MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

BRNO 2012

ŽANETA MARTINCOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Enterokoky a jejich význam Bakalářská práce

Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Vypracovala: Žaneta Martincová

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Enterokoky a jejich význam vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………. podpis ……………………………………

PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych upřímně poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Ing. Liborovi Kalhotkovi, Ph.D., za cenné rady, připomínky, ochotu a čas, který mi věnoval při samotném vzniku této práce.

ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá významem a výskytem bakterií rodu Enterococcus. V této práci jsem shrnula dosavadní poznatky o bakteriích toho rodu. Zrekapitulovala jsem všechny doposud popsané enterokoky a více jsem se zaměřila na jejich popis, význam a výskyt. Větší pozornost jsem věnovala druhům E. faecalis a E. faecium, kteří byli v roce 1984 popsáni a přeřazeni mikrobiology Schleiferem a Kilpper-Bälzem ze svého původního rodu Streptococcus. Oba dva tyto druhy byly izolovány z feces (výkalů) člověka a teplokrevných živočichů. Zjistila jsem, že tyto druhy jsou velmi častou příčinou fekálního znečištění vody, anebo nozokominálních infekcí u lidí, kde způsobují různé druhy infekcí a onemocnění jako např. enteritidy, infekce močových cest, destrukce chlopně aj. Obecně se enterokoky vyskytují téměř všude, ať už je to v potravinách, na rostlinách či v půdě. Klíčová slova: bakterie, Enterococcus, význam, výskyt

ABSTRACT This bachelor thesis deals with significance and occurrence of Enterococcus bacteria. In this thesis I have summed up existing knowledge of this genusofbacteria. I have recapitulated all described Enterococci up to date and I have concentrated especially on their description, significance and occurrence. More attention was given to the E. Faecalis and E. faeciumgenuses, which were described and reclassified by microbiologists SchleiferandKilpper-Bälz from their original genus Streptococcus. Both these genuses were isolated from feces (excrements) of a human or endothermic animal. I have found out that these genuses are quite often the cause of the faecal contamination of water or nosocomial infections on human beings, where they cause many kinds of infections and deseases such as enteritis, urinary tract infection, valve destruction, etc. In general Enterococcus bacteria can be find anywhere – in food, on plants or in soil. Key words: bacteria, Enterococcus, meaning, occurrence

Obsah

1

Úvod.......................................................................................................................... 9

2

Cíl práce .................................................................................................................. 10

3

Taxonomie rodu Enterococcus ............................................................................... 11

4

3.1

Historie taxonomie ........................................................................................... 11

3.2

Současná taxonomie ......................................................................................... 11

3.3

Skupiny enterokoků dle taxonomického rozdělení .......................................... 13

Obecná charakteristika rodu Enterococcus ............................................................. 14 4.1

Bakteriologické znaky...................................................................................... 15

4.2

Fyziologické vlastnosti..................................................................................... 16

4.3

Metabolismus ................................................................................................... 17

4.4

Buněčná stěna................................................................................................... 18

4.5

Pohybové ústrojí............................................................................................... 18

4.6

Antigenní vlastnosti ......................................................................................... 19

4.7

Chromozomy .................................................................................................... 19

4.8

Plasmidy ........................................................................................................... 19

4.9

Transpozony ..................................................................................................... 20

4.10

Tvorba biofirmu............................................................................................ 20

5

Fylogenetické členění rodu Enterococcus .............................................................. 20

6

Charakteristika jednotlivých druhů rodu Enterococcus.......................................... 21 6.1

Enterococcus aquimarinus ............................................................................... 21

6.2

Enterococcus asini ........................................................................................... 21

6.3

Enterococcus avium ......................................................................................... 21

6.4

Enterococcus caccae ........................................................................................ 22

6.5

Enterococcus camelliae ................................................................................... 22

6.6

Enterococcus canintestini ................................................................................ 22

6.7

Enterococcus canis........................................................................................... 23

6.8

Enterococcus casseliflavus............................................................................... 23

6.9

Enterococcus cecorum ..................................................................................... 23

6.10

Enterococcus columbae ................................................................................ 24

6.11

Enterococcus devriesei ................................................................................. 24

6.12

Enterococcus dispar ..................................................................................... 24

6.13

Enterococcus durans .................................................................................... 25

6.14

Enterococcus faecalis ................................................................................... 25

6.15

Enterococcus faecium ................................................................................... 26

6.16

Enterococcus gallinarum.............................................................................. 27

6.17

Enterococcus gilvus ...................................................................................... 28

6.18

Enterococcus haemoperoxidus ..................................................................... 28

6.19

Enterococcus hermanniensis ........................................................................ 28

6.20

Enterococcus hirae ....................................................................................... 29

6.21

Enterococcus italicus.................................................................................... 29

6.22

Enterococcus malodoratus ........................................................................... 29

6.23

Enterococcus moraviensis ............................................................................ 30

6.24

Enterococcus mundtii ................................................................................... 30

6.25

Enterococcus pallens .................................................................................... 30

6.26

Enterococcus phoeniculicola........................................................................ 30

6.27

Enterococcus pseudoavium .......................................................................... 31

6.28

Enterococcus raffinosus ............................................................................... 31

6.29

Enterococcus ratti ........................................................................................ 31

6.30

Enterococcus saccharolyticus ...................................................................... 31

6.31

Enterococcus silesiacus ................................................................................ 32

6.32

Enterococcus sulfureus ................................................................................ 32

6.33

Enterococcus termitis ................................................................................... 32

6.34 7

8

Enterococcus villorum .................................................................................. 32

Výskyt rodu Enterococcus ...................................................................................... 33 7.1

Výskyt enterokoků v rostlinách ....................................................................... 33

7.2

Výskyt enterokoků v živočiších ....................................................................... 34

7.3

Výskyt enterokoků ve vodě .............................................................................. 34

7.4

Výskyt enterokoků v půdě ............................................................................... 35

7.5

Výskyt enterokoků v potravinách .................................................................... 35

7.5.1

Výskyt enterokoků v mléce a mlékárenských výrobcích ......................... 36

7.5.2

Výskyt enterokoků v mase ........................................................................ 37

7.5.3

Výskyt enterokoků u vodních živočichů .................................................. 37

7.5.4

Výskyt enterokoků v pivu ......................................................................... 37

7.5.5

Výskyt enterokoků v obilninách ............................................................... 37

Význam rodu Enterococcus .................................................................................... 38 8.1 Význam enterokoků v potravinářském průmyslu ................................................. 38

9

8.1.1

Význam enterokoků v mléčných výrobcích ............................................. 38

8.1.2

Význam enterokoků v masných výrobcích ............................................... 39

8.2

Význam enterokoků v pitné vodě .................................................................... 40

8.3

Význam enterokoků pro organismus lidí a živočichů ...................................... 40

8.4

Indikátorový význam termorezistentních bakterií ........................................... 42

Stanovení bakterií rodu Enterococcus .................................................................... 42 9.1

Stanovení enterokoků plotnovou metodou....................................................... 43

9.2

Biochemické stanovení .................................................................................... 43

10

Rezistence bakterií rodu Enterococcus ................................................................... 44

11

Charakterizace opatření v boji proti nežádoucím enterokokům ............................. 45

12

Závěr ....................................................................................................................... 47

Přehled použité literatury: ............................................................................................... 49

1 ÚVOD Bakterie rodu Enterococcus jsou zástupci velké domény Bacteria, kmen Firmicutes. Tento rod vznikl přesunem druhů Streptococcus faecalis a Streptococcus faecium v roce 1968. Enterokoky jsou ubikvitárně rozšířené, což znamená, že je můžeme najít téměř všude. Vyskytují se v půdě, ve vodě, v potravinách, na povrchu rostlin či živočichů. Neměl by být opomíjen ani jejich přirozený výskyt a to v intestinálním traktu člověka, nebo živočichů. Díky tomu jsou často používány jako indikátory fekálního znečištění. Dále jsou enterokoky rozšířeny ve fekálně kontaminovaném prostředí např. ve stájích, v půdě, nebo v povrchových vodách. Toto jsou také místa, odkud bývají enterokoky nejčastěji izolovány. Jejich využití a význam je taktéž široký. Můžeme je využívat jako startovací kultury v masném či mléčném průmyslu, nebo jako probiotika. U některých mléčných a masných výrobku se podílejí na jejich aroma a chuti, naopak u některých potravin mohou způsobit i jejich zkázu. Enterokoky jsou odolné k desinfekčním prostředkům (např. k chlóru), díky tomu se mohou používat k indikaci nedostatečné dávky desinfekčního prostředku. Dále jsou zástupci rodu Enterococcus významným humánním infekčním činitelem. Pro člověka jsou nebezpečné hlavně vysoce rezistentní druhy, tzv. fekální enterokoky. Mezi tyto druhy patří hlavně Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Druhy E. faecium a E. faecalis patří mezi nejčastější a nejvíce popsané druhy enterokoků. V těle člověka a hlavně u jedinců s oslabenou imunitou způsobují endogenní, exogenní a často nozokominální infekce.

