Skripsi. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: Dina Christiana Dewi NIM : 088114014

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012


PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: Dina Christiana Dewi NIM : 088114014

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012




HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan karyaku ini untuk kedua orang tuaku Yohanes Agus Yunanto, Veronika Sri Mulyani, Kakaku Mada Prabawa, Sahabatku, Almamaterku




PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melindungi dan memberikan berkat rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini tidak lepas dari dukungan, bantuan, dan motivasi dari banyak pihak. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku Dosen Pembimbing yang memberikan saran, masukan, kritikan dan solusi kepada penulis selama penyusunan skripsi ini. 3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan, kritik, solusi dan motivasi kepada penulis untuk skripsi ini. 4. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan masukan, kritik, saran dan solusi yang bermanfaat kepada penulis untuk skripsi ini.


5. Ibu Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 6. PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero) Klaten atas sumbangan daun tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst yang berguna dalam penelitian. 7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman sehingga berharga dalam proses penyusunan skripsi. 8. Seluruh staff laboratorium, keamanan dan kebersihan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, terutama Mas Bimo, Pak Parlan, dan Mas Kunto yang telah membantu dan memberikan dukungan selama pelaksanaan penelitian ini. 9. Perpustakaan Universitas Sanata Dharma atas koleksi buku-buku dan fasilitas internet sehingga mempermudah penulis dalam memperoleh bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penulisan skripsi ini. 10. Keluargaku tercinta, Bapak Agus Yunanto, Ibu Sri Mulyani, Mas Mada Prabawa yang tidak pernah berhenti memberikan semangat dan doa sampai akhirnya terselesaikannya skripsi ini. 11. DF. Fani Rista Maji, Bernadet Brigita dan Leonardus Damar yang selalu mendukung, menghibur, memberikan perhatian dan menemani penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini. 12. Ayesa Syenina dan Amelia Ernesta selaku teman seperjuangan, sahabat dan teman berbagi cerita, terima kasih atas semangat, perhatian, motivasi, diskusi dan doa yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi.


13. Teman-teman skripsi nikotin KLT-Densito: Novi, Citra, Helen atas diskusi, dukungan dan kerjasamanya selama penelitian. 14. Teman-teman di laboratorium : Felicia, Prasilya, Sasa, Susan, Nona, Sari, Tere dan Wiwi atas dukungan dan keceriaan dalam melakukan penelitian. 15. Teman-teman KKN Alternatif XXXIX Tematik di Desa Pariwiata Pindul atas keceriaan, kerjasama dan dinamika yang telah diberikan. 16. Teman-teman FST-A dan kelompok praktikum A, terima kasih atas kerjasama, dukungan dan keceriaan selama perkuliahan dan praktikum. 17. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas pengalaman, keceriaan dan kebersamaan yang tidak bisa terlupakan. 18. Teman-teman Fakultas Farmasi, terima kasih atas kebersamaan. 19. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis

menyadari

masih

banyak

terdapat

kekurangan

dalam

penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk membantu penulis dalam penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga skripsi ini bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 9 November 2011 Dina Christiana Dewi


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL...................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN.....................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .....................................................

v

LEMBAR PERNYATAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA .........

vi

PRAKATA ..................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ...............................................................................................

x

DAFTAR TABEL .......................................................................................

xv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xvi

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xviii

INTISARI....................................................................................................

xix

ABSTRACT ................................................................................................

xx

BAB I PENGANTAR .................................................................................

1

A. Latar Belakang .....................................................................................

1

1.

Permasalahan ................................................................................

4

2.

Keaslian Penelitian........................................................................

4

3.

Manfaat Penelitian ........................................................................

4

B. Tujuan Penelitian .................................................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA..........................................................

6

A. Tembakau .............................................................................................

6

1.

Keterangan Botani ........................................................................

6


2.

Deskripsi Tanaman .......................................................................

6

a. Akar ..........................................................................................

6

b. Batang ......................................................................................

6

c. Daun .........................................................................................

6

d. Bunga .......................................................................................

6

e. Buah .........................................................................................

7

Tanaman C3 ..................................................................................

7

B. Nikotin .................................................................................................

9

3.

Simplisia dan Penanganan Daun Tembakau ........................................

11

1. Simplisia ..........................................................................................

11

2. Penanganan Daun Tembakau ..........................................................

11

a. Sortasi Pendahuluan ....................................................................

11

b. Penyejunan ..................................................................................

11

3. Curing ..............................................................................................

12

a. Penguningan ..............................................................................

12

b. Pengikatan Warna ....................................................................

12

c. Pengeringan Lembar Daun .......................................................

12

d. Pengeringan Gagang ................................................................

12

C. Ekstraksi ...............................................................................................

13

1.

Ekstrak ..........................................................................................

13

2.

Ekstraksi ........................................................................................

13

3.

Cairan Penyari ...............................................................................

13

4.

Soxhlet ..........................................................................................

14


5.

Penguapan Ekstrak Cair ................................................................

15

D. Spektrofotometri UV............................................................................

15

1.

Transisi

* ............................................................................

16

2.

Transisi n

* .............................................................................

16

3.

Transisi n

* dan

* .............................................................

17

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................................................

18

1.

Definisi dan Instrumentasi ............................................................

18

2.

Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ................................................

21

F. Landasan Teori.....................................................................................

22

G. Hipotesis ..............................................................................................

23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN....................................................

24

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...........................................................

24

B. Variabel ................................................................................................

24

1.

Variabel bebas ...............................................................................

24

2.

Variabel tergantung .......................................................................

24

3.

Variabel pengacau .........................................................................

24

C. Definisi Operasional ............................................................................

24

D. Bahan Penelitian ..................................................................................

25

E. Alat Penelitian ......................................................................................

25

F. Tata Cara Penelitian .............................................................................

26

1.

Pembuatan Buffer Asetat ..............................................................

26

2.

Pembuatan Fase Gerak ..................................................................

26

3.

Pengambilan dan Pembuatan Sampel ...........................................

26


4.

Pembuatan Larutan Baku Nikotin .................................................

26

5.

Pembuatan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ..................

27

6.

Pembuatan Kurva Baku Nikotin ...................................................

27

7.

Pembuatan HCl Encer ...................................................................

28

8.

Pembuatan NaOH 4 M ..................................................................

28

9.

Preparasi Sampel ...........................................................................

28

10. Ekstraksi Daun Tembakau ............................................................

28

11. Penetapan Kadar Nikotin dalam Sampel ......................................

29

G. Analisis hasil ........................................................................................

29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................

31

A. Pembuatan Fase Gerak .........................................................................

31

B. Pengambilan dan Pembuatan Sampel ..................................................

33

C. Pembuatan Larutan Baku Nikotin ........................................................

35

D. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ..........................

35

E. Pembuatan Kurva Baku Nikotin ..........................................................

37

F. Ekstraksi Secara Soxhletasi dan Penguapan Ekstrak Cair ...................

38

G. Optimasi Waktu Ekstraksi Nikotin dalam Serbuk Daun Tembakau....

39

H. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 8 jam ............................................

42

I.

Preparasi Sampel ..................................................................................

45

J.

Analisis Kualitatif Nikotin ...................................................................

47

K. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau ..

50

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN......................................................

54

A. Kesimpulan......................................................................................

54


B. Saran .............................................................................................. .

54

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

55

LAMPIRAN ................................................................................................

58

BIOGRAFI PENULIS ...............................................................................

82


DAFTAR TABEL Tabel I.

Karakteristik pelarut yang digunakan dalam KCKT ...........

Tabel II.

Hasil pengukuran AUC sampel dengan varisi waktu ekstraksi sampel dengan soxhlet .........................................

Tabel III.

42

Hasil pengukuran AUC ekstraksi serbuk daun tembakau jenis VBN dan NO dengan soxhlet selama 8 jam ...............

Tabel IV.

20

45

Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau kedua sampel .......................................................

50

Tabel V.

Uji Normalitas .....................................................................

51

Tabel VI.

Uji t tidak berpasangan ........................................................

52


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Daun tembakau VBN dan NO ..............................................

7-8

Gambar 2.

Struktur alkaloid dalam daun tembakau ..............................

8

Gambar 3.

Struktur nikotin....................................................................

8

Gambar 4.

Struktur nikotin dan asetilkolin ...........................................

9

Gambar 5.

Jalur biosinesis dengan modifkasi .......................................

10

Gambar 6.

Alat soxhlet..........................................................................

14

Gambar 7.

Diagram tingkat energi elektronik .......................................

16

Gambar 8.

Pengaruh pelarut polar pada transisi

*.......................

17

Gambar 9.

Pengaruh pelarut polar pada transisi n

*.......................

17

Gambar 10.

Instrumentasi KCKT ...........................................................

18

Gambar 11.

Nikotin dalam bentuk terion ................................................

33

Gambar 12.

Spektra maksimum 3 seri konsentrasi ..............................

36

Gambar 13.

Struktur kromofor cincin piridin .........................................

37

Gambar 14.

Grafik hubungan antara konsentrasi analit dengan AUC ....

37

Gambar 15.

Proses ekstraksi dengan alat soxhlet....................................

38

Gambar 16.

Kromatogram optimasi waktu ekstraksi 7, 8, 9, 10 jam ......

40

Gambar 17.

Kromatogram ekstraksi kedua jenis daun tembakau dengan waktu optimum 8 jam .............................................

42

Gambar 18.

Reaksi antara nikotin dengan asam klorida .........................

46

Gambar 19.

Reaksi antara nikotin hidroklorida dengan NaOH ..............

46

Gambar 20.

Struktur bagian polar dan non polar ....................................

47

Gambar 21.

Interaksi nikotin dengan fase diam oktadesilsilan ...............

48


Gambar 22.

Gambar 23.

Interaksi nikotin dengan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) ..........................

48

Kromatogram baku nikotin dan sampel ..............................

49


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Sertifikat analisis baku nikotin E.Merck .........................

59

Lampiran 2.

Surat keterangan dan infomasi tembakau .......................

60

Lampiran 3.

Perhitungan pergeseran pKa nikotin dan pH ..................

63

Lampiran 4.

Perhitungan polaritas fase gerak .....................................

64

Lampiran 5.

Spektrum nikotin ............................................................

65

Lampiran 6.

Hasil Perolehan AUC seri baku nikotin..........................

66

Lampiran 7.

Penimbangan serbuk kering dan ekstrak kental daun tembakau untuk optimasi lama waktu ekstraksi ...

Lampiran 8.

Kromatogram hasil optimasi lama waktu ekstraksi dengan soxhlet ...............................................................

Lampiran 9.

72

Kromatogram hasil penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau NO dan VBN ................

Lampiran 11.

68

Penimbangan serbuk kering dan ekstrak kental daun tembakau untuk optimasi lama waktu ekstraksi .............

Lampiran 10.

67

74

Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau ................................................................

77

Lampiran 12.

Data Uji Statistik.............................................................

79

Lampiran 13.

Kromatogram blanko pelarut buffer asetat:metanol : asetonitril (40:54:6) ......................................................

