Biomarkery v onkologii

Biomarkery v onkologii

Šárka Svobodová, Martin Pešta, Ondřej Topolčan, Judita Kinkorová

Editoři: Marie Karlíková, Ondřej Topolčan

Biomarkery v onkologii

Biomarkery v onkologii Autoři: Šárka Svobodová, Martin Pešta, Ondřej Topolčan, Judita Kinkorová Editoři: Marie Karlíková, Ondřej Topolčan

Publikace byla vytvořena za podpory projektu CZ1.07./2.3.00/09.0142.

2

Autoři

Autoři MUDr. Šárka Svobodová, Ph.D. 3. interní klinika a 1. Lékařská fakulta UK Praha RNDr. Martin Pešta, Ph.D. Centrální radioizotopová laboratoř, Lékařská fakulta UK v Plzni Fakultní nemocnice Plzeň Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta UK v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň Doc. RNDr. Judita Kinkorová, Ph.D. Národní informační centrum pro evropský výzkum, Technologické centrum AV ČR RNDr. Marie Karlíková, Ph.D. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta UK v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň

Editoři RNDr. Marie Karlíková, Ph.D. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta UK v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta UK v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň

3

Obsah

Obsah Předmluva ........................................................................................................................................................ 5

1.

Kancerogeneze ............................................................................................................................. 6 1.1.

Maligní transformace buňky ......................................................................................................... 6

1.2.

Molekulárně genetická podstata maligní transformace buňky ................................................. 8

1.3.

Růst nádoru a mechanismus metastazování .............................................................................. 12

2.

Biomarkery................................................................................................................................. 15

3.

Nádorové markery...................................................................................................................... 17 3.1.

Co jsou nádorové markery? ........................................................................................................ 17

3.2.

Význam nádorových markerů .................................................................................................... 17

3.3.

Indikace a interpretace nádorových markerů ........................................................................... 18

3.4.

Klinicko-biochemické rozdělení nádorových markerů ............................................................ 25

Onkofetální antigeny .................................................................................................................. 25 Cytokeratinové nádorové markery ............................................................................................. 26 Enzymy ...................................................................................................................................... 27 Hormony .................................................................................................................................... 28 Ostatní blíže nespecifikované látky ........................................................................................... 29 Nádorové markery spojené s buněčnou proliferací, diferenciací a metastazováním ................. 30 Markery spojené se signální transdukcí ..................................................................................... 30 Angiogenní faktory .................................................................................................................... 30 Adhezívní molekuly ................................................................................................................... 30 Markery spojené s apoptózou .................................................................................................... 30 Matrixové metaloproteinázy a jejich inhibitory ......................................................................... 30 Tkáňové nádorové markery ....................................................................................................... 30 Cirkulující nádorové buňky (CTC) ............................................................................................ 31 Metody izolace CTC .................................................................................................................. 32 Typizace CTC ........................................................................................................................... 33 4.

Shrnutí ........................................................................................................................................ 34

5.

Literatura .................................................................................................................................... 34

4

Předmluva

Předmluva

Rozvoj znalostí o etiopatogenezi nádorového procesu znamenal významný zvrat v diagnostice a léčbě nádorového onemocnění. Důsledkem těchto změny bylo podstatné zlepšení kvality života, které bylo vzápětí následováno prodloužením disease free intervalu a tím nejdůležitějším, celkovým přežitím. Platnost těchto tvrzení je obecná a v konkrétním případě (u každého jednotlivého nemocného) závisí na typu a lokalizaci nádoru, agresivitě onemocnění a toleranci léčby. Nejdůležitějším pro volbu terapie je však stádium nádoru při první návštěvě lékaře. Z toho vyplývá nutnost optimalizace časné diagnostiky, která co nejlépe umožní charakterizovat nádor. Je zapotřebí mít biomarkery, které by umožnily stanovit prognózu nemocného, optimalizovat léčbu a predikovat její efekt. Je pochopitelné, že současná medicína ani zdaleka všechna tato přání nesplňuje. Cílem této monografie je seznámit čtenáře se současným stavem problematiky a ukázat, jaké možnosti existují v rutinní praxi a jaké budou na základě existujícího

výzkumu perspektivy blízké

budoucnosti. Monografie vychází z principu biologie nádoru. Po úvodní kapitole je převážná část monografie věnována problematice biomarkerů. Neklademe si za cíl podat čtenáři vyčerpávající rešerši, ale naopak probudit jeho zájem o existující problémy, kterým se bude pak - ať již pouze studiem nebo vlastní výzkumnou činností - podrobně věnovat.

Ondřej Topolčan

V Plzni, 2012

5

Maligní transformace buňky

1. KANCEROGENEZE Šárka Svobodová, Martin Pešta Kancerogeneze je mnohastupňový proces přeměny normálních buněk v buňky nádorové. Je to kumulace genetických, epigenetických, biochemických a dalších změn, které umožňují nádorovým buňkám selekční růstovou výhodu a vrcholí invazivním růstem a metastazováním.

1.1. Maligní transformace buňky Proliferace buněk je velmi pečlivě řízena tak, aby odpovídala potřebám celého organismu. V časných stádiích života jedince kapacita množení buněk převažuje nad jejich zanikáním, v dospělosti je v dynamické rovnováze a ve stáří začíná převažovat involuce. Pro různé typy buněk je proces množení odlišný: např. buňky sliznice tenkého střeva nebo leukocyty se obnovují během několika dnů, erytrocyty mají životaschopnost 120 dnů. Hepatocyty či nervové buňky zanikají zřídka a nemají regenerační schopnosti vůbec. Pokud se však buňky vymknou kontrole replikace (tj. neodpovídají na vnější signály kontrolující proces dělení), změní se v buňky nádorové. Pokud si i přesto tyto buňky zachovají svůj vzhled i funkci a zůstávají na místě, kde vznikly, jsou to buňky benigní a dávají vznik benigním tumorům. Buňky, které ztratily většinu svých původních vlastností (ztráta diferenciace) a mají snahu pronikat dále do svého okolí (invazivita) i na vzdálená místa (metastazování), jsou buňkami maligními a dávají vznik maligním nádorům. Přeměna tkáně organismu do stavu invazivní nádorové choroby trvá v průměru 5 – 10 let a je ovlivněna hereditárními genetickými faktory a somatickými epigenetickými faktory (kap. 1.2). Průběh kancerogeneze se člení do tří stádií: Iniciační stadium, tj. prvotní genetická událost, kdy dochází k mutaci kritického genu. Je to období časově velmi krátké, ale nevratné. Buňka tím získává potenciál maligní transformace. V tomto stádiu se může proces ještě zastavit. Promoční stadium, které trvá léta až desetiletí. Klon postižených buněk je stimulován k ještě intenzivnější proliferaci. Promoční faktory nejsou samy o sobě schopny vyvolat nádorovou transformaci, jen ji podpořit. Intenzita promočních mechanismů musí dosáhnout určitého stupně,

6

Maligní transformace buňky

aby byl iniciovaný klon stimulován. Po odstranění vlivu těchto faktorů se může proces kancerogeneze zpomalit nebo i zastavit. Stádium progrese, kdy dochází dalšímu postupnému nahromadění genetických změn. Nádor zpočátku zůstává v místě svého vzniku, pak vlivem aktivace dalších faktorů dochází k dalšímu šíření nádoru do okolí i do vzdálených míst (metastazování). Na obrázku 1 jsou znázorněna jednotlivá stádia spolu s produkcí různých typů nádorových markerů. Inicializační st.

Promoční st.

Růst

Dediferenciace

Aktivátory

CDK Ki-ras β-CTN

Normální b.

Stadium progrese

Invaze

MMP erB2

Integriny

THF-β

TF Tiam-1

Hyperplázie

Ca in situ

Metastazování

Mts-1 67-LR MUC-1

Invazívní ca

Metastatický ca

Supresory

DCC APC

p53

IGF-IIR

Rb

E-CAD/CTN Integriny

TIMPs

TIAM-1 TGF-βR-II

markery

Nádorové

CA 19-9 TK

CEA

CA 72-4

Cytokeratininy

CA 242

TK TPS

Obrázek 1 Schematické znázornění jednotlivých etap kancerogeneze a produkce nádorových markerů v jednotlivých etapách kolorektálního karcinomu. Upraveno podle Holubec 2002a, Kaušitz et al. 2003, Masopust et al. 2003. Vysvětlivky: CDK = cyklin dependentní kinázy; Ki-ras = onkogen Kirstenova sarkomového viru; β-CTN = β catenin, erB2 = onkogenní tyroxin kináza (ze skupiny EGFR); THF-β = transforming growth factor β; MMP = metaloproteinázy; TF = tkáňový faktor – aktivátor invazivity; Tiam-1 = aktivátor invazivity u lymfomových buněk a inhibitor invazivity u epiteliálních buněk; mts1 = gen kódující proteiny vázající kalcium; LR67 = lamininový receptor; MUC-1 = mucin stimulující adhezi nádorových buněk k endoteliálním buňkám; APC = protein adenomatózní polypózy tlustého střeva, IGF-IIR = inzulín-like growth factor II receptor; DCC = deleted in colorectal cancer, kódující transmembránový glykoproteid imunoglobulinů; p53 = jaderný protein tlumící replikaci poškozené DNA; Rb = retinoblastoma protein kódující fosfoprotein,který se podílí na regulaci buněčného cyklu; TGF-βR-II = typ II receptor pro TGF-β; E-CAD/CTN = E-cadherin/cateninový komplex.

7

Molekulárně genetická podstata maligní transformace buňky

1.2. Molekulárně genetická podstata maligní transformace buňky Přeměna normální buňky v nádorovou je způsobena postupným hromaděním genetických změn ve formě mutací vedoucích ke změnám v genech, které jsou důležité pro regulaci buněčného dělení, realizaci oprav poškozené DNA a spouštění programované buněčné smrti (apoptózy) buněk. V důsledku narušení signálních cest a deregulace funkce produktů výše zmíněných genů se buňka vymyká svému původnímu „programu“ a stává se nádorovou. Na procesu kancerogeneze a nádorové progrese se však podílí i řada dalších změn, které bezprostředně nemění sekvenci DNA. Tyto změny označujeme jako epigenetické. Mohou významně přispívat k nádorové transformaci a ovlivňovat tak chování nádoru.

Genetické změny Všechna nádorová onemocnění jsou způsobena abnormalitami v sekvenci DNA. Během života je DNA v lidských buňkách vystavena účinkům (např. fyzikálním, chemickým mutagenům nebo chybám při replikaci), které způsobují změny v její sekvenci. Náhodně může jedna z těchto somatických mutací změnit funkci genů spjatých s kontrolou buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy. Pokud v buňce dojde ke změně sekvence několika takových genů, buňka se vymaní ze svého buněčného cyklu a postupně se mění na nádorově transformovanou, dále se dělí a dává vznik nádorovému onemocnění. Je tedy zřejmé, že získání poškozené kopie některého z výše uvedených genů od rodičů, může způsobit vznik nádorové onemocnění dříve a s větší pravděpodobností. Genetické změny, vedoucí ke vzniku nádorového onemocnění, způsobují produkci pozměněných proteinů uvedených genů nebo těchto proteinů v neadekvátním množství. Nádorová onemocnění jsou způsobena dvěma základními typy genetických poškození. Jsou to: - dominantní mutace protoonkogenů a - recesivní mutace antionkogenů (tumor supresorů). Tato poškození se v průběhu transformace buňky v nádorovou kombinují.

