MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ

AGRONOMICKÁ FAKULTA

ÚSTAV MORFOLOGIE, FYZIOLOGIE A GENETIKY ZVÍŘAT

IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU POMOCÍ METODY PCR

Diplomová práce Brno 2010

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Hana Pitrunová

1

2

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Identifikace živočišných druhů v krmivu pomocí metody PCR vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MU v Brně.

V Kelči dne 24. dubna 2010

…………………………………..

3

Poděkování

Děkuji svému vedoucímu práce panu prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za umožnění vypracování diplomové práce a Ing. Michaele Nesvadbové za laboratorní vedení a odborné rady při zpracování.

4

Abstrakt Na kvalitu krmiv pro psy jsou kladeny stále větší požadavky. Optická mikroskopie je v současné době uznána v zemích Evropské unie jako jediná referenční metoda pro detekci živočišného proteinu v krmivech. Touto metodou nelze přesně identifikovat jednotlivé živočišné druhy, a proto jsou stále více používány přesnější metody založené na analýze DNA.

Tato práce byla zaměřena na identifikaci jednotlivých živočišných druhů v krmivu pro psy pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Byla ověřována specifita primerů pro PCR reakci, které byly převzaty ze tří publikací, na DNA z kura domácího, krůty, skotu, prasete, koně, ovce, makrely a lososa. Pouze jedna sada primerů byla vhodná pro specifickou identifikaci druhů, protože vytvářela specifický produkt pouze s těmi druhy DNA, pro které byla určena. Tyto primery byly následně použity k testování krmiv pro psy.

U většiny krmiv odpovídala detekovaná DNA složení, které uvádí výrobce na obalu. Přesto u některých krmiv bylo zjištěno porušení deklarované receptury výrobcem, náhradou jakostního druhu masa za suroviny méně hodnotné. Ve 20 testovaných krmivech byla nejčastěji přítomná DNA kura domácího (95 %), dále DNA prasete (70%), skotu (60%), ovce (25%) a DNA koně nebyla detekována u žádného z testovaných vzorků.

Klíčová slova: PCR, druhově specifické primery, mitochondriální DNA, krmiva, živočišný druh

5

Abstract

There are ever-increasing demands for higher quality feedstuffs. At the current time, the classic microsophy method is considered to be the only reference method for the identification of animal protein in feedstuffs. This method cannot be used for an exact identification of animal species and that is why more accurate methods based on DNA analysis are now available for use.

The aim of this work was to identify animal species in dogs` feedstuffs using the polymerase chain reaction (PCR) method. The specifity of primers taken from three different manufacturers have been tested with DNA extracted from chicken, turkey, cattle, pig, horse, sheep, scomber and salmon. Only one set of primers was suitable for species identification because of providing specific product only with that species for which was determined. These primers were used for dogs` feedstuffs testing.

In the majority of feedstuffs tested, the detected DNA was in agreement with the consitituent composition specified by the manufacturers. However, the composition of a small number of feedstuffs were found to differ from those specified by manufacturers where high quality meat was replaced with less valuable material. Out of 20 tested feedstuffs the most present was the DNA of chicken (95 %), then the DNA of swine (70 %), bovine (60 %), ovine (25 %). Horse DNA was not detected in any of them.

Key words: Polymerase chain reaction, species specific primers, mitochondrial DNA, feedstuffs, animal species

6

Obsah 1 Úvod…………………………………………………………………………………………..…… 9 2 Cíl práce……………………………………………………………………………………..…… 10 3 Literární přehled…………………………………………………………………………..…… 11 3.1 Výroba krmiv pro psy v České republice…………………………………..……. 11 3.1.1 Granulovaná krmiva ………………………………………………………… 12 3.1.2 Konzervovaná krmiva………………………………………...…………….. 12 3.2 Důvody detekce živočišných druhů v krmivu…………………………..…….… 13 3.3 Metody používané k detekci živočišných bílkovin v krmivu ………….…..… 15 3.4 Metody založené na proteinové analýze………………………………...………. 17 3.4.1 Klasická mikroskopie……………………………………………………..… 17 3.4.2 Blízké infračervené zobrazování ………………………………………… 18 3.4.3 Blízká infračervená mikroskopie (NIRM) ………………………….……

19

3.4.4 Blízká infračervená spektroskopie …………………………………..….. 19 3.4.5 Detekce pomocí imunoesejí ……………………………………………..

20

3.4.6 Chromatografické metody …………………………………………..…… 20 3.4.7 Olfaktometrické metody …………………………………………….….… 21 3.5. Metody založené na DNA analýze ………………………………………….……

21

3.5.1 Metody založené na DNA hybridizaci ……………………………….….

24

3.5.2 Metody založené na PCR …………………………………………..….… 25 3.5.2.1 Sekvenování PCR produktu založené na mtDNA……….…

28

3.5.2.2 Restrikční štěpení PCR produktů …………………………… 29 3.5.2.3 Druhově specifické PCR primery ……………………………

30

3.5.2.4 Analýza konformačního polymorfismu jednořetězců ……..

31

3.5.2.5 Náhodná amplifikace polymorfní DNA …………..…………

31

3.5.2.6 Použití aktin multigenové rodiny ……………………………

32

3.5.2.7 Použití mikrosatelitních markerů …………………………....

33

3.5.2.8 Array technologie a mikročipy ………………………………

33

3.5.2.9 Real time PCR ………………………………………………..

34

3.5.2.10 Multiplex PCR………………………………………………..

35

7

3.5.3 Ostatní metody…………………………………………….……………….. 36 3.5.3.1 Metoda založená na elektrochemických biosenzorech……. 36 3.5.4 Kvalitativní a kvantitativní možnosti identifikace živočišných druhů.…. 37

4 Materiál a metodika práce ……………………………………………………………….….. 39 4.1 Izolace genomové DNA z krmiva kolonkovou metodou a elektroforéza..…… 41 4.2 Koncentrace DNA …………………………………………………………………… 42 4.3 Ověřování specifity primerů ………………………………………………………. 42 4.4 Detekce živočišných druhů v krmivech …………………………………………

45

5 Dosažené výsledky a diskuse …………………………………………………….……….. 45 5.1 Výsledky izolace DNA …………………………………………………...………….. 45 5.2 Výsledky koncentrace DNA ……………………………………………..…………. 47 5.3 Specifita primerů ……………………………………………………….……………. 47 5.4 Výsledky detekce živočišných druhů v krmivech ……………………..………. 51

6 Závěr …………………………………………………………………………………….………… 57 7 Seznam použité literatury ………………………………………………………….……….. 59 8 Seznam tabulek…………………………………………………………………….…………….. 64 9 Seznam obrázků………………………………………………………………….………………. 65

8

1 Úvod Základem při výrobě krmiv je zachování jejich nutriční hodnoty a kvality surovin. Zahrnutí jednotlivých komponent do směsí bylo založeno na přirozených krmných požadavcích karnivorů, omnivorů i herbivorů. Psi jsou sice domestikováni již tisíce let, ale genetická rozdílnost mezi psem a vlkem je méně než 0,3 %. Pes je masožravec a jeho trávící soustava je uzpůsobena ke zpracování masité potravy. Trávicí ústrojí psa je poměrně krátké a potrava jím tak prochází rychle. Tudíž masožravci nejsou schopni využít nebílkovinné živiny z potravy jako býložravci. Na druhé straně je pes schopen pozřít velké kusy masa, a v tomto stavu je i trávit. V průběhu domestikace se trávicí trubice prodloužila a pes je dnes schopen strávit i potravu rostlinného původu. Maso je však pro psa velmi důležité a jeho úplná absence v potravě má za následek nedostatečný příjem živin. Přesto bylo zjištěno, že hodně granulovaných krmiv je složeno z obilovin a rostlinného materiálu, což jejich požadavkům neodpovídá. Proteiny živočišného původu obsahují více esenciálních aminokyselin než rostlinný materiál, který je z větší části pro karnivory nestravitelný. Do krmiv pro psy jsou obiloviny přidávány, protože jsou levnější než produkty z masa a mají schopnost vázat dohromady všechny přísady v krmné surovině.

Zákazníci se nyní začínají více zajímat o složení krmiv, které pro své zvířata nakupují a kladou se větší požadavky na kvalitu kupovaných krmiv než tomu bylo doposud. Z tohoto důvodu se zvyšuje i význam laboratorních kontrol hodnotících složení krmných směsí. Kvůli obavám o kvalitu potravin a krmiv se stále zvyšuje potřeba přesných a spolehlivých metod pro identifikaci živočišných druhů. Díky rozvoji molekulární biologie bylo objeveno mnoho metod, které umožňují detekci živočišných druhů téměř v jakémkoli organickém substrátu. Stále se zavádí nové regulace splňující ochranné standardy v potravním řetězci, proto lze očekávat, že metody pro ověřování potravin a krmiv se budou nadále vyvíjet vzhledem k jejich vyšší efektivnosti, přesnosti a finanční nenáročnosti.

9

2 Cíl práce Diplomová práce byla zaměřena na využití molekulární biologie pro DNA analýzu vybraných granulovaných a konzervovaných psích krmiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo otestování specifity primerů převzatých od třech různých autorů na vyizolovaných osmi živočišných druzích DNA. Dále použití vhodných primerů pro identifikaci pěti živočišných druhů (kur domácí, skot, ovce, prase a kůň) ve 20 testovaných krmivech metodou PCR. Následné porovnání efektivnosti PCR metody s použitím druhově specifických primerů s dalšími metodami využívanými k detekci živočišných druhů v krmivu. A v neposlední řadě také srovnání výsledků se složením uvedeným výrobci na obalech.

10

3 Literární přehled 3.1 Výroba krmiv pro psy v České republice Český trh s krmivy pro domácí zvířata má velký potenciál dalšího růstu. Granulované a konzervované krmivo pokrývá pouze 40 % výživových potřeb domácích zvířat na rozdíl od západních zemích, kde se tato hranice pohybuje okolo 60 %. V nejvyspělejších zemích je podíl průmyslově vyráběné stravy v porovnání s domácí ještě vyšší. Prodej průmyslově vyráběné potravy pro psy a kočky minulý rok rostl co do objemu i hodnoty. Někteří zákazníci se však začínají více ohlížet na cenu výrobků a nakupují krmiva v hypermarketech a diskontních prodejích. Avšak čím dál více chovatelů se začíná zaměřovat na kvalitní suroviny a přídavky, které se používají při výrobě prémiových a superprémiových krmiv. Kvalitním prémiovým krmivům dávají přednost chovatelé větších plemen a výstavních zvířat. Takoví zákazníci mají zájem o segmentaci výrobků specielně podle plemene a zatížení. Granule upřednostňují především chovatelé větších plemen a konzervovaná krmiva zase chovatelé malých plemen. V domácnostech narůstá počet psů malých plemen, a proto se předpokládá zvýšení prodeje konzervovaných krmiv. Nicméně největší objem prodeje bude stále v krmivech suchých díky jejich nenáročnosti na přípravu, skladování a ekonomické výhodnosti oproti konzervovaným krmivům. V současné době se začíná také hovořit o syrové stravě stylu BARF – Bones And Raw Food (kosti a syrová strava), která by měla vycházet z nejpřirozenějšího životního stylu psa. Přesto i tato strava má své negativní stránky, jako zajištění zdravotní nezávadnosti, ekonomickou a časovou náročnost na přípravu

krmiv

(KOUCKÁ, 2008).

Technologicky vyráběná krmiva poskytují velké množství výhod oproti doma připravovaným krmivům, jako je např. stálá receptura složení živin, vitaminů, minerálů a dalších látek. Předpokládá se, že se v budoucnu bude zvětšovat zájem o průmyslová krmiva, jelikož nyní pouze tři zákazníci z deseti kupují tyto výrobky oproti západní Evropě, kde je to sedm zákazníků z deseti (ANONYM, 2010).

11

3.1.1 Granulovaná krmiva Granulovaná krmiva se vyrábí procesem extruze za pomocí extrudéru, který je vyroben z intaktní nerezové oceli, aby nedocházelo ke kontaminaci zpracovávaného materiálu. Extruze je tepelná úprava krmiv založená na HTST (high temperature short time) – vysoká teplota po krátký čas, což bývá ke zpracovanému krmivu šetrné. Jde o tepelné a mechanické působení na suroviny jako jsou obiloviny, maso, tuky, oleje a doplňkové látky. Dnes je povinností, aby každá vstupní surovina měla číslo šarže výroby a své označení. Granule vyráběné v České republice používají systém kontroly jakosti ISO 9001. Postup extruze: smíchání obvykle velkého objemu surovin (některé suroviny se před mícháním rozmělňují mletím). Rovnoměrná velikost surovin ovlivňuje další zpracování – absorpci vody, pasáž přes extrudér, vaření, vzhled a stravitelnost krmiva, míchání ingrediencí, hnětení těsta, kynutí a vaření – probíhá v extrudéru, který svým šroubem žene, míchá a vaří hmotu, vaření a krájení – směs je protlačována otvory přes formu na konci extrudéru. Při průchodu formou hmota dosahuje až 200 °C při vlhkosti 25 %, sušení a chlazení – probíhá v sušičce, snížení vlhkosti na 10 %, pokrytí vrstvou ochucovadla (ANONYM, 2009a) .

Podle KOUBALOVÉ (2009) se granule vyrábí při tlaku 50 – 60 atmosfér a 80 – 95 °C. Suroviny používané jako zdroj bílkovin v krmivu musí obsahovat nejméně 20 % bílkovin v sušině. Do granulovaných krmiv se používá drůbeží maso, jehněčí maso, ryby, vedlejší suroviny živočišného původu, sója, kukuřice, rýže, vejce atd.

3.1.2 Konzervovaná krmiva Konzervovaná krmiva jsou většinou lépe přijímána zvířaty, ale složením nemusejí být o nic hodnotnější než granulovaná. Jsou obvykle zpracovávaná pasterizací ve vodní lázni do 100 °C, nebo v autoklávech sterilizací v horké páře s teplotou pohybující se mezi 115 – 120 °C. Při výrobě konzervovaných krmiv se jako zdroj bílkovin používají játra,

12

vedlejší živočišné produkty, hovězí a kuřecí maso, sladkovodní a mořské ryby. Nevýhoda u konzervovaného krmiva je cena, přičemž konzerva obsahuje vysoký podíl vody (až 80 %) v krmivu (ANONYM, 2009a) .

3.2 Důvody detekce živočišných druhů v krmivu Všeobecně u krmiv jakýchkoliv hospodářských zvířat je nutná kontrola jejich složení. V současné době, kdy přibývá chovatelů různě prošlechtěných plemen psů se zvyšují i nároky na kvalitu psích granulovaných a konzervovaných krmiv a tudíž je velmi důležitá zpětná identifikace složení uvedeného na obalu (ANONYM, 2010).

LOCKLEY a BARDSLEY (2000) uvádějí jako hlavní důvod kontroly složení krmiv u hospodářských zvířat výskyt bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a geneticky modifikovaných organismů (GMO). Zákaz výskytu živočišného proteinu v krmivu pro hospodářská zvířata vedl ke značné redukci BSE, jak uvádí FUMIERE et al. (2009), s čímž souhlasí i BELLAGAMBA et al. (2001), podle nichž riziko výskytu BSE je výsledkem nejen infikovaných zvířat, ale také důsledkem používání koncentrovaných krmiv, jejich doplňků, savčího masa a kostní moučky. JIA-QIN et al. (2008) dále upřesňuje, že příčinou lidské creutzfeld-jakobovy choroby (CJD) je BSE. Současný výzkum ukazuje, že krmení živočišné bílkoviny bez tepelného ošetření přežvýkavcům může způsobit BSE a jeho následné rozšíření.