81


PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU VORSTENLANDEN BAWAH NAUNGAN DAN NA OOGST SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK INTISARI Nikotin merupakan alkaloid yang ditemukan dalam tanaman tembakau (Nicotiana tabaccum) dan memiliki efek farmakologis yang berpotensi dalam pengobatan. Ekstrak daun tembakau yang mengandung nikotin dapat dijadikan sediaan farmasi. Penelitian ini bertujuan untuk penetapan dan membandingkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik. Penelitian ini mengikuti jenis dan rancangan penelitian non eksperimental deskriptif. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18), fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), detektor UV pada maks 260 nm (Ernesta, 2011). Parameter validasi metode meliputi selektifitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang pada konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011). Hasil penelitian menunjukkan kadar rata-rata nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan adalah 2,790x10-3 % b/b ± 2,744x10-5 dengan nilai CV= 0,9835% dan Na Oogst adalah 1,316x10-3 ± 2,775x10-6 dengan nilai CV = 0,2109%. Nilai CV yang diperoleh memenuhi syarat presisi yang baik yaitu <2%. Hasil analisis statistik menggunakan uji t tidak berpasangan menunjukkan bahwa kadar nikotin rata-rata antara kedua sampel berbeda signifikan. Kata kunci : nikotin, tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan, tembakau Na Oogst, KCKT fase terbalik, penetapan kadar.


DETERMINATION NICOTINE CONTAINED IN ETHANOLIC EXTRACT OF TOBACCO LEAF VORSTENLANDEN UNDER SHADE AND NA OOGST USING REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ABSTRACT Nicotine is an alkaloid found in tobacco (Nicotiana tabaccum) plant and it has pharmacological effects which is potential for medical importance. The extract of tobacco leaves that contains nicotine can be made into pharmaceutical products. This research aims to amount and compare nicotine in ethanolic extract of tobacco leaves Vorstenlanden Under Shade and Na Oogst can be determined by using reversed phase HPLC system that have been optimized and validated. This research is conducted with a descriptive non-experimental plan and design. The HPLC system used for the quantitative analysis of nicotine consists of octadecylsilane (C18) as the stationary phase, mixture of acetate buffer:methanol :acetonitrile (40:54:6), UV detector with max of 260 nm (Ernesta, 2011). The parameters of method validation used in this research are selectivity, linearity, accuracy, precision and range of concentration 0.05-0.09 ppm (Syenina,2011). The results of this research of average levels of nicotine contained ethanolic extract of tobacco leaves Vorstenlanden Under Shade 2.790x10-3 % w/w ± 2.744 x10-5 with a CV of 0.9835% and Na Oogst 1.316x10-3 %w/w ± 2.775x106 with a CV of 0.2109%. The value of CV obtained qualifies for good precision which is <2%. The results of statistical analysis using unpaired t test showed that amount of nicotine on average between the two samples are significantly different. Key word : nicotine, tobacco Vorstenlanden Under Shade , tobacco Na Oogst, reversed phase-HPLC, determination.


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Nikotin merupakan senyawa alkaloid yang banyak ditemukan pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum) dengan kadar 0,3 sampai 5% dari berat kering tembakau dari hasil biosintesis di akar dan terakumulasi di daun (Anonim, 2011). Nikotin mampu merangsang pelepasan neurotransmitter (serotonin dan dopamine) dan menyeimbangkan kerja dari neurotransmitter tersebut, karena jika terjadi ketidakseimbangan dapat menyebabkan depresi. Selain itu, nikotin berpotensi dalam mengobati penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson (Anonim, 2006). Besarnya potensi nikotin tersebut memiliki peran dalam bidang kesehatan, sehingga memungkinkan untuk dikembangkan sebagai sediaan farmasi yang terlebih dahulu dibuat dalam ekstrak. Varietas Vorstenlanden merupakan salah satu varietas tanaman tembakau. Varietas Vorstenlanden yang dikembangkan oleh PT. Perkebunan Nusantara X merupakan keturunan pertama (F1) dari hasil perkawinan galur TV 38 dan G. TV 38 yaitu Timor Vorstenlanden dengan no 38 dan kode G adalah tembakau yang ditanam di daerah Gayamprit dengan nama Vorsetenlanden Bawah Naungan (VBN) dan Na Oogst (NO). VBN ditanam pada bulan Juni mulai panen bulan Juli, diberikan waring atau naungan, adanya sistem pengairan sedangkan tembakau NO penanaman


pada pertengahan bulan September dan mulai panen akhir Oktober, tidak diberikan waring atau naungan, pengairannya mengandalkan air hujan, namun jika tidak ada hujan tetap diberikan pengairan buatan. Naungan mempengaruhi intesitas cahaya matahari pada tanaman tembakau yang berpengaruh pada kadar nikotin. Penelitian ini dilakukan untuk analisis kuantitatif kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dan mengetahui perdebaan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun tembakau. Daun tembakau diektraksi dengan menggunakan metode soxhletasi dengan cairan penyari etanol. Metode soxhletasi dipilih karena pengerjaannya mudah, jumlah cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lainnya, proses sirkulasi yang berkesinambungan sehingga senyawa yang tersari lebih banyak. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol karena dapat melarutkan alkaloid basa, panas yang dibutuhkan untuk pemekatan lebih rendah (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). Metode KCKT dipilih untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik tembakau karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa multikomponen dengan hasil pemisahan yang baik, dan waktu yang relatif singkat. Detektor yang digunakan adalah UV karena nikotin memiliki struktur kromofor dan memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang teoritis 262 nm (Cordell, 1981). Penelitian ini merupakan tahap akhir dari serangkaian penelitian penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau yang meliputi


tahap optimasi dan validasi metode. Pada penelitian tentang optimasi metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KCKT fase terbalik menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), kecepatan alir 1,2 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang maksimum 260 nm dengan nilai resolusi 1,5679, tailing factor 1,25, jumlah lempeng teoritis 2247,163 dan nilai HETP 0,0111 (Ernesta, 2011). Pada tahap validasi penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KCKT fase terbalik memenuhi parameter selektivitas dengan nilai resolusi (Rs) 1,531, linearitas dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi pada konsentrasi 0,05 dan 0,09 ppm, rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).


1.

Permasalahan Permasalahan yang dapat dirumuskan berdasarkan latar belakang tersebut

antara lain: a. berapakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO? b. apakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO berbeda bermakna? 2.

Keaslian Penelitian Berdasarkan penelusuran literatur yang dilakukan, maka penetapan kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode KCKT fase terbalik belum pernah dilakukan. Penelitian tentang penetapan kadar nikotin yang pernah dilakukan adalah penetapan kadar nikotin dalam sampel biologis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kromatografi gas, spektrofotometri massa, dan kromatografi cair-MS (LC-MS) (Nakajima, Yamamoto, Kuroiwa, Yokoi, 2000), penetapan kadar nikotin dalam daun tembakau VBN dan NO dengan metode spektrofotometri UV oleh PT. Perkebunan Nusantara X (Persero). 3.

Manfaat penelitian a. Manfaat metodologis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat

memberikan alternatif metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO yaitu menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik. b. Manfaat praktis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi dalam dunia farmasi dan masyarakat tentang kadar nikotin dalam


ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dan perbandingan kadar antara kedua jenis tembakau tersebut.

B. Tujuan Penelitian Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk mengetahui a. kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik. b. mengetahui perbedaan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tembakau 1. Keterangan Botani Tanaman tembakau ( Nicotiana tabaccum L. ) termasuk dalam famili Solanaceae (Cahyono, 1998). 2. Deskripsi tanaman a. Akar, tanaman tembakau merupakan tanaman berakar tunggang yang tumbuh tegak ke pusat bumi. Akar tunggangnya dapat menembus tanah kedalaman 50-75 cm, akar serabutnya dapat menyebar ke samping dan memiliki bulu-bulu akar. Perakaran akan berkembang baik jika tanahnya gembur, mudah menyerap air b. Batang, tanaman tembakau memiliki bentuk batang agak bulat, agak lunak tetapi kuat, semakin ke ujung semakin kecil. Ruas-ruas batang mengalami penebalan yang ditumbuhi daun c. Daun, tanaman tembakau memiliki tulang daun menyirip, bagian tepi daun agak bergelombang dan licin. Lapisan atas daun terdiri atas lapisan palisade parenkim dan spongy parenkim pada bagian bawah. Jumlah daun dalam satu tanaman 28-32 helai (Hanum, 2008). d. Bunga, tanaman tembakau memiliki bunga yang tersusun dalam tandan, kelopak banyak buluh dengan banyak gigi yang tidak sama panjang,


mahkota bunga yang berbentuk terompet, tepinya berlekuk 5, panjang yang tidak sama (1 lebih pendek dari yang lainnya) e. Buah, tanaman tembakau memiliki bakal buah yang berada di atas dasar bunga dan terdiri atas dua ruang yang dapat membesar. Jika masak pecah dengan membelah ruang (Tjitroepomo, 1994). 3. Tanaman C3 Cahaya matahari berperan dalam proses fotosintesis, fotorespirasi dan respirasi suatu. Kebutuhan intesitas cahaya berbeda untuk setiap jenis tanaman dikenal tiga tipe tanaman yaitu : C3, C4 dan CAM. Tanaman C3 adalah kelompok tanaman yang memiliki kebutuhan terhadap cahaya matahari rendah. Ketika tanaman C3 mendapatkan cahaya tinggi/berlebih pada siang hari, stomata tertutup, fotorespirasi meningkat sehingga 02 diikat oleh Ribulosa Bi Phospat (RUBP) menghasilkan senyawa Phospho Gliseric Acid (PGA) yang memiliki 3 atom C pada proses pengikatan C02 oleh yang terjadi secara spontan sehingga energi yang dihasilkan untuk proses fotosintesis rendah (Anonima, 2011). Naungan yang diberikan pada tanaman tembakau VBN bertujuan untuk mengurangi intensitas cahaya sebesar 30% sehingga cahaya yang diperoleh tanaman tersebut sebesar 70% (PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).

a


b

Gambar 1. Daun tembakau (a) VBN dan (b) NO (PT. Perkebunan XIX, 1998)

Nikotin merupakan salah satu alkaloid yang terdapat dalam tanaman tembakau ( Nicotiana tabaccum L. ). Alkaloid lain yang terdapat dalam tembakau adalah nornikotin, anatabin dan anabasin.

Gambar 2. Struktur alkaloid dalam daun tembakau (Domino, 1999)

B. Nikotin

N CH3

Gambar 3. Struktur kimia nikotin

Nikotin merupakan senyawa tak berwarna hingga kuning pucat, bersifat sangat higroskopis. Nikotin dapat berubah warna (fotodegradasi) menjadi coklat apabila terkena paparan sinar matahari dan udara. Berbau tajam serasa terbakar.


Sangat larut dalam alkohol, kloroform, eter, petroleum eter, kerosin, dan minyak (The Merck Index, 1989). Nikotin N+

N-

CH3

H

Asetilkolin O_

CH3

C

O

H2 C

H2 C

N+(CH3)3

Gambar 4. Struktur nikotin dan asetilkolin (Domino, 1999)

Kemiripan nikotin dan asetilkolin terletak pada atom N piridin pada nikotin yang merupakan pendonor elektron yang memiliki kesamaan dengan keto oksigen pada gugus asetilkolin. Muatan positif atom N kuarterner pada asetilkolin memiliki

kesamaan

muatan

positif

atom

N

cincin

pirolidin

nikotin

(Domino,1999). Menurut Whagner (2003), asetilkolin (ACh) merupakan satu jenis neurotransmiter yang berperan dalam regulasi sistem saraf tubuh dan membawa pesan dari ke otak. Nikotin di dalam tubuh mampu menyalin asetilkolin, sehingga setiap reseptor yang diarahkan untuk menanggapi asetilkolin merespon nikotin juga. Dengan cara ini, nikotin dapat memicu pelepasan neurotransmiter lain. Nikotin dapat memerintah kelenjar adrenal untuk melepaskan adrenalin, pembuluh darah melepaskan norephinefrin menyebabkan tekanan darah meningkat. Namun dari beberapa penelitian, nikotin berpotensi untuk terapi penyakit Alzheimer, demetia Parkinson. Pada penyakit Parkinson, nikotin mampu meningkatkan kemampuan kognitif dan motorik penderita (Anonimb, 2011).


