (A10)
-8.935
-0.795
8.140
26.24
Caffeic acid benzyl ester (A11)
-9.001
-0.704
8.682
28.95
Caffeic acid ethyl ester (A12)
-8.935
-0.799
8.136
25.57
1-O-caffeoylglycerol (A13)
-9.098
-1.015
8.082
21.93
Caffeic acid methyl ester (A14)
-8.951
-0.823
8.128
20.73
Caffeoylglycolic acid methyl ester (A15)
-9.123
-0.857
8.266
25.57
Sinamat
(4-fluorophenyl)acrylamide (A2) (E)-N-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A3)
yl)ethyl)-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A5) (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(4methoxyphenyl)acrylamide (A6) (E)-N,N-Dibutyl-3-(3,4dihydroxyphenyl)acrylamide (A7) (E)-N-(2-(1H-Indol-3-yl)ethyl)-3(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide (A8) (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-N-(3(trifluoromethyl)phenyl)acrylamid e (A9)
Pada penelitian ini, selisih ΔE(homo-lumo) menunjukan kestabilan suatu molekul dan kereaktifan molekul tersebut. Jika selisih ΔEhomo-lumo
46
besar maka molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi, sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksi-reaksi kimia. Reaktivitas yang rendah memungkinkan mudah untuk berinteraksi dengan molekul. Sedangkan, jika selisih ΔEhomo-lumo kecil maka molekul akan tereksitasi ke elektron yang lebih tinggi (Tahir et al, 2012). Hasil rekapitulasi selisih ΔEhomo-lumo pada tabel 4.2, selisih ΔEhomo-lumo pada setiap struktur memiliki nilai yang hampir sama dengan rentang dari 7.821 sampai 8.682 sehingga struktur memiliki sifat yang stabil dan memiliki kereaktifan yang rendah. Nilai polarisabilitas tertinggi adalah 35.84 dan terkecil adalah 19.58. Polarisabilitas memiliki hubungan yang dekat dengan molar refraksi (MR) untuk dapat berpolarisasi, semakin banyak jumlah elektron maka akan mudah terpolarisasi. 4.1.3. Analisa Korelasi Deskriptor dengan Aktivitas Biologis Analisa korelasi pada penelitian ini berfungsi untuk melihat suatu hubungan atau pengaruh dari suatu deskriptor terhadap nilai aktivitas biologis. Paramater-parameter yang digunakan pada analisa korelasi antara nilai aktivitas dengan deskriptor adalah nilai r (koefisien korelasi), nilai ini menunjukan tingkat hubungan antara variabel tergantung (nilai aktivitas) dengan variabel bebas (deskriptor) dan nilai koefisien korelasi berjarak -1 sampai +1. Nilai korelasi -1 menunjukan hubungan negatif sempurna yang dimana antara variabel bebas dan tergantung memiliki hubungan yang berlawanan, sedangkan nilai korelasi +1 berarti menunjukan hubungan positif sempurna yang berarti antara variabel bebas dan tergantung memiliki hubungan yang erat. Jika suatu nilai korelasi ±1 maka menunjukan hubungan yang kuat antara variabel tergantung dengan variabel bebas dan jika suatu nilai korelasi bernilai 0 maka antara variabel bebas dengan tergantung tidak memiliki hubungan. Analisa korelasi dilakukan dengan menggunakan program SPSS 16.0 dengan metode bivariate, dimana variabel dependent adalah log 1/IC50 dan variabel independent berupa deskriptor dari 15 senyawa turunan asam
47
sinamat, yakni: Log P, Polarizabilitas, EHOMO, ELUMO, ∆EHOMO-LUMO Refraksi molar (MR), Indeks Randic, dan Indeks Hararay. Tabel 4.6. Nilai Korelasi antara deskriptor dengan nilai aktivitas Deskriptor
Korelasi terhadap Log 1/IC50
Log P
0.866**
EHOMO
0.259
ELUMO
0.471
∆EHOMO-LUMO
0.166
Polarisabilitas
0.883**
Molar Refraksi (MR)
0.881*
Indeks Harary
0.680*
Indeks Randic
0.936**
Ket : (*.) korelasi signifikan pada tingkat 0.05 (**.) korelasi signifikan pada tingkat 0.01 Pada tabel 4.6, korelasi antara log 1/C dengan deskriptor MR dan Indeks Harary memiliki hubungan yang sangat kuat pengaruhnya terhadap aktivitas sebesar 0.881 dan 0.680 dengan tingkat signifikasi mendekati 1. Kemudian nilai korelasi pada deskriptor Log P, Polarisabilitas, Indeks Randic memiliki nilai korelasi yang besar, namun tingkat korelasi pada tingkat 0.01 sehingga tidak dapat dijadikan acuan. Untuk variabel lain tidak memperlihatkan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas (log 1/C) sehingga perlu pengujian dan peninjauan lebih lanjut. Pengaruh variabel terhadap aktivitas akan dilanjutkan dengan analisa multiregresi linier dengan melibatkan semua variabel untuk mendapatkan suatu bentuk model persamaan. 4.1.4. Pemodelan Persamaan HKSA dengan metode MLR Pemodelan dilakukan dengan menggunakan analisis multi regresi linier dengan menggunakan paket program SPSS dengan cara Analyze → Regression → Linier dan pilih metode backward. Penggunaan MLR dalam membangun persamaan karena variabel yang digunakan lebih dari dua varibel yang melibatkan aktivitas biologis dan nilai deskriptor.
48
Pemodelan persamaan HKSA dilakukan dengan membagi dua kelompok, yakni training set dan test set. Training set digunakan untuk membangun model persamaan HKSA yang dipilih berdasarkan aktivitas tertinggi, sedang, dan rendah. Kemudian, test set digunakan untuk memvalidasi persamaan yang dibangun dari training set. Untuk training set dipilih sebanyak 11 senyawa (dapat dilihat pada tabel 4.2) dari 15 senyawa turunan asam sinamat, kemudian 4 senyawa (dapat dilihat pada tabel 4.3) digunakan untuk test set untuk memvalidasi persamaan yang telah dibangun. Senyawa dipilih sebagai training set, yakni: A1, A2, A4, A5, A6, A7, A9, A10, A12, A13, dan A14, kemudian test set yang digunakan untuk memvalidasi adalah A3, A8, A11, dan A15. Nilai dari setiap deskriptor dan aktivitas (log 1/C) dari training set dimasukan kedalam program SPSS 16.0. Setelah itu dilakukan analisis multiregressi linier dengan variabel bebas yaitu deskriptor dan variabel terikat adalah log 1/IC50 dengan metode backward untuk memilah deskriptor mana yang berpengaruh terhadap Log 1/IC50. Tabel 4.7. Model Persamaan HKSA dengan metode MLR No 1
2
Deskriptor Log P, ∆EHOMO-LUMO, ELUMO, ∆E, MR, Polar, Randic, Harary Log P, ∆EHOMO-LUMO, ELUMO, MR, Polar, Harary
R
R2
Fhit
0.983
0.966
12.064
1.357
0.097
0.982
0.965
18.281
2.967
0.085
Fhit/Ftab
SE
3
∆EHOMO-LUMO, ELUMO, ∆E, MR, Polar, Harary
0.982
0.964
26.826
5.312
0.775
4
∆EHOMO-LUMO, ELUMO, ∆E, MR, Harary
0.980
0.961
37.331
8.240
0.073
Setelah dilakukan analisa multiregresi linier, didapatkan empat model persamaan seperti yang terlihat pada tabel 4.7. Analisa statistik dari kedua model tersebut mempunyai nilai r, r2, F dan SE yang mirip sehingga
49
perlu dilakukan validasi untuk menentukan persamaan terbaik dari empat model persamaan. Validasi yang dilakukan pada penelitian ini adalah PRESS (Prediction Residual Sum of Square) dan RMSD (Root Mean Square Deviation). 4.1.5. Validasi Persamaan HKSA Validasi dilakukan untuk menentukan persamaan tersebut dapat digunakan untuk menjelaskan secara teoritik dan untuk menentukan persamaan yang terbaik. Validasi yang dilakukan adalah mencari nilai PRESS dan RMSD, dengan membandingkan log 1/IC50 prediksi dengan log 1/C aktivitas. Validasi PRESS menggunakan data training set yang digunakan untuk mengetahui kualitas dan kemampuan memprediksi dari setiap model persamaan (Husna, 2013). Nilai PRESS didapatkan dari persamaan:
Persamaan yang memiliki PRESS terkecil dipilih sebagai persamaan yang terbaik untuk memprediksikan nilai aktivitas anti-inflammasi (-log 1/IC50). Berikut perbandingan nilai aktivitas eksperimen training set dengan nilai aktivitas prediksi empat model persamaan dan nilai PRESS dari tiap model dapat dilihat pada tabel 4.8.
