PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
Iskolavezető: Dr. Kocsis László, DSc
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
A rezisztencia genetikai hátterének vizsgálata a burgonyában különös tekintettel a burgonyavész (P. infestans) rezisztenciára
Készítette: RAMIN HAJIANFAR Témavezetők: Dr. Taller János, PhD és Dr. Polgár Zsolt, CSc KESZTHELY 2014
1
Tartalomjegyzék 1.
BEVEZETÉS .................................................................................................... 3
2. KUTATÁSI CÉLOK ............................................................................................... 5 3. ANYAG ÉS MÓDSZER ......................................................................................... 5 3.1. Növényanyag és fitoftóra izolátumok .............................................................. 5 3.2. Fertőzési tesztek P. infestans izolátumokkal ................................................... 6 3.3. R gének kimutatása specifikus primerekkel a White Lady burgonyafajtában.. 6 3.4. Időkövetéses mintavétellel végzett, új generációs szekvenálások kevert (bulk) transzkriptóm mintákon .......................................................................................... 6 3.4.1. A P. infestans rezisztencia gén homológok filogenetikai analízise ......... 6 3.4.2. P. infestans rezisztenciagén homológok kiválasztása a TC adatbázisból 7 3.4.3. NBS-LRR motívumok az R gén homológ illesztésekben ........................ 7 3.5. Transzkriptóm alapú primerek fejlesztése R gének és R gén homológok azonosításához .................................................................................................. 7 3.6. HR közvetített burgonyavész rezisztencia gének kvantitatív elemzése ...... 7 3.7. A P. infestans fertőzés hatásának vizsgálata a White Lady leveléből vizsgált fehérjeprofilon. .................................................................................... 7 4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ......................................................... 8 4.1. Az inokulációs teszt alapján a White Lady fajtában jelen lévő R gének ............... 8 4. 3. Az R1 génre specifikus intron-targeting primerek fejlesztése ....................... 10 4. 4. Biotikus stress indukált gének expressziójának vizsgálata P. infestans inokulált burgonyában qPCR-rel .......................................................................... 11 5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ................................................................. 11 6. REFERENCIÁK .................................................................................................... 12 7. PUBLIKÁCIÓS LISTA ......................................................................................... 14 Referált folyóiratokban megjelent publikációk: ................................................... 14 Konferencia összefoglalók: .................................................................................. 14
2
1. BEVEZETÉS A burgonya (Solanum tuberosum L.) a harmadik legfontosabb élelmiszernövény a világon a búza és a rizs után (Haverkort et al., 2009). Magas vitamin, szénhidrát és nyomelem tartalma miatt szinte az egész világon előszeretettel fogyasztják. A FAO statisztikai adatai alapján a 2012-es évben a 19.202.082 hektáron termesztett burgonya globális termésmennyisége elérte a 364 808 768 tonnát (Fao, 2012). 1990es éveket alapul véve, megállapítható, hogy 2012-ig a burgonya termés mennyisége igen jelentősen, 98.000.000 tonnával, valamint a termesztésére használt földterület 1.546.000 hektárral nőtt, köszönhetően a tudományos és technológiai fejlődésnek köszönhetően a növénytermesztés és nemesítés területén egyaránt. Azonban a burgonya számos növény-patogén kórokozó gazdaszervezete is, úgy mint gombák, baktériumok, fitoplazmák, vírusok, viroidok és fonálférgek, amelyek nagyban csökkentik a hozam mennyiségét és minőségét. A patogének közül a burgonya legpusztítóbb betegsége a burgonyavész (vagy más néven fitoftóra) amelyet egy petespórás gomba, az oomikóta Phytophthora infestans okoz. Az 1840-ben Írországban bekövetkezett nagy éhínség is ennek a kórokozónak tudható be, amely a mai napig is komoly fenyegetést jelent a burgonyatermesztésre, annak ellenére, hogy azóta már különböző stratégiákat fejlesztettek ki a kórokozó agresszivitásának visszaszorítására. A P. infestans által okozott terméscsökkenésből eredő bevételkiesés körülbelül 6,7 milliárd