Sledování farmakofenotypu pomocí monitorování plasmatických hladin léčiv v onkologii jakou součást komplexního farmakogenetického testování.
Dalibor Valík Masarykův onkologický ústav, Brno
…kolaborativní projekty • • • • •
Dr. J. O´Brien, Prof. J. Štěrba, Dr. M. Radina, Dr. D. O´Kane, Dr. Steve Wong,
• Dr. A. van Kuilenburg
BGL, Mayo Clinic, KDO FN Brno OC NJ DCBI, Mayo Clinic Medical College of Wisconsin AMC Amsterdam
Clinical variables contributing to variation in drug response: • Age
• Sex
• Diet
• Organ function
Host genome (drug-related toxicity)
Genetic variation
Individualized dose/regimen Tumor genome (drug response)
…chronické, dlouhodobé medikace • …tam se nejvíce projeví sumační efekty (interakce, komorbidita, genetické vlivy, apod.) • psychiatrie • onkologie • antikoagulační terapie
Koncepty, pojmy • .hladina xenobiotika • ..biomarker (indukovaná molekula, metabolit, ale také klinický endpoint) • …aktivita limitujícího enzymu • ….genová struktura genů kódujících zúčastněné enzymy.
BĚŽNÁ KLINICKÁ PRAXE stanovení dávky vychází v naprosté většině případů z přepočtu na tělesný povrch pacienta - (BSA - Body Surface Area) LIMITY ?? ….stupeň korelace mezi BSA a dalšími farmakokinetickými parametry jako např. Clearance nebo AUC (Area Under Curve)
FARMAKOKINETIKA
akronym LADME v osudu léčiva • L(iberation) = uvolnění z podané formy (tablety, čípky, im, iv aplikace • A(bsorption) = proces, kdy je molekula vychytána do systémové cirkulace, (tento koncept neplatí pro iv podání léčiva) • D(istribution) = jakmile je lék absorbován a rozptýlen v plasmě může dále: – zůstat v krevním prostoru (vazba na proteiny) – opouštět krevní prostor a vstupovat do extravaskulární tekutiny – migrovat do různých orgánů
• M(etabolism) – proces biotransformace léku většinou do podoby hydrofilní, polárnější, a tak lépe eliminovatelné • hlavními orgány biotransformace jsou: – játra, ledviny (mikrosomální enzymy) » koncept prodrug > active drug (CFM > 4-OH,CFM)
• E(limination) – finální exkrece léku • ve formě parentální sloučeniny nebo biotransformovaných metabolitů • cesty eliminace – moč, žluč, expirovaný vzduch, sliny, pot, mateřské mléko
METABOLICKÉ BIOTRANSFORMACE •reakce fáze I (léčivo se proměňuje v polárnější metabolit připojením nebo odhalením funkčních skupin: •-OH, -NH2, -SH •reakce fáze II (tvorba vysoce polárních konjugátů se snadnou eliminací): •hlavním metabolickým orgánem jsou játra (ale i GIT, plíce, kůže, ledviny)
FARMAKODYNAMIKA
Zabývá se interakcí léčivo - receptor
Kaf Aktivní lék v místě receptoru
receptor Kdiss
…chemotherapy = „guided toxicology“ • essentially, all anticancer agents have narrow therapeutic index – their toxicity can be regarded as • general: – an inherent feature of a cytotoxic compound(s) used
• individual: – a feature of intraindividual variation, or susceptibility in „general“ toxicity
host response versus tumor response • host response: – referred to as pharmacogenetics/genomics
• tumor response: – referred to rather as „predictive oncology“
patient as a host – essentially, any tumor can be killed if sufficiently exposed to cytotoxic drug(s) • however, this is seldom compatible with „in vivo“ achievable dosage enabling survival of a host – nevertheless, this has led to „dose escalation concepts“ leading to high-dose chemotherapy
Conventional chemotherapy – …hitting various nails by the same hammer..
Toxicity is limiting
=
myelosupression…SCR ?