Konečným produktem při zpracování krmiv je konverze živočišného odpadu do masokostních mouček, což zahrnuje tukovou a proteinovou frakci, která může být nositelem jakékoli infekční složky přítomné v syrovém materiálu, která nebyla zničena tepelným procesem. Proto protein od přežvýkavců byl od roku 1998 zakázán v krmivu pro přežvýkavá zvířata. Rozhodnutí rady 94/381/EC zakazovalo v členských státech krmení proteinem pocházejícím ze savčího materiálu ruminantům. Nicméně tatáž komise povolovala krmení proteinů od jiných druhů než přežvýkavců.

BAI et al. (2009) se zabývali složením potravin, jejichž výzkum se v posledních letech zaměřil na detekci různých živočišných druhů. Hlavním důvodem jsou obavy konzumentů z BSE, slintavky a kulhavky a ptačí chřipky. Je zájem o pravdivé značení

13

produktů, a proto je velký požadavek na rychlou a přesnou druhovou identifikaci masa. Propuknutí BSE donutilo Evropskou unii k určitým rozhodnutím, aby nedocházelo k přenosu této nemoci přes potravní řetězec. Používání živočišné bílkoviny je kontrolováno Evropskou unií. Nařízeni EC 999/2001 zakazuje krmení savčího proteinu ruminantům a EC 1774/2002 seznamuje s několika opatřeními, které hlavně uvádí: zákaz krmení zvířat bílkovinou stejného druhu, klasifikaci vedlejších živočišných produktů do 3 kategorií odrážejících různé ochranné úrovně včetně rizika kvůli transmisivní spongiformní encefalopatii. Jen materiál z třetí kategorie, který je vhodný pro lidskou spotřebu, může být použit pro krmení hospodářských zvířat. Zavedení těchto praktik vyžaduje použití analytických metod umožňujících druhově specifickou identifikaci.

Regulace z roku 2003/1234/EC pozměňuje výše uvedené nařízení v tom smyslu, že všechen živočišný protein pocházející z hospodářských zvířat je zakázán přidávat do krmiva jakýmkoliv hospodářským zvířatům, kvůli nedostatku specifických detekčních metod. Mléko a mléčné produkty jako syrovátka, vejce a produkty z vajec jsou povoleny ke krmení hospodářských zvířat. Rybí moučka je jediným oprávněným zdrojem živočišné bílkoviny pocházejícím z masa pro krmení prasat a drůbeže. Krmení odpadního materiálu vznikajícího při zpracování ryb je v současné době povoleno u ryb s vyjímkou materiálu ze sádek, kterým nemůžou být krmeny ryby stejného druhu. V současné době není žádný legislativně stanovený limit pro podávání zpracovaného živočišného proteinu do krmiv (RAAMSDONK et al., 2007).

V roce 2006 EFPRA (European Fat Processors and Renderers Association) navrhla navrácení určitých živočišných bílkovin do krmiv za stálého dodržování regulace EC 1774/2002. EFPRA také požadovala „nulovou toleranci“, což znamená, že krmiva obsahující stopy živočišné bílkoviny jiné než rybí moučku nemohou být použity k výživě zvířat. EFPRA také doporučuje 2 % limit živočišné bílkoviny v krmivech pro ruminanty. Pokud bude jakákoliv výše živočišné bílkoviny v krmivu akceptována, budou dále požadovány kontrolní nástroje pro dodržování těchto hodnot.

STRATFEED projekt byl založený Evropskou unií pro vyhnutí se dalším problémům s výskytem BSE a CJD jako důsledkem zkrmováním masokostních mouček 14

hospodářským zvířatům. Projekt byl vytvořen pod názvem Nové metodologie pro detekci a kvantifikaci nelegálního přidávání savčích materiálů do krmiv. Mimo jiné řeší ekonomický vliv zpracování živočišných vedlejších produktů z jatek. Ročně se v Evropské unii vyrobí 16 milionů tun vedlejších produktů. Naprostý zákaz používání masokostních mouček by měl za následek vysoké finanční náklady na likvidaci vedlejších produktů a dále na nahrazení živočišného proteinu rostlinným. Proto bylo navrženo stanovit podmínky pro prezenci živočišného materiálu v krmivech se striktními kontrolami pomocí metod, které zajistí spolehlivost přes tepelné opracování a dodržování druhových bariér. Projekt byl složen z 10 partnerů z 8 evropských zemích včetně výzkumných center, univerzit, oficiálních laboratoří a soukromých společností. Hlavním cílem STRATFEED projektu je poskytnout metody pro detekci a kvantifikaci masokostních mouček v krmivech, použitelné v jakýchkoliv laboratořích zabývající se kontrolou kvality krmiv. Kromě mikroskopie jsou zde studovány metody NIRS, NIRM a PCR (popsané níže v textu) (DARDENNE, 2000).

3.3 Metody používané k detekci živočišných bílkovin v krmivu Na základě výše uvedených důvodů podle BELLAGAMBA et al. (2001) se zavedla druhová identifikace živočišných druhů prováděná pomocí různých metod, které jsou založeny zejména na analýze určitých biomolekul, jako jsou proteiny – elektroforéza, izoelektrická fokusace, imunochemie a HPLC metody nebo jsou zaměřeny na určení pomocí mikroskopie. V poslední době byly rozvinuty DNA analýzy genetického materiálu používající PCR techniky, přímé DNA hybridizace nebo sekvenování.

V současné době je klasická optická mikroskopie jedinou referenční metodou pro detekci zpracovaného živočišného proteinu a je používána jako oficiální kontrola dle nařízení komise 2003/126/EC (FUMIERE et al., 2009), což potvrzuje ve své studii i PINOTTI (2009). Legislativa také umožňuje použití jiných metod, které mohou být aplikovány navíc, pokud budou poskytovat více informací o původu živočišného materiálu. Většina studií byla zaměřena na schopnosti technik detekovat přítomnost živočišného proteinu od 0.1 % obsahu v krmivu.

15

BAI et al. (2009) rozdělil metody pro analýzu živočišných druhů takto:

1

Metody založené na proteinové analýze:

elektroforéza, chromatografie, imunologické techniky a další techniky podle RAAMSDONKA et al. (2007), NIRS – blízká infračervená spektroskopie (near-infrared spectroscopy), NIRM – blízká infračervená mikroskopie (near infrared microscopy), blízké infračervené zobrazování (near infrared imaging) a olfaktometrické techniky (oflactometry techniques).

Avšak tyto metody nejsou natolik citlivé, aby přesně detekovaly živočišné druhy, které jsou obsaženy v potravině nebo krmivu, jsou časově náročné, inadekvátní a drahé. S tímto souhlasí i MARTÍN et al. (2007), který dodává, že v případě imunologických technik jen protilátky použité proti tepelně stabilním biomarkerům můžou být využity pro detekci masokostních mouček v krmivech živočišného původu. Proteiny po smrti zvířete ztrácejí svou biologickou aktivitu, a tak jejich přítomnost a vlastnosti závisí na typu buněk. Mnoho z nich je také tepelně labilních, jak uvádí HUANG et al. (2006). LOCKLEY a BARDSLEY (2000) vysvětluje, že v minulosti se živočišné druhy v krmivu testovaly za pomocí různých imunologických a elektroforetických metod. Tyto metody se setkávaly s problémy, jako je zahřívání při zpracování krmiv, což způsobuje denaturaci proteinů. Velké množství komerčních metod bylo navrženo k detekci plasmatických proteinů, což mohlo vést k scestným výsledkům kvůli náhodné kontaminaci masa krví jiných druhů zvířat. Proto se testování živočišných druhů posunulo k výzkumu DNA.

2

Metody založené na DNA analýze:

PCR amplifikace - polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction), RAPD-PCR - náhodná amplifikace polymorfní DNA (random amplified polymorphic DNA), PCR-RFLP - polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism), 16

real-time PCR - PCR v reálném čase, PCR – AFLP - polymorfismus v délce amplifikovaných fragmentů (amplified fragment length polymorphism), SSCP - analýza konformačního polymorfismu jednořetězců (single strand conformation polymorphism), multiplex PCR, sekvenování, nested primer PCR a mikrosatelity, jak dodává MURUGAIAH et al. (2009).

Tyto metody jsou jednodušší, rychlejší a specifické, ale mají horší reprodukovatelnost, nebo nižší efektivnost při souběžné detekci všech zkoumaných živočišných druhů. Na rozdíl od proteinů má DNA vyšší termální stabilitu, je přítomná ve většině buňkách a umožňuje detekci živočišného druhu bez ohledu na původ tkáně. PCR techniky můžou teoreticky amplifikovat jednu kopii cílené DNA, proto detekční limit je obvykle nižší než u proteinových technik (BALLIN et al., 2009). MARTÍN et al. (2007) popisuje, že mnoho metod založených na detekci DNA pomocí PCR nemůže být použito pro detekci masokostních mouček v krmivu. Kvůli použité vysoké teplotě při jejich zpracování jsou vysoce degradované, a proto spoléhají na amplifikaci jen krátkých sekvencí DNA.

3.4. Metody založené na proteinové analýze 3.4.1 Klasická mikroskopie

Rozdělení metod podle FUMIERE et al. (2009). Je zde realizována kvantitativní část detekce a jen částečně kvalitativní ze získaných vzorků původního krmného materiálu nebo po pomletí. Pro sedimentaci se používají buď konické eppendorfovy zkumavky, nebo nálevky. Nezpracovaný koncentrovaný materiál musí přejít přes síto. Pro přípravu preparátu k mikroskopování jsou používány média jako glycerol, nebo parafinový olej. Také se používají různé barvící reagenty např. alizarinová červeň a cystin pro zvýraznění některých struktur jako jsou kosti, rybí kostra nebo srst a peří. Podle PINOTTIHO (2009) se využívají mikroskopy v několika zvětšeních k identifikaci hlavně kostních příměsí. Od 10 násobného zvětšení a více jsou viditelné částečky

17

savčích kostí. Vypadají jako zakulacené kousky obsahující eliptické až zakulacené mezery. Drůbeží kosti jsou tmavší s ostrými konci. Nyní je větší zaměření na masové frakce, kdy se dá určit, zda maso pochází ze savců nebo ptáků. Přesnost, kvalitativní a kvantitativní ohodnocení pomocí mikroskopických metod je závislá hlavně na zkušenosti analyzátorů, přičemž kvantitativní stanovení je vždy jen odhadem. Regulace 1774/2002/EC vyžaduje identifikaci původu živočišného materiálu ve vyšších taxonomických úrovních, než tomu bylo v minulosti. Nicméně savčí původ je obtížné identifikovat, jelikož se jejich charakteristiky snadno překrývají. Pracovníci mají k dispozici softwarový program ARIES (Animal Remains Identification and Evaluation System), který obsahuje všechny doposud známé znázornění živočišných materiálů v krmivu, což napomáhá jak k zdokonalování pracovníků, tak k běžné denní praxi. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) také popisují metodu mikroskopie, která při současném použití sedimentační analýzy může detekovat části živočišného původu v krmivu v koncentraci nižší než 0,1 %. DALMASSO et al. (2004) zmiňuje, že tato metoda vyžaduje specializované pracovníky a umožňuje jen detekci zoologických tříd (savci, ptáci a ryby), zatímco původ druhů zůstává neurčen.

3.4.2 Blízké infračervené zobrazování

Snímky se získávají v digitální formě na počítači, což umožňuje se zaměřit na detail a vyhodnotit nález. Přesto takovéto zobrazení není dokonalé a dále se pracuje na zlepšování dalších parametrů. Použití mikroskopické metody společně s počítačovou vizualizací k identifikaci živočišného zdroje v krmivu je slibnou metodou, avšak má několik limitujících bodů, jako je určení materiálu ve vyšší taxonomické jednotce než je třída. Vylepšení této metody by mělo spočívat v: dostatečně velkém a representativním datovém souboru , identifikaci klíčových popisujících znaků a použití lépe definovaných statistických metod k podpoře přiblížení obrazu.

18

3.4.3 Blízká infračervená mikroskopie (NIRM) Principem této metody je měření absorpce infračerveného záření o různé vlnové délce při průchodu vzorkem. Používá se tam, kde se zaměřujem na prostorově rozlišené vlastnosti, efekty a při možnosti sledování ohraničených změn odlišných materiálů v obtížně rozdělitelných směsích. Infračervená mikroskopie napomáhá rozlišit původ krmných složek ve vzorku. Tato metoda byla vylepšena zaměřením se na sedimentační část vzorku, která obsahuje hlavně hustší částice, jako jsou např. kosti. Zobrazení pomocí blízké infračervené mikroskopie umožňuje analýzu 300 – 500 částic jednorázově a tím významně snižuje čas analýzy. Je technikou, která může být použita dohromady s dalšími metodami. Pracuje jak se surovým materiálem, tak se sedimentem. Nicméně vybavení pro tuto metodu je cenově náročné a proto není tolik rozšířená. RAAMSDONK et al. (2007) popisuje NIRM a blízké infračervené zobrazování jako techniky, které dovolují zaznamenání blízkého infračerveného spektra z individuálních částic s možností jejich identifikace. Hladina detekce je nižší než 1g/kg. BAETEN et al. (2005) uvádí, že tato technika může být používána pro detekci DNA v krmivu v koncentraci 0,05 % a je ekvivalentní optické mikroskopii. Na rozdíl od optické mikroskopie tato metoda nevyžaduje vysoce vyškolené pracovníky v určování druhů živočišného původu, protože částice jsou identifikovány automaticky podle jejich infračerveného spektra.

3.4.4 Blízká infračervená spektroskopie

Při

infračervené

spektroskopii

prochází

zkoumaným

vzorkem

infračervené

elektromagnetické záření o rozsahu vlnových délek 10-6 m až 10-3 m, jehož vlnová délka se plynule mění (VACÍK et al., 1999). Je jednou z nejrozšířenějších analytických metod založená na absorpci světla v různých vlnových délkách elektromagnetického spektra organických molekul nacházejících se ve vzorku. Nevýhodou této metody je vyšší než 1 % limit detekce. Přesto se používá jako první metoda pro detekci bílkoviny s následným upřesněním dalších metod. Podle RAAMSDONKA et al. (2007) je to důvěryhodná metoda, která může být využitelná pro rutinní analýzu u rostlinných krmiv, ale detekční limit je hodně vysoký pro aplikování v oficiálních kontrolních laboratořích.

19

3.4.5 Detekce pomocí imunoesejí

Principem této metody je interakce mezi protilátkou v testu a antigenem ve vzorku, který představuje specifickou zpracovanou živočišnou bílkovinu. Nyní se nejvíce používá ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a měřící tyčinky. Některé výzkumy však poukazují na velmi nízkou odezvu ELISY na krmivo ošetřené vyšší teplotou, než vyžaduje sterilizace. Reagenty se vylepšovaly a jsou schopny spolehlivě determinovat obsah 0,5 % živočišné bílkoviny, avšak nikdy nedosáhnou hodnoty 0,1 % citlivosti. Imunoeseje jsou dobré prověřovací metody, ale nesplňují požadavek vysoké citlivosti a specifity. Proto musí být následně potvrzeny jinými metodami jako je např. PCR. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) popisují, že konvenční imunoenzymatické metody pro druhovou identifikaci masokostních mouček selhávají u tepelně ošetřeného proteinu. Dále se zmiňují, že u testování touto metodou ve více laboratořích jen jedna z nich dovedla vývoj imunoeseje tak daleko, že detekovala protein od ruminantů a prasat v koncentraci 0,125 % u masokostní tepelně ošetřené moučky při 130 °C.

