PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA NÖVÉNY NEMESÍTÉS, GENETIKA ÉS AGRÁRBIOTECHNOLÓGIA PROGRAM
ISKOLAVEZETŐJE: DR GÁBORJÁNYI RICHARD, DSC A BURGONYA REZISZTENCIA NEMESÍTÉS HATÉKONYSÁGÁNAK NÖVELÉSE HAGYOMÁNYOS ÉS MOLEKULÁRIS GENETIKAI MÓDSZEREKKEL
DOKTORI (PHD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI KÉSZÍTETTE: AHMAD MOUSAPOUR GORJI TÉMAVEZETŐ DR. POLGÁR ZSOLT, PHD TÁRSTÉMAVEZETŐ DR. TALLER JÁNOS, PHD KESZTHELY, MAGYARORSZÁG 2011
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés ................................................................................. 2 2. Célkitűzések ............................................................................ 6 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK.............................................. 6 3.1. Növényanyag .................................................................... 6 3.2. Hetero-multiplex vizsgálatok ........................................... 7 3.3. A vírus fertőzöttség értékelése Double Sandwich ELISA (DAS-ELISA) technikával. ..................................................... 8 3.4. Ozmotikus stressz vizsgálat ............................................. 9 3.5. Genomi DNS izolálás ....................................................... 9 3.5.1. A növényi sejtek lízise és a fehérjék denaturálása .. 10 3.6. RNS izolálás ................................................................... 11 3.7. Molekuláris marker vizsgálatok ..................................... 12 3.7.1. Intron targeting (IT) ................................................ 13 3.7.1.1. Az EST szekvenciák azonosítása ..................... 13 3.7.1.2. IT elemzés ........................................................ 14 3.7.2. IT-SCoT markerek .................................................. 15 3.7.3. SSCP analízis ......................................................... 15 3.7.4. SCOT analízis ......................................................... 16 3.7.5. SCAR analízis ......................................................... 17 3.7.6. SSR analízis............................................................. 17 3.7.7. ISSR analízis ........................................................... 18 3.7.8. RAPD analízis ......................................................... 18 3.8. Kapcsoltsági térkép szerkesztése ................................... 19 3.9. Szubtraktív hibridizáció ................................................. 20 3.10. Adat elemzés ................................................................ 20 4. Új tudományos eredmények .................................................. 22 5. Irodalomjegyzék .................................................................... 24 6. Publikációs lista..................................................................... 28
1
1. Bevezetés
A modern értelemben vett burgonyanemesítés 1807-ben kezdődött Angliában, mely során gondosan tervezett mesterséges pollenkeresztezéseket végeztek, amit a korai nemesítési szakirodalmak is alátámasztanak (Knight, 1807; Bradshaw és Mackey, 1994). A mai mezőgazdaság számára elsődleges cél a termésstabilitás elérése termésnövelő anyagok, növényvédőszerek és a vízigény egyidejű csökkentésével (Epso, 2005). Egy modern burgonyafajta sikeres termesztéséhez nem csupán a kártevőkkel szembeni ellenállóság elengedhetetlen, de a különböző betegségek ellen is magas rezisztenciával kell rendelkeznie, amit leggyakrabban a különböző Solanum fajokból eredeztethető allélek biztosítanak, továbbá magas terméshozamot kell produkálnia úgy, hogy mindeközben megőrizze a kiváló termésminőséget (Bradshaw és Mackey, 1994; Gorji et al., 2011). Ahhoz, hogy a burgonyatermesztést szélesebb körben változó környezeti tényezőknek megfelelően hosszabb vegetációs periódusokhoz alkalmazkodva kiterjeszthessük, kiemelt jelentőségű az is, hogy az adott burgonyafajta abiotikus stressz rezisztenciával rendelkezzen, így növelve a termés stabilitását, valamint számos termesztési körülményhez alkalmazkodva a termés mennyiségét és minőségét is. A burgonya genotípusok (Solanum spp.) ozmotikus stressz toleranciájának szabadföldi vizsgálata idő és 2
laborigényes folyamat, valamint az eredményeket számos környezeti és szabadföldi tényező zavarhatja (Ingram et al., 1994; Erusha et al., 2002; Iwama és Yamaguchi 2006; Georgieva et al., 2004). Az in vitro szövettenyészetekben elvégzett ozmotikus stressz szimulációk a különböző összetételű táptalajoknak köszönhetően minimalizálják a környezeti tényezőből adódó variabilitást és biztosítják a stressz kiváltás egyenletességét ellenőrzött körülmények között. Leport et al. (1993) tanulmányukban azt jósolták, hogy az in vitro alapú stressz tolerancia vizsgálatoknak a jövőben meghatározó szerepe lesz az optimális stressz-válasz reakciós stratégiai növényi rendszerek kialakításában. Szárazságtűrésre történő szelekció esetében a legalkalmasabb módszernek a regenerációs fázisban kiváltott ozmotikus stresszt találták (Hsissou and Bouharmont, 1994). Gopal és Iwama (2007) az ozmotikus stresszt burgonya esetében in vitro vizsgálatokban szorbitol és mannitol hozzáadása segítségével vizsgálta. Eredményeik azt mutatják, hogy a tenyészetekben kiváltott ozmotikus faktorok hátrányosan befolyásolják a növények növekedését, melyek genotípusonként eltérnek. Arra a következtetésre jutottak, hogy a burgonya célzott és korlátozott ozmotikus stressz körülmények között végzett in vitro vizsgálata egy olyan rendszert eredményezhet, amely segítségével effektíven elkülöníthetjük a genotípusokat és meghatározhatjuk a szabadföldi körülmények között várt gyökértömegüket.