High-dose chemotherapy and BM transplantation:
…only a bigger hammer…?
tumor as target • „targeted therapeutics“, – focused against selective determinants present and/or active in the tumor, but not normal tissues » ! recent issues on EPO…
• list of compounds is growing – herceptin as a prototype drug, now heading to adjuvant chemotherapy
Common comorbidities interfering with anticancer treatment – – – – – – –
Hypertension Diabetes mellitus Dyslipidemia Heart disease and stroke Chronic kidney disease Drugs, alcohol and parapharmaceuticals abuse Viral infections and their sequelae (hepatitis, etc)
– …all often having detrimental influence on function of parechymal organs important in metabolism • …more significant in older patients
realizing complexities of pharmacogenetics • …we are facing to: • polygenic models with significant nongenetic component (typically: chronic diseases of parenchymal organs) – multiple mechanisms influence a single trait – …SNPs not enough… (W.Evans, 2007)
…příklady farmakogenetických determinant protinádorové chemoterapie • …připomeňme, že: • …jde většinou o enzymy jaterní tkáně hostitele zapojené v reakcích fáze I. a II.
CYTOCHROM P 450 • mikrozomální enzym zapojený v I. fázi metabolických přeměn při oxidativních procesech •hemoprotein, ve své redukované formě (Fe++ ) váže oxid uhelnatý a tvoří komplex maximálně absorbující světlo vlnové délky 450 nm ( Omura, Sato 1964 )
•řada izoenzymů - nomenklaturní systém založený na rozdílné sekvenci aminokyselin •izoenzymy označovány CYP ( CYtochrom P450 ) 1A1
Drugs Metabolized (in part) by CYP2D6 Beta Blockers: carvedilol S-metoprolol propafenone timolol Antidepressants: amitriptyline clomipramine desipramine imipramine paroxetine Antipsychotics: haloperidol perphenazine risperidone=>9OH thioridazine zuclopenthixol
alprenolol amphetamine aripiprazole atomoxetine bufuralol chlorpheniramine chlorpromazine codeine (=>OdesMeth) debrisoquine dexfenfluramine dextromethorphan duloxetine encainide flecainide fluoxetine fluvoxamine lidocaine metoclopramide
methoxyamphetamine mexilletine minaprine nebivolol nortriptyline ondansetron oxycodone perhexiline phenacetin phenformin promethazine propranolol sparteine tamoxifen tramadol venlafaxine http://medicine.iupui.edu/flockhart /table.htm
CYP2D6 Problems • Allelic drop-outs • (currently ~0.1%)
• Gene Deletions • Both copies of the gene can be deleted
• Gene Conversions • CYP2D6 can be converted by CYP2D7P • Can produce intron 1 conversions or conversions elsewhere in the CYP2D6 gene • These may or may not amplify with or extend the usual primers
• Neogenes • Hybrid genes: 5’-CYP2D6/CYP2D7-3’ • Hybrid genes: 5’-CYP2D7/CYP2D6-3’
• CYP2D6 Duplications • Which alleles are duplicated in heterozygous cases • Can be determined by fluorescence ratios in most cases • New test for gene duplications developed (J. Black)
Tamoxifen Prodrug Metabolism SULT1A1
SULT1A1
Goetz, M. P. et al. J Clin Oncol; 23:9312-9318 2005 Copyright C 2005 American Society of Clinical Oncology
CYP 3A4 •
původně popsán na příkladu rozdílné oxidace nifedipinu Kleinbloesem CH., van Brummelen P., Faber H., 1984
•
teniposid, etoposid
•
cyklofosfamid, ifosfamid
•
vinkristin, vinblastin, vindesin
•
paclitaxel a docetaxel
Inter-individuální variabilita v metabolizaci paclitaxelu v závislosti na rozdílné expresi izoenzymů P 450 paclitaxel CYP2C8 6-alfa-hydroxypaclitaxel
CYP3A4 3´- OH paclitaxel