dollár világviszonylatban (Haverkort et al., 2008). Ezen a területen végzett kutatások rávilágítottak arra, hogy a petespórás gombák, mint pl. a P. infestans is számos effektor fehérjét szekretálnak, amelyek befolyásolják a gazdaszervezet természetes immunitását utat engedve így a paraziták által okozott fertőzéseknek (Kamoun, 2007). Annak ellenére, hogy ezek a fehérjék elsősorban a kórokozók virulencia faktorai, mégis felmerül a lehetősége annak, hogy növényi R proteinekként kerülnek felismerésre a gazda-genotípusában amely az effektorváltal kiváltott immunválaszhoz vezet. Az ilyen esetekben az effektor molekulák avirulencia (Avr) aktivitást mutatnak ami nem-kompatibilis kapcsolatot eredményez. A rezisztencia (R) géneket a nukleotid kötőhellyel és leucin-gazdag ismétlésekkel jellemzett (NB-LRR) fehérje családok kódolják. Feltételezések szerint az R gének szabályozzák a szignál-transzdukciós útvonalakban szerepet játszó biomolekulák termelődését (Leipe et al., 2004). Az R gének között vannak faj-specifikus - úgymint a S. demissum kifejezetten P. infestans rezisztenciáért felelős rezisztenciagénjei - és
3
vannak az úgynevezett teljes védettséget biztosító rezisztencia gének, mint például a S. bulbocastanum Rpi génjei. Mivel a P. infestans számos genetikailag igen variábilis alfajjal rendelkezik, ezért az új R gének és homológjainak meghatározása és jellemzése napjainkban fontos hangsúlyt kapott a burgonya nemesítés területén végzett molekuláris biológiai kutatásokban. Az ezen célból alkalmazott legelőnyösebb módszer az új ultra-magas áteresztőképességű szekvenálási eljárások (high-throughput sequencing, UHTS) az úgynevezett új generációs szekvenálási eljárások (next generation sequencing, NGS) melyek lehetővé teszik a biotikus stresszre ellenálló és stressz választ adó rezisztens burgonya fajták teljes genomi transzkriptom (TC) adatbázisának létrehozását. Ezt az eljárást használjuk RNS szekvenálására (RNA-seq), transzkriptomok kópia számának meghatározására, valamint bármilyen típusú transzkriptom részletesebb elemzésére (Wang et al., 2012). Ahhoz hogy a kívánt R géneket és QTL-eket (quantitative trait locus) hordozó genotípusok kiválasztásában a legnagyobb pontosságot érjük el, allél-specifikus primerek és az ehhez szorosan kötődő molekuláris markerek használata elengedhetetlen a markeren alapuló szelekció (marker assisted selection, MAS) során. A Solanaceae családba tartózó fajok genomjai nagyfokú konzerváltságot mutatnak, melyek alkalmazásával megvalósítható az intron célzás, azaz az intron-targeting (IT). Ez a módszer egy hatékony stratégia a gén specifikus és kodomináns markerek kifejlesztésére. Amikor a burgonya növény és a P. infestans érintkezésbe kerülnek egymással a gazdaszervezet anyagcseréjében számos változás következik be. Ez az un. molekuláris crosstalk-nak köszönhető, amely a rezisztens növény és a P. infestans közötti jelátviteli molekulák cseréjének sokaságát vonja maga után. Ezen szignál molekulák a növényben transzportálódnak és a védekezésben szerepet játszó géneket stimulálják, beindítva így a patogenezishez köthető (PR) fehérjék, proteináz inhibítorok, reaktív oxigén gyökök és más antimikrobiális vegyületeket termelődősét a hiperszenzitív reakció (HR) részeként. A védekezésben szerepet játszó gének mennyiségi elemzése hozzájárul ahhoz, hogy megismerjük, a gének szerepét és hozzájárulását a fitoftóra rezisztenciéhoz. A valós idejű (real-time) PCR technológia segítségével meghatározhatjuk egy szövet vagy sejttípus adott transzkriptkeinek relatív expressziós szintjét, valamint változásának mértékét (Bookout and Mangelsdorf, 2003). Az utóbbi időben, azonban a transzkriptomok kópia számának a meghatározására egy új és ígéretes NGS digitális gén expressziós eljárást vezettek be, lehetővé téve így egy szekvencia számszerinti ismétlődésének detektálását egy adott mintában (Willenbrock et al., 2009).
4
2. KUTATÁSI CÉLOK A jelen tanulmány kutatási céljai a következők: 1) A burgonyavészt okozó Phytophthora infestans kórokozóval szembeni rezisztencia genetikai hátterének feltárása a White Lady fajtában. 2)
Biotikus stressz által kiváltott génexpressziós változások értékelése a White Lady fajtában RNS-szekvenálással generált transzkriptom adatbázis elemzésén keresztül.
3)
A White Lady fajta P. infestans rezisztencia génhomológjainak filogenetikai vizsgálata.
4)
A transzkriptom adatok alapján az R génhomológokra specifikus intron-targeting (IT) primerek fejlesztése.