3
A növények esetében ismeretes, hogy az ozmotikus stressz tolerancia egy kvantitatív úton öröklődő tulajdonság. Általában több kisebb kvantitatív tulajdonságért felelős lókusz (QTL) együttesen kontrolálja. Az azonosított QTLekhez kapcsolt markerek alléljeire alapozott marker alapú szelekcióval értékesebb fenotípusos tulajdonsággal rendelkező genotípusokat azonosíthatunk, melyek segíthetnek a magasabb ozmotikus stressz toleranciával rendelkező fajták nemesítésében (Bálint et al., 2008). Nemrég jelentős előrelépést értek el kvantitatív tulajdonságok térképezésének és kapcsoltságuk elemzésének elméleti hátterének fejlesztésében autotetraploid fajok esetében, ahol a két szülő keresztezéséből származó teljes testvér (full-sib) utódnemzedéket használtak (Luo et al. 2001; Hackett et al., 2001). Az olyan genetikai vagy DNS alapú marker technikákat, mint az RFLP (restriction fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSR (simple sequence repeats), AFLP (amplified fragment length polymorphism) és ISSR (inter simple sequence repeats) rutinszerűen alkalmazzák a genetikai és kvantitatív tulajdonságok (QTL) térképezése és diagnosztikai genetikai ujjlenyomatok készítésére is. Továbbá sikeresen alkalmazzák a populáció genetikai, ökológiai, evolúció genetikai és molekuláris taxonómiai vizsgálatok során, valamint az olyan különböző szintekre kiterjedő növénytudományt érintő genetikai tanulmányokban is, mint a távolság- és parszimónia alapú filogenetikai 4
szisztematikai kutatások (Gupta et al., 1999; Bussell et al., 2005; Semagen et al., 2006; Mark et al., 2007; Agarwal et al., 2008). Ezek a technikák széles körben ismertek, mint ahogy előnyeik és hátrányaik is egyaránt. A molekuláris markerek számos előnnyel szolgálnak a konvencionális fenotípus alapú markerekkel szemben, mivel stabilak és minden szövetben detektálhatóak a növekedéstől függetlenül úgy, hogy a sejt differenciáltságát, fejlődését és védekezési állapotát nem zavarják a környezeti, pleiotrópikus és episztatikus hatások. Az utóbbi években új korszerűbb technikák egy csoportja alakultak ki, melyek elsődlegesen a korábbi alap módszerek kombinációján alapultak. Ezek a korszerűbb technikák számos alap technika előnyét egyesítik magukban. Ezek az újabb technikák az alap technikák metodikai módosításait is magukba foglalják azért, hogy növeljék a szenzitivitást, a genetikai diszkontinuitás és a különbségtétel detektálásának felbontóképességét. A korszerű marker technikák új DNS elemek sorát hasznosítják, mint a retrotranszpozonok, mitokondriális és kloroplasztisz alapú mikroszatellitek, így növelve a genetikai variabilitás felfedésének képességét a genom lefedésének növelésével egyetemben. A génexpresszió mintázatának és biológiai válaszreakciók genetikai alapjainak tanulmányozása során az olyan technikák, mint az RAPD és AFLP szintén használatosak cDNS alapú templátok esetében.
5
2. Célkitűzések A jelenlegi tanulmány célkitűzései a következők voltak: 1) Olyan burgonya genotípusok létrehozása, amelyek a PVY rezisztencia gént (Ry) hetero multiplex formában hordozzák. 2) Az ISSR, RAPD és SCOT technikák polimorfizmus detektáló képességének
összehasonlítása
burgonyafajták
és
F1
genotípusok esetében. 3) Kapcsoltsági térkép szerkesztése tetraploid burgonyában különböző típusú markerek alapján. 4) Gént-célzó (intron-targeting) markerek azonosítása, melyek kapcsoltak
a
PVYNTN
rezisztencia
génnel
(RYsto)
és
alkalmazhatóak a burgonyanemesítési programokban 5) Genetikai
markerek
fejlesztése
melyek
kapcsoltak
az
ozmotikus stressz toleranciához tetraploid burgonyán végzett in vitro kísérletek során. 6) Új, IT-SCOT-nak nevezett gént-célzó markerek fejlesztése. 7) PVYNTN fertőzés során indukált gének részleges izolációja.
