MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2010
NELA DAŇKOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Způsoby archivace DNA a jejich využití Bakalářská práce
Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.
Vypracovala: Nela Daňková
Brno 2010
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Způsoby archivace DNA a jejich využití vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
Dne……………………………………….
podpis…………………………………….
PODĚKOVÁNÍ
Děkuji vedoucímu bakalářské práce prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D., za podnětnou pedagogickou a odbornou pomoc a další cenné rady při zpracování mé bakalářské práce. Chtěla bych také poděkovat PhDr. Aleně Daňkové za pomoc s jazykovými úpravami.
Abstrakt V práci na téma Způsoby archivace DNA a jejich využití jsou popsány jednotlivé metody archivace DNA z hlediska teplot (+4,-20,-80, -196 ° C, pokojová teplota), rovněž formy vzorku, ve kterých lze DNA uchovávat (roztok, vysušený stav). Je vysvětlena kvalita DNA, jednotlivé způsoby, kterými může být negativně ovlivněna, a to během procesu archivace i izolace. Dále metody UV-absorpční spektrometrie, gelové elektroforézy, polymerázové řetězové reakce (PCR) i PCR v reálném čase (Real-Time PCR), kterými lze kvalitu DNA stanovit. Práce zahrnuje i opodstatnění nutnosti archivace v různých odvětvích a problémy spojené s jejím provedením. Na závěr jsou diskutovány výhody a nevýhody jednotlivých metod archivace.
Klíčová slova: DNA, archivace, kvalita DNA, degradace, izolace
Abstract The thesis entitled The technique of archiving DNA and its utilization describes various methods of archiving DNA in terms of temperature (+4, -20, -80, -196 ° C, room temperature), as well as sample forms, which can store DNA (solution, anhydrous basis). The quality of DNA is explained, as well as different ways, in which it may be adversely affected, namely during the process of archiving, and isolation. Furthermore, it deals with methods of UV-absorption spectrometry, gel electrophoresis, polymerase chain reaction (PCR) i Real-Time PCR, which can determine the quality of DNA. This work also includes the foundation of necessity of archiving in different sectors, and problems associated with its implementation. In conclusion, the advantages and disadvantages of different methods of archiving are being discussed.
Keywords: DNA, archiving, quality of DNA, degradation, isolation
OBSAH 1
ÚVOD............................................................................................................... 9
2
CÍL PRÁCE .................................................................................................... 10
3
STRUKTURA DNA....................................................................................... 10
4
POTŘEBY ARCHIVACE DNA .................................................................... 11
5
KVALITA DNA ............................................................................................. 14
6
PARAMETRY KVALITY DNA ................................................................... 15
7
8
6.1
Nízký stupeň degradace deoxyribonukleové kyseliny............................ 15
6.2
Kontaminace ........................................................................................... 16
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ KVALITU DNA ............................................... 17 7.1
Teplota .................................................................................................... 17
7.2
pH............................................................................................................ 19
7.3
Iontová síla.............................................................................................. 20
7.4
Ultrafialové záření .................................................................................. 20
7.5
Ionizující záření ...................................................................................... 21
7.6
Mechanické síly ...................................................................................... 22
7.7
Ultrazvuk ................................................................................................ 22
7.8
Nukleázy ................................................................................................. 22
SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A KVALITOU DNA ................................. 23 8.1
Odběr biologického materiálu, ze kterého má být DNA izolována........ 23
8.2
Lyze buněčných obalů a membrán ......................................................... 24
8.3
Oddělení kontaminujících látek .............................................................. 26
8.4
Zakoncentrování DNA............................................................................ 29
9
ARCHIVACE DNA ....................................................................................... 31
10
ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ DNA ................................................................ 32 10.1
Rozdělení dle teploty .............................................................................. 33
10.2
Rozdělení dle formy vzorku ................................................................... 35
10.2.1
Rozpuštěný ve vodném roztoku...................................................... 35
10.2.2
Rozpuštěný v pufru ......................................................................... 35
10.2.3
Ve formě vysušeného peletu........................................................... 36
10.2.4
Ve formě precipitátu v 70% EtOH ................................................. 37
10.2.5
Navázaný na pevný nosič ............................................................... 38
10.3
Rozdělení dle časového hlediska ............................................................ 38
10.3.1
Krátkodobá archivace ..................................................................... 38
10.3.2
Dlouhodobá archivace .................................................................... 39
10.4
Archivace DNA za pokojové teploty...................................................... 40
10.4.1
Chitosan .......................................................................................... 41
10.4.2
FTA® papír ...................................................................................... 42
10.4.3
SampleMatrix® technologie............................................................ 46
11
SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A ARCHIVACÍ DNA ............................... 48
12
METODY URČENÍ KVALITY DNA ........................................................... 49 12.1
UV absorpční spektrometrie ................................................................... 49
12.2
Elektroforéza........................................................................................... 51
12.3
Polymerázová řetězová reakce (PCR) a Real-Time PCR....................... 53
13
ZHODNOCENÍ JEDNOTLIVÝCH ZPŮSOBŮ ARCHIVACE ................... 55
14
ZÁVĚR ........................................................................................................... 59
15
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................ 60
1
ÚVOD Tak jako je třeba uchovávat jakékoli informace, které zjistíme či objevíme
v různých odvětvích vědy, proto, abychom se k nim mohli vrátit, opětovně je použít či na jejich základě uskutečnit další výzkum, je nutné, aby se toto dalo provést i v rámci metod molekulární genetiky, a to při výzkumu kyseliny deoxyribonukleové. S nezadržitelným rozvojem oborů jako molekulární biologie, genetika, buněčná biologie, biochemie a ostatních, které se zabývají studiem této ´životadárné´ kyseliny, se stejným tempem rozvíjí i techniky a možné manipulace s touto kyselinou. Jednou z nich je právě i archivace neboli uchovávání DNA. Protože jsou v molekulách DNA uchovány prostřednictvím kódu všechny dědičné vlastnosti organismu, detaily metabolických přeměn, struktury bílkovin, enzymů a morfologické zvláštnosti organismu, je DNA předmětem zásadního výzkumu. Pro výzkum DNA je, aniž by se to na první pohled mohlo zdát, velmi důležité i takové uchovávání vzorků kyseliny deoxyribonukleové, které zajistí bezpečné uskladnění vzorků DNA po dlouhou dobu, a tím i možnost tyto vzorky kdykoli znovu pro výzkum použít. Je nutno uvědomit si, že pokud je z biologického materiálu získána sebevíc kvalitní DNA a je archivována takovým způsobem, kdy podmínky skladování nezajistí dostatečné zachování její kvality, je DNA znehodnocena a nemůže být použita pro další analýzy a důsledkem toho dochází ke ztrátě veškeré genetické informace, která je v ní zakódována, což může mít velký dopad, například měl-li být vzorek využit pro lékařský výzkum nebo měl-li být uložen v genetické bance pro potřeby zachování druhu. Důsledek ztráty vzorku znehodnocením je o to fatálnější, jestliže k tomuto dojde u vzácných vzorků nebo v nejhorším případě, nejde-li znehodnocený vzorek DNA nahradit vzorkem novým. Je tedy zřejmé, že je velmi důležité a potřebné zabývat se archivací DNA a hledat co nejvýhodnější způsoby jejího provedení.
9
2
CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce, která je založena na literární rešerši, je jednoznačně
popsat a shrnout problematiku archivace DNA, a podat tak v českém jazyce ucelený výklad na toto téma. Vysvětlit důvody, proč se archivace DNA provádí, jak to zasahuje do různých oblastí vědy. Na základě prostudované odborné literatury sjednotit a popsat jednotlivé metody uchovávání, které existují a jsou běžně využívány, jejich principy, odlišnosti. Také objasnit
souvislost
mezi
procesem
izolace,
archivace
a
kvalitou
kyseliny
deoxyribonukleové, kdy jedno s druhým úzce souvisí a dále výrazně ovlivňuje veškeré další studie DNA a na základě toho i závěry a výsledky výzkumem dokázané. V práci budou také diskutovány přínosy a omezení jednotlivých způsobů uchovávání z hlediska zajištění kvality DNA během procesu archivace a rovněž komplexně, tedy z hlediska ostatních aspektů, které s archivací souvisí.
3
STRUKTURA DNA Deoxyribonukleová kyselina, zkráceným názvem DNA, je právě tím činitelem,
který umožňuje uchování i přenos genetické informace. Patří spolu s ribonukleovou kyselinou mezi nukleové kyseliny, sám název odvozený od slova nucleus – jádro ukazuje, že tvoří důležité složky buněčného jádra. U eukaryotních organismů DNA spolu s proteiny tvoří v jádře buněčné struktury chromozomy, dále ji nalezneme i mimo jádro v buněčných organelách mitochondriích a u rostlin také v chloroplastech. U prokaryotních organismů se DNA vyskytuje ve formě nukleoidu. Obě nukleové kyseliny jsou lineární polymery složené z jednotlivých článků, které obsahují kyselinu fosforečnou, a to jednu molekulu na jeden článek řetězce, deoxyribosu v DNA a ribosu v RNA, obdobně 1 molekulu pentosy na jeden článek řetězce a jako boční části řetězce heterocyklické dusíkaté báze. Tyto báze jsou purinové – adenin (A), guanin (G) a pyrimidinové – cytosin (C), tymin (T) (Bresler, 1979).
10
4
POTŘEBY ARCHIVACE DNA Abychom mohli DNA uchovávat, nejprve ji vůbec musíme nějak ´dostat´ z buněk
organismu. Předpokladem archivace je tedy získání DNA z požadovaného materiálu, což se provádí izolací, která bude osvětlena v dalších kapitolách. Nebo DNA nemusí být přímo extrahovaná a lze uchovávat jednotlivé části tkání, pletiva, krev a jiné vzorky, které molekuly DNA obsahují. Kyselina deoxyribonukleová se uchovává pro mnoho různých účelů. V současné době je archivace DNA vysoce potřebná a uložené vzorky jsou využívány v mnoha oblastech, jako jsou molekulární biologie, lékařská diagnostika, populační genetika, forenzní analýzy, biotechnologie a zasahuje v podstatě do veškerého výzkumu, který má co do činění s kyselinou deoxyribonukleovou.
Nejčastější důvody požadavku archivace jsou: •
uchování vzorků DNA v laboratoři pro potřeby dalšího výzkumu
Po tom, co je DNA z biologického materiálu získána a nelze ji bezprostředně poté analyzovat, či byla-li analýze podrobena a do budoucna bude ještě tento vzorek pro jiné analýzy potřebný či po analýze čeká například na zaslání do jiného výzkumného ústavu, nelze jej jednoduše nechat bez jakéhokoli zaopatření a je třeba jej vybranou vhodnou metodou archivovat, aby byla zachována jeho kvalita, a byl tak pro všechny analýzy efektivně využitelný. •
zajištění referenčního vzorku pro identifikaci osob
Pomáhá při hledání a identifikaci pohřešovaných osob v případě neštěstí nebo přírodní katastrofy. Důležité je to zejména pro osoby, které vykonávají vysoce nebezpečná zaměstnání - armáda, policie, bezpečnostní agentury, hasiči, váleční zpravodajové, vymahači práva apod. (Genomac, online). Molekulární kriminalistika, která se zabývá vyšetřováním trestných činů na základě využívání molekulárně-biologických metod, provádí identifikaci osob na základě analýzy DNA z odebraných biologických vzorků, jimiž může být vzorek krve, výtěr z bukální sliznice, vlasy a jiné. Vzorek DNA se poté uchovává a může sloužit jako referenční vzorek, tedy jako vzor či předloha pro srovnání s jinými vzorky, to dopomáhá
k určení
totožnosti
pachatelů či 11
obětí
trestných
činů
(Kočárek,
2007). Analýza nemusí proběhnout bezprostředně po činu, na základě analýzy archivovaného odebraného materiálu byla během posledních několika let uzavřena řada starých případů a pachatel postaven před soud (Brown, 2007). Každý člověk je jedinečný, a to nejen svým fenotypovým projevem, ale hlavně svojí genetickou výbavou (Brdička, 2001). Proto metody zjišťování profilu DNA vycházejí z toho, že s výjimkou jednovaječných dvojčat nejsou kopie genomu dvou různých jedinců identické (Brown, 2007). •
zajištění referenčních vzorků od jednotlivých členů rodiny
Toto je vhodné pro možnou identifikaci dědičných onemocnění v rodině, archivaci rodokmenu (Genomac, online). Jedinec nemusí mít výhradně stejný zdravotní stav jako jeho rodiče nebo jiní biologičtí příbuzní, ale analýza DNA někoho z příbuzných může umožnit nalézt geny zodpovědné za nemoc v rodině. Jestliže je známo, jaké genetické rozdíly se v rodině nacházejí, jedinec a jeho potomci se na základě genetického testování mohou dozvědět o svém vlastním riziku vzniku onemocnění. Poté je získání informace o této skutečnosti výhodné pro různá preventivní opatření a léčbu. Na základě poznatků analýzy DNA se také sestavují rodokmeny. DNA je kromě papírových záznamů a dokumentů důležitým nástrojem pro genealogy, kteří hledají stopy po našich předcích. Archivace DNA tak může přinést důležité informace, které mohou do budoucna doplnit původní poznatky či vytvářet poznatky nové (DNA Direct, online). •
uchovávání referenčních vzorků v rámci populačně genetických nebo epidemiologických studií (Genomac, online).
•
uchovávání DNA rostlin
Je důležité v rámci zachování geneticky cenných materiálů a tím genetické diverzity, aby se zamezilo vyhynutí rostlinných druhů a zachovala se možnost jejich využívání. V tomto případě nejde o uchovávání izolovaných vzorků DNA, ale o uchovávání vegetativních částí rostlin či semen s cílem zachovat jejich genetickou rozmanitost. Pro zachování úplné původní genetické informace, by neměl být objektem 12
archivace pyl a buněčné organely, používají se tedy semena, části živých rostlin, z nichž lze původní genotyp regenerovat (hlízy, oddenky, pupeny aj.) a rostlinné explantáty (Dotlačil a kol., 2005). To má vést k zachování genetických zdrojů a také k možnosti efektivně a setrvale je využívat ve šlechtění a v biotechnologiích, což má význam pro zemědělskou výrobu, kdy je tak zachována její stabilita a snížena závislost na agrochemikáliích a energiích (Bednář, Vyhnánek, 2004). •
archivace DNA chovných zvířat
Využívá se pro možnou identifikaci, detekci dědičných chorob, kdy se určují onemocnění, vady nebo náchylnost k nim, a ve šlechtitelské praxi pro potřeby křížení (Genomac, online).
V dnešní době se DNA archivuje pro potřeby výzkumných i zdravotnických institucí, ale i pro účely jednotlivců, kdy tyto nadstandardní služby provádí komerční laboratoře za nemalou finanční částku. Také v rámci zachování druhů, jako projekt Zmrazená Archa, kdy je potřeba uložit genetický materiál ohrožených druhů a zabránit tak jejich vyhynutí (Clarke, 2009). S archivací DNA, kdy jde o uchovávání vzorků pro lékařské výzkumy či v rámci zmíněných komerčních laboratoří, je spojená problematika ochrany osobních údajů. Při odběru vzorků, analýze a následné archivaci DNA musí být dodrženy právnické a etické náležitosti. Každá laboratoř by si měla vést svoji interní kartotéku, která poskytuje přehled o jednotlivých zpracovaných a uložených vzorcích DNA. Měla by obsahovat především jména pacientů, jejich rodná čísla, údaje o diagnózách a data odběrů biologického materiálu (Kočárek, 2007).