Tabel 4.8. Perbandingan aktivitas eksperimen dan prediksi training set Log 1/IC50 Kode
Log 1/IC50 Prediksi (µM)
eksperimen (µM)
Model 1
A1
-0.380
-0.346
A2
-0.568
A4
Model 2
Model 3
Model 4
-0.387
-0.404
0.423
-0.603
-0.676
0.680
0.704
-0.681
-0.553
-0.613
0.616
0.656
A5
-0.699
-0.594
-0.647
0.647
0.681
A6
-0.716
-0.687
-0.741
0.750
0.773
A7
-0.785
-0.808
-0.853
0.861
0.871
50
A9
-0.898
-0.876
-0.929
0.946
0.982
A10
-0.924
-0.849
-0.896
0.910
0.920
A12
-1.076
-1.067
-1.108
1.116
1.172
A13
-1.267
-1.252
-1.288
1.276
1.285
A14
-1.330
-1.225
-1.277
1.289
1.291
0.048
0.030
0.032
0.050
PRESS Kemudian
dilakukan
validasi
RMSD
untuk
memvalidasi
kemampuan persamaan tersebut dapat digunakan untuk memprediksikan aktifitas. RMSD dihitungan dengan cara membandingkan nilai aktivitas eksperimen dengan nilai aktivitas prediksi dan nilai RMSD terbaik <2. Perhitugan RMSD mengikuti persamaan :
Validasi RMSD menggunakan test set yang berjumlah lima dengan kode A3, A8, A11 dan A15. Rekapitulasi RMSD dapat dilihat pada tabel 4.8. Tabel 4.9. Nilai RMSD test set Log 1/IC50
Log 1/IC50 Prediksi (µM)
Kode
Eksperimen (µM)
Model 1
Model 2
Model 3
Model 4
A3
0.613
-0.866
-0.929
-0.939
-0.966
A8
0.826
1.036
0.867
0.932
0.957
A11
1.029
-0.386
-0.486
-0.499
-0.511
A15
1.462
-0.851
-0.910
-0.902
-0.912
1.314
1.194
1.231
1.244
RMSD
Dari data tabel yang disajikan pada tabel, nilai RMSD pada setiap model <2 sehingga perlu untuk menentukan persamaan yang terbaik, maka nilai PRESS dibutuhkan untuk dapat menggambarkan suatu persamaan untuk dapat memprediksi aktivitas. Persamaan terbaik memiliki nilai terkecil dari empat persamaan HKSA, maka dipilihlah persamaan kedua dengan nilai PRESS 0.030 yang menjadi persamaan terbaik HKSA.
51
Berikut model persamaan 2 yang diperoleh dari perhitungan, dapat dituliskan sebagai berikut: Log 1/IC50 = -6.559 + 0.017*(Log P) – 0.025*(Indeks Harary) + 0.039 (MR) + 0.016*(Polarisabilitas) - 0.396*(ELUMO) + 0.427*(∆EHOMO-LUMO) N= 10; r= 0.982; r2 = 0.965; Fhit/tab = 2.967; SE = 0.085; RMSD = 1.1945; PRESS = 0.03029 Dari persamaan HKSA, terlihat deskriptor yang paling berpengaruh adalah ELUMO dan selisih HOMO-LUMO, hal tersebut bisa terlihat dari nilai koefisien yang besar. Menurut Tahir et al (2012), selisih HOMO-LUMO penting dalam penentuan indeks stabilitas molekul dan ELUMO berperan dalam afinitas molekul. Bila senyawa antiinflamasi sama dengan obat, maka kemudahan ikatan suatu obat pada sisi aktif dapat dipengaruhi dari substituent, jika suatu molekul dengan substiuen yang bersifat donor elektron maka kereaktifan suatu senyawa akan tinggi tetapi kestabilan akan berkurang dan afinitas molekul akan semakin besar. Namun, jika senyawa dengan substituent yang bersifat penarik elektron maka kereaktifan senyawa menjadi lemah dan memiliki kestabilan yang tinggi dan afinitas molekul akan semakin kecil sehingga akan lebih mudah obat akan berikat dengan sisi aktif.
