Nyugat-magyarországi Egyetem Savaria Egyetemi Központ Természettudományi és Műszaki Kar Biológia Intézet
Oxidatív stressz hatása vázizom sejtekre
Konzulens:
Készítette:
Dr. Molnár Péter
Hajtó Dorottya
PhD., egyetemi docens
Biológia szak
Szombathely 2015
1
“A legnagyobb dicsőség nem az, hogy soha nem vallunk kudarcot, hanem, hogy minden bukás után képesek vagyunk felemelkedni.” (Nelson Mandela)
2
Tartalom 1
Bevezetés ...................................................................................................................... 5
2
Célkitűzés ...................................................................................................................... 6
3
Irodalmi áttekintés ........................................................................................................ 7 3.1
Vázizomzat ............................................................................................................ 7
3.1.1 A vázizom felépítése és élettani sajátosságai .................................................. 7 3.1.2 Vázizom evolúciója ....................................................................................... 12 3.2
Vázizomzat betegségei ........................................................................................ 13
3.2.1 Izomatrophia .................................................................................................. 13 3.2.2 Izomdistrophia ............................................................................................... 13 3.2.3 A neuromuscularis junctio betegségei ........................................................... 16 3.2.4 Lambert-Eaton-féle myasthenias szindróma ................................................. 16 3.3
Izomdistrophia és oxidatív stressz lehetséges kapcsolata.................................... 16
3.4
Oxidatív stressz.................................................................................................... 17
3.4.1 Az oxidatív stressz evolúciója ....................................................................... 19 3.4.2 Oxidatív stressz mérésének, kiváltásának lehetőségei ................................... 22 3.4.3 Külső, kiváltó tényezők: ................................................................................ 23
4
3.5
In vitro modellek ................................................................................................. 24
3.6
Környezetszennyező anyagok feltételezhető hatásai vázizmokra ....................... 24
3.7
Pesticidek és oxidatív stressz ............................................................................... 25
3.8
Adenosine és oxidative stressz ............................................................................ 25
Módszerek ................................................................................................................... 26 4.1.1 C2C12 tenyésztés ........................................................................................... 26 4.1.2 Kezelés ........................................................................................................... 26 4.1.3 Kiértékelés ..................................................................................................... 26
5
Eredmények ................................................................................................................ 28
3
6
Megvitatás ................................................................................................................... 32
7
Köszönetnyilvánítás .................................................................................................... 33
8
Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 34
4
1
Bevezetés Vázizombetegség valamilyen típusában a felnőtt lakosság 40-44%-a szenved. Az izom-
sorvadás egyes típusainál felmerült a lehetőség, hogy oxidatív stressz szerepet játszhat az izom leépülésének folyamatában. Az izomsorvadás pontos mechanizmusa még nem ismert, ezért fontos lenne az oxidatív stressz hipotézist is tesztelni. Az oxidatív stressz élettani hatásait már évtizedek óta tanulmányozzák, számos in vivo és in vitro modellt is kidolgoztak. Az izomsorvadás elleni gyógyszerek kifejlesztése szempontjából az in vitro modelleknek talán nagyobb a jelentősége, hiszen nagyszámú vegyület gyors tesztelését teszik lehetővé. Az izomsorvadásnak nem csak a mechanizmusa, de a kifejlődésének az oka sem ismert teljesen. Elképzelhető, hogy a mozgásszegény életmódon kívül környezeti faktorok is szerepet játszanak a kialakulásában. A környezetszennyezés korunk problémája, a szervezetünkbe kerülő vegyi anyagok közül csak kevésnek a részletes toxikológiai jellemzését végezték el.
5
2
Célkitűzés
Vázizom betegségeinek, különösen az oxidatív stresszel kapcsolatba hozható betegségeinek áttekintése az irodalom alapján
Oxidatív stressz hatásának vizsgálata differenciált vázizomsejtekre egy in vitro oxidatív stressz modellben
Adenosine hatásának jellemzése ebben a modellben
Cyfluthrin növényvédőszer hatásának vizsgálata a vázizomsejtek differenciálódására
6
3 3.1
Irodalmi áttekintés Vázizomzat
3.1.1 A vázizom felépítése és élettani sajátosságai A vázizomzat a mozgás aktív szerve, legfontosabb feladata a test vázát alkotó elemek elmozdítása egymáshoz képest, ezáltal a test helyének illetve helyzetének a módosítása (Donáth, 1979). A vázizomzat elemi egységei a vázizomrostok, amelyeknek alapvető működési formája az idegi utasításra bekövetkező összehúzódás (kontrakció) (Sztretye, 2010). Izomrostok összessége alkotja a szövetet, melyek módosult sejtek és közöttük sem szerkezeti sem működésbeli kapcsolat sincs. A mozgató neuron és az általa beidegzett izomrostok összessége a motoros egység. Az egyedfejlődés során a vázizmot alkotó sejtek kezdetben különállóak, majd fúziójuk következtében hosszú, többmagvú egységek jönnek létre, amelyeket izomrostoknak nevezünk. A vázizomzat rostjainak mérete fajonként és izmonként is változó. Az emberi vázizomrostok átmérője 10-100 mikrométer közötti, hosszuk akár a 30- 40 cm-t is elérheti. Az izomrostokat kötőszövetes állomány borítja, különböző nagyságú rostkötegeket és végsősoron magukat az izmokat létrehozva. Az egyes izomrostokat sejtmembrán veszi körül, melynek speciális neve a sarcolemma. A harántcsíkolt izmokat sokféle rost építi fel. Az I. típusú rost lassú működésű, ezek a rostok tartós, lassú összehúzódást végeznek és a testtartásért felelős mozgásokban vesznek részt. Abban az esetben, ha sok ilyen rost van jelen az izomban, akkor az izom sötétebb színű less, így innen adódva vörös izomnak hívjuk. IIA típusú rost gyorsabb működésű, alig jelenik meg az emberben. A gyors izomműködésért felelős fehér izmokban legnagyobbrészt IIB típusú rostok vannak, melyek a gyorsaság mellett a precíz, finom mozgásokért felelősek (FazekasSzerényi, 2002). A bennük található fehérjék eltéréseiből adódik az izmot felépítő rostok közötti különbségek. Az emberi izomzat között vegyesen található vörös és fehér izomrész egyaránt. Arányuk izomcsoportonként más és más. Az öröklődés befolyásolhatja az izmok összetételét, de ez az arány testmozgással befolyásolható. A sarcolemma felépítése azonos más ingerelhető membránokéval: lipid kettősréteg, benne integráns fehérjemolekulákkal. Az izomrost működése szempontjából döntő a feszültségfüggő gyors Na+ - és a késői típusú K+ - csatornák jelenléte, ezek teszik lehetővé az akciós potenciál terjedését. A sarcolemmában Cl- és Ca2+ - csatornák, valamint különféle receptormolekulák is találhatók. A vázizomrost intracelluláris terében helyezkednek el a myofilamentumok, amelyek döntően a kontraktilis fehérjéket tartalmazzák. A vastag filamentumok vázát a miozin-, a vékony filamentumokét az aktinmolekulák alkotják. Megtalálhatók a rostokban a kontrakció szabályozá-
7
sához szükséges fehérjék (tropomiozin, troponin), valamint olyan elemek, amelyeknek valószínűleg a szerkezet fenntartásában, valamint az izomszövet mechanikai jellegzetességeinek meghatározásában van szerepük (connectin, α -aktinin) (Web referencia 8; 1. ábra és 2. ábra).