13
5
KVALITA DNA Kyselina deoxyribonukleová je poměrně stabilní molekula (Bresler, 1979), i přesto
však podléhá různým poškozením, která vznikají v důsledku působení mnoha faktorů. Na stabilitu DNA má vliv mnoho chemických a fyzikálních činitelů (Guschlbauer, 1980).
Strukturu DNA v podstatě stabilizují tři druhy sil. A to tyto: •
vodíkové vazby
Vodíkové vazby mají povahu slabých chemických interakcí. Mají význam při určování vzájemného sousedství molekul a také při formování tvaru. Pokud jsou přítomny jednotlivě, nejsou dostatečně silné, aby udržely dva atomy pohromadě (Watson, 1982). Vodíkové vazby se nachází mezi komplementárními bázemi. Jejich prostřednictvím se báze specificky párují, nejsou však hlavními silami, které DNA stabilizují. •
vrstvící síly
Struktura DNA se stabilizuje vrstvícími (hydrofobními) silami, které jsou způsobené vzájemnou interakcí π-elektronů aromatických bází. Interakcí tohoto typu vzniká v polynukleotidovém řetězci dost pevné charakteristické vrstvení bází. •
iontové vazby Důležitost iontových vazeb mezi negativními fosfátovými skupinami je v tom,
že redukují elektrostatické odpuzování mezi negativními náboji cukr-fosfátové kostry polynukleotidů. Pokud chybí ionty s opačnou polaritou, dvoušroubovice DNA přechází do denaturovaného stavu (Guschlbauer, 1980).
Počátečním krokem pro molekulárně biologické či genetické analýzy a jakýkoli výzkum v této oblasti je izolace genetického materiálu. A tím je deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA). Po vyizolování tohoto genetického materiálu z buňky žádné ochranné reparační mechanismy, které automaticky působí v organismu a které by alespoň částečně zabránily poškození DNA, nefungují. Získaná extrahovaná DNA tedy může být ještě 14
fatálněji znehodnocována přímým vlivem vnějších okolních podmínek. To je však pro následující práci s vyizolovanou deoxyribonukleovou kyselinou vysoce nežádoucí, protože je potřebná kvalitní DNA. Principů izolace a jejich modifikací je velmi mnoho. Použitý způsob záleží na charakteru zdroje, z něhož má být DNA nebo RNA izolována (tkáň, pletivo, semena, krev aj.), a zejména závisí na požadované čistotě a kvalitě nukleové kyseliny pro konkrétní účely (Hruban a kol., 1999). Požaduje se, aby při izolačních metodách byla získána nukleová kyselina v nativním stavu, dostatečném množství a kvalitě. Kvalita izolovaného materiálu často rozhoduje o úspěšnosti navazujících postupů (Šmarda a kol., 2005). Kvalitou purifikovaných nukleových kyselin je myšlena absence kontaminantů a nízký stupeň degradace (nalámání). Pro různé metody molekulární biologie je požadována rozdílná kvalita purifikované nukleové kyseliny (Hanáček, 2009).
6
PARAMETRY KVALITY DNA
6.1 Nízký stupeň degradace deoxyribonukleové kyseliny Degradací se myslí rozpad DNA na menší fragmenty (Kočárek, 2007). Při tomto lámání dochází k přerušení fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy v dlouhých polynukleotidových řetězcích (Rosypal a kol., 1983). DNA se poté láme na menší fragmenty, což zapříčiňuje snížení její kvality. K tomuto nežádoucímu procesu může dojít například působením chemických či fyzikálních vlivů nebo enzymů, ale i mechanickými silami. V důsledku degradace tak dochází k přetváření struktury, kdy molekula DNA podléhá depolymeraci a rozpadá se na různě dlouhé úseky. Změny struktury deoxyribonukleové kyseliny se tedy projeví rozpadem dlouhých molekul DNA na menší fragmenty. Při postupu izolace DNA je nutné přidat chtelatační činidlo, za jeho nepřítomnosti se totiž zvyšuje stupeň fragmentace (Karyagina a kol., 1976). Tímto způsobem může být vzorek DNA natolik znehodnocen, že jeho kvalita už nebude dostačující pro využití v následujících technikách a analýzách.
15
Vysoký stupeň degradace DNA snižuje počet molekul DNA, které jsou použitelné pro PCR a schopné úspěšné amplifikace. Tato technika je velmi rozšířená a v dnešní době hojně používaná pro analýzy DNA, a proto je využití fragmentované DNA pro takové aplikace omezeno. Vyšší fragmentace DNA je více pravděpodobná při narušení požadovaného úseku, který má být namnožen, a tím eliminuje jeho dostupnost pro amplifikaci PCR. To má také dopad na cílenou délku amplikonu. Když jsou požadovány dlouhé amplikony, je o to více pravděpodobné, že dojde ke zlomu v řetězci, a tím méně molekul je k dispozici pro amplifikaci. Jsou-li pro amplifikaci požadovány kratší cílové úseky, je výskyt zlomů méně pravděpodobný, a proto mají větší šanci být úspěšně namnoženy. Proto krátké amplikony a nízká fragmentace zvyšují šanci pro úspěšné provedení amplifikace (Ehrich a kol., 2007). Doty a kol. (1959) uvádí, že vlivem ultrazvuku nebo hydrodynamických polí může být molekula DNA rozlámána na kousky, aniž by došlo k porušení Watsonovy a Crickovy dvojité šroubovice Pro makromolekuly DNA o určité délce řetězce existuje takový kritický gradient rychlosti toku, při kterém začíná fragmentace. I při velmi malých rychlostech, např. při vyfukování proudu roztoku DNA z pipety, je DNA o značné molární hmotě podrobena fragmentaci. Aby byla DNA před fragmentací chráněna, je třeba se vyvarovat jakéhokoliv hydrodynamického gradientu (Bresler, 1979).
6.2 Kontaminace Kvalitu DNA a tím i její použitelnost pro navazující postupy, a v důsledku toho i preciznost získaných výsledků, velmi ovlivňuje také výskyt kontaminantů. Kvalitní DNA z hlediska obsahu kontaminantů je taková DNA získaná z buněčného materiálu, která
je
zbavená
všech
ostatních
složek,
které
nejsou
součástí
kyseliny
deoxyribonukleové. Vzorek DNA může obsahovat přirozeně se nacházející složky, které jsou jinak součástí molekul DNA v buňce, ostatní buněčné komponenty, proteiny, RNA a jiné nečistoty. Všechny tyto kontaminanty jsou odstraněny postupem izolace. Purifikovaná DNA však může velmi snadno podlehnout kontaminaci způsobené všudypřítomnými nečistotami, které se mohou nacházet na pracovních nástrojích, v okolní atmosféře či na samotném laboratorním personálu.
16
Proto, abychom získali kvalitní vzorek DNA, který bude dále analyzován nebo bude archivován, je třeba, aby se při postupu izolace dodržovaly všeobecně platné zásady. Pro zajištění toho, aby byl vzorek co nejméně znehodnocen degradací, je nutné jej velmi šetrně zpracovávat. Také je důležité použít všechny dostupné prostředky, které zajistí očištění od různých příměsí a znečištěnin, a zabrání tak kontaminaci. I přesto, že se pro získání kvalitní DNA z rozdílných druhů biologických vzorků využívají specifické postupy, dodržují se zásady, které jsou pro všechny případy shodné.
Mezi základní předpoklady k získávání kvalitní DNA patří (Bednář a kol., 1999): •
volba správné iontové koncentrace extrakčních a purifikačních roztoků
•
vhodné pH prostředí
•
co největší snížení aktivity enzymů degradujících DNA
Předpokladem pro to, aby mohla být DNA efektivně analyzována či archivována, neberou-li se nyní v potaz vlivy, které na vzorek působí následovně, je právě její dostatečná kvalita, která se zajistí vhodným a pečlivým procesem izolace.
7
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ KVALITU DNA Existuje spousta činitelů, kteří mají vliv na stabilitu DNA (Guschlbauer, 1980).
Působením těchto faktorů může docházet k degradaci kyseliny deoxyribonukleové. Je znehodnocována její struktura a tím je negativně ovlivněna její kvalita. Nejčastější faktory, které mohou způsobit znehodnocení nukleových kyselin, jsou teplota, pH, ionizující a neionizující záření, iontová síla roztoku a další. Významnou roli v posuzování kvality DNA hraje i faktor času. Také přítomnost iontů kovů jako Mg2+ a Ca2+ ve vzorku DNA je nežádoucí. Ionty aktivují funkci enzymů (nukleáz), které taktéž způsobují znehodnocení kyseliny deoxyribonukleové.
7.1 Teplota Nativní DNA účinkem tepla, ale i louhu nebo kyseliny, mění nejen svoje optické, ale i hydrodynamické vlastnosti (Guschlbauer, 1980). 17
Uspořádané seskupení vodíkových vazeb se stává méně stabilní, jestliže se jejich teplota zvyšuje nad fysiologickou teplotu. Je-li roztržen významný počet vazeb, ztrácí molekula svůj původní tvar a zaujímá inaktivní (denaturovanou) konfiguraci (Watson, 1982). Vlivem zvýšené teploty dochází v molekulách DNA k výrazným změnám. Je obecně známo, že jestliže zahříváme DNA na teplotu 80°C, probíhá prudké tání pravidelné dvoušroubovicovité struktury a DNA denaturuje (Bresler, 1979). Během denaturace DNA dochází k přechodu dvoušroubovicových molekul DNA ve volné polynukleotidové řetězce. Tento jev je způsoben uvolněním vodíkových vazeb mezi bázemi komplementárních řetězců (Rosypal a kol., 1983). Nukleotidové složení DNA se podél řetězce značně mění a při zahřívání takových polymerů nebude tání probíhat současně po celé délce řetězce, ale zpočátku budou tát oblasti bohaté na AT páry (Bresler, 1979). Proces denaturace začíná už při teplotě nad 50 °C, úplná je ale až při teplotě 95 °C nebo vyšší. (Hanáček, 2009). Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se zkratkou Tm (Rosypal, 2005) (Obr.1).
Obr. 1: Průběh denaturace DNA za standardních podmínek (Kočárek, 2007)
18
Tm závisí na : •
zastoupení GC-párů
•
pH
•
iontové síle
•
složení roztoku
Čím více CG-párů DNA obsahuje, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Při pomalém vyhřívání roztoku DNA je dvoušroubovicová konformace v určitém rozmezí teplot ještě stabilní. V následujícím teplotním intervalu se na molekulách objevují a postupně zvětšují denaturované úseky. Významné je, že při pH 13 dochází k disociaci řetězců dvojřetězcové molekuly DNA již při pokojové teplotě. Přidáním některých organických látek, např. formamidu, lze teplotu Tm snížit (Rosypal a kol., 1983). Denaturaci lze vyvolat jak dostatečným zvýšením teploty, tak i působením jiných vlivů, např. navozením alkalických podmínek (Rosypal, 2005). Při působení vysokých teplot také dochází k porušení glykozidových vazeb mezi purinovou bází a cukrem, čímž dochází k depurgaci, nebo mezi pyrimidinovou bází a cukrem, kdy se jedná o depyrimidinaci. Fosfoglycidová páteř v obou případech zůstává zachována (Rosypal, 2001).
7.2 pH V kyselém i zásaditém prostředí dochází k porušení dvoušroubovicové struktury DNA (Obr.2). V kyselé oblasti jsou změny struktury způsobeny vazbou protonů na aminoskupiny adeninu, guaninu a cytosinu. Obyčejně při tom dochází k uvolnění vodíkových můstků a k denaturaci šroubovicové struktury DNA. Příčinou nestálosti šroubovicové struktury v zásaditém prostředí je zřejmě kyselá disociace OH skupin, které se vytvářejí u guaninu a thyminu (Bresler, 1979). Působením silných kyselin rovněž dochází k porušení glykozidových vazeb a molekula DNA je měněna depurinací či depyrimidinací (Rosypal, 2001).
19
Obr. 2: Tání sekundární struktury DNA při extrémních hodnotách pH (Bresler, 1979, upraveno)
7.3 Iontová síla Čím vyšší je koncentrace anorganických iontů, tedy iontová síla roztoku, tím více je dvojřetězcová DNA stabilizována. Naopak snížení iontové síly prostředí povede k destabilizaci dvojřetězcové molekuly. (Kočárek, 2007)
7.4 Ultrafialové záření Polynukleotidy světlo pohlcují v důsledku konjugovaných dvojných vazeb (elektronových párů) v heterocyklech bází (Bresler, 1979). A díky nim má každá molekula své absorpční spektrum s maximy při určitých vlnových délkách, takže energie fotonů, které mají různé vlnové délky, je různě intenzivně absorbována (Rosypal a kol., 1983). Účinky ultrafialového záření mají na molekulu DNA negativní vliv. UV záření je DNA selektivně absorbováno. Kyselina deoxyribonukelová absorbuje především UV-B a UV-C záření. Excitace DNA vede k vytvoření fotoproduktů, z nichž nejvýznamnější jsou pyrimidinové dimery. Bezprostředně po expozici je výskyt zlomů v řetězci DNA velmi nízký, ale mohou se poté vytvářet nepřímo pozdější inkubací. 20
Nejdůležitějším přírodním zdrojem UV záření je slunce, které vyzařuje UV záření v celém rozsahu. Ozonová vrstva absorbuje většinu UV-C záření, takže větším problémem se zdá být jen UV-B a UV-A záření (Obe, Vijayalaxmi, 2007). Působením ultrafialového záření na DNA vznikají v prostředí buňky dimery, které mají mutagenní účinek. Buňka má však specifické enzymy, které vyštěpují vzniklé tyminové dimery, a tím poškozenou DNA částečně reparují (Guschlbauer, 1980). Kejnovský, Kypr (1993) dospěli ke zjištění, že pufr Tris chrání strukturu řetězce DNA před zlomy, ke kterým dochází působením ozáření ultrafialovým světlem. Ve své práci dokázali, že molekuly pufru Tris chrání DNA před vytvářením zlomů po ozáření ultrafialovým světlem. Tento ochranný účinek se však týká pouze kostry DNA, a ne bází. Jejich pokus byl prováděn v prostředí vodného roztoku, a ne ve formamidu. Změny pH nebo iontové síly způsobené Tris pufrem nemají na ochranu DNA žádný vliv.
7.5 Ionizující záření Po ozáření složité organické sloučeniny, jako je DNA. může důsledkem ionizace atomů docházet k chemickým reakcím a změnám. Ionizované atomy se uvolňují z chemických vazeb, dochází k disociaci molekul a vznikají vysoce reaktivní radikály, které dále chemicky reagují s molekulami látky (Klemš, 2009). Jak je již dlouho známo, molekulu deoxyribonukleové kyseliny mohou měnit elektrony, které mají dostatek energie k ionizaci nebo elektronové excitaci DNA. Působením ionizujícího záření na DNA dochází v řetězci DNA k vytváření zlomů. Avšak nedávno bylo zjištěno, že poškození DNA mohou způsobit také elektrony o ještě nižší energii (1 eV a méně) (Berdys a kol., 2004). Poškození DNA v prostředí in vivo je způsobeno hlavně oxidací volnými radikály, kvůli přítomnosti reaktivních kyslíkových forem, jako je superoxid a hydroxylové radikály. Působením ionizujícího záření ve vodném prostředí se vytváří hydratované elektrony a další reaktivní elementy, většina poškození DNA ve vodném roztoku je však zapříčiněna působením hydroxylových radikálů. Oxidace volnými radikály způsobuje chemickou degradaci ve vodném roztoku. Poškození vzniklé oxidací je ještě výrazně zvýšeno přítomností stopových kovů (např. Fe3+, Cu2+) (Middaugh a kol., 1998).
