Microbiologische aspecten van bioterrorisme

Microbiologische aspecten van bioterrorisme.

Dr. Ed J Kuijper en Prof. dr. H. Goossens, Afdeling Klinische Microbiologie, Centrum van Infectieziekten, LUMC, Leiden.

Inleiding Risicobeheersing voor werken met biologische agentia Anthrax Tularemie Brucellose Pest Q-koorts Botulisme Websites Referenties

blz. 2 blz. 3 blz. 4 blz. 8 blz. 10 blz. 12 blz. 14 blz. 16 blz. 18 blz. 19

Deze bijdrage maakt deel uit van de Boerhaave cursus “Bioterrorisme” die op 18 januari 2002 wordt gehouden. December 2001, Leiden

1

Inleiding

De recente gebeurtenissen in de VS hebben ook de microbiologische laboratoria alert gemaakt voor bioterrorisme en biologische oorlogsvoering [1,2]. Bioterrorisme is het gebruik van biologische wapens gericht tegen mensen, dieren of planten door individuen of organisaties. Bioterrorisme is gericht op een grote, niet geselecteerde groep van mensen. Bij biologische oorlogsvoering is er wel een geselecteerde groep van personen, zoals bijvoorbeeld militairen. Als biologische wapens kunnen microorganismen gebruikt worden of toxinen van micro-organismen, planten of dieren [3]. Op de lijst van mogelijke bacteriologische wapens staan Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, Brucellla spp., Vibrio cholerae en Coxiella burnetti vermeld. Van de virussen gaat de meeste aandacht uit naar variolavirus, virale hemorrhagische koortsvirussen en virale verwekkers van encephalitis.Toxinen die frequent genoemd worden als mogelijke kandidaten voor bioterrorisme zijn exotoxine van Clostridium botulinum, enterotoxinen van staphylokokken en mycotoxinen. Deze biologische wapens kunnen met aërosolen verspreid worden en veroorzaken een niet eenvoudig te dianogsticeren ziekte met hoge morbiditeit en mortaliteit. Voor snelle diagnostiek van biologische wapens ligt het accent op moleculaire biologie (multiplex PCR, real-time PCR), biosensoren en immunoassays [4,5,6]. Salmonella spp. komen niet op de lijst voor, maar in 1984 is er een epidemie van gastro-enteritis bij 751 personen geweest die werd veroorzaakt door opzettelijke besmetting van "salad bars" met een ATCC stam van Salmonella typhimurium [7]. Bij deze salmonellaepidemie (de grootste in 1984!) was het CDC al in een vroeg stadium betrokken maar duurde het tenminste 1 jaar voordat men kon aantonen dat het om een opzettelijke besmetting ging. De stam was gekocht bij een commerciële leverancier van biologische producten. Oorlogsvoering met biologische wapens is al eeuwenoud. In de veertiende eeuw werden bij de belegering van de havenstad Kaffa (thans Feodosia) in Oekraïne kadavers van aan pest gestorven soldaten over de stadsmuren gekatapulteerd om de stad via een pestepidemie tot overgave te dwingen [8]. In de achttiende eeuw deelden de Britse soldaten met variolavirus dekens uit aan Amerikaanse Indianen "to reduce native American tribes hostile to the British". In de eerste wereldoorlog hebben Duitse eenheden met Burkholderia mallei (verwekker van glanders) getracht de Franse cavalerie uit te schakelen. Tijdens de Japanse bezetting van Manchuria (vanaf 1932 tot het einde van WO II) is er een speciale Unit (Unit 731) actief geweest om biologische wapens te ontwikkelen. In deze unit werkten ruim 3000 mensen en er zijn een groot aantal experimenten gedaan op gevangenen met Bacillus anthracis, Neisseria meningitidis, Shigella spp, Yersinia pestis en Vibrio cholerae. Ook zijn tenminste 11 Chinese steden aangevallen met biologische wapens via de lucht, besmet voedsel en water en met Y. pestis besmette vlooien. Er zijn echter geen gegevens beschikbaar over de effectiviteit van deze aanvallen [9]. De interesse van Duitsland tijdens WO II in biologische oorlogsvoering resulteerde in experimenten op gevangenen met onder andere hepatitis A virus, Plasmodium spp. en Rickettsia spp. Ook de geaillieerden ontwikkelden biologische wapens en experimenteerden met Bacillus anthracis op het eiland Gruinard vlak voor de Schotse kust dat tot 1986 hiermee besmet is gebleven. De toedieningsweg van deze biologische wapens kan via aërosolen met partikels die ongeveer een grootte van 1 tot 10 um hebben. Andere mogelijke toedieningsroutes zijn oraal via drinkwater of voedsel en via de percutane route. De belangrijkste biologische wapens zijn vermeld in tabel 1. 2

Tabel 1. Belangrijkste biologische wapens.

Ziekte

Minimale dosis Incubatie Beheersingsvia aërosolen periode niveau bij bewerkingen van kweken

Materiaal voor diagnostiek

Anthrax Tularemie

8000-15000 sporen 1-10 bacteriën

1-5 d 2-10 d

2 3

Brucellose

10-100 bacteriën

5-60 d

3

Pest

100-500 bacteriën

2-3 d

2

1-10 bacteriën 0,001 µg/kg

10-40 d 12 uur-3 d

3 3

Wonduitstrijk, bloed, sputum Wonduitstrijk, sputum, bloed serum Bloed, beenmerg, punctaten, serum Sputum, bloed, serum lymflekierpunctaat, Sputum, serum Serum, wonduitstrijk, feces

Q koorts Toxine van C. botulinum

Risicobeheersing voor werken met biologische agentia. De risico's van het werken met biologische agentia zijn afhankelijk van de voorzieningen in het laboratorium, eigenschappen van het micro-organisme of agens, de mogelijke besmettingsweg en de beschikbaarheid van een behandeling [10,11]. Er zijn 4 niveaus van risicobeheersing. Voor het werken met niet-pathogene microrganismen gelden geen bijzondere eisen (niveau 1). Diagnostische microbiologische laboratoria zullen bij het werken met patiëntenmateriaal beheersingsniveau 2 gebruiken. Bij dit niveau betreft het pathogene micro-organismen waarvan verspreiding onwaarschijnlijk is en waarvoor een effectieve behandeling bestaat. Bij niveau 3 gaat het om micro-organismen die zich wel kunnen verspreiden en in staat zijn een ernstige ziekte te veroorzaken, maar waarvoor nog steeds een effectieve behandeling of profylaxe beschikbaar is. Voor ziekten door micro-organismen uit niveau 4 is geen behandeling mogelijk (b.v Ebola-virus). De moeilijkheid bij de interpretatie van deze niveaus ligt bij het woord "verspreiding". Hoewel de oorzaak van de meeste laboratoriuminfecties niet te achterhalen is, wordt aangenomen dat verspreiding (besmetting) meestal plaats vindt via aërosolvorming. Bij de bewerking van kweken zijn er een aantal handelingen waarbij aërosolen worden gevormd (suspenderen, gebuik van een blender, sonificeren) en waarbij aparte maatregelen moeten worden genomen. In de praktijk betekent dit dat voor het werken op beheersingsniveau 2 in de werkruimte een veiligheidskabinet aanwezig moet zijn voor deze risicovolle handelingen. Voor werken op beheersingsniveau 3 is een afsluitbare sluis en aparte luchtafvoer van de werkruimte vereist en worden alle handelingen in een veiligheidskabinet in deze werkruimte verricht. In Nederland zijn geen laboratoria waar een beheersingsniveau 4 aanwezig is.