5)
A biotikus stress-válaszban résztvevő gének expressziós profiljának vizsgálata qPCR eljárással.
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Növényanyag és fitoftóra izolátumok Vizsgálataink során a komplex rezisztenciával rendelkező White Lady (WL) fajtát alkalmaztuk, mely nagy fokú toleranciával rendelkezik a Phytophthora infestans-szal szemben, valamint extrém rezisztens a burgonya PVX és PVY vírusával szemben. A patogén különböző avirulencia génnel (avr) rendelkező agresszív izolátumait használtunk a kísérletek során. A fenotípusos reakcióinak értékeléséhez a White Lady x S440 keresztezésből származó F1 genotpusokat, valamint a Mastenbroek–féle differenciáló sort használtuk.
5
3.2. Fertőzési tesztek P. infestans izolátumokkal A P. infestans izolátumokat egy héten át növesztettük a fogékony Hópehely fajta gumó szeletein. Az inokulációt üvegházi és laboratóriumi körülmények között végeztük, melyhez zoospóra képződés utáni sporangium szuszpenziót használtunk.
3.3. R gének kimutatása specifikus primerekkel a White Lady burgonyafajtában A White Lady, az S440 és a Mastenbroek R genotípusaiból, továbbá a WL x S440 keresztezésből származó 24 db F1 genotípusból teljes genomi DNS-t izoláltunk a Walbot & Warren-féle eljárás (Walbot and Warren, 1988) szerint. Az ezt követő PCR-eket S. demissum-ból izolált R génekre tervezett specifikus primerekkel (R1, R2, R3a and R3b) végeztük el Eppendorf Mastercycler ep384 készülékben.
3.4. Időkövetéses mintavétellel végzett, új generációs szekvenálások kevert (bulk) transzkriptóm mintákon Annak érdekében, hogy minél részletesebb képet kaphassunk a tetraploid burgonyában a biotikus stressz során bekövetkező stressz-válaszról, több mintából összeállított kevert mintákon végeztünk transzkriptóm elemzést. Az új generációs szekvenálási technikákkal végzett szekvenáláshoz a mintákat eltérő időpontokban vettük. Világszerte a burgonya talán legveszélyesebb betegségének kórokozójával a P. infestans és a PVX és PVY vírussal fertőztük a WL fajtát. Az inokulálás utáni mRNS-t három ismétlésben vontuk ki; a vírusok esetében 11, a fitoftóra esetében pedig 8 mintavételi időpontban. Egyidejűleg, minden esetben kontroll mintát is vettünk. Az RNS szekvenálást Life Tech SOLID RNA Sequencing Kit-tel végeztük. Ezután elvégeztük az összeállított konszenzus szekvenciák burgonya genom térképre illesztetését, melyhez a Solanum tuberosum L. group Phureja clone DM1-3 516 R44 használtuk. A génkifejeződésbeli különbségeket az RPKM (leolvasások száma 1000 bázisonként, egy millió térképezett leolvasásra vetítve) (Mortazavi et al., 2008) érték kontroll és kezelt minták közötti változása alapján állapítottuk meg.
3.4.1. A P. infestans rezisztencia gén homológok filogenetikai analízise A TC adatbázisban P. infestans rezisztencia gén homológokat a funcionális azonosságok alapján kerestük. A kiválasztott homológokat a SOL Genomics Network (SGN - http://solgenomics.net/) segítségével válogattuk ki, és NCBI blast-tal (National Center for Biotechnology Information, USA) azonosítottuk. A szekvenciaazonosság és szekvenciahossz előzetes elemzését parszimónia és maximum likelihood algoritmus alapú vizsgálatok követték.
6
3.4.2. P. infestans rezisztenciagén homológok kiválasztása a TC adatbázisból A különböző R gén homológok vizsgálatát az aminosav sorrend páronkénti illesztésével a Mega 5.2 szoftverrel végeztük, és a szelekciós tesztet Kimura model segítségével (Tamura et al., 2011), az egyes becslések vonatkozásában 95- és 99% -os valószínűség mellett hajtottuk végre.
3.4.3. NBS-LRR motívumok az R gén homológ illesztésekben A R géneken és homológjaikon nukleotid kötőhelyre (nucleotide binding site (NBS), valamint leucingazdag ismétlődéseket (leucin rich repeats - LRR) kerestünk. A homológok ezen régióinak többszörös illesztését Mega 5.2. szoftverrel végeztük.