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Növényanyag Vizsgálataink során huszonnégy burgonyafajtát (1. táblázat) és 85 – egy F1 populációból véletlenszerűen kiválasztott - genotípust használtunk. Az F1 genotípusokat a White Lady burgonyafajta (anyai partner) és az S440 vonal (apai partner) keresztezésével állítottuk elő a Burgonyakutatási Központban (Pannon Egyetem, Keszthely, Magyarország). A 6
szántóföldi megfigyelések alapján a szülőpartnerek eltérnek mind a szárazságtűrő képességükben (natural heat), mint a PVYNTN –el szembeni rezisztenciájuk tekintetében. A WL rezisztens a PVY NTN törzsével szemben és toleráns a természetes hőséggel valamint a szárazság stresszel szemben is. Ellenben az S440 fogékony a PVY NTN törzsével szemben és alacsony toleranciát mutat a természetes hő és szárazság stresszekkel szemben is. 1. táblázat. A vizsgálatok során használt burgonya fajták, és eredetük. Cultivar
Cultivar
Cultivar
Cultivar
Gülbaba (HU)
Sante (NL)
Lorett (HU)
Panda (G)
Somogyi kifli (HU)
Snowden (USA)
S440 (USA)
Lvovjanka (RU)
Atlantic (USA)
Franzi (G)
WL (HU)
Kennebec (USA)
Desiree (NL)
Agria (G)
Irga (P)
Linzer delicate (AU)
Shepody (CA)
Rioja (HU)
Kondor (NL)
Saturna (NL)
Swiss (USA)
Katica (HU)
Cleopatra (NL)
Vénusz Gold (HU)
(G = Németország, HU = Magyarország, NL = Hollandia, CA = Kanada, P = Lengyelország, AU = Ausztria, RU = Oroszország és USA = Egyesült Államok)
3.2. Hetero-multiplex vizsgálatok Hét PVY rezisztens nemesítési vonalat (96.353., 97557., 97.559., 97.560., 98.433., 99.373., 99.384) kereszteztünk a PVY-al szemben fogékony S440 nemesítési vonallal. A pedigré adatok alapján a hét nemesítési vonal mindegyike valamilyen Ry 7
gént hordoz (S. stoloniferum (S.sto), S. hougasii (S.hou) and. S. andigena (S.and) feltehetően hetero-multiplex formában. A rezisztencia vizsgálatok során mindegyik család mintegy 200 genotípusát
vizsgáltuk
három
ismétlésben,
mechanikai
inokulációval, melyet a PVY NTN törzsének D10 izolátumával végeztünk el. A vírus szintet a fertőzést követő 4. héten mértük DAS-ELISA technikával. Az Ry gén kópiaszámát a rezisztens és fogékony egyedek hasadási arányából határoztuk meg. Chi négyzet tesztet (X2) használtuk a megfigyelt és a várt hasadási arány közötti hasonlóság bizonyítására.
3.3. A vírus fertőzöttség értékelése Double Sandwich ELISA (DAS-ELISA) technikával. Az inkubáció első lépésében a mikrotiter lemez felületét antigén specifikus antitesttel borítottuk. A második inkubációs lépés során az antigéneket kötöttük a már fixált antitestekhez, amelyek így egy antitest-antigén komplexet formáltak. A harmadik inkubációs lépés során az antitest-antigén komplexet reagáltattuk egy AP-jelölt antitesttel, amely így egy dupla antitest szendvicset formált. Pozitív és negatív kontrollt is használtunk a vizsgálataink során. Negatív kontrollként egy egészséges növény (White Lady) friss kivonatát használtuk. Az enzimatikus reakciót 405 nm-es hullámhosszon vizsgáltuk 2 óra elteltével.
8
3.4. Ozmotikus stressz vizsgálat A stresszre fogékony
és
toleráns
szülők
megkülönböztetéséhez először az in-vitro ozmotikus stressz körülményeit optimalizáltuk. Első lépésben 40 db három leveles hajtás csúcsot neveltünk alap MS táptalajon a WL-ből és az S440-ből is. Következő lépésben a növényeket egyedileg üvegekbe osztottuk szét, melyek 10 ml MS táptalajt tartalmaztak különböző mannitol koncentrációkkal (0 mint kontrol, 0,15 mol/dm3,
0,2
mol/dm3
and
0,3
mol/dm3,
10
növény/koncentráció) A növényeket 16/8 órás megvilágítási időtartammal neveltük
20oC-on. A vizsgálatokat teljesen
véletlenszerű elrendezésben 10 ismétlésben és két faktorral végeztük. Tíz nap múlva felvételeztük a növényeken fejlődött gyökerek számát és a gyökér hosszt. A második kísérletben a WL és S440 keresztezésből származó 85 F1 genotípus stressz toleranciáját vizsgáltuk a fentebb leírt körülmények között, de csak 0,3 M mannitol koncentráción mivel ez a koncentráció okozott szignifikáns különbséget a két szülő között az első vizsgálatban.
3.5. Genomi DNS izolálás A genomi DNS-t in vitro növények 80 mg levél és szár szövetéből izoláltuk Walbot és Warren (1988) módosított eljárása (Gorji et al. nem publikált adat) alapján a következők szerint: 9
3.5.1. A növényi sejtek lízise és a fehérjék denaturálása 1. Dörzsmozsárban 50-100 mg növényi szövetet összezúzunk folyékony nitrogén jelenlétében, vagy 1.5 ml-es centrifugacsőben kis mennyiségű kvarc homok hozzáadásával. 2. 1 ml PCL ((100mM Tris HCL (pH 8), 50mM EDTA (pH 8), 1M NaCl and 1% PVP (polyvinyl- pyrrolidone)) oldatot és 80 µl 10 %-os SDS oldatot adunk az összezúzott mintákhoz. 3. A mintákat rövid ideig vortexeljük, majd 80oC-on 45 percig inkubáljuk. Az inkubáció során 2-3 alkalommal megforgatjuk a mintákat. 4. Centrifugálás, 10000 rpm fordulaton 5 percig szobahőmérsékleten. 5. A felülúszót (600 µl) steril centrifuga csőbe pipettázzuk, majd 500µl izopropanolt és 150µl a fehérjék kicsapására szolgáló oldatot (7.5 M ammónium-acetát) adunk
hozzá.