Gambar 5. Jalur biosintesis nikotin dengan modifikasi (Anonim, 2010)

Gambar di atas merupakan jalur biosintesis nikotin. D-glukosa merupakan produk fotosintesis yaitu sukrosa (karbohidrat disakarida) yang mengalami hidrolisis menjadi D-glukosa dan fruktosa. D-glukosa tersebut siap dipecah dalam proses glikolisis menjadi asam piruvat. Asam piruvat akan dirombak untuk masuk dalam siklus krebs menjadi asetil Co-A. Asetil Co-A berikatan dengan oksaloasetat dan menghasilkan citrat sampai -ketoglutarat. ketoglutarat menghasilkan 2 asam amino yaitu L-glutamate dan L-arginin yang


menghantarkan ke prekusor biosintesis nikotin yaitu L-ornithine (Salisbury dan Ross, 1995). Kadar

nikotin

yang

diperoleh

dengan

menggunakan

metode

spektrofotometri-UV dalam daun tembakau VBN sebesar 1,4135 dan NO sebesar 0,867% (PT.Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).

C. Simplisia dan Penanganan Daun Tembakau 1. Simplisia Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain simplisia merupakan bahan yang dikeringkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1979). 2. Penanganan Daun Tembakau Kegiatan yang harus dilakukan pada penanganan daun tembakau setelah dipanen adalah sortasi pendahuluan, penyejunan, pengolahan untuk mendapatkan hasil akhir yang baik a. Sorasi pendahuluan, daun tembakau yang telah dipetik dan terkumpul di tempat yang teduh disortasi terlebih dahulu sebelum tahap pengolahan daun. Tujun dari sortasi pendahuluan yaitu : memudahkan proses pengolahan dan memudahkan dalam pengelompokkan ke dalam kualitas menurut mutu b. Penyejunan, kegiatan penataan daun tembakau dengan cara menusuk bagian pangkal gagang daun/ibu tulang daun atau pada bagian ruas batang di antara dua dua daun. Tujuan dari penyejunan yaitu : memudahkan dalam penataan


di ruang pengering/pengolahan dan mencegah daun tidak saling melekat ketika kelembapan tinggi sehingga daun mengering secara merata c. Curing, proses curing bertujuan melepaskan air dari daun tembakau dari kadar air 80-90% menjadi 10-15% dan perubahan warna dari zat hijau daun menjadi warna orange (Cahyono, 1998). 3. Tahapan proses curing a. Penguningan, proses perubahan warna dari warna hijau menjadi warna kuning karena hilangnya zat hijau daun ke zat kuning daun dan terjadi penguraian zat tepung menjadi gula. Perubahan ini terjadi pada suhu 32-42ºC berlangsung selama 55 sampai dengan 58 jam b. Pengikatan warna, proses ketika seluruh daun sudah berwarna kuning orange dari lembar daun sampai tulang daun, maka secara perlahan suhu dinaikkan. Suhu yang digunakan 43-52ºC waktu yang diperlukan sekitar 18 jam c. Pengeringan lembar daun, proses ini bertujuan untuk mengurangi kadar air di dalam lembar daun dengan cara menaikkan suhu 53-62ºC. Ciri-ciri proses ini, daun sudah terasa kering apabila dipegang, namun tulang daun masih terasa basah, daun terlihat keriput atau keriting. Waktu yang dibutuhkan lebih kurang 30-32 jam d. Pengeringan gagang, proses ini dilakukan pada suhu 63-72ºC yang memerlukan waktu normal 30-32 jam. Ciri-ciri tahapan ini selesai apabila seluruh tulang daun sudah kering dan jika ditekuk batangnya akan patah dan berbunyi krek (Hanum, 2008).


D. Ekstraksi 1. Ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,1995). Ekstrak tumbuhan merupakan material yang diperoleh dengan cara menyari bahan tumbuhan dengan pelarut tertentu. Terdapat beberapa jenis ekstrak yaitu : ekstrak cair, ekstrak kental, dan ekstrak kering (Saifudin, 2011). 2. Ekstraksi Ekstrak diperoleh dengan cara ekstraksi. Ekstraksi adalah kegiatan penarikan zat aktif yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung simplisia. Ekstraksi dipengaruhi oleh derajat kehalusan serbuk dan perbedaan konsentrasi. Jika hanya dengan mencelupkan serbuk simplisia ke dalam pelarut, maka ekstraksi tidak akan sempurna karena terjadi kesetimbangan antara larutan zat aktif di luar sel dan larutan zat aktif di dalam sel (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). 3. Cairan Penyari Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut : murah dan mudah


diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, selektif yaitu mudah menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat yang berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20%, tidak beracun, netral, absorpsinya baik dan panas yang digunakan untuk pemekatan lebih sedikit. Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). 4. Soxhletasi Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan soxhletasi menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 2000).

Gambar 6. Alat Soxhlet (Anonimc, 2011)


Cairan penyari diisikan pada labu alas bulat, serbuk simplisia ditempatkan pada kertas saring dan diletakkan pada tabung. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik ke atas melalui pipa samping, kemudian diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif serbuk simplisia, karena terdapat sifon sehingga setelah cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan kembali ke labu (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). 5. Penguapan Ekstrak Cair Ekstrak cair yang memiliki konsistensi cair dan kandungan pelarutnya yang masih tinggi dapat diubah menjadi bentuk ekstrak kental. Proses pengentalan ini dapat dilakukan melalui penguapan dengan menggunakan alat Vacuum Rotary Evaporator. Cara kerjanya yaitu perputaran labu dalam sebuah pemanas pada temperatur dan kecepatan putar tertentu, akan menguapkan cairan yang terkandung dalam ekstrak. Pengaturan dalamnya pencelupan ke dalam penangas air, suhu penangas, hampa udara dan suhu pendingin membuat kondisi optimal dapat terpenuhi sehingga proses pengentalan ekstrak dapat berlangung cepat (Voight, 1994). E. Spektrofotometri UV Spektrofotometri UV adalah teknik analisis spektroskopik yang menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen spektrfotometer (Mulja dan Suharman, 1995).


Jika suatu molekul dikenakan radiasi elektromagnetik (REM) maka molekul akan menyerap REM yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul dengan REM akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi. Transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi dalam suatu molekul yaitu transisi

*, n

*, n

* dan

*.

Gambar 7. Diagram tingkat energi elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007)

1.Transisi

*

Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi sinar yang frekuensinya terletak diantara UV vakum (>180 nm) sehingga kurang begitu bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri UV-Vis 2. Transisi n

*

Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang diperlukan untuk transisi n

* lebih kecil dibanding transisi

* sehingga

sinar yang diabsorpsi memiliki panjang gelombang lebih panjang (150-250 nm) 3. Transisi n

* dan

*

Untuk memungkinkan jenis transisi ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan (Gandjar dan Rohman, 2007).


Pelarut dapat mempengaruhi transisi n

* dan

*, hal ini berkaitan

dengan adanya perbedaan kemampuan pelarut untuk mensolvasi antara keadaan dasar dengan keadaan tereksitasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 8. Pengaruh pelarut polar pada transisi

Molekul yang menunjukkan transisi

* (Gandjar dan Rohman, 2007)

*, keadaan dasar lebih non

polar dibandingkan keadaan eksitasi. Jika pelarut polar digunakan pada molekul yang mengalami transisi ini, maka menyebabkan pelarut polar berinteraksi lebih kuat dengan keadaan tereksitasi dibandingkan keadaan dasar, sehingga perbedaan energi transisi

* pada pelarut polar ini lebih kecil. Menyebabkan terjadinya

pergeseran panjang gelombang yang lebih besar dibandingkan panjang gelombang semula (pergeseran bathokromik) (Gandjar dan Rohman, 2007). Molekul yang menunjukkan transisi n

*, keadaan dasar lebih polar

dibandingkan keadaan tereksitasi. Pelarut akan berikatan hidrogen dengan pasangan elektron yang tidak berpasangan pada molekul dalam keadaan dasar dibandingkan pada molekul dalam keadaan tereksitasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 9. Pengaruh pelarut polar pada transisi n

* (Gandjar dan Rohman, 2007)


Terjadinya

eksitasi

elektronik

pada

panjang

gelombang

yang

memberikan absorbansi yang maksimum disebut panjang gelombang maksimum. Penentuan panjang gelombang maksimum yang tetap dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik sebagai data sekunder, sehingga spektrum UV-Vis dapat untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif (Mulja dan Suharman, 1995).

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 1.

Definisi dan Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa disebut juga

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik, serta dalam cairan biologis (Rohman, 2009). Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Rohman, 2009). Instrumentasi KCKT dapat dilihat pada gambar 10.

Gambar 10. Instrumentasi KCKT (Kazakevich and Nair, 1996)

a. Wadah fase gerak dan fase gerak, alat KCKT yang baru dilengkapi dengan satu atau lebih wadah gelas, yang mengandung 500 mL atau lebih fase


gerak. Sonikasi (penghilangan gas) biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fase gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin terdapat di dalamnya. Adanya gas dapat menyebabkan flow rate yang tidak reprodusibel serta dapat mengganggu detektor (Skoog, Holler, Crouch, 1998). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran metanol atau asetonotril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Ganjar, 2007). Pelarut yang digunakan dalam analisis menggunakan KCKT detektor UV hendaknya memiliki UV cut-off yang jauh dari panjang gelombang serapan analit. Hal ini karena pada panjang gelombang tersebut kepekaan detektor UV sangat lemah (Mulja dan Suharman, 1995). Karakteristik beberapa pelarut yang sering digunakan pada analisis menggunakan KCKT disajikan pada tabel I.


Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut yang digunakan dalam KCKT Pelarut Indeks Nilai eluotropik UV cutpolaritas

Alumina

C18

Silika

off (nm)

Heksan

0.1

0.01

-

0.00

195

Sikloheksan

0.2

0.04

-

-

200

Toluen

2.4

0.29

-

0.22

284

Tertrahidrofuran

4.0

0.45

3.7

0.53

212

Etil Asetat

4.4

0.58

-

0.48

256

Aseton

5.1

0.56

8.8

0.53

330

Metanol

5.1

0.95

1.0

0.7

205

Asetonitril

5.8

0.65

3.1

0.52

190

Dimetilformamida

6.4

-

7.6

-

268

Dimetilsulfoksida

7.2

0.62

-

-

268

Air

10.2

-

-

-

190

b. Pompa, dalam alat KCKT pompa yang memenuhi syarat wadah pelarut, yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit (Rohman, 2009). c. Tempat

penyuntikan

sampel,

sampel-sampel

cair

dan

larutan

disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom. (Gandjar dan Rohman, 2007). d. Kolom, kolom merupakan bagian KCKT yang terdapat fase diam di dalamnya. Oktadesilsilan (C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk pelarut yang bersifat polar (Rohman, 2009).