3.5. Transzkriptóm alapú primerek fejlesztése R gének és R gén homológok azonosításához Primerek tervezéséhez a P. infestans R génekre és R gén homológokra a biotikus stressz által indukált White Lady TC adatbázist használtuk fel. Különösen az R1 gén esetében számos olyan homológ van, melynek a P. infestans rezisztenciában szerepe lehet. Három különböző markerezési eljárást használtunk a primerek tervezése során: IT (intron-targeting), a CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence), SCAR (sequence characterized amplified region) (bővebben lásd:1. Táblázat).
3.6. HR közvetített burgonyavész rezisztencia gének kvantitatív elemzése Több, a burgonyavész rezisztenciában potenciálisan szerepet játszó, transzkriptomból kiválasztott, biotikus stressz indukált gén expressziós szintjét vizsgáltuk qPCR-rel. A kórokozómentes környezetben nevelt WL növényeket H12/10 és 10/2010 izolátumokkal, a kontrolt pufferrel inokuláltuk. A mRNS kivonáshoz 7 időpontban vettünk (1, 4, 17, 24, 35, 48 és 65 órával az inokulálás után) mintát; mintavétel után azokat azonnal folyékony nitrogénben fagyasztottuk le. A kontrollként szolgáló, pufferrel inokulált mintákat ezekkel párhuzamosan gyűjtöttük be. Az mRNS-t RNAzol (MRC Inc., USA) kittel vontuk ki. A kiválasztott gének átiratát használtuk specifikus RT primerek tervezéséhez a Primer Express 3 szoftver (Life Technologies, USA) segítségével. A kvantifikálást StepOne Real-Time PCR Systems (Life Technologies, USA) készülékkel végeztük el.
3.7. A P. infestans fertőzés hatásának vizsgálata a White Lady leveléből vizsgált fehérjeprofilon. A kezelt (P. infestans inokulálást) és kezeletlen (mock inokulált) WL leveleket SDSPAGE eljárással vizsgáltuk. Az összes kivont fehérjét poliakrilamid
7
gélelektroforézissel vizualizáltuk; festés, és 7%-os metanol-ecetsavas fixálás után szárítottuk, majd kiértékeltük a kapott fehérje profilt.
1. Táblázat: A transzkriptom alapján tervezett IT Primerek Név
Szekvencia
R1L506-2-F R1L506-2-R R1L380-1-F R1L380-1-R R1L333-1-F R1L333-1-R R1A4-1F R1A4-1R R1B23-1F R1B23-1R R1B23-3F R1B23-3R R1C3-2F R1C3-2R R1A4-3F R1A4-3R
TCAACTTCATCAACTCGCACTT CTCAGCAACATATCTACTGTATCACAA TCAAAGCAAAGATTCAGGAAAA TCATTCATCCTCGGAGTCCT CCAGAACACAAGGAACAAATAGAA GCTAGCCTCAATTAAAGCATGA CCAATACTTTGCCGATCGTCC TATATCTGGCAGCTGATCTACGC TAGCCTTCGCAATGAGTACA GCATCTTCACTTTCTGCGCT AAGCTGCTCCCCTCTCCTAA GCCATCCACGCAAAACCAAT AAATGCGCTACTGTTCACGC CAGTTCCACGGTACAAGGCT AGCAATGGCAAGTTCCCTCA GGCTGACTTGACAACCGACT
Tm (°C)
Marker típus
enzim
56
IT
-
R1
55
IT
-
R1
58
IT
-
R1
RsaI
R1
RsaI
R1
57 57
NGScaps NGScaps
Célgén
(TC)
57
SCAR
-
R1
62
SCAR
-
R1
58
SCAR
-
R1
4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
4.1. Az inokulációs teszt alapján a White Lady fajtában jelen lévő R gének A White Lady fenotipikus reakcióját összehasonlítva a Mastenbroek differenciáló sor, különböző R géneket tartalmazó vonalaival - négy különböző avr/Avr gént tartalmazó izolátummal történt fertőzés után – megállapítható, hogy legalább nyolc gén az R1, R2, R3, R4, R6, R7, R10 és az R11 található meg a fajta genetikai hátterében.
4.2. A P. infestans rezisztencia gének azonosítása A S. demissum vad fajból származó R gének közül napjainkig csak az R1, R2, R3a és R3b géneket klónozták (Ballvora et al., 2002; Huang et al., 2005; Lokossou et al.,
8
2009; Li et al., 2011). Míg vizsgálatainkban az R2, R3a és az R3b gének esetén a várt PCR terméket kaptuk, a már publikált gén specifikus primer párokkal, addig az R1 gént nem tudtuk amplifikálni. Az inokulációs vizsgálat azonban egyértelműen jelzi az R1 gén jelenlétét a White Lady fajtában.