A
mintákat
óvatosan
megforgatva
inkubáljuk őket -20oC-on 30 percig. Az inkubáció 12 órára is kitolható. 6. Centrifugálás, 15000 rpm fordulaton, 10 percig. Tisztítás 7. A centrifugálást követően a felülúszót eltávolítjuk, majd a DNS pelletet 600µl TE pufferrel (10mM TrisHCL, pH 8; 1mM EDTA, pH 8) visszaoldjuk. 10
8. 500µl CIA (chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1) adunk a mintákhoz, majd rázatjuk őket (10 perc, 90 rpm) 9. Centrifugálás, 15000 rpm fordulaton 5 percig. 10. 1 ml 99.5%-os etanolt és 50µl 3M szódium–acetátot adunk a mintához, majd óvatosan megforgatjuk a centrifugacsöveket. 11. Centrifugálás 15000 rpm fordulaton 10 percig. 12. A folyadékot eltávolítjuk majd a pelletet 400µl 70%os etanollal feloldjuk. 13. Centrifugálás, 15000 rpm fordulaton, 5 percig. 14 A felülúszót leöntjük, a csapadékot megszárítjuk (a centrifuga csöveket szűrő papíron fejtetőre állítjuk) 15. A pelletet 100 – 200µl TE pufferrel visszaoldjuk.
3.6. RNS izolálás Az RNS és mikro RNS frakciók izolálásához az RNAzol RT oldatot használtuk. Az RNAzol RT fenol és guanidin segítségével, egyetlen lépésben választja el az RNS-t az egyéb sejtalkotóktól. A nem kloroform indukált fázis eltávolítása elengedhetetlen a tiszta RNS kinyeréséhez, ezért a növényi mintát homogenizáltuk és feltártuk az oldat segítségével. A DNS, fehérje, poliszacharid fázisok és egyéb növényi részek homogén mintából történő eltávolítását víz hozzáadásával és centrifugálással végeztük. A tiszta RNS-t alkoholos kicsapással
11
a felülúszó folyadékból nyertük, amit újabb tisztítási fázis és a kinyert anyag feloldása követett. Az RNS és mikro RNS frakciók szétválasztásának folyamata: 1. Homogenizáció- 1 ml RNAzol®RT + max. 100 mg növényi szövet. 2. DNS/fehérje kicsapás - homogenizátum + 0.4 ml víz, 5 – 15 perc várakozási idő, centrifugálás 12,000 g x 15 min. 3. mRNS kicsapás - 1 ml felülúszó + 0.4 ml 75%-os etanol, 10 perc várakozási idő, centrifugálás 12,000 g x 8 min. 4. mRNS mosása - 0.4 ml 75% etanol, centrifugálás 8,000 g x 1 3 min; kétszer ismételve. 5. RNS visszaoldása vízben. 6. Mikro RNS kicsapás – a 3. lépésben nyert mRNS felülúszó + 0.8 egység izopropanol, 30 perc várakozási idő, centrifugálás 12,000 g x 15 min. 7. Mikro RNS tisztítása - 0.4 ml 70% izopropanol, centrifugálás 8,000 g x 3 min, kétszer ismételve. 8. RNS visszaoldása vízben.
3.7. Molekuláris marker vizsgálatok IT, IT-SCoT, SSCP, SCoT, SCAR, SSR, ISSR és RAPD primerek felhasználásával polimorf fragmentumokat kerestünk Eppendorf Mastercycler ep 384 (Eppendorf, Németország) és
12
Robocycler (Stratagene, USA) típusú PCR gépek segítségével. Az egyes módszerek rövid leírása a következőkben olvasható:
3.7.1. Intron targeting (IT) 3.7.1.1. Az EST szekvenciák azonosítása Összesen 700 S. tuberosum ismeretlen
exon-intron
összetételű EST szekvenciát, illetve 200 ismert rezisztencia mechanizmussal
és
tisztázott
anyagcsere
folyamatokkal
rendelkező burgonya gén szekvenciát gyűjtöttünk ki a National Center
for
Biotechnology
Information
(NCBI)
dbEST
adatbázisából blastx, blastn vagy tblastx keresők alkalmazásával. A génszekvenciák esetében elsősorban egy- vagy alacsony kópiaszámban előforduló géneket céloztunk meg. Azokban az esetekben, melyekben a gének exon-intron szerkezete ismert volt, primereket terveztünk az exonokból indulva úgy, hogy a közrefogott intronok szaporodjanak fel. Azokat a génszekvenciákat, melyeknek ismeretlen volt az exonintron struktúrája, és azokat a burgonya EST-ket melyek nagy hasonlóságot mutattak a más szervezetekben felfedezett génekkel (elsősorban paradicsom és Arabidopsis thaliana) további elemzés alá vetettünk.
Az elemzéseket a 2010
augusztusában az NCBI nyilvános adatbázisában elérhető lehetséges (vélelmezett) exon-intron szekvenciákhoz igazítottuk. Ezt úgy valósítottuk meg, hogy sorba rendeztük az átíródott szekvenciákat, melyeket összehasonlítottunk a szülői genom 13
szekvenciákkal, annak érdekében, hogy azonosítsuk a tényleges exon-intron kapcsolódási pontokat. Előnyben részesítettük a 200-1200 bp hosszúságú termékeket, és ez alapján szűrtük az ennek megfelelő exonokat. Az intronok pontos pozícionálása után a PRIMER 3 nevű program segítségével oligonukleotidokat terveztünk
az
exon
szekvenciákra.