3.4.6 Chromatografické metody

Chromatografie je metoda selektivního dělení složek směsi, založená na odlišných vlastnostech jednotlivých komponent (rozpustnosti, adsorpci, velikosti částic, chemické afinitě atd.). K oddělení složek směsi dochází při pohybu mobilní fáze stacionární fází. (VACÍK et al., 1999). Tato metoda je také potenciální k nalezení živočišné bílkoviny. RAAMSDONK et al. (2007) popisuje LC (liquid chromatography), jako metodu založenou na detekci a následném zjištění podílu různých polypeptidů. HPLC (high performance liquid chromatography) a plynová chromatografie jsou metody schopné separace a detekce téměř jakéhokoliv typu molekuly přítomné ve vzorku. HPLC může detekovat sloučeniny jako proteiny, aminokyseliny, fenolické látky a karbohydráty, zatímco plynová chromatografie je vhodnější na analýzu tekutých a polotekutých molekul. Nevýhodou těchto metod je zpracování analytických dat, což je časově náročné a vyžaduje zkušené pracovníky. BALLIN et al. (2009) popisuje HPLC jako metodu schopnou detekovat živočišný materiál v množství okolo 0,5 %.

20

3.4.7 Olfaktometrické metody

„Elektronický nos“ je technologie založená na detekci poloselektivních plynových senzorů tekutých složek přítomných v krmivu. Výhodou této techniky je nutnost pouze nízkého množství zkoumaného vzorku a rychlost analýzy. Nicméně senzory nejsou vysoce selektivní k určitým zkoumaným složkám, proto tato technika není vhodná pro zjišťování znehodnocovaného krmiva (REID et al., 2006).

Kombinace metod NIRM může detekovat části masa a kostní moučky jen obecně, bez možnosti určení živočišného druhu. Zavedly se strategie kombinující NIRM, která detekuje a izoluje částečky masokostní moučky společně s DNA extrakcí umožňující druhovou identifikaci pomocí real time PCR. Cílem je vyextrahovat dostatečné množství DNA z malého množství materiálu. Byly založeny druhově specifické databáze, které se nyní používají k nalezení druhově specifického spektra markerů. Stále se řeší nedostatky v čištění materiálu od kontaminující DNA, aby DNA extrakty pocházely jen ze zkoumaného materiálu a ne ze zbytků krmiva přichyceného na testovaný vzorek.

3.5 Metody založené na DNA analýze DNA je velice stabilní biologickou molekulou. LOCKLEY a BARDSLEY (2000) popisují, že DNA je více termostabilní než jiné proteiny, a proto úspěšnost analýzy není tolik odkázaná na znehodnocení během zpracování krmiv. Navíc DNA je přítomná ve většině buněk organismu, tudíž usnadňuje identifikaci jakéhokoliv vzorku bez ohledu na jeho původ. DNA může potenciálně poskytnout více informací než protein, díky degenerování genetického kódu a přítomnosti mnoha nekódujících oblastí. Kvalita DNA vyjadřuje průměr molekulární váhy DNA, která je v délce individuálních dvojitých řetězcích vyjádřená v číslech párů bazí (bp). DNA degradace je výsledkem snížení délky molekul, obvykle beze změny bp sekvence (MEYER a CANDRIAN, 1996). DNA tání je proces, kterým jsou interakce mezi vlákny dvojité šroubovice narušeny a vznikají dvě vlákna DNA. Vazby mezi vlákny dvoušroubovice jsou slabé, snadno oddělitelné zahříváním, enzymy nebo působením fyzikálních sil. Této schopnosti DNA se využívá při PCR (ANONYM, 2008).

21

Izolace genomové DNA z živočišných tkáních Cílem purifikace je získat nukleovou kyselinu v nativním stavu, dostatečném množství a čistotě. Při izolaci DNA se využívá rozdílné rozpustnosti makromolekul, adsorpce na pevný podklad nebo ultracentrifugace v gradientních roztocích. Jde především o následující metody: homogenizaci – třecími nástroji, minikuličkami, zmrazováním v tekutém dusíku, lýzí buněk a tkání – stěny živočišných buněk se rozrušují jemnými metodami jako př. slabými neiontovými detergenty, deproteinizaci – použitím enzymů jako proteináz, celuláz, fenolu, chloroformu, koncentrování a přečištění DNA vysrážením v 70 % ethanolu, rozpuštění v pufru (TE) nebo v H2O, odstranění zbytku RNA – působením ribonukleázy (Rnázy) (ŠMARDA, et al., 2008).

Běžným limitním činitelem pro PCR metody je selhávání amplifikace kvůli přítomnosti inhibičních látek ve vzorku. Tyto látky zahrnují hemové složky v krvi, vodnaté a sklovité humorální látky, heparin, moč a polyaminy (HUANG et al., 2006). PINTO et al. (2007) popisuje PCR metodu jako vysoce specifickou, schopnou reprodukce, sensitivní a charakteristickou svojí vysokou rozlišovací schopností. Přesto PCR inhibitory jako jsou polysacharidy, huminové kyseliny jsou v krmivech hojné a během extrakce se je často nepodaří úplně odstranit. Tudíž mohou zasahovat do reakce v několika úrovních, což vede ke snížení a dokonce ke kompletní inhibici DNA polymerázové aktivity. Proto DNA metody jsou vysoce závislé na DNA extrakci a purifikačních technikách.

KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) vyvinuli rychlou, sensitivní a důvěryhodnou metodu založenou na PCR procedurách pro demonstraci bovinního, ovčího, prasečího a kuřecího masokostního materiálu v krmivech. DNA izolovali

pomocí metod

založených na jejím vázání s SiO2 za přítomnosti guanidin thiokianatu. Tato metoda se potvrdila jako efektivní pro izolaci DNA, protože odstraňuje inhibitory PCR reakce, je rychlá a dává dostatečný výnos.

22

Kity používané pro izolaci DNA

Pro izolaci DNA se používájí různé protokoly a v poslední době se začínají často používat komerčně vyráběné soupravy – kity. Existuje řada komerčně dostupných kitů pro izolaci DNA z krmiv a potravin, které se liší podle výchozího materiálu z kterého chceme DNA získat. Např. kity pro exktraci plasmidové DNA, RNA, pro lidské tkáně a buňky, buňky kvasinek, virové nukleové kyseliny, pro krev a biologické tekutiny, genomickou DNA z tkání a buněk, genomickou DNA z forenzních vzorků, z rostlin a vzorků z životního prostředí a genomickou DNA z potravin a krmiv. Pro izolaci genomové DNA z krmiv a potravin je komerčně vhodný např. kit NukleoSpin Food pro svou výbornou schopnost odstranit PCR inhibitory a purifikovat i malé množství částečně degradované DNA s velikostí vzorku do 200 mg. Při zkoumání efektivnosti Nukleospinu na bovinní DNA byla prokázána vysoká senzitivita a specifita i u vysoce zpracovaného krmiva a potravin, jako je tepelné ošetření masa při 133 °C. Dalším používaným kitem je Invisorb Spin Food Kit I – byl vyvinutý pro extrakci DNA z malého množství krmiva živočišného původu. Mezi jeho přednosti patří rychlá lýze buněk bez mechanické homogenizace, DNA extrakce a purifikace z vysoce zpracovaných potravin a krmiva, vysoký zisk a kvalita vyextrahované DNA. Poskytuje vysoký výnos i z malého množství počátečního materiálu. U rostlinného materiálu má schopnost odstranit buněčné zbytky a nelýzovaný materiál pomocí přefiltrování, odstranění kontaminujících látek a enzymových inhibitorů (WAGNER, 2010).

V současné době se používá několik extrakčních metod jako např. Wizard, NucleoSpin, GenomicPrep a CTAB. V experimentu CHAPELA et al. (2007) byla čistota extrahované DNA u CTAB metody z poměru absorbancí 260/280 nm vlnových délek v různých konzervovaných produktech tuňáka okolo 2. Extrakce DNA pomocí této metody poskytuje produkty s velice nízkým obsahem kontaminujících proteinů (VODRET et al., 2007).

Elektroforéza Elektroforéza je nejpoužívanější separační technikou při izolaci DNA a bílkovin. Jde o pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. DNA má záporný náboj, a proto se

23

v elektrickém poli pohybuje od katody k anodě. Rychlost pohybu závisí na vlastnostech DNA jako je molekulová hmotnost, elektrický náboj a prostorové uspořádání, a také na vlastnostech gelu, prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Elektroforéza se nejčastěji provádí na polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu, které vytváří síťovou strukturu polymerních molekul s póry. Agarózové gely se používají pro separaci molekul nukleových kyselin o velikosti od 100 bp po 50 kb. Zatímco polyakrylamidové gely se využívají pro separaci menších molekul od 10 do 1000 bp. Molekuly větší velikosti a složitější prostorové struktury procházejí gelem pomaleji, než menší molekuly. Pro stanovení velikosti molekul DNA se používají hmotnostní standardy, což jsou většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů s přesným určením velikosti pomocí sekvenování DNA (ŠMARDA et al., 2008).

3.5.1 Metody založené na DNA hybridizaci

LOCKLEY a BARDSLEY (2000) popisují, že DNA hybridizace zahrnuje získání DNA extrakcí a purifikací. Označené DNA sondy jsou hybridizovány ke vzorku genomické DNA kovalentně připojené k nylonové membráně v mezerovitém nebo tečkovitém formátu. Sondy obsahující značenou genomickou DNA od určitého druhu hybridizují k DNA získaného z testovaného vzorku. Při použití této metody byly s vysokou přesností zjišťovány vzorky obsahující DNA kura domácího a prasete. Sondy pro DNA z kozy, ovce a krávy byly zjištěny s určitým stupněm nespecifického nasedání sond na jinou DNA (cross-reactivity). Takovéto výsledky jsou odrazem různého stupně homologních sekvencí satelitní DNA u různých druhů zvířat. Tato závada se částečně napravila u úzce příbuzných druhů díky přidání neznačené DNA tam, kde docházelo k mezidruhové kontaminaci. U ovcí a koz se dlouhou dobu řešil tento problém, jelikož jejich satelitní DNA je vysoce homologní. Postupně se tato metoda vylepšovala a lze ji nyní použít pro identifikaci masa hovězího, zvěře, vepřového, kuřecího, krůtího, králičího, ovčího a kozího. Navíc lze tuto metodu použít i k odlišení různých plemen skotu.

DNA hybridizační metody jsou časově náročné, kdy sondy mohou být značeny radioaktivně, což je negativní stránkou této metody. Hybridizace umožňuje identifikovat mnoho živočišných druhů i z degradované DNA, avšak je zapotřebí relativně velkého množství purifikované DNA. 24

3.5.2 Metody založené na PCR

ŠMARDA et al. (2008) popisuje, že metoda PCR byla zavedena v roce 1985 Kary B. Mullisem. Tato metoda umožňuje získat požadovanou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech. Její podstatou je enzymová, cyklicky se opakující syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA (dsDNA) ve směru 5´- 3´ zprostředkována DNA polymerázou. Daný úsek je vymezen připojením dvou primerů, které se vážou na protilehlé řetězce DNA. Reakce probíhá v termocykleru (viz obr. 1), což je programovatelný termostat schopen rychlého a přesného přechodu mezi jednotlivými teplotami (RUMLOVÁ, 2003).

Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát v cyklech opakují. denaturace dsDNA (92 – 95 °C), nutnost kompletní denaturace obou vláken, jinak by mohlo dojít k renaturaci, což by zabránilo specifickému připojení primerů, annealing – (30 – 65 °C), připojení primerů

k jednořetězcové

DNA

(ssDNA), teplota závisí na délce oligonukleotidu a na zastoupení A-T a G-C párů (G-C páry zvyšují stabilitu a tím i denaturační teplotu), elongace – (65 – 75 °C), syntéza nových řetězců ve směru 5´ - 3´ DNA-polymerázou.

Obr. 1 Termální cykler PTC – 200 (MU)

Výchozí koncentrace templátové DNA rozhoduje o počtu cyklů, který se většinou pohybuje mezi 25 – 35. Příliš vysoký počet cyklů zvyšuje množství nespecifických produktů PCR. Výsledným produktem PCR jsou amplikony, úseky DNA definované délky o velikosti desítek až tisíců bp. Výsledek reakční směsi se obvykle prokáže stanovením jejich velikosti elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Z jedné dvoušroubovice DNA vzniknou po jednom replikačním cyklu dvoušroubovice dvě. Po 30 cyklech vznikne více než miliarda kopií sekvence DNA. Termální cyklery mění 25

teplotu automaticky a amplifikují velké množství vzorků, díky čemuž se tato metoda stala relativně jednoduchou. Jednou z nevýhod PCR je zanášení chyb do amplifikovaných kopií DNA. Taq- polymeráza 3´- 5´ nemá korekční aktivitu a tím při replikaci produkuje chyby s vyšší četností. Další nevýhodou Taq-polymerázy je, že úseky DNA delší než několik tisíc nukleotidových párů (nad 35 kb) amplifikuje neúčinně (SNUSTAD a SIMMONS, 2009). Úspěšnost PCR při amplifikaci určité sekvence DNA je závislá na pečlivém návrhu obou primerů. Jsou to krátké sekvence DNA nebo RNA, z kterých se iniciuje replikace DNA. Primery by měly být 18 – 25 nukleotidů dlouhé, s obsahem G+C 40 – 60 %, rovnoměrně rozdělené páry G/C a A/T, teplota tání primeru by měla být alespoň 50 °C, neměly by se na vazebném místě vyskytovat nespecifická vazebná místa, komplementární sekvence a vnitřní sekundární struktury (vlásenky) (ŠMARDA et al., 2008).

Tab. 1 Citlivost PCR metod podle AHEME, (2004)

DNA

Limit detekce ( ng/µ µl)

Ptáci

10-7

Ryby

10-3

Savci

10-3

Podle FREZZA et al. (2008) při použití metody konvenční PCR byla sensitivita druhově specifických primerů 0,2 %, 0,5 % a 1 % a to ve vzorcích krmiva u hovězí, ovčí, vepřové a kuřecí masokostní moučky. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) popisují, že molekulárně biologické techniky umožňují demonstraci DNA i po její tepelné úpravě. Také mohou být použity pro druhově specifickou identifikaci DNA v masokostních moučkách a složených krmivech. Poprvé k těmto účelům byla popsána PCR metoda při amplifikaci bovinní mitochondriální DNA jako markeru pro prezenci bovinní tkáně v krmivu.