21
7.6 Mechanické síly Kyselina deoxyribonukleová se vyskytuje ve formě dlouhého tenkého dvojvlákna, je však velmi křehká, a proto může být snadno poškozena, ať už tlakem, mechanickými silami nebo účinkem enzymů. Aby mohla být izolována nativní DNA v neporušené formě, je třeba vzít na vědomí veškeré vlivy, které by její strukturu mohly porušit či poškodit. Už jen při samotné izolaci DNA z buněčného materiálu hrozí riziko jejího znehodnocení, také pipetování může způsobit poškození DNA (Guschlbauer, 1980). DNA si při dodržování šetrných podmínek zachovává svoji strukturu, ale již po krátkém míchání roztoku DNA dochází k částečné depolymerizaci (Bresler, 1979).
7.7 Ultrazvuk Působení ultrazvuku také dokáže degradovat purifikovanou DNA ve vodném roztoku. V práci Elsnera a Lindblada byla tato skutečnost dokázána působením ultrazvuku o intenzitě, která se běžně používá v klinických aplikacích, na vodný roztok DNA a DNA v biologických vzorcích. K degradaci DNA v roztoku po vystavení ultrazvukovému působení dochází rozbitím vodíkové vazby, což se projeví zlomy v jednom či obou řetězcích DNA šroubovice. Tento proces způsobí dva mechanismy, a to kavitace a účinek tepelný nebo mechanický. Zlomy v šroubovici DNA se vyskytují hlavně mezi atomy kyslíku a uhlíku (Elsner, Lindblad, 1989). Ryabchenko a kol. (1964) prokázali, že kinetika degradace původní dvojřetězcové DNA pomocí ultrazvuku se řídí zákonitostí vlastnotí jednořetězcových polymerů. Jejich výzkum naznačuje, že degradace makromolekuly DNA pomocí ultrazvuku je výsledkem současného prasknutí dvojřetězcové DNA, a nikoliv důsledkem akumulace jednotlivých zlomů v řetězcích DNA.
7.8 Nukleázy Nukleázy rovněž způsobují degradaci DNA, jsou to enzymy, které katalyzují hydrolýzu fosfodiesterových vazeb mezi jednotlivými nukleotidy v polynukleotidových řetězcích (Rosypal, 2001). Za normálních podmínek se nacházejí v cytoplazmě buňky a 22
štěpí nukleové kyseliny (Kočárek, 2007). Jejich působením tedy dochází k významnému znehodnocení kyseliny deoxyribonukleové. Proto je důležité se při manipulacích s DNA vyvarovat jakékoli kontaminace nukleázami. Chelatační činidlo má vlastnost vázat dvojmocné ionty kovů, hořčíku a vápníku, které jsou známy tím, že podporují degradaci DNA, protože působí jako kofaktory pro enzymy štěpící DNA. Činidlo s ionty reaguje tak, že vytvoří komplex, čímž je zajištěna inaktivace těchto nežádoucích nukleáz. Pro správnou činnost chelatačního činidla, které váže dvojmocné kovy, je důležité zajištění alkalického pH v rozmezí 8,0-9,5. Takto se zabrání působení nukleáz, které degradují DNA. Jako báze může posloužit Tris, který je slabou organickou bází, anebo lze použít anorganické báze jako uhličitan či hydrogenuhličitan alkalického kovu, a to například sodíku, lithia nebo uhličitan či hydrogenuhličitan draselný (Burgoyne, online).
8
SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A KVALITOU DNA Pro izolaci DNA z požadovaného vzorku se používá celá řada různých protokolů a
v poslední době se také často používají komerčně vyráběné soupravy neboli kity. Provedení izolace za použití těchto kitů je sice rychlejší, ale finančně náročnější. Ve většině případů však spolehlivě funguje klasická fenol-chloroformová metoda (Zima a kol., 2004). Nebo adsorpce na silikát, na níž jsou kity založeny. Postup izolace zahrnuje následující kroky:
8.1 Odběr biologického materiálu, ze kterého má být DNA izolována DNA můžeme izolovat z nejrůznějšího biologického materiálu, kterým může být rostlina, živočich nebo lidský organismus. •
rostlina
Jako zdroj DNA u rostlin je možné použít jakékoli pletivo, klíční rostliny, semena či rostliny in vitro kultur. Izolace vysoce polymerní DNA z rostlinného materiálu je daleko obtížnější než izolace z bakteriálních nebo živočišných buněk vzhledem k existenci celulózní buněčné stěny. Při izolaci celkové rostlinné DNA je výsledkem
23
izolace směs všech typů DNA, a to jaderné (nDNA), chloroplastové (cpDNA) a mitochondriální (mtDNA) kyseliny deoxyribonukleové. Pro molekulární analýzu rostlinného genomu je vždy nutné mít dostatečné množství DNA v potřebné kvalitě. Proto se v izolačních postupech zaměřuje na odstranění kontaminantních sacharidů, proteinů a polyfenolů (Bednář a kol., 1999). •
živočich
U živočichů může být DNA izolována z jakékoliv živočišné tkáně obsahující nativní buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používá i celých jedinců. V tomto případě však samozřejmě hrozí kontaminace parazity, symbionty a zbytky potravy. U jednobuněčných živočichů se někdy používá postup, při kterém se nejprve daný jedinec rozmnoží a DNA je potom izolována ze všech jedinců najednou. U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se dá DNA snadno izolovat z krve, to se používá například i u malých druhů ptáků a ryb. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství krve. U malých savců nebo obojživelníků lze velmi kvalitní DNA získat z čerstvé tkáně, obvykle však postačí například s odstřihnutý konec ocásku nebo části prstu, takže zvíře nemusí být usmrceno. Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako je trus (Zima a kol., 2004). Lze použít i spermie. A pro potřeby mikroanalýzy postačí i pár chlupů s váčkem (Hruban a kol., 1999). Tyto techniky jsou však poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci (Zima a kol., 2004). •
lidský organismus
U člověka jsou nejčastějším výchozím materiálem pro izolaci DNA solidní tkáně (normální i nádorové), buněčné kultury, leukocyty periferní krve, chloridové klky, buňky získané stěrem ze sliznic nebo mikroorganismy a viry ( Křemen a kol., 1998).
8.2 Lyze buněčných obalů a membrán Pro izolaci nepoškozené DNA se vyžaduje velmi šetrná dezintegrace tkáně nebo buněk. K uvolnění protoplastu (buněčného obsahu) dojde rozrušením buněčných obalů. K této lyzi buněčných stěn se mohou použít mechanické prostředky či enzymové štěpení v závislosti na tom, o jaký typ buňky jde. 24
Jsou-li výchozím materiálem bakteriální buňky, musí se nejprve odstranit pevná bakteriální stěna, která je mechanicky velmi odolná. Pro tyto účely se volí enzym lysozym, který hydrolyticky štěpí proteoglykany bakteriální stěny (Křemen a kol., 1998), nebo etyléndiamin tetraacetátu (EDTA) či jejich kombinace. EDTA odstraňuje ionty hořčíku nutné k ochraně struktury buněčných obalů a také inhibuje buněčné enzymy, které by mohly DNA degradovat (Brown, 2007). Kromě toho se přidávají detergenty (tenzidy), které napomáhají rozpadu buněčných membránových struktur díky tomu, že odstraňují molekuly lipidů. Jako detergenty se používají látky komerčně označené jako Tween 20, Triton X100, nebo lauryl sulfát sodný, který je běžněji označován jako SDS (sodium dodecylsulfát sodný). SDS je negativně nabitý polykationt. Kromě toho, že má detergentní účinky, také působí jako denaturační činidlo a způsobuje disociaci DNA, kdy se oddělí od proteinů (Hruban a kol., 1999). Jestliže chybí chelatační činidlo, stupeň fragmentace DNA se značně zvyšuje. Solubilizace
je
doprovázena
ztrátou
některých
histonů
a
nenhistonových
chromosomálních proteinů. Odstranění jaderné membrány a velké části proteinů detergentem
Triton
X
100
napomáhá
degradaci
chromatinu
a
vzniku
nízkomolekulárních fragmentů (Karyagina a kol., 1976). Stěny buněk rostlin a hub se od stěn buněk bakteriálních liší svým chemickým složením, a proto vyžadují jiné způsoby degradace. Často se využívá mechanické dezintegrace kombinované s působením degradačních enzymů (Šmarda a kol., 2005). U rostlinných pletiv se používají enzymy celulázy nebo hemicelulázy, většinou se však postupuje levněji, kdy se rostlinný vzorek zmrazí v kapalném dusíku a následně se rozmělnění na jemný prášek. Lyze živočišných buněk se docílí jednodušeji, protože buněčná stěna chybí, lze ji tedy indukovat jemnějšími metodami, např. slabými neiontovými detergenty (Šmarda a kol., 2005). U tkání bohatých na pojivo se k usnadnění homogenace používají enzymy typu proteas (kolagenasa, elastasa, proteiasa K.) (Křemen a kol., 1998). Po rozrušení buněčné stěny a plazmatické membrány se v roztoku nachází jejich degradační produkty spolu s nitrobuněčnými složkami. Ze vzniklé komplexní směsi DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů nízkomolekulárních látek a uhlovodíků je třeba extrahovat pouze čistou, kvalitní DNA.
25
Lyze buňky obvykle vede k fragmentaci chromozomové DNA. Pokud se má izolovaná DNA zachovat intaktní, tedy neporušená, je nutné použít co nejjemnějších podmínek lyze. Je vhodné udržovat lyzační směs v pufrovaném médiu a chladu. Důležité je rovněž vyhnout se fragmentaci DNA, ke které může dojít při pipetování lyzátu (Šmarda a kol., 2005). Mechanické rozdrcení, jeden z nejčastěji používaných postupů homogenizace rostlinného materiálu, však také někdy může způsobit částečnou degradaci DNA (Bednář a kol., 1999).
8.3 Oddělení kontaminujících látek Obě nukleové kyseliny se nacházejí v buňkách ve formě nukleoproteinů. Proto, chceme-li získat čistou deoxyribonukleovou kyselinu, je třeba ji při postupu izolace uvolnit z vazby na proteiny a samozřejmě také odstranit další buněčné komponenty, které jsou v tomto případě potenciálními kontaminanty. Odstranění proteinů je při purifikaci DNA velmi důležité, protože buňky obsahují jednak řadu enzymů, které kyseliny degradují, jednak také proteiny, které se na DNA vážou. Svou přítomností by tak mohly omezovat účinnost následujících experimentů (Šmarda a kol., 2005). Protože vzniklý buněčný extrakt obsahuje tedy kromě DNA také kontaminanty, je třeba DNA od této směsi oddělit. Existuje celá řada postupů, jak toto provést. Jedním ze způsobů, jak získat čistou DNA, je působení látkami, které degradují kontaminanty (Obr.3a), např. metoda organické extrakce. Další metody jako iontoměničová chromatografie jsou založeny na principu rozdělení směsi na složky. Poté je DNA oddělena od nežádoucích příměsí (Obr.3b) (Brown, 2007). .
26
Obr. 3: Dva způsoby purifikace DNA: a) Smíchání směsi s reagenciemi, které degradují kontaminující součásti v čistém roztoku DNA; b) Rozdělení směsi na dvě frakce, z níž v jedné se nachází čistá DNA (Brown, 2007, upraveno)
Pokud je to technicky možné, je dobré okamžitě po odběru vzorků přidat látky zabraňující činnosti nukleáz. K ochraně DNA před účinkem DNáz se obvykle používá chelatační činidlo EDTA či citrát sodný. EDTA, etylen-diamino-tetraoctová kyselina, je sloučenina s vysokou afinitou k řadě kovů. Používá se jako součást mnoha pufrů k zastavení činnosti enzymů vyžadujících kov jako kofaktor (Hruban a kol., 1999). Svým působením vyváže vápníkové a hořčíkové ionty nezbytné pro funkci enzymů, které by jinak štěpily DNA. Proto, abychom co nejvíce snížili aktivitu těchto enzymů, které degradují DNA, je také třeba práci provádět při snížených teplotách, je vhodné pracovat s chlazenými roztoky (Křemen a kol., 1998). V případě, že by nukleázy zůstaly aktivní, došlo by k rozštěpení DNA a jakákoli další analýza genetického materiálu by byla bezpředmětná (Kočárek, 2007). Dále se EDTA používá k zabránění adheze buněk, jako antikoagulační látka a vůbec ke konzervaci biologických materiálů. Zpravidla jde o dvojsodnou sůl Na2EDTA (Hruban a kol., 1999).
27
Odstranění RNA z purifikované DNA lze snadno dosáhnout působením ribonukleázy (Rnázy). Přečištění purifikované nukleové kyseliny působením zmíněných enzymů se používá jen v některých postupech. Pokud určitá kontaminace nukleové kyseliny není v daném postupu na závadu nebo k jejímu odstranění postačují následné purifikační kroky, je možné tento krok vynechat (Šmarda a kol., 2005). U rostlin je také nutno odstranit nežádoucí polysacharidy, které tvoří buněčnou stěnu. Provádí se tak vysrážením DNA cetyltrimetylamóniumbromidem (CTAB) nebo tetraetylamoniumbromidem (TEAB). Pro důkladné odstranění bílkovinných příměsí od DNA se používají různá činidla, která zajistí denaturaci proteinů. DNA zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, aniž by došlo k poškození její struktury (Bednář a kol., 1999). Disociaci DNA od proteinů způsobí přidaný tenzid, například výše zmíněný SDS; umožní oddělení DNA od histonů. Dokonalé degradace disociované bílkoviny se dosahuje pomocí proteolytických enzymů, které jsou aktivní v přítomnosti tenzidů (proteinasa K nebo pronasa) (Křemen a kol., 1998). K oddělení denaturovaných proteinů a lipidů od požadované DNA se obvykle používá
fenolová nebo fenol-chloroformová extrakce. Jednotlivé typy nukleových
kyselin se extrahují do vodné fáze v závislosti na hodnotě pH použitého pufru, zatímco proteiny se denaturují a vysráží. Alkalický pufr (pH = 8) extrahuje DNA s malou kontaminací ribonukleovými kyselinami, kdežto při kyselém pH (4,5-6) se extrahují převážně rRNA a nízkomolekulární RNA. Jednotlivé fáze, tedy fáze vodná s extrahovanou DNA a fáze organická, se oddělí nízkoobrátkovou centrifugací (Křemen a kol., 1998). Po extrakci fenolem máme k dispozici vodný roztok DNA zbavený proteinů, který je však příliš naředěný a navíc obsahuje další kontaminanty, nově přítomné zbytky fenolu a chloroformu. Obzvláště fenol má určitý stupeň rozpustnosti ve vodě a mohl by způsobit nežádoucí denaturaci enzymů při další práci s purifikovanou deoxyribonukleovou kyselinou (Šmarda a kol., 2005). Jak už bylo výše zmíněno, existuje i spousta dalších metod purifikace DNA. K novějším technikám patří například metoda využívající adsorpce nukleových kyselin na silikátový povrch a oproti fenol-chloroformové metodě je rychlejší, bezpečnější a zajišťuje získání vysoce čisté DNA (Kočárek, 2007).