-1.000
-0.500
Aktivitas prediksi
-1.500
0.000 0.000 -0.200 -0.400 -0.600 -0.800 -1.000 -1.200
Aktivitas eksperimen
-1.400
Gambar 4.2, Grafik korelasi antara aktivitas (Log 1/IC50) prediksi dan eksperimen dari 10 senyawa turunan asam sinamat. Berikut prediksi aktivitas antiinflamasi dari modifikasi amidasi dari etil p-metoksisinamat dengan model persamaan 2 :
52
Tabel 4.10. Hasil prediksi aktivitas antiinflamasi dengan HKSA Log 1/IC50 Kode
Senyawa
Prediksi
IC50 µM
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-phenylprop-2-enamide
1B
-0.677
4.750
-1.004
10.902
-0.739
5.479
-0.963
9.180
-1.199
15.807
(2E)-N-acetyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
2B
(Z)-2-[(2-hydroxyethyl)[(3E)-4-(4methoxyphenyl)buta-1,3-dien-2-yl]amino]ethen-1-ol
3B
(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide
4B
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
5B
Tabel 4.8. Nilai deskriptor senyawa amidasi EPMS (sample set)
53
Indeks Kode
Log P
1B
Indeks MR
Ehomo
Elumo
ΔEhomo-lumo
Polaris
Randic
Harary
abilitas
3.24
56.75
15.43
78.03
-8.724
-0.552
8.172
30.93
2B
1.23
43.44
12.91
61.74
-8.997
-0.670
8.327
24.47
3B
1.69
56.08
17.08
78.40
-8.549
-0.380
8.169
31.08
4B
0.82
42.95
13.81
63.24
-8.908
-0.495
8.413
25.07
5B
1.20
32.30
10.79
52.38
-8.869
-0.478
8.391
20.76
Dari prediksi amidasi EPMS yang ditampilkan pada tabel 4.7 dengan model persamaan 2, bahwa senyawa yang mempunyai potensi aktivitas antiinflamasi terbaik adalah senyawa 1B, 3B, dan 4B dengan nilai prediksi aktivitas sebesar 4.750 µM, 5.479 µM, dan 9.180 µM. 4.2. Penambatan Molekul (Molecular Docking) 4.2.1. Penyiapan Molekul Untuk melakukan penambatan molekul diperlukan suatu ligan (struktur) dan molekul (reseptor). Makromolekul yang akan digunakan diunduh dari Protein Data Bank (PDB= http://www.rcsb.org/) dan ligan dapat diunduh melalui www.pubchem.com. Reseptor yang akan digunakan adalah enzim siklooksigenase-2 (COX-2) pada hewan mencit (Mus musculus) dengan kode protein 1CX2 yang diperoleh dari difraksi sinar-X dengan resolusi 2.35 Å. Kemudian, reseptor (molekul) diunduh dengan format file .pdb. Molekul COX-2 yang telah diunduh, selanjutnya dihilangkan molekul-molekul air dan ligan-ligan yang terikat pada molekul. Pemisahan molekul agar proses penambatan tidak terganggu dan proses penambatan lebih cepat dan penghilangan ligan yang terikat pada molekul bertujuan agar interaksi dengan ligan yang akan ditambatkan. Penghilangan molekul air dan ligan melalui program Dicovery Studio, setelah itu disimpan dalam format .pdb. Reseptor (molekul) yang telah dihilangkan molekul air dan ligan, kemudian dioptimasi dengan menggunakan program Autodock Tools (Yanuar, 2012). Optimasi dilakukan agar pada saat proses penambatan (docking) dapat berjalan secara optimal dan menyesuaikan pada kondisi
54
sebenarnya didalam tubuh. Proses optimasi, yaitu penambatan molekul atom hidrogen dan penentuan grid dan parameter box. Penambahan molekul atom hidrogen pada molekul berfungsi untuk menyesuaikan suasana pH sel sehingga menjadi stabil dan penentuan grid box bertujuan untuk menentukan ruang penambatan antara ligan dan molekul. Ruang tambat merujuk pada penelitian yang dilakukan oleh Ekowati et al, 2010. Pengaturan grid box (posisi penambatan) meliputi center_x, center_y dan center_y, pengaturan parameter box (lokasi ruang tambat) meliputi size_x, size_y dan size_z dan pengaturan spacing atau pengaturan besar/kecilnya ukuran ruang tambat. Pengaturan grid box pada molekul center_x = 20.8; center_y = 24.9; center_x = 13.1, pengaturan parameter box pada molekul size_x = 28; size_y = 28; size_z = 28, sedangkan pengaturan spacing 1.000 Å. Setelah optimasi molekul selesai, file tersebut disimpan dengan format .pdbqt dan disimpan pada folder Vina. 4.2.2. Penyiapan Ligan Pada penelitian ini, ligan yang digunakan ada dua, yakni ligan yang dipakai sebagai kontrol positif dan ligan uji. Ligan yang dipakai sebagai kontrol positif adalah ibuprofen yang diunduh dengan format .sdf melalui situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov. Pemilihan ibuprofen sebagai kontrol positif karena ibuprofen selain memiliki aktivitas analgesik juga sebagai antiinflamasi dan struktur ibuprofen memiliki kesamaan bentuk dengan EPMS yaitu memilik 1 cincin aromatik dan memiliki gugus karbonil. Setelah itu dilakukan pemodelan ligan uji (struktur) EPMS dan penambahan molekul turunan amida pada EPMS dapat dilakukan dengan menggunakan program Marvin Skecth. Penambahan molekul amida pada EPMS dengan menghilangkan gugus etil yang terikat pada gugus karbonil, dimana proses amidasi merupakan proses suatu senyawa yang mempunyai nitrogen trivalent yang terikat pada suatu gugus karbonil (Mc Murry, 2008). Contoh senyawa dari turunan amida yakni anilini, asetamid, etanolamid, dietanolamid, dll. Ligan uji yang sudah dibuat, kemudian dioptimasi kedalam bentuk 3D agar ligan menjadi stabil dan disimpan kedalam format
55
.sdf. Karena dalam penambatan (docking,) format yang berlaku adalah .pdb maka format ligan dikonversi kedalam format .pdb dengan menggunakan program Open Babel. Ligan kontrol dan ligan uji yang telah dibuat, selanjutnya dioptimasi menggunakan program Autodock Tools. Optimasi ini sama dengan pada saat melakukan optimasi reseptor dan disimpan dengan format .pdbqt dan disimpan pada folder Vina. 4.2.3. Penambatan Molekul Penambatan molekul melibatkan reseptor 1CX2 dan ligan uji yang sudah dioptimasi sebelumnya dengan format file .pdbqt dan ditempatkan di dalam satu folder yakni Vina (C:/Vina). Pada tahap awal penambatan, dilakukan penentuan ruang tambat, lokasi tambat, dan ukuran ruang tambat yang kemudian dilakukan penyalinan yang dibuat di file notepad dengan nama file conf.txt. Didalam file conf.txt, dituliskan receptor, ligand, size (x,y,z), dan center sepeti pada gambar 4.3.
Gambar 4.3. Penulisan konfigurasi file dalam notepad
Penentuan lokasi penambatan dikutip berdasarkan jurnal Ekowati et al, yang menyatakan bahwa sisi aktif molekul pada center_x 20.8, center_y 24.9, dan center_y 13.1, dimensi 1.000 Å, dan ukuran ruang tambat (size) 28 x 20 x 20. Pada penelitian ini ukuran ruang tambat (size) diperbesar menjadi 30 x 30 x 30 agar mendapatkan pengikatan ligan yang lebih kompleks sehingga penambatan akan lebih maksimal. Pada receptor dan ligand dituliskan nama dari molekul dan ligan yang dipakai beserta format dari file tersebut dan pada out dituliskan out.pdbqt. Center (x,y,z) dan size (x,y,z) dituliskan berdasarkan grid box
56
parameter yang telah ditentukan pada saat optimasi molekul. Setelah semua tersedia (molekul, ligan, dan conf.txt) didalam satu folder, kemudian dilakukan penambatan menggunakan Autodock Vina. Autodock Vina dijalankan dengan menggunakan Command Prompt pada PC, kemudian ketikan pada
Command Prompt cd.. →cd.. →cd vina→vina --config
conf.txt --log log.txt.