Pada KCKT fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). ODS atau C18 merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi karena adanya kandungan air yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007). e. Detektor, persyaratan detektor KCKT adalah sensitivitas yang tinggi, rentang sensitivitas (10-8 – 10-15 analit/detik), kestabilan dan reprodusibilitas yang baik memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi analit, dapat bekerja dari temperatur kamar sampai 400oC, tidak terpengaruh oleh perubahan temperatur dan kecepatan dari fase gerak, mudah didapat dan mudah dioperasikan, selektif terhadap berbagai macam analit di dalam fase gerak, tidak merusak sampel, dapat menghilangkan zone broadening dengan adanya pengaruh minimal internal volume (Mulja dan Suharman, 1995). 2.

Analisis Kualititatif dan Kuantitatif Analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (tR) senyawa

baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antara keduanya sekecil mungkin (Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk KCKT kuantifikasi dapat dilakukan dengan mengukur tinggi puncak atau dengan luas puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis


dasar ke puncak maksimum. Sedangkan luas puncak diukur sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2) (Gandjar dan Rohman, 2007).

G. Landasan Teori Tanaman tembakau merupakan kelompok tanaman C3. Tanaman C3 adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Cahaya matahari berperan dalam proses fotorespirasi, fotosintesis dan respirasi tumbuhan. Pada siang hari tanaman C3 (tanaman tembakau) mendapatkan intensitas cahaya yang tinggi menyebabkan terjadinya pengikatan CO2 secara spontan oleh RDP hal ini disebabkan O2 lebih banyak sehingga CO2 yang berperan dalam proses fotosintesis sedikit, karbohidrat (CH2O)n yaitu D-glukosa hasil hidrolisis dari sukrosa sebagai produk fotosintesis dan substrat respirasi berkurang sehingga Lornithine yang dihasilkan dari tahap Glikolisis dan Siklus Krebs sebagai prekusor biosintesis nikotin berkurang. Tanaman tembakau VBN adalah tanaman yang diberikan naungan sehingga intensitas cahaya yang diterima lebih sedikit dibandingkan tembakau NO yang tidak diberi naungan. Proses ektraksi dengan menggunakan soxhlet menghasilkan ekstrak daun tembakau yang mengandung nikotin. Nikotin memiliki efek farmakologis yang menguntungkan yaitu mampu meningkatkan kemampuan kognitif dan motorik. Nikotin memiliki kromofor pada cincin piridin sehingga dapat dideteksi kadarnya menggunakan spekrofotometri-UV, diperoleh kadar nikotin terdapat dalam daun tembakau VBN sebesar 1,413% dan NO sebesar 0,867%.


Metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dapat digunakan untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa multikomponen dengan waktu yang relatif singkst. Metode KCKT fase terbalik ini telah dioptimasi dan divalidasi. Penetapan kadar dilakukan dengan membandingkan nilai AUC (Area Under Curve) antara sampel ekstrak etanolik daun tembakau dengan AUC standar baku nikotin. Persamaan kurva baku nikotin yang didapat merupakan kurva hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan nilai AUC yang dihasilkan, dinyatakan dengan y = bx + a, dimana y adalah AUC dan x adalah kadar nikotin, maka AUC sampel dimasukkan dalam persamaan, kemudian kadar dari sampel nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dapat diketahui.

H. Hipotesis Terdapat perbedaan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini mengikuti jenis penelitian non eksperimental deskriptif, karena tidak terdapat intervensi terhadap subyek uji.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO. 2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO. 3. Variabel pengacau pada penelitian ini adalah a. kemurnian pelarut, sehingga digunakan pelarut pro analysis yang memilki kemurnian tinggi. b. larutan baku nikotin yang bersifat mudah teroksidasi oleh udara dan cahaya, diatasi dengan menggunakan alumunimum untuk menutupi alatalat gelas. c. pH pelarut dan fase gerak yang dikendalikan dengan buffer pada pH 4.

C. Definisi Operasional 1. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan


komposisi fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) dengan kecepatan alir 1,2 mL/menit. 2. Ekstrak etanolik daun tembakau yang digunakan adalah VBN dan NO. 3. Kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak dinyatakan dalam satuan % b/b ± SD.

D. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro analysis kecuali dinyatakan lain yakni baku nikotin (E. Merck), ammonium asetat (E. Merck), natrium asetat (E. Merck), asam asetat glasial (E. Merck), asetonitril (E. Merck), metanol (E. Merck), natrium hidroksida 4M (E. Merck), kloroform (E. Merck), asam klorida (teknis), etanol (teknis), aquades, aquabides dan ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO.

E. Alat Penelitian Alat yang digunakan adalah Spektrofotometer UV-Vis (merek Optima SP-300 Plus),

seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri : pompa (merek

Shimadzu LC-10 AD No.C20293309457 J2) dengan sistem elusi gradien, detektor UV-Vis (merek Shimadzu SPD 10 AV No.C20343502697 KG), kolom C-18 merek Bondapack C-18 dengan panjang kolom 25 cm No.P61271BO2, seperangkat alat komputer (merek Dell Vostro 220, printer merek HP D2566), alat ultrasonikator (Retsch tipe T640 no 935922013), membran filter Whatman ukuran pori 0,45 m dan diameter 47 mm, nerca analitik merek Ohaus, milipore, mikropipet, indikator pH, seperangkat alat gelas.


F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan buffer asetat (pH 4) Buffer asetat dibuat dengan cara menimbang 0,1683 g ammonium asetat, 0,5599 g natrium asetat dan diambil 0,406 mL asam asetat glasial. Ketiga zat tersebut dimasukkan ke dalam labu takar 250,0 mL kemudian dilarutkan dengan aquabides hingga batas tanda. (Larutan buffer ini harus selalu dibuat baru untuk mencegah tumbuhnya mikroorganisme). 2. Pembuatan fase gerak Campuran fase gerak yang digunakan untuk penelitian ini adalah campuran buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6). Masing-masing larutan fase gerak disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman dengan bantuan pompa vakum, kemudian diultrasonikasi selama 15 menit. 3. Pengambilan dan pembuatan sampel Sampel yang digunakan berupa lembaran daun tembakau kering VBN dan NO. Teknik pengambilan yaitu daun tembakau diambil secara acak mewakili setiap deret tanaman tembakau di lahan PT. Perkebunan Nusantara X (Persero) Klaten, dan dilakukan proses penyerbukan. 4. Pembuatan larutan baku nikotin a. Pembuatan larutan stok nikotin. Larutan stok nikotin 2 ppm dibuat dengan cara mengambil sebanyak 10 L baku nikotin dan dimasukkan dalam labu ukur 5,0 mL. Encerkan dengan fase gerak hingga tanda. b. Pembuatan seri larutan baku nikotin. Lima seri larutan baku nikotin dibuat dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09 ppm dengan cara


mengambil larutan stok nikotin dengan mikropipet sebanyak 25; 75; 125; 175; 225 L, dimasukkan dalam labu ukur 5,0 mL dan diencerkan dengan fase gerak (buffer asetat:metanol: asetonitril) hingga tanda. Larutan disaring dengan milipore dan diawaudarakan selama 15 menit. 5. Penetapan maksimum Tiga seri larutan baku nikotin dengan konsentrasi 0,005; 0,007; 0,009 ppm. Masing-masing konsentrasi dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 225-325 nm. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang memberikan serapan terbesar dan sama pada 3 seri konsentrasi larutan baku nikotin. 6. Pembuatan kurva baku nikotin Seri larutan baku dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07 dan 0,09 ppm, masing-masing larutan disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonikasi selama 15 menit dan 20 µL dari masing-masing larutan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) pada kecepatan alir 1,2 mL/menit. Dari kromatogram diperoleh luas area nikotin untuk masing-masing konsentrasi. Luas area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi nikotin untuk memperoleh regresi linear dengan persamaan y = bx + a.


7. Pembuatan HCl encer Asam klorida pekat (HCl P) 22,6 mL dimasukkan dalam labu takar 10,0 mL kemudian encerkan dengan aquabidest hingga tanda. 8. Pembuatan NaOH 4 M Natrium hidroksida pro analisis (NaOH p.a) ditimbang sebanyak 4 g dan dimasukkan dalam labu takar 25,0 mL larutkan dan encerkan dengan aquabidest hingga tanda. 9. Preparasi Sampel Ekstrak kental daun tembakau VBN dan NO ditimbang kurang lebih seksama 1 g, dilarutkan dalam 10 mL asam klorida encer dengan bantuan ultrasonikator selama 30 menit hingga semuanya larut. Kemudian larutan ditambah 10 mL kloroform dalam corong pisah, dilakukan penggojogan selama 5 menit hingga terbentuk 2 lapisan, lapisan kloroform (fase bawah) dibuang. Kemudian ditetesi NaOH 4M hingga pH larutan 11-12, setelah itu ditambahkan 10 mL kloroform lanjutkan ekstraksi selama 5 menit. Lapisan kloroform diuapkan di ruang asam hingga semua kloroform teruapkan (tersisa residunya). Residu kemudian dilarutkan dengan fase gerak ke dalam labu takar 5,0 mL dan diencerkan dengan cara pipet 100 L larutan ke dalam labu takar 10,0 mL hingga tanda. Saring dengan milipore dan diawaudarakan selama 15 menit. Dilakukan replikasi lima kali dari kedua jenis sampel. 10. Ekstraksi daun tembakau a.Optimasi lama waktu ekstraksi. Serbuk daun tembakau VBN dan NO ditimbang kurang lebih seksama 20 g. Kemudian dibungkus dengan kertas saring


dan dimasukkan dalam tabung soxhlet dengan 130 ml etanol teknis 96% dalam LAB. Optimasi lama waktu ekstraksi dilakukan pada waktu 7; 8; 9; dan 10 jam dengan suhu waterbath 80-90 ºC. Filtrat yang didapat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator pemanas waterbath pada suhu 65 ºC selama 10 menit hingga diperoleh ekstrak agak kental dan dituangkan dalam cawan porselin. Diuapkan di atas waterbath suhu 80ºC. Didapat ekstrak kental tembakau. b. Ekstraksi daun tembakau hasil optimasi. Dilakukan prosedur yang sama dengan optimasi lama waktu ekstraksi dengan menggunakan waktu optimal ekstraksi selama 8 jam. 11. Penetapan Kadar Nikotin dalam Sampel Sampel yang dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT yang telah dioptimasi sehingga didapatkan kromatogram sampel dan dibaca AUC dari masing-masing replikasi. Masukkan hasil AUC ke persamaan regresi linear baku nikotin dari hasil validasi sehingga diperoleh kadar sampel.

G. Analisis Hasil Analisis kualitatif dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan baku nikotin. Analisis kuantitatif dapat dihitung dengan memasukkan AUC sampel ke dalam persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva baku nikotin hasil validasi y = bx + a. sehingga didapat kadarnya. Satuan kadar nikotin adalah %b/b ± SD. Selanjutnya dilakukan analisis statistik dilakukan untuk melihat apakah kadar

nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO berbeda bermakna


atau tidak. Uji statistik yang digunakan adalah uji normalitas Shapiro-Wilk untuk mengetahui data yang diperoleh normal atau tidak, uji t tidak berpasangan untuk mengetahui kadar yang diperoleh dari kedua sampel tersebut berbeda bermakna atau tidak.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dapat dianalisis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik karena metode yang digunakan telah dioptimasi dan divalidasi terlebih dahulu pada awal penelitian. Pada tahap optimasi diperoleh kondisi optimum yaitu kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), kecepatan alir 1,2 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang maksimum 260 nm dengan nilai resolusi 1,5679, tailing factor 1,25; jumlah lempeng teoritis 2247,163 dan nilai HETP 0,0111 (Ernesta, 2011). Pada tahap validasi metode diperoleh bahwa metode KCKT fase terbalik memenuhi parameter validasi meliputi selektifitas dengan nilai resolusi (Rs) 1,531, linearitas dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi pada konsentrasi 0,05 dan 0,09 ppm. Metode KCKT fase terbalik ini memenuhi kriteria validasi metode pada rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).