28
8.4 Zakoncentrování DNA Purifikovanou DNA je nutno zakoncentrovat neboli zahustit, což se provádí vysolením a precipitací (Hruban a kol., 1999). DNA se z vodné fáze vysráží ethanolem (případně isopropanolem) za přítomnosti solí jako NaCl, octanu sodného či draselného a poté se precipitát oddělí centrifugací od kontaminujících nízkomolekulárních látek (např. nukleotidů) (Křemen a kol., 1998). Protože soli mohou být částečně sráženy spolu s DNA, precipitát se promývá 70% ethanolem a tím se soli odstraní (Šmarda a kol., 2005). Takto získaný precipitát je připraven pro následné úpravy a analýzy.
Riziko kontaminace Protože neustále hrozí nebezpečí kontaminace, je třeba dodržovat zásady práce, které zajistí sterilní prostředí. Nejde jen o kontaminaci vzorků DNA mikroorganismy, potem na rukou, který obsahuje nukleázy, a vzorků navzájem, ale i o nebezpečí kontaminace zásobních roztoků a reakčních komponentů, např. enzymů, primerů apod.. Proto, aby se zabránilo znečištění, se při práci s DNA většinou používají gumové (chirurgické) rukavice. Veškeré manipulace jako nabírání, promíchávání či přenášení vzorků DNA a dalších reakčních komponentů se provádí prostřednictvím pístových pipet s pevným či nastavitelným objemem a reagencie se nabírají do nasazených plastikových špiček. Všechny manipulace s DNA se obvykle provádí v plastikových nádobách a zkumavkách. Laboratorní nádobí jako zkumavky, špičky, vícejamové desky a komůrky, kultivační misky apod. se používají výhradně jednorázově (Hruban a kol., 1999). Zabránění kontaminace docílíme tím, že veškerá práce bude prováděna za sterilních podmínek. Roztoky budou autoklávované, rukavice a veškeré laboratorní nádobí a pomůcky budou sterilní (Křemen a kol., 1998).
Z popsaného postupu izolace deoxyribonukleové kyseliny je zřejmé, že pokud chceme získat kvalitní DNA, musíme při její purifikaci ze vzorku odstranit ostatní složky. V tomto případě se i látky, které se jinak v buňce nacházejí spolu s DNA přirozeně, stávají potenciálními kontaminanty. Všechny tyto nečistoty negativně ovlivňují kvalitu DNA a v podstatě ji znehodnocují.
29
S deoxyribonukleovou kyselinou je také třeba opatrně zacházet, dbát na správné pipetování, vyvarovat se energického třepání a míchání, které by ji mohlo rovněž znehodnotit mechanickým poškozením.
Požadavek kvality DNA u různých metod Při některých metodách, v rutinních a rychlých vyšetřeních, například při těch, která jsou založena na amplifikaci DNA pomocí PCR, postačí DNA horší kvality a v nízké koncentraci a je možné použití rychlejší a méně nákladné metody izolace (Zima a kol., 2004). Pro PCR detekci je zcela dostačující zjednodušený postup izolace, znečištění vzorku kontaminanty jako proteiny, jejich fragmenty a jinými látkami není omezující. Pokud potřebujeme DNA pouze k analytickým účelům, zvolíme drastičtější metody, které povedou k částečné degradaci DNA (depolymeraci) (Bednář a kol., 1999). V extrémním případě lze použít pouhé zlyzované buňky (Zima a kol., 2004). Je tedy možné pracovat semisterilně a při jednorázových vyšetřeních (diagnostika) i nesterilně. Pro jiné metody, například pro potřeby klonování a sekvencování či hybridizační techniky je zapotřebí, aby DNA byla ve vysoce čisté formě a měla vyšší koncentraci. Je tedy nezbytné pracovat sterilně, aby se zabránilo nežádoucím kontaminacím jako znečištění DNA bakteriemi a plísněmi (Hruban a kol., 1999). Například DNA určená k hybridizaci musí být zbavena kontaminujících látek, jakými jsou např. glykogen, proteiny nebo ionty kovů, které by mohly bránit reasociaci DNA. Rovněž požadavky na množství a integritu izolované DNA se mohou u různých metod podstatně lišit. Například pro potřeby polymerázové řetězové reakce se nevyžaduje velké množství výchozího materiálu, zatímco pro podrobné genetické analýzy je vhodné připravit požadovaný vzorek
DNA v dostatečném zásobním
množství. Jiné typy analýz jako pulzní gelová elektroforéza nebo štěpení BAL 31 vyžadují zase vysokou integritu izolované DNA (Šmarda a kol., 2005).
30
9
ARCHIVACE DNA V poslední době je velmi diskutovanou problematikou uchovávání kyseliny
deoxyribonukleové. Pro některé potřeby je požadováno vzorek DNA skladovat krátkou dobu, avšak jestliže je pro navazující genetické analýzy potřebná její archivace po dobu delší, zvyšuje se tím riziko možné degradace, což je samozřejmě nežádoucí, a proto je tím více vynakládáno úsilí o zachování její kvality. Ať už je třeba uchovat vzorky kyseliny deoxyribonukleové na krátkou dobu pro běžná laboratorní použití nebo na čas mnohonásobně delší, například pro archivaci v DNA bankách, společným rysem obou těchto případů by mělo být vytvoření takových podmínek skladování, které zajistí vhodné prostředí pro uchovávání DNA, během kterého bude zachována její chemická i fyzikální integrita. Před uložením vzorku je třeba pečlivě zvážit dobu, po kterou má být uchováván, a zvolit vhodnou metodu archivace, která zajistí optimální ochranu DNA, kdy během skladování DNA nebude znehodnocena vůbec nebo jen minimálně.
Kyselina deoxyribonukleová je považována za poměrně stabilní makromolekulu. Například oproti RNA je daleko méně reaktivní, což vyplývá z její molekulové struktury. Tento chemický rozdíl mezi DNA a RNA je usuzován z různého chování cukerných složek. Ukázalo se, že sloučeniny ribosy jsou mnohem labilnější než sloučeniny deoxyribosy, protože hydroxylová skupina na 2´ uhlíkovém atomu umožňuje např. alkalickou hydrolýzu řetězce. Kromě toho je ribosa, obsahující hydroxylové skupiny na 2´ a 3´ uhlíkových atomech, na tomto místě lehko atakovatelná různými oxidačními činidly. Deoxyribosa tyto vlastnosti nemá (Bresler, 1979). I přesto však molekula DNA podléhá různým změnám. Z hlediska archivace se bere v potaz působení různých činitelů, kteří mohou zapříčinit znehodnocení DNA v průběhu skladování. Na vzorek izolované DNA působí mnoho činitelů, kteří mohou způsobit takováto znehodnocení. Jsou to již zmíněné DNázy, ionizující a ultrafialové záření, volné radikály a mnoho dalších vnějších podmínek, které molekuly DNA destabilizují (Baust, 2008). Problém stability DNA spočívá v tom, že jestliže DNA, kterou separujeme z buňky a purifikujeme od zbylých buněčných komponentů, necháme stát při pokojové teplotě, je rychle degradována nebo fragmentována deoxyribonukleázami. 31
Ve skutečnosti je pozvolná degradace DNA přirozenou vlastností vzorku a působí v každém vzorku bez ohledu na podmínky skladování. Cílem efektivní archivace je však minimalizovat tuto rychlost rozkladu DNA (Anchordoquy, Molina, 2007) a vytvořit takové podmínky, při kterých nebude DNA ohrožena působením nepříznivých vlivů okolního prostředí. Je tedy snaha snížit rychlost degradace na co nejnižší stupeň a pro tyto účely se používají různá opatření, která zajistí stabilitu molekul DNA.
10 ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ DNA Přesto, že jsou využívány pro uchovávání DNA různé metody, které jsou založeny na úplně odlišných principech , společným znakem jich všech je nutnost zachování kvality uložené DNA po celou dobu, po kterou je potřeba vzorek archivovat. DNA by měla být po procesu archivace použitelná pro různé genetické analýzy, jako PCR, hybridizace, sekvenování a celou škálu různých potřebných technik. Způsob skladování nukleové kyseliny závisí na její velikosti, konformaci a dalším využití (Šmarda a kol., 2005). V praxi se pro uchování DNA běžně využívají různé strategie, které se odlišují teplotou, při níž se DNA skladuje, a také tím, v jaké formě se uchovávaný vzorek nachází (Baust, 2008). V současné době se pro skladování nebo přepravu DNA běžně využívají různé metody,
při
kterých
je
purifikovaná
kyselina
deoxyribonukleová
izolovaná
z genetického materiálu stabilizována převedením do vysušeného stavu nebo je převedena na kapalné skupenství a následně je uchovávána za různých teplotních podmínek. Kyselina deoxyribonukleová se může uchovávat zamražená v precipitovaném stavu v ethylalkoholu nebo vysušená v lyofilizovaném stavu či ve vodném roztoku, případně v pufru, což se využívá nejčastěji (Knoll, Vykoukalová, 2002).
32
10.1 Rozdělení dle teploty Archivace se provádí za různých teplotních podmínek, při kterých se významně liší způsob ochrany molekul DNA, a to (Baust, 2008): •
při teplotě +4 ° C
•
při teplotě -20 ° C
•
při teplotě -80 ° C
•
při teplotě -196 ° C
•
při pokojové teplotě
Při teplotách +4,-20,-80 a -196 ° C v principu jde o uchovávání vzorků DNA za snížených teplot. Obecně je totiž známo, že působením snížených teplot, tedy chlazením, resp. zmrazením, se omezí molekulární pohyblivost, a proto je při uchovávání za takovýchto podmínek zajištěno zachování integrity molekul DNA po dlouhou dobu (Anchordoquy, Molina, 2007).
Nevýhodou těchto způsobů uchovávání je však to, že chceme-li vzorek DNA opětovně použít, je nutno jej rozmrazit a opakovaným rozmrazováním a zamrazováním dochází ke znehodnocování DNA. Bylo prokázáno, že proces zmrazování roztoku DNA má za následek zjevný úbytek DNA templátu pro PCR. To může souviset s vodnou fází, která se stále více koncentruje jako kapalná voda a přeměňuje se na ledové krystalky před tím, než celkový objem nakonec zamrzne za předpokladu, že konečná teplota je dostatečně nízká. Tento efekt může také vysvětlit poněkud větší stabilitu vodných vzorků skladovaných při +4°C a podstatně nižší stabilitu vzorků uchovávaných při teplotě -20 ° C (Podivinsky a kol., 2009). Výjimkou je archivace při pokojové teplotě, která je založená na jiném principu, kdy je DNA navázána na pevné matrici a uchovávána za běžných laboratorních teplot. Během manipulací a samotné archivace je vhodné, aby DNA nebyla vystavována přímému slunečnímu záření, které způsobuje její degradaci; z toho důvodu je žádoucí DNA skladovat v takových podmínkách, kde bude před působením světla chráněna. Je dostačující, je-li vzorek, který není bezprostředně používán v laboratoři, uložen v uzavřeném chladicím či mrazicím zařízení, nebo je-li při skladování za pokojových teplot skladován v laboratorních skříních.
33
Jak je výše zmíněno, způsob archivace je ovlivněn velikostí DNA. Ve dvojřetězcových nukleových kyselinách je adenin spojený dvěma vodíkovými vazbami s tyminem nebo guanin spojený třemi vodíkovými vazbami s cytosinem (Rosypal, 2001). Vytváří se tak páry bází a právě počet těchto párů bází udává velikost neboli délku dvojřetězcové deoxyribonukleové kyseliny. K označení délky dvojřetězcové molekuly se používá zkratka bp (bázový pár), zatímco počet nukleotidů se značí nt či b (báze). Vzhledem k délce jsou tyto údaje identické a 1000 nt odpovídá 1000 bp (Brdička, 2001). Množství DNA v buňce je vhodné udávat celkovým počtem monomerních jednotek (mononukleotidů). V nejmenším viru se počet nukleotidových článků odhaduje přibližně na 5000, v bakteriální buňce Escherichia coli je celkový obsah DNA tvořen přibližně 1 . 107 monomerními jednotkami a v buňkách vyšších organismů dosahuje hodnot 109-1011 nukleotidů (Bresler, 1979). Má-li molekula DNA příliš velkou délku, dochází tak snadněji k jejímu lámání. Dlouhé úseky DNA se lámou a tím vzniká více menších fragmentů. Tento proces vede ke znehodnocování DNA, a snižuje se tak její kvalita. Například T. A. Brown (2007) v Klonování genů a analýza DNA jako ukázku rozdílné velikosti uvádí, že největší plazmidy dosahují pouze 8% velikosti chromozomu E.coli, avšak většinou jsou mnohem menší. Z toho lze logicky usoudit, že čím jsou molekuly DNA větší, tím je složitější a obtížnější jejich archivace i veškeré jiné manipulace. Proto se pro většinu molekulárněgenetických technik molekuly DNA cíleně rozštěpují na menší fragmenty, se kterými se už snáze pracuje. Výběr skladování závisí také na konformaci nukleové kyseliny. U polymerů, jako je DNA, pod pojmem konformace rozumíme celkové prostorové uspořádání molekuly do struktury, která je za daných podmínek pro ni energeticky nejvýhodnější (Rosypal, 2001). Dvoušroubovicová DNA se může vyskytovat jako lineární či kružnicová molekula (Rosypal a kol., 1983). Uvádí se, že teplota uchovávání -20°C není vhodná pro lineární DNA o velikosti přesahující 20 kb, je totiž křehká a během zmrazování a rozmrazování se snadno láme (Šmarda a kol., 2005).
34
I na základě toho, pro jakou analýzu budeme vyizolovanou DNA dále využívat, volíme mezi různými způsoby uchovávání. Například vzorek DNA, který má být podroben polymerázové řetězové reakci (PCR), se uchovává ve vodném roztoku při teplotě -20°C, dlouhodobě až při -70°C. Pufr TE sice zvyšuje délku skladovatelnosti DNA, ale vzhledem k tomu, že obsahuje chelatační činidlo EDTA, které inhibuje PCR, se tedy pro skladování vzorku DNA pro potřeby PCR nedoporučuje (Knoll, Vykoukalová, 2002).
10.2 Rozdělení dle formy vzorku Podle toho, na jakou formu vzorek deoxyribonukleové kyseliny převedeme, může být archivace DNA provedena takzvaně: •
na sucho
•
na mokro
Vyizolovaný vzorek DNA totiž můžeme uchovávat v několika různých formách, a to rozpuštěný ve vodném roztoku, rozpuštěný v pufru, ve formě vysušeného peletu, ve formě precipitátu v 70% EtOH a navázaný na pevný nosič. Je-li vzorek DNA rozpuštěný ve vodném roztoku či pufru, spadá do kategorie uchovávání v kapalné podobě (na mokro) a další formy vzorku znamenají manipulace na sucho, kdy je vzorek převeden do vysušeného stavu.
10.2.1 Rozpuštěný ve vodném roztoku Uchováváním DNA ve vodném médiu je omezena dlouhodobá stabilita DNA, protože molekuly DNA jsou citlivé na poškození (depurinace, hydrolytické štěpení aj.), ke kterým může při způsobu tohoto uchování dojít (Anchordoquy, Molina, 2007). Izolovaná DNA se před použitím obvykle zředí vodou a zásobní koncentrovaný roztok je uchován v mrazničce. Zředěné vzorky, které jsou používány častěji, se však mohou poměrně dlouho uchovat i v lednici (Zima a kol., 2004).