1. ábra. Harántcsíkolt vázizom szerkezete (Web referencia 7).
8
2. ábra. Vázizomsejt metszeti képe (Web referencia 1, 2, 3)
Vázizomzatnak 2 része van. Az egyik az eredés melyet origónak a másik a tapadás, melyet insertionak nevezünk. Az origó rész a nyugvó csontokon, az insertio a mozgó csontokon található minden esetben. A végtagokon az eredés mindig proximálisan, a tapadás pedig distalisan helyezkedik el. „Eredésnél fej található, amely az izomhasba, venter folytatódik és végül ínban, tendo végződik. Ez az izom minden rostja keresztmetszetének összege.” Így kiszámolható az izomerő (3. ábra).
9
3. ábra. Ember vázizomzat (Platzer, 1996).
Az akaratlagos irányítás alatt álló vázizomzat rendelkezik a leghosszabb izomrostokkal, melyeken belül a fehérje szálacskák (filamentumok) sajátságos elrendeződése harántcsíkolt rajzolatot mutat, innen kapta a harántcsíkolt izom nevet. A vázizomzat rostjai gyors és erőteljes összehúzódásra képesek, de gyorsan fáradnak. Az izomrostokat kötőszövet (perimysium) fogja össze kötegekké, a kötegeket (fasciculusok) védelmet nyújtó kötőszövetes burok (epymisium) veszi körül, így együttesen alkotják a teljes izmot (4- és 5-ös ábra hivatkozás McCracken, 2000).
10
4. ábra. Emberi test és vázizomzat (Web referencia 8.)
5. ábra. A vázizom rendszer szöveti felépítése (Web referencia 6).
11
3.1.2 Vázizom evolúciója A harántcsíkolt izomzat megtalálható mind a kétoldali szimmetriájú állatoknál (mint például a gerincesek, rovarok és gyűrűsférgek) (4. ábra) mind néhány primitívebb, nem- kétoldali szimmetriájú állatnál. Mivel a harántcsíkolt vázizom nagyon jelentős ultrastruktúrális hasonlóságot mutat mindezen állattörzseknél, logikus volt a feltételezés, hogy a vázizom egy közös őstől származik (Steinmetz, 2012). Ez azt is jelentené, hogy a vázizom szerkezete (5. ábra) és az ezt meghatározó gének rendkívül konzervatívok. Újabb eredmények egy más evolúciós fejlődési utat támasztanak alá.
Steinmetz és munkatársai (2012) kétoldali szimmetriájú állatfajok
vázizomjának 47 fehérje komponensét hasonlították össze 22 olyan eukarióta faj esetében, melynek a teljes genomja már ismert volt. Ezek a fajok az evolúciós fejlődés nagyon különböző állomásait reprezentálták, mint például a valódi szövetes állatokat, protisztákat, gombákat és más eukariótákat. Az analízis lehetőséget adott a vázizom evolúciós fejlődésének a rekonstrukciójára. Az eredmények azt mutatták, hogy a vázizom egyes komponensei, amelyek esszenciálisak az izom működéséhez (pld. ST myhc) előbb alakultak ki, mint maguk az izomsejtek, míg más komponensek (mint például a troponin komplex, a paramyosin vagy a titin) párhuzamosan fokozatosan alakultak ki a különböző állatfajokban (6. ábra). Ezt a jelenséget konvergens evolúciónak nevezzük, amely során hasonló biológiai jellegzetességek egymástól függetlenül alakulnak ki különböző egymástól távoli fajokban. Ezek az eredmények arra is rávilágítanak, hogy a szerkezeti hasonlóság önmagában nem bizonyítéka a közös evolúciós eredetnek, mivel ugyanolyan struktúrák egymástól függetlenül is kialakulhatnak különböző fehérjékből. A vázizom esetében elektronmikroszkópos vizsgálatok nem elegendőek az evolúciós eredet- fa feltárásához, hanem molekuláris biológiai módszerek is szükségesek. Az izomsejtek kialakulása szerves része szervezetünk működésének. Különböző állatcsoportokban is kialakultak izomsejtek majd később szakirányú progresszív izmok. Hasonló kialakulási mód előfordulhatott más összetettebb sejtalkotók esetén is.
12
6. ábra A) A vázizom ultrastruktúrális felépítése nagyon hasonló egymástól távol eső fajoknál. B) Genetikai rokonsági fa mutatja, hogy a vázizom fő komponensei egymástól függetlenül alakultak ki, egymástól távol eső fajoknál. Más törzseknél a vázizom nem alakult ki (Hejnol, 2012). 3.2
Vázizomzat betegségei
3.2.1 Izomatrophia Az izom aspecifikus válaszreakciója, amely számos betegség talaján kialakulhat. A klinikai képre jellemző a kórosan kisméretű izomrostok jelenléte. Okai lehetnek: neurogen okok, denervatio, immobilitás, glukokortikoid kezelés, hypercortisolismus. A spinális izomatrophia egy olyan öröklött betegség, amely a gerincvelőben elhelyezkedő, az izmok beidegzését végző, az azokat mozgató idegsejtek pusztulását jelenti. Emiatt azok a beidegzett izmok, amelyeket ezek a sejtek működtetnének, nem tudnak dolgozni, elsorvadnak. Egy gerinc eredetű izomsorvadásról van tehát szó (Web referencia 5). Izomatrophia során leírták a szabadgyökök koncentrációjának növekedését (oxidatív stressz), melyek aktiválják azokat a proteázokat, amelyek szerepet játszanak az izomfehérjék lebontásában. 3.2.2 Izomdistrophia Olyan örökletes progresszív izomrost degeneráció, amely gyakorta gyermekkorban jelentkezik, és izomgyengeséghez, valamint testi sorvadáshoz vezet (7. ábra).