26

Důležité parametry byly zváženy k vylepšení efektivnosti těchto testů: mitochondriální DNA (mtDNA) je hlavním zájmem pro identifikaci živočišných druhů, jelikož obsahuje mnoho kopií sledovaného vzorku v buňce, snadná detekce krátkých frekvencí DNA ve vzorku. V některých interlaboratorních studiích většina různých PCR technik selhala v požadované sensitivitě a specifitě. Jen PCR vyvinutá uvnitř STRATFEED projektu přinesla přijatelné výsledky a jeví se jako potenciální alternativní metoda pro detekci živočišné bílkoviny v krmivu. Bylo zjištěno, že bílkovina upravená nad teplotu požadovanou legislativou pro sterilizaci je stále detekovatelná v množství 0,1 % hmotnosti krmiva. Různé laboratoře zlepšily jejich PCR techniky pro detekci živočišné bílkoviny ve stopovém množství v krmivu. Důležitý limit pro použití PCR je skutečnost, že živočišná DNA (patřící k určitému druhu nebo druhové skupině) detekovaná ve vzorku krmiva nemusí vždy pocházet z živočišné bílkoviny. Mohou tam být stopy mléka, krve, tuku, hydrolyzovaného proteinu z kůže ruminantů nebo vaječné produkty, které můžou kontaminovat hledanou DNA.

Identifikace živočišných druhů pomocí PCR reakce Podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000) testy založené na PCR pro druhovou identifikaci mohou být prováděny s mnohem nižším množstvím počátečního materiálu díky amplifikaci, kterou tato metoda umožňuje. RAAMSDONK et al. (2007) uvádí, že u PCR metody bylo vyvinuto sestavení primerů tak, aby amplifikovaly DNA sekvenci kratší než 100 nukleotidů. Současné výsledky různých studií indikují, že specifická DNA a metody detekce proteinů můžou nalézt od 1g zpracovaného živočišného proteinu na 1 kg materiálu. Tepelné procesy nad 100 °C mohou způsobit spontánní fragmentaci DNA, což je důležitým měřítkem pro spolehlivost testů. Mikroskopické metody jsou důvěryhodné také ve vysoce zpracovaném krmivu se zanechanými morfologickými strukturami, i když je genetický materiál vysoce degradovaný. Na druhou stranu PCR techniky poskytují alternativní analýzu vzorků s genomickým materiálem i bez prezence morfologických částic (WEINER a KWIATEK, 2008).

PCR metoda se ukázala jako levná a snadná na provedení, poskytující spolehlivé výsledky. Tato metoda umožňuje rychlou replikaci sledovaných úseků DNA, která je

27

v poslední době čím dál častěji používanou metodou pro identifikaci živočišných druhů v potravinách i krmivu. Patří mezi nejvíce senzitivní metody, které byly kdy vynalezeny. Jedinou kompetiční metodou pro PCR je v současné době použití DNA čipů se zvyšující se senzitivitou, které by mohly v budoucnu převzít hlavní roli v identifikaci živočišné DNA (ANONYM, 2004).

3.5.2.1 Sekvenování PCR produktu založené na mtDNA Další metody analýzy DNA po provedené PCR amplifikaci podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000). Cílem sekvenování DNA je stanovení pořadí nukleotidů v molekulách DNA. Nejčastěji se používá enzymatická metoda u které se syntéza zprostředkuje enzymem polymerázou a reakce je upravena tak, že v určitých místech dochází k ukončení syntézy, když se v templátovém vlákně vyskytne určitý nukleotid. Délka nedokončeného úseku se zjišťuje elektroforézou na gelu a odpovídá vzdálenosti od začátku vlákna. Sekvenování je přímým způsobem získání informace z PCR produktu. Mitochondriální DNA (mtDNA) (viz obr. 2) se vyznačuje několika výhodami nad jadernou DNA: mtDNA je maternálně děděna tak, že jedinci nesou jen jeden typ alely v genu. Tím se vyhne dvojsmyslnosti sekvence pocházející od heterozygotního genotypu, relativně vysoká četnost mutací oproti jaderným genům má za příčinu nahromadění dostatečného množství bodových mutací umožňujících odlišení i blízce příbuzných jedinců. Přesto i práce s mtDNA musí být opatrná, protože se objevuje intraspecifická variabilita. Podle MURUGAIAH et al. (2009) se mtDNA vyvíjí mnohem rychleji než jaderná DNA a její sekvence je více různorodá, a proto usnadňuje identifikaci blízce příbuzných druhů. Sekvenační techniky vyžadují dobrou kvalitu DNA pro analýzu, protože frakce denaturované DNA by mohly produkovat zavádějící výsledky. Navíc sekvenování může vést k nejednoznačným výsledkům u vzorků obsahujících více živočišných druhů. DNA sekvenační techniky jsou časově náročné a zdají se být těžko proveditelné pro rutinní analýzy (HAEZEBROECK, 2001).

28

3.5.2.2 Restrikční štěpení PCR produktů Metoda PCR-RFLP (polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) je široce používána jako úspěšná identifikace mnoha živočišných druhů. Jedná se o naštěpení genomové DNA určitou restrikční endonukleázou v polymorfních místech typických pro určité druhy a detekování rozdílů ve velikosti restrikčních fragmentů gelovou elektroforézou. HAEZEBROECK et al. (2001) dále dodává, že rozdíly v délce fragmentů mezi jednotlivci jsou dány jak jednonukleotidovými polymorfismy, tak inzercí nebo delecí DNA uvnitř fragmentu, které vedou ke ztrátě štěpícího místa nebo ke tvorbě nového. MURUGAIAH et al. (2009) se zmiňuje o výhodách PCR – RFLP oproti přímému sekvenování. Tato technika je ekonomicky efektivní pokud se provádí ve velkém rozsahu, např. pro rutinní analýzu potravin. Také poskytuje přesnější detekci u vícedruhové analýzy produktů. Při pokusu sekvenování DNA pocházející z ovce a kozy, PCR produkty vykazovaly 92 % homologii. Nicméně byly nalezeny 4 restrikční místa podle kterých lze tyto dva druhy rozeznat. U ovčího produktu restriktáza naštěpila amplifikovanou DNA na fragmenty, které nebyly rozštěpeny u kozího produktu, což se vizualizovalo pomocí gelové elektroforézy. RFLP analýza PCR produktů je široce používána pro rozlišení jednotlivých druhů. Jeden pár primerů může produkovat fragment, který může být použit pro identifikaci více druhů s rozumným výběrem restrikčních enzymů. Tato metoda má nevýhodu v nedokonalém naštěpení, které se může příležitostně vyskytnout a intraspecifická variance může vymazat nebo vytvořit další restrikční místa. SALAH, et al. (2009) identifikoval oslí a koňské maso metodou PCR-RFLP za použití mtDNA genu pro cytrochrom b o velikosti 359 bp. Pomocí restrikčního enzymu AluI se podařilo nalézt 3 rozdílná místa, která se naštěpila jen u koňské DNA. MARTÍN et al. (2009a) také dodává, že PCR-RFLP technika je současně nejvíce používanou pro identifikaci koňského masa v krmivu. Nicméně analýza tepelně upraveného krmiva nese v sobě fragmentovanou DNA, což není vyhovující pro RFLP, která díky restrikčním enzymům vyžaduje delší fragmenty. Jinak může docházet ke štěpení na nespecifickém místě. Kromě toho aplikace PCR-RFLP metodiky může být limitována při analýze smíšených vzorků, protože výsledky mohou vykazovat různorodé restrikční štěpení u vyskytujících se druhů.

29

3.5.2.3 Druhově specifické PCR primery

Detailní informace o sekvenci DNA jsou dostupné pro mnoho druhů, proto mohou být identifikovány i jednonukleotidové polymorfismy, které umožňují vytvoření druhově specifických primerů. Neselektivní primer je založen na sekvenci, která je běžná všem studovaným druhům. Jeho přesná lokalizace v genu může být použita k určení velikosti amplifikovaného produktu. Použitím druhově specifických primerů je možné testovat v jedné reakci přítomnost více živočišných druhů současně. Navíc touto metodou je možné detekovat nahrazení levnějších masových přídavků a různé příměsi. U této metody je nevyhnutelná předchozí znalost sekvence. Pokud jsou primery sestaveny na mitochondriálních genech může se stát, že amplifikace bude ovlivněna intraspecifickou variací. Také během evoluce kopie mitochondriálních genů můžou být přemístěny do jaderného genomu a tyto nukleární pseudogeny můžou nasměrovat primery přímo k mitochondriálním sekvencím. Tato skutečnost se vyskytla při identifikování různých druhů zvěře. MARTÍN et al. (2007) použil pro druhovou identifikaci a detekci přežvýkavců mitochondriální gen kódující 12S rRNA. Testoval specifitu u tří druhově specifických primerových párů získaných ze svalových vzorků 30 druhů zvířat (13 savců, 12 ryb a 5 ptáků) a 5 druhů rostlin. Nebyla pozorována žádná mezidruhová amplifikace. Z hlediska jakékoliv možné kontaminace krmiv různými živočišnými druhy autor navrhuje, že každá diagnostická technika by měla být testována pro mezidruhovou reaktivitu k zabránění falešných pozitivních výsledků. Zjištěný detekční limit při použití bovinního specifického primeru byl 0,1 %, který neovlivnila ani prodloužená doba ohřevu (50´ a 120´). Použití druhově specifické PCR pro přítomnost příměsí DNA přežvýkavých zvířat v krmivu může být zavedeno pro provádění rutinních kontrolních testů. Prokázalo se, že jsou vysoce sensitivní, rychlé (méně než jeden pracovní den) a schopné ověřovat jak syrový, tak denaturovaný materiál.

Obr. 2 Mitochondriální DNA (Wikipedia)

30

3.5.2.4 Analýza konformačního polymorfismu jednořetězců

Tato

metoda

je

založena

na

tvorbě

rozdílných

sekvenčně

specifických

intramolekulárních struktur ssDNA nebo ssRNA. Tyto rozdíly mají vliv na mobilitu ssDNA v nedenaturujících elektroforetických podmínkách. K přípravě ssDNA molekul se používá formamid nebo tepelné ošetření a jejich rozdělení se uskutečňuje elektroforézou v nedenaturačním gelu (ŠMARDA et al., 2008). SSCP byla použita k identifikaci různých druhů ryb a k rozlišení vepřového masa od černé zvěře. PCR amplifikuje stejnou oblast DNA různých druhů, obecně část mitochondriálního genu cytochromu b. Jednořetězcová DNA se začne spojovat s komplementární sekvencí, konformačně se mění a vykazuje různou mobilitu na polyakrylamidovém gelu. Pomocí této metody jsou patrné rozdíly i v jednotlivých bázích sekvence. Tato analýza je více náročná, jelikož je závislá na odlišnostech sekundární struktury, která se objeví na gelu. Tyto rozdíly jsou výhradně závislé na teplotě během analýzy produktu. Problémem této metody je i její reprodukovatelnost. Mezi další nevýhody této metody podle TELETCHEA (2009) patří: nutnost aplikace vzorků vedle sebe na stejném gelu – závislé na podmínkách nativní PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza), intraspecifická variace může být důsledkem různé konformace vedoucí k špatným výsledkům a možnost vizualizace více než dvou produktů odlišujících se svou intenzitou.

3.5.2.5 Náhodná amplifikace polymorfní DNA

RAPD metoda spočívá v použití náhodných primerů o velikosti okolo 10 bází. Amplifikuje se mnoho fragmentů s různou délkou a detekuje se velké množství polymorfizmů. Tato metoda se používá k identifikaci ptačího, savčího i rybího masa. RAPD metoda nevyžaduje předešlou znalost sekvence DNA, ale je nepraktická při identifikaci živočišného původu v produktech obsahujících více druhů dohromady. Také tato metoda není adekvátní při analýze vysoce degradovaného materiálu, protože je velmi citlivá k mírným změnám u cílené DNA (TELETCHEA, 2009). RAPD

31

technika je výhodná tam, kde je známý referenční materiál pro porovnání, ale ne tam, kde není žádná informace o sekvenci DNA, jak dodává BALLIN et al. (2009). U této metody stejně jako u SSCP je hlavním zájmem vylepšení v její reprodukovatelnosti. Je zde také důležitá kvalita templátové DNA. Pokud je DNA vysoce degradovaná ovlivní to velikost amplikonů a tím i úspěšnost metody. Metody SSCP a RAPD nejsou nespolehlivé, ale kritickým bodem je zajištění stabilních podmínek během reakce pro umožnění jejich snadné reprodukovatelnosti.

3.5.2.6 Použití aktin multigenové rodiny

Aktin multigenová rodina obsahuje velké množství genetických kopií, které mají vysoce zachované kódované sekvence, ale introny se liší jak ve svém umístění tak ve velikosti, a tím umožňují druhovou identifikaci. PCR primery byly založeny na protein kódující sekvenci o které se ví, že bude zachovaná v různých aktinových izoformách, ale je přerušená introny u většiny článků genetické rodiny. Použitím těchto primerů, k amplifikaci několika aktinových genových lokusů souběžně, bylo možné vygenerovat elektroforetické produkty, jako přímý následek intronové variace o různých velikostech. Dosažené výsledky jsou opakovatelné a neliší se mezi jednotlivci stejného druhu nebo mezi různými plemeny uvnitř druhu. V prováděném testu byly primery zkonstruovány za použití intronové variace a neselektivních oligonukleotidů v připojených exonech tak, aby selektivně amplifikovaly DNA z kuřete a krocana a ne z jiných druhů. HOOPWOOD et al. (1999) použil pár oligonukleotidových primerů ze svalů, které můžou získat amplifikát současně od několika členů aktin multigenové rodiny. DNA kura domácího byla jasně detekovatelná u vzorku s 99 % obsahem ovčího a 1 % obsahem kuřecího masa tepelně ošetřeného na 120 °C.

Tab. 2 Výčet používaných DNA metod pro ověření pravosti potravin podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000)

Metoda

Studované druhy masa

DNA hybridizace

hovězí, vepřové, ovčí, kozí, kuřecí, krůtí, králičí. zvěř, koňské

PCR produkt sekvenování

hovězí, vepřové, ovčí, kozí, buvolí, oslí, kuřecí, krůtí, klokaní, krokodýlí, žabí, ryby včetně makrely, tresky, sledě, lososa, tuňáka

32

Metoda

Studované druhy masa hovězí, vepřové, ovčí, kozí, kuřecí, krůtí, několik druhů zvěřiny a antilopí,

PCR – RFLP

koňské, buvolí, lososí, zaječí, klokaní, černá zvěř, kačena, emu, pakůň, kočka, pes, krokodýl, had, ryby, okoun říční, sova, platýz, jeseter, losos, tuňák, pstruh

Specifické druhové

hovězí, vepřové, ovčí, kozí, kuřecí, krůtí, koňské, oslí, tuňák, makrela,

primery

jeseter

PCR-SSCP

RAPDs Aktin

norčí, velrybí – plejtvák, ryby včetně platýse, úhoří, jeseter, losos, pstruh, tuňák hovězí, vepřové, ovčí, kozí, kuřecí, pštrosí, kachní, králicí, zvěř, koňské, buvolí, mul, oslí, klokaní, černá zvěř, pes, kočka, norčí, velrybí – plejtvák hovězí, vepřové, ovčí, kuřecí, krůtí, koňské

3.5.2.7 Použití mikrosatelitních markerů Mikrosatelity jsou tandemové opakující se úseky DNA v délce nejčastěji 2 – 6 pb. Jsou velice polymorfní tzn. nacházejí se v různých variantách uvnitř jedné populace. Jejich rozmanitost alel je snadno zjistitelná, a proto umožňuje sledovat variabilitu mezi jednotlivými druhy i v rámci jednoho druhu uvnitř populace. Mikrosatelitové markery jsou repetetivní úseky DNA ohraničené sekvencí primerů, které se používají při PCR reakci. (LITT and LUTY, 1989) HAEZEBROECK (2001) popisuje metodu identifikace živočišných druhů pomocí mikrosatelitních markerů. Vyhodnocoval 23 mikrosatelitů pro jejich schopnost identifikovat 4 hlavní plemena skotu v Belgii a zkonstruoval panel obsahující 9 až 12 ověřených satelitů pro identifikaci těchto plemen. Pravděpodobnost stejné identity dvou různých genomů byla 10–9 pro 11 markerů současně u 4 plemen.