URIDIN DIFOSFÁT GLUKURONYLTRANSFERASA (UGT)
• početnější rodiny enzymů katalyzujících glukuronidaci řady endogenních substrátů a xenobiotik • UGT1 (glukuronidace bilirubinu a fenolů) • UGT2 (NSAID, morfin, zidovudin)
UGT1 a IRINOTECAN, CPT 11 • derivát camptothecinu, inhibice topoizomerázy I irinotecan karboxylesteráza
SN38 UGT 1A1
SN38 glukuronid
Irinotecan Summary •
CYP3A metabolizes Irinotecan in part
•
Irinotecan activated by carboxylesterases
•
SN-38 is active drug, blocks DNA replication
•
SN-38 inactivated by glucuronidation
•
SN-38 conjugate secreted into bile and the intestines
UGT1A SN-38glucuronide
UGT1A1 TA Promoter Repeats
5 6 7 8
5-FLUOROURACIL a (DPD)
FdUMP - inhibice TS 5-fluorouracil
FUTP - RNA
dihydropyrimidindehydrogenaza (DPD)
5-DFHU (neúčinný metabolit)
DIHYDROPYRIMIDINDEHYDROGENAZA
• 10 - 20 % 5-FU se vylučuje nezměněno močí • až 80 % 5-FU je metabolizováno na 5-FDHU pomocí DPD • ?? % zůstane k dispozici pro biotransformaci na fluoropyrimidinnukleotidy pro vlastní cytotoxický efekt ?? ….je obtížné dosáhnout klinické odezvy bez navození významné systémové toxicity….
Fluoropyrimidiny v terapii kolorektálního karcinomu: data MOÚ
plasma AUCs (5-FU, DHFU) AUC 5-FU (mmol.l-1.min-1) 4.0
AUC DHFU (mmol.l-1.min-1) B
3.5 B
3.0
2.5
B
Values in log scale: LN [X + 1]
A A
A
II
III
A
2.0
2.5 2.0
3.0
A
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
0.5 0.0 I
II
III
IV
0.0 I
IV
Ratio of AUC values: 5-FU / DHFU 1.8
C
1.6
95 % Confidence limits
1.4
BC
1.2
B
Mean value
1.0 0.8
A
A-C: marks of statistical significance Variants marked by the different letter are mutually statistically significant (p < 0.05).
0.6 0.4 0.2 0.0 I
II
III
IV
Table 5. Genomic data in relation to CHT-related adverse effects (pilot examination, N = 23) Adverse effects severity score 1 - all % calculated within columns I-II (N = 8) III - IV (N = 15) Total number of mutations per patient 1 2–3 4-5
p level 2
0% 50 % 50 %
20 % 40 % 40 %
75.0 %
40.0 %
75.0 %
40.0 %
0.103
50.0 %
46.7 %
0.878
75.0 %
46.7 %
0.126
75.0 % 0% 0%
53.3 % 6.7 % 6.7 %
0.185
0.180
Exon sequence variants 3 Exon 2 c. 85 T>C (T85C) Exon 6 c. 496 A>G (A496G) Exon 7 IVS7-118 A>G Exon 23.3A c. 3947 G>A (G3947A) Exon 23.3B c. 3959 C>T (C3959T) c 4079 T>C (T4079C) c. 4059 T>C (T4059C) 1
0.127
Score aggregating frequency and grade of toxic events, increasing from degree I (no toxic effects of CHT) to IV (severe effects of high grade, elevated in time); see also Table 2. Groups III and IV were summed due to similarity of data. 2 p level of applied statistical tests: M-L χ2 test for association between genomic data and toxicity scoring 3 Only exons with relatively frequent mutations that allow statistical processing are included.
interim results •
AUC5-FU/AUCDHFU
was the best indicator of toxicity
– unfortunately: it is not a predictive test » but, it is probably the only test capable of indicating also deficiency of DHP (van Kuilenburg, Clin.Cancer Res, 2003)
• significant interpatient variability in DPYP gene – lacking relation to clinically manifest toxicity
• ongoing prospective study > data on efficacy being collected
…významným příspěvek ke studiu efektu fluoropyrimidinů..? • 18-fluorothymidin • ..jde o pozitronový zářič vhodný k in vivo studiím pacientů s onkologickými onemocněními • …marker proliferace
Biomarkery odpovědi na terapii v dětské onkologii HDMTX – hcys, folát asparaginasa – L-asparagin amphotericin B – hladina ?