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm).
3.7.1.2. IT elemzés A PCR reakciókat 12 μl végtérfogatú oldattal végeztük. A PCR reakció elegy tartalma: 40 ng DNS templát, 1.2 μl mindegyik 10 M-os 12-mer primerből, 1.2 μl 2 mM-os dNTP (Fermentas, Lithuania), 1.5 μl a 10x PCR buffer -ből(1 mM Tris-HCl, pH 8.8 at 25○C, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl and 0.1% Triton X-100) és 0.29U a DyNazyme II (Finnzymes, Finnország) polimeráz enzimből. A reakciókat a következő profillal indítottuk el: 3 perc 94○C-on, ezt követte 35 cikluson keresztül 94○C 1 min, 51○C 1 perc és 72○C 1 min. A végső extenziós lépés 72°C 10 min. A felszaporított PCR termékeket 5 μl BPB oldattal festettük meg (99.5% de-ionizált formamid, 10 mM EDTA pH 8, 0.05% brómfenol-kék, xylén-cyanol festék, 1 μl steril H2O) és 1,5%-o agaróz gélen (Promega, USA) választottuk szét, 0.5x TBE (Tris-HCl, Boric acid, EDTA) oldatban. Az elektroforézis után az amplifikálódott fragmenteket etídium-bromid festékkel tettük láthatóvá és GenGenius Bio 14
Imaging System (Syngene, UK) géldokumentációs rendszer segítségével dokumentáltuk.
3.7.2. IT-SCoT markerek Az IT-SCoT markereket laboratóriumunkban fejlesztettük úgy, hogy kombináltuk három markertípus - az IT, SCoT (Start Codon Targeted) és a TRAP (Target Region Amplified polymorphism) – előnyeit. Negyven, ismert rezisztencia mechanizmusú,
anyagcseréjű
és
kromoszómális
helyzetű
burgonya gént választottunk az IT primerek tervezéséhez. A lehetséges exon és intron szekvenciák azonosítása után primer párokat terveztünk a burgonya gének exon részének ATG start codon elnevezésű, rövid, konzervatív régiójára, melyek így csak egy vagy maximum két intron régiót céloztak. Ez a technika nevezhető SCoT-nak, ha a primereket egymagukban használjuk, IT-nek, ha párban használjuk és TRAP-nak is, ha az egyedülálló primert valamely más random primerrel állítjuk párba (pl. ISSRrel). A PCR reakcióelegy, az amplifikáció feltételei, az elemzés és a dokumentáció megegyezett az IT és SCoT primereknél említettekkel.
3.7.3. SSCP analízis Az SSCP vizsgálathoz azt a negyven IT primert használtuk, amelyek egy fragmentumot és monomorf mintázatot adtak az IT vizsgálat során. A PCR reakció profilja és az összetétele 15
megegyezik az IT primereknél alkalmazottakkal. A reakciót követően a PCR termékből 4 μl-t a következő összetételű oldattal (95% formamid, 10 mm NaOH és 0.05% os brómfenolkék) festettük meg. Az amplifikált PCR termékeket 95○C-on 5 percig denaturáltuk és azonnal 3 percig jégen hűtöttük. A denaturált minták elválasztásához 0.5 mm x 28.5 cm x 20cm denaturálatlan
poli-akrilamid
gélt
alkalmaztunk.
Az
elektroforézist 1x TBE oldattal, szobahőmérsékleten, 10-12 óra alatt végeztük el. A fragmentumokat módosított ezüst festéses eljárással (Bassam et al. 1991) tettük detektálhatóvá.
3.7.4. SCOT analízis A vizsgálat során 12 SCoT primerből, 15 véletlenszerűen összekombinált primer párt alkalmaztunk az ujjlenyomat készítéséhez. A primer párokat azokból a primerekből képeztük, amelyek az előzetes vizsgálatok során nagyfokú polimorfizmust mutattak. A PCR reakciót az Eppendorf Mastercycler 384-es készülékben végeztük el, mintánként 12 μl reakcióeleggyel, amely a következő komponenseket tartalmazta: 40 ng DNS templát, 1,2 μl a primer pár mindkét 10 μM-os tagjából, 1,2 μl 2 mM dNTP (Fermentas,Lithuania), 1,5 μl 10xPCR puffer (1 mM Tris-HCl, pH 8.8, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl and 0.1% Triton X-100) és 0,29 U DynaZyme II (Finnzymes, Finland) polimeráz enzim. A PCR reakció profil a következő volt: 94○C 4 perc, 35 ciklus: 94○C 30 másodperc, 50○C 1 perc, 72○C 2 perc és a végső 16
extenzió 72○C 5 perc. A PCR termékeket mintánként 5 μl brómfenol-kék festékkel (99.5 % formamid, 10 mM EDTA pH 8, 0.05% brómfenol-kék, xilén-cyanol, 1 μl sterilizált víz) festettük meg és 1.5% agaróz gélen (Promega, USA) 0.5x TBE pufferben (Tris-HCl, Boric acid, EDTA) választottuk el. A géleket elektroforézis után etídium-bromiddal festettük, majd a kapott mintázatot a GenGenius Bio Imaging System (Syngene, UK) géldokumentációs
rendszer
segítségével
detektáltuk
és
dokumentáltuk.