3.5.2.8 Array technologie (mikročipy)

Mikročipy se skládají ze silikonových, nylonových nebo skleněných destiček na kterých jsou zachyceny oligonukleotidové sondy komplementární k cílené DNA. V současné době může být zachyceno přes 50 000 cDNA sond na 25 x 75 mm. Sondy jsou zpravidla připraveny z jednotlivých přepsaných genů kódujících určitý protein, tzn. zpětným přepisem mRNA. Komplementární DNA (cDNA) je hybridizována na DNA mikroarray a opláchnuta. Zkoumaná DNA je obvykle fluorescenčně značená během

33

PCR amplifikace a hybridizuje s cDNA sondami. Fluoresncenční signály jsou detekovány pomocí konfokálního laserového zařízení. Mezi výhody array technologií patří snadné použití a možnost analýzy tisíce genů, nebo markerů ve stejnou dobu (RUMLOVÁ, 2003).

LOCKLEY a BARDSLEY (2000) uvádí, že náklady na DNA metody pro testování složení krmiv jsou podstatné a je vyžadován přístup k drahému zařízení pro sekvenování nebo real-time PCR analýzu. Pro designování těchto testů je také důležitá kvalita zkoumané DNA. Rozšířené zpracování jako je např. konzervování ryb může způsobit rozsáhlou degradaci DNA, a tím limitovat velikost produktu úspěšně amplikovatelného z takovýchto vzorků. Avšak TELETCHEA (2009) popisuje, že tyto metody jsou relativně rychlé s přesnějšími výsledky než metody založené na PCR. Array metody byly úspěšně hodnoceny jak při jednotlivých, tak směsných vzorcích obsahujících do 5 různých druhů na syrovém i degradovaném materiálu. Začíná být žádoucí vyvíjet technologie k zjednodušení PCR analýzy a to směrem k odstranění požadavku na elektroforézu. Jedním z možných řešení jsou mikročipy, avšak jejich použití je zatím velmi drahé pro zavedení do praxe.

3.5.2.9 Real time PCR Real time PCR je moderní technika molekulární biologie určená pro rychlou a spolehlivou detekci a kvantifikaci určitého úseku DNA nebo RNA. Je založena na sledování průběru PCR přímo během reakce pomocí fluorescenčních sond nebo barviv, které detekují vytvoření amplifikátu zvýšením fluorescenční aktivity. Provádí se za pomocí cyclerů, které umožňují teplotní cyklování a zároveň detekci fluoresncence. Tato metoda je schopna přesně stanovit výchozí počet kopií templátové sekvence DNA pomocí matematické analýzy amplifikačních křivek. Detekční systémy používané při real-time PCR interkalační barviva – ethidium bromid, SYBR Green I, TaqMan, oligonukleotidové sondy – fluorescenčně značené oligonukleotidy.

Analýza křivky tání je metoda používaná po ukončení real-time PCR pro zjištění povahy amplifikovaných produktů, jako např. detekci SNP polymorfismů a detekci specifických a nespecifických produktů (ANONYM, 2009b).

34

Hlavní výhodou real time PCR podle MARTÍNA et al. (2009b) je schopnost odlišit původ DNA bez potřeby jiných časově náročných metod a dalších pracovních kroků. Autor dále popisuje, že použití druhově specifických primerů a SYBR – Green je vhodnou a levnou alternativou, kde druhové amplikony jsou detekovány značenými TaqMan sondami. Tato metoda byla úspěšná i u vysoce tepelně ošetřených vzorků. Výsledky tradiční PCR jsou analyzovány na konci posledního cyklu a dávají v mnoha případech jen kvalitativní stanovení. Nicméně výsledky z real time PCR se zaznamenávají od začátku a během exponencionálního

růstu, čímž můžou být

detekovány i kvantitativní hodnoty.

FREZZA et al. (2008) testoval výkon metody real-time PCR použitím druhově specifickcýh primerů a sond k detekování a kvantifikování hovězích, ovčích, vepřových a kuřecích masokostních mouček ošetřených podle legislativy EU (133 °C, 20´ a 3 bary). Primery byly designovány k získání amplikonů o velikosti menší než 120 bp detekovatelné i u vysoce degradovaného materiálu. Výsledky při použití těchto metod byly efektivní až při vyšší koncentraci DNA v krmivu (okolo 0,5 %). Efektivnost byla vyšší u primerů pro hovězí a vepřovou DNA a nižší u primerů pro kuře. Přesto tato metoda patří mezi hlavní metody pro detekování specifických druhů ve zpracovaném krmivu podle EU nařízení. RODRÍGUEZ et al. (2005) popisuje real-time kvantitativní PCR, kdy jako marker použil mitochondrialní geny 12S rRNA. Detekční limit u zkoumané DNA z prasete byl 0,01 ng (0,1%). Tato metoda byla úspěšná i u sterilizovaných produktů s vysoce fragmentovanou DNA.

3.5.2.10 Multiplex PCR U této metody se amplifikuje více odlišných úseků DNA (několik párů primerů s odlišnou specifitou) současně v jedné reakční směsi. Umožňuje detekovat více druhů organismů najednou, a proto jsou výhodné z hlediska úspory času a nákladů (ANONYM, 2009b). DALMASSO et al. (2004) se zabýval metodou multiplex PCR, u které detekoval přežvýkavce, drůbež, ryby a vepřové maso v krmivech během jedné reakce. Primery byly

designovány

tak,

aby

obsahovaly

různé

geny

mitochondriální

DNA

35

charakteristické svými alternativními dobře uchovanými a variabilními regiony. Místa navázání primerů byla vybrána tak, aby generovala specifické amplikony kratší než 300 bp. Takové primery by měly být účinné i na materiálech vysoce degradovaných tepelným ošetřením. U primerů pro různé druhy zvířat byl pozorován vysoký stupeň homologie 98 – 100 %. Bylo dokázáno, že multiplex PCR je vysoce sensitivní metoda schopná detekovat i velice nízké limity u krmiv s několika živočišnými druhy. Tato metoda je lepší variantou PCR pro kontrolu krmiv. Navržení primerů je u této metody velice důležité, protože je rozhodující jejich specifita a teplota tání. Stupeň špatně navázaných primerů byl ve studii MATSUNAGA et al. (1999) víc než 15%. Tyto neshody snižují teplotu tání více než o 15 °C a to způsobuje, že zpětné primery nasedají jen na druhově specifickou sekvenci. Nicméně při použití stejné koncentrace DNA od šesti živočišných druhů byla zjištěna nerovnoměrná intenzita zobrazení na gelu. která byla ovlivněna rozdílností v sekvenci primerů. BAI et al. (2009) popisuje, že u této metody došlo k selhání efektivnosti amplifikace kvůli kompetici mezi primery a templáty.

GHOVVATI et al. (2009) zmiňuje, že pro detekci druhů pomocí multiplex PCR byly vybírány genomické a mitochondriální geny. Pro identifikaci druhů v krmivu byly použity mitochondriální geny jako gen cytochromu b, 12S rRNA a 16S rRNA geny. Molekulární techniky jako PCR, RAPD fingerprinting, DNA hybridizace, PCR-RFLP a genové sekvenování byly testovány pro identifikaci původu masa, ale každá z těchto metod měla svá limitující kritéria. Multiplex PCR má možnost opakování, je časově a technicky nenáročná a cenově dostupná na rozdíl od předešlých metod. Tato metoda se také vyznačuje velice nízkým detekčním limitem. Multiplex PCR prokázala svou vysokou specifičnost, která se nelišila v závislosti na teplotě při zpracování vzorku.

3.5.3 Ostatní metody 3.5.3.1 Metoda založená na elektrochemických biosenzorech

CHAUMPLUK et al. (2006) použil metodu založenou na elektrochemickém biosenzoru, která nevyžaduje předešlou imobilizaci sondy na elektrodu před hybridizací. Metoda využívá vlastnosti agregace cílové DNA za přítomnosti značení Hoechst 33258. Agregace DNA ukazuje na její kvantifikaci v nízkých hodnotách 36

měřením proudu anodických píků. Tato metoda se prokázala jako rychlá, jednoduchá a efektivní pro kvalitativní a kvantitativní stanovení hovězích složek v krmivu. AHMED et al. (2010) se pokusil stanovit druhovou specifitu použitím kombinace smyčkou zprostředkovaných izotermálních amplikonů pro DNA amplifikaci s následnou elektrochemickou detekcí na jednorázových elektrochemických čipech. Jde o amplifikaci nukleové kyseliny, která rychle množí cílenou DNA s vysokou specifitou a efektivností v izotermálních podmínkách. Tato metoda má potenciál nahradit konvenční DNA amplifikační metody svými čtyřmi smyčkovitými primery, kde je detekováno a amplifikováno šest vzdálených regionů s vysokou koncentrací amplikonů. Je izotermická, takže nepotřebuje termální cykler a v porovnání s PCR je rychlá, specifická a efektivní, prováděná za konstantní teploty s použitím jednoho typu enzymu.

3.5.4 Kvalitativní a kvantitativní možnosti identifikace živočišných druhů

Tab. 3 Porovnání vhodnosti různých částí genomu pro druhovou determinaci podle BALLIN et al., (2009) Kvalitativní detekce živočišných druhů výhody většina buňěk obsahuje Mitochondriální mnoho kopí mtDNA DNA

nevýhody žádné

vysoký stupeň mutace nízký limit detekce jednoduché navržení druhově Jedinečná kopie specifických primerů a vyhnutí se genomické DNA

vysoký detekční limit

mezidruhovému nasedání

Repetitivní DNA

tvoří rozlehlou část genomu nízký detekční limit

degenerování nesnadná interpretace křivky tání obtížné navrhování sondy

37

Kvantitativní detekce živočišných druhů výhody Mitochondriální DNA

nízký detekční limit

počet konstantních kopií Jedinečná kopie umožňuje kvantifikaci založenou na genomické DNA

nevýhody rozdílnost v množství mtDNA v různých tkáních není možná kvatifikace založená na DNA nebo obsahu masa vysoký detekční limit

DNA ekvivalentech

Repetitivní DNA

počet konstantních kopií umožňujících kvantifikaci založenou na genom/genom ekvivalentech nízký detekční limit

degenerování, nesnadná interpretace křivky tání obtížné navrhování sondy

PCR amplikony pro druhovou determinaci můžou pocházet buď z mtDNA nebo genomické DNA, u které lze použít jak jedinečné kopie, tak repetetivní sekvence. Kvantitativní druhová determinace by měla být založena na real-time PCR analýze, kdy by měly být výsledky vyjádřeny v ekvivalentech genom/genom a ne v % obsahu masa (hmotnost/hmotnost). PCR amplifikovaná sekvence pro kvantitativní stanovení musí pocházet z genomické DNA a to buď z jedinečných nebo repetetivních sekvencí, jelikož počet kopií mtDNA se v různých tkáních liší.

38

4 Materiál a metodika práce Výzkumná část práce byla prováděna v laboratoři genetiky Mendelovy University v Brně na ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat. DNA z 20 druhů krmiv pro psy byla extrahována a stanovena její koncentrace. Dále byla DNA izolována z masa 8 živočišných druhů, na které se zkoumala specifita primerů převzatých od třech různých autorů na základě metody PCR a elektroforézy. Následně se testoval výskyt 5 živočišných druhů ve 20 krmivech pro psy metodou PCR s použitím druhově specifických primerů.

Pracovní potřeby: termální cykler PTC – 200 (Peltier Thermal Cycler), stolní centrifuga – HERMLE Z 160 M, Bio vortexV1, Elfo Lightning Volt Power Supply (model OSP – 300), eppendorfovy zkumavky 1,5 ml, tenkostěnné mikrozkumavky pro PCR 0,2 ml, sada mikropipet, špičky k mikropipetám, mrazící box, stojan, sterilní rukavice. Chemikálie: redestilovaná H2O, izolační kit NucleoSpin Food (Marcherey - Negel), směs nukleotidů dNTP mix – dATP, dTTP, dCTP, dGTP, pufr pro PCR, primery, LA DNA polymeráza a UNIS DNA polymeráza (Top-Bio, s.r.o.), roztoky DNA, agaróza (Serva). Vzorky použité k detekci přítomnosti DNA a druhové specifity patří mezi krmiva běžně dostupná na našem trhu. Jejich výčet je uveden pouze podle pořadového čísla v tab. 4. Vzorky od č. 1 do 12 jsou granule od různých výrobců a vzorky od č. 14 do 20 jsou konzervy. Byla zde také zařazena kuřecí moučka pro výrobu granulí od firmy Dibaq – vzorek č. 13.

39

Tab. 4 Označení vzorků a jejich složení Číslo Složení deklarované výrobcem

vzorku

Obiloviny, maso a výrobky živočišného původu, bílkovinné extrakty rostlinného

1

původu, vedlejší výrobky rostlinného původu – oleje a tuky, premix doplňkových látek vit A, D3 a E, minerální látky, zchutňovadla, antioxidanty. Dehydratované drůbeží maso, živočišné tuky, vysoce stravitelné dehydratované

2

drůbeží bílkoviny, drůbeží játra, rybí tuk, hydrolyzovaní korýši, hydrolyzovaná chrupavka.

3 4

Dehydrované drůbeží maso, živočišné tuky, vysoce stravitelné živočišné proteiny, rybí tuk, vaječný prášek, hydrolyzovaní korýši, hydrolyzovaná chrupavka. Dehydratované drůbeží maso, živočišné tuky, hydrolyzované živočišné bílkoviny, dehydratovaná vepřová bílkovina, rybí tuk, vaječný prášek.

5

Maso a deriváty živočišného původu (min 4 % drůbežího masa)

6

Drůbeží maso a produkty drůbežího původu, sušená vejce, drůbeží tuk, lososový olej.

7

Kuře (> 20 %), rybí moučka, živočišný tuk, sušená vejce, kuřecí vnitřnosti.

8

Kuřecí a krůtí moučka, vnitřnosti, živočišný a rybí tuk, vaječná hmota.

9

Maso a výrobky živočišného původu, kuřecí maso, mléko a mléčné deriváty

10

Kuřecí maso (18 %), dehydrované drůbeží bílkoviny, živočišný tuk, vedlejší výrobky živočišného původu, rybí bílkoviny, rybí tuk, sušená vejce, mlezivo.

11

Drůbeží maso a produkty drůbežího původu, drůbeží tuk, lososový olej.

12

Maso a výrobky živočišného původu, oleje a tuky.

13

kuřecí moučka – na výrobu granulí

14

Hovězí maso, drůbeží játra, vedlejší živočišné produkty.

15

Maso a výrobky živočišného původu (42 %, z toho kuře 6 %, krůta 5 %).

16

Maso a výrobky živočišného původu, zvěřina

17

Maso a výrobky živočišného původu (85 % hovězí, 9 % kuře, 4 % králík).

18

Maso a výrobky živočišného původu (42 %, z toho jehněčí 5,4 %).

19

Vepřové maso.