Plasmatické hladiny AmphB u pacientů s projevem akutní toxicity AMB total (ug/ml) 2,50 2,00 1,50 AMB total (ug/ml) 1,00 0,50
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
0,00
Sledování farmakodynamických ukazatelů terapie asparaginasou u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií a s non-Hodgkinskými lymfomy 1
P. Růžičková1, D. Mendelová1, D. Valík2, A. Mikušková3, J. Štěrba1 Klinika dětské onkologie, LF MU a FN Brno; 2 Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ Brno, 3 OKBH FN Brno
Asparaginasa je jednou ze základních komponent léčby ALL a NHL u dětí. Je to enzym, který hydrolyzuje aminokyselinu asparagin na kyselinu asparagovou a amoniak. Pro lymfoblasty je asparagin esenciální aminokyselinou (nedostatečná aktivita asparagin synthetasy). Po podání asparaginasy dojde ke snížení hladiny asparaginu v plazmě a tím i jeho nabídka lymfoblastům, sníží se tvorba proteinů a sekundárně i syntéza nukleových kyselin, zablokuje se progrese buněčného cyklu ve fázi G1, nedochází k další proliferaci buněk, indukce apoptózy. Druhy asparaginasy: - bakteriální protein izolovaný ze 2 druhů bakterií 1) E.coli (Elspar, Kidrolase, Medac) 2) Erwinie (Erwinasa) 3) pegylovaná asparaginasa (Oncaspar) – chemicky upravená nativní E.coli asparaginasa kovalentně vázaná s monomethoxypolyethylenglykolem (PEG) - méně alergizující, delší poločas rozpadu v plazmě, prodloužená aktivita - klesá množství jednotlivých dávek asparaginasy potřebných k udržení dostatečné deplece asparaginu v plazmě - použití u pacientů s alergickou reakcí na nativní asparaginasy (díky dlouhému poločasu rozpadu se udrží požadovaná deplece asparaginu v plazmě dostatečně dlouhou dobu i za přítomnosti protilátek) Cíl: Plazmatická hladina asparaginu je farmakodynamickým ukazatelem efektu terapie asparaginasou. Monitorování hladin asparaginu v plazmě po podání jednotlivých preparátů asparaginasy v průběhu indukční a reindukční fáze léčby dětí s ALL a NHL a srovnávání jejich účinnosti, sledování změn v koagulačních parametrech, vliv tvorby protilátek na plazmatické hladiny asparaginu a případné ovlivnění hladin asparaginu v plazmě po podání substituční léčby plnou krví, mraženou plazmou, fibrinogenem nebo AT III. Metodika: - odběr 2 ml periferní krve vždy před podáním asparaginasy, po odběru na led a okamžitý transport do laboratoře, kde ihned proběhne separace elementů od plazmy a příprava vzorku, aby nedocházelo k falešnému poklesu koncentrace asparaginu - použití metody iontově výměnné chromatografie (molekuly aminokyselin jsou separovány na ionexové koloně) - plazma pacienta je smíchána s deproteinizačním činidlem, vysrážené proteiny se ze vzorku odstraní, deproteinát s pufrem určitého pH je nanesen do kolony - NH3+ skupiny aminokyselin reagují se záporně nabitými skupinami ionexu, jsou z kolony postupně vymývány pomocí 6-ti pufrů o zvyšujícím se pH - molekuly aminokyselin jsou separovány podle kyselosti (jako 1. vycházejí z kolony nejkyselejší aminokyseliny) - postkolonově probíhá reakce s ninhydrinem (maximum absorbance je při vlnové délce 570 nm) - eluát z kolony prochází fotometrem a je měřena absorbance při 570 nm - koncentrace dané aminokyseliny v plazmě je úměrná ploše jejího píku
Odběry vzorků: - Protokol I/I´ : den +12, +15, +18, +21, +24, +27, +30, +33, +36, +39, +41, +45 - Protokol II : den +8, +11, +15, +18, +22, +29 - Protokol III : den +1, +4, +8, +11, +17, +24
Celkový soubor: Celkem je do souboru zařazeno 18 dětí léčených na Klinice dětské onkologie FN Brno od 1/05 do 8/06 s diagnosou ALL a NHL. 16 dětí je léčeno dle protokolu ALL-IC 2002 a 2 děti dle protokolu NHL BFM 95.