9

2 CÍL PRÁCE Cílem této práce, bylo shrnout obecné informace o bakteriích rodu Enterococcus. Podrobněji se zaměřit na druhy významné v potravinářském průmyslu a obecně popsat jejich výskyt a význam a to nejen v potravinářském průmyslu. Dále pak se zaměřit na jejich význam pro lidský organismus a charakterizovat opatření v boji proti těmto nežádoucím bakteriím.

10

3 TAXONOMIE RODU ENTEROCOCCUS 3.1 Historie taxonomie V roce 1899 francouzský vědec Thiercelin poprvé popsal morfologické a některé biologické vlastnosti nového grampozitivního rodu. Tento rod označil jako „entérocoque“ z důvodu jeho střevního původu. V roce 1903 Thiercelin a Jouhaud navrhl rodové jméno Enterococcus (Kalina, 1970). Název tohoto rodu je odvozen z řeckých slov enteron-střevo a coccos-kulaté jádro (Klaban, 1999). Na základě schopnosti těchto mikroorganismů tvořit krátké, nebo dlouhé řetězce je v roce 1906 Andrewes a Horder přejmenoval na „Streptococcus faecalis“. V pozdějších klasifikacích byly enterokoky spolu s dalšími mléčnými a ostatními streptokoky zahrnuty do rodu Streptococcus. Toto nesprávné označení se používalo až do roku 1984 (Kalina, 1970). V roce 1933 publikovala Lancefieldová sérologické rozdělení rodu Enterococcus a dle tohoto rozdělení byly enterokoky klasifikovány jako streptokoky skupiny D (Hartman a kol., 1966). Sherman poprvé v roce 1937 oddělil antigenní strukturu enterokoků od streptokoků (Kalina, 1970). Navrhl odlišení enterokoků od pravých mléčných streptokoků pomocí následujících kriterií: růst v médiu s 6,5% obsahem NaCl, což znamená, že jsou odolné i vůči nízkým hodnotám aktivity vody, rostou v médiu se 40% obsahem žluče, při pH 9,6, při 10°C i při 45°C a přežívají záhřev na teplotu 60˚C po dobu 30 minut (Görner a Valík, 2004). Přesun druhů Streptococcus faecalis a Streptococcus faecium do rodu Enterococcus poprvé navrhl v roce 1968 Kalina (Kalina, 1970). Tento přesun však nebyl přijat. Díky tomu byl rod Enterococcus validně popsán až v roce 1984. V tomto roce byl rod Enterococcus uznán jako samostatný rod, protože byla uveřejněna práce Schleifera a Kilpper-Bälze. Ti navrhli přesun druhů S. faecalis a S. faecium do rodu Enterococcus na základě výsledků DNA-DNA a DNA-rRNA hybridizace (De Vos a kol., 2009). Další studie 16S rDNA potvrdila nejen toto rozdělení, ale také, že enterokoky se liší od rodu Lactococcus a některých dalších grampozitivních koků (De Vos a kol., 2009).

3.2 Současná taxonomie V dnešní době je validně popsáno 34 druhů enterokoků. Jejich přehled uvádím v tabulce č. 1 (De Vos a kol., 2009). 11

Tabulka 1: Validně popsané druhy enterokoků (De Vos a kol., 2009) Druh

Autoři reference

Enterococcus aquimarinus

Švec a kol., 2005

Enterococcus asini

De Vaux a kol., 1998

Enterococcus avium

Collins a kol., 1984

Enterococcus caccae

Carvalho a kol., 2006

Enterococcus camelliae

Sukontasing a kol., 2007

Enterococcus canintestini

Naser a kol., 2005

Enterococcus canis

De Graef a kol., 2003

Enterococcus casseliflavus

Collins a kol., 1984

Enterococcus cecorum

Williams a kol., 1989

Enterococcus columbae

Devriese a kol., 1993

Enterococcus devriesei

Švec a kol., 2005

Enterococcus dispar

Collins a kol., 1991

Enterococcus durans

Collins a kol., 1984

Enterococcus faecalis

Schleifer and Kilpper-Bälz, 1984

Enterococcus faecium

Schleifer and Kilpper-Bälz, 1984

Enterococcus gallinarum

Collins a kol., 1984

Enterococcus gilvus

Tyrrell a kol., 2002

Enterococcus haemoperoxidus

Švec a kol., 2001

Enterococcus hermanniensis

Koort a kol., 2004

Enterococcus hirae

Farrow and Collins, 1985

Enterococcus italicus

Fortina a kol., 2004

Enterococcus malodoratus

Collins a kol., 1984

Enterococcus moraviensis

Švec a kol., 2001

Enterococcus mundtii

Collins a kol., 1986

Enterococcus pallens

Tyrrell a kol., 2002

Enterococcus phoeniculicola

Law-Brown and Mayers, 2003

Enterococcus pseudoavium

Collins a kol., 1989

Enterococcus raffinosus

Collins a kol., 1989

Enterococcus ratti

Teixeira a kol., 2001

Enterococcus saccharolyticus

Rodrigues and Collins, 1991

Enterococcus silesiacus

Švec a kol., 2006

Enterococcus sulfureus

Martinez-Murcia and Collins, 1991

Enterococcus termitis

Švec a kol., 2006

Enterococcus villorum

Vancanneyt a kol., 2001

12

3.3 Skupiny enterokoků dle taxonomického rozdělení Jedním z nejdůležitějších jevů je existence skupin druhů v rámci rodu Enterococcus. Bylo zjištěno, že některé druhy vytvářejí oddělené linie, ale většina může být zařazena do skupin. Členové těchto skupin mají podobné fenotypové vlastnosti a rozpoznávání jednotlivých druhů může být problematické (De Vos a kol., 2009). Podobnost genové sekvence 16S rRNA mezi druhy se v některých skupinách pohybuje kolem 99,8 %. I přes tyto podobné vlastnosti se druhy dobře rozpoznávají na základě stanovení podobnosti DNA-DNA, nebo pomocí molekulárních identifikačních technik (De Vos a kol., 2009). Skupin máme celkem šest. Skupina Enterococcus faecium obsahuje druhy E. faecium, E. durans, E. canis, E. hirae, E. mundtii, E. ratti a E. villorum. Tyto druhy většinou vykazují stejné fyziologické vlastnosti a stejný růst. Rozlišení druhů v této skupině na základě biochemických testů je většinou nespolehlivé. Nejobtížnější je odlišit druhy E. durans, E. hirae a E. villorum. Jednoznačně je můžeme odlišit například pomocí profilu buněčných proteinů, nebo pomocí analýzy SDS-PAGE, tDNA-PCR. (De Vos a kol, 2009). Druhou skupinou je skupina Enterococcus avium, která je tvořena E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium a E. raffinosus. Pro tyto druhy je typická tvorba malých kolonií. Rostou při teplotách v rozmezí od 10°C do 45°C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Členové této skupiny jsou zpravidla adonitol a L-sorbóza pozitivní. D-antigen může být negativní (De Vos a kol., 2009). Další skupinou je Enterococcus faecalis. Do této skupiny řadíme druhy E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, E. silesiacus a E. termitis. Tyto druhy mají různé fylogenetické vlastnosti, ale fenotypově jsou si dost podobné. Na agaru Slanetz-Bartley tvoří podobné tmavě červené kolonie s kovovým leskem. Rostou při 10˚C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Výroba D-antigenu je pozitivní. Tyto druhy od sebe můžeme odlišit díky některým biochemickým testům (De Vos a kol., 2009). Další skupinou, do které patří pouze dva druhy je skupina Enterococcus gallinarum. Řadíme sem E. gallinarum a E. casseliflavus. Pohyblivost a nízká vnitřní odolnost vůči vancomycinu je pro tuto skupinu charakteristická. Zřídka kdy mohou být izolovány i nepohyblivé kmeny (De Vos a kol., 2009). Do skupiny Enterococcus cecorum patří E. cecorum a E. columbae. Tyto druhy jsou si fylogeneticky vzdáleně příbuzné, ale jejich fenotypová podobnost je pozoruhodná. 13