20

Maso a výrobky živočišného původu (drůbeží moučka 28 %), oleje a tuky (drůbeží tuk 4,5%), ryby a vedlejší výrobky z ryb

40

4.1 Izolace genomové DNA z krmiva kolonkovou metodou a elektroforéza DNA z 20 vzorků krmiva byla získána pomocí extrakčního kitu NucleoSpin. Tento extrakční kit se ukázal být v našich laboratorních podmínkách nejvhodnější pro extrakci vysoce degradovaného krmiva tepelným ošetřením. Vyznačuje se vysokou kvalitou extrahované DNA a krátkou inkubační dobou vzorku s lyzačním pufrem (30 min). Izolace byla prováděna na principu kolonek využívajících silikamembrány. Principem kolonkové metody je navázání DNA k silikamembráně a odstranění nečistot, které procházejí přes silikamembránu centrifugaci.

Postup izolace genomové DNA: vzorky krmiva byly rozdrceny, zhomogenizovány, 200 mg krmiva bylo vloženo do 1,5 ml eppendorfovy zkumavky, bylo přidáno 1 100 µl předem nahřátého pufru CF, zvortexovalo se 15 sekund, vzorky byly inkubovány 2 hodiny při 65 °C, poté bylo přidáno 20 µl proteinázy K, inkubováno 30 minut při 65 °C a zcentrifugováno 10 minut při rychlosti 10 000 rpm, do čisté zkumavky bylo přeneseno 300 µl čistého supernatantu s přidáním 300 µl pufru C4 a 300 µl ethanolu, zvortexováno 30 sekund, dále do kolony bylo přepipetováno 750 µl směsi z předešlého kroku, zcentrifugováno 1 minutu při 11 000 rpm a obsah zkumavky byl vylit, do kolony bylo napipetováno 400 µl pufru CQW, zcentrifugováno 1 minutu při 11 000 rpm, obsah sběrné zkumavky byl opět vylit, bylo napipetováno se 700 µl pufru C5, zcentrifugováno 1 minutu při 11 000 rpm znovu byl obsah sběrné zkumavky vylit, bylo přidáno 200 µl pufru C5, zcentrifugováno 2 minuty při 11 000 rpm a vylito, kolona byla umístěna do čisté 1,5 ml zkumavky, přidáno 100 µl elučního pufru CE předehřátého na 70 °C a inkubováno při pokojové teplotě 5 minut, po 1 minutě zcentrifugování při 11 000 rpm byla ve zkumavce obsažena izolovaná DNA. Úspěšnost extrakce DNA byla ověřena elektroforeticky nanesením na 1% agarózový gel.

41

Vizualizace na gelu a elektroforéza Pracovní potřeby pro elektroforézu: TBE pufr, ethidium bromid, agaróza, elektroforetická vana s anodou, katodou, pufrem a vaničkou, externí zdroj stejnosměrného proudu, izolepa, hřebínek, varné sklo, mikrovlnná trouba a rukavice. 1% gel byl připraven z 0,3 g agarózy a 30 ml TBE pufru. Pro ověřování specifity primerů a obsahu živočišných druhů v krmivech byl použit 3 % gel z 0,9 g agarózy a 30 ml TBE. Směs se povařila v mikrovlnné troubě a ochladila na 50 až 60 °C. Poté bylo přidáno 6 µl ethidium bromidu. Na gel bylo naneseno 5 µl DNA smíchaného s nanášecím pufrem obsahujícím směs sacharózy a bromfenolovou modří. Elektroforéza probíhala při napětí 5V/cm (100V) v délce od 20 do 30 minut. Vizualizace gelu se uskutečňila ozářením ultrafialovým světlem, vyfocením a uložením do počítačové podoby. DNA se uchovávala v mrazicím boxu při teplotě – 20 °C.

4.2 Koncentrace DNA Koncentrace DNA 20 vzorků krmiva byla stanovena při 260 nm přístrojem NANODROP 2000 – Spektrofotometr, který umožňuje měření absorbance od 0,5 do 2 µl vzorku. Principem této metody je absorpce UV záření nukleovými kyselinami. Čistota nukleových kyselin byla ověřována z poměru absorbancí 260/280 nm vlnových délek, které se u DNA optimálně pohybují v hodnotě 2. Postup měření: Po kalibraci přístroje NANODROP byl nanesen 1 µl vzorku DNA, kdy výsledná koncentrace a její čistota byla zaznamenána v počítačové formě.

4.3 Ověřování specifity primerů Primery byly převzaty z původních publikací od DALMASSE et al. (2004), RODRIGUEZE et al. (2003) a MATSUNAGA et al. (1999) (Výčet použitých primerů od různých autorů udává tab 5). Tyto primery byly testovány na osmi vzorcích živočišné DNA (tab 6).

42

Tab. 5 Seznam použitých primerů pro testování Živočišný druh

Sekvence (5 ´– 3´)

Velikost PCR produktu

Přímý GTGGGGTATCTAATCCCATC primer (12S

Polymeráza

Gen

Odkazy

UNIS

12S rRNA

Dalmasso al. (2004)

et

UNIS

12S rRNA

Dalmasso al. (2004)

et

UNIS

12S rRNA

Rodriguez et al. (2003) Rodriguez et al. (2003) Rodriguez et al. (2003) Rodriguez et al. (2003) Matsunaga et al.(1999)

FISH A)

Makrela TAA GAG GGC CGG TAA AAC TC obecná(12S

224 bp

FISH B)

Přímý primer (12SFW) Kuře (12SC) Krůta (12ST) Prase (12SS) Přímý primer (SIM) Kuře (C)

CCACCTAGAGGAGCCTGTTCT(AG)TAAT

CCGTCTTAAAGTGAGCTTAGCGG

285 bp

UNIS

12S rRNA

TTGAGCTCACTATTGATCTTTCAGTTT

122 bp

UNIS

12S rRNA

GTTACGACTTGTCTCTTCGTGCA

387 bp

UNIS

12S rRNA

LA

cytochrom b

GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCAT CTTGATGAAA 227 bp

LA

cytochrom b

Skot (B)

CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATA AG CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA

274 bp

LA

cytochrom b

Ovce (S)

CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA

331 bp

LA

cytochrom b

Prase (P)

GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA

398 bp

LA

cytochrom b

Kůň (H)

CTCAGATTCACTCGACGAGGGTAGTA

439 bp

LA

cytochrom b

Matsunaga et al.(1999) Matsunaga et al.(1999) Matsunaga et al.(1999) Matsunaga et al.(1999) Matsunaga et al.(1999)

Tab. 6 vzorky vyizolovaných druhů DNA pro testování primerů Pořadové číslo 1 2 3 4 5 6 7 8

DNA kuře krůta skot prase kůň ovce makrela losos

43

Příprava MASTER MIXU pro testování specifity primerů od DALMASSE et al. (2004) a PCR cyklování Od Dalmasse byl převzatý primer vhodný pro detekci následujících druhů ryb: Oncorhynchus mykiss – pstruh americký duhový, Sardina pilchardus – sardinka obecná, Engraulis encrasicolus – sardel obecná, Mullus sp. – parmice, Sebastes sp. – okouník, Lophius piscatorius – ďas mořský, Scomber scombrus – makrela obecná, Boops boops – očnatec štíhlý, Trigla sp. – štítník, Merlangius merlangus – treska merlang, Acipenser sp. – jeseter a Solea solea – jazyk mořský. Složení reakční směsi pro PCR obsahovalo 8,9 µl redestilované vody, 1,25 µl pufru, 0,25 µl dNTP mixu, přímého primeru 12S FISH A a zpětného primeru 12S FISH B, 0,1 µl polymerázy UNIS a 1,5 µl DNA.

Podmínky PCR reakce byly: 95/2min – (95/30s – 60/1min – 72/1min)35x – 72/10min – 4/∞.

Příprava MASTER MIXU pro testování specifity primerů od RODRIGUEZE et al. (2003) a PCR cyklování Reakční směs pro PCR se skládala z 8,9 µl redestilované vody, 1,25 µl pufru, 0,25 µl dNTP mixu, přímého primeru 12SFW a zpětného primeru 12SC (12ST, 12SS), 0,1 µl polymerázy UNIS a 1,5 µl DNA.

Podmínky pro cyklování byly: 95/2min – (95/30s – 65/30s – 72/30s)35x – 72/10min – 4/∞.

Příprava MASTER MIXU pro testování specifity primerů od MATSUNAGA et al. (1999) a PCR cyklování Složení reakční směsi pro PCR s použitím primerů od Matsunaga: 7,65 µl redestilované vody, 2,5 µl pufru, 0,25 µl dNTP mixu, přímého primeru SIM a zpětného primeru C (B, S, P a H), 0,1 µl polymerázy LA a 1,5 µl DNA.

Podmínky PCR reakce byly: 95/2min – (95/30s – 52/30s – 68/30s)35x – 68/7min – 4/∞. 44

4.4 Detekce živočišných druhů v krmivech Test byl prováděn metodou PCR s následnou elektroforézou na 3% agarózovém gelu. Primery použité pro reakci byly převzaty od MATSUNAGA et al. (1999). Podmínky PCR reakce byly: 95/2min – (95/30s – 52/30s – 68/30s)35x – 68/7min – 4/∞.

Příprava MASTER MIXU pro PCR detekci živočišných druhů Reakční směs pro PCR obsahovala 7,65 µl redestilované vody, 2,5 µl pufru, 0,25 µl dNTP mixu, přímého primeru SIM a zpětného primeru C (B, S, P a H), 0,1 µl polymerázy LA a 1,5 µl DNA.

5 Dosažené výsledky a diskuse 5.1 Izolace DNA Obr. 3 Izolovaná DNA ze vzorků krmiv č. 1 - 10

Obr. 4 Izolovaná DNA ze vzorků krmiv č. 11 - 20

45

Obrázky 3 a 4 potvrzují, že zkoumaná krmiva obsahují určité množství DNA, které bylo podrobeno dalším analýzám pro zjištění přesné koncentrace DNA a následné zjištění druhů živočišného původu v jednotlivých krmivech. DNA byla detekována téměř ve všech vzorcích, i když byla během zpracování krmiv tepelně degradovaná a kvůli tomu se na gelu zobrazuje v různé intenzitě v podobě smíru. U vzorku č. 19 se ilozace nezdařila, a proto není znatelný žádný produkt na gelu. Produkty z materiálu č. 9, 10, 11, 15 a 18 jsou na gelu zobrazeny jen nepatrně, což odpovídá i nízké detekované koncentraci (viz tab. 7).

LOCKLEY a BARDSLEY (2000) se zmiňuje, že DNA je více termostabilní než proteiny a je také přítomná ve většině buněk organismu, což usnadňuje identifikaci kteréhokoliv vzorku. MARTÍN et al. (2007) popisuje, že čím je nižší procento zastoupení hledané příměsi, tím je viditelnost amplifikovaných produktů slabší, což bylo potvrzeno i zde u 20 zkoumaných vzorků. MURUGAIAH et al. (2009) doplňuje, že intenzita produktů není závislá jen na koncentraci, ale také na druhu přítomném ve vzorku. U DNA z prasete potvrdil silnější zobrazení vyizolovaných produktů na gelu na rozdíl od DNA z kura domácího nebo ze skotu. Podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000) testy založené na PCR mohou být prováděny s mnohem nižším množstvím počátečního materiálu díky amplifikaci, kterou tato metoda umožňuje. Tepelné procesy nad 100 °C můžou způsobit spontánní fragmentaci DNA, což je důležitým měřítkem pro spolehlivost testů. Pro získání dobrých výsledků by mělo být pro mikroskopickou metodu použito 5 g vzorku na rozdíl od PCR technik, kdy postačí 0,4 g. Při identifikaci živočišných druhů v krmivu bylo v této práci použito 0,2 g tepelně ošetřených vzorků, které poskytly dostatečné množství mtDNA pro PCR amplifikaci.To je důsledkem použití izolačního kitu NucleoSpin, u kterého je množství 0,2 g vzorku postačující.

Bylo dokázáno, že u masa po 20 minutové vlhké sterilizaci v autoklávu dochází asi k 99 % degradaci DNA. Proto BALLIN et al. (2009) popisuje, že při izolaci nukleových kyselin se musí vzít v potaz stupeň jejich degradace. Ta může být zrealizována procesem nazvaným normalizace, kde amplikony známého množství DNA jsou porovnávány s amplikony DNA přítomnými v nedegradované kontrole. LAUBE et al. (2003) použil dvojitý systém zahrnující druhově specifické a myostatin specifické primery a sondy. Bylo zjištěno, že gen pro myostatin je podobný u savčích a ptačích 46

druhů, a tudíž využitelný pro normalizaci. Byl vyvinut myostatinový systém, který identifikuje 7 různých živočišných druhů a další systém pro savčí druhy byl založený na genu bovinního růstového hormonu. Množství vyextrahované DNA je také závislé na typu tkáně, ze které je získána př. z orgánů se vyextrahuje více DNA než ze svalů.

5.2 Výsledky koncentrace DNA Tab. 7 Koncentrace DNA a její čistota Vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Koncentrace DNA ng/µ µl 1724,8 451,6 255,2 455,3 311,4 107,0 133,1 177,1 19,5 29,1

Čistota DNA 260/280 nm 2,14 2,06 2,09 2,09 2,08 2,00 2,02 2,01 2,03 1,94

Vzorek č. Koncentrace DNA ng/µ µl 11 29,6 12 215,8 13 170,9 14 78,0 15 21,7 16 76,8 17 144,4 18 39,5 19 20 287,7

Čistota DNA 260/280 nm 1,93 2,03 1,84 1,85 1,78 1,89 1,89 1,85 1,97

Tabulka 7 znázorňuje koncentraci a čistotu DNA extrahované z 20 testovaných druhů krmiv. Naměřená koncentrace DNA se pohybovala v rozmezí od 19,5 do 1 724,8 ng/µl. Krmiva obsahující vyšší koncentraci DNA byla také lépe vizualizovaná na elektroforetickém gelu. Čistota DNA se pohybovala od 1,78 do 2,14. Poměr absorbancí při 260/280 nm menší než 1,75 by vypovídal o obsahu kontaminujících bílkovin, což se u žádného vzorku neprokázalo. Tyto výsledky byly dosaženy díky použití enzymu proteinázy K, která štěpí bílkoviny, včetně histonů vázaných na strukturu DNA. Proteináza K má širokou substrátovou specifitu, degraduje mnoho proteinů v nativním stavu i za přítomnosti detergentů (PASTORIS, 2006).

5.3 Specifita primerů Ověřovala se specifita a použití vybraných primerů získaných ze tří různých publikací. Primery byly navrženy na stabilní úsek mitochondriální DNA v oblasti genu pro cytochrom b a 12S rRNA. Tyto primery jsou nejčastěji používány pro detekci živočišných druhů, jelikož mtDNA je variabilní a přítomná v dostatečném množství ve všech buňkách MURUGAIAH et al. (2009). Z následujících obrázků 5 - 7 vyplývá, že jen primery převzaté z publikace od MATSUNAGA et al. (1999) vytváří specifický

47

produkt s druhy DNA, pro které byly navrženy. Tudíž tyto primery se dále použily k identifikaci živočišných druhů v testovaných krmivech. Ostatní primery od dalších dvou autorů vytvářely specifický produkt téměř se všemi druhy živočišné DNA, a proto byly pro další detekci nevhodné.

Obr. 5 Primer převzatý od DALMASSE et al. (2004)

Výše znázorněný gel, u něhož byl aplikován primer pro rybí druhy nasedal na všechny druhy testované DNA. Primery byly navrženy z alternativních dobře uchovávaných a variabilních regionů mitochondriální sekvence. Vazebné místa byly vybírány tak, aby produkovaly specifické amplimery kratší než 300 bp, které mají podle DALMASSE et al. (2004) dobrou využitelnost i u tepelně degradovaného materiálu.