8


Protoonkogeny se vlivem patologických mutací mění na onkogeny. O dominantních mutacích mluvíme proto, že k projevení „pronádorového efektu“ u konkrétního onkogenu stačí poškození alespoň jedné ze dvou jeho alel. Jako onkogeny nejčastěji působí geny podílející se na realizaci růstových stimulů nebo inhibujících apoptózu. Jednoduše se dá říci, že onkogeny jsou geny podporující dělení buňky. Jsou to například geny růstových faktorů (mutace β-řetězec PDGF u astrocytomů a osteosarkomů), receptorů pro růstové faktory (mutace EGFR u karcinomy plic), geny přenašečů signálů vázaných na membránu (mutace K-ras u kolorektálního karcinomu), mutace cytoplazmatických přenašečů signálů (mutace c-raf-1), mutace jaderných transkripčních faktorů (cmyc u Burkittova lymfomu a dalších B-lymfomů). U onkogenů jsou nalézány bodové mutace nebo delece DNA, které způsobují syntézu změněného, abnormálního, genového produktu – onkoprotein. Takto vzniklý onkoprotein může například stimulovat buňku k růstu, bez ohledu na vnější signály. Dalším typem změn DNA onkogenů jsou genové translokace (přesun části genů) způsobující vznik zkrácených nebo fůzních genů, jejichž produkty (onkoproteiny) vykazují abnormální funkci. Dále jsou u onkogenů nalézány změny ovlivňující regulaci jejich genové exprese. Jsou to amplifikace genů pro onkogeny nebo inzerce retrovirů se silnými retrovirovými promotory do promotorových oblastí těchto genů. Tyto změny způsobují nepřiměřenou produkci strukturně nezměněné formy normálního proteinu – abnormální transkripci. Protože tumor supresorové geny (antionkogeny) jsou geny kontrolující dělení či diferenciaci buněk nebo podílející se na opravách poškozené DNA, jejich nefunkčnost se projeví až při poškození obou alel daného tumor supresorového genu, proto hovoříme o recesivních mutacích. Takto definoval tumor supresorové geny Alfred Knudson již v roce 1971 svojí „Teorií dvou zásahů“: pro vývoj nádoru je nutná ztráta funkce obou alel příslušného tumor supresorového genu. V roce 1997 Kenneth W. Kinzler a Bert Vogelstein rozdělili tumor supresorové geny na tzv. „Gatekeeper“ (vrátný) – tumor supresorový gen, který přímo reguluje růst, a „Caretaker“ (strážce) – gen podílející se na opravách DNA. Epigenetické změny Jsou to změny, které postihují molekulu DNA nebo chromatin (komplex DNA a některých proteinů v jádru buňky), ale na rozdíl od mutací nejsou změnami sekvence nukleotidů. Tyto změny však ovlivňují realizaci genetické informace (expresi genů). Mohou tak dosáhnou podobného účinku jako mutace v příslušných genech. Postihují-li tyto epigenetické změny geny zapojené v procesech

9


růstu buněk a opravy genetické informace a spouštění apoptózy, pak se může výsledný efekt rovněž podílet na procesu nádorové transformace. Epigenetické změny v současnosti zahrnují: -

procesy metylace DNA,

-

chemicky podmíněnou změnu v uspořádání chromatinu (tzv. remodelace chromatinu),

-

interference RNA.

Metylace DNA Proces, při němž se za účasti enzymu váže metylová skupina na vybrané nukleotidové baze, se označuje jako DNA metylace. Tímto procesem se vytváří v normálních tkáních metylační vzorec DNA, který se ustanoví během embryonálního vývoje. Cílovou molekulou pro metylaci jsou cytosinové base v CpG dinukleotidech. Metylace DNA se může uplatňovat v procesu nádorové transformace prostřednictvím několika mechanizmů: -

Hypermetylace DNA má za následek umlčování genů v důsledku inhibované vazby transkripčních faktorů (obr.2). Na proces kancerogeneze má největší vliv inaktivace nádorově supresorových genů hypermetylací, přičemž výsledný efekt je podobný jako v případě mutací těchto genů. V kolorektálním karcinomu byla popsána hypermetylace promotorů DNA genů podílejících se na opravách DNA. Metylace DNA může být příčina bodových mutací. U metylovaného cytosinu proběhne spontánní deaminace na tymin. Vyskytuje-li se tato C-T tranzice v kódující oblasti genů regulujících buněčný růst a přežití buňky, může změna funkce těchto genů přispět k nádorové transformaci buňky. Tyto mutace bývají časté zejména v genu TP53, jak bylo popsáno např. u kolorektálního karcinomu či u karcinomu prsu.

-

Naopak hypometylace DNA může způsobit genomickou instabilitu v důsledku aktivace dříve neaktivních genů nebo prostřednictvím poklesu metylace v repetitivních a pericentrozomálních oblastech, vznikají zlomy DNA nebo numerické chromozomální aberace.

10


Obrázek 2 Metylace DNA má za následek umlčování genů v důsledku inhibované vazby transkripčních faktorů (A – nemetylovaný promotor, B – metylovaný promotor)

Remodelace chromatinu Remodelace chromatinu jsou epigenetické změny spočívající v chemické modifikaci (metylaci, acetylaci nebo fosforylaci) histonových proteinů, čímž ovlivňují kondenzaci chromatinu a následně i zapínání genů v důsledku změněné přístupnosti transkripčních enzymů k promotorům, řídícím oblastem genů. Interference RNA (RNAi) Interference RNA je důležitý regulátor genové exprese a její změny se významně podílejí na procesu kancerogeneze. Tento proces regulace aktivity genů spočívá v řízené produkci malých molekul RNA (miRNA), které se komplementárně vážou ke konkrétním molekulám mRNA a blokují tak tvorbu proteinů. V procesu kancerogeneze se mohou molekuly miRNA chovat jako tumor supresory nebo jako onkogeny. Molekuly miRNA fungují jako tumor supresory v případě, že jejich cílem (inhibovaným genem) je protoonkogen, resp. onkogen. Důsledkem snížené produkce takové miRNA je zvýšená hladina původně inhibovaného onkogenu. Naopak miRNA se mohou chovat jako onkogeny v případě že inhibují produkci tumor supresorového genu a důsledkem např. amplifikace genu kódujícího tuto miRNA dojde k patologicky zvýšené inhibici tumor supresorového genu.

11

Růst nádoru a mechanismus metastazování

MiRNA inhibují translaci mRNA mnoha cílových genů, které se podílejí na rozvoji nádorů. Tímto dochází ke změnám hladin příslušných proteinů, což spolu s dalšími změnami přispívá k nádorové transformaci.

1.3. Růst nádoru a mechanismus metastazování Pouze vysoce maligní buňky se vyznačují metastazujícím potenciálem. Aby mohly dále metastazovat, musí získat další invazivní vlastnosti, které jsou důsledkem dalších genových mutací, aktivace či inaktivace většího počtu genů. Proces metastazování je složitý mnohastupňový proces, kterého se účastní široká škála faktorů (tabulka 1). Tabulka 1 Etapy metastatického procesu a faktory, které se na něm podílejí

Etapa metastatického procesu:

Faktory: Matrixové metaloproteinázy

a.

Angiogenetické faktory

Invaze nádoru do okolí

Adhezívní molekuly Matrixové metaloproteinázy

b.

Cysteinové a serinové proteázy Invaze z extracelulární matrix přes cévní stěnu do Angiogenetické faktory lumen Adhezívní molekuly (Intravazální invaze) Hemokoagulační faktory c.

Pasivní transport.

Transport nádorových buněk

Hemokoagulační faktory Matrixové metaloproteinázy

d.

Cysteinové a setinové proteázy

Invaze z lumen cévy do extracelulární matrix

Angiogenetické faktory

(Extravazální invaze)

Adhezívní molekuly Hemokoagulační faktory Hemokoagulační faktory Adhezívní molekuly.

e.

Proliferační faktory Nidace nádorových buněk a růst metastáz v nové Angiogenetické faktory tkáni Adhezívní molekuly Apoptotické faktory

12


Ad a) Invaze nádoru do okolí Předpokládá průnik nádorových buněk bazální membránou do extracelulární matrix. Narušení její integrity umožní invazi nádorových buněk do okolí mechanickou cestou při zvýšeném hydrostatickém tlaku uvnitř rostoucího nádoru. Na disrupci bazální membrány se podílí především proteolytické enzymy – matrixové metaloproteinázy (Nelson 2000, Stevenson 1999). Svým proteolytickým účinkem působí nejen na bazální membránu extracelulární matrix, ale i na bazální membránu endotelií, čímž usnadňují angiogenezi (novotvorbu cév) (Stevenson 1999) za účasti angiogenetických faktorů – obrázek 3. Angiogeneze je nezbytným faktorem expanze a invaze primárního nádorového ložiska a současně hraje roli i při vzniku vzdálených metastáz. Stádium 1

Stádium 3

Malý avaskulární nádor Výživa nádoru difúzí

Růst nových cév z okolních cév, vaskularizace tumoru.Výživa difúzí

Stádium 2 angiogenní faktory pučení nových cév

Stádium 5 Výsev vzdálených metastáz

Stádium 4 Invaze nádor. buněk skrz cévní stěnu Tvorba nádorových embolů

Obrázek 3 Proces angiogeneze u nádorů (Harris 1997)

Ad b) Intravazální invaze Po průniku do extravazálního prostoru následuje další stupeň invazivity nádoru - intravazální invaze, na které se kromě metaloproteináz podílejí i další proteázy. Po průniku cévní stěnou dochází k aktivaci cytokininů (Banks et al. 1993,Holubec et al. 2002b) a k agregaci nádorových buněk 13


s krevními elementy. Vznik těchto agregátů – mikrotrombů jednak usnadňuje transport buněk a jednak aktivuje hemokoagulační faktory, které jsou nezbytné pro extravazální invazi nádorových buněk. Ad c) Transport nádorových buněk Transport nádorových buněk v cévním řečišti je především pasivní děj, ale aktivací hemokoagulačních faktorů se připravuje extravazální invaze. (Duffy et al. 2004a, Duffy et al. 2004c) Ad d) Extravazální invaze Extravazální invaze je zahájena hemokoagulačními faktory aktivujícími cytokininy, které aktivují adhezívní molekuly (Alexiou 2001), které zajistí adhezi na cévní stěnu. Z adherovaného agregátu krevních destiček a metastatických buněk se z trombocytů uvolňuje tromboxan A, který je zodpovědný za ireverzibilní agregaci, a tím definitivní adhezi mikrotrombu s nádorovými buňkami na cévní stěnu. Po ireverzibilní adhezi mikrotrombu následuje pochod obdobný první etapě metastatické kaskády, na které se podílejí matrix metaloproteinázy, faktory angiogeneze a další tkáňové působky. V této fázi metastatického procesu se připisuje významná úloha růstovému faktoru z trombocytů (PDGF), který stimuluje proliferaci buněk mikrometastázy. Větší odolnost mikroembolu je způsobena i tím, že se mikroembolus záhy obaluje fibrinem, který vzniká jako produkt plazmatické koagulace aktivované při agregaci destiček a indukované tromboplastickými substancemi z nádorových buněk. Fibrinový obal chrání buňky mikrometastáz proti mechanické traumatizaci a maskuje nádorové buňky před imunokompetentními lymfocyty. Ad e) Nidace nádorových buněk a růst metastáz v novém mikroprostředí Po průniku nádorových buněk cévní stěnou růst metastáz v novém mikroprostředí neprobíhá uniformně (Alexiou et al. 2001, Amaya et al. 1997, Aotake et al. 1999). Buňky v metastáze se mohou diferencovat, jindy mohou zůstat dlouhou dobu v klidovém stavu, aniž ztratí svůj proliferační potenciál. Proliferace buněk v metastáze je závislá na přítomnosti rozmanitých růstových (proliferačních) faktorů a jejich vzájemném poměru s faktory, které proliferaci inhibují. Rovněž inhibice apoptózy (programové smrti buněk) má za následek intenzivnější proliferaci (Aotake et al. 1999).