Špatně rostou na selektivních médiích. Jejich růst je zvýšen kultivací v atmosféře, která obsahuje CO2. Zvláštností u těchto dvou druhů je výroba alkalické fosfatázy (De Vos a kol., 2009). Skupina Enterococcus italicus zahrnuje druhy E. italicus a E. camelliae. Tyto nedávno popsané druhy mají ve srovnání s ostatními enterokoky nízkou biochemickou aktivitu. Zbytek druhů rodu Enterococcus patří do samostatné fylogenetické větve. Jsou to druhy E. aquimarinus, E. asini, E. canintestini, E. dispar, E. hermanniensis, E. pallens, E. phoeniculicola, E. saccharolyticus a E. sulfureus (De Vos a kol., 2009).

4 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA RODU ENTEROCOCCUS Rod Enterococcus nebyl do 70. let 20. století považován za škodlivý. Ale v pozdějších letech byly bakterie tohoto rodu stále častěji prokazovány za původce nebezpečných onemocnění a to jak lidí, tak zvířat. Mezi tato onemocnění patří zejména enteritidy, infekce močových cest, meningitidy, sepse a choroby žlučníku (Hampl, 1968). Nejčastěji bývají izolovány z močových cest, ranných infekcí, endokarditid a bacteremií. V dnešní době se enterokoky staly velmi významnými původci nozokominálních a jiných infekcí (De Vos a kol., 2009). Občas způsobují hnisavé infekce (Sedláček, 2006). Jsou nebezpečné hlavně kvůli jejich stále rostoucí rezistenci vůči antibiotikům. E. faecium a E. faecalis byly navrženy jako indikátory fekálního znečištění, ale vyskytují se i na rostlinách, které nepřišli do styku s fekáliemi, proto jsou méně specifické než Escherichia coli (Šilhánková, 2002). Enterokoky jsou používány jako indikátory bezpečnosti potravin (Marth, Steele, 2001). Mohou také způsobit i zkázu potravin (Hampl, 1968). Často se bakterie rodu Enterococcus v laboratorní řeči souhrnně nazývají enterokoky, streptokoky sérologické skupiny D anebo fekální streptokoky (Görner a Valík, 2004).

14

4.1 Bakteriologické znaky Enterokoky patří do skupiny grampozitivních bakterií, které jsou běžně izolovány z lidských klinických vzorků, některých druhů potravin a z životního prostředí (Švec a kol., 2001). Tvoří koky i krátké tyčinky sférického, nebo ovoidního tvaru (Sedláček, 2006). Vyskytují se v různých seskupeních, buď ve dvojicích, ve shlucích, nebo v krátkých řetízcích a jsou často prodloužené ve směru řetízku (De Vos a kol., 2009). Z morfologické stránky připomínají pneumokoky (Klaban, 1999). Zástupci bakteriálního rodu Enterococcus se vyskytují jako saprofyté a komenzálové trávicího ústrojí člověka a zvířat. Saprofyté jsou organismy využívající ke svému životu rozkládající se části jiného organismu, nebo jeho výměšků aniž by mu tím způsobil poškození. Komenzálové jsou organismy žijící v blízkém vztahu k jinému organismu, aniž by mu působily škodu (Komprda, 2003). Jsou odolnější k nepříznivým podmínkám (např. k uzení) než střevní tyčinky (Šilhánková, 2002). Optimální teplota růstu se pohybuje v rozmezí od 35°C do 37°C. Hodně druhů, ale ne všechny mohou růst při 42°C a dokonce i při 45°C. Naopak při 10°C zaznamenáváme pomalý růst. Jsou velmi odolní vůči vysychání (De Vos a kol., 2009). Jsou poměrně rezistentní, přežívají záhřev na teplotu 60°C po dobu 30 minut (Lukášová a kol., 1997). Jsou schopni růstu v 6,5 % NaCl a při pH 9,6. Díky těmto vlastnostem lze odlišit enterokoky od streptokoků (výjimky jsou Lactococcus Lactis a Lactoccus cremoris) (Schleifer, 1984). Od ostatních kataláza negativních grampozitivních koků můžeme enterokoky odlišit díky jejich schopnosti hydrolyzovat eskulin v přítomnosti 40 % žlučových solí, nebo díky jejich produkci pyrrolidonylarylamidasy (Varman, 2012). Dále jsou enterokoky odolné vůči nízké aktivitě vody (Lukášová a kol., 1997). Rostou také v přítomnosti 40% žluče (Sedláček, 2006). Netvoří endospory (Sedláček, 2006). Kmeny některých druhů se mohou pohybovat pomocí bičíků (De Vos a kol., 2009). Některé druhy tvoří žlutý pigment (De Vos a kol., 2009). Enterokoky dobře kultivujeme na umělých živných půdách (Hampl, 1968). Využívají široké rozmezí sacharidů. Hlavním produktem jejich fermentace je L (+)kyselina mléčná. Ale plyn nevytváří. Vyjímkou jsou E. avium a E. malodoratus, kteří produkují sirovodík. Kataláza je negativní, enterokoky jsou často alfahemolitické (viridující) na krevním agaru (Sedláček, 2006). 15

Lancefieldová publikovala ve 30. letech 20. století sérologické rozdělení enterokoků. Dle tohoto zjištění patří rod Enterococcus do sérologické skupiny D (Marth, Steele, 2001). Enterokoky mají obecně složité nutriční požadavky (De Vos a kol., 2009). Zkvašují glukózu za tvorby kyseliny, nebo kyseliny a plynu (Hampl, 1968). Enterokoky fermentují sacharidy podobně jako bakterie mléčného kvašení. Konečná hodnota pH v glukózovém roztoku se pohybuje v rozmezí od 4,6 do 4,2, příležitostně mohou být tyto hodnoty i nižší. Neredukují dusičnan na dusitan, nerozkádají celulózu pektin a ani tuky. Významný rozklad vykazuje pouze druh E. faecalis, což je proteolytický druh (Görner a Valík, 2004). Hemolytická aktivita je variabilní a z velké části závisí na druhu. Obsah G + C v DNA se u enterokoků pohybuje v rozmezí od 35,1 do 44,9 mol % (De Vos a kol., 2009).

Obrázek 1: Elektronová mikrofotografie ultra tenké části dělícího páru enterokoků (dostupné na: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/Structure.html)

4.2 Fyziologické vlastnosti Enterokoky

řadíme

podle

nároků

na

kyslík

mezi

fakultativně

anaerobní

mikroorganismy, což znamená, že mají schopnost aerobního i anaerobního metabolismu (Sedláček, 2006). Mohou růst za přítomnosti i za nepřítomnosti kyslíku. V přítomnosti 16

kyslíku se většinou rozmnožují rychleji. Aerobní metabolismus přeměňuje rychleji substrát v energii, proto je výhodnější a poskytuje i více energie než metabolismus anaerobní. Podle zdroje energie patří mezi chemoorganotrofní mikroorganismy, což znamená, že využívají organický oxidovatelný substrát, jsou to heterotrofní mikroorganismy, u kterých jsou zdrojem uhlíku organické látky (např. organické kyseliny, lipidy, sacharidy, alkoholy) (Šimonovičová a kol., 2008).