Obr. 6 Primery převzaté od RODRIGUEZE et al. (2003) pro kuře, krůtu a prase

48

Obr. 7 Primery převzaté od RODRIGUEZE et al. (2003) pro kuře, krůtu a prase-pokračování

Na obrázku 6 a 7 byly aplikovány primery prezentované v článku od RODRIGUEZE et al. (2003), kde jsou popisovány jako specifické dávající jednoznačné výsledky. Vzorky jsou znázorněny zprava do leva. Primer pro kuře byl aplikován u obrázku 6 u prvních osmi vzorků. U zbývajících čtyřech vzorků byl aplikován primer pro krůtu, který pokračuje na obrázku č. 7. Posledních osm vzorků obsahuje primer pro prase. Všechny primery vytvářely specifický produkt i u ostatních testovaných druhů. Podle RODRIGUEZE et al. (2003) nebyly potvrzeny žádné nespecifické produkty na jiných testovaných druzích jako hovězí, ovčí, kozí, koňské a králičí DNA.

Obr. 8 Specifita primerů navržená MATSUNAGEM et al. (1999)

Obr. 9 Specifita primerů navržená MATSUNAGEM et al. (1999) - pokračování 49

Výše znázorněné gely (obr. 8 a 9) s navrženými primery z regionu pro cytochrom b od MATSUNAGA et al. (1999) pro kuře, skot, ovci, prase a koně, byly specifické na živočišné druhy, pro které byly konstruovány. Tyto primery byly dále použity pro detekci nukleových kyselin v krmivu. Přímý primer SIM má delší sekvenci než druhově specifické primery, které byly dlouhé 26 – 29 nukleotidů. Zpětné primery byly sestaveny na druhově specifické oblasti. Délka fragmentů se u různých druhů podstatně lišila, a tak mohly být identifikovány bez mezidruhového nasedání. Autor použil vyrovnané množství primerů ve směsi pro 6 různých živočišných druhů v multiplex PCR, ale nedošlo k rovnoměrnému zobrazení na gelu. Při klasickém použití druhově specifických primerů metodou PCR byla v tomto experimentu bezproblémová amplifikace. KRČMÁŘ a RENCOVÁ (2003) popisují, že molekulárně biologické techniky umožňují demonstraci DNA i po její tepelné úpravě s vysokou specifitou a senzitivitou PCR metody, při minimální detekci 0,1 % živočišného materiálu ve zkoumaném vzorku. Délka DNA sekvence se snižuje při teplotě 100 °C na 1 100 bp a při teplotě 120 °C na 600 bp dodává JIA-QIN et al. (2008), což je důležité při navrhování primerů. Vhodné DNA markery pro identifikaci živočišných druhů by měly být mezi druhy dostatečně variabilní (hlavně mezi blízkými druhy) a neměly by vykazovat intraspecifickou variaci. Každý mitochondrion obsahuje několik cirkulárních mitochondriálních genomů, což umožňuje metodám založených na PCR nízký limit detekce již od 0,0001 %, jak bylo

50

zjištěno u kachního masa. Množství mtDNA je různé podle typu tkání, proto je tato detekce vhodná pro stanovení kvality a ne kvantity masa (BALLIN et al., 2009). Mezi nejpoužívanější markery vhodné pro identifikaci druhů nyní patří cytochrom

b –

používaný ze 44 %, 12S – 11 %, 16S – 8 % a D-loop segment – 8 % (TELETCHEA et al., 2005).

5.4 Výsledky detekce živočišných druhů v krmivech Obr. 10 Určení přítomnosti DNA kura domácího

Podle obrázku 10 byla DNA kura domácího přítomna v 19 krmivech, a to ve všech testovaných vzorcích, kromě vzorku č. 19 u kterého se nepodařilo DNA vyizolovat. Podle většiny studií pro identifikaci DNA kura domácího byl použit jako molekulární marker mitochondriální gen cytochrom b. Podle STAMOULISE et al. (2010) se u zpracovaných materiálů mletím a vysokou teplotou, ukázal marker 12S rRNA jako nevhodný, jelikož neamplifikoval žádný PCR produkt. Velmi dobré rozlišení bylo dosaženo použitím restrikčního enzymu Acilu s cytrochromem b. Avšak nejlepší výsledky byly zaznamenány u středně degradovaného materiálu při použití mitochondriálního segmentu 12S rRNA s restrikčním enzymem Acilem, což ukazovalo profil všech testovaných 10 ptačích druhů najednou. MARTÍN et al. (2007) popisuje, že mnoho metod založených na detekci DNA pomocí metody PCR nemůže být použito pro detekci masokostních mouček v krmivu kvůli použité vysoké teplotě při jejich

51

zpracování. Tyto vysoce degradované materiály spoléhají na amplifikaci jen krátkých sekvencí DNA. Přesto kuřecí moučka v tomto experimentu při použití kuřecího primeru vykazovala na gelu jasný specifický produkt.

Obr. 11 Určení přítomnosti DNA skotu

Podle obrázku 11 bylo hovězí maso přítomno celkem ve 12 krmivech, a to ve vzorcích č. 1,2, (3,4,5 – velmi slabě), 10,12,14,15,16,17 a 18. Podle složení krmiv uvedeného v tabulce č. 4 je hovězí maso uvedeno v krmivech č. 14 a 17. Mnoho producentů krmiv většinou místo přesného označení jednotlivých druhů uvádí na obalech výrobky živočišného původu jen obecně, a proto není možno porovnat laboratorně ověřené složení od složení uváděného výrobcem. MARTÍN et al. (2007) se zabýval detekcí DNA skotu pomocí druhově specifické PCR, která se prokázala být vysoce senzitivní, reprodukovatelná a rychlá (méně než jeden pracovní den). I při tepelné degradaci byla detekovatelná v množství 0,1 %. Pro úspěšnou amplifikaci bylo u tepelně degradovaných vzorků důležité použít primery kratší než 150 bp. Primer použitý v této práci pro DNA u skotu má 274 bp. Tato délka neovlivnila amplifikaci DNA z vysoce tepelně ošetřeného granulovaného a konzervovaného krmiva.

52

Obr. 12 Určení přítomnosti DNA z ovce

Podle obrázku 12 byla DNA ovce výrazně detekována ve vzorku č. 10 a velmi slabě u vzorků č. 4,6,7 a 12. Podle výrobců by ve vzorku č. 16 a 18 mělo být obsaženo jehněčí maso. Avšak tyto vzorky nevykazují žádný specifický produkt. Místo toho byla v těchto krmivech detekována DNA kura domácího, skotu a prasete. Podle BLAŽKOVÉ (2008) nejsou normy pro výrobu krmiv tak striktní v porovnání s normami potravinářského průmyslu. Výrobci si je mnohdy upravují podle svých potřeb tak, aby složení odpovídalo normě. Avšak živočišné produkty jsou často nahrazovány lacinějšími, méně kvalitními surovinami, které snižují výrobní náklady a zisk.

53

Obr. 13 Určení přítomnosti DNA prasete

DNA prasete byla zřetelně navázaná u vzorků č. 2,8,10,12,14,16,17,18 a 20. A velmi slabě u vzorků č. 3,4,5,7, a 15. Celkem 14 vzorků krmiva obsahovalo DNA prasete (obr. 13). CHE MAN et al. (2007) popisuje, že použití druhově specifických primerů je rychlou metodou, senzitivní a specifickou pro druhovou identifikaci specielně u výskytu vepřového masa.

Obr. 14 Určení přítomnosti DNA koně

DNA koně nebyla detekována u žádného testovaného krmiva (obr. 14). Koňské maso se na našem trhu vyskytuje velmi málo, proto nebylo nalezeno ani v jednom z testovaných vzorků (ANONYM, 2009a). MARTÍN et al. (2009a) se zabýval detekcí DNA koně 54

v krmivech, kde popisuje, že tepelná degradace DNA způsobuje problémy v amplifikaci hlavně delších fragmentů. Proto upozorňuje na nutnost použití kratších fragmentů než 200 bp. V tomto experimentu byl použit primer o délce 439 bp, což by mohlo ovlivnit PCR amplifikaci. Jelikož tato délka neovlivnila předešlý test na specifitu primerů, předpokládá se, že testované krmivo neobsahuje koňské maso. Nejpoužívanější metodou pro detekci DNA koně je PCR-RFLP, přesto restrikční endonukleáza při detekci ve směsných vzorcích může štěpit různé nespecifické místa. Proto je tato metoda nahrazována PCR s použitím druhově specifických primerů.

Tab. 8 Přehled identifikovaných živočišných druhů v testovaných krmivech Vzorek

kur

skot

ovce

prase

kůň

č.

domácí

1

+

+

-

-

-

2

+

+

-

+

-

3

+

+(velmi slabé)

-

+(velmi slabé)

-

4

+

+(velmi slabé)

+(velmi slabé) +(velmi slabé)

-

5

+

+(velmi slabé)

-

+(velmi slabé)

-

6

+

-

+(velmi slabé)

-

-

7

+

-

+(velmi slabé) +(velmi slabé)

8

+

-

-

+

-

9

+

-

-

-

-

10

+

+

+

+

-

11

+

-

-

-

-

12

+

+

+(velmi slabé)

+

-

13

+

-

-

-

-

14

+

+

-

+

-

15

+

+

-

+(velmi slabé)

-

16

+

+

-

+

-

17

+

+

-

+

-

18

+

+

-

+

-

19

-

-

-

-

-

20

+

-

-

+

-

-

55

Tabulka 8 označuje přítomnost (+) nebo absenci (–) živočišné DNA kura domácího, skotu, ovce, prasete a koně. U vzorku č. 4 byla ve složení uvedená dehydratovaná vepřová bílkovina, avšak obsah DNA prasete byl detekován jako velmi nízký. Granule č. 6 a 8 měly kromě uvedeného masa a produktů drůbežího původu také slabě detekovatelnou DNA prasete. Stejně tak u materiálu č. 7, který obsahoval kromě vepřového i jehněčí maso. Ve vzorku č. 16 a 18 by se mělo podle složení vyskytovat jehněčí maso, což nebylo prokázáno. Vzorek č. 19 má podle složení obsahovat vepřové maso, ale díky nevydařené izolaci DNA nebylo nic detekováno. Ostatní vzorky se shodovaly s uvedeným složením na obalu.

Tab. 9 Detekovaná živočišná DNA u zkoumaných vzorků v %

DNA

% živočišné DNA

Kur domácí

95

Skot

60

Ovce

25

Prase

70

Kůň

0

% zastoupení druhu v krmivu

Graf 1: % živočišné DNA v krmivu 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Kur domácí

Skot

Ovce

Prase

Kůň

Živočišný druh

Podle tab. 9 a grafického znázornění se nejvíce u zkoumaných vzorků vyskytovalo kuřecí, vepřové a hovězí maso. Jehněčí velmi zřídka a v žádném vzorku nebylo detekováno maso z koně. Skopové a koňské maso není na našem trhu v takovém zastoupení jako ostatní testované živočišné druhy, a proto se dá očekávat, že se bude také velmi zřídka vyskytovat v krmivech pro psy.

JIA-QIN et al. (2008) popisuje primární detekci živočišného materiálu za použití obecných primerů 16S rRNA genu sekvence tura, ovce, prasete, kuřete, ryby a mtDNA koně. Druhově specifické primery byly použity pro amplifikaci fragmentů o velikosti 271, 274, 149 a 266 bp. Potvrdil vysokou specifitu a sensitivitu této metody při minimální detekci 0,1 % živočišného materiálu ve zkoumaném vzorku. Pro masitou a kostní moučku jsou 2 metody zpracování, suchý ohřev a mokrý ohřev při teplotě

56

118 – 143 °C. Výsledky z 12 laboratořích v Evropě dokazují, že větší poškození struktury DNA se dosahuje suchým zahříváním.

Nynější metody pro identifikaci živočišných druhů poskytují většinou jasné výsledky ohledně prezence druhů na rozdíl od kvantitativního stanovení obsahu živočišné DNA. Hlavní problém v kvantifikaci falšovaných produktů je v tom, že není známé složení tkání, ošetření materiálu, ani zpracování masa. Počet mitochondriální DNA se odlišuje podle typu tkáně, proto kvantifikace produktů mtDNA bude vždy nepřesná, dokud nebude známo přesné složení tkáně.

Degradace DNA kvůli jejímu zpracování (př. tepelnému) a její následné snížení amplifikace ovlivňuje real-time PCR kvantifikaci. Kvantitativní určení druhů by mělo být založeno na real-time PCR z genomické DNA, kde může být použita jak jedinečná kopie, tak repetitivní sekvence (BALLIN et al., 2009). Real-time PCR je považována za hlavní metodu schopnou analyzovat vzorky jak z kvalitativního, tak kvantitativního hlediska. To by se ukázalo jako zásadní, pokud by se schválil určitý množstevní limit živočišné bílkoviny přítomný v krmivu u hospodářských zvířat (MARTÍN et al., 2009b).

6 Závěr V této práci byla použita metoda PCR s aplikací druhově specifických primerů pro identifikaci živočišných druhů v krmivu. Celkem bylo hodnoceno 20 krmiv z toho 12 granulovaných a 7 konzervovaných, které jsou běžně k zakoupení na českém trhu. Vybíralo se tak, aby se pokrylo veškeré cenové rozpětí a různá kvalita krmiv. U jednoho vzorku se testovala kuřecí moučka, která se přidává do granulovaného krmiva pro psy.

DNA byla izolována z 20 vzorků a její přítomnost byla potvrzena na agarózovém gelu elektroforézou. Koncentrace DNA byla zjišťována na spektrofotometru NANODROP 2000 s hodnotami pohybujícími se od 19,5 do 1 724,8 ng/µl a čistota DNA u absorbance 260/280 nm dosahující hodnot v rozmezí od 1,78 do 2,14.

Primery, u kterých byla testována specifita, byly převzaty ze 3 publikací od různých autorů (DALMASSO et al., 2004, RODRIGUEZ et al., 2003 a MATSUNAGA et al.,

57

1999). Avšak bylo prokázáno, že primery od MATSUNAGA et al. (1999) byly jako jediné specifické na uvedené živočišné druhy, pro které byly konstruovány. Tyto primery byly dále použity pro testování přítomnosti různých živočišných druhů v krmivech. DNA ze vzorku 19 se nepodařilo úspěšně extrahovat, tudíž nebylo možné provést druhovou identifikaci složení krmiva. Většina zkoumaných vzorků, až na dvě výjimky u konzervovaných krmiv, se shodovala s deklarovaným složením uvedeným výrobcem na obalu. U vzorku č. 16 a 18 mělo být přítomné jehněčí maso, které nebylo detekováno. Hlavní složkou všech krmiv bylo kuřecí maso (95%), následovalo vepřové (70%), hovězí (60%) a jehněčí (25%). DNA z koně nebyla detekována v žádném z testovaných krmiv.