Výsledky: 1) pacientům byly podány 3 druhy preparátů asparaginasy ve standartním dávkování dle daných protokolů: - Elspar (medián doby deplece asparaginu v plazmě 8 dní, interkvartilový rozsah 3-10 dní) - Medac (medián doby deplece asparaginu v plazmě 12 dní, interkvartilový rozsah 12-14 dní) - Oncaspar (medián doby deplece asparaginu v plazmě 14 dní, interkvartilový rozsah 9-23 dní) 2) alergické reakce v souboru pacientů s ALL : - 10 dětí mělo v průběhu léčby alergickou reakci - 3 děti jsou zatím v reindukční fázi, 1 dítě v konsolidační fázi protokolu - 2 děti alergickou reakci neměly - nejčastěji se alergická reakce projevila při zahájení reindukční fáze protokolu - u 7/10 pacientů, u nichž se projevila alergická reakce, došlo k depleci asparaginu v reindukci po kratší dobu - u 1 chlapce bez známek alergické reakce dochází v průběhu reindukce ke zkrácení doby deplece asparaginu v plazmě (tzv. „silent inactivation“) 3) sledování změn v koagulačních parametrech : - v případě nedostatečné deplece asparaginu v plazmě byl potvrzen vzestup AT III nad 120% v 9/14 případů (aniž by byl AT III substituován)
Závěr: 1) ve sledovaném souboru jsme pozorovali významné diference v mediánu navození a trvání deplece asparaginu 2) další akvizice dat pokračuje 3) pilotní data neukazují, že by substituce plné krve, AT III, fibrinogenu nebo čerstvé mražené plazmy ovlivňovala plazmatickou hladinu asparaginu 4) získaná data by mohla přispět k individualizaci léčby, k maximalizaci terapeutického účinku a k minimalizaci nežádoucích vedlejších účinků
Systemic MTX in the treatment of children with ALL/NHL consensus – lack of consensus • Important part of the treatment… • MTX dosage, administration schedule, drug exposure time: may influence efficacy and toxicity of MTX containing regimen.
• Importance of trials like e.g. COG AALL 0232 • Proper dosing and scheduling of MTX +/-LV remains to be defined
• Accurate MTX dosing and timing • Need for leucovorin rescue – if any..? • Timing and dosing of leucovorin following HD MTX - how much is too much? • Timing of LP in relation to MTX/leucovorin timing
…after methotrexate MTX Homocysteine
DHF
DHFR
5-CH3-THF
THF
Methionine
dTMP TS
B12 MS
SAH
DNA synthesis
MTHFR
dUMP
5,10-CH2-THF
SGHMT
Formate
Glycine Serine AICARFT GARFT
PURINES
10-CHO-THF
5,10=CH-THF 5-CHO-THF
16
*
*
8 4
-1
*
40
* 20
24 18
36 30
48 42
60 54
72 66
84 78
96 90
p < 0.001 Variance ratio: 20.8 %
-1
*
* * *
* *
*
80
p < 0.001 Variance ratio: 87.2 %
-1
12
16
8
60
±1.96*Std.0Err.12 24 36 48 60 72 84 96 6 18 30 42 54 66 78 90 Mean
Methotrexate (μmol . l )
0
20
12
p < 0.001 Variance ratio: 88.81 %
80
0
6
Homocysteine (μmol . l )
*
12
0
BLOCK 2
* *
p < 0.001 Variance ratio: 32.3 %
*
Methotrexate (μmol . l )
20
-1
Homocysteine (μmol . l )
BLOCK 1
60
*
40
20
4
*
0
0
FIGURE 1A
0 12 24 36 48 60 72 84 96 ±1.96*Std. Err. Time (hours) 6 18 30 42 54 66 78 90 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Mean 6 18 30 42 54 66 78 90 95 % Confidence limits
Geometric mean
B. Folate > 10 nmol.l-1
Homocysteine
25
25
B
-1
-1
(average AUC, μ mol.1 .h )
A. Folate ≤ 10 nmol.l-1
20
20
AB
15
15
A 10
10
5
5
0
0 I
II
III
A
I
A
A
II
III
Methotrexate (average AUC total, μ mol.1-1.h-10h -?) I. < 1000; II. 1000 - 1599; III. ≥ 1600 95 % Confidence limits
Geometric mean
FIGURE 4
Our contribution: • PK studies comparing MTX 5 g/24h to 2 g/24h and to Capizzi MTX schedule – the phenomenon is there, study is accruing.