A. Pembuatan Fase Gerak Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari hasil optimasi

yaitu

buffer

asetat:metanol:asetonitril

(40:54:6).

Berdasarkan

kepolarannya, sistem kromatografi yang digunakan adalah sistem kromatografi fase terbalik karena fase gerak lebih polar dibandingkan fase diam oktadesilsilan.


Menurut (Kazakevich, 2007) fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan KCKT fase terbalik adalah modifikasi metanol dan asetonitril karena memiliki eluent strenght yang kuat. Metanol memiliki eluent strenght 1,0 sedangkan asetonitril memiliki eluent strenght 3,1. Semakin besar nilai eluent strenght, semakin besar kemampuan elusinya sehingga waktu retensi dari sampel menjadi semakin singkat. Buffer asetat adalah salah satu komponen dalam fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari asam lemah (asam asetat glasial) dan basa konjugatnya (natrium asetat dan amonium asetat) yang bertujuan agar nikotin (senyawa yang akan dianalisis) mudah terion. Pemilihan buffer berdasarkan nilai pKa dari senyawa yang akan dianalisis. Menurut Kazakevich dan LoBrutto (2007), pH buffer yang digunakan ± 2 unit dari pKa analit agar analit berada dalam bentuk tunggal yakni bentuk terion atau bentuk molekul utuh. Nikotin memiliki nilai pKa 8,5 (Landoni, 1991). Dalam penelitian ini, buffer asetat dibuat pada pH 4. Campuran fase gerak terdapat 54 % metanol dan 6% asetonitril. Setiap penambahan 10 % senyawa organik mengalami penurunan pH yaitu 0,2 unit sehingga pKa nikotin mengalami pergeseran 7,3 dan pH dari buffer asam mengalami pergeseran sebanyak 1,2 unit ke atas. Pada penelitian ini, pH dari buffer yang digunakan 2 unit di bawah pKa nikotin agar nikotin menjadi bentuk terion sehingga lebih cepat terelusi oleh fase gerak (Kazakevich dan LoBrutto, 2007). Sehingga pH dari buffer asetat maksimum 4,1 agar nikotin tetap dalam bentuk terion.


N

CH3 N

N

H2O / H+

H3C

H N

+

Gambar 11. Nikotin dalam bentuk terion

Masing-masing komponen dari fase gerak disaring menggunakan kertas Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel asing dalam larutan fase gerak yang dapat menyumbat kolom, kemudian larutan diawaudarakan menggunakan ultrasonikator untuk menghilangkan gelembung udara yang mempengaruhi tekanan pada pompa KCKT yang berpengaruh pada waktu retensi.

B.

Pengambilan dan Pembuatan Sampel

Tujuan penelitian ini adalah untuk membandingkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO. Teknik pengambilan yaitu daun tembakau diambil secara acak mewakili setiap deret tanaman tembakau di lahan PT. Perkebunan Nusantara X (Persero) Klaten. Tanaman tembakau merupakan kelompok tanaman C3. Tanaman C3 adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Pemberian naungan pada tanaman tembakau untuk mengurangi intensitas cahaya sebesar 30%, sehingga intensitas cahaya yang diperoleh tanaman tembakau sebesar 70% (PT.Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).


Kadar nikotin yang terdapat pada berat kering tembakau 0,6-3% dengan proses biosintesis di akar dan terakumulasi di daun, sehingga pada penelitian ini bagian tanaman tembakau yang digunakan adalah bagian daun. Proses pembuatan simplisia merupakan salah faktor untuk menjamin keseragaman senyawa aktif, keamanan dan kegunaan. Proses pembuatan simplisia meliputi : sortasi basah, pencucian, perajangan dan pengeringan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1985). Tahap penanganan daun tembakau setelah dipanen tidak jauh berbeda dengan proses pembuatan simplisia meliputi : sortasi pendahuluan dengan cara memisahkan daun tembakau berdasarkan ukuran dan kecacatan daun yang bertujuan memperoleh keseragaman mutu, tahap selanjutnya penyejunan dan proses curing. Tahapan tersebut tidak dilakukan oleh peneliti, melainkan dilakukan oleh PT. Perkebunan Nusantara X, sehingga daun tembakau VBN dan NO untuk penelitian ini sudah diperoleh berupa lembaran daun tembakau yang berwarna orange dan kering. Proses penyerbukan daun tembakau untuk memperkecil ukuran partikel. Proses penyerbukan daun tembakau dilakukan di Lembaga Pusat Penelitian Terpadu (LPPT) UGM dengan ukuran lubang pengayakan serbuk 1mm. Tujuan dari pengayakan untuk memperoleh serbuk sedikit halus, tidak lolos dari kertas saring yang akan digunakan untuk ekstraksi. Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, ukuran lubang pengayak 1,00 mm menunjukkan nomor pengayak 18. Derajat halus serbuk dalam Farmakope Indonesia edisi III dinyatakan dengan nomor pengayak. Apabila derajat halus suatu serbuk dinyatakan dengan satu nomor, dimaksudkan bahwa semua serbuk dapat melalui pengayak dengan nomor


tersebut. Nomor pengayak 18 berarti semua serbuk dapat melalui pengayak nomor 18.

C. Pembuatan Larutan Baku Larutan baku nikotin dibuat dengan melarutkan sejumlah tertentu baku nikotin E.merck dalam pelarut. Pelarut yang digunakan adalah sama dengan fase gerak yaitu buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6), untuk menghindari terjadinya perbedaan solvent strength antara pelarut dan fase gerak. Solvent strenght merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi waktu retensi. Pembuatan larutan stok baku nikotin dengan konsentrasi 2 ppm, kemudian dibuat 5 seri konsentrasi larutan baku nikotin yaitu : 0,01; 0,03; 0,05; 0,07 dan 0,09 ppm.

D. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk memperoleh panjang gelombang analisis yang dapat memberikan serapan maksimum dari nikotin. Penetapan panjang gelombang nikotin dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV pada rentang panjang gelombang 225 – 325 nm karena menurut Cordell panjang gelombang maksimum nikotin 262 nm. Pengukuran maks

dilakukan pada 3 seri konsentrasi yaitu rendah (0,005 ppm), tengah (0,007

ppm), dan tinggi (0,009 ppm). Dapat dilihat hasil spektra panjang gelombang nikotin dari 3 seri konsentrasi pada gambar 12.


Gambar 12. A = konsentrasi 0,005 ppm absorbansi 0,205, maksimum 260 nm; B = konsentrasi 0,007 ppm, absorbansi 0,333, , maksimum 260 nm dan C = konsentrasi 0,009 ppm, absorbansi 0,374, maksimum 260 nm

Dari ketiga gambar spektra nikotin yang diperoleh terlihat bahwa bentuk spektra yang dihasilkan pada tiga level konsentrasi sama. Panjang gelombang yang menghasilkan serapan maksimum nikotin terletak pada 260 nm. Menurut Mulja, 1995 penentuan panjang gelombang maksimum yang pasti (tepat) dapat digunakan sebagai data sekunder (analisis kualitatif). Syarat suatu senyawa dapat dianalisis oleh spektrofotometer UV adalah memiliki kromofor. Nikotin memiliki kromofor pada cincin piridin.


Gambar 13. Kromofor cincin piridin

E. Pembuatan Kurva Baku Nikotin Pembuatan kurva baku telah dilakukan pada tahap validasi. Kurva baku menunjukkan hubungan antara AUC dengan konsentrasi analit pada beberapa seri baku. Dalam penelitian ini dibuat tiga replikasi kurva baku, kemudian dipilih persamaan regresi linear yang memberikan nilai koefisien korelasi (r) dengan kriteria r

0,999 (Center for Drug Evaluation and Research, 1994). Diperoleh

persamaan regresi linear y = 20708810x + 82847,5 dengan nilai koefisien korelasi yaitu 0,9996. Persamaan regresi linear ini digunakan untuk menghitung kadar nikotin dalam ekstrak daun tembakau. Berdasarkan grafik hubungan pada gambar (14) antara konsentrasi analit (baku nikotin) dan AUC baku terlihat bahwa semakin meningkatnya konsentrasi baku nikotin, semakin meningkat AUC baku.

Gambar 14. Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dengan AUC


F. Ekstraksi secara Soxhletasi dan Penguapan Ekstrak Cair Serbuk daun tembakau diekstraksi dengan metode soxhletasi dengan cara sejumlah serbuk dijahit dengan menggunakan kertas saring agar tetesan-tetesan dari cairan penyari dapat membasahi kertas saring sehingga dapat menyari serbuk daun tembakau tersebut. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol 96% karena nikotin larut dalam etanol, sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal dan tidak beracun (Voight, 1994). Prinsip metode soxhletasi adalah pemanasan yang menyebabkan cairan penyari naik ke atas, diembunkan oleh pendingin menjadi tetesan-tetesan yang akan turun ke tabung berisi sebuk yang telah dibungkus kertas saring. Cairan penyari akan menetes melarutkan zat aktif jika volume tetesan telah mencapai permukaan, seluruh pelarut akan turun kembali ke labu alas bulat sehingga sirkulasi terjadi berulang-ulang yang akan menghasilkan penyarian yang baik.

Gambar 15. Proses ekstraksi dengan alat soxhlet

Tahap selanjutnya dilakukan penguapan ekstrak cair karena kandungan pelarutnya masih tinggi. Penguapan ekstrak dengan meggunakan vacuum rotary evaporator (VRE) mempercepat penguapan pelarut. Pada penelitian ini, suhu


yang digunakan adalah 65ºC yang dilakukan selama 10 menit. Setelah diperoleh ekstrak cair yang lebih pekat hasil evaporasi, dipekatkan kembali dengan diuapkan di atas waterbath pada suhu 80ºC hingga diperoleh ekstrak kental. Sampel dalam cawan ditutup aluminium foil dan disimpan dalam desikator.

G. Optimasi Waktu Ekstraksi Nikotin dalam Serbuk Daun Tembakau Tujuan dari optimasi waktu ekstraksi nikotin dari serbuk daun tembakau untuk mendapatkan waktu ekstraksi yang paling optimum sehingga nikotin terekstraksi seluruhnya. Metode yang digunakan untuk penelitian ini adalah soxhletasi karena pengerjaannya mudah, cepat, cairan penyari yang digunakan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lain dan secara langsung diperoleh hasil ekstraksi yang lebih pekat (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). Variasi optimasi waktu ekstraksi pada penelitian ini adalah 7; 8; 9; 10 jam. Optimasi waktu 7 jam digunakan sebagai waktu optimasi terendah karena dilakukan orientasi ekstraksi terlebih dahulu selama 5 jam diperoleh hasil yaitu cairan penyari yang terdapat pada tabung soxhlet berwarna hijau tua (pekat). Berdasarkan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan (1986), optimasi dikatakan sempurna jika cairan penyari pada tabung soxhlet tidak berwarna. Ekstrak kental dari masing-masing waktu ekstraksi dikumpulkan, dilanjutkan preparasi sampel dan diinjek ke instrument KCKT. Diperoleh hasil kromatogram dan respon AUC pada gambar 16.