Gambar 4.4. Pengaturan penambatan molekul menggunakan Vina
Proses penambatan (docking) selama 10 – 20 menit dan bisa lebih cepat tergantung dari spesifikasi PC/Laptop. Setelah penambatan, output yang keluar berupa log.txt yang berisi nilai dari energi Gibbs atau nilai afinitas, root mean square deviation (RMSD) dan out.pdbt yang berisi hasil penambatan antara molekul dengan ligan. Kemudian dilakukan visualisasi antara reseptor (1CX2.pqbqt) dengan out.pdbqt dengan melalui program Pymol dan Ligplot untuk melihat ikatan, posisi, dan jarak ligan dengan asam amino. 4.2.4. Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekul Setelah proses penambatan (docking) selesai, tahap berikutnya adalah menganalisa penambatan dan melakukan visualisasi. Untuk menganalisa penambatan antara ligan dan reseptor (molekul), ada beberapa parameter yang digunakan untuk menilai kualitas hasil penambatan, antara lain posing, scoring dan rangking (Arry Yanuar. 2012). Visualisasi penambatan dilakukan dengan memakai software Pymol (untuk melihat visualisasi tiga dimensi) dan Ligplot (untuk melihat visualisai dua dimensi serta jarak dari asam amino yang terikat). Berikut hasil visualisasi penambatan antara molekul dengan ligan pada tabel 4.11. Tabel 4.11. Hasil visualisai penambatan molekul (3D dan 2D) dengan ligan uji dan kontrol positif (Ibuprofen) ΔGbind Visualisasi 3D dengan Pymol
Visualisasi 2D dengan LigPlot
Kcal/mol
57
-7.8 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)N-phenylprop-2-enamide (1B)
-7.6
(2E)-N-acetyl-3-(4methoxyphenyl)prop-2enamide (2B)
-7.6
(Z)-2-[(2-hydroxyethyl)[(3E)4-(4-methoxyphenyl)buta-1,3dien-2-yl]amino]ethen-1-ol
(3B)
58
-7.0 (2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2enamide
(4B)
-6.9
(2E)-3-(4methoxyphenyl)prop-2enamide (5B)
-7.0
EPMS (6B)
59
Kontrol positif Ibuprofen
-7.5
*Untuk mempermudah perhitungan maka penamaan IUPAC diganti kode senyawa
Pada tabel 4.9, menunjukan visualisasi molekul COX-2 dengan ligan yang ditunjukan pada kolom visualiasi 3D dan 2D. Visualisasi bertujuan untuk melihat gambaran ligan terikat pada sisi aktif molekul dan kecocokan bentuk dan volume ligan yang tertambat pada molekul. Visualisasi secara 3D menggunakan Pymol, dalam hal ini pemakaian Pymol berfungsi agar dapat mempertegas kecocokan dari dari penambatan, sedangkan visualisasi secara 2D menggunakan LigPlot berfungsi untuk melihat gambaran jenis dari residu atau asam amino yang terikat pada ligan. Baik visualisasi 2D dan 3D mempunyai kegunaan yang sama, namun hanya cara visualisasi yang berbeda. Selain visualisasi, penambatan molekul dilihat dari besaran energi bebas atau afinitas yang diurutkan (peringkat) berdasarkan nilai RMSD. Dari hasil penambatan molekul dari 5 model ligan yang masingmasing ditambahkan senyawa turunan amida didapat nilai energi Gibbs (ΔGbind) dan RMSD (Root Mean Square Deviation) < 2, serta residu (asam amino) yang terikat pada ligan. Hasil penambatan dari lima model ligan akan menghasilkan masing-masing sembilan konformasi atau pola ligan yang tertambat yang kemudian diurutkan dari nilai afinitas (ΔGbinding site ) terendah hingga tertinggi yang dinamakan skoring, jarak ikatan antara ligan
60
dan asam amino yang terikat dan banyaknya sisi aktif amino yang terikat pada ligan. Pada tabel 4.9, nilai afinitas (ΔGbinding site) dari sembilan konformasi tiap ligan dengan nilai RMSD. RMSD berfungsi untuk mengukur perbedaan antara nilai prediksi dan nilai pengamatan eksperimen. Nilai RMSD dikatakan baik jika ≤ 2 Å, penyimpangan yang semakin besar, maka semakin besar kesalahan prediksi. Pada hasil akhir penambatan, maka akan menghasilkan sembilan konformasi. Nilai RMSD terbaik yang diperoleh dari penambatan masing-masing ligan adalah 0. Sehingga nilai afinitas terbaik dari hasil penambatan tiap ligan adalah yang memiliki nilai RMSD = 0. Nilai afinitas adalah Energi bebas atau afinitas menyatakan besaran suatu ligan terikat pada suatu molekul, semakin kecil nilai afinitasnya maka ikatan akan semakin kuat dan semakin besar nilai afinitasnya maka ikatan akan semakin renggang atau mudah lepas. Perbedaan dari nilai afinitas berdasarkan dari residu protein yang berinteraksi dengan ligan. Residu protein dikelompokan ke dalam 5 jenis berdasarkan struktur asam amino, yaitu ionik, polar, aromatik, dan hidrofobik. Residu ionik memberikan kontribusi terbesar dalam penentuan nilai ΔGbinding site, kemudia residu polar, aromatik, hidrofobik, secara berurutan (Schneider, Baringhaus & Kubinyi. 2008). Pada tabel 4.11, menunjukan rentang nilai afinitas berkisar -7.8 kcal/mol sampai -6.9 kcal/mol, dimana nilai afinitas terbaik adalah ligan 1B dari 5 ligan yang diujikan. Namun, bila dibandingkan dengan kontrol positif (Ibuprofen), hanya 3 ligan yang mempunyai nilai afinitas terbaik dari kontrol positif, yakni: 1B, 2B, dan 3B. Akan tetapi ligan-ligan lain memiliki nilai afinitas yang kecil namun mendekati kontrol positif (Ibuprofen). Ini menunjukan bahwa ligan uji senyawa amidasi EPMS memiliki potensi yang sama dengan ibuprofen sebagai antiinflamasi. Besaran nilai afinitas yang berbeda-beda berdasarkan dari sifat substiuen yang terikat pada struktur EPMS dan jenis asam amino yang terikat. Dari interaksi terhadap residu dapat dihubungkan dengan nilai
61
afinitas (ΔGbinding site) yang diperoleh. Selain nilai afinitas dari penambatan molekul, juga dilihat dari jarak ikatan dan sisi aktif residu yang mengikatnya menurut Kurumbail et al, sisi aktif (active site) dari molekul COX-2 (PDB:1CX2) adalah Ala516, Arg120, Arg513, Gln192, His90, Ile517, Leu384, Leu531, Phe318, Phe518, Ser530, Trp387, Tyr385, Tyr355, Val116, Val434, dan Val434. Tabel 4.12. Interaksi molekul ligan dengan asam amino terikat. Molekul
Asam amino terikat
Kontak residu Asn382, Thr212, His214, Phe210,
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-
Asn382, Trp387
His386, His388,
N-phenylprop-2-enamide
Leu390, Ala199,
(1B)
Leu391, Gln203, His207 Val523, Gly526, Met522, Trp387,
(2E)-N-acetyl-3-(4-
Tyr355, Arg120
Ser530, Ala527,
methoxyphenyl)prop-2-
Val349, Leu359,
enamide (2B)
Val116, Leu531, Met113 Gln192, Leu352, Ala516, Ser530,
(Z)-2-[(2-hydroxyethyl)[(3E)-
His90, Tyr385
4-(4-methoxyphenyl)buta-1,3-
Ser353, Phe518, Tyr348, Gly526,
dien-2-yl]amino]ethen-1-ol
Trp387, Val349,
(3B)
Ala527, Val523, Tyr355 Ala516, Tyr355,
(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-
His90, Tyr385
Gln192, Val523,
methoxyphenyl)prop-2-
Phe518, Leu352,
enamide (4B)
Gly526, Trp387,
62
Ser530, Ala527, Val349, Ser353. Ser353, Leu352, (2E)-3-(4-
Ser353, Leu352,
Ser530, Gly526,
methoxyphenyl)prop-2-
His90
Tyr385, Ala527,
enamide (5B)
Tyr355, Val532. Ser530, Tyr348,
EPMS (6B)
Tyr385, Arg120
Ala527, Leu531, Tyr355, Val349, Trp387,Leu352, Leu352, Ser530, Val349, Gly526, Leu531, Val116,
Kontrol Positif Ibuprofen
Tyr385
Leu359, Tyr355, Arg120, Ala527, Tyr348.