10.2.2 Rozpuštěný v pufru Studie prokázaly, že alkalické podmínky potlačují působení degradačních mechanizmů, které jsou katalyzovány kyselým prostředím při dlouhodobém skladování 35
v roztoku (Middaugh a kol., 1998). Využívají se tedy pufry, které zajišťují potřebné specifické alkalické prostředí. Po dokonalém vysušení se DNA rehydratuje v pufru o pH 8 (Bednář a kol., 1999). TE skládající se z Tris a inhibitoru nukleáz, již zmíněného chelatačního činidla EDTA, je nejběžnějsí pufr používaný k rozpouštění a uchování DNA. Složka Tris je trihydroxymethyl(aminomethan), jednoduchá organická sloučenina s vysokou pufrovací účinností. Pozměněnou variantou roztoku Tris je pufr Tris-HCl, jehož pH je upraven přídavkem kyseliny chlorovodíkové (HCl), a pohybuje se tak v rozmezí 7-9 (Hruban a kol., 1999). V tomto pufru se obvykle DNA nechá rozpouštět asi 1 hodinu, poté se mikrozkumavky se vzorkem DNA umístí do mrazničky (Bednář a kol., 1999).
10.2.3 Ve formě vysušeného peletu Způsob archivace, kdy je vzorek dehydratován, využívá mechanismus ochrany DNA, jehož podstatou je převedení vzorku do vysušeného stavu (Baust, 2008), kdy je rovněž omezen pohyb molekul (Anchordoquy, Molina, 2007). Vysušená forma vzorku DNA poskytuje ochranu molekulám DNA a zajišťuje zachování integrity v případě, že chybí opravné buněčné mechanismy (Marrone, Ballantyne, 2010). Již výše zmíněné srážení (precipitace) pomocí ethanolu je běžně používaná technika pro zahuštění a odsolení vzorků nukleových kyselin (DNA nebo RNA) ve vodném roztoku. Základním principem je, že soli a ethanol, které se přidají do vodného roztoku, způsobí vysrážení nukleové kyseliny z roztoku. DNA se vysráží ve formě peletu – agregátu. Takto vysrážená nukleová kyselina poté může být odstraněna ze zbytku roztoku centrifugací. Pelet je promyt chlazeným 70% ethanolem, který vymyje nežádoucí zbytkové soli, a po další centrifugaci je agregát DNA nachystán
pro
vysušení (Oswald, 2007). To probíhá při pokojové teplotě, při 40°C v termostatu nebo rychleji lyofilizací (Hruban a kol., 1999). Prostřednictvím lyofilizace se docílí zakoncentrování a ochrany vzorku DNA (Vaughan a kol., 2006). Také se používá vakuová centrifugace, kdy jsou vzorky do vysušeného stavu převedeny dehydratací pomocí vakuové centifugy (Marrone, Ballantyne, 2010). Vzorky uchovávané ve vysušené formě jsou však velmi citlivé na přítomnost vody či pouhé vlhkosti, kdy mohou podlehnout hydrolýze (Baust, 2008). 36
I přesto, že zatím nebyly provedeny zásadní studie hydrolytické degradace DNA ve vysušeném stavu, nedávná studie dokázala, že chemický mechanismus hydrolýzy DNA se zdá být stejný u hydratované i vysušené formy DNA, zásadním rozdílem je však rychlost hydrolytické degradace (Marrone, Ballantyne, 2010),
Lyofilizace Lyofilizace neboli vymrazování je účinný způsob pro stabilizaci nukleových kyselin i proteinů (Hymas a kol., 2005). Toto sušení vymrazováním zajišťuje šetrnou metodu přípravy suchých látek. Využívá fyzikálního jevu sublimace ledu. Vzorek se zmrazí na nízkou teplotu a v prostředí vakua se uvolněná pára vzniklá sublimací zachytává na kondenzátoru (Pragolab, online). Výsledný vzorek se zbytkovým množstvím vody nižším než 2% je velmi stabilní a snadno rehydratovatelný (Vaughan a kol., 2006). V práci Vaughana a kol. (2006) bylo u vybraných lyofilizovaných virů dokázáno, že jejich nukleové kyseliny DNA či RNA byly po dlouhodobém skladování lehce detekovatelné. Taktéž jejich koncentrace byla po procesu lyofilizace úspěšně zachována, což potvrdila kvantitativní analýza. Při teplotě +4 nebo -20 ° C je vhodné skladovat lyofilizované vzorky DNA, respektive kalibrační vzorky DNA pro PCR (Podivinsky a kol., 2009). Hymas a kol. (2005) uvádí, že stabilita lyofilizovaného kalibrátoru ve srovnání s kalibrátory uloženými ve zmrazeném tekutém stavu byla vyhodnocena zkoušením dvojího ředění čerstvě rozpuštěného lyofilizovaného a 10 dnů starého zmrazeného standardu. Všechna ředění zmrazených kalibrátorů ukázala výrazně nižší stabilitu oproti lyofilizovanému materiálu, a to zpožděním Ct hodnoty.. Vzorky nukleových kyselin jak o nízké, tak i o vysoké koncentraci byly extrémně stabilní při zmrazení v lyofilizovaném stavu. Značná labilita byla zaznamenána u vzorků o nízkých koncentracích, které byly uloženy zmrazené v tekutém stavu (Hymas a kol., 2005).
10.2.4 Ve formě precipitátu v 70% EtOH Precipitovaná DNA je uložena do méně koncentrovaného roztoku ethanolu, který má díky naředění vodou 70%. 37
DNA se běžně skladuje jako sraženina v ethanolu při teplotě -80 ° C. Takovéto opatření zajistí, že je DNA stabilní po delší dobu. Vzorek však musí být od ethanolu izolován, přenesen do vodného pufru a před použitím kvantifikován (Anchordoquy, Molina, 2007).
10.2.5 Navázaný na pevný nosič Vzorek kyseliny deoxyribonukleové je navázán na matrici. Dnes už je řada takovýchto technologií a každá pracuje na základě jiného principu. Burgyone (1996) v popisu svého vynálezu představuje pevné médium pro uchovávání DNA, zejména DNA ve vzorcích krve, skládající se z pevné matrice, jež má takové složení, které chrání DNA před degradací tím, že je DNA začleněna na tuto matrici nebo je jí absorbována. V souladu s jeho vynálezem bylo zjištěno, že používání kyseliny močové nebo solí kyseliny močové je důležité zejména pro dlouhodobé uchovávání DNA, kdy tato složka vykonává řadu funkcí. Především působí jako lapač volných radikálů, také působí jako součást vyrovnávacího systému, poněvadž je slabá kyselina. Působí také jako erodující povrch v tom, že je těžko rozpustná, takže materiál obsahující DNA sušený na jejich krystalcích bude uvolněn, protože urát pod ním se narušuje. Dále uvádí, že soli kyseliny močové chrání purifikovanou DNA před degradací v průběhu skladování po dobu delší než 36 měsíců.
10.3 Rozdělení dle časového hlediska Podle časového hlediska dělíme archivaci DNA na krátkodobou a dlouhodobou.
10.3.1 Krátkodobá archivace Patří sem skladování vzorku při teplotě +4°C. Za této teploty můžeme několik týdnů až měsíců DNA za semisterilních podmínek uchovávat konzervovanou v roztoku v lednici (Hruban a kol., 1999). Podivinsky a kol. (2009) na základě svého výzkumu uvádí, že teplota +4°C může být nejvhodnější pro krátkodobé uchovávání vzorků DNA v kapalné podobě; šlo o kalibrační vzorky pro PCR.
38
Takovýto způsob uchovávání purifikované DNA, kdy se vzorek nachází v kapalném stavu, je vyhovující pro bezprostřední použití DNA, ale je-li skladován po delší dobu, hrozí riziko degradace DNA (Moon Woo-Chul a kol., 2006).
10.3.2 Dlouhodobá archivace Pokud je DNA z buňky izolována, je s ní šetrně zacházeno a zabrání se jejímu enzymovému rozštěpení, lze ji dlouhodobě uchováva.( Hruban, 1999). Pro požadavek dlouhodobého uložení vzorku se DNA zmrazuje na teplotu - 80°C, kterou spolehlivě zajistí například hlubokomrazicí box. Ten však běžně nebývá součástí obvyklého vybavení laboratoře. Tato teplota je vhodná pro archivaci DNA z hlediska zachování její struktury, kdy nedochází ke změnám vlivem teploty ani enzymů, a zabrání se tak chemické i enzymatické degradaci (Anchordoquy, Molina, 2007). I teplota -20°C , kterou poskytuje běžná mraznička, se používá pro dlouhodobé uchovávání izolované deoxyribonukleové kyseliny. Pokud je třeba DNA v tekuté podobě skladovat dlouhodobě ve zmrazeném stavu, je vhodné ji předem rozdělit do několika jednotlivých objemů (alikvotů) (Hymas a kol., 2005). Protože rozmrazování negativně ovlivňuje kvalitu DNA, je obzvláště vhodné uložit alikvotní vzorek u vzácných vzorků (Knoll, Vykoukalová, 2002). Měli bychom si rozvrhnout i velikost jednotlivých alikvotů, čímž předejdeme opakovanému rozmrazování a zamrazování a z toho plynoucí degradaci deoxyribonukleové kyseliny. Jak se dá předpokládat, při jednorázovém použití je vzorek DNA stabilnější, než je-li použit opakovaně (Podivinsky a kol., 2009). Stabilita kapalné zmrazené DNA je proměnlivá. Obecně platí, že nukleové kyseliny mohou být uloženy po dobu několika měsíců a jejich stabilita bude dostačující, zatímco vzorky s nízkou koncentrací jsou často labilní, jsou-li uchovávány po tuto dobu (Hymas a kol., 2005). Skladování za ultranízkých teplot (-20 ° C až -80 ° C) poskytuje odpovídající podmínky pro uchovávání vzorku požadované DNA v závislosti na jeho kvalitě a množství po dobu, po kterou jej chceme uložit. Ani jedna z těchto teplot však neposkytuje tak kvalitní dlouhodobé skladování, které umožňuje kryokonzervace (Baust, 2008).
39
Kryokonzervace Tato metoda archivace při teplotách tekutého dusíku (-196 °) udržuje DNA ve skelném stavu. Molekuly ve skelném stavu ztrácí translační pohyb, tedy schopnost šířit se, takže pohyb protonů (vodíkových iontů) je odhadován přibližně jen o jeden atomový průměr za 200 let, což znamená, že možnost vzniku chemických reakcí je velmi nepravděpodobná, a to dokonce po staletí (Baust, 2008). Kryokonzervace je prakticky využívaná metoda uchovávání genetických zdrojů rostlin, biologických materiálů v medicíně i v plemenitbě hospodářských zvířat, která zajišťuje genetickou stabilitu a dlouhodobost konzervace (Dotlačil a kol., 2005).
Metoda uchovávání DNA zmrazením či způsob sublimačního sušení (lyofilizace) skýtá problém v tom, že DNA se může poškodit opakovaným táním a zmrazováním. Také způsob, kdy ukládáme vzorek DNA za použití činidla, jako je ethanol, se jeví problematický z hlediska předběžného a konečného zpracování, stejně jako jiné metody. Kromě toho nejzávažnější nedostatek výše uvedených metod skladování je to, že DNA musí být před archivací nejprve vyizolována z odebraného genetického materiálu (Moon Woo-Chul a kol., 2006).
10.4 Archivace DNA za pokojové teploty Tak jako tomu bylo v počátcích nástupu vědy a techniky, i dnes, a to čím dál více, se člověk snaží o hlubší poznání, ulehčení si práce a efektivnější rozvoj. Není tomu jinak ani v oblasti manipulací s kyselinou deoxyribonukleovou. V dnešní době se v rámci analýzy DNA snažíme o maximální zjednodušování laboratorních technik a s tím souvisejících modifikací postupů, které povedou k nalezení nejefektivnějších způsobů provedení. Protože je zapotřebí skladovat vzorky DNA pro následující rozbory a analýzy, je logické, že s přibývajícím počtem nově získaných vzorků se také zvyšuje potřeba skladovacího prostoru, kde se mohou takovéto vzorky archivovat. Aby bylo uchovávání DNA bezpečné po delší dobu, totiž aby nedošlo k degradaci DNA, je třeba drahých speciálních zařízení jako hlubokomrazicích zařízení či tekutého dusíku, specifických činidel a podobně. Tímto se však zvyšují náklady pro plnohodnotné uchovávání vzorků DNA. 40
V poslední době jsou předmětem výzkumu technologie, které by zajistily dlouhodobé skladování DNA při pokojové teplotě. Takovéto uchovávání by výrazně snížilo náklady spojené s provozem mrazniček a zařízení umožňujících zmrazení vzorků DNA na nízké teploty, také by mělo být šetrnější k životnímu prostředí a schopné zachovat vysokou kvalitu a výtěžnost DNA. Metody skladování, které jsou založeny na zmrazování, jsou velmi drahé, neekologické a při uchovávání a přepravě vzorků za takovýchto podmínek dochází k zabírání zbytečně velkého prostoru. Převod vzorků DNA ze zmrazené formy do formy, prostřednictvím které se mohou skladovat za pokojové teploty, by mohl významně omezit používání elektřiny, tím snížit potřebné finance na archivaci a tím samozřejmě i finance týkající se celého provozu laboratoře. Dnes je již vyvinuto mnoho takovýchto metod uchovávání DNA. Jsou založeny na různých principech, také se liší podmínkami, při kterých je nutno vzorek deoxyribonukleové kyseliny skladovat, a jsou využívány ve výzkumných laboratořích i pro komerční použití.
Vybrané technologie, pomocí kterých může být DNA uchovávána za pokojové teploty, jsou Chitosan, FTA® papír a SapmleMatrix® technologie.
10.4.1 Chitosan Chitosan je biologický polymer, jenž vyniká vlastnostmi jako je stabilita, schopnost biologicky se rozložit a vhodně působit na lidský organismus. Hojně se proto využívá v medicíně. Jestliže se chitosan dostane do styku s kyselinou, reaguje tak, že vytváří soli, které jsou ve vodě rozpustné a mají kladný náboj. Soli chitosanu ve vodě disociují a jeho rozpustnost je úměrná stupni deacetylace a pH. Ve vodě rozpustný chitosan se stává kladně nabitým přidáním protonu na aminoskupiny. Také je možno vodorozpustný chitosan lyofilizovat. Formy chitosanu, které jsou ve vodě rozpustné, se silně vážou s DNA, která má aniontovou povahu, a v podstatě ji tak chrání. Proto chitosan slouží jako vhodná látka pro navázání molekul DNA.
Využitím chitosanu mohou být uloženy vzorky jako: •
DNA člověka
•
DNA zvířat
•
DNA rostlin 41
•
DNA bakterií
•
biologický vzorek obsahující DNA – a to krev
Principem
uchovávání
DNA
na
chitosanu
je
smíchání
vzorku
DNA
s vodorozpustným chitosanem. Tuto směs, kterou uchováváme v kapalném stavu či v podobě pevné fáze na pevném médiu, kterým může být papír, lze skladovat při pokojové teplotě po dlouhou dobu. Takto archivovaná DNA zůstává ve stabilizovaném stavu a je bezpečně uložena do doby, než ji budeme potřebovat pro následující analýzy. Tato metoda skladování kyseliny deoxyribonukleové je jednoduchá a ekonomická (Moon Woo-Chul a kol., 2006).