3.7.5. SCAR analízis A PCR reakció összetétele az amplifikálódott termékek dokumentálása és elemzése megegyezik a már leírt IT primerekével. A PCR reakció paraméterei a következőek voltak: 94○C 1 perc, 35 ciklus: 94○C 30 másodperc, 54○C 1 perc, 72○C 1 perc, majd egy végső extenziós lépés 72°C 10 percig. A primereket Cernák et al.(2008) tervezték.
3.7.6. SSR analízis A vizsgálat során a burgonya genom XI és XII kromoszómájára lokalizált SSR markereket (Milbourne et al., 1998) teszteltük le. A PCR reakciót a Robocycler (Stratagene, USA) készülékben végeztük el mintánként 25 μL reakció eleggyel, mely a következő komponenseket tartalmazta: 50 ng DNS, 0.5 μL 10 mM dNTP (Fermentas, Litvánia), 2.5 μL 10x 17
Taq puffer, 2 μL 25mM MgCl2, 1μl 10 μM primer páronként, 0.5 u Taq DNS polimeráz enzim. A PCR reakcióhoz a következő programot alkalmaztuk: 94 °C 4 perc,35 ciklus: 94°C 30 másodperc, 51°C 30 másodperc,72°C 1 perc és a végső extenziós lépés 72°C 5 perc. A kapott termékeket 1.5% agaróz gélen (Promega, USA) 0.5x TBE pufferben választottuk el, majd etídium-bromiddal festettük.
3.7.7. ISSR analízis Az ISSR analízist 15 primerrel végeztük el. A PCR elegy összetétele megegyezett a SCoT analízisnél használtakkal, azzal az egy kivétellel, hogy a primerből 2.4 μl mennyiséget használtunk. A PCR reakció a következő beállításokkal zajlott le: 94○C 2 perc, 35 ciklus: 94○C 30 másodperc, 50○C 1 perc, 72○C 2 perc, majd 72○C 5 perc. A primerek kapcsolódási hőmérséklete az UBS835, UBS841, UBS842 és UBS844 primerek esetében 55○C volt. A PCR reakció során felszaporodott fragmentumokat 1.5%-os agaróz gélen TBE bufferben választottuk el, majd etídium-bromidos festéssel tettük detektálhatóvá és a GenGenius Bio
Imaging
System
(Syngene,
UK)
géldokumentációs
rendszerrel dokumentáltuk.
3.7.8. RAPD analízis A vizsgálatot megelőzően, azért hogy a legjobban alkalmazható primereket válasszuk ki, 50 RAPD primert 18
teszteltünk
le
a
WL
és
S440
szülőkön,
valamint
keresztezésükből származó 6 egyeden (3 rezisztens és 3 fogékony a burgonya Y vírusra). Ennek eredményeképp olyan 15 primer párt választottunk ki amelyek megismételhető eredményt adtak. A reakció elegy mennyisége mintánként és az összetétele is megegyezik a SCoT analízisnél leírtakkal. A PCR profil a következő volt: 94○C 4 perc, 35 ciklus 94○C 30 másodperc, 37○C 1 perc, 72○C 2 perc, a végső lépés pedig, 72○C 5 perc. A PCR termékek detektálása és dokumentálása megegyezik a SCoT vizsgálatnál alkalmazottakkal.
3.8. Kapcsoltsági térkép szerkesztése Előzetesen klaszter vizsgálatot végeztünk a szülőkön a szimplexnek minősülő markerekkel. Ezután az összes szimplex, duplex és multiallélikus markerrel csoport analízist végeztünk kapcsoltsági csoportokba (LG) rendezés céljából (Luo et al., 2001). A markereket a két szülőn külön vizsgáltuk. Mindegyik LG rekombinánciós gyakoriságát és LOD értékét minden marker pár vonatkozásában kalkuláltuk a Luo és mtsai (2001) által leírt algoritmus segítségével. Permutációs teszttel (Churchill és Doerge, 1994) 99%-os küszöböt állítottunk fel a simlex és duplikált simplex kapcsolat megállapítására. A Tetraploidmap szoftverrel (Hackett és Luo, 2003) elemeztük az adatokat.
19
3.9. Szubtraktív hibridizáció Az RNS tisztítást, cDNS
szintézist,
a
szubtraktív
hibridizálásokat és minden egyéb lépést a PCR-Select cDNA subtraction kit gyártójának (Clontech, USA) útmutatása szerint végeztünk. A szubtraktált termékeket Clonejet™ PCR klónozó kittel (Fermentas, Litvánia) molekulárisan klónoztuk.