*Warna merah menunjukan sisi aktif asam amino COX-2 (PDB: 1CX2) Pada ligan (1B), menunjukan interaksi penambatan pada molekul COX-2. Ligan terikat dengan residu Asn382 dan Trp387 dan jarak dari ligan dengan residu masing – masing adalah 3.26 Å dan 2.85 Å. Ikatan hidrogen menjadi sangat lemah jika melebihi >3Å, hal itu ditunjukan dengan terikatnya residu Asn382 yang terikat pada atom oksigen digugus metoksi. Pada residu Trp387 yang terikat pada atom oksigen digugus karboksilat, ikatan hidrogen sangat kuat karena sifat dari asam amino Trp387 bersifat hidrofobik dan atom oksigen yang berfungsi sebagai penarik elektron. Pada senyawa uji ini, pose docking tidak berada pada sisi aktif enzim COX-2. Docking ligan (1B) menghasilkan nilai afinitas/energi bebas sebesar -7.8 kcal/mol. Pada ligan (2B), menunjukan interaksi pengikatan pada molekul COX-2. Ligan terikat dengan residu Try355 dan Arg120 dengan jarak ikatan masing-masing 2.94 Å dan 2.85 Å yang terikat pada atom oksigen pada gugus karboksilat sehingga ikatan cukup dekat dan sangat kuat. Selain itu
63
pose docking senyawa uji pada COX-2 berinteraksi dengan sisi aktif yakni Arg120, Tyr355, Val116 dan Leu531. Hasil dari docking menunjukan nilai afinitas sebesar -7.6 kcal/mol. Pada ligan (3B), menunjukan interaksi pengikatan pada molekul COX-2. Ikatan hidrogen terjadi pada gugus metoksi, dimana residu His90 berikatan pada atom oksigen digugus metoksi dengan jarak ikatan adalah 2.83 Å . Selain itu, terdapat interaksi ikatan hidrogen yang lemah antara residu Tyr385, dimana jarak ikatan antara residu dengan ligan adalah 3.06 Å (>3Å). Pose docking senyawa uji berinteraksi pada sisi aktif COX-2, yakni: Ala516, His90, Phe518, Tyr385, Tyr355 dan Val523. Hasil docking menunjukan nilai afinitas sebesar -7.6 kcal/mol. Pada ligan (4B), menunjukan interaksi pengikatan pada molekul COX-2. Ligan terikat dengan residu His90 dengan jarak ikatan 2.90 Å yang terikat pada atom oksigen pada gugus metoksi, dimana residu His90 bersifat polar maka akan cenderung berikat dengan atom yang bersifat elektrofil. Residu Tyr385 dengan jarak ikatan 2.93 Å yang terikat pada atom oksigen pada gugus –OH. Pose docking senyawa uji berinteraksi pada sisi aktif, yakni: Ala516, His90, Tyr355, Ser353, dan Tyr385. Hasil nilai afinitas setelah docking adalah -7.0 kcal/mol. Pada ligan (5B), menunjukan interaksi pengikatan pada molekul COX-2. Ligan terikat dengan residu Ser353, Leu352 dan His90 dan jarak antara ligan dan masing-masing residu berjarak >3Å (3.06 Å, 3.05 Å, dan 3.19). Jarak yang terlalu jauh (>3 Å) membuat ikatan hidrogen akan menjadi sangat lemah dan energi yang dikeluarkan akan sangat besar pula. Pose docking senyawa uji berinteraksi pada sisi aktif COX-2, yakni: Ser530, Tyr355, His90, dan Val523. Hasil dari docking menunjukan nilai afinitas sebesar -6.9 kcal/mol. Pada ligan (6B) atau ligan EPMS, menunjukan interaksi pengikatan pada molekul COX-2. Residu Tyr386 berikatan pada atom oksigen digugus ester dan atom oksigen pada gugus karboksilat dengan jarak ikatan 3.06 Å dan 3.14 Å. Selain itu, residu Arg120 berikatan dengan atom oksigen pada gugus metoksi dengan jarak ikatan 3.03 Å sehingga energi yang dibutuhkan
64
besar. Pose docking EPMS berinteraksi dengan sisi aktif COX-2, yakni: Arg120, Ser530, Trp387, Tyr385, Tyr355, Leu531. Hasil dari docking menunjukan nilai afinitas sebesar -7.0 kcal/mol. Tabel 4.13. Jenis asam amino yang terikat pada ligan Ikatan Molekul Ionik Polar Aromatik Hidrofobik (2E)-3-(4His214, Thr212, Phe210, Leu390, methoxyphenyl)-NHis386, Gln203, Trp387 Ala199, phenylprop-2-enamide His207, Asn382 His388. (1B) Met522, Gly526, (2E)-N-acetyl-3-(4Val523, methoxyphenyl)prop-2Arg120 Ser530 Trp387, Ala527, Tyr355 Val349, enamide (2B) Val116, Met113, Leu531. Phe518, Leu352, (Z)-2-[(2Ser353, Tyr385, Ala516, hydroxyethyl)[(3E)-4-(4His90 Ser530, Trp387, Gly526, methoxyphenyl)buta-1,3Gln192. Tyr355, Val349, dien-2-yl]amino]ethen-1Tyr348. Ala527, ol (3B) Val523. (2E)-N-(2-hydroxyethyl)His90 Ser353, Phe518, Val523, 3-(4-methoxyphenyl)propSer530. Tyr385, Ala527, 2-enamide (4B) Trp387, Val349, Tyr355. Gly526 (2E)-3-(4Ser353, Tyr385, Val523, methoxyphenyl)prop-2His90 Ser530. Tyr355. Leu352, enamide (5B) Ala527, Trp387, Leu531, EPMS (6B) Arg120 Ser530 Tyr385, Val349, Tyr348, Ala527. Tyr355. Leu352 Leu531 Tyr385 Leu359 Kontrol ibuprofen Arg120 Ser530 Tyr348 Val349 Tyr355 Val116 Gly526
65
Ala527 Menurut Ekowati et al (2013), ada dua kriteria hasil penambatan terbaik, yakni: senyawa uji memiliki energi ikatan paling rendah dan secara geometris menempati active site (sisi aktif) yang sama dengan ligan yang terdapat pada molekul terkait sebelumnya dalam hal ini ligan S58 yang tertambat pada COX-2 (PDB: 1CX2). Dari enam ligan yang ditambatkan, ligan 1B mempunyai nilai afinitas (energi ΔEGibbs) yang sangat kecil yaitu 7.8 kcal/mol dan ligan 5B mempunyai nilai afinitas (energi ΔEGibbs) yang sangat besar yaitu -6.9 kcal/mol. Ligan 1B mempunyai energi ΔEGibbs yang kecil karena lebih banyak asam amino yang bersifat ionik menghadap ligan, sedangkan ligan 5B mempunyai energi ΔEGibbs yang besar karena jumlah asam amino yang menghadap ligan sedikit sehingga akan mempengaruhi energi ΔEGibbs. Banyaknya asam amino yang bersifat ionik dan hidrofobik akan mempengaruhi besar kecilnya energi ΔEGibbs. Selain energi ΔEGibbs, penempatan ligan pada sisi aktif digunakan sebagai kriteria hasil penambatan terbaik. Menurut Kurumbail et al (1996), sisi aktif dari hasil penambatan ligan S58 dengan COX-2 adalah Ala516, Arg120, Arg513, Gln192, His90, Ile517, Leu384, Leu531, Phe318, Phe518, Ser530, Trp387, Tyr385, Tyr355, Val116, Val434, dan Val434. Dari enam ligan termasuk EPMS, hanya ligan 1B yang tidak menempati sisi aktif COX-2 dan hanya terikat dengan salah satu asam amino dari sisi aktif, yakni Trp387. Sisi aktif dianalogikan sebagai ruang katalitik yang bertindak sebagai mekanisme reaksi, dalam hal ini reaksi inflamasi. Dalam perancangan suatu obat oral mengikuti aturan Lipinski atau yang lebih dikenal Rule of Five Lipinski’s. Ada 5 hal dalam aturan Lipinski, yakni: 1. Berat molekul tidak lebih 500 2. Tidak lebih dari 5 ikatan hidrogen donor 3. Tidak lebih dari 10 ikatan hydrogen aseptor 4. Log P = 5 Enam senyawa uji (ligan) termasuk EPMS yang telah di docking, kemudian masing-masing dicari nilai dari Rule of five menggunakan Marvin
66
sketch dan hasil dari perhitungan dapat dilihat pada tabel 4.11. Pada tabel, hanya ligan 2B, 3B dan 4B tidak memenuhi kriteria dan ligan lain memenuhi kriteria sehingga memungkinkan aktif secara klinis diberikan secara oral. Tabel 4.14. Tabel Rule of Five Lipinski’s ligan yang di dockings Ligan
Log P
H-donor
H-aseptor
Berat molekul
1B
3.24
1
4
78.03
2B
1.69
1
6
78.40
3B
1.23
2
7
61.74
4B
0.82
2
6
63.24
5B
1.20
0
4
52.38
6B
2.40
2
4
59.86
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1.