4.3 Metabolismus Enterokoky

mají

fermentativní

typ

metabolismu

(Sedláček,

2006).

Jsou

homofermentativní. Enterokoky jsou schopné fermentovat mnoho sacharidů jako např. N-acetylglukosamin, amygdalin, arbutin, celobiósa, D-fruktósa, galaktósa, laktósa, maltósa, D-mannosa, ribósa a další (De Vos a kol., 2009). Hlavní metabolickou dráhou při výrobě energie je Embden-Meyerhof-Parnasova dráha. Za aerobních podmínek je glukóza metabolizována na kyselinu octovou, acetoin a CO2. Pyruvát se stechiometricky přeměňuje na laktát, pomocí E. faecalis při pH v rozmezí od 5,0 do 6,0. V neutrálním, nebo v zásaditém pH je pyruvát převeden na kyselinu mravenčí, etanol a acetát v poměru 2:1:1. Při nedostatku živin, je pyruvát přeměněn na etanol a octan. Hippurát je hydrolyzován na glycin a kyselinu benzoovou (De Vos a kol., 2009). Enterokoky mohou získat energii degradací některých aminokyselin, jako jsou arginin, tyrosin, serin, fenylalanin aj (De Vos a kol., 2009). E. faecalis metabolizuje malát prostřednictvím specifického enzymu NAD. U E. faecalis je glukonát fosforylován na 6-phosphoglukonát, poté následuje jeho disimilace na laktát a CO2. V prostředí, které je dosyceno oxidem glycerolu, produkuje E.

faecalis

zejména

kyselinu

octovou

a

CO2

se

stopovým

množstvím

acetylmethylcarbinolu. E. faecium může oxidovat glycerol na kyselinu octovou, CO2 a malé množství peroxidu vodíku (De Vos a kol., 2009).

17

4.4 Buněčná stěna Buněčná stěna enterokoků se barví grampozitivně. Jako grampozitivní bakterie označujeme ty bakterie, jejichž mrtvé buňky po obarvení Gramovým barvícím roztokem a moření jodovým roztokem toto barvivo neztrácejí, takže zůstanou zabarvené krystalovou violetí (Sedláček, 2006). To, že neztrácejí toto barvivo, je způsobeno působením rozpouštědel a to hlavně acetonu, nebo ethanolu (Šilhánková, 2002). Gramovo barvení se používá při určování rodu bakterií, nebo při diagnostice bakterií. Grampozitivní bakterie mají mnoho společných fyziologických vlastností. Mezi tyto vlastnosti patří např. citlivost k některým antibiotikům, jedovatým barvivům, nebo aniontovým povrchově aktivním látkám. Všechny tyto vlastnosti jsou dány rozdíly složení buněčných stěn grampozitivních a gramnegativních bakterií. (Šilhánková, 2002). Hlavní složkou buněčné stěny enterokoků je silná vrstva peptidogklykanu, která přiléhá na cytoplasmatickou membránu. Přes tuto vrstvu pronikají na povrch lineární řetězce teichoových kyselin (Hudecová, Majtán, 2002). Mezi hlavní složky jejich buněčné stěny kromě teichoové kyseliny dále patří: peptidoglykan a polysacharidy. Kromě těchto složek obsahují také povrchové a zanořené proteiny. Teichoová kyselina je vázána kovalentní vazbou a představuje až 50 % sušiny buněčné stěny. Polysacharidy buněčné stěny grampozitivních bakterií jsou složeny z glukósy, mannósy, galaktósy a některých dalších monosacharidů (Šilhánková, 2002). Buněčná stěna je tvořená z peptidoglykanů. Typ lysin D-asparagin je popsán u rodu E. avium, E. casseliflavus, E. dispar, E. durans, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium a E. raffiosus kromě E. faecalis který má buněčnou stěnu tvořenou typem lysin-alanin (De Vos a kol., 2009).

4.5 Pohybové ústrojí Některé druhy rodu Enterococcus mohou být pohyblivé (De Vos a kol., 2009). Pohybují se za pomoci malých nevýrazných bičíků (Sedláček, 2006). Mezi tyto druhy patří např. E. casseliflavus a E. gallinarum (Schleifer, 1984).

18

4.6 Antigenní vlastnosti Enterokoky jsou dle Lancefieldové řazeny do sérologické skupiny D. Tento antigen je považován za typický znak rodu Enterococcus, ale ne všechny druhy ho mají. Jeho výskyt nebyl popsán u několika nových druhů (De Vos a kol., 2009). Na druhou stranu se může antigen D vyskytovat u několika druhů streptokoků, např. u Streptococcus bovis, Streptococcus suis, Streptococcus alactolyticus a u některých leukonostoků a pediokoků. Antigen D se u enterokoků nachází mezi buněčnou stěnou a buněčnou membránou. Tento antigen je tvořen polymerem kyseliny teichoové, která je na glycerol-fosfátovou kostru polymeru navázaná esterovou vazbou. Lipidová složka je tvořena l-kojibiosyl diglyceridem (De Vos a kol., 2009).

4.7 Chromozomy Chromozomy enterokoků představují jednu kruhovou DNA o různé velikosti. Pro E. faecalis se pohybuje v rozmezí od 3000 do 3250 kb, pro E. faecium 2550-2995 kb, pro E. avium 3445 kb a pro E. durans 3070 kb. Úplná sekvence genomu je k dispozici u kmene E. faecalis V583 a u kmene E. faecium. Genom E. faecalis se skládá z jednoho chromozomu a ze třech plastidů. Velikost chromozomu je 3 218 013 bp. Bylo detekováno celkem 3 182 genů kódujících proteiny o střední velikosti 889 bp. Mezi nimi bylo 1760 genů známých jako proteinové geny. Celkem bylo nalezeno 519 bílkovin, které jsou zachovány v malém množství u G + C grampozitivních bakterií. Jsou zde, aby se zapojily do transkripčního překladu a syntézy bílkovin (De Vos a kol., 2009).

4.8 Plasmidy Plasmidy jsou mobilní elementy odpovědné za vysokou rychlost, se kterou enterokoky získávají a dále distribuují geny. Dále zajišťují jejich antibiotickou nebo UV rezistenci. Byly popsány 3 druhy plasmidů: RCR (rolling circle replicating) plasmidy, Inc18 plasmidy a feromonové plasmidy (pheromone-responding). Inc18 plasmidy mohou být replikovány u mnoha jiných grampozitivních bakterií, jejich velikost se pohybuje v rozmezí od 25 kb do 30 kb. Feromonové plasmidy jsou typické pro E. faecalis (De Vos a kol., 2009).

19

4.9 Transpozony Kromě plasmidů, bylo u enterokoků izolováno široké rozmezí transpozonů.. Existuje několik druhů transpozonů. Obecně jsou uznávány transpozony typu Tn3, kompozitní transpozony, složené a konjugativní transpozony. Mezi typické členy Tn3 skupiny patří Tn917 a Tn1546. Tn917 nese geny pro rezistenci vůči makrolidům, linkosamidům a streptograminu. Tn1546 nese geny pro rezistenci k vancomycinu. Konjugativní transpozony nesou rezistenci proti nejméně jednomu antibiotiku a odhalují široký rozsah hostitelů. Tyto transpozony se začlení do DNA hostitelské buňky pomocí konjugace (De Vos a kol., 2009).