14


Kromě již zmíněného PDGF se na proliferaci mikrometastáz mohou podílet též humorální faktory produkované vlastními nádorovými buňkami (tzv. autokrinní stimulace). Uplatňují se též různé produkty onkogenů, zejména c-myc, c-erb a c-sic, které mají aktivitu růstových faktorů (FGF, TGF , EGF) (Dirix et al. 1999). Předpokladem růstu metastázy je též plynulý přísun živin a kyslíku, a proto je pro růst metastázy opět nezbytná novotvorba cév (Carmeliet 2000). Pro vlastní cévní zásobení metastáz je též nezbytná produkce fibrinu, který vytváří matrici, jež je oporou novotvořeným cévám, na které metastatické ložisko dále roste.

2. BIOMARKERY Ondřej Topolčan, Judita Kinkorová Definice biomarkeru je neustále diskutována a teprve v posledních letech bylo docíleno jednotného chápaní pojmu „biomarker“. Pokud se podíváme na problematiku biomarkerů v onkologii, prvním biomarkerem nejspíše byla Bence Jonesova bílkovina v moči. Dalším nepochybně významných biomarkerem byla Brdičkova reakce popsaná v padesátých letech minulého století; jde o katalytické vylučování vodíku pomocí elektroredukce komplexu Co s amoniakem a látky obsahující SH skupinu. V padesátých a šedesátých letech 20. století byla metoda testována pro nespecifickou diagnózu rakovinných onemocnění. Dodnes je používána pro stanovení látek majících SH skupiny (proteiny) Vývoj biomarkerů směřuje od jednotlivého uplatnění k široké vše shrnují definici. V klasifikaci biomarkerů jsou značné rozdíly a mohou byt děleny z nejrůznějších hledisek. Vývoj poznání o biomarkerech Biomarkery jsou množinou parametrů , které umíme kvantitativně měřit a které se mění v závislosti na fyziologických nebo patologických stimulech, v důsledku vlivu léku, či dlouhodobé léčebné intervence.

15


Základní dělení podle využití markerů Diagnostické Prediktivní Prognostické Klasifikace biomarkerů podle vztahu k onemocnění 1. Predisponující biomarker – rizikový faktor 2. Screeningový biomarker 3. Časná diagnostika 4. Primární diagnosticku 5. Diferenciální diagnostiku 6. Monitorovaní průběhu onemocnění a jeho komplikací 7. Pro volbu léčby 8. Pro monitoraci léčby 9. Pro odhad DFI 10. Pro odhad OS

Typy molekulárních biomarkerů 1. Proteinové 2. Proteomické 3. DNA 4. RNA 5. Transcriptomické 6. Mikro RNA 7. Metabolomické 8. Glykomické

Velice se mění názory na aplikaci biomarkerů v klinické praxi Od neúčelného naopak k výraznému zúžení doplnění atd. Obrovsý rozdíl mezi klinickou rutinní praxí. Rozdíly mezi použitím v různých státech východiskem personalizovaná medicína.

16

Co jsou nádorové markery?

3. NÁDOROVÉ MARKERY Ondřej Topolčan, Marie Karlíková, Šárka Svobodová

3.1. Co jsou nádorové markery? Nádorové markery (angl. tumor markers) lze velice jednoduše charakterizovat jako látky produkované maligními buňkami či organizmem jako odpověď na nádorové bujení. Může se jednat o antigeny lokalizované na povrchu buněčných membrán, enzymy metabolických drah, fragmenty cytoplazmatických struktur uvolňované do okolí při zániku buněk a další. Jsou to markery, od kterých se nádorové bujení odvíjí (onkogeny, antionkogeny) nebo kterými se nádorové onemocnění projevuje (nádorové antigeny, produkty nádorových buněk nebo reaktivní produkty nenádorových buněk); mohou být produkované nádorovými buňkami nebo zdravými buňkami jako reakce na přítomnost nádoru. Nádorové markery lze detekovat -

imunoanalytickými metodami v séru či jiných biologických tekutinách, popřípadě v buněčném cytozolu a extraktech z tkáňových kultur

-

imunohistochemicky přímo v tkáních z bioptických vzorků

-

metodami molekulární biologie genovou expresi nádorových buněk

-

v cirkulujících buňkách v periferní krvi (zatím ve stadiu výzkumu).

3.2. Význam nádorových markerů Nádorové markery mohou přispět k rozlišení mezi benigním a maligním nádorem, k určení stadia onemocnění, k odhadu prognózy (prognostické markery) a odpovědi na léčbu (prediktivní markery) a především jsou vhodné pro monitoraci léčby a včasný záchyt progrese a recidivy nádoru. Proto indikované použití vhodného markeru může rozhodujícím způsobem přispět k výsledku léčby a tím zlepšit dobu přežití nemocného.

17

Indikace a interpretace nádorových markerů

Diagnostická hodnota určitého nádorového markeru závisí na prevalenci onemocnění v populační skupině a na specificitě a senzitivitě stanovení daného nádorového markeru. Specificita nádorového markeru: pravděpodobnost, s jakou má pacient bez diagnostikovaného maligního onemocnění negativní výsledek laboratorního testu. Čím větší je specificita, tím méně je falešně pozitivních výsledků. Senzitivita nádorového markeru: pravděpodobnost, že pacient s pozitivním výsledkem testu má hledané nádorové onemocnění. Čím větší je senzitivita, tím méně je falešně pozitivních výsledků. Požadavky kladené na ideální nádorový marker jsou následující: •

je produkován pouze u maligních onemocnění

•

je orgánově specifický

•

vyskytuje se ve vysokých koncentracích v biologických tekutinách

•

koreluje s velikostí nádoru

•

koreluje se stádiem onemocnění

•

koreluje s prognózou

•

koreluje s účinností terapie

V klinické praxi neexistuje v současné době žádný nádorový marker, který by tato kriteria splňoval. Je proto nutné si vždy uvědomit optimální indikace a současně i limitace těchto vyšetření. Správně indikované vyšetření nádorových markerů může přispět především k včasnému záchytu recidivy či progrese onemocnění a tím i k rychlejšímu terapeutickému zákroku, který může prodloužit život nemocného. Orgánová specificita při vyšetřování nádorových markerů je nízká, a proto je nezbytně nutné jejich dynamické sledování v pravidelných intervalech.

3.3. Indikace a interpretace nádorových markerů Při indikaci vyšetření nádorových markerů je vhodné se řídit následujícími kritérii: 1) Klinická otázka, tj. proč nádorový marker stanovujeme a co od výsledku očekáváme. To by měl být základ uvažování lékaře, protože s tím i úzce souvisí interpretace. Možné klinické situace, kdy a jak vyšetřovat nádorové markery, jsou podrobněji popsány v další části kapitoly. 2) jaký je přínos vyšetření – největším přínosem by bylo, kdyby markery umožnily diagnostiku časných stadií nádorového onemocnění, ale to je stále sen budoucnosti. Při monitoraci onemocnění 18


existují zcela extremní názory – nedělat sledování vůbec, protože tím, že zjistíme recidivu, progresi, event. generalizaci onemocnění dříve – v asymptomatickém období – se nic nezmění na perspektivě nemocného. Druhý názor předpokládá intenzivně sledovat nádorové markery a již pouze při změně hladin nádorových markerů léčbu zahájit nebo změnit. Oba přístupy jsou extrémní. V současné době nové chirurgické přístupy umožňují reoperace, operaci metastáz apod. Obdobně i onkologická léčba má zcela jiné možnosti než dříve. Proto čím dříve určíme progresi onemocnění, tím lépe. Na druhé straně tam, kde je možná již pouze paliativní léčba, je otázkou, zda má sledování nádorových markerů význam. Jedná se například o pokročilá stadia nádorů jícnu, pankreatu apod. 3) Pro výběr konkrétního nádorového markeru musíme vycházet z lokalizace nádoru a předpokládané TNM klasifikace, stádia onemocnění, histologické struktury a s tím i úzce související buněčné diferenciace nádorových buněk. Obecně platí, že čím je nádorové bujení pokročilejšího stadia, tím je větší pravděpodobnost zvýšené hodnoty nádorových markerů. Co se týká histologického typu, je nutné si na prvním místě uvědomit, že nádorové markery nejsou tkáňově ani orgánově specifické. Jen velice obecně lze říci, že nádory vycházející z dlaždicového epitelu produkují SCC, CEA, event. CYFRA. U karcinomů mucinosního charakteru vyšetřujeme nádorové markery CA typu. U nádorů vycházejících ze zárodečného listu jsou pozitivní AFP a hCG. Proliferaci nejlépe vystihují změny hladiny thymidinkinázy. Někdy jsou mezi proliferační markery řazeny i cytokeratiny, což však řada autorů odmítá s tím, že jejich zvýšení je důsledkem poškození buňky (nekrózy nebo apoptózy), nikoliv proliferace. 4) Klinický stav nemocného a fáze onemocnění – před operací, po radikální operaci, po paliativním výkonu, před onkologickou a po onkologické terapii, v částečné či úplné remisi, pokud existuje podezření na progresi, či je-li progrese nebo generalizace onemocnění zcela zřejmá . 5) Frekvence vyšetření nádorových markerů je nejčastěji 1x za 3 – 4 měsíce v prvních třech letech po vzniku nádorového onemocnění. Později stačí 2 x do roka. Frekvence však závisí i na vývoji onemocnění. Při progresi nádoru je samozřejmě nutné frekvenci vyšetření zvýšit na 1 x za měsíc nebo 1x za dva měsíce. V následujících odstavcích je podrobněji uvedeno obecné využití stanovení nádorových markerů v různých fázích klinického rozhodování, včetně příkladů. Konkrétní údaje lze nalézt v publikacích věnovaných specifickým nádorovým onemocněním.