Kesimpulan 1. Dari analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA) dengan metode MLR, diperoleh deskriptor yang mempengaruhi aktivitas antiinflamasi dari 10 senyawa turunan asam sinamat yakni Log P, ELUMO, EHOMO-LUMO, Polarisabilitas, dan Indeks Harary dan didapatkan model persamaan: Log 1/IC50 = -6.559 + 0.017*(Log P) – 0.025*(Indeks Harary) + 0.039 (MR) + 0.016*(Polarisabilitas) - 0.396*(ELUMO) + 0.427*(∆EHOMO-LUMO) Dengan n = 10; r = 0.982; r2 = 0.965; Fhit/tab = 2.967; SE = 0.085; RMSD = 1.1945; PRESS = 0.03029 Aktivitas antiinflamasi tertinggi dari lima senyawa amidasi EPMS dengan model persamaan HKSA adalah senyawa 1B sebesar -0.677. 2. Hasil penambatan molekul dari lima senyawa amidasi EPMS dan EPMS terhadap COX-2 menunjukan nilai afinitas (ΔEGibbs) terbaik dan pose terhadap sisi aktif COX-2, maka terpilihlah ligan 2B dan 3B dengan nilai afinitas sebesar -7.5 kkal/mol yang telah dibandingkan dengan ibuprofen (-7.5 kkal/mol). Ligan lainnya (4B, 5B, dan EPMS) tidak termasuk ligan 1B, mempunyai aktifitas antiinflamasi yang sama dengan energi ikatan mendekati energy ikatan ibuprofen.
5.2.
Saran 1. Perhatikan keseragaman data uji in vitro yang akan digunakan untuk membangun model HKSA 2. Software yang akan digunakan untuk menghitung nilai deskriptor dalam membangun model HKSA, 3. Hasil dari penambatan molekul (in silico) hanya sebatas memberikan gambaran interaksi, sehingga perlu kajian lanjutan berupa pengujian secara laboratorium baik secara in vitro atau in vivo
67
DAFTAR PUSTAKA Accelrys Enterprise Platform. (2005). Introduction to the Discovery Studio Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc. Barus, Rosbina, 2009. Amidasi Etil p-metoksisinamat yang Diisolasi dari Kencur (Kaempferia galanga L.). Tesis. Sekolah Pascasarjana USU. Medan. Champe, P. C. & Harvey, R. A. (2007). Lippincott's Illustrated Reviews: Biochemistry 4th edition. New York: Lippincott Wiliams & Wilkins. Da Cunha, Fernanda M et al. 2004. Caffeic Acid Derivatives: In Vitro and In Vivo Anti-inflammatory Properties, Free Radical Research, Vol. 38 (11): 1241 – 1253. Dash, Pritesh Ranjan. 2014. In Vivo Cytotoxic and In Vitro Antibacterial Activities of Kaempferia galanga L., Vol. 3 (1): 172 – 177. De Lano, W. L., & Bromberg, S. (2004). PyMOL User's Guide. San Carlos, California, U.S.A: DeLano Scientific LLC. Devillers, J., Domine, D., Guillon, C., Bintein, S. dan Karcher, W., 1997, Prediction of Partition Coefficients (logPoct) Using Autocorrelation Descriptors, SAR QSAR Environ. Res., Vol 7, 151 – 172. Ekowati, Juni et al. 2012. Structure Modification Of Ethyl p-Methocycinnamate and Their Biossay As Chemopreventive Agent Againts Mice’s Fibrosarcoma. Int J Pharma Pharma Sci, Vol. 4, (Suppl. 3): 528 – 532. Ekowati, Juni., Nurul W. Diyah. 2013. Aktivitas Antinociceptiv dan Uji In Silico Terhadap Cyclooxygenase dari Asam p-Metoksisinamat dan Asam mMetoksisinamat. Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol. 2 (1): 32 – 39. Fessenden & Fessenden. 1999. Kimia Organik Ed. 3. Jakarta: Erlangga. Ganiswarna, Sulistia G. 1995, Farmakologi dan Terapi. Jakarta: Gaya Baru. Geisteiger, John. 2003. Handbook of Chemoinformatics Vol. 1.Germany: WileyVCH. Hames, D., & Hooper, N. 2005. Biochemistry Thirdth Edition. Leeds, UK: Taylor & Francis Group.
68
69
Hasanah, Aliya Nur., Fikri Nazaruddin., Ellin Febrina., dan Ade Zuhrotun. 2011. Analisis Kandungan Minyak Atsiri dan Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Kencur (Kaempferia galanga L.), Vol. 16, 3. Bandung. Hertiani, Triana., Sylvia Utama Tunjung Pratiwi., Iramie Duma Kencana Irianto., Aini Febriana. 2010. Kaempferia galanga L. Rhizome As a Potential Dental Plaque Preventice Agent, ISCC, Vol. 1: 19 – 25. Husna, Ridhatul., Emdeniz., Imelda. 2013. Studi Toksisitas Floroanilim Berdasarkan Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas (HKSA)Beberapa Amina Aromatis. Jurnal Kimia Unand. Vol. 2: 2303 – 3401. Katritzky, A.R., Karelson, M., dan Lobanov, V.S., 1996, Quantum-Chemical Descriptors in QSAR/QSPR Studies, J. Am. Chem. Soc. Vol 96 (3): 1027 – 1044. Kee, Joyce L & Evelyn R. Hayes. 1996, Farmakologi: Pendekatan Proses Keperawatan. Jakarta: Penerbit Buku Kedoktan EGC. Kerns, Edward H and Li Di. 2008. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods.Elsevier Inc. UK. Kurumbail et al. 1996. Structural Basic for Selective Inhibition of Cyclooxygenase2 by Anti-inflammatory Agents. Letters to Nature, Vol 384. Leach, A.P., 1996, Molecular Modelling, Principles and Applications, Addison Wesley Longman Limited, Singapore. Liu, Zhiqian et al. 2014. Synthesis, Preliminary Bioevaluation and Computasional Analysis of Caffeic Acid Analogue, Int. J. Mol. Sci. Vol. 15: 8808 – 8820. Lodish, H., et al. (2008). Molecular Cell Biology Sixth Edition. New York: W.H. Freeman and Company. Lucic, B., Milicevic, A., Nikolic, S., dan Trinajstic, N., 2002, Harary Index – Twelve Years Later, Croatica. Chem. Act., Vol. 75 (4), 847-868. McMurry, John. 2008. Organic Chemistry Ed. 7. United State of America: Thomas Learning, Inc. Mukesh, Bachwani & Kumar Rakesh. 2011. Molecular Docking: A Review, Vol. 2, (6): 1746 – 1751.