10.4.2 FTA® papír Jednou z efektivních metod uchovávání DNA je uchovávání biologických vzorků na FTA papíře, který je jakousi ´archivační kartou´ a je napuštěný chemickým činidlem (Smith, Burgyone, 2004). Karta FTA je komerční produkt využívající patentovanou technologii Whatman, která zjednodušuje manipulaci s nukleovými kyselinami a jejich zpracování (Whatman, online). Je naprosto vhodná pro izolaci nukleových kyselin z biologického materiálu a jejich shromažďování. Podstatou zpracování je často jednoduché vymývání in situ , kdy se nečistoty vymytím odstraní a vzorek DNA zůstane zadržený na papíře (Smith, Burgyone, 2004). Karta se skládá z filtračního papíru, který je napuštěný patentovanou směsí chemikálií, která zajistí lyzi buněk, denaturaci proteinů a chrání nukleové kyseliny proti poškození způsobenému nukleázami, oxidativními a UV účinky, zabrání množení bakterií a celkově chrání samotnou DNA ve vzorku (Whatman, online). Základní předpoklad pro izolaci DNA na FTA kartě je jednoduchý: biologický vzorek je nanesen na FTA kartu a přirozeně vysušen na vzduchu. Zachycená nukleová kyselina je po vysušení zcela stabilizována a karta může být uskladněna do doby, než bude DNA potřebná pro další analýzy; poté je tedy připravena na následující čištění (Obr.4). Z FTA karty je vyjmut malý disk, který je několikrát promyt, aby došlo k odstranění kontaminantů, navázaných proteinů, tedy komponent, které neobsahují DNA (vlastní DNA materiál je navázán na kartě). Následně může být provedena analýza DNA in situ, kdy je DNA stále navázána na papír, nebo ji před použitím můžeme eluovat do roztoku (Smith, Burgyone, 2004). 42
Obr. 4: Získání DNA z FTA karty (Whatman, extr. dok., upraveno)
FTA karty jsou k dispozici buď v bílé nebo růžové formě. Bílé FTA karty jsou doporučovány pro vzorky krve, rostlinných tkání a jiné snadno identifikovatelné vzorky. Růžové karty, které jsou indikační, jsou doporučovány pro ústní (bukální) buňky, buněčné kultury a další bezbarvé vzorky (Whatman, extr.dok.). U těchto indikačních karet není třeba se obávat, zda odebraný vzorek obsahuje dostatek buněk k testování, karta totiž změnou barvy signalizuje přítomnost požadovaných vzorků. Po nanesení vzorku se barva karty změní z růžové na bílou, což indikuje přítomnost DNA. Proto je tato karta vhodná i pro bezbarvé vzorky (Whatman, online). FTA karty lze použít pro celou škálu vzorků (Whatman, online): •
krev
•
buněčné kultury
•
bukální buňky
•
rostlinný materiál 43
•
bakterie
•
plasmidy
•
mikroorganismy
•
pevná tkáň
•
virové částice
FTA je vysoce flexibilní technologie, která se používá v řadě průmyslových odvětví po celém světě. FTA karty jsou použitelné například pro (Whatman, extr.dok.): •
analýzu krve, rostlin, hmyzu, virů a bakterií
•
genetické identifikace
•
uchovávání bakteriálních klonů
•
environmentální analýzy
•
molekulární identifikace
•
studium chovu a šlechtění zvířat
Reagenty na FTA kartách jsou navrženy tak, aby zabily většinu patogenů, potlačovaly parazity během vysušování a při vysoké vlhkosti, měly silné vyrovnávající vlastnosti, vychytávaly volné radikály a vypořádávaly se s atmosférickým znečištěním. Podle základních principů chemie DNA se dá odvodit, že se integrita vzorku liší podle čistoty skladovacího ovzduší a množství konzervačních látek na papírech (Smith, Burgyone, 2004). Smith, Burgyone (2004) uvádí, že jakmile se vzorky krve a tkáně umístí na FTA papír a zaschnou, nepotřebují už žádné zvláštní podmínky pro uchovávání a přemisťování a DNA uvnitř vzorku uložená na FTA kartě zůstává při pokojové teplotě neporušená po velmi dlouhou dobu, což bylo dokázáno výzkumem, kdy ve městě se subtropickým podnebím (jižní Austrálie) byly vzorky ptačí krve umístěny na FTA karty a ty
byly uskladněny v běžných kartotékách v laboratorní skříni (s omezeným
prouděním vzduchu) ve tmě po 44 měsíců. Klimatizace byla přerušovaná, proto se pokojová teplota pohybovala v rozmezí od 18 ° C až do 42 ° C. Vybranou metodou byla z FTA karty získána DNA a poté použita pro PCR reakci. Protože všechny vzorky byly úspěšně amplifikovány, bylo dokázáno, že DNA nebyla během uchovávání podrobena závažnému znehodnocení. 44
Vzorky krve byly například úspěšně analyzovány po 14 letech a vzorky z bukální sliznice jsou stabilní už 5 let a výzkum stále probíhá (Whatman, extr.dok.). Kočárek (2007) ve své knize uvádí, že po stabilizaci vzorku navázáním na kartu je možné vzorek v této podobě archivovat po dobu několika let, aniž by došlo k nežádoucí degradaci nukleových kyselin; výrobci garantují 11-15letou trvanlivost, podle některých předpovědí však vzorek vydrží v nepozměněném stavu až 50 let. Tato technologie shromažďování a uchovávání prakticky jakéhokoli biologického vzorku velmi zjednodušuje. Uchovávání materiálu na těchto papírech umožňuje přezkoumání DNA, kdykoli je to třeba. FTA karty zajišťují jednak efektivnost v uskladnění vzhledem k prostoru, kdy lze uchovávat rozmanité vzorky na jedné FTA kartě beze strachu z vzájemné kontaminace, takže velké množství vzorků může být uchováváno v zásuvce skříňky, jednak jednoduchý a levný transport, kdy vzorek můžeme přepravovat poštou či jednoduše odnést v osobním zavazadle (Smith, Burgyone, 2004). Také možnost skladování při pokojové teplotě je obrovskou výhodou; lze tedy pohodlně sbírat vzorky v terénu bez nutnosti okamžitého chlazení a manipulací se suchým ledem. Skladovací systém se tak zjednodušuje, není třeba
drahých
mrazírenských prostor, tím se snižují náklady na skladování a také se zlepšuje přístupnost vzorků. Nemalou výhodou je také samozřejmě to, že pro separaci DNA z nosiče FTA není třeba žádné drahé izolační soupravy (Whatman, online). Snadná přeprava a skladování vzorků vysušených na papíře je velmi praktická pro vědce, protože tak mohou během celé své kariéry nashromáždit celou kolekci zkoumaných vzorků. Stabilita DNA, když zůstane navázána na papíře FTA, a malá plocha papíru, která se pokaždé zpracovává, zajišťují, že stejné vzorky mohou být analyzovány mnohokrát po dobu několika let bez obav, že degradace DNA nepříznivě ovlivní výsledky analýz (Smith, Burgyone, 2004).
45
10.4.3 SampleMatrix® technologie Technologie zvaná SampleMatrix stabilizuje DNA tak, že ji lze bezpečně skladovat při pokojové teplotě. Až bude vzorek DNA archivovaný touto metodou potřebný k dalšímu použití, stačí jednoduše přidat malé množství vody, které způsobí rehydrataci vzorku, a poté je DNA připravena pro další analýzy (DNA Direct, online). SampleMatrix je založena na extrémofilní biologii, ve které jsou organismy schopny přežívat dlouhodobě ve stavu anhydrobiosis, což znamená život bez vody, a později jsou znovu oživeny rehydratací. Extrémofilové jako živočichové tardigrades, známí také jako vodní medvědi, a živočichové rodu Artemia jsou schopni ochránit svoji DNA, RNA, proteiny, membrány a buněčné systémy ve vysušeném stavu na dlouhou dobu. Tato stabilizační technologie napodobuje přírodní molekulární mechanismy, které právě tyto organismy používají. Podstatou je vytváření termostabilní bariéry v průběhu procesu sušení (obr.5). Vzorky se tak chrání proti ztrátě biologické aktivity a degradaci, která jinak nastává při skladování při pokojové teplotě.
Obr. 5: Ochranná bariéra SampleMatrix®
46
Na matrici jsou naneseny požadované vzorky, které jsou před vlastním skladováním vysušeny na vzduchu při pokojové teplotě. Právě během tohoto sušení se aktivuje tvorba ochranných bariér. Tento přirozený mechanismus tak chrání molekuly DNA proti degradaci teplem či UV-zářením. Vzorky se obnoví jednoduchou rehydratací, kdy během několika minut dojde k rozpuštění a poté jsou zcela zachované vzorky okamžitě připraveny pro následující použití, aniž by došlo ke znehodnocení či ztrátám, a také odpadá potřeba následné purifikace DNA (Biomatrica, online). SampleMatrix technologie tak vytvořením ochranného těsnění kolem DNA zajišťuje efektivní skladování vzorků krve, tkání a buněk při pokojové teplotě. Využitím archivace prostřednictvím této technologie je zjednodušena přeprava a skladování vzorků DNA při pokojové teplotě. Je zajištěno dlouhodobé uchovávání vzorků a zachovává se kvalita a množství genomické DNA v uložených biologických vzorcích (Laboratory talk, online). Tato SampleMatrix technologie je používána ve výzkumných a klinických laboratořích, ale je k dispozici i pro veřejnost, a to výhradně prostřednictvím DNA Archiv ™. Pomocí DNA Archiv se mohou bezpečně ukládat vzorky stabilní DNA v soukromí domova či v bezpečnostní schránce. DNA Archiv používá laboratorní kvalitní zkumavky a balení, které je odolné proti UV-záření, a technologii Sample-Matrix ™, to vše pro zajištění toho, aby vzorky DNA mohly být uchovány na neurčitě dlouhou dobu. Celý systém funguje tak, že po podání objednávky je zákazníkovi zaslán DNA Archive kit pro sběr vzorku. Vzorek DNA ve formě bukálních buněk je získán výtěrem z ústní tkáně a vzorek je po zpětném zaslání do laboratoře analyzován. DNA je po izolaci umístěna do testovací laboratorní zkumavky a je přes noc vysušena na SampleMatrix. Nakonec je zapečetěna v kvalitní laboratorní zkumavce a UVrezistentním balení, které zajišťuje bezpečnou přepravu a stabilitu při skladování. Zákazníkův DNA Archiv obsahuje tři zkumavky, ve kterých má konzervovanou svou DNA v atraktivním balení. Může jej skladovat v trezoru či kdekoli v domácnosti bez obav, že DNA bude znehodnocena (DNA Direct, online).
47
11 SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A ARCHIVACÍ DNA Je-li
materiál
obsahující
DNA
kvalitně
archivován,
je
možno
vzorek
deoxyribonukleové kyseliny získat izolací i za velmi dlouhou dobu. DNA lze často izolovat i z muzejního materiálu. Dobrým zdrojem DNA jsou hlavně tkáně uchovávané v lihu. Naopak izolace DNA vzorků, které přišly do styku s formalínem, bývá často neúspěšná (Zima a kol., 2004). Formaldehyd je účinnou složkou formalínu a vede k vytváření vzájemného propojení mezi nukleovými kyselinami a proteiny. Také způsobuje to, že se nukleové kyseliny lámou na jednotlivé fragmenty, a to z důvodu podmínek, které nastávají při procesu fixace, např. extrémně nízké pH (<1) (Lin a kol., 2009). DNA lze získat i z velmi starých vzorků (řádově i desítky tisíc let starých), například z fosilního kosterního materiálu či jiných tkání. DNA byla například úspěšně izolována z fosilních kostí neandrtálce (Zima a kol., 2004). V mnoha případech však bývá DNA natolik degradována, že analýza nelze provést. Stupeň degradace stoupá s časem a je značně ovlivněn prostředím, ve kterém byly pozůstatky uloženy (Kočárek, 2007). Izolaci DNA lze s větší pravděpodobností provést, byl-li materiál dlouhou dobu v chladném prostředí, například ve věčně zmrzlé půdě (permafrostu). Při takovýchto izolacích je však třeba postupovat velmi opatrně a pečlivě, neboť riziko kontaminace je veliké a extrakce DNA z minimálního množství materiálu velmi obtížná (Zima a kol., 2004). Prakticky lze oživit zachovalou DNA i z archeologických nálezů (mumie) nebo dokonce snad i z paleontologických vykopávek. Jednotlivé DNA sekvence lze různými způsoby znova namnožit a genetickou informaci oživit vnesením do vhodné buňky nebo do organismu. DNA ve fosilním materiálu je však poškozená a fragmentovaná. Nicméně většinou není problém určité krátké sekvence (např. geny) pomnožit, protože nejsou rozfragmentováním totálně poškozeny. Jiným problémem je však revitalizace genu, aby se podle jeho informace vytvořil funkční polypeptidový prodkut (Hruban a kol., 1999). Jako největší problém při forenzních studiích spojený se strukturální integritou molekul DNA ve vysušených vzorcích se zdá být depurinace. V důsledku míst, kde tyto báze chybí, dochází k inhibici PCR a tím ke zmaření možnosti dalšího výzkumu (Marrone, Ballantyne, 2010). 48
12 METODY URČENÍ KVALITY DNA Poté, co vyizolujeme DNA, by měla být stanovena její kvalita a kvantita. Také je-li DNA nějaký čas archivovaná a posléze ji znovu potřebujeme analyzovat, je dobré si ověřit, zda nebyla během doby uchovávání nějak znehodnocena. Pro tyto potřeby se v dnešní době používají různé metody, pomocí kterých můžeme určit charakteristiky DNA jako množství, koncentraci, čistotu, nebo zda je molekula DNA nalámaná na jednotlivé fragmenty. Právě čistota vzorku, která se stanoví absorpční spektrometrií v ultrafialovém světle, vypovídá o kvalitě DNA, která je tolik potřebná pro další aplikace, zvláště pro stanovení pomocí citlivých technik, které vysokou čistotu DNA vyžadují. Pro stanovení kontroly degradace deoxyribonukleové kyseliny využíváme další metody jako klasickou polymerázovou řetězovou reakci (PCR) spolu s elektroforézou či polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase (Real-Time PCR).
12.1 UV absorpční spektrometrie Pro určení čistoty DNA i RNA se využívá UV absorpční spektrometrie. Tato absorpce může být použita pro základní charakterizaci vzorku před tím, než bude podroben dalším výzkumným technikám. Podstatou principu je skutečnost, že báze nukleových kyselin absorbují UV záření (Vorlíčková a kol., 2005). Výše optické denzity (míra absorpce UV-záření) závisí na délce molekuly DNA a na tom, zda je ve vzorku přítomna jednořetězcová DNA (ss DNA) nebo dvojřetězcová DNA (ds DNA) (Kočárek, 2007). Absorpční spektrum DNA a RNA je totiž hypochromní, což znamená, že absorbance polymerních nebo oligomerních řetězců je nižší než u příslušných monomerů. Absorbance DNA a RNA se snižuje, když jednořetězcová forma přechází do dvojřetězcové. Míru pohlcování ultrafialového zaření molekulou DNA ovlivňuje také vyšší teplota. Zahříváním roztoku nukleových kyselin dochází k nárůstu UV absorpce díky částečné ztrátě narovnání bází, která doprovází rozkládání řetězce. Maximum absorpce se pohybuje v blízkosti 260 nm a absorpční minimum je kolem 230 nm a další maximálně do 170 – 200 nm. Nad 300 nm nukleové kyseliny světlo neabsorbují. Pokud není izolovaná deoxyribonukleová kyselina zbavená kontaminantů, které absorbují ultrafialové záření, pohlcuje světlo i při hodnotě vyšší než 300 nm. 49
Z toho důvodu tedy není dostatečně čistá a absorpční signál, který nad 300 nm není roven nule, indikuje přítomnost nečistot, jako jsou proteiny, volné nukleotidy, fenol aj. Čistotu DNA stanovíme porovnáním absorbancí. Poměr absorbancí - A260/A280 by měl být v optimálním případě asi 1,8 a poměr A260/A230 by měl být 2 nebo vyšší. Hodnota A260/A280 nižší než 1,8 nebo hodnota A260/A230 nižší než 2 indikuje přítomnost proteinů a dalších nečistot (Vorlíčková a kol., 2005). Je-li poměr absorbancí při 260 a 280 nm (poměr A260/A280) v rozmezí od 1,8 do 2,0, preparát je kvalitní. Vychází-li tato hodnota níže než 1,75, svědčí to o tom, že vzorek je znečištěn zbytky fenolu po deproteinování nebo stále ještě obsahuje proteiny (Hruban a kol., 1999). Absorpční maximum bílkovin udává vlnová délka 280nm (Kočárek, 2007). Proto tedy UV záření absorbují více při 280 nm a to díky aromatickým aminokyselinám fenylalaninu a tyrosinu. Z toho důvodu poměr A260/A280 klesá pod 2,0 (Hanáček, 2009). V těchto případech se proto doporučuje vzorek znovu purifikovat (Kočárek, 2007). UV absorpční spektroskopie se dále používá ke stanovení koncentrace nukleových kyselin. Protože absorbují nejintenzivněji světlo o vlnové délce 260 nm, míra absorpce tohoto záření odpovídá koncentraci nukleových kyselin v roztoku (Kočárek, 2007). Absorbance se měří proti destilované vodě. 1 optická jednotka (1 O.D. = optical density) zhruba odpovídá koncentraci 50 ng v 1 ml roztoku dvojvláknité DNA (Hruban a kol., 1999). Znamená to tedy, že roztok dvojřetězcové DNA o koncentraci 50 µg/ml má absorbanci 1. Tuto hodnotu však pozmění přítomnost výše zmíněných proteinů nebo fenolu
v roztoku.