13
7. ábra. Izomdistrophia (Web referencia 1, 2, 3, 4)
3.2.2.1 X-kromoszómához kötött izomdistrophiák Két típusát különböztetjük meg: Duchenne-féle izomdistrophia (DMD), és a Becker-féle izomdistrophia (BMD) (Robbins 2009) 3500 élve született fiúra jut egy DMD-s beteg, amely az izomdistrophia legsúlyosabb és leggyakoribb formája. Morfológiailag az érintett izmokat hypertrophias és atrophias rostok jellemzik, valamint distrophiára utaló jelek még a sarcoplasma basophiliája, a sejtmagok megnagyobbodása, a feltűnő nucleolusok jelenléte, és a rostok közötti kötőszövet megnövekedett mennyisége. Előrehaladott stádiumban valamennyi izomcsoportban rostpusztulás és zsírszövet felszaporodás mutatkozik. A disztróphia mindkét formájában az Xkromoszóma rövid karján, a p21-es régióba lokalizálódó dystrophin gén eltérései okozzák a tüneteket. A dystrophin fehérje funkciója a sarcomerek sarcoplasmához való rögzítése, ezáltal a kontrakciós erő kötőszövetre, és vázelemekre történő átvitele. DMD- s betegek izmaiból nem izolálható dystrophin fehérje, míg BMD- s betegek esetében a mutáció következtében csökkent menynyiségű, vagy kóros dystrophin termelődik, amely magyarázatul szolgál a BMD- s forma kevésbé súlyos klinikai lefolyására. A betegség kétharmad részben familiáris, egyharmad részben pedig új mutációval állunk szemben. A nők klinikailag tünetmentes hordozók, de fokozott körükben a dilatativ cardiomyopathia előfordulásának kockázata. Az érintett gyermekek később sajátítják el a járást. A betegségre elsőként az izomgyengeségből eredő ügyetlenség, és az mozgáskészség elmaradó fejlődése hívja fel a figyelmet. Elsőként a medenceöv, majd később a vállöv izmai
válnak
érintetté.
izomrostnövekedés,
később
Jellemző pedig
a
lábikra
zsír-
és
pszeudohipertróphiája,
kötőszövetszaporulat
amely
eleinte
következménye.
A
myocardiumban is mutatkoznak kóros eltérések, amelyek szívelégtelenséget okoznak, és ritmuszavarokat generálnak. DMD esetében a kognitív funkciókban is zavar detektálható, amely akár
14
mentális retardációba is torkollhat. A halál leggyakoribb okai: légzési elégtelenség a légzőizmok érintettsége miatt, tüdőfertőzés, pangásos szívelégtelenség. 3.2.2.2 Autoszomálisan öröklődő izomdistrophiák Nagyfokú hasonlóság mutatkozik a DMD- s, és a BMD- s esetekkel, ugyanakkor az egyes formák specifikus izomcsoport érintettséggel járnak. Általánosságban jellemző az axialis, és a végtagok proximalis izmainak érintettsége. A betegségcsoportnak jelenleg 6 autoszomális domináns, és 10 autoszomális recesszív altípusa ismeretes. Kóroki szerepe van a szarkoglikán fehérjekomplex alkotórészeinek, egyes citoszkeleton fehérjéknek, és a kaveolinnak. 3.2.2.3 Miotoniás distrophia Egy izomcsoport akarattól független tartós kontrakciója. Az öröklődése autoszomális domináns. A betegséget a CTG trinukleotid ismétlődő szekvencia meghosszabbodása (trinukleotid repeat), és a következményes intracellularis proteinkináz szintézis zavara okozza, amely a mRNS viselkedését kóros irányban modulálja. A CTG ismétlődések száma generációról generációra emelkedik, továbbá a kórkép súlyosbodása is megfigyelhető. Általában késő gyermekkorban jelentkezik testtartásbeli problémák képében, amelynek oka a láb dorsalis hajlítóizmainak gyengesége. A későbbiekben arcizomzat sorvadás, és ptosis is kialakul. 3.2.2.4 Miopathia Veleszületett, és toxicus formákra osztható. Az első csoportba tatoznak az ioncsatorna fehérjék örökletes defektusai, és a kongenitalis anyagcsere betegségek (pl. lipidtárolási betegségek, glikogéntárolási betegségek, mitokondriális betegségek). Ide tartozik pl. a malignus hiperthermia, amelynek patogenetikai háttere a Ca csatornákat kódoló gén mutációja. A toxikus miopathiakon belül megkülönböztetünk extrinzik és intrinzik toxinokat. Előbbire példa az alkohol, utóbbira pedig a tiroxin.
15
3.2.3 A neuromuscularis junctio betegségei
8. ábra. Ideg-izom szinapszis (Web referencia 1) A miasthenia gravis egy olyan autoimmun betegség, amelyben acetil-kolin ellenes antitestek jelenléte jellemző. Az antitestek a neuromuscularis junctioban (8. ábra) a működőképes acetilkolin receptorok számát csökkentik, ezáltal pedig izomgyengeséghez vezetnek. A működőképes receptorszám csökkenés lehetséges módozatai: fokozódó receptor internalizáció, fokozódó receptor degradáció, valamit az acetil- kolin kompetitív antagonizmusa. Kezdeti tünetei a ptosis (szemhéjcsüngés), és a diplopia (kettős látás) a külső szemmozgató izmok érintettsége miatt. A panaszok jelentős csökkenése észlelhető acetil-kolin észteráz hatású szerek terápiás alkalmazása mellett. Mortalitása: 95 %-ban 5 éves túlélés jellemző. 3.2.4 Lambert-Eaton-féle myasthenias szindróma Ez a betegség malignus tumorokhoz társulva alakul ki. Általában kissejtes tüdőkarcinóma kísérője, de daganatos betegség nélkül is manifesztálódhat. Jellemzője az izomgyengeség, amelynek kiváltója a praesynapticus akciós potenciálok hatására a normálisnál kevesebb szinaptikus vezikulum felszabadulása. Utóbbi oka pedig a praesynapticus Ca csatorna ellenes antitestek megjelenése.
3.3
Izomdistrophia és oxidatív stressz lehetséges kapcsolata Az izomdistrophia különböző formái a felnőtt emberek 40-44%-át érinti. Kialakulásának
lehet genetikai oka, káros szenvedély következtében vagy pedig valamilyen betegség visszamaradt komplokációja miatt is bekövetkezhet (Bonaldo, 2013; Davies, 2006; Emery, 2002). Az izomdistrofiának több típusa van. Leggyakrabban gyermekkorban kezdődik, és főként fiúgyermekeket érinti. A progresszív izomdistrofia következtében fokozatosan csökken a működőképes izomtömeg. Az izom leépülésének oka valamennyi ilyen betegségnél egy izomfehérje károsodá-
16
sa vagy hiánya, ami idővel a teljes izomzat pusztulását is magával hozhatja, és sajnos egyelőre nincs elfogadott terápiája (Flanigan, 2012). Az izomsorvadás (izomatrophia) (Neuzil, 2005) leggyakrabban az izom használatának hiánya miatt következik be, de okozhatja az öregedés, metabolikus zavar, éhezés valamint számos betegség is (Bonaldo, 2013; Jackman, 2004). Az izomsorvadás patomechanizmusa még nem teljesen ismert, számos trigger molekulát és jelátviteli kaszkádot azonosítottak melyek szerepet játszhatnak a betegség kialakulásában (Jackman, 2004; Zhang, 2007). Felmerült az a lehetőség, hogy az oxidatív stressz központi szerepet játszhat az izomsorvadás folyamatában (Powers, 2007; Pellegrino, 2011).