70
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry Fifth Edition. New York: W.H. Freeman and Company. Nguyen, Phi-Hung et al. 2014. Isolation of Benzoic and Cinnamic Acid Derivatives from The Grains of Sorghum Bicolor and Their Inhibition of Lipopolysaccharide-induced Nitric Oxide Production in RAW 264.7 Cells, Food Chemistry, Vol. 168 (2015): 512 – 519. O’Boyle, N. M., Banck, M., James, C. A., Morley, C., Vandermeersch, T., & Hutchison, G. R. (2011). Open Babel: An open chemical toolbox. Journal of Cheminformatics. Patrick, G. 2001. Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific Publisher. Patrick, Graham L. 2009. An Introduction to Medicinal Chemistry Fourth Edition. New York, United State of America: Oxford University Press. Petsko, G., & Ringe, G. (2003). Protein Structure and Function (Primers in Biology). United Kingdom: New Science Press. RCSB. (2014, March 10). About the PDB Archive and the RCSB PDB. Retrieved from Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=general_information/about_pdb/in dex.html Reck. R. A. 1984. Marketing and Economic of Oleochemical to The Plastic Industry. J. Am. Oil Chem. Soc. Rifai, Abdul Aziz., Kasmui., Subianto Hadisaputro. 2014. Kajian HKSA Senyawa Turunan Deoksubenzoi Terhadap Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisa Regresi Multilinier. Indo. J. Chem. Sci, Vol 3 (3). Sharma, Prateek. 2011. Cinnamic Acid Derivatives: A New Chapter of Various Pharmacological Activities. J. Chem. Pharm. Res, Vol. 3 (2): 403 – 423. Setyawan, Eko., Pandhu Putratama., Asriningtyas Ajeng., dan Wara Dyah Pita Rengga. 2012. Optimasi Yield Etil p-Metoksisinamat Pada Ekstraksi Pleoresin Kencur (Kaempferia galanga L.) Menggunakan Pelarut Etanol. Vol. 1, (3). Sirisangtragul, Wanna & Bungorn Sripanidkulchai. 2011. Effects of Kaempferia galanga L. and ethyl-p-methoxycinnamate (EPMS) on Hepatic
71
Microsomal Cytochrome P450s Enzyme Activities in Mice. SJST, Vol. 33 (44): 411 – 417. Siswandono & Bambang Soekardjo. 2000, Kimia Medisinal Ed. 1. Surabaya: Airlangga University Press. Smith, H. J. & Simons, C. (2005). Enzymes and Their Inhibition: Drug Development. Florida: CRC Press. Sumardjo, Damin. 2009, Pengantar Kimia. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Tahir, Iqmal., Karna Wijaya., Bambang Purwono dan Dinni Widianingsih, 2003. QSAR Study of Flavone/Flavonol Analogues as The Antiradical Compound Based on Hansch Analysis. Indonesia Journal of Chemistry., Vol. 3 (1): 48 – 54. Tahir, Iqmal., Nur Fatimah., Ria Armunanto. 2012. Analisis Hubungan Kuantitatif Struktur dan Aktivitas Antitoksoplasma Senyawa Analog Kuinolon Menggunakan Deskriptor Teoritik. Sains dan Terapan Kimia. Vol. 6 (2): 139 – 153. Trott, O & Olson, A. J. (2010). Autodock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. National Institute of Health. Todeschini, Roberto., Viviana Consonni. 2009. Molecular Descriptors for Chemoinformatics, Volume I & II. Wiley-VCH. UK. Umar et al. 2012. Bioactivity – Guided Isolation of Ethyl-p-methoxycinnamate an Anti-Inflammatory Constituent, from Kaempferia galanga L. Extracts, Molecules, Vol. 17: 8720 – 8734. Umar et al, 2014. Ethyl-p-methoxycinnamate Isolated From Kaempferia galanga Inhibits Inflamation by Suppressing Interleukin-1, Tumor Necrosis Factor-α, and Angiogenesis by Blocking Endothelial Functions. Clinics, Vol. 69 (2): 134 – 144. Winter. A. 2005. Organic Chemistry for Dummies. Wiley Interscience. New York. Zukhurullah, Mukhtasyam., Muhammad Aswad., Subehan. 2012. Kajian Beberapa Senyawa Antiinflamasi: Docking Terhadap Siklooksigenase-2 Secara In Silico. Majalah Farmasi, Vol 16 (1): 37 – 44.
LAMPIRAN
73
Lampiran 1. Alur penelitian HKSA dan penambatan molekul ALUR PENELITIAN HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR-AKTIFITAS
Input Training Set
Proses Membangun Model
Model
Test Set
Validasi Model
Model Tervalidasi
Struktur Uji
Output
Memakai model untuk meramalkan aktivitas
RAMALAN Nilai Aktivitas
74
ALUR PENAMBATAN MOLEKULAR (MOLECULAR DOCKING)
Penyiapan Ligan Amidasi EPMS
Penyiapan Makromolekul COX-2
Pembuatan ligan dengan Marvin Sketch dan simpan dalam format .pdb
Makromolekul diunggah melalui situs www.pdb.org
Ligan dan Makromolekul dioptimasi dengan Autodock Tools simpan dalam format .pdbqt
Simpan dalam satu folder Vina dan buat file konfigurasi file dengan notepad, beri nama conf.txt
Analisa visualisasi untuk melihat bentuk, volume dan kecocokkan dengan menggunakan Pymol
Analisa interaksi molekul dan ligan dengan menggunakan LigPlus
75
Lampiran 2. Tabel rekapitulasi perhitungan deskriptor hidrofobik, sterik, dan elektronik 15 senyawa turunan asam sinamat Indeks
Indeks
Harary
Randic
4.84
61.80
2A
3.23
3A
MR
EHOMO
ELUMO
ΔE(HOMO-LUMO)
Polarisabilitas
IC50
Log 1/IC50
19.70
84.74
-8.938
-0.789
8.149
33.59
2.4
-0.380
65.37
15.97
80.24
-9.010
-0.756
8.254
31.80
3.7
-0.568
3.11
67.05
14.82
75.10
-9.076
-0.875
8.201
29.77
4.1
-0.613
4A
3.53
64.77
16.88
81.43
-8.950
-0.811
8.139
33.28
4.8
-0.681
5A
2.73
75.68
18.04
87.72
-8.887
-0.477
8.410
34.77
5.0
-0.699
6A
3.16
65.37
17.11
84.70
-8.370
-0.529
7.841
33.58
5.2
-0.716
7A
2.34
47.21
15.14
68.06
-8.849
-0.575
8.274
26.98
6.1
-0.785
8A
3.06
20.74
19.23
95.55
-8.378
-0.554
7.824
37.88
6.7
-0.826
9A
3.65
76.79
16.03
80.55
-9.094
-0.854
8.240
31.75
7.9
-0.898
10A
2.96
47.21
14.70
66.21
-8.935
-0.795
8.140
26.24
8.4
-0.924
11A
3.75
51.94
14.55
73.30
-9.001
-0.704
8.682
28.95
10.7
-1.029
12A
1.95
40.09
12.20
56.94
-8.935
-0.799
8.136
25.57
11.9
-1.076
13A
0.71
44.14
12.07
55.34
-9.098
-1.015
8.082
21.93
18.5
-1.267
14A
1.59
36.53
10.95
52.31
-8.951
-0.823
8.128
20.73
21.4
-1.330
15A
1.71
46.99
13.72
64.52
-9.123
-0.857
8.266
25.57
29
-1.462
Sinamat
Log P
1A
76
Lampiran 3. Hasil analisi korelasi antara deskriptor dengan aktivitas biologis
77
Lampiran 4. Hasil analisis MLR dengan Training Set
78
79
Lampiran 5. Struktur 3D protein COX-2
Struktur 3D COX-2 dengan kode PDB: 1CX2 (Sumber : http://www.rcsb.org/pdb)
80
Lampiran 6. Prosedur kerja penambatan molekul (molecular docking) a. Penyiapan protein Pengunduhan makromolekul COX-2 dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul yaitu 1CX2. Data makromolekul diunduh dalam format .pdb.