3

Anthrax. Kliniek en pathogenese De bacterie Bacillus anthracis is door Robert Koch in 1867 beschreven als verwekker van "Milzbrand", een ziekte die bij runderen en schapen leidde tot een grote zwelling van de milt en die soms ook bij mensen voorkwam. Miltvuur is de eerste ziekte die Koch gebruikte voor zijn beroemde postulaten; de vreemde rechthoekige staven die hij in het bloed van zieke dieren waarnam, konden gekweekt worden op een voedingsbodem en bij inspuiting in gezonde muizen de ziekte veroorzaken. Bacillus anthracis is een sporenvormende bacterie. De sporen van B. anhracis zijn zeer resistent tegen uitdroging, hitte en desinfectantia en kunnen jarenlang overleven. Anthrax is endemisch onder vee in veel landen in Afrika, Midden-Oosten en Azië. Door contact met besmet vee, dierlijke producten of karkassen kunnen infecties (meestal huidinfecties) ontstaan via overdracht van sporen. Per jaar wordt geschat dat er ongeveer 20.000 tot 100.000 gevallen van cutane anthrax wereldwijd voorkomen. Besmetting kan via de lucht plaatsvinden als er een groot aantal sporen in de lucht vrijkomt. Besmetting van mens naar mens komt niet voor. Geëxtrapoleerd uit gegevens van proefdieronderzoek wordt de gemiddelde lethale dosis voor mensen geschat van 2500 tot 55.000 sporen. Na een incubatietijd van 1-5 dagen (kan uitlopen tot 60 dagen) kan anthrax zich manifesteren als [12,13,14]: 1. cutane anthrax 2. pulmonale anthrax 3. gastro-intestinale anthrax Bij de pulmonale vorm (vroeger ook wel "wolsorteerdersziekte" genoemd) komen de sporen die kleiner zijn dan 5 µm tot diep in de longblaasjes. De fagocyterende cellen brengen de sporen naar de lymfeklieren en het mediastinum waar een hemorrhagische ontsteking ontstaat met sepsis en complicaties zoals meningitis. De waarneming bij rhesusapen dat dit tot 60 dagen na besmetting kan plaatsvinden, heeft geleid tot de aanbeveling antibiotische profylaxe 60 dagen te continueren [15]. De infectie van het maag-darmkanaal ontstaat door ingestie van de sporen waarna voornamelijk het het slijmvlies van oropharynx of ileum/coecum wordt aangedaan. Gastro-intestinale anthrax bij de mens is zeer zeldzaam. Bij pulmonale anthrax ontstaat vrijwel altijd sepsis. Er is hierbij een mortaliteit (onbehandeld) van vrijwel 100%. Meningitis kan als complicatie ontstaan van sepsis bij de pulmonale vorm. Aërogene transmissie van de ziekte van mens tot mens komt niet voor. De mens is op zich weinig gevoelig voor B. anthracis. De ID50 voor inhalatie-anthrax wordt geschat op 8.00 tot 15.000 sporen [3,12,13]. Voor cutane anthrax in een preëxistentie huidlesie noodzakelijk. Bacillus anthracis is een lange, gekapselde, facultatief anaërobe Gram-positieve staaf die ovale tot subterminale endosporen vormt en in korte ketens (2-4 cellen) ligt [10,13]. Bij patiënten worden de sporen niet in de weefsels gevormd. Twee plasmiden bevatten de informatie voor drie belangrijke virulentiekenmerken. Incubatie bij 42 °C geeft een verlies van de plasmiden die genetische informatie voor toxinen bevatten. Het polyglutamyl kapsel remt de fagocytose en verhindert intracellulaire killing. De twee exotoxinen bevatten elk een eiwit (het "protective antigen" ) dat zorgt voor specifieke hechting aan de celwand waarna het toxine via endocytose wordt opgenomen. Het "edema toxine" bevat een calmoduline afhankelijk adenylaat-cyclase dat vooral oedeem geeft op de plaats van infectie, de neutrofiele granulocyten remt en de productie van TNF en IL-6 door monocyten remt. Het zink-

4

metalloprotease van het "lethal toxin" stimuleert de productie van TNF-α en IL-1β (geeft sudden death bij proefdieren) en verhindert de intracellulaire signaling. Diagnostiek. Patiëntenmateriaal kan op beheersingsniveau 2 op het microbiologisch laboratorium worden verwerkt. De bewerking van geïsoleerde stammen zal bij voorkeur in een veiligheidskabinet moeten plaatsvinden. Voor een keuze van voedingsmedia kan gebruik gemaakt worden van tabel 2. In het Gram-preparaat van patiëntenmateriaal is B. anthracis te herkennen aan de aanwezigheid van een kapsel en het ontbreken van sporen. Afhankelijk van de aard van het materiaal, kan een aankweekmedium (nutrient broth met 100.000 E polymyxine U/l) gebruikt worden. Indien het patiëntenmateriaal ook veel andere bacteriën bevat, kan extra een ethanolshock behandeling (96% ethanol, 1/1 met patiëntenmateriaal voor 30-60 minuten op kamertemperatuur) worden toegepast waarna het wordt geënt op een bloedplaat, MacConkey medium, chocoladeagarplaat en een CNA-medium (colistine en nalidixinezuur bevattend medium). Kolonies van B. anthracis groeien na 18-24 uur incubatie bij 35 °C als 2-5 mm platte kolonies met een onregelmatige rand, matglas van aspect en vaak Medusahoofdachtige uitlopers. Op de MacConkeyplaat is geen groei. De kolonies hebben bij aanraken met de öse een vaste consistentie. Op bloedplaten hebben de kolonies geen ß-hemolyse maar op een eiplaten is er als bij B. cereus wel lecithinase activiteit (tabel 3). De B. anthracis is onbeweeglijk en is gevoelig voor penicilline. In tegenstelling tot B. thermodenitrificans groeit B. anthracis aëroob en anaëroob. De sporen zijn ovaal, liggen centraal of subterminaal en geven geen zwelling van de celwand. Het onderscheid met B. mycoides is met de penicilline gevoeligheid te bepalen. Confirmatie van B. anthracis dient op een Referentielaboratorium plaats te vinden met directe immunofluorescentie op kapselpolysacchariden, faaggevoeligheid of PCR [2,13]. Kweken van B. anthracis uit de neus is niet meer dan een experimenteel onderzoek om vast te stellen of er via inhalatie een besmetting is opgetreden. Wat het risico is om vanuit deze kolonisatie een infectie te ontwikkelen, is niet bekend. Voor serologisch onderzoek bestaan EIA's waarbij als antigeen het kapselpolysacchariden of het " protective antigen" gebruikt worden. Bij cutane anthrax lijkt er voor deze testen een plaats te zijn (11 van 12 patiënten waren positief) [16]. De testen worden voorlopig alleen gebruikt om retrospectief een diagnosie te kunnen stellen als kweken en PCR niet meer mogelijk zijn. Bescherming. Het anthraxvaccine bestaat uit gezuiverd "Protective antigen" en is niet (meer) door FDA goedgekeurd. Dit vaccine wordt toegediend bij 0, 2, 4 weken en nog eens herhaald na 6, 12 en 18 maanden. De effectiviteit van dit vaccine voor bescherming tegen de pulmonale vorm is niet bekend (anders dan bij proefdieren) en productie vindt slechts op beperkte schaal plaats. Wel zijn er data (CDC) die aantonen dat het vaccine werkt ter voorkoming van cutane anthrax. Antibiotische gevoeligheid. In vitro is B. anthracis gevoelig voor penicilline, chinolonen, tetracyclinen, macroliden, aminoglycosiden, glycopeptiden en eerste generatie cephalosporinen. Er bestaat intrinsieke resistentie tegen tweede en derde generatie cephalosporinen en tegen co-trimoxazol. Omdat uit een voorlopige analyse van de "Amerikaanse" stam lijkt alsof er zowel constitutieve als induceerbare beta-lactamasen worden gevormd (http://www.cdc.gov/mmwr), wordt aanbevolen geen monotherapie van penicilline of amoxocilline te gebruiken. Analoog aan de behandeling van ernstige infecties door toxine-producerende stafylokokken en streptokokken,