4.10 Tvorba biofirmu Klinické izoláty některých enterokoků mají schopnost vytvářet biofilm na inertním povrchu, za současné produkce slizu. Tato vlastnost se běžně vyskytuje u E. faecalis. Také izoláty E. faecium byly schopné vytvořit biofilm, ale v menší míře. Tvorba biofirmu je stále častěji spojována z infekcí v organismu, protože se častěji vyskytuje u kmenů izolovaných z infekcí, než u izolátů od zdravých jedinců. Tvorba biofilmu je výrazně ovlivněna přítomností dalšího zdroje sacharidů v médiu, nebo deprivací železa, což ukazuje na úlohu slizu pro přežití v náročných podmínkách (Baldassarri a kol., 2001).

5 FYLOGENETICKÉ ČLENĚNÍ RODU ENTEROCOCCUS Podle fylogenetické analýzy 16S rRNA v souladu s upraveným plánem jsou rody Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus a Vagococcus zařazeni do nové čeledi Enterococcaceae,

na

základě

velké

podobnosti

Lactobacillales (De Vos a kol., 2009).

Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Enterococcaceae 20

tohoto

genu,

v rámci

řádu

6 CHARAKTERISTIKA

JEDNOTLIVÝCH

DRUHŮ

RODU

ENTEROCOCCUS 6.1 Enterococcus aquimarinus Enterococcus aquimarinus byl izolován z mořské vody. Díky tomu získal také svůj název aqua – voda, marinus – z moře (De Vos a kol., 2009). Jeho buňky jsou protáhlé, často kopinaté. Vyskytují se jednotlivě, nebo v malých skupinkách, převážně ale v párech (Švec a kol., 2005). Tento kmen má široké rozmezí teplot, při kterých roste. Roste při 25°C – 42°C. Roste v přítomnosti 6,5 % NaCl. Přidávání 5 % CO2 nezpůsobuje posílení růstu. Buňky jsou nepohyblivé. Dávají pozitivní výsledky u testů na pyrrolidonyl arylamydázu a alfaa beta- galaktosidázu (Švec a kol., 2005). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje slabý růst. Obsah G + C v DNA je 38,7 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.2 Enterococcus asini Tyto koky byly izolovány během vyšetřování bakteriální flóry slepého střeva u oslů. Druh Enterococcus asini je grampozitivní. Buňky mají oválný tvar, tvoří páry, nebo krátké řetězce. Nevytváří spory a nejsou pohyblivé. Optimální růst je při teplotě 38°C až 40°C. V roztoku 6,5 % NaCl se nevytváří. Slabý růst byl zaznamenán při teplotách 10°C a 45°C (De Vaux a kol., 1998). Jeho nejbližší příbuzný je Enterococcus avium a Enterococcus faecium. Sekvenční podobnost s těmito druhy je 97,4 %. Tyto druhy lze od sebe odlišit na základě fenotypových vlastností (De Vaux a kol., 1998). Obsah G + C v DNA je 39,4 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.3 Enterococcus avium Enterococcus avium byl izolován od ptáků, od lidí, nebo z potravy (De Vos a kol., 2009). Může být izolován i z kuřecích výkalů (Collins a kol., 1984). Tento druh se liší od E. faecalis a E. faecium zejména svým charakteristickým původem ze střev drůbeže a s výskytem i v lidských a zvířecích výkalech (Görner a Valík, 2004). Tvar těchto buněk je vejčitý, protáhlý, tvoří řetězce. Tento druh spolu s E. malodoratus jsou jediné známé druhy rodu Enterococcus, které produkují H2S. 21

E. avium dobře roste při 45°C a přežívá i záhřev na 60°C (Collins a kol., 1984). Jeho buňky jsou α-hemolytické. Obsah G + C v DNA 39,0-40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.4 Enterococcus caccae Enterococcus caccae byl izolován z lidské stolice v USA v roce 2000. Díky tomu získal své druhové jméno, které je odvozeno od původců jeho izolace (kakke - feces). Buňky E. Caccae neobsahují pigment (Maria da Glória S. Carvalho a kol., 2006). Rostou při 45°C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Při 37°C tvoří na krevním agaru s ovčí krví malé kolonie do průměru 0,5 mm (De Vos a kol., 2009). Nevytváří plyn. Jsou alfa hemolytické (Maria da Glória S. Carvalho a kol., 2006). Obsah G + C v DNA je 32,5 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.5 Enterococcus camelliae Tento druh byl izolován v Thajsku z fermentovaných čajových lístků rostliny Camellia sinensis, od toho je také odvozeno jeho druhové jméno (De Vos a kol., 2009). Buňky E. camelliae jsou pohyblivé a nevytváří spory. Mají kulovitý, nebo ováný tvar bez tvorby pigmentu. Rostou při teplotách 15 – 45°C a 2 – 6 % obsahu NaCl (Sukontasing a kol., 2007). Dále při pH v rozmezí 5-9 (De Vos a kol., 2009). Úzce souvisí s druhem Enterococcus italicus, protože mají velmi podobnou DNA (Sukontasing a kol., 2007). Obsah G + C V DNA je 37,8 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.6 Enterococcus canintestini Enterococcus canintestini byl izolován ze vzorku stolice zdravých psů (De Vos a kol., 2009). Je tvořen nepohyblivými buňkami, které jsou seskupeny převážně do malých skupin. Ne krevním agaru tvoří kruhové, hladké kolonie, které mají mléčnou barvu. Na agaru Slanetz-Bartley tvoří kolonie červené (Naser a kol., 2005). Buňky rodu E. canintestini rostou pomalu při 25°C. Lépe rostou při 30°C a jejich optimální růst je při 37 – 42°C. Rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl (Naser a kol., 2005). Obsah G + C je 36,0 až 37,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

22

6.7 Enterococcus canis Tento druh byl izolován z análních výtěrů psů, kteří měli chronickou otitidu. Jeho buňky jsou mírně prodloužené koky, které se vyskytují v párech, nebo v malých skupinkách (De Graef a kol., 2003). Buňky optimálně rostou při 37°C, pomaleji při 42°C a jsou schopny růstu i v 6,5 % NaCl. Nerostou při 25°C (De Graef a kol., 2003). Na agaru Slanetz-Bartley se vytvoří po 48 hodinách bez redukce tetrazolia drobné kolonie. Obsah G + C je v rozmezí 41,7-43,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.8 Enterococcus casseliflavus Tento druh byl izolován z rostlin, siláže či z půdy (Collins a kol., 1984). V roce 1993 byl popsán také jejich výskyt v povrchových vodách (Švec a kol., 2001). Buňky tohoto rodu jsou pohyblivé, obvykle se vyskytují ve dvojicích (Collins a kol., 1984). Přežívají záhřev na 60°C po dobu 30 minut (De Vos a kol., 2009). Na krevním, nebo živném agaru tento druh vytváří jasně žluté kolonie, odtud dostal také svůj název (casseliflavus – žlutě zbarvený) (Collins a kol., 1984). Na druhou stranu byl hlášen i výskyt nepohyblivých a nepigmentovaných kmenů, které byly izolovány z lidského klinického materiálu. Obsah G + C v DNA je 40,5-44,9 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.9 Enterococcus cecorum Vyskytují se v párech, nebo v krátkých řetízcích, nebo v malých skupinkách. V rámci řetězců jsou buňky uspořádány v párech (Devriese a kol., 1983). Buňky E. cecorum nerostou při 10°C. Růst je pomalejší a méně častý za přístupu vzduchu. Buňky nerostou v přítomnosti 6,5 % NaCl. Dobře rostou při 45°C. Při pH 9,6 je růst pomalejší než růst při pH 7,0 (Devriese a kol., 1983). Buňky nepřežívají teplotu 60°C po dobu 30 minut (De Vos a kol., 2009). Tento druh při svém růstu preferuje zvýšený obsah CO2 v atmosféře. Obsah G + C v DNA je 37,0-38,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