4.2.1. Az R gén homológok transzkriptom analízise A White Lady biotikus stresszel szemben kifejeződött mRNS mintáin elvégzett új generációs szekvenálás számos rassz specifikus rezisztenciagén homológ és széles spektrumú P. infestans rezisztenciagén homológ jelenlétét tárta fel a fajtában. A 39,000 gén közül, amelyek a doubled haploid S. phureja burgonya DM-referencia genomhoz voltak annotálva a White Lady transzkriptom adatbázisában, 747 rezisztencia gént és analógot sikerült azonosítani, amelyek közül 385 gén tartalmazott NBS és/vagy LRR domént. Ezek közül 142 volt a burgonyavésszel szemben rezisztenciát biztosító gén vagy homológ, a maradék, különböző rezisztencia válaszért felelős gén és analóg volt. A White Lady fajtában azonosított 142 P. infestans rezisztenciagén homológból több mint 60 rassz-specifikus R gének közé tartozott, míg a többi a S. bulbocastanum és egyéb Solanum fajok széles spektrumú rezisztenciát biztosító génjeinek (Rpi gének) homológjai volt. Mindössze a S. demissum fajból származó R1, R2 és R3a géneket lehetett annotálás révén a TC adatbázisban azonosítani. Az R3b jelen lehet a White Lady fajtában, de az R3a génnel vagy más homológokkal mutatott szekvencia-hasonlósága miatt ez a gén vagy tévesen lett annotálva, vagy a leolvasásai a nem-térképezett leolvasások között találhatók.
4.2.2. Az Rpi homológok filogenetikai analízise és szelekciós tesztje A filogenetikai analízis nagy távolságokat mutatott az elemzett szekvenciák között. A fő kládokat ismert Rpi gének valamint szekvencia-azonos homológok alkották. Az R2 gén (beleértve az Rpi-abpt, Rpi-hjt, Rpi-snk és Rpi-blb3 géneket is) egy külön kládot reprezentál, és jól elkülönül az R1 és Rpi-blb2 szekvenciákból kialakult csoporttól. Az Rpi-blb1 (beleértve az Rpi-sto és Rpi-bt1 géneket) és az Rpi-vnt gének egy külön kládot képeztek, míg az R3a az R3b génnel együtt egy 12 homológot tartalmazó nagy klád része volt (2. táblázat). Amíg az R1 gén csoport tagjai a maximum likelihood analízis során egy csoportot képeztek, a parsimony analízis során mégis elkülönültek egymástól. Ennek kivételével, a két analízis eredményei majdnem azonosak voltak. A maximum likelihood analízisben 12 homológ nem képezett közös csoportot egyik Rpi génnel sem.
9
A rezisztencia gének aminosav sorrendje alapján végzett elkülönítés különböző típusú felosztottságot mutatott a Rpi gének homológjai között. Az R1 gén homológja 95%-os valószínűség mellett pozitívan diverzifikálódtak a szelekciós tesztben, míg az R2 és Rpi-blb2 génhomológok kevésbé különültek el a rezisztenciagénjeiktől és purifikációs szelekciót mutattak a szinonim szubsztitúciókkal. 2. táblázat: A rezisztencia gén homológok száma a legnagyobb valószínűség (maximum likelihood) fa kládjaiban.
R-gének
Homológok száma a kládokban
Csoportokon kívüli homológok száma
R1 R2, Rpi-abpt, Rpi-hjt, Rpiedn Rpi-snk és Rpi-blb3 R3a and R3b Rpi-blb1, Rpi-bt1, Rpi-sto és Rpi-pta Rpi-blb2 Rpi-vnt1 Összes
9
1
26
0
11
1
11
3
8 9 74
2 1 8
4. 3. Az R1 génre specifikus intron-targeting primerek fejlesztése Az R1 gén különböző, publikált homológjait, mint a R1A4, R1B23, R1C3, R1-B16 és R1-Tken (Kuang et al., 2005) azonosítottuk a TC adatbázisban. Kuang és munkatársai (2005) (Kuang et al., 2005) tanulmánya alapján megállapítottuk, hogy a R1 gén három haplotípusa, az A, B és a C közül több, például a R1A4, R1B23, R1C3 a R1 gén gyors evolúciójú régióját tartalmazzák és nagyfokú szekvenciahasonlóságot mutatnak. A különböző NGS alapú R1 specifikus primerek közül egy IT marker, a R1L333, egy 380 bp méretű szekvenciát adott a White Lady-ben. Ez a fragmentum polimorf volt a White Lady és a fogékony S440 nemesítési vonal keresztezéséből származó F1 populáció 24 genotípusában, és csak a rezisztens genotípusokban volt detektálható. E fragmentum nagyfokú hasonlóságot (98%) mutat a S. demissum eredetű R1 génnel. A NTI szoftverrel végzett szekvenciaelemzés alapján megállapítottuk, hogy ez szakasz a R1A4, R1C3, R1B23 homológok szensz szálának fő ORF-ének intron régiójában található.