19


Indikace vyšetření nádorových markerů Prevence vzniku nádorů 1) Rizikové faktory u ohrožených populačních skupin a. Onemocnění predisponující k nádorům b. Vyšetření rizikových faktorů predisponujících ke vzniku nádorů c. U osob s vysokým rizikem vzniku nádorového onemocnění – při rodinné anamnéze maligního nádorového onemocnění v mladém věku nebo vysoké frekvenci výskytu v rodině, prokázaném geneticky podmíněném karcinomu,.. d. Pravidelná monitorace nádorových markerů u nemocných s prekancerosou e. Biomarker jako rizikový marker pro vznik a rozvoj nádorového onemocnění Screening Obecnou podmínkou screeningu je, aby při 95 % specificitě byla senzitivita 97 %. Této senzitivity musí být dosaženo nejlépe v časném stadiu nádorového onemocnění. Pro screening byla snaha použít CEA u nádorů kolorekta, CA 125 pro nádory ovarií a PSA pro karcinom prostaty. Žádný z markerů této podmínce nevyhověl. U karcinomu prostaty by se proto mělo hovořit nikoliv o screeningu, ale o časné diagnostice ve vybrané populační skupině. Některé nádorové markery však lze využít pro screening u populačních skupin se zvýšeným rizikem: -

vrozené mutace BRCA1 pro screening karcinomu prsu,

-

AFP pro hepatocelulární karcinom.

Časná detekce Podobně jako v případě screeningu nejsou nádorové markery vhodné pro časnou detekci. Využívá se pouze PSA pro karcinom prostaty ve vybrané populační skupině. Probíhají studie, které se snaží najít optimální kombinaci několika nádorových markerů pro časnou detekci různých karcinomů, např. karcinomu ovaria. Podle doporučení NACB je CA125 doporučován, spolu s transvaginálním USG, pro časnou detekci žen s hereditárními syndromy (Sturgeon a Diamandis 2010).

20


Primární diagnostika Nádorové markery nejsou příliš vhodné ani pro primární diagnostiku, a to ze stejných důvodů jako v případě screeningu; navíc i proto, že jejich orgánová specificita je většinou malá.

Příklady: -

PSA jako marker pro rozlišení mezi maligním a benigním onemocněním prostaty

-

AFP (hepatocelulární karcinom)

-

CA 125 (ovariální karcinom)

Diferenciální diagnostika Podobně jako při primární diagnostice se zde obecně nádorové markery nedoporučují. U vybraných následujících diagnóz je však naopak použití velice účelné. Jedná se o nádory testes, chorioepiteliom, neuroendokrinní nádory a v současné době stále více i diferenciální diagnostika nádorů plic. Volba léčby a predikce odpovědi na léčbu Tzv. prediktivní markery jsou využívány pro predikci odpovědi pacienta na léčbu a tedy pro volbu vhodné léčby. Jedná se zejména o genetické markery – expresi specifických genů či receptorů a volbu či zamítnutí specifické biologické léčby. Příklady: -

Mutace KRAS/ anti-EGFR terapie (karcinom kolorekta)

-

Exprese HER2 / anti-Her2 terapie (karcinom prsu a žaludku)

-

Exprese estrogenových receptorů/ antiestrogenová terapie (karcinom prsu)

Monitorování průběhu onemocnění V praxi je nejvýznamnější indikací pro sledování nádorového markeru monitorování průběhu onemocnění a s tím úzce související diagnostika recidivy nebo progrese. Dodržuje se určité schéma, které je odvozeno ze senzitivit získaných z předoperačních vyšetření nebo dlouhodobých monitorovacích studií. Používají se hlavní a doplňkové nádorové markery.

21


Diskutovanou otázkou je, kdy se sledováním nádorových markerů začít a jaká má být frekvence. Zde se již mísí úvahy o současném víceúčelovém využití stanovení nádorového markeru – tedy nejen pro monitoraci nádorového onemocnění, ale současně pro sledování efektu léčby, prognózy s ohledem na všechny aspekty průběhu onemocnění. Dle naší zkušenosti je nejvhodnější provést první vyšetření před léčbou, tj. nejčastěji před operací,14 dní po operaci a pak vyšetřovat v prvních třech měsících 1 x za měsíc a na to navázat vyšetřením 1x za 3 – 4 měsíce až do konce třetího roku od zahájení sledování. Později je dostačující frekvence 2 x ročně. Samozřejmě dojde-li k progresi onemocnění, je nutné frekvenci sledování zvýšit. Vyšetření předoperační hodnoty má dvojí význam. Jak naše dlouhodobé zkušenosti ukazují, pokud je nádorový marker zvýšen předoperačně, bude zvýšen i při progresi, a to v 88 – 95 % , naproti tomu tam, kde předoperační hodnoty byly v normě, dojde při progresi k vzestupu jen v 30 %. Předoperační vyšetření vhodně voleného nádorového markeru umožňuje do jisté míry individualizovat dispenzární péči. Při předoperační pozitivitě markeru se na něj můžeme spolehnout i při follow up, při negativitě by měl být dán důraz především na klinické sledování nemocného, eventuelně na zobrazovací techniky. Kromě toho absolutní výše sérové hladiny nádorového markeru souvisí s prognózou nemocného. Sledování efektu terapie Sledování efektu terapie pomocí nádorových markerů je, pokud se systematicky a indikovaně provádí, neocenitelným pomocníkem lékaře. Vzhledem k různým biologickým poločasům jednotlivých markerů je nutno správně volit intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně postihl efekt terapie a ne „lysis fenomen“, tj. krátkodobý prudký nárůst hladiny markeru jako odpověď na terapii. Vyšetřujeme nádorové markery pro posouzení úspěšnosti terapie nejdříve koncem třetího týdne, lépe ve 4. týdnu od aplikace terapie. Tato oblast se v poslední době dostává do centra zájmu onkologů. Nezanedbatelnou výhodou pro markery, oproti zobrazovacím metodám, je fakt, že jejich elevace může upozornit na progresi i v jiném orgánu, než který je sledován zobrazovacími metodami. Existuje tedy potřeba lepšího systému pro sledování terapie, než je současně dostupný. Toto je oblast, ve které v budoucnu markery najdou své ocenění a snad nedůležitější roli v praxi. Důležitou výhodou vyšetřování sérových nádorových markerů je, že jejich měření odráží dynamiku stavu nemocného a vyšetření může být opakováno, jak je třeba. Pozitivní korelace mezi změnami některých sérových nádorových markerů a odpovědí k systémové terapii u

22


onkologických pacientů byla popisována nejčastěji u karcinomu prsu. Další práce potvrzují zvýšení přežívání u nemocných léčených na základě zvýšených hodnot sérových nádorových markerů při negativním nálezu zobrazovacích metod u nemalobuněčného plicního karcinomu. Při terapii ovariálních karcinomů byl prokázán význam stanovení CA 125 pro optimalizaci léčby. U nehodgkinských lymfomů a leukémií vyšetřování sérové TK i B-2-M umožňuje sledovat efekt chemoterapie i predikci vývoje choroby. Další příklady: -

CEA, PSA, CA125, CA15-3 a CA19-9 jsou doporučeny pro monitoraci odpovědi na paliativní léčbu u metastatického kolorektálního Ca, Ca prostaty, prsu a pankreatu (v tomto pořadí) (Harris et al. 2007, . Locker et al. 2006),

-

CA 15-3 a/nebo CEA pro monitoraci chemoterapie při pokročilém karcinomu prsu, CA 125 pro monitoraci chemoterapie (Sturgeon a Diamandis 2010)

Předpokladem správné interpretace výsledku v laboratoři je respektování podmínek preanalytiky, analytiky a samozřejmě existující interní a externí kontroly kvality. Na rozdíl od enzymů, hormonů a dalších analytů jsou nádorové markery relativně odolné zevním vlivům. Hemolýza zvyšuje významnou měrou pouze sérovou hladinu NSE – což je způsobeno jeho vysokou hladinou v erytrocytech. Nevyžadují odběr nalačno a pro standardizaci výsledků je doporučeno provádět odběr vždy v ranních hodinách. Nádorové markery podléhají relativně minimální denní variabilitě, výjimkou jsou cytokeratiny a thymidinkináza, kde se denní variabilita podle našich zkušeností pohybuje mezi 10 – 25 %. Biologická variabilita je různá a pohybuje se od 5 – 70 %, extrémně vysokou biologickou variabilitu má podle některých autorů CA72 - 4 – až 300 %. Při monitoraci onemocnění je důležité nádorové markery stanovovat jednou metodikou v jedné laboratoři. Negativní výsledek ještě neznamená, že nádorové onemocnění není přítomno. Pro kvalitní klinické zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. Pro klinické zhodnocení nádorových markerů se používá Cut off (referenční hladina) – při primární diagnostice je definována jako hladina markeru, pod kterou je 95 % zdravých lidí, eventuelně pacientů s benigním onemocněním, při follow up nádoru nebo monitoraci léčby je definována jako hladina markeru, pod kterou leží 95 % hodnot pacientů v kompletní remisi. V současné době je doporučeno stanovovat

23


senzitivitu při 95% specificitě. Je nutné respektovat i skutečnost, že se nádorové markery mohou zvyšovat i u benigních onemocnění. Rutinní praxe V tabulce 2 jsou uvedeny nejčastěji používané nádorové markery. Tabulka 2 Přehled klinicky využívaných nádorových markerů

Maligní nádor /

Diagnostika a diferenciální diagnostika

Diagnostika relapsu či recidivy

Monitorace terapie

Prostata

tPSA,,fPSA, proPSA

tPSA

tPSA

Ovarium

HE 4 CA- 125

HE 4 CA- 125

HE 4 CA- 125

orgán

Děloha Nádory plic

Cyfra, MT, CEA, TN Dle typu karcinomu proGNP, Chromogranin A

Testes

AFP, fbeta HCG, NSE, AFP, fbeta HCG, NSE, TK TK

Chorioepiteliom

HCG

HCG

HCG

Hemoblastózy

TK

TK

Karcinom kolorekta

CEA, CA 19-9, TPS

CEA, CA 19-9, TK

Prs

Egr, Pgr AgR, Ki 24

CEA, CA 15-3 , Cyfra, (TK)

Dle typu terapie

Neuroendokrinní

Hormony , chromogranin

Hormony, chromogranin

Hormony, chromogranin

Preanalytika Předpokladem správné interpretace výsledku v laboratoři je respektování podmínek preanalytiky, analytiky a samozřejmě existující interní a externí kontroly kvality. Na rozdíl od enzymů, hormonů a dalších analytů jsou nádorové markery relativně odolné zevním vlivům. Hemolýza zvyšuje významnou měrou pouze sérovou hladinu NSE – což je způsobeno jeho vysokou hladinou v erytrocytech. Nevyžadují odběr nalačno a pro standardizaci výsledků je doporučeno provádět odběr vždy v ranních hodinách.