3.10. Adat elemzés A PCR termékeket az adott pozíciókban lévő jelenlétük (1) illetve hiányuk (0) alapján bináris mátrixban regisztráltuk. Csak a tisztán kivehető, egyértelműen értékelhető sávokat vettük számításba. Feltételeztük, hogy az együtt migráló fragmentumok analóg lókuszokból származnak. A Jaccard hasonlóság mátrix, Shannon log2 alapján kalkulált információs index, variancia (Bowman et al., 1969), AMOVA (analysis of molecular variance) és PCOA (principal coordinate analysis) vizsgálatokat FAMD 1.23β (Schluter és Harris, 2006) programmal végeztük. Dendrogram szerkesztéshez a távolság mátrixot a NeighborJoining módszerrel kalkuláltuk. A bootstrap vizsgálatot 2000 replikációban a Splits Tree4 program (Huson and Bryant, 2006) segítségével végeztük. A primerek polimorfizmus detektáló erejét (resolving power) (rp), a polimorf információs tartalmat (polymorphic information content) (pic), marker indexet (mi), és a diverzitás indexet (di) kalkuláltuk. A QTL vizsgálatot és a permutációs tesztet a Tetraploidmap szoftverrel végeztük 20
(Hackett és Luo, 2003). A statisztikai elemzéseket az SPS v11.5 és SAS v8 rendszerekkel hajtottuk végre.
21
4. Új tudományos eredmények 1) Azonosítottunk egy heterotriplex szülői vonalat, mely S. stoloniferum, S. tuberosum, ssp. andigena és a S. hougasii vad burgonya fajokból származó Ry gént hordoz. 2) A klaszter mintázat összehasonlítása azt muatta, hogy a SCoT marker hely specifitása (a fajta származási helye vonatkozásában) magasabb mint a többi markeré, mivel különbséget tudott tenni a fajták között nemcsak azok rokonsági foka, de a kibocsátás helye szerint is. 3) Eredményeink alapján megállapítható, hogy a SCoT, ISSR és RAPD markerek hatékonysága az F1 populáció vizsgálatában
nagyjából
azonos,
azonban
a
burgonyafajták megkülönböztetésében a SCoT technika hatékonyabb a másik két eljárásnál. 4) Egy új markerezési eljárást, nevezetesen az IT-SCoT technikát fejlesztettük ki, mely az IT, SCoT és TRAP technikák előnyeit kombinálja. 5) A White Lady vonatkozásában 13, míg az S440 esetében 14 kapcsoltsági csoportot (LG) állítottunk fel a duplikált szimplex markerek kizárása után. A kapcsoltsági csoportok közül három, a VII, XI és XII burgonya 22
kromoszómákkal mutatott azonos markereket, míg két másik LG valószínűsíthetően a IX kromoszómához köthető. A XII kromoszómát azonosító kapcsoltsági csoport esetében egy IT és egy SSR marker is valószínűsíti az azonosságot. 6) Az in vitro ozmotikus stressz tolerancia vizsgálatok során 14 QTL-t (LOD>2) azonosítottunk. Ezek közül 6 darab (3 a gyökér hosszúsággal, 3 pedig a gyökér számmal kapcsolt) fő QTL-nek bizonyult a permutációs teszt
alapján.
A
gyökér
hosszra
egy
QTL-t
azonosítottunk a XII kromoszómán mely a fenotipikus variancia 52.3%-át magyarázza. A gyökér számra egy, a fenotipikus
variancia
19,2%-át
magyarázó
QTL-t
azonosítottunk a IX kromoszómán, illetve a XII kromoszómán egy másik azonosított QTL a fenotipikus variancia 26,8%-át magyarázza (LOD=2.4). 7) Az azonosított fő QTL-ek mindegyivel 2-4 cM távolságra
kapcsolt
markereket
azonosítottunk.
E
markerek az in vitro eredmények 40-55%-át igazolták. 8) A gyökér hossz és gyökér szám QTL-einek kapcsoltsága a két tulajdonság asszociációjára utal.
23
5. Irodalomjegyzék Agarwal, M., Neeta, S., and Harish, P. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep 27:617–631. Bálint, A. F., Szira, F., Börner, A., and Galiba, G. (2008) Segregation- and association based mapping of loci influencing osmotic tolerance in barley. Acta Biologica Szegediensis, 52 (1):101-102.
Bassam, B.J., Caetano-Anolles, G., and Gresshoff, P.M. (1991) Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels, Anal. Biochem. 196 80–83. Bowman, K.O., Hutcheson, K., Odum, E.P., and Shenton, L.R. (1969) Comments on the distribution of indices of diversity, Proc. Intl. Symp. Stat. Ecol 3:315-359. Bradshaw, J.E., and Mackay, G.R. (eds) (1994) Potato Genetics. CAB International, Wallingford, 467–497. Bussell, J.D., Waycott, M., and Chappill, J.A. (2005) Arbitrarily amplified DNA markers as characters for phylogenetic inference. Persp Plant Ecol Evol Syst 7:3-26.
Cernak, I., Decsi, K., Sandor, N., Istvan, W., Polgar, Z., Gergely, G., Yataka, H., and Taller, J. (2008) Development of a locusspecific marker and localization of the Rysto gene based on 24
linkage to a catalase gene on chromosome XII in the tetraploid potato genome. Breeding Science, 58: 309-314. Churchill, G.A., and Doerge, R.W. (1994) Empirical threshold values for quantitative trait mapping. Genetics 138:963–971. EPSO (2005) European plant science: a field of opportunities. Journal of Experimental Botany, 417: 1699–1709. Erusha, K.S., Shearman, R.C., Roirdan, T.P., and Wit, L.A. (2002) Kentucky bluegrass cultivar root and top growth responses when grown in hydroponics. Crop Sci. 42:848–852. Georgieva, M., Djilianov, D., Konstantinova, T., and Parvanova, D. (2004) Screening of Bulgarian raspberry cultivars and elites for osmotic tolerance in vitro. Biotechnol. & Biotechnol. Eq. 95-98.