10
4. 4. Biotikus stress indukált gének expressziójának vizsgálata P. infestans inokulált burgonyában qPCR-rel Biotikus stress-válaszban részt vevő géncsaládok 16 génjét választottuk ki a TC adatbázisból és vizsgáltuk qPCR-rel. Ezek közül 11, 8 nem-specifikus, 2 specifikus és 1 teljes védettséget adó rezisztenciagén homológ szignifikáns expressziónövekedést mutatott P. infestans fertőzés hatására. Az aktivált gének közül az aszparaginsav proteáz inhibítor (Aspi), a szerin proteáz inhibitor (Serpi), a reaktív oxigén fajták A, B, C homológjai, patogenitással összefüggő fehérjék, mint a PR1 és egy immun receptor gén, a PPR1 a fertőzés biotróf szakaszában aktiválódott. Különbségeket tapasztaltunk a fertőzés első 3 időpontjában a fehérje-mintázat vonatkozásában is a P. infestans fertőzött és a nem-fertőzött minták között. A fertőzés biotróf szakaszában a patogének élő gazdasejtekre van szüksége, ezért megpróbálják elnyomni a védekezési választ (Heath, 2000; Vleeshouwers et al., 2000). Ezért e gének, melyek expressziós aktiválódást mutattak a fertőzés e korai fázisában feltételezhetően jelentős szereppel bírnak a rezisztencia kialakulásában. A vizsgát időszakban csak a R1 és R2 homológok mutattak aktiválódást, de csak 65 órával a fertőzés után, míg az R3a gén egyáltalán nem mutatott aktiválódást. Érdekes módon a R2 homológ mutatta a legmagasabb expressziós szintet a vizsgált rezisztenciagén homológok közül. A R1 homológgal kapott eredményeink megegyeznek a Ross et al. (2004) eredményeivel, akik azt találták, hogy a R1 gén csak a fertőzés utáni harmadik napon aktiválódik. A R3a gén konstitutiv kifejeződésű, és ezért csak expressziós szintje alacsony marad a fertőzés után is (Huang et al., 2005). Ez megegyezik az általunk kapott eredményekkel, mivel az R3a gén nem mutatott expressziós változást a fertőzés hatására. A Rpi-bt1 gén homolog vizsgálata gyors expresszió növekedést mutatott a vizsgált időszak első felében. Ez a gén is konstitutív kifejeződésű a vad S. bulbocastum fajban, melyből származik, mindazonáltal más genetikai háttérben megváltozhat az alapműködése, illetve a transzkripciós aktivitása a burgonyavész kórokozójával való fertőzés után (Kramer et al., 2009).
5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1) A R1, R2, R3a and R3b rassz-specifikus P. infestans rezisztenciaglnek azonosítása a White Lady fajtában fertőzési tesztekkel és specifikus primerekkel. 2) A transzkriptom adatbázis elemzésével a patogén fertőzésre indukálódó teljes genomi expressziós változásokat azonosítottunk, melyek új lehetőségeket jelentenek a további genomi kutatásokhoz a burgonya biotikus stress-válasza terén. (e kutatások részben megvalósultak a jelen tanulmányban.)
11
3) A P. infestans rezistenciagén homológok filogenetikai vizsgálatával kimutattuk, hogy nemcsak S. demissum eredetű R gén homológok vannak jelen a White Lady fajtában, hanem teljes védettséget adó rezisztenciagének (Rpi) is olyan fajokból melyek nincsenek jelen e fajta genetikai hátterében. 4) A transzkriptom adatbázis elemzése alapján intron-targeting markert fejlesztettünk ki az R1 génre a White Lady fajtában. E marker hasznossága az R1 homológok elemzésében igazolásra került. Mivel az R1 gén szekvenciűja az NCBI-ban némileg eltérő a jelene tanulmányban kapott szekvenciától, ezért feltételezzük, hogy ez White Lady-ben vagy egy allélikus verziója vagy egy funkcionális homlógja a génnek. 5) Biotikus stress-válasz gének qPCR vizsgálatával 11 gént azonosítottunk, melyek P. infestans fertőzés hatására aktiválódtak. E gének expresszióját 7 különböző időpontban vizsgáltuk a fertőzés korai szakaszában a sikeres rezisztenciaválasz során.