24

Klinicko-biochemické rozdělení nádorových markerů

Nádorové markery podléhají relativně minimální denní variabilitě, výjimkou jsou cytokeratiny a thymidinkináza, kde se denní variabilita podle našich zkušeností pohybuje mezi 10 – 25 %. Biologická variabilita je různá a pohybuje se od 5 – 70 %, extrémně vysokou biologickou variabilitu má podle některých autorů CA72 - 4 – až 300 %. Při monitoraci onemocnění je důležité nádorové markery stanovovat jednou metodikou v jedné laboratoři. Interpretace výsledku Negativní výsledek ještě neznamená, že nádorové onemocnění není přítomno. Pro kvalitní klinické zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. Pro klinické zhodnocení nádorových markerů se používá Cut off (referenční hladina) – při primární diagnostice je definována jako hladina markeru, pod kterou je 95 % zdravých lidí, eventuelně pacientů s benigním onemocněním, při follow up nádoru nebo monitoraci léčby je definována jako hladina markeru, pod kterou leží 95 % hodnot pacientů v kompletní remisi. V současné době je doporučeno stanovovat senzitivitu při 95% specificitě. Je nutné respektovat i skutečnost, že se nádorové markery mohou zvyšovat i u benigních onemocnění.

3.4. Klinicko-biochemické rozdělení nádorových markerů Onkofetální antigeny . Jde o látky, které nacházíme v poměrně vysokých koncentracích u plodu, kde se vyskytují na povrchu diferencujících se buněk (diferenciační antigeny) a hrají významnou roli ve vývoji plodu a trasportu biologicky aktivních látek . Po porodu jejich hladina prudce klesá a ve většině případů u zdravých dospělých osob je jejich hladina velice nízká a biologická funkce není známa. Při většině nádorových onemocnění se jejich aktivita výrazně zvyšuje. Typické pro ně je, že se vyskytují především u dobře diferencovaných nádorů a jejich hladina většinou koreluje s velikostí nádorové masy. Jejich stanovení má význam zejména pro určení diagnostiku relapsu či progrese nádorového onemocnění a pro monitoraci efektu terapie. Je možné je rozdělit do dvou základních skupin Tabulka 2 Onkofetální antigeny

Nádorový marker

Typ nádoru

Význam v klinické praxi Fáze vývoje

AFP

Nádory jater

Rutinní praxe Klinické využití

25


hCG , f beta 26g

Nádory germinálního původu

Klinické využití

Choriokarcinom

Klinické využití

Nádory testes

Klinické využití

Nádory ovarií

Ve fázi evaluace

CA - Cancer antigen nebo carbohydrate antigen CA 125

Nádory ovarií

Klinické využití

CA 15-3

Nádory prsu

Klinické využití

CA 19-9

Nádory kolorekta

Klinické využití

Nádory žlučníku

Klinické využití

Nádory žaludku

Vyžaduje evaluaci

CA 72-4

Nádory žaludku

Klinické využití

CA 242

Nádory kolorekta

Ve stadiu evaluace

CEA

Nádory kolorekta

Klinické využití

Nádory prsu

Klinické využití

Nádory ovarií

Výzkum

HE 4

Nádory ovarií

Klinické využití

TATI

Nádory ovarií

Výzkum + omezené klinické využití

Cytokeratinové nádorové markery Cytokeratiny jsou proteiny, které jsou součastí intermedialních filament ,která nacházíme v intracytoplasmickém cytoskeletonu

prakticky všech epithelialních tkání. Pojem "cytokeratin" je

užíván od 70 let kdy Franke, Schmid, Osborn and Weber [ kdy je poprvé popsali a v roce 2006 vytvořili systematickou klasifikaci. Kromě tkání však za chorobných stavů především při nádorových onemocněních epilelového původu dochází k jejich vyplavování z buněk lze je prokázat v tělesných tekutinách jako tzv solubilní cytokeratininové fragmenty, které jsou využívány jsou orgánově nespecifickými nádorovými markery. Jejich vyplavení souvisí předvším s buněčnou destrukcí , která jeobvykle projevem jak buněčné proliface tak nekrózy buněk ev I buněčné apoptózy. Pro souvislost s profirací byl některé markery TPA a TPS řazeny mezi proliferační nádorové markery. Tabulka 3 Cytokeratinové markery

Nádorový marker

Typ nádoru

Fáze vývoje

26


Nádory plic

Klinické využití

Nádory děložního čípku

Klinické využití

Nádory žaludku

Vyžaduje evaluaci

Monototal

NSCLC

Klinické využítí .

SCC


Vyžaduje evaluaci

TPA

Nádory prsu

Omezené klinické využití

Nádory ovarií

Výzkum


Vyžaduje evaluaci

Nádory žaludku

Vyžaduje evaluaci

Metastázy do jater

Klinické využití

Nádory prsu


Nádory cervix

Vyžaduje evaluaci

Nádory žaludku

Vyžaduje evaluaci

CYFRA 21.1

TPS

Enzymy Enzymatickénádorové markery. můžeme je rozdělit na dvě podskupiny: enzymy mající biologickou funkci především při buněčném dělení, (např. thymidinkináza a neuron-specicifická enoláza). Tyto markery jsou značně zvýšené u všech stavů charakterizovaných především výraznou buněčnou proliferací jakékoliv etiologie .jde tedy o markery které nejsou ani orgánově a ani nádorově specifické, V praxi jsou proto vždy využívany jako doplňkové nádorové markery. Jen v ojedinělých situacích mohou mít diagnostický význam. Proto nejvyšší hladiny nacházíme u málo diferencov¨ných především aplastických nádorů a dále nádorů s rchlou progresí. Jsou proto využívány předvším pro určování prognózy a onemocnění. enzymy, které mají v organismu svojí fyziologickou funkci a při nádorovém onemocnění dochází poze ke kvantitativním změnám hladin v tělesných tekutinách nebo tkáních. . Některé z nich jsou výrazně výrazně orgánově specifické ne však nádorově specifické Jako příklad může sloužit PSA,HE 4, NT pro GNP nebo tkáňově a částečně i nádorově specifické – Chomogranin A typický pro neuroendokrinní tkáň a především pro karcinoid syndrom Naproti tomu

LDH je markerem, který není ani orgánově ani nádorově spe¨cifický a je

výhradně doplňkovým markerem, který při pozivititě dalšího markeru poue jeho sou

Tyto

markery jsou vysoce orgánově či tkáňově specifické, ale neposkytují jakoukoliv informaci o typu poškození daného orgánu či tkáně. Dají se použít k určení primární lokalizace nádoru. 27


Tabulka 4 Enzymy jako nádorové markery

Nádorový marker

Typ nádoru

Fáze vývoje Proliferační

Thymidinkináza

Aplastické nádory

Klinické využití

Hemoblastomy

Klinické využití

Progrese nádoru NSE

Nádory plic

Klinické využití

(Neuronspecifická enoláza)

Nádory vycházející ze zárodečných listů

Výzkum

Melanom Neuroendokrinní nádory Orgánově specifické Nádory pankreatu

Klinické využití

Neuroendokrinní nádory

Klinické využití

Nádory plic

Klinické využití

PSA a jeho fragmenty

Nádory prostaty

Klinické využití

Renin

Wilmsův tumor ledviny

HE 4

Maligní nádory ovária

Chromogranin A

Maligní nádory endometria NT-proGNP

Nádory plic

Výzkum

Orgánově i nádorově nespecifický enzym LDH

Nádory testes

Klinické využití

(Laktátdehydrogenáza)

Lymfomy

Klinické využití

Nádory germinálního původu

Klinické využití

Melanom

Hormony Jsou produkovány endokrinními buňkami (např. kalcitonin u medulárního karcinomu štítné žlázy nebo tyreoglobulin při typu folikulárním), nebo ektopicky, samotným nádorem (např. látka podobná ACTH nebo hCG při bronchogenním karcinomu). Tyto nádorové markery jsou nečastěji využívány ke kontrole efektu operační či medikamentózní léčby.

28


Tabulka 5 Hormony jako nádorové markery

Nádorový marker

Typ nádoru

Fáze vývoje

Ektopická sekrece ACTH drenokortikotropin

Nádory plic

Klinické využití

ADH

Nádory plic

Klinické využití

(Antidiuretický hormon) Nádory plic

Prolaktin

Změny hladin hormonů u endokrinně aktivních nádorů ACTH


ADH


Prolaktin


Kortizol


Kalcitonin

Medulární tyroidální nádory

Klinické využití

Parathormon


Klinické využití

Pepsinogen

Nádory traktu


Růstový hormon


Klinické využití

Tyreoglobulin

Tyroidální nádory

Klinické využití

gastrointestinálního

Ostatní blíže nespecifikované látky Nejrůznější tkáněmi produkované blíže nespecifikované látky, které se nedají zařadit do žádné z předchozích skupin, ale při nádorovém bujení se jejich hladiny v krvi zvyšují jako nespecifická reakce organizmu na přítomnost nádorového onemocnění. •

Feritin

•

Laminin

•

b2-mikroglobulin

•

Elastin

•

Imunoglobuliny

•

Selectin

29


Nádorové markery metastazováním

spojené

s buněčnou

proliferací,

diferenciací

a

Tyto markery se zatím až na výjimky klinicky nevyužívají a jsou předmětem výzkumu či evaluace.

Markery spojené se signální transdukcí o HER-2/neu

o Interleukiny a jejich receptory

o EGF

o TGF-β

o IGF-1

o TNF-α

Angiogenní faktory o Osteoprotegerin

o bFGF

o osteopontin

o endostatin

o angiostatin

o VEGF

o angiogenin

Adhezívní molekuly o ICAM-1

o E-cadherin

o VCAM-1

o E-selektin

Markery spojené s apoptózou Bcl-2 sFas

Matrixové metaloproteinázy a jejich inhibitory

Tkáňové nádorové markery U nádorů hormonálně aktivních se stanovují i počty receptorů. Na rozdíl od předchozích markerů, které se převážně stanovují v séru, jde o markery tkáňové, které se stanovují v bioptickém

30


materiálu. Mají význam pro určení prognózy nádoru, ale rozhodující význam mají pro volbu a kontrolu terapie. Exprese estrogenových (ER) a progesteronových (PR) receptorů Exprese katepsinu D Exprese onkoprotein HER-2/neu Exprese proteinu kódovaného tumor-supresorovým genem p53 Mutace KRAS Mutace EGFR

Cirkulující nádorové buňky (CTC) Diagnostické a prognostické údaje z periferní krve o nádorovém onemocnění, můžeme získat analýzou molekul, které jsou ve vztahu k nádorovým buňkám, ať již jsou jimi přímo produkovány, uvolňují se při jejich rozpadu nebo jejich produkci stimulují. Samozřejmě největší diagnostický potenciál má analýza nádorových buněk samotných. Tak je tomu u leukemických onemocnění, kdy se leukemické buňky nacházejí přímo v periferní krvi. U solidních nádorů se nádorové buňky mohou do krevní cirkulace dostávat cestou lymfogenního nebo hematogenního metastazování. Přítomnost cirkulující nádorových buněk v periferní krvi si uvědomil již roku 1869 Thomas Ashworth, když pozoroval nádorové buňky v krvi pacienta s metastazujícím karcinomem. Od 90 let jsou cirkulující nádorové buňky předmětem intenzivního výzkumu, přesto je třeba říci, že dodnes nejsou naše znalosti o CTC takové, aby jejich diagnostika v klinické praxi pomáhala pacientům. Naopak dochází k paradoxní situaci, čím více vědomostí o CTC máme, otázek přibývá. Jaký přínos pro léčbu pacientů s onkologickým onemocněním se od diagnostiky CTC očekává? Detekovat cirkulující nádorových buňky by pomohlo zejména pro časnou detekci relapsu nádorových onemocnění a jeho rizika a dále při volbě protinádorové terapie. Začněme s tím co je dnes zřejmé. U pacientů se solidními nádory epiteliálního původu se v periferní krvi mohou nacházet cirkulující buňky s vlastnostmi nádorových buněk. Vyskytují se u pacientů jak s lokalizovanými nádory, tak s metastatickým postižením. Počet CTC je ve vztahu k prognóze nádorového onemocnění. Snížení počtu CTC po podané chemoterapii je ve vztahu k odpovědi na léčbu. 31


Přesné znalosti nám naopak chybí o délce přežívání CTC. Protože bylo zjištěno, že ne všechny izolované CTC u téhož pacienta mají stejný fenotyp, zůstává otázka jak identifikovat ty s “metastatickým potenciálem“.