5

wordt door het CDC geadviseerd om clindamycine toe te voegen aan ciprofloxacine of doxycycline.

Tabel 2. Inzetschema van patiëntenmateriaal voor onderzoek naar Bacillus anthracis.

Cutaan Gastrointestinaal Pulmonaal Bloed4 Kolonisatie

Materiaal

Grampreparaat

extra media

Ethanolbehandeling1

Aankweekmedium2

Wattenstok, vocht, biopt Feces, biopt

Ja

CNA3 Ei-plaat CNA

neen

Neen

ja

Neen

CNA Ei-plaat CNA Ei-plaat CNA

neen

Neen

neen

-

neen

Ja

Alleen van biopt

Sputum, bal, ja biopt Bloedkweek- neen flesje Neus, keel en neen huiduitstrijk

1

Ethanol-shock behandeling: gelijke delen feces met 96% ethanol, 30-60 minuten kameremperatuur en vervolgens afenten op bloedagarplaat, eiplaat en CNA 2 Aankweekmedium is bouillon met 100.000 U/l polymyxine. Na O/N incubatie afenten op bloedagarplaat, CNA en ei-plaat. 3 CNA-medium: bevat colistine en nalidixinezuur 4 Bij sepsis met B. anthracis kan in een bloeduitstrijkje de gekapselde B. anthracis aangetoond worden.

6

Tabel 3. Identificatie van Bacillus anthracis B. subtilis groep

Beweeglijkheid Anaërobe groei Ei-plaat (lecithinase) ß-hemolyse Penicilline

B. cereus groep

Andere Bacillus spp.

+ +/-

B. cereus + + +

B. anthracis + +

B. thuringiensis + + +

B. mycoides + +

+ R

+ R

S

+ R

R

+ +/+/-

Tularemie Kliniek en pathogenese. Tularemie is een zoönose veroorzaakt door een Gram-negatief staafje Francisella tularensis [2,3,10]. Van deze bacterie komt biovar A (biovar tularensis) alleen in Noord-Amerika voor en biovar B (biovar palaearctica) voornamelijk in Europa en Azië. F. tularensis is uit meer dan honderd diersoorten geïsoleerd, zowel knaagdieren, vogels, zoogdieren als arthropoden. Vooral wilde konijnen worden genoemd als reservoir [17]. Het micro-organisme kan via deze dieren en hun urine of uitwerpselen water en grond besmetten [18]. Mensen kunnen via direct contact met dieren geïnfecteerd worden, via insektenbeten, via teken, of via de respiratoire route. Bij een studie van 6071 teken in Zwitserland, bleek 0,12% geïnfecteerd te zijn met F. tularensis [19]. Overdracht van mens naar mens is nog nooit beschreven. Bij mensen kan de ziekte zich, afhankelijk van de toedieningsroute, het inoculum en de virulentie van de stam manifesteren als een ulceroglandulaire, oculoglandulaire, glandulaire, oropharyngeale, intestinale, pulmonale of een typheuze vorm. Er zijn slechts 10-50 bacteriën nodig om een infectie te veroorzaken, behalve bij de intestinale vorm waarbij tenminste 108 bacteriën nodig is. Recent is op de respiratoire route de aandacht gevestigd bij een epidemie op een eiland vlak voor de kust van Massachusetts (Martha's Vineyard) waar 15 patiënten een pneumonie ontwikkelden (1 patiënt overleed) [20] . Risicofactoren waren grasmaaien en houthakken. Bij inademing van grote hoeveelheden F. tularensis kan dit leiden tot pneumonie, pleuritis en hilaire lymfadenopathie [21]. Elk jaar worden ongeveer 100-200 gevallen gediagnosticeerd in een beperkt aantal staten in het zuiden en westen van de VS, waarbij vaak een contact is geweest met konijnen en hazen in de winter of met teken in de zomer. In de VS zijn laboratoriuminfecties door F. tularensis berucht waarbij via de respiratoire route een sepsis kan ontstaan. Dit betekent dat het werken met F. tularensis op beheersingsniveau 3 moet plaatsvinden. Diagnostiek. De diagnose kan worden gesteld met behulp van kweek uit bloed, sputum of uitstrijk van een huidlaesie. Er zijn verschillende PCR's beschreven voor de detectie van F. tularensis in huislaesies bij mensen [19,22]. Bij een onderzoek van 40 patiënten met ulceroglandulaire tularemie tijdens een epidemie in Zweden, was de PCR bij 75% positief en de kweek in 62% [23]. Voor de isolatie uit bloed wordt de lysis-centrifugatie methode aanbevolen en is niet van alle commerciële systemen bekend of deze groei van F. tularensis detecteren [2]. Blinde afenting na 7 dagen op een cysteïne bevattend medium is aan te bevelen. In het directe Grampreparaat van patiëntenmateriaal zijn de kleine coccoïde staafjes van F. tularensis moeilijk te herkennen. Er is een antiserum beschikbaar voor directe immunofluorescentie (CDC). Serologie wordt gebruikt om retrospectief alsnog een diagnose te stellen. Voor een standaardof micro-agglutinatietest is commerciëel antigeen beschikbaar (BBL, Cockeysville, Md.). De interpretatie is soms moeilijk door kruisreactiveit met Brucella spp. F. tularensis is een onbeweeglijk, pleiomorf, klein Gram-negatief staafje, dat obligaat aëroob groeit en geen sporen vormt [2,10]. De bacterie heeftt een dun lipiden-rijk kapsel. Hoewel de bacterie geen sporen vormt, is hij in staat in water, grond en dierkarkassen enige weken te overleven. Net als Legionella spp. is groei en overleving gemeld in amoeben [24]. De bacterie is katalase positief, oxidase negatief (!) en produceert geen urease (tabel 4). Inmiddels is er van F. tularensi nog een derde biovar (novicida) beschreven en is de oxidase-reactie een belangrijk onderscheid met F. philomiragia. De groei wordt bevorderd door de media bij CO2 te incuberen waarbij na 48 uur zeer kleine, grijswitte kolonies zichtbaar zijn op bloedagarplaten of chocolade-agarmedia. De bacterie is voor groei van de aanwezigheid van cysteïne afhankelijk en groeit eerder op een chocolade-agarplaat dan op een bloedagarplaat.