23

6.10 Enterococcus columbae Tento druh grampozitivních koků byl izolován ze střevní flóry domestikovaných holubů (Devriese a kol., 1990). Díky tomu získal také své druhové jméno columbae – holubice (De Vos a kol., 2009). Tento rod je nejvíce příbuzný rodu Enteroccocus cecorum. Buňky nerostou při 10°C a v médiu s obsahem 6,5 % NaCl (De Vaux, 1998). Tento druh preferuje zvýšený obsah CO2 ve vzduchu. Růst na médiu Slanetz-Bartley je negativní. Naopak roste na agaru žlučových eskulin s obsahem 3-10 % CO2 ve vzduchu, ale v normální atmosféře bez CO2 neroste. Obsah G + C v DNA je 38,2 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.11 Enterococcus devriesei Enterococcus devriesei byl pojmenován na počest významného belgického taxonoma Dr. Luc A. Devriese (De Vos a kol., 2009). E. devriesei byl izolován ze skotu, vakuově baleného dřevěného uhlí a ze vzduchu v drůbežárnách (De Vos a kol., 2009). Buňky rodu E. devriesei dobře rostou při 10 – 35°C. Nerostou při teplotách vyšších než 42°C, nebo při teplotách menších než 2°C. Buňky rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl. Na krevním agaru tvoří bílé až světle šedé kolonie (Švec a kol., 2005). Na krevním agaru skotu vytváří α-hemolýzu. Dále vykazuje pozitivní růst na azidu obsahující selektivní média a na agaru žlučových eskulin. Obsah G + C v DNA je 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.12 Enterococcus dispar Enterococcus dispar původně popsal Collins a kol. v roce 1991 na základě dvou izolátů (Naser a kol., 2005). Jeden byl izolován ze synoviální tekutiny člověka, takže z klinického materiálu a druhý ze stolice psa (De Vos a kol., 2009). Buňky přežívají ohřev na 60°C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA je 39,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

24

6.13 Enterococcus durans Tento druh byl izolován z mléka, mléčných výrobků a ze sušeného mléka. Buňky jsou protáhlé ve směru řetězce, vyskytuje se ve dvojicích nebo v krátkých řetězcích. Nerostou při teplotách nad 50°C (Collins a kol., 1984). Facklam a Collins v roce 1989 izolovali E. durans vykazující pozitivní výsledky na melibiosu z lidského klinického materiálu. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 38,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.14 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis byl izolován z výkalů člověka, teplokrevných a studenokrevných živočichů (Schleifer a kol., 1984). Odtud je také odvozeno jeho druhové jméno feacesvýkaly. Dále se vyskytuje v hmyzu a na rostlinách. Výskyt E. faecalis je častý i v nesterilizovaných, zejména solených potravinách bez souvislosti s jejich fekální kontaminací. Buňky tohoto rodu jsou vejcovitého tvaru prodloužené ve směru jejich dělení. Jejich průměr se pohybuje v rozmezí od 0,5 až 1,0 µm. Jsou uspořádány v páru a v krátkých řetězcích. Z pravidla jsou nepohyblivé. Dle Lancefieldové odpovídají sérologické skupině D (Görner a Valík, 2004). Na polotuhých živných půdách tvoří kruhové, hladké, smetanové až bílé povrchové kolonie. Na médiu Slanetz-Bartley vytváří kolonie, které mají průměr od 1 do 2 mm. Jsou zpravidla kruhové, hladké a lesklé, hnědočervené až růžové barvy. Půda okolí kolonií je zabarvená (Görner a Valík, 2004). Většinou jsou nehemolytické, vzácně však tvoří β – hemolýzu. Rostou při 10 – 45°C, ale přežívají i záhřev na teplotu 60°C po dobu 30 minut (Schleifer a kol., 1984). Což je významně podmíněné hodnotou pH prostředí a věkem buněk. Optimální teplota růstu je 37°C (Görner a Valík, 2004). Buňky rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl a při pH 9,6 (Schleifer a kol., 1984). Buňky E. faecalis fermentují glukózu za tvorby zvláště kyseliny mléčné. Pokud se živné médium při fermentaci neutralizuje, vytvoří se větší množství kyseliny mravenčí, octové a etanolu (Görner a Valík, 2004). Jako zdroj energie využívá E. faecalis pyruvát, citrát, malát, nebo serin. Využití těchto tří látek je spojeno s metabolismem. Dále mohou jako zdroj energie využívat také arginin (Schleifer a kol., 1984).

25

E. faecalis rychle redukuje 2,3,5-trifenyl-terazolium-chlorid na hnědočervený bifenyl formazan. Lakmusové mléko redukuje dříve, než vznikne sraženina. Dále pak peptonizuje kasein a želatinu a aminokyselinu tyrosin dekarboxyluje na biogenní amin tyramin. Přenosné plazmidy regulují odolnost E. faecalis vůči antibiotikům (Görner a Valík, 2004). Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37 do 40 mol % (De Vos a kol., 2009).

Obrázek 2: Enterococcus faecalis (dostupné na: http://www.symbinatur.com/Mikrobiologicka-terapie-lecebna-cast-Enterococcusfaecalis-lekar-online-72_51.html)

6.15 Enterococcus faecium Enterococcus faecium byl obdobně jako E. faecalis izolován z výkalů člověka, nebo z výkalů teplokrevných živočichů (Schleifer a kol., 1984). Jako první izolát se udává sušené mléko, nachází se i v mléku a v mléčných produktech. I vlastnosti E. faecalis a E. faecium jsou většinou podobné (Görner a Valík, 2004). Glukózové živné médium okyseluje na hodnotu pH od 4,4 do 4,0. Lakmusové mléko redukuje před jeho sražením, sraženinu vytváří za 5 až 7 dní, 2,3,5-trifenylterazolium-chlorid redukuje ne světle růžovou, nebo ji neredukuje. Na médiu SlanetzBartley tvoří světle růžové až bílé kolonie. Želatinu a kasein nepeptonizuje (Görner a Valík, 2004).

26

Některé kmeny tohoto rodu mohou na krevním agaru vytvářet α – hemolýzu. Buňky jsou vejcovitého tvaru a vyskytují se hlavně ve dvojicích, nebo v krátkých řetězcích. Některé kmeny jsou pohyblivé (Schleifer a kol., 1984). Původně byl tento druh popsán jako rafinosa a sorbitol acidifikace negativní, ale kmeny které byly izolovány ze psů, nebo od lidí jsou sorbitol pozitivní (De Vos a kol., 2009). Rozmezí teplot, při kterých rostou kmeny E. faecium je 10 – 50°C. Přežívají ale i záhřev na 60°C po dobu 30 minut, rostou i v 6,5 % roztoku NaCl, nebo při pH 9,6 (Schleifer a kol., 1984). Obsah G + C se pohybuje v rozmezí od 37,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

Obrázek 3: Enterococcus faecium (dostupné na: http://www.ciriscience.org/ph_119Enterococcus_faecium_Copyright_Dennis_Kunkel_Microscopy).

6.16 Enterococcus gallinarum Druh Enterococcus gallinarum byl izolován ze střev domácích slepic a jiné domestikované drůbeže (Collins a kol., 1984). Díky tomu získal tento druh také svůj název. Gallinarum znamená z latinského překladu kuřata. Buňky E. gallinarum se většinou vyskytují v párech, nebo v krátkých řetízcích a jsou pohyblivé (Bridge a kol., 1982). Kolonie na krevním agaru jsou kruhové a hladké. Na médiu, které obsahuje koňskou krev, vykazuje tento druh β – hemolýzu (Collins a kol., 1984). E. gallinarum tvoří nejspíše kyselinu ze škrobu (Görner a Valík, 2004).

27

Většina kmenů nepřežívá teplotu 60°C po dobu 30 minut, ale přežívá záhřev na teplotu 60°C po dobu 15 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.17 Enterococcus gilvus Tento druh byl izolován z lidských klinických vzorků, přesněji ze žluče pacienta, který trpěl cholecystitidou (zánětem žlučníku) (Tyrrell a kol., 2002). Buňky E. gilvus tvoří světle žlutý pigment. Obsah G + C u tohoto druhu není dosud stanovena (De Vos a kol., 2009).