Metody izolace CTC U pacientů se solidními nádory se nádorové buňky mohou nacházet v periferní krvi a lymfatických uzlinách. Z pohledu diagnostiky je periferní krev dostupná i pro pravidelnou monitoraci pacientů Limitací je zde nízká koncentrace CTC, méně než 10/mL. Sentinelová uzlina z operačního materiálu podává informaci o infiltraci regionálních lymfatických uzlin nádorovými buňkami, pro pravidelnou monitoraci pacientů je limitací dostupnost. Přítomnost nádorových buněk můžeme zjistit v periferní krvi nebo lymfatických uzlinách nepřímo, detekcí volných nukleových kyseliny (DNA, RNA) nebo přímo, detekcí nádorových buněk jako takových. Při detekcí volných nukleových kyseliny předpokládáme, že pocházejí buď z rozpadlých nádorových buněk, nebo se uvolní do izolovaného materiálu z cirkulujících nádorových buněk. Následně se izolují nukleové kyseliny a detekují se specifické mutace v DNA (např. mutace genu K-ras) nebo se stanovuje exprese genů, které jsou charakteristické pro nádorové buňky a to na úrovni RNA metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT qPCR).

Tabulka 6 Markery exprese (mRNA) používané pro detekci CTC

Kolorektální karcinom

CEA, CK 19, CK20, EGFR, MUC 1, MUC 2

Karcinom prsu

CK 18, CK19, mammaglobin, EGFR, MUC-1

Karcinom prostaty

PSA

32


Typizace CTC Z periferní krve se získávají CTC přímo nebo se izoluje tzv. “obohacená frakce CTC“. Po izolaci následuje ověření charakteru buněk metodami imunocytochemie (značení protilátkami), průtokové cytometrie nebo molekulárně biologickými metodami např. RT qPCR nebo sekvenace DNA. Pro izolace CTC byla vyvinuta řada metod od postupů manuální izolace až po automatizované postupy, které však používají stejných principů. Je to imunomagnetická separace využívající protilátek proti epiteliálním antigenům (např. proti molekule EpCAM) pro pozitivní selekce a anti CD45 protilátku pro negativní selekce pro odstranění leukocytů. Tyto protilátky jsou připevněny na magnetické kuličky, které umožňují separaci jednotlivých frakcí. Podobný postup používají například soupravy firmy Adnagen. Další možností oddělení nádorových buněk, i když méně specifickou, je jejich izolace pomocí hustotního gradientu (gradient Ficollu) nebo použití filtračních metod. Tak je možno zachytit CTC na filtru (např. firmy Millipore), kdy leukocyty projdou membránou a na filtru zůstávají buňky větší, což jsou většinou nádorové buňky. Z automatizovaných metod je třeba zmínit soupravy a přístroj americké firmy Veridex - Cell Search Assay, který schválilo ministerstvo spojených státu Food and Drug Administration jako prognostický test. Přístroj využívá pro izolaci CTC protilátek imobilizovaných na magnetické partikule a následné zobrazení izolovaných buněk. Přínos stanovení CTC by měl být pro prognózu a sledování léčby pacientů s karcinomem prsu kolorekta a karcinomem prostaty. Rutinnímu použití mimo jiné však brání absence velkých klinických studií, nemožnost srovnání studií provedených za použití různých izolačních metod a do jisté míry i cena těchto vyšetření.

33


4. SHRNUTÍ Správně indikované vyšetření nádorových markerů může přispět především k časnému záchytu recidivy onemocnění a tím i k rychlejšímu terapeutickému zákroku, který může prodloužit život nemocného. Orgánová i nádorová specificita při vyšetřování markeru je relativně nízká, proto je nutné vyšetřovat nádorové markery v pravidelných intervalech a v optimální kombinaci. Pro časnou diagnostiku recidivy nádového onemocnění, je dynamika vzestupu markerů. Praxe je však přesně opačná, vyšetření jsou indikována naprosto náhodně. To znamená spíše ekonomickou ztrátu, protože výtěžnost těchto nahodilých vyšetření je naprosto nulová. Mnohdy je opomíjeno předoperační stanovení nádorových markerů, které je nezbytným předpokladem využití markerů v úspěšné kontrole terapie.

5. LITERATURA 1.

Alexiou, D., Karayiannakis, AJ., Syrigos, KN., Zbar, A., Kremmyda, A., Bramis, I., Tsigris, C. Serum levels of Eselectin, ICAM-1 and VCAM-1 in colorectal cancer patients: correlations with clinicopathological features, patient survival and tumour surgery. Eur J Cancer, 2001, Dec, 37(18), p. 2392-2397.

2.

Amaya, H., Tanigawa, A., Lu, C., Matsumura, M., Shimomatsuya, T., Horiuchi, T., Muroaka, T. Associacion of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis, survival and thymidin phosphorylase/plateled derived endothelial cell growth factor expression in human colorectal cancer. Cancer Lett 1997, 119, s. 227-235.

3.

Aotake, T., Cai De, L., Chiba, Y. Changes of Angiogenesis and Tumor Cell Apoptosis during Colorectal Carcinogenesis. Clin Cancer Research 1999, 5, p. 135-142.

4.

ASCO - American Society of Clinical Oncology: Clinical Practice Guidelines for the Use of Tumor Markers in Breast and Colorectal Cancer. J Clin Oncology, 1996, 14(10), p. 2843-2877.

5.

ASCO special articel: 2000 Uptade of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast and Colorectal Cancer. Clinical practice guidelines of the American society of clinical oncology.

6.

Banks RE, Gearing AJ, Hemingway IK, et al. Circulating intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), E-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human malignancies. Br J Cancer. 1993 Jul;68(1):122-4.

7.

Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000; 6: 389-395.

8.

Dirix, L. Y., Vermeulen, p. b., Hubens, G. et al. Serum basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor and tumour growth kinetic in advanced colorectal cancer. Ann. Oncol., 1999, 7, p. 843-848.

9.

Duffy MJ, van Dalen A, Haglund C, et al. Clinical utility of biochemical markers in colorectal cancer: European Group on Tumour Markers (EGTM) guidelines. Eur J Cancer. 2003 Apr;39(6):718-27. Review.

34


10. Duffy MJ. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy.Curr Pharm Des. 2004;10(1):39-49. Review 11. Duffy MJ. Evidence for the clinical use of tumour markers Ann Clin Biochem. 2004 Sep;41(Pt 5):370-7. 12. Duffy MJ, Duggan C. The urokinase plasminogen activator system: a rich source of tumour markers for the individualised management of patients with cancer Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):54113. EGTM-EUROPEAN GROUP ON TUMOUR MARKERS. Tumour Markers in Gastrointestinal Cancers-EGTM Recommendations. Anticancer Research 1999,19, p. 2785-2820. 14. Franke WW, Schmid E, Osborn M, Weber K (1979). Intermediate-sized filaments of human endothelial cells. J Cell Biol. 81 (3): 570–580. 15. Harris, L., Fritsche, H., Mennel, R., Norton, L., Ravdin, P., Taube, S.,Somerfield, M.R., Hayes, D.F., Bast Jr., R.C., 2007. American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer. J. Clin. Oncol. 25, 5287e5312, . Locker, G.Y., Hamilton, S., Harris, J., Jessup, J.M., Kemeny, N., Macdonald, J.S., Somerfield, M.R., Hayes, D.F., Bast Jr., R.C., 2006. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J. Clin. Oncol. 24, 5313e5327.,) 16. Harris AL.: Antiangiogenesis for cancer therapy. The Lancet, Vol. 349, 13-15, 1997. 17. Holubec, L., Jr., Topolčan, O., Pikner, R.: Biologická aktivita u kolorektálního karcinomu. Čas. Lék. Čes. 2002, 141(16), s. 508-512 18. Holubec, L.jr, Topolčan, O., Fínek, J., Pikner, R., Pecen, L., Lipská, L., Holubec, L.sen., Visokai, V. The role of VCAM, ICAM, Selectin E and Selectin P in detection of liver metastases of colorectal carcinoma. Tumor Biology 23(S1): 51, 2002 19. Kaušitz, J. et al.: Onkológia. Veda, 2003. 20. Masopust J. et al.: Patobiochemie buňky. 2003. ISBN: 80-239-1011-0. 21. Nelson, AR., Fingleton, B., Rothenberg, LM., Matrisian, LM. Matrix Metalloproteases: Biologic Activity and Clinical Implications. J Clin Oncology 2000, 18(5), p. 1135-1149. 22. Schweizer J, Bowden PE, Coulombe PA, Langbein L, Lane EB, Magin TM, Maltais L, Omary MB, Parry DA, Rogers MA, Wright MW (2006). New consensus nomenclature for mammalian keratins". J Cell Biol. 174 (2): 169– 174. 23. Stevenson, SGW. Matrix metalloproteinases in angiogenesis: a moving target for therapeutic intervention. J of Clin Investig 1999, 103, p. 1237-1241 24. Walid MS, Osborne TJ, Robinson JS (2009). "Primary brain sarcoma or metastatic carcinoma?". Indian J Cancer 46 (2): 174–175 25. Holdenrieder S, Stieber P, Liska V, Treska V, Topolcan O, Dreslerova J, Matejka VM, Finek J, Holubec L. Cytokeratin serum biomarkers in patients with colorectal cancer. Anticancer Res. 2012 May;32(5):1971-6. PubMed PMID: 22593474. 9: Liska V, Sutnar A, Jr LH, Vrzalova J, Treska V, Skalicky T, Pesta M, Kormunda S, Finek J, Rousarova M, Topolcan O. Matrix metalloproteinases and thein inhibitors in correlation to proliferative and classical tumour markers during surgical therapy of colorectal liver metastases. Bratisl Lek Listy.2012;113(2):10813. PubMed PMID: 22394042. 26. Pesta M, Kulda V, Kucera R, Pesek M, Vrzalova J, Liska V, Pecen L, Treska V, Safranek J, Prazakova M, Vycital O, Bruha J, Holubec L, Topolcan O. Prognostic significance of TIMP-1 in non-small cell lung cancer. Anticancer Res. 2011 Nov;31(11):4031-8. PubMed PMID: 22110238. 27. Pazdiora P, Svobodova S, Fuchsova R, Kucera R, Prazakova M, Vrzalova J, Narsanska A, Strakova M, Treskova I, Pecen L, Treska V, Holubec L Jr, Pesek M, Finek J, Topolcan O. Vitamin D in colorectal, breast, prostate and lung cancer: a pilot study. Anticancer Res. 2011 Oct;31(10):3619-21. PubMed PMID: 21965787. 28. Prazakova M, Vrzalova J, Auge JM, Safranek J, Topolcan O, Fuchsova R, Spisakova M, Svobodova S, Holubec L Jr, Pesta M. The role of MonoTotal in the primary diagnosis, prognosis and follow-up of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Anticancer Res. 2011 Sep;31(9):3107-12. PubMed PMID: 21868567. 35