Az oxidatív károsodás önálló
patobiokémiai folyamatként, és az egyes kórképeket kísérő súlyosbító tényezőként egyaránt figyelemre méltó jelenség. A sejtkárosodás többféle mechanizmus által valósulhat meg, amely mechanizmusok a következő csoportokba sorolhatók (Klaunig, 2010):
3.4
ATP hiány mitokondrium károsodás kalciumbeáramlás oxigén tartalmú szabadgyökök felhalmozódása (oxidatív stressz) membránpermeábilitás zavarai DNS- és fehérjekárosodás
Oxidatív stressz
A szabad gyökök olyan kémiai termékek, amelyek egyik külső elektronpályáján egyetlen, párosítatlan elektron helyezkedik el. Az ilyen kémiai állapot rendkívül instabil, így a szabad gyök kész reakcióba lépni szervetlen és szerves vegyületekkel egyaránt. Ha a sejten belül keletkezik, megtámadja a nukleinsavakat, a különféle sejtfehérjéket és lipideket is. A szabad gyökök ezen kívül autokatalitikus folyamatokat is beindítanak; azok a molekulák, amik reakcióba lépnek a szabad gyökökkel, maguk is egymás után szabad gyökökké alakulnak, így a károsodások láncreakciója indul el. A reaktív oxigénszármazékok (ROS) oxigéntartalmú szabad gyökök, amelyek sejtkárosodásban betöltött szerepe jól meghatározott. Fiziológiásan a mitochondriális légzés és energiaképződés során keletkeznek, de a sejt védekező rendszerei lebontják, és eltávolítják őket. Amikor a ROS képződése fokozott, vagy a scavenger rendszerek hatékonysága csökkent, a szabad gyökök felszaporodnak, és létrehozzák az úgynevezett oxidatív stressz állapotát.
17
Oxidatív stressz bekövetkezhet túltermelődés által, vagy az őket elimináló rendszerek funkciócsökkenése következtében. A szabadgyökök általi sejtkárosodás számos folyamatban bekövetkezhet, mint például: ischaemia-reperfusio kémiai ingerek besugárzás oxigén toxicitás egyéb gázok toxicus hatása sejtöregedés mikrobák phagocytosisa gyulladásos sejtek okozta szövetkárosodás Az endoplazmatikus retikulumban, a sejtmembránban, a citoszolban, a peroxiszómákban, és a mitokondriumokban szuperoxidanion, hidrogén-peroxid, és hidoxilgyökök keletkezhetnek. A mitokondriumokban az oxigén részleges redukciója következtében képződnek az említett termékek. A réz és a vas is részt vesznek olyan intracellularis redox folyamatokban, amelyek szabadgyök képződéssel járnak. Amennyiben ionizáló sugárzás - pl. ultraibolya, vagy röntgensugárzás - hidrolizálja a vizet, úgy hidroxil-, és hidrogén szabadgyökök képződnek. Különböző anyagok metabolizmusa során is keletkeznek szabadgyökök. Ilyen például a szén-tetraklorid. A gyulladásban szereplő leukocyták is termelnek szabadgyököket, melyek funkciója az egyes mikrobák eliminálása az immunválasz során. A nitrogén-monoxid fontos mediátora az érfal-simaizmok relaxációjának, de szabadgyökként is szerepelhet, illetve reaktív nitrittermékké alakulhat. A szabadgyökök instabilitásukból adódóan spontán elbomlanak, de egyéb enzimatikus, és nem enzimatikus utakon is inaktiválódnak. Pl. szuperoxid- dizmutáz a szuperoxid aniont inaktiválja, glutation a hidroxil gyököt, peroxidáz pedig a hidrogén-peroxidot bontja a peroxiszómákban. Az endogén és exogén antioxidánsok - mint pl. A-, C-, E vitamin, béta-karotin - szabadgyökök ellen ható faktorok, amelyek vagy a képződést gátolják, vagy a meglévő szabadgyököket neutralizálják. A fémionokat szállító, és tároló fehérjék - pl. transzferrin, ferritin - a reaktív fémek koncentrációját csökkentve fékezi a reaktív oxigénszármazékok keletkezését. A szabadgyökök sejtkárosító mechanizmusai közül mindenképpen említést érdemel a membránlipidek peroxidációja, a fehérjék keresztkötése, és a magi, valamint a mitokondriális DNS fragmentációja a timinspeifikus szabadgyökkötődés következtében. A lipidperoxidáció
18
során autokatalitikus láncreakció veszi kezdetét. A fehérjék keresztkötése az enzimaktivitás csökkenését, vagy a fehérjék katabolizmusát eredményezi. A DNS lánc szabadgyökök által okozott törésével megegyező laesio tapasztalható még malignus sejttranszformációk során. Ezek a hatások valamennyi sejt- illetve szövettípusban manifesztálódnak, többek között az izomszövetben is, ahol szerepe lehet az egyik genetikailag determinált izombetegség, az izomdistrophia kialakulásában.
3.4.1 Az oxidatív stressz evolúciója Az élet először egy redukáló atmoszférában alakult ki a földön. Csak a fotoszintetizáló algák megjelenésével került egyre fokozódó mennyiségű oxigén az atmoszférába. Az átmenet a redukálódó környezetből az oxidáló környezetbe komoly evolúciós nyomást eredményezett. Meglepő, hogy a metabolikus útvonal fontossága ellenére 98%-t a felhasznált oxigénnek egyetlen enzim, a cytochrome-oxidase használja fel (McCord, 2000). A cytochrome oxidase rendkívüli dominanciájának egy lehetséges magyarázata, hogy ezt a bonyolult kémiai folyamatot csak ez az enzim képes ellátni megfelelően kontrollált módon a megfelelő biztonsággal. Az evolúciós fejlődés során, miközben a primitív metabolikus rendszerek próbáltak megbirkózni az energiagazdag oxidatív pályákra történő átállással biztosan kialakultak más, alternatív metabolikus útvonalak is, de ezek nem maradtak fenn, mivel túl sok szabad gyököt hoztak létre. A cytochromeoxidase evolúciójának néhány lépését a 9. ábra mutatja.
19
9. ábra: A cytochrome-oxidase evolúciója (Goldberg, 2003). A véletlen szabadgyök képződés rendkívül káros következményekkel jár, az élő szervezet szinte minden alapvető kémiai folyamatát károsítja (10. ábra).
20
10. ábra: Oxigén szabad gyökök molekuláris célpontjai oxidatív stressz esetén (Cannio, 2000).
Legalább két olyan helyet azonosítottak az elektronszállítási láncban, ahol az elektronok kiszivároghatnak és az oxigén molekulákkal szabadgyököket (szuperoxid) képezhetnek (Chen, 2000). Az evolúció egyrészt optimalizálta az elektron transzport lánc enzimjeit, hogy minimalizálja a szabadgyökök képződését, másrészt olyan molekulákat (antioxidánsokat) hozott létre, amelyek reakcióba lépve a szabadgyökökkel semlegesítik azokat. Ennek eredményeként több száz antioxidáns molekula jött létre, különösen növényekben. A legsikeresebb ezek közül a vízoldékony aszkorbinsav és a zsíroldékony E- vitamin. Emberben a szabadgyökök semlegesítését elsősorban a szuperoxid dizmutáz (SOD) végzi, melyet három gén kódol. SOD megtalálható a mitokondriumban, a cytosolban és az extracelluláris térben is. Ez a három gén két ősi génből származik, az egyik a rézt és cinket, míg a másik a mangánt és vasat tartalmazó enzimek őse. Ezek a gének visszavezethetők a legprimitívebb organizmusokig, és rendkívül konzervatív a szekvenciájuk. Ezek az enzimek akkor alakultak ki, amikor a korai életformák alkalmazkodtak az oxigén jelenlétéhez (11. ábra).