8

Hoewel bij primaire isolatie er wel na 48 uur groei kan ontstaan op bloedagarmedia, lukt het nauwelijks de bacterie over te enten als geen cysteïne wordt toegevoegd. Thayer-Martin medium, thioglycolaat medium of gebufferde charcoal-yeast-extract medium (BCYE) bevatten extra cysteïne en kunnen als alternatief gebuikt kunnen worden. Commerciële identificatiesystemen (Microscan, Api, Vitek) zijn niet in staat F. tularensis goed te determineren. Voor een voorlopige identificatie van verdachte kolonies kan gebuik gemaakt worden van een agglutinerend serum (Difco, Detroit, Michigan). Met behulp van een arbitrary primer (anders dan ERIC of REP) zijn subspecies van F. tularensis te herkennen [25]. Bescherming Er is een levend verzwakt vaccine beschikbaar met een effectiviteit van ongeveer 80% dat in het Amerikaanse leger gebruikt wordt maar waarvan de beschermingsduur niet precies bekend is. Na een mogelijke besmetting wordt ook wel geadviseerd om 14 dagen profylaxe met tetracycline te gebruiken. Antibiotische gevoeligheid Standaard gevoeligheidsbepalingen zijn niet mogelijk, tenzij verrijkte media gebruikt worden. Hoewel streptomycine in vitro en in vivo de beste activiteit heeft, worden nu gentamicine en tetracyclinen in de therapie gebruikt. Carbapenems en chinolonen zijn waarschijnlijk goede alternatieven. Met behulp van E-testen op cysteïne verrijkt medium bij 38 stammen werd een goede gevoeligheid voor chinolonen gevonden [26]. Ook voor de therapie worden chinolonen als tweede keuze aanbevolen [21]. Tabel 4. Identificatie van Brucella, Yersinia en Francisella spp. Bacterie Brucella spp. Actinobacillus spp. Actinobacillus actinomycetemcomitans Haemophilus spp. (not H. influenzae) Francisella. tularensis F.philomiragia Yersinia pestis Cardiobacterium spp.

Groei SBA

CO2

Groei MAC

Oxidase

Catalase

HsS

Motility urease

+ + +

++ + ++

V + -

+/+ -

+ + +

V + +

-

+ + -

+

++

-

-/+

+

V

-

-

+

++

-

-

+

+

-

-

+ + +

++ + ++

+ -

+ +

+ + -

+

-

-

9

Brucellose Kliniek en pathogenese Het genus Brucella is vernoemd naar de Britse militair chirurg David Bruce die in 1887 op het eiland Malta de bacterie voor het eerst isoleerde. Brucellose is een zoönose en de species zijn belangrijke veterinaire pathogenen. Ook insekten en teken kunnen met Brucella soorten besmet zijn. Brucellose soorten hebben een sterke geografische gebondenheid. Brucella abortus komt bij rundvee voor, maar is ook gevonden bij paarden, buffels en bisons. B. melitensis wordt niet alleen bij geiten en schapen gevonden, maar ook bij kamelen en alpaca's. Hoewel B. suis vooral varkens infecteert, wordt de bacterie ook aangetroffen in rundvee, rendieren, hazen en knaagdieren. B. canis (geïsoleerd van honden) is een zeer zeldzame verwekker van brucellose bij mensen. Brucella kan tot 6-10 weken in stof, grond en water overleven. Transmissie van Brucella spp. van dieren naar mensen kan plaatsvinden via ingestie van besmet materiaal, via microtraumata door huid en muceuze membranen en via de respiratoire route. Brucellose is de meest gerapporteerde laboratoriuminfectie voornamelijk door besmetting via aërosolen van culturen die niet in een veiligheidskabinet zijn bewerkt [11,27]. Alle species zijn in staat een laboratoriuminfectie te veroorzaken. Ook in Nederland is in 1986 een epidemie van brucellose onder medewerkers van verschillende laboratoria ontstaan door de verwerking van Brucella bevattende bloedkweken buiten het veiligheidskabinet. Verzending van een "onbekende stam voor nadere determinatie" naar een referentielaboratorium leidde ook daar tot een laboratoriuminfectie. Brucella is een intracellulair groeiend micro-organisme die in de gastheer een granulomateuze onstekingsreactie induceert. Klinisch manifesteert brucellose zich als een acute, subacute of chronische ziekte met algemene symptomen en een typisch intermitterende koort (83%). Vooral de chronische vorm kan zich lokaliseren in organen zoals de lever, botten (spondylodiscitis), gewrichten (sacroiliitis), urogenitaal systeem, ogen, centraal zenuwstelsel, huid, longen en hart [14]. Diagnostiek. De diagnose brucellose kan met een positieve kweek worden gesteld, maar ook met serologie of moleculaire biologie. Meestal zal de diagnose gesteld worden met behulp van een bloedkweek of beenmergkweek. Hoewel vroeger speciale "Bifasische Castaňeda media" werden gebruikt, zijn een aantal geautomatiseerde bloedkweeksystemen ook in staat de groei van Brucella te stimuleren. Vooral van BACTEC 9240 zijn een aantal studies bekend die aantonen dat zonder blinde afentingen en verlengde incubatie Brucella te kweken is uit bloed [28,29,30]. Van de BacT/Alert zijn nog onvoldoende gegevens en is het wel aan te raden de incubatie tot 21 dagen te verlengen [2]. Een recent gepubliceerde studie waarin BacT/Alert bloedkweekflesjes werden besmet met B. melitensis suggereert dat de "enhanced FAN aerobic bottle" geschikt zou zijn [31]. Bij subacute en chronische brucellose wordt aanbevolen toch nog een beenmergpunctie te doen en het materiaal in bloedkweekflesjes of Castaňeda medium te inoculeren, omdat uit 1 studie zou blijken dat dit een hogere opbrengst geeft [32]. Ook is snelle diagnostiek mogelijk met genus-specifieke primers voor Brucella op perifeer bloed of serum [33]. Vooral bij focale complicaties in organen is de PCR gevoeliger dan de kweek; bij 34 patiënten met orgaanlokaties was de PCR positief in 97%, terwijl de kweek slechts in 30% positief was [34]. Inmiddels is een real-time PCR beschreven voor voor de detectie van B. abortus, B. melitensis en B. suis [35]. Brucella spp. groeien als kleine, coccoïde staafjes zonder kapsel of sporen, op standaardmedia zoals bloedagar en chocoladeagarmedia bij een CO2 concentratie van 5-10%. Meestal groeit