29. Treska V, Topolcan O, Vrzalová J, Slauf F, Liska V, Skalický T, Sutnar A, Fichtl J, Narsanská A, Vachtová M. [Can tumor markers predict outcomes of portal vein branch embolization in patients with primary inoperable liver tumors?].Rozhl Chir. 2011 May;90(5):285-9. Czech. PubMed PMID: 21838131. 30. Treska V, Topolcan O, Kocová J, Molácek J, Houdek K, Tonar Z, Vrzalová J, Tresková I, Krízková V, Boudová L. [Plasmatic levels of proinflammatory cytokines in abdominal aortic aneurysms]. Rozhl Chir. 2011 Jan;90(1):37-41. Czech. PubMed PMID: 21634132. 31. Liska V, Holubec L Jr, Treska V, Vrzalova J, Skalicky T, Sutnar A, Kormunda S, Bruha J, Vycital O, Finek J, Pesta M, Pecen L, Topolcan O. Evaluation of tumour markers as differential diagnostic tool in patients with suspicion of liver metastases from breast cancer. Anticancer Res. 2011 Apr;31(4):1447-51. PubMed PMID: 21508401. 32. Kobr J, Pizingerova K, Fremuth J, Sasek L, Kocova J, Hes O, Racek J, Topolcan O. Signaling molecules for early detection of adverse interactions during mechanical ventilation in animal models. In Vivo. 2011 MarApr;25(2):209-17. PubMed PMID: 21471537. 33. Svobodova S, Topolcan O, Holubec L Jr, Levy M, Pecen L, Svacina S. Parameters of biological activity in colorectal cancer. Anticancer Res. 2011 Jan;31(1):373-8. PubMed PMID: 21273626. 34. Treska V, Topolcan O, Vrzalova J, Skalicky T, Sutnar A, Liska V, Fichtl J, Narsanska A, Ferda J, Treskova I, Mirka H, Kreuzberg B. Predictive value of serum biomarkers in patients after portal vein embolization (PVE): a pilot study. Anticancer Res. 2011 Jan;31(1):339-44. PubMed PMID: 21273621. 35. Rupert K, Holubec L, Nosek J, Houdek K, Topolcan O, Treska V. [Significance of the TPS cytokeratin marker in the postoperative follow up of colorectal carcinoma patients]. Rozhl Chir. 2009 Aug;88(8):428-33. Czech. PubMed PMID: 20055296. 36. Duffy MJ, Sturgeon C, Lamerz R, Haglund C, Holubec VL, Klapdor R, Nicolini A, Topolcan O, Heinemann V. Tumor markers in pancreatic cancer: a European Group on Tumor Markers (EGTM) status report. Ann Oncol. 2010 Mar;21(3):441-7. Epub 2009 Aug 18. Review. PubMed PMID: 19690057. 37. Safranek J, Pesta M, Holubec L, Kulda V, Dreslerova J, Vrzalova J, Topolcan O, Pesek M, Finek J, Treska V. Expression of MMP-7, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 mRNA in lung tissue of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and benign pulmonary disease. Anticancer Res. 2009 Jul;29(7):2513-7. PubMed PMID: 19596921. 38. Treska V, Topolcan O, Stanislav K, Liska V, Holubec L. Preoperative tumor markers as prognostic factors of colorectal liver metastases. Hepatogastroenterology. 2009 Mar-Apr;56(90):317-20. PubMed PMID: 19579590. 39. Vrzalova J, Prazakova M, Novotny Z, Topolcan O, Casova M, Holubec L Jr. Test of ovarian cancer multiplex xMAP technology panel. Anticancer Res. 2009 Feb;29(2):573-6. PubMed PMID: 19331205. 40. Ulcova-Gallova Z, Gruberova J, Vrzalova J, Bibkova K, Peknicova J, Micanova Z, Topolcan O. Sperm antibodies, intra-acrosomal sperm proteins, and cytokines in semen in men from infertile couples. Am J Reprod Immunol. 2009 Mar;61(3):236-45. PubMed PMID: 19239426. 41. Levy M, Visokai V, Lipska L, Topolcan O. Tumor markers in staging and prognosis of colorectal carcinoma. Neoplasma. 2008;55(2):138-42. PubMed PMID: 18237252. 42. Linhartová K, Veselka J, Sterbáková G, Racek J, Topolcan O, Cerbák R. Parathyroid hormone and vitamin D levels are independently associated with calcific aortic stenosis. Circ J. 2008 Feb;72(2):245-50. PubMed PMID: 18219161. 43. Hess Z, Podlipný J, Rosolová H, Topolcan O, Petrlová B. [Cortisol levels are more closely associated with depressiveness and other psychopathologies than catecholamine levels]. Vnitr Lek. 2007 Oct;53(10):1040-6. Czech. PubMed PMID: 18072427. 44. Liska V, Treska V, Holubec L, Kormunda S, Skalicky T, Sutnar A, Topolcan O. Recurrence of colorectal liver metastases after surgical treatment: multifactorial study. Hepatogastroenterology. 2007 Sep;54(78):1741-4. PubMed

36


45. Sutnar A, Pesta M, Liska V, Treska V, Skalicky T, Kormunda S, Topolcan O, Cerny R, Holubec L Jr. Clinical relevance of the expression of mRNA of MMP-7, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and CEA tissue samples from colorectal liver metastases. Tumour Biol. 2007;28(5):247-52. Epub 2007 Nov 9. PubMed PMID: 17992052. 46. Eybl V, Kotyzová D, Sýkora J, Topolcan O, Pikner R, Mihaljevic M, Brtko J, Glattre E. Effects of selenium and tellurium on the activity of selenoenzymes glutathione peroxidase and type I iodothyronine deiodinase, trace element toroid level, and thyroid hormone status in rats. Biol Trace Elem Res. 2007 Summer;117(1-3):105-14. PubMed PMID: 17873396. 47. Safranek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Pesta M, Klecka J, Vodicka J, Finek J, Kormunda S, Pesek M. Expression of mRNA MMP-7 and mRNA TIMP-1 in non-small cell lung cancer. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4C):29536. PubMed PMID: 17695477. 48. Liska V, Holubec L Jr, Treska V, Skalicky T, Sutnar A, Kormunda S, Pesta M, Finek J, Rousarova M, Topolcan O. Dynamics of serum levels of tumour markers and prognosis of recurrence and survival after liver surgery for colorectal liver metastases. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4C):2861-4. PubMed PMID: 17695461. 49. Slavíková J, Kuncová J, Topolcan O. Plasma catecholamines and ischemic heart disease. Clin Cardiol. 2007 Jul;30(7):326-30. PubMed PMID: 17674373. 50. Votava T, Topolcan O, Holubec L Jr, Cerna Z, Sasek L, Finek J, Kormunda S. Changes of serum thymidine kinase in children with acute leukemia. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4A):1925-8. PubMed PMID: 17649797. 51. Topolcan O, Holubec L, Polivkova V, Svobodova S, Pesek M, Treska V, Safranek J, Hajek T, Bartunek L, Rousarova M, Finek J. Tumor markers in pleural effusions.´Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4A):1921-4. PubMed PMID: 17649796. 52. Svobodova S, Topolcan O, Holubec L, Treska V, Sutnar A, Rupert K, Kormunda S, Rousarova M, Finek J. Prognostic importance of thymidine kinase in colorectal and breast cancer. Anticancer Res. 2007 JulAug;27(4A):1907-9. PubMed PMID: 17649793. 53. Finek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Elgrova L, Skalova A, Pecen L. The importance of prognostic factors in premenopausal women with breast cancer. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4A):1893-6. PubMed PMID: 17649790. 54. Liska V, Holubec L, Treska V, Skalicky T, Sutnar A, Topolcan O, Kormunda S, Finek J. Tumor markers as useful predictors of survival rate after explorátory laparotomy for liver malignancies. Anticancer Res. 2007 Jul-Au g;27(4A):1887-91. PubMed PMID: 17649789. 55. Holubec L Jr, Topolcan O, Finek J, Salvet J, Svoboda T, Svobodova S, Mrazkova P, Ludvikova M. Dynamic monitoring of cardio-specific markers and markers of thyroid gland function in cancer patients--a pilot study. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27(4A):1883-6. PubMed PMID: 17649788. 56. Jancarikova D, Pesek M, Benesova L, Topolcan O, Holubec L Jr, Minarik M. Acquired resistance of pulmonary adenocarcinoma to initially successful targeted therapy due to EGFR mutation T790M. Anticancer Res. 2007 JulAug;27(4A):1879-82. PubMed PMID: 17649787. 57. Pesta M, Topolcan O, Holubec L Jr, Rupert K, Cerna M, Holubec LS, Treska V, Finek J, Cerny R. Clinicopathological assessment and quantitative estimation of the matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-7 and the inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 in colorectal carcinoma tissue samples. Anticancer Res. 2007 JulAug;27(4A):1863-7. PubMed PMID: 17649785. 58. Duffy MJ, van Dalen A, Haglund C, Hansson L, Holinski-Feder E, Klapdor R, Lamerz R, Peltomaki P, Sturgeon C, Topolcan O. Tumour markers in colorectal cancer: European Group on Tumour Markers (EGTM) guidelines for clinical use. Eur J Cancer. 2007 Jun;43(9):1348-60. Epub 2007 May 18. Review. PubMed PMID: 17512720. 59. Topolcan O. [A recommended procedure in laboratory-based diagnostics of thyroid function--yes or not?]. Vnitr Lek. 2006 Oct;52(10):985-7. Czech. PubMed PMID: 17063816. 60. Cerna M, Holubec L Jr, Pesta M, Kormunda S, Topolcan O, Cerny R. Quantitative estimation of CEA and CK20 expression in tumour tissue of colorectal cancer and its liver metastases with reverse transcription and real-time PCR. Anticancer Res. 2006 Jan-Feb;26(1B):803-8. PubMed PMID: 16739357. 37