21
11. ábra: A vas és mangán tartalmú SOD enzimek filogenetikai fája. Fe- SOD (vörös), cambialistic (Fe vagy Mn) SOD (narancs), és Mn-SOD (fekete). A fának az a része, amely öregebb, mint a Paleoproterozoic hógolyó-föld a pontozott oválison belül található (Kirschvink, 2000).
3.4.2 Oxidatív stressz mérésének, kiváltásának lehetőségei Oxidatív stressznek nevezzük az olyan állapotot, amikor a prooxidánsok és az antioxidánsok egyensúlya eltolódik az előzőek javára. Az antioxidáns - prooxidáns egyensúly fenntartása az egészség megőrzésének fontos eszköze. Az oxidatív stressz a reaktív oxigén vagy nitrogén eredetű szabadgyökök keletkezése és az antioxidáns védő rendszerek közötti egyensúly megbomlása, a sejtek oxido- redukciós állapotának megváltozása során lép fel. A ROS kontrollálatlan keletkezése vagy az antioxidáns rendszer működésének csökkenése vezet az oxidatív stressz kialakulásához (Finkel- Holbrook, 2000).
22
Oxidatív stressz akkor fordul elő, ha a homeosztázis az oxidánsok és az antioxidáns rendszerek között felbomlik, és a redox állapot az oxidáció irányába eltolódik (Halliwell, 2006). Ha az oxidánsok kapacitás meghaladja az antioxidánsok kapacitást, az ROS egy része kiszabadul az antioxidáns rendszer hatása alól. Oxidatív stressz során az egyes szövetek és szervek biomolekulái sérülnek. Valójában minden sejtben jelen van bizonyos mennyiségű oxidált nukleinsav, fehérje vagy lipid. Mindez azt jelenti, hogy nemcsak a biomolekulák oxidálódnak in vivo, de oxidált termékeik helyreállítása sem teljes. Az oxidált termékek mennyisége jelzi az oxidációs és javító rendszerek között fennálló kapcsolatot. Szinte nincs olyan betegség, ahol a szabadgyökök károsító hatását ne mutatták volna ki a szabadgyökök túltermelődése vagy az antioxidáns rendszer károsodása miatt. Külső, kiváltó tényezők:
Élvezeti szerek, cigarettafüst és alkoholos befolyásoltság
Magas hőmérséklet – hőstressz
UV sugárzás – fertőtlenítés, napfény hatása
Ionizáló sugárzás – fertőtlenítés
Peszticidek, herbicidek és egyéb környezeti toxinok
Ózon
Szmog
Fémtoxikózisok (réz és a vas)
Megemelt, többszörösen telítetlen zsírsav-bevitel (egyidőben megnövelt mennyiségű antioxidáns-bevitel hiányában)
Glutation depléció
Éhezés
metionin hiány
cisztein hiány
A-vitamin túladagolása
23
3.5
In vitro modellek Kétféle vizsgálati módszert különíthetünk el; in vitro és in vivo. Mindkettőnek van előnye
és hátránya. Az in vitro módszer előnye, hogy gyors, olcsó és könnyen beszerezhető anyagok szükségesek hozzá. E módszert hasznosítják a gyógyszerkutatásban is. Az in vivo módszer pedig lassú és rendkívül költséges. Oxidatív stressz előidézéséhez két, alternatív út használható. Mindegyik célja, hogy megzavarjuk a pro-antioxidáns egyensúlyt. Az egyik út, hogy olyan anyagot adunk, ami gátolja az antioxidáns védelmi mechanizmusokat. A másik lehetőség pedig az, hogy kívülről hidrogén-peroxidot adunk közvetlenül (J. J. P Gille and H. Joenje 1992). A stressz következményeit csak későn érzékeli az élő szervezet, ezért speciális vizsgálatokkal történő kimutatása rendkívül fontos, mellyel a napi stresszhatások káros következményeire még időben figyelmeztet. Az oxidatív stresszt vizsgálhatjuk közvetett módon, a védelem oldaláról, az antioxidáns hatású komponensek mérésével vagy a támadás oldaláról közvetlenül az oxidált metabolitok mérése révén, vagy a két módszer kombinációjával (Miret, 2006). Számos in vitro meghatározás áll rendelkezésre a reaktív oxigén vagy nitrogén gyökök kimutatására. A reaktív oxigén és nitrogén gyökök in vitro elektronspin rezonanciával (ami a párosítatlan elektront detektálja) vagy kemilumineszcenciával mérhetőek, de ezeknek a direkt módszereknek a laboratóriumi alkalmazása nehézségekbe ütközik a módszerek költségessége, valamint a szabadgyökök instabilitása miatt. A szabadgyökök reaktívak, féléletidejük igen rövid, ezért rutin célból történő közvetlen mérésük általában nem végezhető a szövetekben, sejtekben és testfolyadékokban. A szabadgyökökkel történő reakció során átalakult molekulák számos esetben sokkal stabilabbak, mint maguk a szabadgyökök, így pl. a stabil metabolitjaik (nitrát, nitrit) vagy a károsított lipid, fehérje vagy nukleinsav termékek mutathatók ki nagyobb biztonsággal. 3.6
Környezetszennyező anyagok feltételezhető hatásai vázizmokra Az iparosodás következtében szerves és szervetlen vegyületek kerülnek a levegőbe. A
növényvédőszereknek a feladata, hogy megvédje a növényt a kártevőktől és ezáltal, elősegítse a növény fejlődését. A növényvédőszerek a pesticidek (rovarírtók) csoportjába tartoznak. A cyfluthrin vizsgálatára alkalmasak az in vitro módszerek (Sebestyén Adrienn NYME konferencia ea.).
24
3.7
Pesticidek és oxidatív stressz Rovarirtó szereket is vizsgáltak az oxidatív stresszel kapcsolatban. Bebizonyították, hogy
a pesticidek emberi szervezetben oxidatív stresszt okoznak és ezzel kapcsolatos a mérgező hatásuk. A rovarirtószerek kezdetben legyengítik a szervezetet, majd később kóros elváltozásokat okoznak, ezért különösen oda kell figyelni, hogy ne kerüljenek be a szervezetünkbe. Több tanulmány is kimutatta, hogy a pyrethroidok oxidatív stresszt idéznek elő. Ennek nyilvánvaló nyomai több szervben, szövetben is meglátható, mint például májban, agyban, vesében vagy akár sejt szinten az erythrocitáknál. Megfigyelték, hogy az antioxidáns enzimek mennyisége (mint például a szuperoxid dismutase és catalase, melyek a H2O2-t és glutathiont bontják szét) növekedett pyrethroid kezelésnek kitett patkányok erythrocitáiban, mely valószínűleg egy adaptiv válasz a megnövekedett oxidativ stresszre (Mohammad Abdollahi 2004).