10

Brucella na 48-72 uur als kleine, glinsterende en bolle kolonies. Sommige isolaten groeien ook op MacConkey media. Brucella is onbeweeglijk, katalase positief, oxidase positief (uitgezonderd sommige isolaten van B. canis) en urease positief (tabel 4). Er bestaat een commercieel antiserum voor genus specifieke kolonie-agglutinatie (Difco, Detroit, Mich), hoewel B. canis hier niet mee reageert. De 4 species zijn te identificeren met de H2S productie, gevoeligheid voor kleurstoffen en gevoeligheid voor een Tb faag. Met 16SDNA sequencing lukt het niet de verschillende Brucella species van elkaar te onderscheiden [E. Claas, E.Kuijper]. Ook commerciële identificatieystemen (inclusief API 20E, Biomerieux) zijn niet in staat om Brucella goed te herkennen [2,36]. VITEK 2 geeft wel een voorzichtige identificatie van Brucella spp. Voor serologische bevestiging van brucellose wordt nog steeds een standaard agglutinatietest gebruikt met B. abortus antigeen. Er bestaat wel kruisreactie met B. melitensis en B. suis, maar niet met B. canis. Gebruik van 2-mercapto-ethanol (verbreekt de disulfide bruggen in IgM) maakt het mogelijk een onderscheid tussen IgG en IgM antistoffen te maken. Hoewel er meer sensitieve EIA's bestaan, zijn deze niet commercieel beschikbaar. Bij subacute en chronische brucellose worden relatieve lage titers van agglutinerende antistoffen gevonden. De serologie wordt ook gehinderd door kruisreacties met Francisella tularensis en Yersina enterocolitica O:9. Bescherming Er is wel een vacine beschikbaar, maar niet voor humaan gebruik. Antibiotische gevoeligheid Routine gevoeligheidsbepalingen worden niet verricht. De therapie bestaat meestal uit een combinatie van doxycycline en rifampicine voor een periode van 6 weken of bij kinderen cotrimoxazol en een aminoglycoside.

11

Pest Kliniek en pathogenese Het genus Yersinia is benoemd naar Alexander Yersin die in 1894 de verwekker van pest voor het eerst isoleerde. Pest is een van langst bekende infectieziekten. Tot nu toe zijn er waarschijnlijk drie pandemieën geweest (541-544, 1330-1480, 1855 AC) en meer dan 150 epidemieën. In enkele endemische gebieden in Afrika (Tanzanië, Zaire), Amerika (Peru) en Azië (India, Madagascar) waar Y. pestis nu nog voorkomt, worden nog steeds kleine epidemieën bij knaagdieren en mensen gerapporteerd. In de VS worden er per jaar nog ongeveer 15 gevallen aangegeven bij het CDC. Meer dan 200 diersoorten kunnen geinfecteerd worden met Y. pestis, maar knaagdieren zoals muizen, ratten, eekhoorns en gerbils vormen de belangrijkste groep. Transmissie gaat vooral via vlooien, maar is ook via direct contact mogelijk. Vooral vlooien met een grote proventriculus kunnen Y. pestis efficiënt overbrengen, omdat de bacteriën zich daar tot grote aantallen kunnen vermenigvuldigen en door regurgitatie in de bloedbaan van de gastheer komen. Nadat de bacterie via een vlooienbeet lokaal in de bloedbaan is gekomen, ontstaat een primaire bacteriëmie met tevens een hemorragische necrotiserende ontsteking van een lokale lymfeklier (bubo). Afhankelijk van de immuniteit van de gastheer kunnen door een secundaire bacteriëmie verschillende organen worden getroffen met onder andere een pneumonie of meningitis als gevolg. Via de respiratoire route kan Y. pestis worden overgedragen naar andere dieren of mensen. Deze route wordt het meest gevreesd bij gebruik van Y. pestis als een biologisch wapen. Besmetting via de respiratoire route leidt tot "primaire longpest" met de verschijnselen van acute, lobaire pneumonie, koorts en koude rillingen en met opgeven van bloederig sputum. Patiënten met pneumonie door Y. pestis kunnen via aërosolen andere mensen besmetten! Yersinia pestis is een Gram-negatief staafje dat geen sporen vormt en lang kan overleven in grond en water. Het genus Yersinia (met DNA-DNA hybdridisatie ongeveer 25% verwant met andere genera uit de Enterobacteriaceae) omvat 10 soorten, waarvan Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis en Y. pestis de belangrijkste zijn. Hoewel de WHO heeft voorgesteld de zeer sterk op elkaar gelijkende soorten pseudotuberculosis en pestis taxonomisch als 1 species te benoemen, is dit door een storm van protesten niet ingevoerd [37]. Recent is het complete genoom van Y. pestis gepubliceerd en bleken er opvallend veel insertiesequenties en genen van andere bacteriën en virussen aanwezig te zijn [38]. Y. pseudotuberculosis en pestis hebben een topisme voor lymfatisch weefsel en beschikken over groot aantal identieke virulentiekenmerken. De meeste virulentiegenen zijn op een 70-75 kb plasmide gelegen; verlies van het plasmide betekent afgenomen virulentie. De genen op dit plasmide van Y. pestis coderen voor eiwitten die de fagocytose remmen (YopE, YopH, YopM, LcrV), eiwitten die bij de excretie betrokken zijn (Ysc) en andere regulerende eiwitten (Lcr). Y. pestis bevat op het chromosoom genen voor hechting (Ail) en invasie (Inv) en een belangrijk pathogenicity island (het pgm locus) dat bij de ijzerhuishouding betrokken is. Diagnostiek. De directe microsopie van verdacht patiëntenmateriaal is belangrijk voor een eerste indruk over de aanwezigheid van Yersinia pestis. In sputum of een uitstrijk van een bubo zal Y. pestis zichtbaar zijn als een bipolair aankleurend staafje in een methyleenblauwkleuring of een klein coccoïd staafje in de Gram-kleuring. Met behulp van directe immunofluorescentie met antiserum tegen het F1 kapsel antigeen (niet commercieel verkrijgbaar) kan de diagnose bevestigd worden. Ook is er een PCR beschreven met primers voor het gen van kapsel F1, maar de test is niet op klinische monsters gevalideerd [39]. Naast aselectieve media, worden