Rovněž
pro
kvantifikaci
jednovláknové
DNA,
např.
oligonukleotidových primerů, se používá spektorofotometrický přístup. Absrobance 1 roztoku jednovláknové DNA při vlnové délce 260 nm je v tomto případě ekvivalentní koncentraci 30 µg/ml. Tento způsob stanovení koncentrace DNA je jednoduchý, ale ne příliš selektivní. Je zde riziko nízké přesnosti a také je metoda citlivá na znečistění vzorku. Navíc údaj o úrovni absorbance nepodává informaci o integritě molekuly DNA (Šmarda a kol., 2005).
50
12.2 Elektroforéza Po provedení izolace je třeba ověřit, zda získaný vzorek DNA není degradován. Jak už bylo výše zmíněno, degradace DNA se projevuje rozštěpením původních dlouhých molekul na malé fragmenty. A právě ty lze izolovat pomocí elektroforézy (Kočárek, 2007). Elektroforéza patří v molekulární biologii při izolaci a analýze nukleových kyselin k nejpoužívanějším separačním technikám (Šmarda a kol., 2005). Má význam při ověřování kvality vzorku DNA, používá se nejen k oddělení fragmentů DNA, ale také k separaci RNA, proteinů, popř. některých dalších biochemicky významných látek (Kočárek, 2007). Elektroforéza na nosičích, zejména na polyakrylamidovém gelu, je jednou z obecně uznávaných metod, která podává informace o čistotě preparátu (Králová a kol., 2008). Principem elektroforetické separace je dělení látek v elektrickém poli (Šmarda a kol., 2005). Pohyb koloidních částic, makromolekul nebo i jednotlivých molekul v elektrickém poli závisí jednak na vlastnostech studované látky a jednak na vlastnostech nosiče a prostředí, ve kterém pohyb probíhá. Příčiny rozdílné pohyblivosti makromolekul primárně závisí na: •
molekulové hmotnosti
•
elektrickém náboji
•
prostorovém uspořádání makromolekul
Protože působení elektrického pole zasahuje jen povrchovou nábojovou vrstvu molekul, během elektroforézy většinou nejsou změněny vlastnosti DNA ani proteinů (Hruban a kol., 1999). Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny (PO43-), a proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují k opačně nabité elektrodě, kterou je kladně nabitá anoda (Šmarda a kol., 2005).
Gelová elektroforéza je základním nejčastěji využívaným typem elektroforézy, při kterém molekuly DNA prostupují tzv. molekulárním sítem, které je zpravidla tvořeno složitou sítí vláken polymerní sloučeniny. Vlivem menšího tření, ke kterému dochází mezi molekulami DNA a sítí polymerů, se při průchodu kratší fragmenty pohybují 51
rychleji než delší molekuly, jejichž přesun se naopak opožďuje. Tak můžeme dosáhnout úplného oddělení všech fragmentů (Kočárek, 2007). Podle předpokládané velikosti fragmentů můžeme pro přípravu elektroforetického gelu, který slouží jako molekulární síto, využít dvě možné sloučeniny – agarózu či polyakrylamid. Po dokončení elektroforézy je třeba identifikovat polohy separovaných molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. Molekuly DNA lze snadno zviditelnit obarvením vhodným barvivem (Šmarda a kol., 2005). Pro tuto vizualizaci se využívají fluorescenční barviva, chemické látky, jejichž molekuly po ozáření UV-světlem fluoreskují, tedy emitují viditelné světelné záření. Obvykle se používá ethidiumbromid, který se váže na molekulu DNA. Molekuly této anorganické sloučeniny se vmezeřují (interkalují)
mezi
polynukleotidová
vlákna
ve
dvojřetězcové
molekule
deoxyribonukleové kyseliny (Kočárek, 2007). Vytváří tak s ní komplex, který po ozáření ultrafialovým světlem o délce 260 nm emituje oranžově červené fluorescenční světlo (Hruban a kol., 1999). Konečnou vizualizaci pruhů provádíme zpravidla pomocí transiluminátoru, což je speciálně upravený zdroj UV-záření. Na desku tohoto přístroje položíme gel obarvený ethidiumbromidem a zapneme zdroj UV světla, jímž gel zezdola ozáříme (Kočárek, 2007). Molekuly DNA o stejné velikosti jsou pak na gelu patrné jako proužky, jejichž intenzita je úměrná koncentraci DNA. (Šmarda a kol., 2005) Po vyizolování celkového neporušeného vzorku DNA ze zkoumaného materiálu slouží po elektroforetické separaci na gelu tato DNA jako kontrola. Při ověřování degradace izolované deoxyribonukleové kyseliny by měl být poblíž startovní jamky, do které se nanáší pipetou požadovaný zkoumaný vzorek DNA, pozorovatelný
jedinečný
pruh,
který
tvoří
dlouhý
řetězec
nedegradované
deoxyribonukleové kyseliny a slouží jako kontrola; pokud však pozorujeme fluorescenci i ve větší vzdálenosti od startu, svědčí to o přítomnosti menších fragmentů vzniklých degradací (Kočárek, 2007). Kontrolujeme pro potřeby budoucích analýz srovnáním vzorku zkoumané DNA, která by mohla být degradována působením různorodých nepříznivých vlivů v průběhu archivace či jiných manipulací.
52
Za předpokladu, že DNA nebyla nijak znehodnocena, je elektroforetogram shodný s kontrolou a struktura vzorku DNA zůstává zachována. Jestliže však k degradaci došlo, vzorek DNA se rozpadl na více fragmentů a zobrazení na gelu již neodpovídá kontrole. Vzniklé různě dlouhé úseky DNA mají odlišnou rychlost migrace a ta je závislá na jejich velikosti. Kratší fragmenty putují rychleji a urazí větší vzdálenost než fragmenty delší. Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je totiž nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Velikost molekuly DNA nebo jejího fragmentu o neznámé velikosti lze stanovit srovnáním jejich elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí molekul nebo fragmentů DNA o známé velikosti, které se označují jako standardy velikosti (hmotnostní standardy). Těmi bývají většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním DNA (Šmarda a kol., 2005).
12.3 Polymerázová řetězová reakce (PCR) a Real-Time PCR Důkaz změny struktury DNA způsobené degradací můžeme stanovit pomocí PCR a následné vizualizace na gelu nebo prostřednictvím polymerázové řetězové reakce v reálném čase (Real-Time PCR). Dříve byly molekulární analýzy velmi limitovány nutností izolovat velké množství čisté DNA, což v některých případech, např. u muzejního materiálu, fosílií nebo u vzorků obsahujících jen velmi malé množství nativní DNA (moč, stopy krve či spermatu, chlupy, exkrementy apod.) nebylo možné. Toto omezení bylo prolomeno s objevem polymerázové řetězové reakce, která představuje jednoduchý a efektivní způsob, jak amplifikovat in vitro požadovaný specifický úsek DNA prakticky v neomezeném množství, přičemž množství původního vzorku DNA může být extrémně malé, může ho představovat dokonce jediná molekula. Navíc díky tomu, že syntetizovaná DNA obsahuje prakticky výhradně studovanou sekvenci, není ji zpravidla zapotřebí dále purifikovat. (Zima a kol., 2004) Princip této metody je založen na replikaci nukleových kyselin. Podstatou PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvojřetězcové DNA ve směru 5´→ 3´ prostřednictvím DNA-polymerázy. Úsek nukleotidové sekvence, který chceme amplifikovat, je vymezen dvěma primery, které jsou 53
komplementární k sekvencím, jež se nacházejí na okrajích množeného úseku a vážou se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3´ konce jsou orientovány proti sobě. (Šmarda a kol., 2005). Kromě primerů potřebujeme dostatečné množství deoxyribonukleotidtrifosfátů (dNTP) a termostabilní DNA-polymerázy, která se izoluje z termofilní gramnegativní bakteri Thermus aquaticus žijící ve vývěrech horkých minerálních pramenů Yellowstonského národního parku. Za přítomnosti těchto tří nezbytných elementů pak probíhá syntéza nových vláken na obou matricových řetězcích protisměrně (Kočárek, 2007). Reakce proíhá v termocykleru a sestává se ze tří základních kroků s odlišnými nároky na teplotu (Šmarda a kol., 2005): •
denaturace dvojřetězcových molekul DNA v důsledku vysoké teploty (94°C)
•
připojení (annealing) primerů k odděleným řetězcům DNA (30-65°C)
•
syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA-polymerázy (65-75°C)
Tento cyklus se neustále opakuje, přičemž v každém cyklu se počet kopií zdvojnásobí, protože fragmenty nasyntetizované v předchozích cyklech slouží současně jako matrice v cyklech následujících, a množství DNA tak geometricky narůstá. Předpokládaný počet vzniklých fragmentů DNA se však ve skutečnosti nepatrně liší, neboť dochází k postupné degradaci enzymu polymerázy. (Zima a kol., 2004) Po provedení PCR provádíme kontrolu amplikonů – výsledných produktů PCR. Stanovení těchto úseků definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce bp prokazujeme elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. PCR v reálném čase je varianta klasické PCR, která umožňuje přímou kvantifikaci PCR-produktu v průběhu reakce. Kvantifikace amplikonu se provádí prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním cykleru, který umožňuje cyklické střídání teplot a zároveň detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky. Při této metodě je nutné kromě faktorů ovlivňujících standardní PCR optimalizovat také kinetiku reakce. Nejprve je templát jednořetězcový, a proto přístroj nezaznamená žádný signál, poté se probíhající amplifikací vytvoří dvojřetězcový produkt, na který se naváže fluorescenční barvivo, které emituje fluorescenční signál. V průběhu dalších cyklů se 54
míra emitované fluorescence dále zvyšuje. Extrapolací vzniklé křivky zpět k nule lze určit počet cyklů nutných pro vytvoření detekovatelného množství produktu; tato hodnota Ct závisí na prvotním množství templátu. Čím je množství prvotního templátu vyšší, tím je hodnota Ct nižší (Šmarda a kol., 2005). Dojde-li ke zvýšení hodnoty Ct, značí to, že došlo k úbytku DNA, která slouží jako templát pro nově syntetizovaný řetězec, a došlo tedy k degradaci DNA (Podivinsky a kol., 2009).