3.8
Adenosine és oxidative stressz Adenosin és ATP fontos alkatórészei a purinergic rendszernek. Ezek a vegyületek P1 és
P2 purinoceptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Bár adenosint nem tekintjük valódi neurotranszmitternek, mivel nem vezikulákban tárolódik, azért jelentős autokrin és parakrin szerepet tölt be. Ez a nucleoside cytoprotective hatását A1AR és A3AR receptorokon keresztül fejti ki a szívizomzatban és az idegrendszerben.. Összességében az adenosinnak fontos védő szerepe van in vitro és in vivo. Ez nucleosid szintén közreműködik ischemiás prekondícióban is. Vagyis olyan vegyületek, amelyek az adenosine hatását másolják, hasznosak lehetnek infarktus esetén klinikai körülmények között. Azt is megfigyelték, hogy egy dinamikus kölcsönhatás létezik az oxidatív stressz és az adenosin receptorok expressziója között (Vickram Ramkumar 2001).
25
4
Módszerek
4.1.1 C2C12 tenyésztés A C2C12 (ATCC) sejtvonalat folyékony nitrogén gőz fázisában tartottuk lefagyasztva. A kísérlet kezdetén 1 csövet (1 millió sejt) felolvasztottunk, lecentrifugáztunk (300g, 5 perc) majd 25 cm2-es sejttenyésztő flaskában (6 ml DMEM+10% FBS /Sigma/ tenyészmédiumban) tenyésztettünk, amíg a tenyészet konfluens (teljesen benőtte az edény alját) nem lett. Ezután a sejtekhez 3ml tripszint (fehérjebontást végző enzim) adtunk. Miután a sejtek leváltak a felszínről a flaskához 5 ml tenyészmédiumot öntöttünk majd 300g-on 5percig centrifugáltuk. Utána a sejteket szétosztottuk 24 lyukú plate-ekbe, majd 37 °C-on 5% CO2 mellett 3 napig tenyésztettük, míg a tenyészet újra konfluens nem lett. A differenciálatlan sejteket ekkor használtuk fel a kísérletekhez, vagy a sejteket szérummentes DMEM médiumban 5 napig differenciáltattuk és úgy használtuk fel a kísérletekhez. 4.1.2 Kezelés A vegyületeket törzsoldatból 100x hígításban adtuk. Minden kísérletben 4 párhuzamossal dolgoztunk. Egy plate-en belül volt a kontroll és a kezelt csoport. Vizsgált anyagok: Hidrogénperoxid (Sigma) 2, 3, 4, 6, 10 mM; Adenosine (Sigma) 3 µM; Cyfluthrin (Bulldock 25 hatóanyaga) 3, 1, 0.3, 0.1 µM. A vegyületeket desztillált vízben oldottuk fel és 100x higításban adtuk a tenyészetekhez. 4.1.3 Kiértékelés A kezelt és kontroll tenyészeteket lefényképeztük (minden csoportról minden nap 4-4 fénykép készült) egy Olympus invertált fázis kontraszt mikroszkóppal 40x-es objektíven keresztül. A képeket kvalitatívan értékeltük. Ezután a tenyészetekhez 0.01 mg/ml végső koncentrációban Alamar blue (Sigma) festéket adtunk (Luyten, 2007). A sejtekbe belépve, a mitokondriumban a resazurin átalakult resorufinná, melynek mennyiségét egy fluoreszcens platereaderrel (530 nm excitáció, 580 nm emisszió) kvantifikáltuk (12. ábra). Az adatokat Microsoft Excell program segítségével értékeltük ki és ábrázoltuk. Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg. Hipotézisteszteléshez kétmintás Student’s t-tesztet használtunk.
26
12. ábra. Az Alamar blue toxicitási teszt vázlata (Web referencia 9).
27
5
Eredmények Korábbi kísérleteink leginkább arra irányultak, hogy hogyan hatnak a toxinok differenciá-
latlan C2C12 tenyészeteken (Lakatos, 2014). Akkor megállapítottuk, hogy a C2C12 egér vázizom sejtvonal könnyen tenyészthető, megbízható sejtforrás a toxikológiai kísérletekhez. Ebben a kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogy hogyan hatnak a toxinok a differenciáltatott vázizom sejtekre, vagy magára a differenciálódás folyamatára. Megállapíthattuk, hogy a C2C12 sejtek megbízhatóan, reprodukálhatóan és egyszerűen differenciáltathatók vázizom rostokká (13. ábra)(Soltow, 2013). A differenciáció folyamata kb. 5 napig tartott, kezdetben a sejtek hosszúkás alakúvá váltak, párhuzamosan rendeződtek, majd fúzionáltak. A harántcsíkolt vázizom szövettel összehasonlítva a differenciáltatott C2C12 tenyészetben az izomrostok sokkal kevésbé rendezettek, a harántcsíkolat sokkal kevésbé volt megfigyelhető, valamint a sejtmagok a sejtek közepén láncban, vagy a rostok közepén egy csomóban helyezkedtek el.
13. ábra. Vázizom. Bal: patkány vázizom, hemotoxylin-eosin-nal festett metszet. Jobb: differenciáltatott C2C12 vázizom tenyészet (fáziskontraszt) (40x objektív)
A vázizom tenyészettel fiziológiai kísérletet nem végeztünk, de mások megállapították, hogy a differenciált C2C12 sejtek sokban hasonlítanak a vázizom sejtekre, de az általuk kifejthető erő jelentősen kisebb, valamint más különbségeket is megfigyeltek (McMahon, 1994; Burattini, 2004; Cooper, 2004, Manabe 2012). A differenciáció kvantitatív értékelése fényképek alapján is lehetséges, de rendkívül időigényes feladat. Meg kell számolni a differenciálódott izomrostokat és egyesével minősíteni a differenciációjuk fokát. Erre nincs kész számítógépes programunk. Ezért inkább egy biokémiai tesztet használtunk az élő sejtek számának meghatározására. Alamar blue teszttel mértük a sejtek
28
metabolikus aktivitását. Korábbi kísérleteinkben és az irodalom alapján is ez jól korrelált a sejtszámmal. Az Alamar blue teszt olcsó, érzékeny és nagy áteresztőképességű módszer, mely csak kis mértékben befolyásolja a sejtek fiziológiai aktivitását. A készített fényképeket kvalitatív kiértékelésre és ellenőrzésre használtuk. 24 órás hidrogén-peroxid kezelés koncentrációfüggően elpusztította a differenciált C2C12 izomrostokat (14. Ábra). A koncentráció/sejtpusztulás görbe nagyon meredeknek bizonyult, 1 mM H2O2 csak minimális (adat korábbi kísérletből származik), míg 6 mM szinte teljes pusztulást okozott. Korábbi kísérletekben, melyeket differenciálatlan C2C12 sejteken végeztünk, kimértük az adenosin koncentráció hatás görbéjét. 3µM adenosin bizonyult a leghatékonyabbnak a hidrogén- peroxid toxicitásának a visszafordításában, bár ez a koncentráció sem okozott teljes védelmet. Differenciáltatott C2C12 izomrostokon adenosin teljesen hatástalannak bizonyult.