12

ook selectieve media aanbevolen voor de isolatie van Y. pestis uit sputa, biopten, bubones of materialen waar ook commensale flora aanwezig kan zijn. Een cefsulodin-irgasannovobiocine-medium (met een verlaagde concentratie van 4 mg/l cefsulodin) is zeer geschikt, vooral als het medium wordt geincubeerd bij 28 °C voor 7 dagen. Dit CIN-medium kan ook als een aankweekmedium worden gebruikt. Bloedkweken kunnen in commerciële systemen worden afgenomen. Hoewel Y. pestis een optimale groeitemperatuur heeft bij 25-28 °C, is de bacterie op routine media in het laboratorium na 24 uur incubatie bij 35 °C wel als groei met kleine "pinpoint" kolonies zichtbaar. Na 48 uur wordt het mucoïde aspect zichtbaar en krijgt de kolonie onregelmatige randen en een "fried-egg" uiterlijk. Hoewel op de kolonies ook een directe immunofluorescentie kan worden verricht, is dit niet aan te raden bij groei van kolonies bij 28 °C omdat hierbij de kapselgenen niet tot expressie komen [40]. Voor de identificatie van Y. pestis geldt dat lage incubatietemperaturen gebruikt moeten worden voor de relatief metabool inactieve bacterie (tabel 4). Een belangrijk verschil met andere Yersinia species is de onbeweeglijkheid van Y. pestis bij 28 °C. Y. pestis fermenteert alleen wat glucose (zonder gas) en is negatief voor decarboxyleringsrecaties, urease productie en indol productie. Y. pestis wordt door een aantal commerciële identificatiesystemen herkend, zoals API 20E, MicroScan en Vitek. De diagnose kan ook serologisch worden gesteld met een EIA gericht tegen het F1 kapselantigeen (CDC, Atlanta, Ge) [40]. Ook deze test is niet commercieel beschikbaar. Bescherming. Hoewel er twee vaccines beschikbaar zijn, is de beschermende werking niet echt goed bekend. Het vaccine van Instituut Pasteur bestaat uit een levende verzwakte (pgmdeficiënte) stam, terwijl het Amerikaanse vaccine bestaat uit een formaline geinactiveerde stam. Voor mensen die in nauw contact zijn geweest met een patiënt bij wie pneumonie door Y. pestis is gediagnosticeerd, wordt wel aanbevolen 1 week 7 dagen tetracycline of cotrimoxazol voor te schrijven. Antibiotische gevoeligheid. Standaard gevoeligheidsbepalingen voor Y. pestis zijn nodig om verworven resistentie aan te kunnen tonen tegen tetracycline, chlooramphenicol, cotrimoxazol en amoxicilline. Een verontrustende publicatie van een multidrug-resistente stam uit Madagascar heeft bevestigd dat deze resistentie via plasmiden overdraagbaar is [41]. Een real-time PCR is ontwikkeld voor de detectie van ciprofloxacine resistente Y. pestis [42].

13

Q-fever Kliniek en pathogenese Q-koorts is een zoönose. In 1935 werd de uitdrukking "Q (query)-fever" voor het eerst gebruikt bij een koortsende ziekte bij 20 werknemers in een vleesverwerkingsbedrijf in Brisbane. Uit bloed en urine van deze patiënten werd Coxiella burnetii geisoleerd. Deze bacterie komt wereldwijd voor bij rundvee, schapen en geiten, maar ook bij vele andere dieren zoals paarden, honden, katten, konijnen, duiven en andere vogels [43]. In meer dan 40 tekensoorten is C. burnetii aangetroffen. C. burnetii bevindt zich vooral in de uterus en mammae van geinfecteerde dieren. In de zwangerschap kan C. burnetii gereactiveerd worden en aanleiding geven tot abortus of vroeggeboorte. Tijdens de partus worden grote hoeveelheden uitgescheiden en via aërosolen kan overdracht naar de mens plaatsvinden. Er zijn ook aanwijzingen dat via besmette dierlijke producten, zoals melk, overdacht naar de mens kan plaatsvinden [44]. Hoewel ongeveer 50% van de infecties met C. burnetii symptoomloos verloopt, zijn er drie duidelijke klinische manifestaties: een kortdurend (2-14 dagen) self-limited koortsend ziektebeeld, een pneumonie of hepatitis. Zeldzamer zijn endocarditis en neurologische ziektebeelden. Mens naar mens besmetting is extreem zeldzaam en is alleen in de oudere literatuur zeer sporadisch gerapporteerd. C. burnetii is intracellulair levend, pleiomorfe Gram-negatieve bacterie (0.3-0.7 µm) die sporen kan vormen. De sporen kunnen lang overleven bij lage temperatuur (10 maanden bij 15-20 °C). De bacterie kleurt niet in een Gram-kleuring, maar wel in een zilverkleuring (Gimenez-kleuring, Whartin Starry kleuring). C. burnetii kan in 2 verschillende fasen voorkomen. C. burnetii in fase 1 is virulent en wordt geisoleerd bij dieren en mensen. Na een aantal passages in weefselkweken komen er veranderingen in het lipopolysaccharide waardoor een avirulente fase 2 ontstaat [45]. Diagnostiek. Patiëntenmateraal dat C. burnetii bevat, zal op het laboratorium met beheersingniveau 3 moeten worden verwerkt. Hoewel met directe immunofluorescentie C. burnetii in patiëntenmateriaal kan worden aangetoond, is er een belangrijkere plaats voor de PCR met voor C. burnetii specifieke primers [46,47,48]. Kweek van C. burnetii is mogelijk met behulp van continue cellijnen (zoals Verocellen) of inoculatie van proefdieren (muizen, cavia's). Meestal wordt de diagnose serologisch gesteld met een indirecte immunofluorescentietest, complementbindingsreactie of EIA waarbij fase 1 en 2 antigenen gebruikt worden. Er is kruisreactiviteit van C. burnetii met Bartonella spp. en Chlamydia pneumoniae [49]. Bij acute infecties zijn de antistoftiters tegen fase II antigeen hoger dan tegen fase I. Pas 4 maanden na de infectie bereiken de antistoffen tegen fase I hun hoogste waarde. IgM antistoffen kunnen lang persisteren (tot langer dan 6 maanden) en zijn in een éénmalig afgenomen serum van beperkte waarde voor de diagnostiek. Bij chronische infecties (endocarditis) zijn vooral antistoffen tegen fase 1 antigeen verhoogd.

Bescherming. Hoewel er een aantal nog niet geregistreerde vaccines verkrijgbaar zijn, worden er nog geen aanbevelingen gedaan personen met een verhoogd risico (bv abattoirwerkers) te vaccineren.

14

Antibiotische gevoeligheid Gegevens van antimicrobiële gevoeligheid zijn verkregen met proefdiermodellen en weefselkweekexperimenten. Beta-lactam antibiotica zijn niet actief, maar tetracyclinen, chlooramfenicol, chinolonen, co-trimoxazol, rifampicine en macroliden hebben bacteriostatische activiteit. Verworven mutaties in gyrA zijn geassocieerd met ongevoeligheid van C. burnetii voor ciprofloxacine.