A

B

C

D


E

F

G

H Keterangan gambar 16 = A: 7 jam-1, B: 7 jam-2, C: 8 jam-1, D: 8 jam-2, E: 9 jam-1, F: 9 jam-2, G: 10 jam-1, H: 10 jam-2


Tabel II. Hasil pengukuran AUC sampel dengan variasi waktu ekstraksi sampel dengan soxhlet Waktu (jam) AUC

7A

7B

8A

8B

9A

9B

10 A

10 B

1072305

1135700

1228904

123771

916992

942139

659037

644588

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada gambar 15 dan tabel II menunjukkan peningkatan respon AUC pada 7 jam ekstraksi ke 8 jam ekstraksi, dan terjadi penurunan respon AUC pada 9 jam ekstraksi dan 10 jam ekstraksi, maka waktu optimum proses ekstraksi dengan soxhlet adalah 8 jam karena menghasilkan respon AUC paling tinggi. Hal ini dimungkinkan terdapat pengaruh lama waktu ekstraksi terhadap stabilitas dari nikotin. Suhu yang harus diperhatikan dalam panci pemanas antara 85 – 87ºC, proses ekstraksi terjadi secara berkesinambungan. Pelarut diperbolehkan berada di dalam refluks selama 8 jam (Raymond et al., 1991).

H. Ekstraksi dengan Waktu Optimum 8 jam Berdasarkan data yang diperoleh dari optimasi waktu ekstraksi, dilanjutkan dengan ekstraksi Vorstenlanden Bawah Naungan dan Na Oogst dengan waktu optimum ekstraksi selama 8 jam. Hasil kromatogram dan respon AUC dari kedua sampel dapat dilihat pada gambar 17 dan tabel III.

A


B

C

D

E


F

G

H

I


J

Gambar 16 = A:NO 1; B:NO 2; C:NO 3; D:NO 4; E:NO 5; F:VBN 1; G:VBN 2; H:VBN 3; I:VBN 4; J:VBN 5. Tabel III. Hasil pengukuran AUC ekstraksi serbuk daun tembakau jenis VBN dan NO dengan soxhlet selama 8 jam Replikasi

AUC

1

Na Oogst 627977

Vorstenlanden 1258549

2

628873

1232800

3

626067

1231498

4

628265

1238593

5

628560

1232771

I. Preparasi Sampel Ekstrak etanolik daun tembakau terdapat senyawa alkaloid selain nikotin misalnya anabasin, anatabin, dan nornikotin. Ekstraksi dilakukan untuk meminimalkan campuran senyawa yang terdapat dalam ekstrak daun tembakau. Sampel yang berupa ekstrak kental ditimbang ± 1 gram dilarutkan dalam HCl encer dengan bantuan ultrasonikator selama 30 menit. Pada tahap ini nikotin yang terkandung dalam sampel akan bereaksi dengan asam klorida membentuk nikotin hidroklorida yang larut dalam fase air, kemudian ditambahkan kloroform sebanyak 10 mL, diekstraksi menggunakan corong pisah. Penambahan kloroform untuk menarik senyawa-senyawa non polar.


N

+

N

HCl

CH3

N nikotin

N asam klorida

H3C +- H

Cl

nikotin hidroklorida

Gambar 18 . Reaksi antara nikotin dengan asam klorida

Fase air yang mengandung nikotin hidroklorida ditampung dan ditambahkan 8 mL NaOH 4 M mencapai pH 11-12, agar nikotin hidroklorida kembali dalam suasana basa atau ke bentuk molekulnya Sehingga dengan penambahan kloroform yang kedua nikotin akan terlarut dalam fase kloroform.

N

+

Nikotin hidroklorida

N N

CH3

N

H3C

NaOH

-

Cl H

+ NaOH Nikotin

+ NaCl + H2O

Gambar 19. Reaksi antara nikotin hidroklorida

dengan NaOH

Penambahan 10 ml kloroform dan diekstraksi menggunakan corong pisah (5 menit), kemudian fraksi kloroform ditampung dan diuapkan di ruang asam hingga tersisa residu nikotin, karena titik didih nikotin adalah 247°C sehingga nikotin tidak ikut menguap bersama kloroform. Residu dilarutkan menggunakan fase gerak dan dilakukan pengenceran sepuluh kali lipat untuk memperoleh respon analit yang masuk dalam area under curve (AUC) kurva baku . Pada larutan sampel masih terdapat senyawa lain yang larut dalam fase kloroform yang akan dipisahkan pada analisis menggunakan KCKT. Larutan sampel disaring dengan penyaring millipore dan diawaudarakan dengan utrasonikator untuk


menghilangkan gelembung udara, adanya gelembung udara dapat menggangu mengganggu proses pemisahan sampel.

J. Analisis Kualitatif Nikotin Waktu retensi atau waktu tambat yang dinyatakan dalam satuan waktu (menit) merupakan parameter analisis kualitatif dalam KCKT. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan analit saat diinjek sampai keluar dari kolom dan terdeteksi oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995). Waktu retensi (tR) suatu analit sangat dipengaruhi oleh interaksi analit dengan fase diam dan fase gerak. Jika waktu retensi analit semakin singkat maka interaksi analit lebih besar dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam. Dalam penelitian ini, fase diam yang digunakan kolom oktadesilsilan (C18) yang bersifat

non

polar

dan

fase

gerak

yang

digunakan

adalah

buffer

asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) bersifat lebih polar dibandingkan fase diam. Dari sistem kromatografi fase terbalik, senyawa polar akan terelusi terlebih dahulu daripada senyawa non polar sehingga waktu retensinya lebih singkat. Dilihat dari strukturnya pada gambar (20), nikotin memiliki bagian polar dan non polar. Bagian polar terdapat pada cincin piridin dan pirolidin dan bagian non polar terdapat pada metil.

Gambar 20. Struktur nikotin dengan bagian polar dan non polar


Nikotin memiliki bagian polar yang akan berinteraksi melalui interaksi hidrogen dengan fase gerak, sedangkan bagian non polarnya akan berinteraksi secara Van der Waals dengan rantai alifatis fase diam oktadesisilan (C18).

!

Gambar 21. Interaksi nikotin dengan fase diam oktadesilsilan (C18)

Nikotin

akan

berinteraksi

dengan

fase

gerak

buffer

asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) melalui interaksi hidrogen dan ionik. Interaksi hidrogen terjadi pada atom nitrogen cincin piridin, sedangkan interaksi ionik terjadi pada atom nitrogen cincin pirolidin yang terprotonasi karena suasana asam dari buffer asetat. Karena interaksi hidrogen dan ionik lebih kuat dibandingkan interaksi Van der Waals antara bagian non polar nikotin dengan fase diam, sehingga nikotin dapat terelusi dari kolom.


O

CH3

Asam asetat

C

O

Interaksi ionik

H N+ Ch3

N H

= Interaksi hidrogen

H

O H3 C

O

Metanol

CH3

Na O

O

H

H

O

O

H

H3 C

O- NH4+ C H3 C

O

C

CH3

OH

H

Aqua

Natrium asetat

H

H

C

Asetonitril

CH3

Amonium asetat

Gambar 22. Interaksi nikotin dengan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6).

Hasil validasi pada gambar (22) diperoleh kromatogram baku nikotin

dengan tR yaitu 2,017 menit dan hasil penetapan kadar diperoleh kromatogram sampel dengan tR pada puncak I yang hampir sama dengan baku pada puncak I yaitu 1,970 menit, dapat dipastikan adanya nikotin dalam sampel ekstrak daun tembakau. Menurut Snyder, kondisi kromatografi seperti kecepatan alir, temperatur, komposisi fase gerak dan tekanan yang stabil menghasilkan tR yang stabil pula. Variasi waktu retensi yang diperbolehkan <0,02-0,05 menit.

a


b

Gambar 23. (a) kromatogram baku nikotin tR = 2,017 menit dan (b) kromatogram sampel ekstrak etanolik daun tembakau tR = 1,970 menit

Ketika analisis penetapan kadar nikotin pump pressure pada instrument KCKT 115 kgf/cm2 berbeda dengan validasi metode 110 kgf/cm2, hal ini disebabkan karena penggunaan kolom yang bergantian oleh 2 kelompok sehingga pressure tidak stabil. Semakin besar tekanan semakin singkat waktu retensinya, karena semakin kuat kemampuan fase gerak untuk mendorong analit (nikotin) keluar dari kolom. Data yang diperoleh benar karena tR sampel lebih singkat dibandingkan tR baku.

K. Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau VBN dan NO Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dihitung berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari validasi. Presisi yang dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (CV) merupakan parameter dalam mengukur suatu metode untuk mendapatkan hasil yang reprodusibel. Perhitungan kadar nikotin dari kedua sampel pada tabel berikut : Tabel IV. Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau kedua sampel


Jenis ekstrak

Replikasi

Na Oogst

Vorstenlanden Bawah Naungan

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Kadar %b/b 0,001316 0,001318 0,001311 0,001317 0,001317 0,002838 0,002776 0,002773 0,002790 0,002775

Keterangan Rata-rata =1,316 x 10-3 SD = ± 2,775 x 10-6 CV = 0,2109% Rata-rata = 2,790 x 10-3 SD = ± 2,744 x 10-5 CV = 0,9835%

Data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau Vorstenlenden Bawah Naungan 2,790 x 10-3 ± 2,744 x 105

% b/b dengan nilai CV = 0,9835% dan Na Oogst adalah 1,316 x 10-3 ± 2,775x10-

6

% b/b dengan nilai CV = 0,2109 %. Kadar nikotin yang didapatkan dalam

penelitian ini merupakan kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak yang digunakan, dengan demikian kelemahan dalam penelitian ini adalah tidak dilakukan penimbangan terhadap jumlah total ekstrak kental tembakau yang dihasilkan dalam sekali ekstraksi sebelum dilakukan preparasi sampel sebanyak 1 gram. Setelah diperoleh nilai CV dari kedua sampel, maka dilanjutkan uji statistik yang bertujuan untuk mengetahui data yang diperoleh berbeda bermakna atau tidak. Syarat dilakukan uji t tidak berpasangan adalah data yang didapatkan merupakan data yang terdistribusi normal, oleh karena itu dilakukan uji normalitas terlebih dahulu. Uji normalitas data yang digunakan adalah ShapiroWilk dengan nilai kemaknaan (p) > 0,05. Shapiro-Wilk digunakan karena jumlah sampel pada penelitian ini

50 (Dahlan, 2009).


Pada tabel V dapat disimpulkan data kadar kedua ekstrak tembakau terdistribusi normal karena pada tabel Sig. VBN memiliki nilai p = 0,454 dan NO nilai p = 0,126. Tabel V. Uji Normalitas Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova

Kadar

Shapiro-Wilk

jenis Statistic

df

Sig.

Statistic

df

Sig.