Ghislain, M., Zhang, D., Fajardo, D., Huamann, Z., and Hijmans, R.H. (1999) Marker-assisted sampling of the cultivated Andean potato Solanum phureja collections using RAPD markers. Genet Resour. Crop Evol., 46, 547–555. Gopal, J., and Iwama, K. (2007) In vitro screening of potato against water-stress mediated through sorbitol and polyethylene glycol. Plant Cell Rep, 26:693–700. Gorji, M.,A., Wolf, I., Decsi, K., Taller, J., Ahmadvand, R., and Polgár, Z. (2011)
Development of hetero multiplex potato
genotypes carrying PVY resistance genes, IX, Magyar Genetikai Kongresszus es XVI, Sejt-es Fejlődésbiológiai Napok, pp 176-177.
25
Gupta, P.K., Varshney, R.K., Sharma, P.C., and Ramesh, B. (1999) Molecular markers and their application in wheat breeding. Plant breed 118:369-90. Hackett, C.A., Bradshaw, J.E., and McNicol, J.W. (2001) Interval mapping of QTLs in autotetraploid species. Genetics 159:1819– 1832.
Hackett, C.A., and Luo, Z.W. (2003) TetraploidMap: construction of a linkage map in autotetraploid species. J Hered 94:358–359. Hackett, C.A., Pande, B., and Bryan, G.J. (2003) Constructing linkage maps in autotetraploid species using simulated annealing. Theor Appl Genet 106:1107–1115. Hsissou, D., and Bouharmont, J. (1994) In vitro selection and characterization of drought-tolerant plants of durum wheat (Triticum durum Desf) Agronomy, 2: 65-70.
Huson, D.H., and Brayant, D. (2006) Application of phylogenetic networks in evolutionary studies, Molecular Biology and Evolution, 23 (2):254-267. Ingram, K.T., Bueno, F.D., Namuco, O.S., Yambao, E.B., and Beyrouty, C.A. (1994) Rice root traits for drought resistance and their genetic variation. In: KirkGJD (ed) Rice roots: nutrient and water use. IRRI, Manila, Philippines, pp 67–77.
26
Iwama, K., and Yamaguchi, J. (2006) Abiotic stresses. In: Gopal J, Khurana SM Paul (eds) Handbook of potato production, improvement and postharvest management. Food Product Press, New York, pp 231– 278. Knight, T.A. (1807) On raising of new and early varieties of the potato (Solanum tuberosum). Trans Hort Soc Lond 1: 57–59.
Leport, L., Petrivalsky, M., and Chappart, M. (1993) Effectors for the osmoinduced proline response in higher plants. Plant Physiol Biochem 31: 911-922. Luo, Z.W., Hackett, C.A., Bradshaw, J.E., McNicol, J.W., and Milbourne, D.M. (2001) Construction of a genetic linkage map in tetraploid species using molecular markers. Genetics 157:1369– 1385. Mark, P.S., Li-Bing, Z., Colleen, T.W., and Kai, M. (2007) A penalty of using anonymous dominant markers (AFLPs, ISSRs, and RAPDs) for phylogenetic inference. Molecular phylogenetics and Evolution 42:528-542.
Prevost, A., and Wilkinson, M. J. (1999) A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars , Theor Appl Genet 98: 107-112 . Semagen, K., Bjornstad, A., and Ndjiondjop, M.N. (2006) An overview of molecular marker methods for plants. Afr J Biotechnol 5:2540-68.
27
Schluter, P.M., and Harris, S.A. (2006) Analysis of multilucous fingerprinting data sets containing missing data. Mol. Notes: 6:569-572. Stam, P. (1993) Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package: Joinmap. Plant J 3:739– 744. Walbot, V., and Werren, C. (1988) Regulation of Mu element copy number in maiz line with an active or inactive mutator transposonable element system. Mol Gen Genet 211:27-34.
6. Publikációs lista Lektorált folyóirat cikkek: Gorji, M.A., Poczai, P., Polgar, Z., and Taller, J. (2011): Efficiency of arbitrarily amplified dominant markers (SCoT, ISSR and RAPD) for diagnostic fingerprinting in tetraploid potato. American Journal of Potato Research, pp 1-12. Doi: 10.1007/s12230-011-9187-2. Gorji, M.A., and Polgar Z. (2010) Application of genetic engineering in potato breeding, Acta Agronomica Hungarica, 58(4), pp. 427–441.
28
Poczai, P., Cernák, I., Gorji, M.A., Nagy, S., Taller, J., and Polgár, Z. (2010) Development of intron targeting (IT) markers for potato and cross-species amplification in Solanum nigrum (Solanaceae). American Journal of Botany, 97: e142-e145.
Konferencia összefoglalók: Gorji, M.A., Wolf, I., Decsi, K., Taller, J., Ahmadvand, R., and Polgár, Z. (2011)
Development of hetero multiplex potato
genotypes carrying PVY resistance genes. IX., Magyar Genetikai Kongresszus és XVI.,Sejt-és Fejlődésbiológiai Napok, pp 176-177. Decsi K., Gorji, M.A., Taller, J., Cernák, I., Wolf, I., and Polgár, Z. (2011) Burgonya fitoftóra rezsztencia gén molekuláris markerezése és térképezése. IX., Magyar Genetikai Kongresszus és XVI.,Sejt-és Fejlődésbiológiai Napok, pp 206-207. .
29