58

7 Seznam použité literatury AHMED, Minhaz Uddin; HASAN, Quamrul; HOSSAIN, M. Mosharaf; SAITO, Masato; TAIMYA, Eiichi. Meat species identification based on the loop mediated isothermal amplification and electrochemical DNA sensor. Elsevier : Food Control. 2010, 21, s. 599 - 605. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/foodcont>. ANONYM. PCR: an autstanding method, 2004, s. 65 – 81, Dostupný z: <www.roche.com/pages/facets/pcr_e.pdf >. ANONYM. DNA structure, From Wikipedia, the free encyclopedia, 2008, Dostupný z: . ANONYM, Krmiva pro psy .

a

kočky,

2009a,

Dostupný

z:

ANONYM. Základní principy kvantitativní real-time PCR (qPCR), 2009b, Generi Biotech, Compounds and Services for Molecular Biology, Dostupný z: <www.generibiotech.com>. ANONYM, Na trhu sílí privátní i superprémiové značky, Regal, Management, marketing a logistika v obchodu, 2010, Dostupný z: . BAETEN, Vincent; HOLST, Christoph von; GARRIDO, Ana; VANCUTSEM, Jeroen; RENIER, Antoine Michotte; DARDENNE, Pierre. Detection of banned meat and bone meal in feedstuffs by near-infrared microscopic analysis of the dense sediment fraction. A nal Bioanal Chem. 2005, 382, s. 149-157. ISSN 10.1007/s00216-005-3193-5. BAI, Weibin; XU, Wentao; HUANG, Kunlun; YUAN, Yanfang; CAO, Sishuo; LUO, Yunbo. A novel common primer multiplex PCR (CP-M-PCR) method for the simultaneous detection of meat species. Elsevier : Food Control. 2009, 20, s. 366-370. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/foodcont>. BALLIN, Nicoali Z.; VOGENSEN, Finn K.; KARLSSON, Anders H. Species determination - Can we detect and quantify meat adulteration?. Elsevier : Meat Science. 2009, 83, s. 165 - 174. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/meatsci>. BLAŽKOVÁ, Lenka. Rozhledník: Správné krmení psů a koček (4), Zvířetník, 2008, Dostupný z: <www. neviditelnypes.lidovky.cz>. BELLAGAMBA, F.; MORETTI, V.M.; COMINCINI, S.; VALFRE, F. Identification of Species in ANimal Feedstuffs by Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Mitochondrial DNA. Agricultural and Food Chemistry. 2001, 8, s. 3775-3781. DALMASSO, A.; FONTANELLA, E.; PIATTI, P.; CIVERA, T.; ROSATI, S.; BOTTERO, M. T. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Elsevier : Molecular and cellular Probes. 2004, 18, s. 81-87. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/ymcpr>.

59

DARDENNE, P. Stratfeed, European project n° G6RD-2000-CT-00414, Walloon Agricultural Research Centre, Belgium, 2000, Dostupný z: <www.stratfeed.cra.wallonie.be>. FREZZA, Domenico; GIAMBRA, Vincenzo; CHEGDANI, Fatima; FONTANA, Cecilia; MACCABIANI, Giampietro; LOSIO, Nadia; FAGGIONATO, Elena; Chiappini, Barbara; VACCARI, Gabriele; HOLST, Christoph; LANNI, Luigi; SACCARES, Stefano; AJMONE-MARSAN, Paolo. Standard and Ligh-Cycler PCR methods for animal DNA species detection in animal feedstuffs. Elsevier : Innovative Food Science and Emerging Technologies. 2008, 9, s. 18 - 23. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/ifset>. FUMIERE, Olivier; VEYS, Pascal; BOIX, Ana; HOLST, von Christoph; BAETEN, Vincent; BERBEN, Gilbert. Methods of detection, species identification and quantification of processed animal proteins in feedingstuffs. Biotechnol. Agron. Soc. Environ.. 2009, 13, s. 59-70. GHOVVATI, S.; NASSIRI, M.R.; MIRHOSEINI, S.Z.; MOUSSAVI, A. H.; JAVADMANESH, A. Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay. Elsevier : Food Control. 2009, 20, s. 696 - 699. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/foodcont>. HAEZEBROECK, V.; RENAVILLE, R.; BERTOZII, C.; PARMENTIER, I.; PIRARD, M.; PORTETELLE, D. Molecular traceability of animals and their products. Biotechnology in Animal Husbandry. 2001, 20, s. 333 - 344. HOOPWOOD, A.J.; FAIRBROTHER, K.S.; LOCKLEY, A. K.; BARDSLEY, R. G. An Actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures. Elsevier, Meat Science, Volume 53, Number 4, 1999, s 227 – 231. HUANG, Qing ; YAO, Chun-Yan; CHEN, Bin; WANG, Feng; HUANG, JunFu; ZHANG, Xue; FU, Wei-Ling. Species-specific identification by inhibitor-controlled PCR of ruminant components contaminating industrial crude porcine heparin. Elsevier : Molecular and cellular Probes. 2006, 20, s. 250 - 258. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/ymcpr>. CHAPELA, María José; SOTELO, G. Carmen; PÉREZ-MARTÍN, I. Ricardo; PARDO, Miguel Angel; PÉREZ-VILLAREAL, Begona; GILARDI, Patricia; RIESE, Juan. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification. Elsevier. Food Control, 2007, 18, s. 1211 – 1215, Dostupný z: <www.elsevier.com/locate/foodcont>. CHAUMPLUK, Piyasak; CHIKAE, Miyuki; TAKAMURA, Yazuru; TAMIYA, Eiichi. TAIM Novel electrochemical identification and semi quantification of bovine constituents in feedstuffs. Elsevier : Sceince and technology of advanced materials. 2006, 7, s. 263 - 369. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/stam>.

60

CHE MAN, Y.B.; AIDA, A.A.; RAHA, A.R.; SON, R. Identification of pork derivatives in food products by species-specific polymerase chain reaction (PCR) for halal verification. Elsevier : Food Control. 2007, 18, s. 885-889. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/foodcont>. JIA-QIN, Luo; JIA-QI, Wang; DENG-PAN, Bu; DAN, Li; LI, Wang; HONG-YANG, Wei; LING-Yun, Zhou. Development and Application of a PCR Approach for Detection of Bovis, Sheep, Pig, and Chicken Derived Materials in Feedstuff. ScienceDirect : Agricultural Sciences in China. 2008, 10, s. 1260-1266. Dostupný také z WWW: <sciencedirect.com>. KRČMAŘ, Pavel; RENCOVA, Eva. Identification of Species-Specific DNA in Feedstuffs. Agricultural and Food Chemistry. 2003, 51, s. 7655-7658. KOUBALOVÁ, Veronika. Výroba krmiv a dělení dle obsahu vody, 2009. Dostupný z: . KOUCKÁ, Michaela. White Dart, Staffordshire Bull Terrier kennel – FCI protected, 2008, Dostupný z : . LAUBE, I.; SPIEGELBERG, A. BUTSCHKE, A.; ZAGON, J.; SCHAUZU, M.; KROH, L.; et al. Methods for the detection of beef and pork in foods using real-time polymerace chain reaction. International Journal of Food Science and Technology, 2003, 38(2), s. 111–118. LITT, M. and LUTY, J. A. (1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics, 44, s. 397 – 401. LOCKLEY, A.K.; BARDSLEY, R.G. DNA-based methods for food authentication. Elsevier : Food science and technology. 2000, 11, s. 67-77. MARTÍN, Irene; GARCÍA, Teresa; FAJARDO, Violeta; LÓPEZ-CALLEJA, Inés; HERNÁNDEZ, Pablo E.; GONZÁLEZ, Isabel; MARTÍN, Rosario. Species-specific PCR for the identification of ruminant speies in feedstuffs. Elsevier : Meat Science. 2007, 75, s. 120 - 127. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/meatsci>. MARTÍN, Irene; GACRÍA, Teresa; FAJARDO, Violeta; ROJAS, María; HERNÁNDEZ, Pablo E.; GONZÁLEZ, Isabel; MARTÍN, Rosario. Detection of horse DNA in food and feedstuffs using a polymerase chain reaction assay. Society of Chemical Idustry. 2009a, 89, s. 1202-1206. Dostupný také z WWW: . MARTÍN, Irene; GARCÍA, Teresa; FAJARDO, Nicolette; HERNÁDEZ, Pablo E.; GONZÁLEZ, Gren real-time PCR approach for the detection feedstuffs. Elsevier : Meat Science. 2009b, 82, <www.elsevier.com/locate/meatsci>.

Violeta; ROJAS, María; PEGELS, Isabel; MARTÍN, Rosario. SYBRand quantification of pig DNA in s. 252 - 259. Dostupný také z :

61

MATSUNAGA, T.; CHIKUNI, K.; TANABE, R; MUROYA, S.; SHIBATA, K.; YAMADA, J.; SHINMURA, Y. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Elsevier : Meat Science. 1999, 51, s. 143-148. MEYER, Rolf; CANDRIAN, Urs . PCR - based DNA Analysis for the Identification and Characterization of Food Components. Laboratory of Food Chemistry : University of Berne. 1996, 29, s. 1 - 9. MURUGAIAH, Chandrika; NOOR, Zainon Mohd; MASTAKIM, Maimunah.; BILUNG, Lesley Maurice; SELAMAT, Jinap; RADU, Son. Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA. Elsevier : Meat Science. 2009, 83, s. 57 - 61. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/meatsci>. PASTORIS, Pichia, Proteinase K, recombinant, PCR Grade, Roche Applied Science, 2006, Germany. Dostupné z: <www.roche-applied-science.com>. PINOTTI, Luciano. Image analysis and microscopy: a useful combination. Biotechnol. Agron.Soc.Environ.. 2009, 13, s. 21-24. PINTO, Angela Di; FORTE, Vito Tony; GUASTADISEGNI, Maria Corsignano; MARTINO, Carmela; SCHENA, Francesco Paolo; TANTILLO, Giuseppina. A comparison of DNA extraction methods for food analysis. Elsevier : Food Control. 2007, 18, s. 76-80. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/foodcont>. RAAMSDONK, L.W.D. ; HOLST, C.; BAETEN, V.; BERBEN, G.; BOIX, A.; JONG, J. New developments in the detection and identification of processed animal proteins in feeds. Elsevier : Animal feed science and technology. 2007, 133, s. 63 - 83. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate/anifeedsci>. REID, Linda M.; O DONNELL, Colm P.; DOWNEY, Gerard. Recent technological advances for the determination of food authenticity. Elsevier : Trends in food science and technology. 2006, 17, s. 344 - 353. Dostupný také z: <www.elsevier.com/locate>. RODRÍGUEZ, M.A.; GARCÍA, T.; GONZÁLEZ, I.; ASENSIO, L.; MAZORAL, B.; LÓPEZ-CALLEJA, I.; HERNÁNDEZ, P.E.; MATÍN, R. Identification of Goose, Mule Duck, Chicken, Turkey, And Swine in Foie Gras by Species-Specic Polymerase Chair Reaction. Agricultural and Food Chemistry. 2003, 51, s. 1524 - 1529. RODRÍGUEZ, Miguel A.; GARCÍA, Terese; GONZÁLEZ, Isabel; HERNÁNDEZ, Pablo E.; MARTÍN, Rosario. TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures. Elsevier : Meat Science. 2005, 70, s. 113 - 120. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/meatsci/>. RUMLOVÁ, Michaela; PAČES, Václav; RUML, Tomáš. Základní metody genového inženýrství. Laboratorní manuál. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze : 2003, s. 1 - 55. ISBN 80-86313-12-3.

62

STAMOULIS, P.; STAMATIS, C.; SARAFIDOU; T.; MAMURIS, Z. Development and application of molecular markers for poultry meat identification in food chain. Elsevier : Food Control. 2010, 21, s. 1061-1065. Dostupný také z WWW: <elsevier.com/locate/foodcont>. SNUSTAD, Peter, D.; SIMMONS, Michael, J.; Genetika, Z anglického originálu Principles of genetics, Masarykova Univerzita, nakladatelství Brno, 2009, s. 871, ISBN 978-80-210-4852-2. SALAH, M. Abdel-Rahman; MOHAMED, A.; EL-SAADANI, KHALLID M.; HAGGAG, Ashry; HAGGAG, Amany S. Detection of Adulteration and Identification of Cat´s, Dog´s, Donkey´s and Horse´s Meat Using Species-Specific PCR and PCRRFLP Techniques, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2009, 3, s. 1719 – 1719, ISSN 1991-8178. ŠMARDA, Jan; DOŠKAŘ, Jiří; PANTUČEK, Roman RUŽIČKOVÁ, Vladislava; KOPTIKOVÁ, Jana. Metody molekulární biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, 2008, s. 181, ISBN 978-80-210-3841-7. TELETCHEA, Fabrice. Molecular identification methods of fish species: reassessment and possible applications. Springer. 2009, 19, s. 265 - 293. TELETCHEA, Fabrice; MAUDET, Celia; HANNI, Catherine. Food and forensic molecular identification: update and challenges. Elsevier. 2005, 7, s. 359-366. Dostupný také z WWW: <sciencedirect.com>. VACÍK, J.; BARTHOVÁ, J.; PACÁK, J.; STRAUCH, B.; SVOBODOVÁ, M.; ZEMÁNEK, F. Přehled středoškolské chemie, Státní pedagogické nakladatelství, 1999, s. 365, ISBN 80-7235-108-7. VODRET, B.; MILIA, M.; ORANI, M.G.; SERRATRICE, G. and MANUCO, M.R. Detection of genetically modified organisms in food: Comparison among three different DNA extraction methods. Veterinary Research Communications, Springer, 2007, 31, s. 385–388. WAGNER, Carolin. MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG, Nucleic Acid Purification, Neumann Neander, 2010, Germany. Dostupný z: <www.mn-net.com>. WEINER, Anna; KWIATEK, Krzysztof. Evaluation of the usefulness of PCR method for the detection of processed animal protein in feedingstuffs. Bull Vet Inst Pulawy. 2008, 52, s. 411-415.

63

8. Seznam tabulek Tab. 1 Citlivost PCR metod podle AHEME, (2004) Tab. 2 Výčet používaných DNA metod pro ověření pravosti potravin podle LOCKLEY a BARDSLEY (2000) Tab. 3 Porovnání vhodnosti různých částí genomu pro druhovou determinaci podle BALLIN et al., (2009) Tab. 4 Označení vzorků a jejich složení Tab. 5 Seznam použitých primerů pro testování Tab. 6 vzorky vyizolovaných druhů DNA pro testování primerů Tab. 7 Koncentrace DNA a její čistota Tab. 8 Přehled identifikovaných živočišných druhů v testovaných krmivech Tab. 9 Detekovaná živočišná DNA u zkoumaných vzorků v %

64

9. Seznam obrázků Obr. 1 Termální cykler PTC – 200 Obr. 2 Mitochondriální DNA (Wikipedia) Obr. 3 Izolovaná DNA ze vzorků krmiv č. 1 - 10 Obr. 4 Izolovaná DNA ze vzorků krmiv č. 11 - 20 Obr. 5 Primer převzatý od DALMASSE et al. (2004) Obr. 6 Primery převzaté od RODRIGUEZE et al. (2003) pro kuře, krůtu a prase Obr. 7 Primery převzaté od RODRIGUEZE et al. (2003) pro kuře, krůtu a prase-pokračování Obr. 8 Specifita primerů navržená MATSUNAGEM et al. (1999) Obr. 9 Specifita primerů navržená MATSUNAGEM et al. (1999) – pokračování Obr. 10 Určení přítomnosti DNA kura domácího Obr. 11 Určení přítomnosti DNA skotu Obr. 12 Určení přítomnosti DNA z ovce Obr. 13 Určení přítomnosti DNA prasete Obr. 14 Určení přítomnosti DNA koně

65