VBN

.310

5

.130

.908

5

.454

NO

.319

5

.106

.824

5

.126

a. Lilliefors Significance Correction

Tahap selanjutnya untuk mengetahui rata-rata kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau jenis VBN dan NO berbeda bermakna atau tidak, maka dilakukan uji uji t tidak berpasangan dengan taraf kepercayaan 95%. Dari tabel VI diperoleh hasil bahwa varians data kedua jenis ekstrak sama karena memiliki nilai p >0,05 yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Untuk mengetahui data kedua kelompok berbeda bermakna atau tidak, ditunjukkan dengan kolom sig.(2-tailed) baris kedua (equal variences not assummed) jika p <0,05 terdapat perbedaan bermakna. Tabel VI. Uji t tidak berpasangan

! "


$% &' % # +

%$,%-.. %/

( 00 % '1

"

"

)

*

- %/// %//0,1,2// %////0'..1 %//0,,20 0 %//0 /./,

00 % '1 ,%/-' %/// %//0,1,2// %////0'..1 %//0,,/202 %//0 /- -,

Kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan lebih besar daripada daun tembakau Na Oogst hal ini disebabkan besarnya pengaruh cahaya. Tanaman tembakau merupakan kelompok tanaman C3. Tanaman C3 adalah tanaman yang kebutuhan terhadap intensitas cahaya rendah. Proses fotosintesis menghasilkan karbohidrat (CH2O)n sebagai produk fotosintesis yang bertindak sebagai substrat respirasi. Jalur biosintesis nikotin diawali tahap glikolisis D-glukosa selanjutnya siklus krebs. D-glukosa dan D-fruktosa adalah hasil hidrolisis sukrosa dengan bentuan enzim invertase. Glikolisis adalah perombakan glukosa menjadi asam piruvat, selanjutnya asam piruvat menjadi asetil CoA sebagai substrat untuk daur Krebs. Salah satu hasil asetil CoA yang berikatan dengan oksaloasetat adalah asam

-ketoglutarat, menghasilkan salah

satu senyawa pemula/prekusor asam amino yaitu L-arginin, menghantarkan ke prekusor biosintesis pada nikotin yaitu L-ornithine.


Dari penjelasan di atas, reaksi yang terjadi dipengaruhi oleh adanya kerja enzim yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi (katalis) dan lebih spesifik sehingga reaksi yang terjadi dapat dikendalikan dengan terbentuknya senyawa tertentu (Salisbury dan Ross, 1995). Salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah cahaya yang berpengaruh terhadap suhu. Pada suhu yang melebihi atau dibawah suhu normal enzim, kerja enzim tidak efektif sehingga tidak tersedia cukup substrat yang memiliki energi untuk bereaksi. Dapat disimpulkan bahwa fungsi naungan pada tanaman VBN adalah mengurangi intensitas cahaya yang berpengaruh terhadap efektifitas kerja enzim sehingga menghasilkan substrat yang lebih banyak sehingga nikotin yang terbentuk lebih besar. Sehingga kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN lebih besar daripada daun tembakau NO.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Dari hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa rata-rata kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN = 2,790x10-3± 2,744x10-5 % b/b dan Na Oogst = 1,316x10-3± 2,775x10-6 % b/b. 2. Hasil analisis statistik kadar nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun tembakau berbeda bermakna yaitu daun tembakau VBN lebih besar dibandingkan daun tembakau NO.

B. Saran 1. Ditambahkan Standar Internal dalam preparasi sampel untuk penetapan kadar nikotin sebagai faktor koreksi . 2. Perlu dilakukan penimbangan terhadap berat total jumlah ekstrak kental yang dihasilkan dalam sekali ekstraksi sehingga kadar yang didapat setara berat serbuk daun tembakau yang diekstraksi.


DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Biosynthesis of Alkaloid Derived From Ornithine, Lysine and Nicotine,http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map01064.html, diakses tanggal 27 Oktober 2011. Anonim (a), 2011, Tanaman C3, www.litbang.deptan.go.id/unker/one/462, diakses tanggal 23 Desember 2011. Anonim (b), 2011, Nicotine for Alzheimer’s, http://www.wchstv.com/newsroom/ healthy forlife/2450.shtml, diakses tanggal 7 September 2011. Anonim (c), 2011, Soxletat extractor, http://www.sst.ums.edu.mydatafileiw7zkh8 wepCp, diakses tanggal 7 Maret 2011. Cahyono, B., Drs., 1998, Tembakau Budidaya dan Analisis Usaha Tani, Kanisius, Yogyakarta, pp. 9-10. Center for Drug Evaluation and Research, 1994, Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods, Food and Drug Admisnistration, Rockville, pp. 12. Cordell, Geoffrey,A., 1981, Introduction to Alkaloids, John Willey&Sons., Inc., Canada, pp.85. Dahlan, M.S., 2009, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, pp.45-57, 53, 60-65. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1979, Farmakope Indonesia, jilid III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.XXX, 9, 777. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.1-22. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7, 1134. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 2000, Parameter Stander Umum Ekstrak Tumbuhan Obat cetakan I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1, 10-11.


Domino, E.F., 1999, Pharmacological Significance of Nicotine, in Gorrod, J.W., and Jacob, P., Analytical Determination of Nicotine and Their Compounds and Their Metabolites, Chapter 1, Elsevier, Italy, pp. 5, 14. Ernesta, A., 2011, Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase T Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Gandjar, I. G. Dan Rohman, A., 2007, Kimia FarmasiAnalisis, PustakaPelajar, Yogyakarta, pp. 230-234, 344-345, 381. Hanum, C., 2008, Teknik Budidaya Tanaman jilid 3, Teknik Budidaya Tembakau bab X, Direktorat Jenderal Manajemen Pendidikan Dasar dan Menegah Departemen Pendidikan Nasional, Jakarta, pp.425, 431-435. Harborne, J.B., 1987, Phitochemical methods, diterjemahkan oleh Padmawinata, Kosasih dan Soediro, Iwang, hal. 19-21, Penerbit ITB, Bandung. Whagner, H.L., 2003, The Health Effects of Nicotine and Smoking, in Triggle, D.J., Nicotine-Drugs the Straight Facts, Chapter 3, University Pofessor School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences State University of New York, Buffalo, pp. 45-48. Kar, A., 2005, Pharmaceutical Drug Analysis, New Age Publications, India, pp. 454, 462. Kazakevich, Y., dan LoBrutto R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 15, 192. . Landoni, J.H., 1991, Nicotine, http://www.inchem.org/documents/pims/chemical/ nicotine.htm#SectionTitle:32%20Chemical%20structure, diakses tanggal 18 Februari 2011. Mulja, M. danSuharman, 1995, Analisis Instrumental, UniversitasAirlangga, Surabaya, pp. 26, 31, 259. PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998, Tembakau Vorstenlanden, PT. Pekebunan Nusantara XIX (Persero) Bidang Penelitian, Klaten. Raymond, W.R., Hale, R.W., 1991, United States Patents Process For Isolating Plant Extract Fractions, Philip Morris Incorporated, New York, pp. 1112.


Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition, Saunders College Publishing, USA, pp. 386. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, Second edition., Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 313, 507. Syenina, A., 2011, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. The Merck Index, 1989, The Merk Index An Encyclopedia OF Chemicals, Drugs and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.6434. Tjitrosoepomo, Gembong, 1994, Taksonomi Tanaman Obat-Obatan, Universtitas Gadjah Mada Press, Yogyakarta, pp. 341-342. Voight, 1994, Lehrbuch Der Pharmazeutischen Technologie, diterjemahkan oleh Soewandhi, S.N., hal. 579-580, Universitas Gajah Mada Press.


LAMPIRAN


0%

3

& 4 3 (5 +

+


'%

+

$

5 +

6

7 %7 89 :* ; 3 ; ; * 3 ; 3 83 < &7 8 : "3; = 7 ; 7 ; >%7

+ ; %0

%?# @&/'1'(.'''.2 9

84 (

3;

3; 9 3 1,00

; A 5

$B+

C

+

%

Klaten, 29 Agustus 2011 No Lampiran Hal

: KC – INSIP/11.262 : -,-. : Bahan Penelitian (Tembakau Jenis VBN dan NO)

Kepada : Yth. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Di Yogyakarta Menindaklanjuti hasil konsultasi Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang melalukan penelitian, dengan ini kami berikan bahan penelitian berupa krosok daun tembakau jenis VBN dan NO serta data pendukung lainnya. Demikian untuk dipergunakan sebagai bahan penelitian. Penelitian Klaten,

Tindasan : 1. Sdr. Dina Christiana Dewi 2. Sdr. Amelia Ernesta 3. Sdr. Ayesa Syenina 4. Sdr. Helena Angelina 5. Sdr. Novi Chairio 6. Sdr. Citra Dewi Ariani

( Erna Anastasia D.E.,SP ) Nopeg.00101480


TEMBAKAU Vorstenlanden Bawah Naungan (VBN) Tembakau VBN mulai penanaman Juni dan mulai panen Juli. Pemanenan dilakukan 3 hari sekali 2 lembar daun, jumlah daun per pohon 22 lembar daun. Panen dilakukan kira-kira 40 hari sampai daun tembakau habis. Data Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Tembakau VBN MT.TAHUN : 2010/2011 Nomor Pengamatan Contoh daun 1 1 Tinggi tanaman (cm) 170 2 Jumlah daun (lembar) 22 3 Besar batang (cm) 1,7 4 Panjang daun (cm) 60 5 Lebar daun (cm) 37 6 Indek daun (cm) 0,62 7 Luas daun (g/cm) 1,494,35 8 Panjang ruas (cm) 10 9 Tebal daun (cm) 0,2 Foto Daun Tembakau VBN


Tembakau Na Oogst (NO) Tembakau NO mulai penanaman pertengahan September dan mulai panen akhir Oktober. Pemanenan dilakukan 3 hari sekali 2 lembar daun, jumlah daun per pohon 22 lembar daun. Panen dilakukan kira-kira 40 hari sampai daun tembakau habis. Data Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Tembakau NO MT.TAHUN : 2010/2011 Nomor Pengamatan Contoh daun B 1 Tinggi tanaman (cm) 100 2 Jumlah daun (lembar) 22 3 Besar batang (cm) 1,8 4 Panjang daun (cm) 44 5 Lebar daun (cm) 28 6 Indek daun (cm) 0,64 8 Panjang ruas (cm) 6 9 Tebal daun (cm) 0,28 Foto daun Na Oogst


Lampiran 3. Perhitungan pergeseran pKa nikotin dan pH buffer berdasarkan Kazakevich dan LoBrutto (2007) Untuk senyawa basa dengan setiap penambahan pelarut senyawa organik sebanyak 10% terjadi pergeseran Ph 0,2 unit ke bawah. Cara-cara menghitung : 1. Menghitung ke bawah pergeseran pKa nikotin : pKa nikotin = 8,5 pelarut organik dalam sistem 60% (metanol:asetonitril = 54:6), sehingga 0,2 x 6 = 1,2 8,5 – 1,2 = 7,3 2. Menghitung pH agar nikotin dalam bentuk ionik : pH = -2 unit pKa nikotin 7,3 – 2 = 5,3 3. Pergeseran ke atas pH dari buffer dengan penambahan pelarut organik : 0,2 x 6 = 1,2 4. Menghitung pH maksimum buffer yang dibuat agar nikotin dalam bentuk terion : 5,3 – 1,2 = 4,1. Sehingga pH buffer yang dibuat

4,1


Lampiran 4. Perhitungan Kepolaran Fase Gerak Diketahui: Asetonitril dengan log P = 0,17 ; indeks polaritas = 5,8 Metanol dengan log P = -0,027 ; indeks polaritas = 5,1 Aquabidest dengan indeks polaritas = 10,2 Fase gerak : Buffer asetat : metanol : asetonitril (40 : 54 : 6) Indeks polaritas =


Lampiran 5. Spektrum Nikotin

A = konsentrasi 0,005 ppm absorbansi 0,205, maksimum 260 nm; B = konsentrasi 0,007 ppm, absorbansi 0,333, , maksimum 260 nm; C = konsentrasi 0,009 ppm, absorbansi 0,374, maksimum 260 nm