61. Liska V, Treska V, Holubec L, Skalický T, Sunar A, Topolcan O, Fínek J. [Prognostic factors of early recurrence of colorectal liver metastases and their usage in clinical praxis]. Rozhl Chir. 2006 Apr;85(4):163-8. Review. Czech. PubMed PMID: 16719411. 62. Liska V, Treska V, Holubec L Jr, Skalický T, Sutnar A, Topolcan O, Fínek J. [A partial relaps of a colorectal carcinoma metastatic process following liver surgery--a multifactorical study]. Rozhl Chir. 2006 Feb;85(2):86-9. Czech. PubMed PMID: 16626018. 63. Opatrná S, Klaboch J, Opatrný K Jr, Holubec L, Tomsů M, Sefrna F, Topolcan O. Procalcitonin levels in peritoneal dialysis patients. Perit Dial Int. 2005 Sep-Oct;25(5):470-2. PubMed PMID: 16178480. 64. Mayer O Jr, Simon J, Hrbková J, Pikner R, Topolcan O. [Epidemiological study of hypothyroidism as cardiovascular risk in population]. Cas Lek Cesk. 2005;144(7):459-64; discussion 464-5. Czech. PubMed PMID: 16161538. 65. Pesta M, Holubec L Jr, Topolcan O, Cerna M, Rupert K, Holubec LS, Treska V, Kormunda S, Elgrova L, Finek J, Cerny R. Quantitative estimation of matrix metalloproteinases 2 and 7 (MMP-2, MMP-7) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases 1 and 2 (TIMP-1, TIMP-2) in colorectal carcinoma tissue samples. Anticancer Res. 2005 Sep-Oct;25(5):3387-91. PubMed PMID: 16101153. 66. Rosolova H, Cech J, Simon J, Spinar J, Jandova R, Widimský sen J, Holubec L, Topolcan O. Short to long term mortality of patients hospitalised with heart failure in the Czech Republic--a report from the EuroHeart Failure Survey. Eur J Heart Fail. 2005 Aug;7(5):780-3. PubMed PMID: 16051521. 67. Finek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Salvet J, Pikner R, Holdenrieder S, Stieber P, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Helmichova E. Clinical relevance of tumor markers for the control of chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A):1655-8. PubMed PMID: 16035152. 68. Ludvíková M, Holubec L Jr, Ryska A, Topolcan O. Proliferative markers in diagnosis of thyroid tumors: a comparative study of MIB-1 and topoisomerase II-a immunostaining. Anticancer Res. 2005 MayJun;25(3A):1835-40. PubMed PMID: 16033110. 69. Topolcan O, Holubec L Jr, Finek J, Stieber P, Holdenrieder S, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Lipska L. Changes of thymidine kinase (TK) during adjuvant and palliative chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A):1831-3. PubMed PMID: 16033109. 70. Holdenrieder S, Holubec L Jr, Topolcan O, Finek J, Stieber P. Circulating nucleosomes and cytokeratin 19fragments in patients with colorectal cancer during chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A):1795801. PubMed PMID: 16033102. 71. Holubec L Jr, Topolcan O, Finek J, Holdenrieder S, Stieber P, Pesta M, Pikner R, Holubec Sen L, Sutnar A, Liska V, Svobodova S, Visokai V, Kormunda S. Markers of cellular adhesion in diagnosis and therapy control of colorectal carcinoma. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A):1597-601. PubMed PMID: 16033066. 72. Pikner R, Ludvíkova M, Ryska A, Kholova I, Holubec L Jr, Topolcan O, Pecen L, Fínek J. TPS, thymidine kinase, VEGF and endostatin in cytosol of thyroid tissue samples. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A):1517-21. PubMed PMID: 16033053. 73. Holubec L, Finek J, Topolcan O, Svobodová S. [Serum tumor markers at exocrine adenocarcinoma of pancreas]. Cas Lek Cesk. 2005;144(2):86-8; discussion 89. Review. Czech. PubMed PMID: 15807292. 74. Hess Z, Rosolová H, Podlipný J, Holubec L, Topolcan O, Petrlová B. [Metabolic syndrome and latent depression in the population sample]. Cas Lek Cesk. 2004;143(12):840-4; discussion 844-6. Czech. PubMed PMID: 15730216. 75. Opatrná S, Topolcan O, Opatrný K Jr. [The role of cytokines in peritoneal dialysis]. Vnitr Lek. 2000 Nov;46(11):794-800. Review. Czech. PubMed PMID: 15637896. 76. Rusavý Z, Sramek V, Suchat R, Lacigova S, Topolcan O. Effects of carrier´solution on insulin bioavailability. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2004 Nov-Dec;28(6):439-41. PubMed PMID: 15568292. 77. Hájek T, Bartůnĕk L, Topolcan O, Polívková V, Hess Z, Holubec L Jr. [The role of procalcitonin in the patient assessment after surgical procedures]. Rozhl Chir. 2004 Jul;83(7):337-41. Czech. PubMed PMID: 15373204.

38


78. Holubec L Jr, Fínek J, Topolcan O, Bouda J, Rokyta Z. [Clinical relevance of tumor markers in epithelial ovarian cancer]. Ceska Gynekol. 2004 May;69(3):225-8. Czech. PubMed PMID: 15309999. 79. Svacina S, Matoulek M, Svobodová S, Visokai V, Lipská L, Topolcan O, Zvárová J, Plavcová M. [Gastrointestinal tract cancer and diabetes mellitus]. Vnitr Lek. 2004 May;50(5):386-91. Review. Czech. PubMed PMID: 15305638. 80. Treska V, Skalický T, Fínek J, Kormunda S, Topolcan O, Sutnar A, Neprasová P, Sůvová B. [Is liver resection or radiofrequency ablation indicated in breast carcinoma metastases?]. Rozhl Chir. 2004 Apr;83(4):173-7. Czech. PubMed PMID: 15216686. 81. Fínek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Pikner R, Sůvová B, Treska V. [Clinical importance of determination of tumor markers during follow-up in breast carcinoma]. Cas Lek Cesk. 2004;143(3):174-7. Czech. PubMed PMID: 15134036. 82. Mares J, Opatrná S, Ferda J, Opatrný K Jr, Tomsu M, Sefrna F, Kreuzberg B, Topolcan O. Computed tomographybased assessment of bone mineral density in patients treated with peritoneal dialysis. Perit Dial Int. 2003 NovDec;23(6):601-3. PubMed PMID: 14703206. 83. Kholová I, Ludvíková M, Ryska A, Hanzelková Z, Cap J, Pecen L, Topolcan O. Immunohistochemical detection of dipeptidyl peptidase IV (CD 26) in thyroid neoplasia using biotinylated tyramine amplification. Neoplasma. 2003;50(3):159-64. PubMed PMID: 12937847. 84. Treska V, Kocova J, Boudova L, Neprasova P, Topolcan O, Pecen L, Tonar Z. Inflammation in the wall of abdominal aortic aneurysm and its role in the symptomatology of aneurysm. Cytokines Cell Mol Ther. 2002;7(3):91-7. PubMed PMID: 12850808. 85. Kholová I, Ludvíkova M, Ryska A, Topolcan O, Pikner R, Pecen L, Cáp J, Holubec L Jr. Diagnostic role of markers dipeptidyl peptidase IV and toroid peroxidase in thyroid tumors. Anticancer Res. 2003 MarApr;23(2A):871-5. PubMed PMID: 12820316. 86. Holubec L Jr, Topolcan O, Pikner R, Pecen L, Holubec Sen L, Finek J, Ludvikova M, Cerna M. Criteria for the selection of referential groups in tumor marker statistical evaluation on the basis of a retrospective study. Anticancer Res. 2003 Mar-Apr;23(2A):865-70. PubMed PMID: 12820315. 87. Duffy MJ, van Dalen A, Haglund C, Hansson L, Klapdor R, Lamerz R, Nilsson O, Sturgeon C, Topolcan O. Clinical utility of biochemical markers in colorectal cancer: European Group on Tumour Markers (EGTM) guidelines. Eur J Cancer. 2003 Apr;39(6):718-27. Review. PubMed PMID: 12651195. 88. Hauerová D, Pikner R, Topolcan O, Mrázová D, Holubec L Jr, Pecen L. [Thyroid disease in pregnant women and its development after childbirth]. Vnitr Lek. 2002 Nov;48(11):1060-4. Czech. PubMed PMID: 12577458. 89. Holubec L Jr, Topolcan O, Pikner R. [Biological activity in colorectal carcinoma]. Cas Lek Cesk. 2002 Aug 16;141(16):508-12. Review. Czech. PubMed PMID: 12404950. 90. Tucek M, Tenglerová J, Kollárová B, Kvasnicková M, Maxa K, Mohyluk I, Svandová E, Topolcan O, Vlasák Z, Cikrt M. Effect of acrylate chemistry on human health. Int Arch Occup Environ Health. 2002 Oct;75 Suppl:S67-72. Epub 2002 Sep 6. PubMed PMID: 12397413. 91. Hauerová D, Pikner R, Topolcan O, Mrázová D, Holubec L Jr, Pecen L. [Prevalence of thyroid gland disorders in pregnant women in the West Bohemia Region during their 2nd trimester of pregnancy in the year 2000--pilot study]. Vnitr Lek. 2002 Jul;48(7):629-31. Czech. PubMed PMID: 12197405. 92. Nekulova M, Pecen L, Kalabova R, Simickova M, Topolcan O, Pikner R, Vondracek V, Valik D. Predicting response of ovarian cancer to paclitaxel treatment based on trend analysis of serum CA125. Clin Chem. 2002 Aug;48(8):1364-7. PubMed PMID: 12142397. 93. Opatrná S, Racek J, Stehlík P, Senft V, Sefrna F, Topolcan O, Opatrný K Jr. [Effect of a dialysis solution with icodextrin on ultrafiltration and selected metabolic parameters in patients treated with peritoneal dialysis]. Cas Lek Cesk. 2002 May 10;141(9):281-5. Czech. PubMed PMID: 12061197. 94. Tŕeska V, Hasman D, Topolcan O. Tissue concentration of cytokines in kidneys from non-heart-beating donors. Transplant Proc. 2001 Nov-Dec;33(7-8):3747-9.PubMed PMID: 11750597. 39


95. Holubec L Jr, Topolcan O, Pikner R, Pecen L, Vaclavickova J, Wirthova M, Molacek J, Stieber P, Holdenrieder S, Sen LH, Finek J. The significance of CEA, CA19-9 and CA72-4 in the detection of colorectal carcinoma recurrence. Anticancer Res. 2000 Nov-Dec;20(6D):5237-44. PubMed PMID: 11326702. 96. Treska V, Topolcan O, Pecen L. Cytokines as plasma markers of abdominalaortic aneurysm. Clin Chem Lab Med. 2000 Nov;38(11):1161-4. PubMed PMID:11156350. 97. Treska V, Hasman D, Topolcan O, Hes O. Cytosolic concentration of cytokinesin kidneys from non-heart beating donors. Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med.2000;143:103. PubMed PMID: 11144105.

40

Biomarkery v onkologii

Recommend Documents