6.18 Enterococcus haemoperoxidus Enterococcus haemoperoxidus byl izolován z povrchové vody. Název je spojen ze tří slov, haema jako krev, per jako intenzivní a oxys jako kyselý. Je odvozený od schopnosti tohoto druhu při kultivaci na krevním agaru rozkládat peroxid vodíku na kyslík a vodu (De Vos a kol., 2009). To se projevuje jako pozitivní výsledek katalázového testu. Buňky pěstované na médiu bez krve mají katalázu negativní (Švec a kol., 2001). Buňky jsou oválného tvaru, vyskytují se v párech, krátkých řetězcích, nebo v malých skupinách. Nejsou pohyblivé. Na krevním agaru produkují buňky slabě nažloutlý pigment (Švec a kol., 2001). Růst silně inhibují teploty nad 42°C. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,3 do 35,5 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.19 Enterococcus hermanniensis Tento druh byl izolován ze vzorků psích mandlí. Dále byl izolován z marinovaného masa brojlerů, kteří byli baleni v ochranné atmosféře (Koort a kol., 2004). Název tohoto rodu je odvozen od lokality Hermanni, kterou najdeme v Helsinkách ve Finsku (De Vos a kol., 2009). Buňky tohoto rodu jsou kulovité koky rostoucí v páru. Rostou na médiu, které obsahuje hovězí krev, kde pak vytváří α – hemolýzu. Optimální teplota pro růst buněk E. hermanniensis je 10 – 37°C. Buňky nerostou při teplotě 45°C. Všechny kmeny dobře rostou v přítomnosti 2 % nebo 4 % NaCl. Některé kmeny rostou i v přítomnosti 6,5 % 28

NaCl, ale žádný kmen neroste při 10 % koncentraci NaCl (Koort a kol., 2004). Obsah G + C v DNA je 36,6-37,1 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.20 Enterococcus hirae Enterococcus hirae byl izolován ze střev prasat a kuřat. Buňky jsou vejčité a vyskytují se většinou v párech, nebo v krátkých řetězcích. Buňky rostou při teplotě od 10 do 45°C. Rostou i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při pH 9,6 (Farrow a kol., 1985). Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37,0-38,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.21 Enterococcus italicus Druh Enterococcus italicus byl izolován ze syrového kravského mléka požívaného při výrobě Italských sýrů (Naser a kol., 2006). Poprvé byl v mléčných výrobcích izolován v Piemontu v Itálii. Díky tomu také získal své druhové jméno italicus (Fortina a kol., 2004). Růst buněk je optimální při teplotě 37°C. Naopak při 10°C téměř nerostou. Schopnost růstu buněk E. italicus při 45°C je u jednotlivých kmenů různá. Závisí na obsahu 5 % CO2 v atmosféře (Fortina a kol., 2004). Obsah 5 % CO2 totiž podporuje růst buněk. Kmeny rostou i při pH 9,6 a přítomnosti 5 % NaCl. Některé kmeny rostou i při koncentraci 6 % NaCl, ale nerostou při 6,5 % obsahu NaCl (De Vos a kol., 2009). Na krevním agaru tvoří α – hemolýzu. Kmeny jsou schopny růstu v sušeném odstředěném mléku, kde způsobují srážení do 48 hodin. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39,9 do 41,1 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.22 Enterococcus malodoratus Tento druh byl izolován ze sýru Gouda. Spolu s Enterococcus avium jsou dva jediné druhy rodu Enterococcus, které produkují H2S.

Svůj druhový název získal podle

zápachu, který buňky vytvářejí, z anglického malodorous - zapáchající. Buňky se vyskytují většinou v párech či v krátkých řetězcích. Některé kmeny mohou vytvářet slizy (Collins a kol., 1984).

29

Buňky tohoto rodu nerostou při 45°C a nepřežívají teplotu 60°C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 40,0 do 41,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.23 Enterococcus moraviensis Enterococcus moraviensis byl izolován z povrchových vod během rutinní analýzy kvality vody. Všechny kmeny byly izolovány z různých míst v regionu severní Moravy. Odtud vznikl druhový název E. moraviensis (Švec a kol., 2001). Růst je silně inhibován při 42°C. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,6 do 36,3 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.24 Enterococcus mundtii Enterococcus mundtii byl izolován od krav, z rukou dojnic, z rostlin i z půdy. Tento druh je pojmenován po americkém mikrobiologovi J. O. Mundtovi, který ho studoval (Collins a kol., 1986). Buňky jsou vejčitého tvaru. Vyskytují se většinou v párech, nebo v krátkých řetězcích a produkují žlutý pigment. Rostou při 10 – 45°C (Collins a kol., 1986). Rostou i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při pH 9,6. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 38,0 do 39,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.25 Enterococcus pallens Enterococcus pallens byl izolován z klinických lidských vzorků. Přesněji byl izolován ze žluče pacienta, který trpěl peritonitidou (Tyrrell a kol., 2002). Tyto grampozitivní, nesporotvorné bakterie vytvářejí světle žlutý pigment. Obsah G + C dosud nebyl stanoven (De Vos a kol., 2009).

6.26 Enterococcus phoeniculicola Tento druh byl izolován z uropygiální žlázy dudkovce stromového (Phoeniculus purpureus). Od toho je také odvozeno jeho druhové jméno (De Vos a kol., 2009).

30

Studie prokázaly, že přítomnost bakterií Enterococcus phoeniculicola v sekretu této žlázy ovlivňuje jeho barvu i zápach (Law-Brown a kol., 2003). Buňky tohoto rodu nejsou schopny růstu v přítomnosti 6 % NaCl. Nerostou ani v přítomnosti 40 % žluči. Optimální teplota růstu je 30 – 37°C a pH 8. Na živném agaru buňky vytvářejí kruhové, šedavé, nebo nazelenalé kolonie. Obsah G + C nebyl dosud stanoven (De Vos a kol., 2009).

6.27 Enterococcus pseudoavium Enterococcus pseudoavium byl izolován ze vzorku od mastitidních krav (Collins a kol., 1989). Obsah G + C v DNA je 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.28 Enterococcus raffinosus Enterococcus raffinosus byl izolován ze vzorků klinického původu (Collins a kol., 1989). Jen vzácně je tento druh izolován z živočišných zdrojů. Buňky dokážou utilizovat rafinosu, díky tomu získal i své druhové jméno. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39 do 40 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.29 Enterococcus ratti Enterococcus ratti byl izolován ze střev a z výkalů potkanů, kteří trpěli průjmem. Buňky rostou v rozmezí teplot 10 – 45°C. Rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl (Teixeira a kol., 2001). Nejsou pohyblivé a na agaru s beraní krví mohou být jak α – hemolytické tak i nehemolytické (De Vos a kol., 2009).

6.30 Enterococcus saccharolyticus Tento druh byl izolován ze slaměné podestýlky a od krav. Tento druh je schopen utilizovat sacharózu (Rodrigues a kol., 1990). Buňky nepřežívají záhřev na teplotu 60°C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37,6 do 38,3 mol % (De Vos a kol., 2009).

31

6.31 Enterococcus silesiacus Enterococcus silesiacus byl izolován z povrchových vod. Všechny kmeny byly izolovány z různých míst v regionu Slezska. Odtud vznikl jeho druhový název E. silesiacus (De Vos a kol., 2009). Tyto grampozitivní koky se vyskytují ve dvojicích, krátkých řetězcích či v malých skupinách. Na agaru s obsahem ovčí krve tvoří lesklé, kulaté a hladké kolonie. Jsou nepohyblivé (Švec a kol., 2006). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje slabý růst a vytváří malé tmavě červené kolonie (De Vos a kol., 2009). Optimální teplota růstu je 10°C, naopak neroste při 45°C. Růst je slabý i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při pH 9,6. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,6 do 36,7 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.32 Enterococcus sulfureus Tento druh byl izolován z rostlin, pomocí reverzní transkriptázy. Buňky tohoto rodu tvoří žlutý pigment. Díky tomu získal také své druhové jméno (sulphur – jako žlutá síra) (Martinez-Murcia a kol., 1991). Buňky rostou při 40°C, ale při 45°C už nerostou. Obsah G + C v DNA je 38,0 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.33 Enterococcus termitis Tento druh byl izolován ze střev termitů (De Vos a kol., 2009). Díky tomu získal své druhové jméno termitis. Buňky jsou oválné koky vyskytující se ve dvojicích, krátkých řetězcích či v malých skupinách. Jsou nepohyblivé. Buňky rostou při pH 9,6 i za přítomnosti 6,5 % NaCl. E. termitis roste v rozmezí teplot 10 – 45°C. Na médiu s krví či bez krve je kataláza negativní (Švec a kol., 2006). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje pomalý růst a vytváří malé tmavě červené kolonie. Obsah G + C v DNA je 37,1 mol % (De Vos a kol., 2009).