15

Botulisme Kliniek en pathogenese Al in de negentiende eeuw werden in Europa epidemieën gemeld van paralytische ziekte na het eten van worst die besmet was met botulinustoxine. In 1897 toonde de Belgische microbioloog van Ermengen aan dat een toxine geproduceerd door Clostridium botulinum paralyse bij proefdieren veroorzaakte. De strikt anaërobe sporenvormende Gram-positieve staaf Clostridium botulinum is in staat 7 (A-G) verschillende hitte-labiele neurotoxinen te produceren, waarvan typen A, B, E en F bij mensen symptomen kunnen veroorzaken [2,10,14]. Van type G is nog niet bekend of het bij mensen ziekte kan verorzaken. Anders dan het toxine, zijn de sporen zeer hitte-resistent. De neurotoxinen kunnen ook door andere Clostridium soorten worden geproduceerd, zoals C. butyricum, C. baratii en C. argentinense. Afhankelijk van de porte d' éntree worden 3 syndromen onderscheiden: wondbotulisme, food-borne botulisme en intestinale botulisme. Botulisme is niet van mens naar mens overdaagbaar. Elk jaar worden er ongeveer 100 patiënten met botulisme aangegeven bij het CDC, voornamelijk bij kinderen (75%). Epidemieën zijn meestal geassocieerd met voedsel dat besmet is geraakt met C. botulinum die in een anaërobe milieu neurotoxinen hebben geproduceerd (worst, ingeblikt voedsel). Ook voedsel dat "thuis" bereid is, zoals honing en geweckt voedsel, kan toxine van C. botulinum bevatten. Het toxine wordt (12-72 uur na ingestie of inhalie) uit een wond of duodenum/jejunum geabsorbeerd en bereikt via de circulatie de perifere cholinergische synapsen [50]. Na binding aan presynaptische receptoren en endocytose remt het toxine de release van acetylcholine. Hierdoor geeft presynaptische stimulatie geen release van transmitter en ontstaat er paralyse en autonome dysfunctie. Botulisme begint als een acute, dubbelzijdige neuropathie van hersenzenuwen met spierzwakte. Klinisch manifesteert botulisme zich als een droge mond, dubbelzien, verwijde pupillen, ptosis, moeilijkheden met slikken en met praten. Symmetrisch worden ook de spieren van bovenste extremiteiten, romp en onderste extremiteiten aangedaan. Door glottisdysfunctie en aantasting van de ademhalingspieren en van het diafragma is beademing noodzakelijk. De mortaliteit is ongeveer 60% als geen behandeling wordt ingesteld. Het botulisme toxine is het toxine met de laagste LD50: 1 nanogram/kg!! Diagnostiek. De diagnose zal vooral klinisch worden gesteld. Uit wonduitstrijken, voedsel en feces kan C. botulinum gekweekt worden die vervolgens onderzocht moeten worden op het vermogen toxinen te produceren. Het toxine en de bacterie (in de feces) kunnen tot 1 maand na het begin van de ziekte nog aantoonbaar zijn. Meestal wordt serum ingestuurd voor onderzoek naar de aanwezigheid van neurotoxinen met een muizenbioassay of met EIA. Ook verdacht voedsel kan onderzocht worden op de aanwezigheid van het neurotoxine. Patiëntenmaterialen zullen op heheersingsniveau 3 verwerkt moeten worden. Bij 309 patiënten met een klinische diagnose botulisme die in de periode van 1975 tot 1988 op het CDC (Atlanta, Georgia, VS) nader werden onderzocht, lukte het in 65% de diagnose te bevestigen met een positieve feceskweek of het aantonen van toxinen in serum en feces. Voor de behandeling van botulisme is een een trivalent (typen A, B en E) paarden-antitoxine beschikbaar (CDC, Atlanta, Georgia). Een belangrijke nadeel van de therapie is de overgevoeligheidsreactie die op het paardenserum kan ontstaan (9-20%) zodat voor toediening een huidtest moet worden verricht. Bij een wondinfectie of een porte d'éntree

16

vanuit het maagdamkanaal, is ook een antibiotische therapie geindiceerd met penicilline of metronidazol. Bescherming. De belangrijkste preventieve maatregel bestaat uit een goede voedselhygiëne waarbij het voedsel voldoende moet worden verhit om het hitte-labiel toxine te inactiveren. Er ontstaat na een doorgemaakte infectie waarschijnlijk geen beschermende immuniteit tegen het botulisme toxine [51]. Er wordt aan een vaccine gewerkt: nu is er slechts een experimenteel vaccine beschikbaar [52].

17

WEBSITES ! ! ! ! ! !

Office of Health and Safety Information system (CDC): www.cdc.gov/od/ohs/ Dvision of Healthcare Quality Promotion (CDC): www.cdc.gov/ncidod/hip/ Public Health Image Library (CDC): phil.cdc.gov/ WHO: Communicable Disease Surveillance and Response: www.who.int/emc CDC bioterorrism: www.bt.cdc.gov Public Health Laboratory Service, UK: www.phls.co.uk

18

Referenties 1. Kingma JH, Wijngaarden JK. Infectieziekten als wapen: waakzaamheid geboden. Ned tijdschr Geneeskd 2001:145;2364-65. 2. WF Klietmann, KL Ruoff: Bioterrorism: implications for the clinical microbiologist. Clin Microbiol Rev 2001:14;364-381. 3. Franz DR, Jahring PB, Friedlander AM et al. Clinical recognition and management of patients exposed to biological warfare agents. JAMA 1997:278;399-411. 4. Lindstrom M, Keto R, Markkula A, Nevas M, Hielm S, Korkeala H. Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types A, B, E, and F in Food and Fecal Material. Appl Environ Microbiol 2001:67;5694-9 5. McDonald R, Cao T, Borschel R. Multiplexing for the detection of multiple biowarfare agents shows promise in the field. Mil Med 2001:166;237-9 6. O'Brien T, Johnson LH 3rd, Aldrich JL, Allen SG, Liang LT, Plummer AL, Krak SJ, Boiarski AA. The development of immunoassays to four biological threat agents in a bidiffractive grating biosensor. Biosens Bioelectron 2000:14;815-2. 7. Török TJ, Tauxe RV, Wise RP et al. A large community outbreak of salmonellosis caused by intentional contamination of restaurant salad bars. JAMA 1997:278;389-95. 8. Christopher GW, Ceislak TJ, Pavlin JA, Eitzen EM. Biological Warfare; a historical perspective. JAMA, 1997:2768; 412-417. 9. Harris S. Japanese biological warfare research on humans; a case study on microbiology and ethics. Ann NY Acad Sci 1992;666:21-52. 10. Manual of Clinical Microbiology, 7edition, ASM press 1999 (eds: PR Murray, EJ Baron, MA Pfaller, FC Tenover, RH Yolken). 11. Schellekens H (ed). Veilig werken met micro-organismen, parasieten en cellen in laboratoria en andere werkruimten. Nederlandse Vereninging voor Microbiologie, tweede druk, Bilthoven, 2000. 12. Inglesby TV, henderson DA, Bartlett JG et al. Anthrax as a biological weapon; medical and public health management. Working group on civilian biodefense. JAMA 1999:281;1735-45. 13. Swartz MN. Recognition and management of Anthrax-an update. N Eng J Med 2001:345;1621-26. 14. Principles and Practise of Infectious Diseases. Churchill Livingstone, 2000: fifth edition (eds: Mandell GL, Bennett JE, Dolin RD). 15. Friedlander AM, Welkos SL, Pitt MLM et al. Postexposure prophylaxis against experimental inhilation anthrax. J Infect Dis 1993:167;1239-43. 16. Harrison LH, Ezzell JW, Abshire TG, Kidd S, Kaufmann AE. Evaluation of serologic tests for diagnosis of anthrax after an outbreak of cutaneus anthrax in Paraquay. J Infect Dis 1989:160;706-10. 17. Evans ME, Gregory DW, Schaffner W, McGee ZA. Tularemia: a 30-year experience with 88 cases. Medicine 1985:64;251-69. 18. Bell JF, Stewart SJ. Chronic shedding tularemia nephritis in rodents: posible relation to occurrence of Francisella tularensis in lotic waters. J Wildl Dis 1975:11;421-30. 19. Wicki R, Sauter P, Mettler C, Natsch A, Enzler T, Pusterla N, Kuhnert P, Egli G, Bernasconi M, Lienhard R, Lutz H, Leutenegger CM. Swiss Army Survey in Switzerland to determine the prevalence of Francisella tularensis, members of the Ehrlichia