29
14. ábra. Hidrogén-peroxid kezelés hatása differenciáltatott C2C12 sejtekre. A: kezeletlen kontroll. B: 24 órás 4mM hidrogén-peroxid kezelés jelentős sejtpusztulást váltott ki C: 3 µM adenosin nem fordította vissza a H2O2 kezelés hatását. D: Hidrogén-peroxid kezelés differenciáltatott C2C12 sejtekre kifejtett hatásának mérése Alamar blue módszerrel. 2 mM H2O2 (H2) több mint 40% sejtpusztulást okozott. A hatás koncentrációfüggő volt és minden vizsgált koncentrációban szignifikáns. 3 µM Adenosine nem változtatta meg szignifikánsan a hidrogén- peroxid kezelés hatását. (H2, H3, H4, H6, H10 – hidrogén-peroxid 2, 3, 4, 6 és 10 mM koncentrációban. H2A, H3A, H4A, H6A, H10A – hidrogén-peroxid 3 µM adenosine jelenlétében.)
Cyfluthrin korábbi akut kísérletekben koncentrációfüggően elpusztította a differenciálatlan C2C12 sejteket. Akkor is megfigyeltünk egy érdekes hatást, alacsonyabb koncentrációkban mintha növelte volna a sejtszámot az Alamar blue teszt szerint, de a fényképeken nem volt megfigyelhető ez a hatás. A mostani kísérletekben 5 napig adtuk a Cyfluthrint a differenciáltatás kezdetétől. 3 µM Cyflutrin, mely akut adásnál éppen a toxicitási küszöb alatt volt, láthatóan (a készített fényképek alapján) gátolta az izomrostok kialakulását (15. ábra). Meglepő módon az Alamar blue teszt a sejtek számának, vagyis metabolikus aktivitásának drasztikus (több mint 50%-os) növekedését jelezte. Adenosine kezelés nem befolyásolta a Cyflutrin hatását.
30
15. ábra. Cyfluthrin kezelés hatása differenciáltatott C2C12 sejtekre. A: kezeletlen kontroll. B: 24 órás 3 µM Cyfluthrin kezelés jelentősen gátolta a differenciációt C: 3 µM adenosin nem fordította vissza a Cyfluthrin kezelés hatását. D: Cyfluthrin kezelés differenciáltatott C2C12 sejtekre kifejtett hatásának mérése Alamar blue módszerrel. 3 µM Cyfluthrin (C) több mint 50%-al megnövelte a sejtek metabolizmusának sebességét. A többi koncentrációban a kezelés nem volt hatékony. 3 µM adenosine (A) nem változtatta meg szignifikánsan a Cyfluthrin kezelés hatását.
31
6
Megvitatás Ebben a kísérletsorozatban egy oxidatív stressz modell (hidrogén- peroxid kezelés) hatá-
sát vizsgáltuk C2C12 egér vázizom sejtvonal differenciációjára. Hidrogén-peroxid kezelés koncentráció
függvényében
elpusztította
mind a
differenciálatlan,
mind
a
differenciált
vázizomsejteket. 3µM adenosine a differenciált sejteknél, ellentétben a differenciálatlanoknál korábban tapasztaltnál, nem fordította vissza a hidrogén- peroxid hatását. Cyfluthrin 3 µM koncentrációban gátolta a differenciációt, de érdekes módon növelte a sejtek metabolizmusának sebességét. Az adenosin itt is hatástalannak bizonyult. A differenciált C2C12 izomrostok érzékenysége az oxidatív stresszre hasonlónak bizonyult, mint a differenciálatlan C2C12 sejteké. A hidrogén- peroxid kezelés 1 mM koncentráció felett, mely előfordulhat fiziológiás körülmények között is, toxikus a vázizomrostokra. Adenosine kezelés hatástalannak bizonyult, aminek a legvalószínűbb magyarázata, hogy a differenciáció folyamata során megváltozott az adenosine receptorok expressziója. Ennek az eldöntése további vizsgálatokat igényel. A mi adataink is azt a véleményt erősítik, hogy oxidatív stressz jelentős szerepet játszhat az izomsorvadásban. Cyfluthrin komplex módon hat a vázizomsejtekre, a toxikus koncentráció határán jelentősen megnöveli a sejtek metabolikus sebességét (Sadowska- Woda, 2010). Hogy ez összefügghete a Cyfluthrin oxidatív stresszt indukáló hatásával vagy teljesen más mechanizmuson keresztül valósul meg, további vizsgálatokat igényel. A Cyfluthrin vázizom differenciációt csökkentő hatásának magyarázata is további vizsgálatokat igényel, különösen annak a fényében, hogy korábbi kísérleteinkben a nem differenciálódó C2C12 sejtek egy idő után leváltak a tenyészfelületről és elpusztultak (ezért is lehetett az Alamár blue tesztet a differenciáció mérésére használni). Cyfluthrin kezelés talán csak lelassította a vázizom sejtek érését.
32
7
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Molnár Péternek folyama-
tos, önzetlen, segítő támogatását mely nélkül e munka nem jöhetett volna létre. Köszönetemet szeretném kifejezni a Nyugat-magyarországi Egyetem Természettudományi és Műszaki Karának a munka támogatásáért.