13 ZHODNOCENÍ JEDNOTLIVÝCH ZPŮSOBŮ ARCHIVACE Nejen vzhledem k zachování kvality DNA, ale i k aspektům, jako je skladovací prostor, spotřeba energie, finance či čas a pohodlnost, jsou zvažovány jednotlivé způsoby archivace DNA. Je na každém pracovišti, pro kterou metodu se rozhodne. Také záleží na tom, o jak vzácný vzorek jde, pro jaké další analýzy má být použit a po jakou dobu má být archivován. Je zřejmé, že pokud má být vzorek zanedlouho použit nebo má být využit pro analýzy, které nevyžadují vysoce kvalitní DNA a na základě výsledků analýz nebude stanovena například diagnóza pacienta, či slouží-li vzorek jako pouhá demonstrace manipulací s kyselinou deoxyribonukleovou například ve výuce, nebude uchováván složitými metodami jako zmrazením na -80°C či kryokonzervací, které by zajistily jeho dlouhodobou archivaci. Doba, po kterou má být vzorek uchováván se pohybuje v obrovském rozmezí, od jednotlivých dnů, u vzorků bezprostředně používaných v laboratořích po destiletí dokonce až staletí, po které by vzorky měly být stabilně uloženy například v DNA bankách. Z časového hlediska je tedy podstata krátkodobosti a dlouhodobosti archivace velmi rozdílná, bereme-li v potaz potřeby a požadavky různých oblastí vědy. Uchovávání DNA ve formě vodného roztoku by vzhledem k pohodlnosti manipulace bylo nevhodnější, pro dlouhodobou archivaci však není možné, protože dochází k degradaci vzorku. Pokud se použijí látky jako ethanol či soli, jejichž přítomnost může být neslučitelná s některými analýzami, je třeba je před následujícími manipulacemi odstranit. Při uchovávání DNA ve vysušené formě bychom se měli vyvarovat změn obsahu vlhkosti (Baust, 2008). Navzdory tomu, že se v dnešní době pro potřeby archivace uchovává DNA zmrazená nebo vysušená, zatím bylo provedeno příliš málo zásadních studií a výzkumů, 55
které by jednoznačně určily, jak podstatně a v jaké míře tyto metody ovlivňují stabilitu DNA. Výzkum, který by poskytl jednoznačné údaje o vzájemné korelaci mezi mírou kvality DNA (např. zlomy, schopnost amplifikace) a teplotou skladování, by byl nesmírně přínosný. Vzhledem k nezanedbatelným nákladům, které jsou spojené s uchováváním biologických vzorků a DNA při nízkých teplotách (-80°C a -196 ° C), je zřejmé, že je třeba se takovým výzkumem zabývat (Anchordoquy, Molina, 2007). Standardní metody zmrazování na nízké teploty jsou sice vysoce efektivní, ale souvisí s nimi sousta již zmíněných nevýhod. Anchordoquy, Molina (2007) například uvádí, že podle jejich odhadu byly roční náklady v roce 2007 právě na zachování zmrazených vzorků ve Spojených státech přibližně 54.000.000 dolarů. Odhaduje se, že polovina celosvětového uchovávání tkání se provádí ve Spojených státech, a tedy celkové náklady na udržování zmrazených vzorků každý rok pravděpodobně přesáhne 100 milionů dolarů. Také se musí vzít v úvahu riziko znehodnocení vzorků, dojde-li k výpadku proudu, a přívod elektřiny zajišťující účinné zmrazení tak bude zastaven. Metody skladování a přepravy vzorků obvykle spočívající v chlazení nebo fixování se mohou oproti skladování za podmínek pokojové teploty jevit jako nepohodlné a nákladné (Smith, Burgyone, 2004). Sorenson Molecular Genealogy Foundation (SMGF) oznámila, že pro dlouhodobé uchovávání všech nově odebraných vzorků bude využívat technologii SampleMatrix místo hlubokomrazicích mrazniček, kromě toho bude také přesunovat sbírky již dříve archivovaných vzorků DNA z mrazničkek a skladovat je za podmínek pokojové teploty prostřednictvím této technologie (Laboratory talk, online). Archivace DNA při pokojové teplotě se zdá být velmi výhodná po ekonomické stránce vzhledem k finančním výdajům spojeným s provozem mrazících zařízení, avšak mělo by se vzít v úvahu i to, že technologie jako FTA papíry či SampleMatrix technologie jsou komerčního rázu, z čehož také plynou určité náklady. FTA karty se dnes běžně využívají, například farmaceutické firmy je používají pro sběr a archivaci vzorků lidské DNA pro klinické pokusy s léky, kriminalisté ke shromažďování a archivaci vzorků DNA odsouzených zločinců, vládní agentury na uchování vzorků potravinářských produktů (Whatman, extr.dok.). Veškeré manipulace se vzorky v terénu jsou daleko obtížnější a náročnější, než když se provádí v pohodlí laboratoře. Manipulace s čerstvě odebranými vzorky z místa odběru představuje riziko znehodnocení vzorku, kdy může dojít k vytékání odebraného 56
vzorku a degradaci materiálu zapříčiněné změnami teplot. Archivace prostřednictvím FTA karet však skýtá obrovskou výhodu v tom, že je lze použít při výzkumech přímo v terénu, kdy zajišťují bezpečné, jednoduché a pohodlné shromažďování a přepravu vzorků. To se týká například výzkumu volně žijící zvěře, kdy se na základě skutečností z provedených analýz deoxyribonukleové kyseliny se studuje příbuznost mezi více druhy, určují se patogeny nebo se formuje systematické třídění, také pro potřeby biologů, kdy se hledají nové druhy rostlin, či je-li rostlinný druh ohrožený, a tudíž jej celý nelze z terénu odebrat (Smith, Burgyone, 2004). Pro udržení podmínek, které se vytváří metodou kryokonzervace, jež se běžně využívá pro archivaci genetického potenciálu rostlin, musí být zachována stabilní, neměnná teplota. Pro potřeby efektivního uchovávání DNA člověka se využívají mimo jiné i krevní vzorky. Dříve byly takovéto vzorky pro potřeby analýzy či uchovávání běžně nanášeny na filtrační papír a vysušeny, při tom však nedochází ke zničení patogenů, kdy v důsledku pomalého vysychání či při podmínkách vysoké relativní vlhkosti je podporován růst mikroflóry, která znehodnocuje DNA, proto tento způsob není vhodný pro dlouhodobé uchovávání, protože nelze chránit vzorek před poškozením a zničením. FTA karty, které se běžně pro vzorky krve používají a zajišťují jejich bezpečné a stabilní uchovávání, se tedy jeví jako velmi účinný způsob dlouhodobého uchovávání. Také archivace vzorků krve na matrici způsobem SampleMatrix vede k podstatně vyšším výnosům získané DNA ze vzorku v porovnání s konvenčními metodami dlouhodobého skladování při pokojové teplotě (Biomatrica, online). Obecně má uchovávání za pokojové teploty, kdy je vzorek navázán na pevnou matrici, i svá omezení. Předpokládá se, že hlavním proměnným činitelem během uchovávání bude kvalita atmosféry, zejména obsah kyselých plynů a znečišťujících látek, které uvolňují volné radikály. Na základě znalostí principů poškození DNA je reálné, že doba uchovávání může být značně prodloužena, jestliže je atmosférická cirkulace záměrně potlačena (Smith, Burgyone, 2004). FTA karty chrání DNA uvnitř vzorků od okolních vlivů po několik let. Kvůli předpokládaným změnám ovzduší při skladování však ani uchování na FTA papírech není na dobu nekonečně dlouhou. FTA karta zajišťuje archivaci tím způsobem, že je na ni nanesen biologický vzorek, čili ne izolovaná DNA, z toho důvodu se hodí pro dlouhodobou archivaci či zmíněné použití v terénu. Pro účely krátkodobého uskladnění 57
při bezprostředním používání vzorků DNA se tedy zdá být účelnější běžné uchovávání DNA v roztoku v lednici. Z uvedeného je více než zřejmé, že každá metoda archivace má své výrazné výhody, ale i nevýhody. Existuje však několik studií, které poskytují konečnou odpověď na otázku optimálních podmínek pro skladování DNA. National Cancer Institute a National Institute of Standards and Technology zveřejnily některé údaje, které naznačují, že "chladnější je lepší". Při hledání optimální strategie uchovávání ex vivo se musí vzít v úvahu velké množství proměnných, které se týkají metodiky izolace, zachování skladovacích podmínek či technik testování vzorků. Vzhledem k různorodosti těchto proměnných je tedy velmi složité učinit srovnání a je nepravděpodobné, že bude určeno rozhodující optimální řešení (Baust, 2008).
58
14 ZÁVĚR Předložená práce poskytuje vysvětlení problematiky archivace DNA, způsobů, kterými se provádí, a aspektů, které s tímto procesem souvisí. V úvodní části je popsáno, proč je archivace kyseliny deoxyribonukleové užitečná a proč se provádí, z hlediska potřeb člověka, rostlin i zvířat. Je vysvětlena kvalita DNA, která je určujícím faktorem při izolaci i samotné archivaci. DNA by měla být co nejméně degradovaná a znečištěná kontaminanty. I přesto, že je DNA poměrně stabilní molekula, působí na ni spousta různých faktorů, které mění její strukturu, tím ji znehodnocují a v důsledku toho snižují tolik potřebnou kvalitu. V části, která se zabývá právě faktory, které na DNA mohou působit, je nastíněn vliv teploty, pH, iontové síly, ultrafialového a ionizujícího záření, mechanických sil, ultrazvuku a nukleáz. V další části je podrobně popsán postup izolace DNA a vyzdvižena důležitost jejího provedení, taktéž vzhledem k zachování kvality. Poté se práce soustřeďuje na vlastní archivaci DNA a způsoby jejího provedení, které jsou popsány a rozděleny podle formy vzorku DNA a teploty. Pro potřeby krátkodobé archivace se DNA uchovává při teplotě +4 ° C a pro dlouhodobou archivaci se uchovává při teplotách -20 a -80 ° C nebo kryokonzervací při teplotě -196 ° C. Požadovaný vzorek DNA se může skladovat ve formě kapalné, kdy je rozpuštěn ve vodném roztoku či pufru, nebo ve formě vysušené, kdy je precipitovaný pelet uchováván v ethanolu či v lyofilizovaném stavu. DNA může být také uchovávána za pokojové teploty, čehož se dosáhne archivací prostřednictvím FTA papíru, chitosanu či SampleMatrix technologie, které jsou v práci rovněž popsány. Dále jsou zmíněny metody UV-absorpční spektrometrie, elektroforéza, PCR a Real-Time PCR, které se používají pro ověření kvality DNA. V práci jsou diskutovány výhody a nevýhody jednotlivých metod, kdy se zvažují všechny možné
aspekty související
s archivací
DNA.
S uchováváním
DNA
prostřednictvím zmrazování jsou sice spojeny vysoké finanční náklady a jiné zmiňované nevýhody, avšak i přesto se běžně využívá vzhledem k tomu, že zajišťuje vysoce účinnou a efektivní dlouhodobou archivaci.
59
15 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ANCHORDOQUY, T. J., MOLINA, M. C., 2007: Preservation of DNA. Cell Preservation Technology, 5 (4): 180-188. BAUST, J. G., 2008: Strategies for the Storage of DNA. Biopreservation and biobanking, 6 (4): 251–252. BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T., 2004: Genetika rostlin. MZLU, Brno, 146 s. BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T., JEDLIČKOVÁ, D., 1999: Cvičení z genetiky rostlin. MZLU, Brno, 133 s. BERDYS, J., ANUSIEWICZ, I., SKURSKI, P., SIMONS, J., 2004: Damage to Model DNA Fragments from Very Low-Energy (<1 eV) Electrons. Journal of the American Chemical Society, 126 (20): 6441–6447. BRDIČKA, R., 2001: Lidský genom na rozhraní tisíciletí. Grada, Praha, 249 s. BRESLER, S. J., 1979: Molekulární biologie. Přeložil Zadražil, S. Academia, Praha, 512 s. BROWN, T. A., 2007: Klonování genů a analýza DNA: úvod. Univerzita Palackého, Olomouc, 389 s. CLARKE, A. G., 2009: The Frozen Ark Project: the role of zoos and aquariums in preserving the genetic material of threatened animals. International Zoo Yearbook, 43 (1): 222-230. DOTLAČIL, L., STEHNO, Z., FABEROVÁ, I, 2005: Kryoprezervace jako perspektivní metoda konzervace genetických zdrojů rostlin, s. 5-7. In: ZÁMEČNÍK, J., BILAVČÍK, A., FALTUS, M. (eds): Metody kryoprezervace vegetativně množených rostlin: Workshop: sborník příspěvků a laboratorních postupů. Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, 62 s.
60
DOTY, P., BOEDTKER, H., FRESCO, J. R., HASELKORN, R., LITT, M., 1959: Secondary structure in ribonucleic acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 45 (4): 482–499. EHRICH, M., ZOLL, S., SUR, S., VAN DEN BOOM, D., 2007: A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment. Nucleic Acids Research, 35 (5): 29. ELSNER, H. I., LINDBLAD, E. B., 1989: Ultrasonic degradation of DNA. DNA, 8 (10): 697-701. GUSCHLBAUER, W., 1980: Štruktúra nukleových kyselín. Alfa, Bratislava, 182 s. HANÁČEK, P., 2009: Materiály k přednášce předmětu Metody molekulární a buněčné biologie. HRUBAN, V. (ed), 1999: Principy a aplikace molekulární genetiky ve šlechtění. ČZUAF, Praha, 242 s. HYMAS, W., STEVENSON, J., TAGGART, E. W., HILLYARD, D., 2005: Use of lyophilized standards for the calibration of a newly developed real time PCR assay for human herpes type six (HHV6) variants A and B. Journal of Virological Methods, 128 (1-2): 143–150. KARYAGINA, Y. I. MYULBERG, A. A., TISCHENKO, L. I., ASHMARIN, I. P., 1976: Effect of conditions of isolation and incubation of nuclei on fragmentation of chromatin DNA by Ca,Mg dependent endonuclease. Change in spectrum of chromosomal proteins and possible role of DNA protein interactions. Biochemistry, 41 (6 II): 930-938. KEJNOVSKÝ, E., KYPR, J., 1993: Tris buffer protects DNA backbone against breakage upon irradiation with ultraviolet light. General Physiology and Biophysics, 12 (4): 317-324.
OBE, VIJAYALAXMI, 2007: Chromosomal Alterations Methods, Results and Importance in Human Health. Springer, Berlín, 515 s.
61
KLEMŠ, M., 2009: Materiály k přednášce předmětu Radioindikátorové metody. KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z., 2002: Molekulární genetika zvířat: Metody detekce polymorfizmů DNA genů. MZLU, Brno, 130 s. KOČÁREK, E., 2007: Molekulární biologie v medicíně. Národní ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů v Brně, Brno, 218 s.
centrum
KRÁLOVÁ, B., FUKAL, L., RAUCH, P., RUML, T., 2008: Bioanalytické metody. VŠCHT, Brno, 254 s. KŘEMEN, J., POHLREICH, P., STŔÍBRNÁ, J., 1998: Techniky molekulární biologie a jejich využití v medicíně. Karolinum, Praha, 117 s. LIN, J., KENNEDY, S. H., SVAROVSKY, T., ROGERS, J., KEMNITZ, J. W., XU, A., ZONDERVAN, K. T., 2009: High-quality genomic DNA extraction from formalinfixed and paraffin-embedded samples deparaffinized using mineral oil. Analytical Biochemistry, 395 (2): 265-267. MARRONE, A., BALLANTYNE, J., 2010: Hydrolysis of DNA and its molecular components in the dry state. Forensic Science International: Genetics, 4 (3): 168-177. MIDDAUGH, C. R., EVANS, R. K., MONTGOMERY, D. L., CASIMIRO, D. R., 1998: Analysis of Plasmid DNA from a Pharmaceutical Perspective. Journal of Pharmaceutical Sciences, 87 (2): 130-146. PODIVINSKY, E., LOVE, J. L., VAN DER COLFF, L., SAMUEL, L., 2009: Effect of storage regime on the stability of DNA used as a calibration standard for real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry, 394 (1): 132-134. ROSYPAL, S., 2001: Terminologie molekulární biologie. S. Rosypal, Brno, 281 s.
ROSYPAL, S., 2005: Úvod do molekulární biologie: Vstup do molekulární biologie, molekulární biologie prokaryotické buňky. První díl. S. Rosypal, Brno, 289 s. ROSYPAL, S., ROSYPALOVÁ, A., VONDREJS, V., 1983: Molekulární genetika. SPN, Praha, 309 s. 62
RYABCHENKO, N. I., BRAGINSKAYA, F. I., ELPINER, I. Y., TSEITLIN, P. I., 1964: Analysis of the mechanisms of degradation of DNA macromolecules by ultrasonic waves. Biophysics, 9 (2): 168-174. SMITH, L. M., BURGOYNE, L. A., 2004: Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA® databasing paper. BMC Ecology, 4 (4) ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J., 2005: Metody molekulární biologie. Masarykova univerzita, Brno, 188 s. VAUGHAN, H., CHALKER, V. J., MEE, Z., ROSSOUW, A., JAMES, V., 2006: Stability of lyophilised specimens for the molecular detection of viral DNA/RNA. Journal of Clinical Virology, 35 (2): 135–140 VORLÍČKOVÁ, M., KYPR J., SKLENÁŘ, V., 2005: Nucleic Acid, Spectroscopic Methods. Encyklopedia of Analytical Science (Second Edition), 6: 391-399. WATSON, J. D., 1982: Molekulární biologie genu. Přeložili Šatava, J., Pačes, V. Academia, Praha, 757 s. ZIMA, J., MACHOLÁN, M., MUNCLINGER, P., PIÁLEK, J., 2004: Genetické metody v zoologii. Karolinum, Praha, 239 s. Biomatrica: Technology. [online]. [cit.
2010-02-23].
Dostupné
na:
BURGOYNE, L. A., 1996: Solid medium and method for DNA storage. [online]. [cit. 2009-11-15]. Dostupné na: http://www.freepatentsonline.com/5496562.html DNA Direct: DNA storage. [online]. [cit. 2009-11-15]. .
Dostupné
na:
Genomac International: Archivace DNA. [online]. [cit. 2009-09-21]. Dostupné na: . Laboratory talk: Samplematrix technology protects DNA samples. [online]. [cit. 201002-23]. Dostupné na: .
63
MOON WOO-CHUL, OH MYUNG-RYURL, YIM SU-BIN, EUM TAE-HAN, LEE MI-AE, JEON BU-IL, 2006: Method for storing DNA using chitosan, and products using the methods. [online]. [cit. 2010-02-23]. Dostupné na: OSWALD, N., 2007: The Basics: How Ethanol Precipitation of DNA and RNA Works. Bitesize Bio. [online]. [cit. 2010-02-21]. Dostupné na Pragolab: Lyofilizace a zakoncentrování vzorků. [online]. [cit. 2009-09-21]. Dostupné na Whatman, Externí dokumentace - FTA Nucleic Acid Collection, Storage and Purification: FTA Cards, FTA DNA Archiving. [online]. [cit. 2009-09-21]. Dostupné na: Whatman: FTA Nucleic Acid Collection, Storage and Purification. [online]. [cit. 200909-21]. Dostupné na
64