19

phagocytophila genogroup, Borrelia burgdorferi sensu lato, and tick-borne encephalitis virus in ticks. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000:19;427-32. 20. Feldman KA, Enscore RE, Lathrop SL et al. An outbreak of primary pneumonic tularemia on Martha's Vineyard. N Engl J Med 2001:345;1601-6. 21. Dennis DT, Inglesby TV, Henderson DA et al; Working Group on Civilian Biodefense. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management JAMA 2001:285;2763-73. 22. Sjöstedt A, Tärnvik A, Sandström G. Francisella tularensis: host-parasite interaction. FEMS Immunol Med Microbiol 1996:13;181-4. 23. Johansson A, Berglund L, Eriksson U, Goransson I, Wollin R, Forsman M, Tarnvik A, Sjostedt A. Comparative analysis of PCR versus culture for diagnosis of ulceroglandular tularemia. J Clin Microbiol 2000:38;22-6. 24. Berdal BP, Mehl R, Meidell NK, Lorentzen-Styr AM, Scheel O. Field investigation of tularemia in Norway. FEMS Immunol Med Microbiol 1996:13;191-5. 25. Johansson A, Ibrahim A, Goransson I, Eriksson U, Gurycova D, Clarridge JE 3rd, Sjostedt A. Evaluation of PCR-based methods for discrimination of Francisella species and subspecies and development of a specific PCR that distinguishes the two major subspecies of Francisella tularensis.J Clin Microbiol 2000:38;4180-5. 26. Ikaheimo I, Syrjala H, Karhukorpi J, Schildt R, Koskela M. In vitro antibiotic susceptibility of Francisella tularensis isolated from humans and animals. J Antimicrob Chemother 2000:46;287-90 27. Corbel MJ. Brucellosis: an overview. Emerging Infect Dis 1997:3;213-221. 28. Bannatyne RM, Jackson MC, Memish Z. Rapid diagnosis of Brucella bacteremia by using the BACTEC 9240 system. J Clin Microbiol 1997:35;2673-4. 29. Yagupsky P, Peled N, Press J, Abramson O, Abu-Rashid M. Comparison of Bactec 9240 Peds Plus medium and Isolator 1.5 microbial tube for detection of Brucella melitensis from blood cultures. J Clin Microbiol 1997:35;1382-1384. 30. Yagupsky P. Detection of brucellae in blood cultures. J Clin Microbiol 1999:37;3437-42. 31. Sumerkan B, Gokahmetoglu S, Esel D. Brucella detection in blood: comparison of the BacT/Alert standard aerobic bottle, BacT/Alert FAN aerobic bottle and BacT/Alert enhanced FAN aerobic bottle in simulated blood culture. Clin Microbiol Infect 2001:7;369-72. 32. Gotuzzo E, Carrillo C, Guerra J, Llosa L. an evaluation of diagnostic methods for brucellosis-the value of bone marrow cultures. J Infect Dis 1986:153;122-25. 33. Zerva L, Bourantas K, Mitka S, Kansouzidou A, Legakis NJ. Serum is the preferred clinical specimen for diagnosis of human brucellosis by PCR. J Clin Microbiol 2001:39;1661-4. 34. Morata P, Queipo-Ortuno MI, Reguera JM, Miralles F, Lopez-Gonzalez JJ, Colmenero JD. Diagnostic yield of a PCR assay in focal complications of brucellosis. J Clin Microbiol 2001:39;3743-6. 35. Redkar R, Rose S, Bricker B, DelVecchio V. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis. Mol Cell Probes 2001:15;43-52 36. Barham WB, Church P, Brown JE, Paparello S. Misidentification of Brucella species with use of rapid bacterial identification systems. Clin Infect Dis 1993:17;1068-69. 37. Williams J. Warning on a new potential for laboratory-acquired infections as a result of the new nomenclature for the plaque bacillus. WHO 1983:61;545-46. 38. Parkhill J, Wren BW, Thomson NR, et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature 2001:4;413:523-7 39. Norkina OV, Kulichenko AN, Gintsburg AL et al. Development of a diagnostic test for Yersinia pestis by the polymerase chain reaction. J Appl Bacteriol 1994:76;240-5.

20

40. Perry RD, Fetherston JD. Yersinia pestis-etiologic agent of plaque. Clin Microbiol Rev 1997:10;35-66. 41. Galimand M, Guiyoule A, Gerbaud G et al.. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a tranferable plasmid. N Engl J Med 1997: 337:677-80. 42. Lindler LE, Fan W, Jahan N. Detection of Ciprofloxacin-Resistant Yersinia pestis by Fluorogenic PCR Using the LightCycler. J Clin Microbiol 2001:39;3649-55. 43. Baca OG, Patersky D. Q fever and Coxiella burnetii; a model for host-parasite interaction. Microbiol Rev 1983:47;127-149 44. Fishbein DB, Raoult D. A cluster of Coxiella burnetii infections associated with exposure to vaccinated goats and their unpasteurized dairy products. Am J Trop Med Hyg 1992:47;35-40. 45. Schramek S, Mayer H. Different sugar compositions of lipopolysaccharides isolated from phase I and pure phase II cells of Coxiella burnetii. Infect Immun 1982:38;53-57. 46. Raoult D, Lauren JC, Mutillod M. Monoclonal antibodies to C. burnetii for antigenic detection in cell cultures and in paraffin embedded tissues. Am J Clin Pathol 1994:101;318-20. 47. Stein A, Raoult D. Detection of C. burnetii by DNA amplification using polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992:30;2462-66. 48. Fritz E, Thiele H, Willems H, Wittenbrink MM. Quantification of C. burnetii by PCR and a calorimetric microtiter plate in hybridization assay (CMHA). Eur J Epidemiol 1995:11;549-75. 49. La Scola B, Raoult D. Serological cross-reactions between Bartonella quintana, B, henselae and Coxiella burnetii. J Clin Microbiol 1996:34;2270-74. 50. Arnon SS, Schechter R, Inglesby TV et al ; Working Group on Civilian Biodefense. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA 2001:285;1059-70. 51. Beller M, Middaugh JP. Repeated type E botulism in an Alaska Eskimo. N Eng J Med 1990:322;855. 52. Byrne MP, Smith LA. Development of vaccines for prevention of botulism. Biochimie 2000:82;955-66.

21