Lampiran 6. Hasil Perolehan AUC seri baku nikotin Replikasi 1 Konsentrasi AUC (ppm) 312810 0,01 599259 0,03 1042346 0,05 1395814 0,07 1780515 0,09 A = 93157,55 B = 18659825 r = 0,9985 y = 18659825x + 93157,55

Replikasi 2 Konsentrasi AUC (ppm) 0,01 385360 0,03 753585 0,05 1205207 0,07 1646918 0,09 2098121 A = 138124,45 B = 21594275 r = 0,9993 y = 21594275x + 138124,45

Replikasi 3 Konsentrasi AUC (ppm) 0,01 293732 0,03 719507 0,05 1092432 0,07 1522805 0,09 1962964 A = 82847,5 B = 20708810 r = 0,9996 y = 20708810x + 82847,5

Grafik hubungan antara konsentrasi nikotin dengan AUC


Lampiran 7. Penimbangan Serbuk Kering dan Ekstrak Kental Daun Tembakau Untuk Optimasi Lama Waktu Ekstraksi Penimbangan serbuk kering tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan (Jam)

7 -A

7-B

8-A

8-B

9-A

9-B

10-A

10-B

Beker kosong (g)

62,53

44,89

58,23

45,09

58,24

58,23

61,19

45,09

Beker + serbuk (g)

82,54

64,90

78,24

65,10

78,24

78,24

81,20

65,10

Timbangan kasar

Timbangan analitik Beker + serbuk (g)

82,5492

64,9028

78,2490

65,1108

78,2435

78,2437

81,2062

65,1025

Beker + sisa (g)

62,5488

44,9024

58,2488

45,1103

58,2439

58,2435

61,2059

45,1022

Berat serbuk (g)

20,0004

20,0004

20,0002

20,0005

19,9996

20,0002

20,0003

20,0003

Penimbangan ekstrak kental tembakau Vorstenlanden Bawah Naungan (Jam)

7 -A

7-B

8-A

8-B

9-A

9-B

10-A

10-B

Beker kosong (g)

62,53

61,23

63,68

54,66

33,42

63,15

63,37

62,53

Beker + serbuk (g)

63,64

62,34

64,79

55,77

34,42

64,31

64,79

63,65

Timbangan kasar

Timbangan analitik Beker + serbuk (g)

63,6467

62,2326

64,7937

55,7743

33,4205

64,3116

64,7943

63,6555

Beker + sisa (g)

62,6466

62,2324

63,7933

54,7741

32,4203

63,3115

63,7942

62,6552

Berat serbuk (g)

1,0001

1,0002

1,0004

1,0002

1,0002

1,0001

1,0001

1,0003


Lampiran 8. Kromatogram hasil optimasi ekstraksi dengan soxhletasi selama 7,8,9 dan 10 jam (replikasi 2x) a. Kromatogram waktu ekstraksi 7 jam A

b. Kromatogram waktu ekstraksi 7 jam B


c. Kromatogram waktu ekstraksi 8 jam A

d. Kromatogram waktu ekstraksi 8 jam B


e. Kromatogram ekstraksi 9 jam A

f. Kromatogram ekstraksi 9 jam B


g. Kromatogram waktu ekstraksi 10 jam A

h. Kromatogram waktu ekstraksi 10 jam B

Hasil pengukuran AUC sampel dengan variasi waktu ekstraksi sampel dengan soxhlet Waktu (jam) AUC

7A

7B

8A

8B

9A

9B

10 A

10 B

1072305

1135700

1228904

123771

916992

942139

659037

644588


Lampiran 9. Penimbangan Serbuk Kering dan Ekstrak Kental Daun Tembakau VBN dan NO untuk Penetapan Kadar Jenis tembakau

Berat awal

Berat serbuk

Diameter saringan

VBN

961 gram

871,79 gram

1 mm

NO

1817 gram

1686,84 gram

1 mm

1. Penimbangan serbuk kering tembakau VBN Replikasi

I

II

III

IV

V

Beker kosong

58,23 g

45,09 g

44,89 g

49,12 g

44,89 g

Beker + serbuk

78,24 g

65,10 g

64,90 g

69,22 g

64,90 g

Beker + serbuk

78,2490 g

65,1108 g

64,9047 g

69,2256 g

64,9027 g

Beker + sisa

58,2488 g

45,1103 g

44,9043 g

49,2255 g

44,9020 g

Berat serbuk

20,0002 g

20,0005 g

20,0004 g

20,0001 g

20,0007 g

Timbangan kasar

Timbangan analitik

Penimbangan ekstrak kental tembakau VBN Replikasi

I

II

III

IV

V

Beker kosong

63,68 g

54,66 g

44,88 g

62,39 g

49,10 g

Beker + serbuk

64,79 g

55,77 g

45,90 g

63,41 g

50,19 g

Beker + serbuk

64,7937 g

55,7753 g

45,8952 g

63,4113 g

50,1945 g

Beker + sisa

63,7933 g

54,7751 g

44,8949 g

62,4110 g

49,1940 g

Berat serbuk

1,0004 g

1,0002 g

1,0003 g

1,0003 g

1,0005 g

Timbangan kasar

Timbangan analitik


2. Penimbangan serbuk kering daun tembakau Na Oogst Replikasi

I

II

III

IV

V

Beker kosong

49,19 g

54,65 g

49,18 g

49,18 g

49,18 g

Beker + serbuk

69,20 g

74,66 g

69,19 g

69,19 g

69,19 g

Beker + serbuk

69,2055 g

74,6620 g

69,1984 g

69,1926 g

69,1967 g

Beker + sisa

49,2052 g

54,6616 g

49,1982 g

49,1925 g

49,1962 g

Berat serbuk

20,0003 g

20,0002 g

20,0002 g

20,0001 g

20,0005 g

Timbangan kasar

Timbangan analitik

Penimbangan ekstrak kental tembakau Na Oogst Replikasi

I

II

III

IV

V

Beker kosong

61,15 g

62,28 g

44,86 g

54,35 g

45,20 g

Beker + serbuk

62,17 g

63,29 g

44,88 g

55,65 g

46,11 g

Beker + serbuk

62,1656 g

63,2904 g

45,8810 g

55,6458 g

46,1176 g

Beker + sisa

61,1554 g

62,2900 g

44,8807 g

54,6455 g

45,1174 g

Berat serbuk

1,0002 g

1,0004 g

1,0003 g

1,0003 g

1,0002 g

Timbangan kasar

Timbangan analitik


Lampiran 10. Kromatogram Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau VBN dan Na Oogst a) Na Oogst Replikasi 1

b) Na Oogst Replikasi 2

c) Na Oogst Replikasi 3


d) Na Oogst Replikasi

e) Na Oogst Replikasi 5

f) VBN Replikasi 1

g) VBN Replikasi 2


h) VBN Replikasi 3

i) VBN Replikasi 4

j) VBN Replikasi 5


Lampiran 11. Perhitungan kadar nikotin 1. Contoh Perhitungan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau

Seluruh fase kloroform diuapkan dalam almari asam, kemudian dilarutkan dalam 5 mL pelarut. Diambil 100 µL dan diencerkan dalam labu ukur 10,0 mL dengan pelarut hingga tanda. A. Diperoleh AUC VBN 1 = 1258549, kemudian dimasukkan dalam persamaaan kurva baku Y = 20708810x + 82847,5. Y = 20708810x + 82847,5 1258549 = 20708810x + 82847,5

B. Untuk mengetahui nikotin dalam 5 mL, maka

Kadar dinyatakan dalam % b/b


2. Data Perhitungan Kadar AUC

kadar

(ppm)

(µg/ml)

µg/g (dalam5ml)

%b/b (g/100 g)

VBN 1

1258549

0,056773

5,677301

5,677301

28,37516

0,002838

VBN 2

1232800

0,05553

5,552963

5,552963

27,75926

0,002776

VBN 3

1231498

0,055467

5,546676

5,546676

27,72506

0,002773

VBN 4

1238593

0,055809

5,580936

5,580936

27,89631

0,002790

VBN 5

1232771

0,055528

5,552823

5,552823

27,75024

0,002775 0,001316

NO 1

627977

0,026324

2,632356

2,632356

13,15915

NO 2

628873

0,026367

2,636682

2,636682

13,18077

0,001318

NO 3

626067

0,026231

2,623132

2,623132

13,11304

0,001311

NO 4

628265

0,026337

2,633746

2,633746

13,1661

0,001317

NO 5

628560

0,026352

2,635171

2,635171

13,17322

0,001317

3. Tabel Kadar Nikotin Jenis ekstrak Na Oogst

Vorstenlanden Bawah Naungan

Replikasi 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Kadar %b/b 0,001316 0,001318 0,001311 0,001317 0,001317 0,002838 0,002776 0,002773 0,002790 0,002775

Keterangan Rata-rata = 1,316 x 10-3 SD = ± 2,775 x 10-6 CV = 0,2109% Rata-rata = 2,790 x 10-3 SD = ± 2,744 x 10-5 CV = 0,9835%


Lampiran 12. Data Uji Statistik 1. Uji Normalitas Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova

jenis kadar

Statistic

df

Shapiro-Wilk

Sig.

Statistic

df

Sig.

VBN

.310

5

.130

.908

5

.454

NO

.319

5

.106

.824

5

.126

a. Lilliefors Significance Correction Uji normalitas data yang digunakan adalah Shapiro-Wilk dengan nilai kemaknaan (p) > 0,05, kadar kedua ekstrak tembakau terdistribusi normal karena pada tabel Sig. VBN memiliki nilai p = 0,454 dan NO nilai p = 0,126.


2. Uji t tidak berpasangan Independent Samples Test

Levene's Test for Equality of Variances

t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference

F kadar Equal variances

4.833

Sig.

t

.059 119.527

df

Sig. (2-

Mean

Std. Error

tailed)

Difference

Difference

Lower

Upper

8

.000 .001474600 .000012337 .001446151

.001503049

119.527 4.082

.000 .001474600 .000012337 .001440616

.001508584

assumed Equal variances not assumed

Varians data kedua jenis ekstrak sama karena memiliki nilai p >0,05 yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Data kedua kelompok berbeda bermakna ditunjukkan dengan kolom sig.(2-tailed) baris kedua (equal variences not assummed) jika p <0,05 terdapat perbedaan bermakna.


Lampiran 13. Kromatogram Blanko Pelarut Buffer Asetat:aMetanol:Asetonitril (40:54:6)




BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau Jenis VBN dan NO Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” memiliki nama lengkap Dina Christiana Dewi. Penulis lahir di Klaten pada tanggal 29 Desember 1989 sebagai putri kedua pasangan Agus Yunanto dan Sri Mulyani. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Indriayasana, TK Maria Asumpta Klaten (1995-1996), SD Maria Asumpta Klaten (1996-2002), SD Maria Asumpta Klaten (1996-2002), SLTP Pangudi Luhur 1 Klaten (20022005), SMA Negeri 1 Klaten (2005-2008) dan pada tahun 2008 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dhrma Yogyakarta. Selama kuliah penulis mengikuti kegiatan dan organisasi antara lain : panitia pelantikan apoteker angkatan XIX dan XX, pengabdian masyarakat bersama dosen tentang Hipertensi dan Diabetes Melitus, sebagai committe dalam program pertukaran pelajar 2010 dan asisten dosen mata kuliah praktikum Kromatografi (2011).

Skripsi. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Recommend Documents