33
8
Irodalomjegyzék
Bonaldo, P., & Sandri, M. (2013). Cellular and molecular mechanisms of muscle atrophy. Disease Models&Mechanisms, 6, 25–39. Burattini, S., Ferri, R., Battistelli, M., Curci, R., Luchetti, F., & Falcieri, E. (2004). C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: Morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry, 48, 223–233. Cannio, Raffaele, Gabriella Fiorentino, Alessandra Morana, Mosè Rossi and Simonetta Bartolucci (2000) Oxygen: Friend or foe? Archaeal superoxide dismutases in the protection of intra and extracellular oxidative stress. Frontiers in Bioscience 5, d768-779. Chen, Q. M., Tu, V. C., Wu, Y., &Bahl, J. J. (2000). Hydrogen Peroxide Dose Dependent Induction of Cell Death or Hypertrophy in Cardiomyocytes, ÚJSÁG 373 (1), 242–248. Cooper, S. T., Maxwell, A. L., Kizana, E., Ghoddusi, M., Hardeman, E. C., Alexander, I. E., … North, K. N. (2004). C2C12 Co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motility and the Cytoskeleton, 58, 200–211. Davies, K. E. &Nowak, K. J. (2006). Molecular mechanisms of muscular dystrophies: old and new players. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 7, 762–773. Donáth T.: (1979) Az emberi test felépítése. Tankönyvkiadó, Budapest. Emery, A. E. H. (2002). The muscular dystrophies. The Lancet, 359, 687–695. Fazekas György- Szerényi Gábor (2002) Biológia II. kötet, Scolar kiadó Budapest Finkel, T. &Holbrook, N. J. (2000). Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 408, 239–247. Flanigan, K. M. (2012). The muscular dystrophies. Seminars in Neurology, 32, 255–63. Geusens, N. Hanssens, M., Luyten, C., & Pijnenborg, R. (2007). The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of viability ,migration and invasion of choriocarcinoma cells, 22(5), 1304–1309. Goldberg, Allon, Derek E. Wildman, Timothy R. Schmidt, Maik Hüttemann, Morris Goodman, Mark L. Weiss, and Lawrence I. Grossman (2003) Adaptive evolution of cytochrome c oxidase subunit VIII in anthropoid primates PNAS 100 5873-5878
34
Halliwell, B. (2006). Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? Journal of Neurochemistry, 97, 1634–1658. Hejnol, Andreas (2012) Evolutionary biology: Muscle's dual origins Nature 487, 181–182 Jackman, R. W. & Kandarian, S. C. (2004). The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology. CellPhysiology, 287, C834–C843. J. J. P. Gille and H. Joenje. Department of Human Genetics, Free University, Amsterdam, Netherlands- Cell culture models for oxidative stress: superoxide and hydrogen peroxide versus normobaric hyperoxia- Mutation Research, 275 (1992) 405- 414 Kirschvink, Joseph L., Eric J. Gaidos, L. Elizabeth Bertani, Nicholas J. Beukes, Jens Gutzmer, Linda N. Maepa, and Rachel E. Steinberger (2000) Paleoproterozoic snowball Earth: Extreme climatic and geochemical global change and its biological consequences PNAS 97 1400-1405; Klaunig, J. E., Kamendulis, L. M., &Hocevar, B. A. (2010). Oxidative stress and oxidativedamage in carcinogenesis. Toxicologic Pathology, 38, 96–109. Lakatos, Renáta és Péter Molnár (2014)Cell Cultures in Pharmacological and Toxicological Research. NYME SEK Tudományos Közlemények 2014, Természettudományi Kötet. Inpress. Manabe, Y., Miyatake, S., Takagi, M., Nakamura, M., Okeda, A., Nakano, T., … Fujii, N. L. (2012). Characterization of an Acute Muscle Contraction Model Using Cultured C2C12 Myotubes. PLoS ONE, 7. McCord, J. M. (2000) The evolution of free radicals and oxidative stress. American Journal of Medicine, 108, 652–659. McCracken, Thomas O. (2000) Háromdimenziós anatómiai atlasz, Scolar Kiadó Budapest McMahon, D. K., Anderson, P. A., Nassar, R., Bunting, J. B., Saba, Z., Oakeley, A. E., & Malouf, N. N. (1994). C2C12 cells: biophysical, biochemical, and immunocytochemical properties. American Journal of Physiology - Cell Physiology, 266, C1795–C1802 Miret, S.,Groene, E. De, & Klaffke, W. (2006). Comparison of in vitro assays of cellular toxicity in the human hepatic cell line HepG2. Journal of Biomolecular Screening, 11, 184–193. Mohammad Abdollahi, Akram Ranjbar, Shahin Shadnia, Shekonfeh Nikfar, Ali Rezaie: Pesticides and oxidative stress: a review- Med Sci Monit, 2004. 10 (6): RA 141- 147
35
Neuzil, J.,Rayner, B., Lowe, H., & Witting, P. (2005). Oxidative stress in myocardial ischaemia reper fusion injury: a renewed focuson a long-standing area of heart research. Redox Report, 10, 187–197. Pellegrino, M. A., Desaphy, J.-F., Brocca, L., Pierno, S., Camerino, D. C., &Bottinelli, R. (2011). Redox homeostasis, oxidative stress and disuse muscle atrophy. The Journal of Physiology, 589(Pt 9), 2147–60. Platzer, Werner (1996) SH atlasz- Anatómia I. Springer Hungarica Kiadó Kft, Budapest Powers, S., Kavazis, A., & McClung, J. (2007). Oxidative stress and disuse muscle atrophy. Journal of Applied Physiology, 2389–2397. Robbins- Kumar Abbas Fausto Mitchell: A patológia alapjai (8. kiadás) Medicina Könyvkiadó Zrt. (2009) Sadowska-Woda, I., Wójcik, N., Karowicz-Bilińska, A., &Bieszczad-Bedrejczuk, E. (2010). Effect of selected antioxidants in beta-cyfluthrin-induced oxidative stress in human erythrocytes in vitro. Toxicology in Vitro. 24, 879–884. Soltow, Q. A.,Zeanah, E. H., Lira, V. A., &Criswell, D. S. (2013). Cessation of cyclic stretch induces atrophy of C2C12 myotubes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 434, 316–321. Steinmetz, P. R., Kraus, J. E., Larroux, C., Hammel, J. U., Amon-Hassenzahl, A., Houliston, E., … Technau, U. (2012). Independent evolution of striated muscles in cnidarians and bilaterians. Nature, 487, 231–234. Sztretye Mónika Tünde (2010) A kalciumfelszabadulás elemi eseményeinek szabályozása és módosulása normal és pathologiás körülmények között. PhD. Tézis, Debreceni Egyetem. https://dea.lib.unideb.hu/dea/ bitstream/handle/2437/92758/Sztretye_Monika_tezis_magyar.pdf?sequence=8 Vickram Ramkumar, Dan M. Hallam and Zhongzhen Nie: Adenosine, Oxidative stress and Cytoprotection- Jpn. J. Pharmacol. 86, 265- 274 (2001) Zhang, P., Chen, X., & Fan, M. (2007). Signaling mechanisms involved in disuse muscleatrophy. Medical Hypotheses, 69, 310–321.
36
Web referencia 1: http://slideplayer.hu/slide/2147182/ Web referencia 2: https://hu.wikipedia.org/wiki/Izom Web referencia 3: https://www.mozaweb.hu/Lecke-BIO-Biologia_es_egeszsegtan_8A_mozgas_szolgalataban-104859 Web referencia 4: http://www.hazipatika.com/betegsegek_a_z/izomdisztrofia/34 Web referencia 5: http://www.hazipatika.com/betegsegek_a_z/spinalis _izomatrofia/770 Web referencia 6: http://slideplayer.hu/slide/2237665/ Web referencia 7: http://www.unicafe.hu/egeszseg/testunk/az-emberi-test-az-izomrendszer/ Web referencia 8: https://hu.wikipedia.org/wiki/Izom Web referencia 9: http://www.lifetechnologies.com/hu/en/home/brands/ molecular-probes/keymolecular-probes-products/alamarblue-rapid-and-accurate-cell-health-indicator.html http://www.hazipatika.com/betegsegek_a_z/spinalis_izomatrofia/770
37