6. REFERENCIÁK Ballvora A., Ercolano M.R., Weiß J., Meksem K., Bormann C.A., Oberhagemann P., Salamini F. and Gebhardt C. (2002). The R1 gene for potato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes. The Plant Journal 30, 361-71. Bookout A.L. and Mangelsdorf D.J. (2003). Quantitative real-time PCR protocol for analysis of nuclear receptor signaling pathways. Nuclear receptor signaling 1. Fao F. (2012). Agriculture Organization (2009). State of the worlds forests. Haverkort A., Boonekamp P., Hutten R., Jacobsen E., Lotz L., Kessel G., Visser R. and Van der Vossen E. (2008). Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification. Potato Research 51, 47-57. Haverkort A., Struik P., Visser R.G.F. and Jacobsen E. (2009). Applied biotechnology to combat late blight in potato caused by Phytophthora infestans. Potato Research 52, 249-64. Heath M.C. (2000). Hypersensitive response-related death. In: Programmed Cell Death in Higher Plants (pp. 77-90. Springer. Huang S., Van Der Vossen E.A.G., Kuang H., Vleeshouwers V.G.A.A., Zhang N., Borm T.J.A., Van Eck H.J., Baker B., Jacobsen E. and Visser R.G.F. (2005). Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. The Plant Journal 42, 251-61. Kamoun S. (2007). Groovy times: filamentous pathogen effectors revealed. Current opinion in plant biology 10, 358-65. Kramer L.C., Choudoir M.J., Wielgus S.M., Bhaskar P.B. and Jiang J. (2009). Correlation between transcript abundance of the RB gene and the level of
12
the RB-mediated late blight resistance in potato. Molecular Plant-Microbe Interactions 22, 447-55. Kuang H., Wei F., Marano M.R., Wirtz U., Wang X., Liu J., Shum W.P., Zaborsky J., Tallon L.J. and Rensink W. (2005). The R1 resistance gene cluster contains three groups of independently evolving, type I R1 homologues and shows substantial structural variation among haplotypes of Solanum demissum. The Plant Journal 44, 37-51. Leipe D.D., Koonin E.V. and Aravind L. (2004). STAND, a class of P-loop NTPases including animal and plant regulators of programmed cell death: multiple, complex domain architectures, unusual phyletic patterns, and evolution by horizontal gene transfer. Journal of molecular biology 343, 1-28. Li G., Huang S., Guo X., Li Y., Yang Y., Guo Z., Kuang H., Rietman H., Bergervoet M. and Vleeshouwers V. (2011). Cloning and characterization of R3b; members of the R3 superfamily of late blight resistance genes show sequence and functional divergence. Molecular Plant-Microbe Interactions. Lokossou A.A., Park T., van Arkel G., Arens M., Ruyter-Spira C., Morales J., Whisson S.C., Birch P.R.J., Visser R.G.F. and Jacobsen E. (2009). Exploiting knowledge of R/Avr genes to rapidly clone a new LZ-NBS-LRR family of late blight resistance genes from potato linkage group IV. Molecular Plant-Microbe Interactions 22, 630-41. Mortazavi A., Williams B.A., McCue K., Schaeffer L. and Wold B. (2008). Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature methods 5, 621-8. Ros B., Thümmler F. and Wenzel G. (2004). Analysis of differentially expressed genes in a susceptible and moderately resistant potato cultivar upon Phytophthora infestans infection. Molecular plant pathology 5, 191-201. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. and Kumar S. (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular biology and evolution 28, 2731-9. Vleeshouwers V.G.A.A., van Dooijeweert W., Govers F., Kamoun S. and Colon L.T. (2000). The hypersensitive response is associated with host and nonhost resistance to Phytophthora infestans. Planta 210, 853-64. Walbot V. and Warren C. (1988). Regulation of Mu element copy number in maize lines with an active or inactive Mutator transposable element system. Molecular and General Genetics MGG 211, 27-34. Wang Y., Zeng X., Iyer N.J., Bryant D.W., Mockler T.C. and Mahalingam R. (2012). Exploring the Switchgrass Transcriptome Using Second-Generation Sequencing Technology. PloS one 7, e34225. Willenbrock H., Salomon J., Søkilde R., Barken K.B., Hansen T.N., Nielsen F.C., Møller S. and Litman T. (2009). Quantitative miRNA expression analysis: comparing microarrays with next-generation sequencing. Rna 15, 2028-34.