• single cell studies – p53 activation • plasma samples SELDI assessment
ABBOTT versus ROCHE
MTX plasma levels (80 parallel events) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
10
20
30
40
50
60
70
0,1 0,11 0,11 0,12 0,12 0,12 0,13 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,17 0,18 0,18 0,18 0,18 0,19 0,21 0,21 0,23 0,23 0,25 0,25 0,28 0,28 0,31
0,21 0,17 0,18 0,24 0,21 0,14 0,29 0,28 0,32 0,29 0,37 0,23 0,21 0,29 0,32 0,22 0,22 0,25 0,33 0,31 0,39 0,42 0,44 0,37 0,49 0,39 0,44
Both made by major manufacturers, both approved for in vitro diagnostic use A method for measurement is not usually specified within protocols.. The answer how to best incorporate MTX into the treatment protocols is not yet known, and important questions regarding the timing and dosing of both MTX and LV rescue remains unanswered. New studies for old drug still needed.., despite our fascination by TKI etc..
….the reality is that • A method for measurement is not usually specified within protocols • ….probably cannot be strictly recommended on the manufacturer principle
Skarby TV, et al: High leucovorin doses during high-dose methotrexate treatment may reduce the cure rate in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2006 Nov;20(11):1955-62.
• HDMTX treatment of 445 children with ALL. • …that high LV dose is related to higher risk for relapse. Doubling of the LV dose increased the relapse risk by 22% (95% confidence interval 1-49%, P = 0.037). 0.037 • …results suggest that high doses of LV increase the risk for relapse despite the fact that they were correlated with high MTX levels and longer MTX elimination time.
farmakogenotypizace 2007…kde pramení deziluze …? – …pojmy: » farmakogenetika versus prediktivní onkologie
– …často pouze suplement fenotypových testů: » Warfarin+INR, UGT1A1+bilirubin, antihypertensiva+TK
– …relevantní biomarkery: » prof. Lindpaintner…“genotype may be the wrong place to look for biomarkers for drug response…“ (BMJ 2007:3,334)
– …čas: » tamoxifen versus inhibitory aromatázy,…co se bude používat v klinice ?
„!“ Common comorbidities interfering with anticancer treatment – – – – – – –
Hypertension Diabetes mellitus Dyslipidemia Heart disease and stroke Chronic kidney disease Drugs, alcohol and parapharmaceuticals abuse Viral infections and their sequelae (hepatitis, etc)
– …all often having detrimental influence on function of parechymal organs important in metabolism • …more significant in older patients
we may rather go towards evaluating • rate phenomenons: rates of drug activation and elimination relations on an individual basis – irinotecan > SN38 > SN38 glucuronide
• biomarkers, if available – pretreatment plasma folates, Hcys, antifolates, their biotransformation » the most known example: warfarin, CYP2C9/VKOR and INR
• downstream phenomenons – such as induction of critical cellular events (p53 ?), provided that those events relate to the action of a drug – „collateral damage“ » treatment induced disturbances in plasma low-molecular proteome etc.
evidence-based medicine versus
personalized medicine – >…can these concepts be compatible ..? – EBM is built on robust group (populational) statistics, which has led to treatment protocols » whereas personalized medicine operates with rate of deviation from „group average“
• >>?…relevance of studying personalized medicine using standard clinical trial methodology – …back to studying „personifiable“ variations… – to adopt some degree of toxicity as efficacy marker…?
Děkuji za pozornost …thank you for your attention !