1. Pemisahan Makromolekul Air dan Ligan Pemisahan menggunakan Discovery Studio 3.5 Visualizer. Setelah dipisahankan, kemudian simpan dalam format .pdb.
“Pilih Script → selection → Select water molecules/Select ligand molecules”
81
“Save as → ke folder Vina (C:/Vina) → 1CX2.pdb” 2. Optimasi makromolekul Optimasi makromolekul dilakukan dengan menggunakan Autodock Tool dan buka makromolekul yang disimpan dalam format .pdbqt (file → read molecule → 1CX2.pdb). Optimasi dengan penambahan hidrogen.
“Edit → Hydrogen → add”
82
“Diatur sesuai konfigurasi diatas” 3. Gridbox parameter Pengaturan dilakukan dengan grid box (grid → grid box) yang meliputi ukuran (size x, y, z), kordinat (center x, y, z) dan, besarnya ukuran (amstrong) dan simpan (file → close saving current).
“Grid → macromolecule → choose → 1CX2 → select molecules”
83
“Save as → 1CX2.pdbqt”
Dilakukan pengaturan grid box “Grid → grid box → grid options” (konfigurasi disesuaikan seperti diatas). Kemudian pilih “File → closing saving current” b. Penyiapan Ligan Senyawa amidasi EPMS dibuat dengan menggunakan Marvin Sketch. Kemudian struktur diubah ke dalam bentuk 3D (structure → clean 3D → clean in 3D) disimpan dengan format .pdb.
84
“Save as → ligan. (file of type diubah menjadi Protein Data Bank/PDB)”
File yang sudah dibuat, kemudian dioptimasi di Autodock. “Ligand → input → Open → ligan.pdb
85
Simpan ke dalam folder Vina. “Ligand → output → save as .pdbqt” c. Penambatan Molekul Molekul dan ligan dengan format .pdbqt ditempat didalam satu folder Vina yang telah berisi vina.exe, vina_split.exe, dan vina license.rtf.
1. Buat pada notepad dengan nama “conf.txt”, yang berisikan ligand (=ligand.pdbqt), receptor (=1CX2.pdbqt), output, center (x,y,z), size (x,y,x).
Isi conf.txt disamakan dengan pengaturan grid box sebelumnya
86
2. Penambatan dijalankan melalui Vina
Ketik perintah “cd.. (enter) →cd.. (enter) →cd vina (enter) → vina --config conf.txt --log log.txt (enter)”
d. Analisa dan visualisasi penambatan molekul 1. Hasil kalkulasi penambatan berupa energi ΔEGIBBS
Buka file “log.txt” akan terbuka melalui notepad
87
2. Visualisasi dengan menggunakan Pymol
Inputkan file “1CX2.pdbqt dan Out.pdbqt” secara bersama. (file type diganti All file agar memudahkan pencarian.
Pilih “Action/A (all) → preset → ligand sites → transparent (better)”
88
Pilih “Show/S (pada out.pdbqt) → sphere” e. Analisa Interaksi ligand dan makromolekul
Buka Command prompt dan ketikan seperti dibawah ini:
Pilih “out_ligan_1.pdbqt dan 1CX2.pdbqt, kemudian buka file tersebut di Wordpad.
89
Copy seluruh isi didalam file ligand.pdbqt, kemudian paste kan didalam file 1CX2.pdbqt
“Save as → plain text document → nama file diganti out-1CX2.pdb (save)”
90
Klik “File → open (pilih PDB) → browse → out-1CX2.pdb (open) → run”
Interaksi antara ligan dengan asam amino. (interaksi antara ligan 1B dengan COX-2)
91
Lampiran 7. Data hasil docking Autodock Vina Ibuprofen Mode
Affinity (kcal/mol)
Dist from RMSD L. B.
Best mode RMSD L. B.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
-7.5 -7.2 -6.9 -6.8 -6.8 -6.5 -6.4 -6.2 -6.1
0.000 1.888 2.995 15.322 1.636 2.572 2.299 14.948 2.896
0.000 2.611 6.411 16.646 2.708 3.137 2.849 16.539 3.675
Ligan 1B dengan substituent anilin Mode
Affinity (kcal/mol)
Dist from RMSD L. B.
Best mode RMSD L. B.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
-7.8 -6.9 -6.5 -6.3 -6.1 -6.1 -6.1 -6.0 -5.9
0.000 17.590 21.196 20.196 15.997 17.801 2.234 22.005 16.110
0.000 21.935 23.355 22.355 18.493 19.462 2.706 23.527 18.491
Ligan 2B dengan substituent asetamid Mode
Affinity (kcal/mol)
Dist from RMSD L. B.
Best mode RMSD L. B.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
-7.6 -7.3 -7.1 -7.0 -7.0 -6.5 -6.4 -6.3 -6.1
0.000 2.212 15.782 2.044 4.467 4.245 1.406 12.882 17.164
0.000 7.344 17.062 7.413 6.283 7.229 1.633 13.615 20.685
92
Ligan 3B dengan substituent dietanolamid Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Affinity (kcal/mol) -7.5 -7.0 -6.9 -6.5 -6.3 -6.3 -6.2 -6.2 -5.9
Dist from RMSD L. B. 0.000 3.667 16.220 3.443 15.356 11.595 14.352 11.308 10.546
Best mode RMSD L. B. 0.000 5.352 19.080 5.164 16.874 13.815 17.301 13.543 12.228
Ligan 4B dengan substituent etanolamid Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Affinity (kcal/mol) -7.0 -6.9 -6.8 -6.7 -6.6 -6.3 -6.1 -5.8 -5.7
Dist from RMSD L. B. 0.000 2.450 14.326 3.708 3.615 2.322 2.825 3.572 11.669
Best mode RMSD L. B. 0.000 6.863 15.760 5.181 5.335 6.528 6.356 6.729 13.322
Dist from RMSD L. B. 0.000 14.519 3.961 14.351 13.486 2.233 3.376 14.349 2.931
Best mode RMSD L. B. 0.000 16.002 6.532 16.695 14.714 3.149 3.968 15.172 3.219
Ligan 5B dengan substituent urea Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Affinity (kcal/mol) -6.9 -6.9 -6.6 -6.6 -6.6 -6.5 -6.3 -6.2 -6.1
93
Etil p-metoksisinamat/EPMS (6B) Mode
Affinity (kcal/mol)
Dist from RMSD L. B.
Best mode RMSD L. B.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
-7.0 -6.9 -6.8 -6.8 -6.7 -6.6 -6.5 -6.5 -6.3
0.000 4.219 14.357 1.767 14.385 13.432 3.864 13.943 15.121
0.000 6.687 16.159 6.965 16.047 16.688 4.941 15.746 19.572