13
7. PUBLIKÁCIÓS LISTA Referált folyóiratokban megjelent publikációk: 1. Hajianfar, R., Polgár, Z, Wolf, I., Takács, A., Cernák, I, and Taller, J.Complexity of late blight resistance in potato and its potential in cultivar improvement. Accepted for publication in Acta Phytopathologica Vol. 49 No. 2, 2014. 2. Ahmadvand R., Poczai, P., Hajianfar, R., Kolics B., Gorji A.M., Polgár Z. and Taller J. (2014). Next generation sequencing based development of intron-targeting markers in tetraploid potato and their transferability to other Solanum species. Gene 540, 117-21 3. Taller, J., Ahmadvand, R., Hajianfar, R., Gorji A.M., Wolf, I., Decsi,K., Kolics,B., Cernák, I., Polgár, Z., Poczai, P. Genome-wide analysis of bulked transcriptomes captured in multiple time points for revealing PVX, PVY and Phytophthora infestans induced expressional changes in a resistant potato cultivar. Submitted to PLoS ONE – in-house acception.
Konferencia összefoglalók: 1. Hajianfar,R ., Taller, J., Polgar, Z., Wolf,I., Cernak,I.,Ahmadvand,R., Mousapour Gorji,A. (2014). Expressional analysis of Phytophthora infestans induced resistance response genes in potato. 19th Triennial Conference of the European Association for Potato Research (EAPR). Brussels, Belgium 6-11 July. Abstract book.pp.77. 2. Hajianfar, R, Ahmadvand, R., Polgár,Z., Wolf, I, and Taller,j. (2013). R1 late blight (Phytophthora infestans) resistance gene homolog in the cultivar White Lady. A Pannon Növény-Biotechnológiai Egyesület konferenciája PhD hallgatók számára, 2013. Május 15 3. Hajianfar, R, Ahmadvand, R., Mousapour Gorji, A, Wolf, I., Cernák, I., Taller,J, and Polgár,Z. (2013). Next generation sequencing based analysis of genes for resistance to Phytophthora infestans in cultivar White Lady. Abstract book of the EAPR-EUCARPIA Congress "The challanges of improving both quality and resistance to biotic and abiotic stresses in potato", June 30 - July 04. Hévíz, Hungary pp:26 4. Hajianfar, R ., Taller, J. and Polgár, Z. 2013.Next generation sequencing based identification of late blight resistance genes in potato. Georgikon for Agriculture,vol 16 No.1
5. Hajianfar, R., Decsi, K., Kolics, B., Taller, J., Polgár Z and Wolf I. (2012). Study on resistance genes to potato late blight in the White Lady variety 54th Georgikon scientific conference .Kesztheky, Hungary.
14
6. Ahmadvand, R., Hajianfar, R., Mousapour Gorji, A., Wolf, I., Cernák, I., Polgár, Z, and Taller, J. (2013). Transcriptome analysis of White Lady in response to PVX, PVY and Phytophthora infestans using next generation sequencing. Abstract book of the EAPR-EUCARPIA Congress "The challanges of improving both quality and resistance to biotic and abiotic stresses in potato", June 30 - July 04. Hévíz, Hungary pp: 26 7. Ahmadvand, R., Hajianfar, R., Polgár, Z, and Taller, J. (2013). Transcriptome and functional marker study in potato. A Pannon Növény-Biotechnológiai Egyesület konferenciája PhD hallgatók számára, 2013. Május 15 8. Ahmadvand, R., Hajianfar, R., Mousapour Gorji, A., El-Banna, A., Polgár, Z, and Taller, J. (2013). Development of intron-targeting markers as a tool for molecular breeding in response to pathogens. Proceeding of 8th plant breeding international conference, 6-7 May, Egypt. 9. Taller, J., Ahmadvand, R., Hajianfar, R., El-Banna, A., Cernák,I., Wolf, I and Polgár, Z. (2013). Gene expression studies for the resistance breeding of potato. Plant Breeding Scientific Day conference 10. El-Banna,A., Ahmadvand, R., Mousapour Gorji, A., Hajianfar, R., Cernák, I., Wolf, I., Polgár, Z, and Taller, J. (2013). Isolation and functional analysis of resistance response genes in potato and the development of molecular markers. Abstract book of the EAPR- EUCARPIA Congress "The challanges of improving both quality and resistance to biotic and abiotic stresses in potato", June 30 - July 04. Hévíz, Hungary. pp: 27.
15