6.34 Enterococcus villorum Enterococcus villorum byl izolován ze střev selat a prasat, která trpěla průjmovými onemocněními. Druhové jméno je odvozeno od slova villus, což je termín pro označení drsných vlasových klků, které se pro srážení struktur vytvoří v tenkém střevě (De Vos a kol., 2009). 32

Všechny kmeny jsou α-hemolytické (Vancanneyt a kol., 2001). Na agaru SlanetzBartley vytváří růžové kolonie. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,1 do 35,3 mol % (De Vos a kol., 2009).

7 VÝSKYT RODU ENTEROCOCCUS Bakterie tohoto rodu jsou ubikvitárně rozšířené. Jsou obyvateli střevního systému člověka a zvířat (Klaban, 1999). Enterokoky mohou být izolovány z půdy, z rostlin, z hmyzu, z divokých zvířat anebo z vody (Švec a kol., 2001). Rod Enterococcus získal své pojmenování díky svému původnímu stanovišti: střeva lidí a zvířat. V novějším systematickém rozdělení těchto bakterií se uvádí taxony, které jsou považované za samostatné druhy a to jsou Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Jejich původním stanovištěm je střevo lidí a některých zvířat. Enterococcus avium a Enterococcus gallinarum jejichž původním stanovištěm jsou zejména střeva drůbeže (Görner a Valík, 2004). Enterokoky jsou také součástí střevní mikroflóry ptáků a jiných zvířat. Některé druhy jsou spojeny s rostlinami, nebo byly izolovány z vody (De Vos a kol., 2009).

7.1 Výskyt enterokoků v rostlinách Enterokoky jsou velmi odolné vůči nepříznivým podmínkám prostředí, proto jsou rozšířené i v přírodě. Často se vyskytují na rostlinách a ve velkém množství i v silážových krmivech (Görner a Valík, 2004). Z rostlin byly izolovány druhy E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. mundtii, E. casseliflavus a E. sulfureus. Tyto druhy jsou obecně častěji izolovány z květů, než z pupenů, nebo listů. Z tohoto můžeme odvodit, že se hmyz podílí na šíření enterokoků. Ačkoliv jsou tyto bakterie považovány pouze za dočasnou součást mikroflóry rostlin, v dobrých podmínkách se mohou šířit i na jejich povrchu (De Vos a kol., 2009) Valenzuela a kol., v roce 2011 prováděl výzkum výskytu bakterií rodu Enterococcus v divokých květinách na jihu Španělska. Zkoumali v nich výskyt rodu E. faecalis a E. faecium. Izolovalo se na čtyřicet šest vzorků z osmi různých druhů rostlin, ve kterých byly tyto dva rody identifikovány. E. fecalis se vyskytoval u 28 izolátů a E. faecium u 18 izolátů. Většina izolátů byla proteolytických (Valenzuela a kol., 2011). Dále pak 33

byly z rostlin izolovány tyto druhy rodu Enterococcus: E. camelliae, E. casseliflavus, E. mundtii a E. sulfureus (Valenzuela a kol., 2011). Z rostlin byly také izolovány bakterie rodu Enterococcus, které produkují bakteriociny (De Vos a kol., 2009).

7.2 Výskyt enterokoků v živočiších Enterokoky se pravidelně izolují ze stolice, nebo z exkrementů zvířat (Klaban, 1999). U zvířat se vyskytuje mnoho enterokoků jako např. E. faecium, E. cecorum, E. faecalis, E. hirae a E. durans. E. gallinarum a E. avium se u zvířat vyskytuje spíše vzácně (De Vos a kol., 2009). Enterokoky lze nalézt také v ústním sekretu horních dýchacích cest, na kůži, nebo v pochvě (Varman, 2012). Některé bakterie rodu Enterococcus jsou často izolovány ze zvířat. E. termitis byl nalezen ve střevech termitů. Nedávno popsané E. canis a E. hermanniensis byly izolovány z krčních mandlí psů. E. canintestini byl izolován ze psích výkalů, E. phoeniculicola byl objeven u dudka chocholatého a E. devriesei z hovězího masa (De Vos a kol., 2009). Enterococcus faecalis je součástí normální střevní mikroflóry drůbeže a člověka (Diderot, 1999). Jsou součástí mikroflóry v tlustém střevě, ale lze je prokázat i v tenkém střevě (Klaban, 1999). E. faecalis se nejčastěji vyskytuje v konečníku, anebo také v krčních mandlí psů a koček (De Vos a kol., 2009). Baele a kolektiv v roce 2002 nalezli jako společné obyvatele holubích střev E. columbae spolu s E. cecorum (De Vos a kol., 2009). Mundt v roce 1963 a Mallon a kolektiv v roce 2002 objevili enterokoky ve výkalech volně žijících savců, plazů a ptáků. E. casseliflavus byl shledán jako běžný obyvatel ve střevě hlemýždě zahradního (De Vos a kol., 2009).

7.3 Výskyt enterokoků ve vodě Bakterie rodu Enterococcus se vyskytují také v pitné vodě (Görner a Valík, 2004). Zde jejich přítomnost poukazuje na nedávné fekální znečištění. To je dáno tím, že enterokoky ve vodě odumírají rychleji, jako všechny indikátorové bakterie z čeledi Enterobactericeae (Burdychová a Sládková, 2007). E. faecalis, E. faecium, E. durans a E. hirae jsou považovány za enterokoky fekálního původu nicméně tyto enterokoky můžeme nalézt také v povrchových vodách 34

(Švec a kol., 2001). Méně často se ve vodě nachází E. avium, E. gallinarum, E. cecorum a E. columbae (De Vos a kol., 2009). V některých státech se enterokoky sérologické skupiny D využívají jako indikátorové mikroorganismy při mikrobiologickém rozboru pitné vody (Görner a Valík, 2004). Niemi a kolektiv v roce 1993 popsal výskyt E. casseliflavus jako typický druh odpadních vod v lesním hospodářství ve Finsku (Švec a kol., 2001).

7.4 Výskyt enterokoků v půdě Půda není pravděpodobně přirozeným prostředím pro enterokoky (Švec a kol., 2001). Půda může být kontaminována enterokoky jejich přenosem ze zvířat, z rostlin anebo díky větru či dešti (De Vos a kol., 2009). Medrek a Lidsky se v roce 1960 zabývali izolací enterokoků z půdy, která nebyla hospodářsky obdělávána. Izolovali pouze 8 enterokoků z původních 369, které byly ovlivněny činností člověka (De Vos a kol., 2009).

7.5 Výskyt enterokoků v potravinách Bakterie rodu Enterococcus jsou běžnou součástí mnoha druhů potravin. Zejména se vyskytují u potravin živočišného původu, jako jsou mléko, mléčné výrobky, maso a fermentované uzeniny (De Vos a kol., 2009). Výskyt enterokoků v potravinách nelze dávat do souvislosti s přímou kontaminací fekáliemi, protože se nacházejí nezávisle na fekální kontaminaci i v životním prostředí. Jejich výskyt v potravinách upozorňuje na nedostatečnou sanitaci nářadí a zařízení používaného v technologickém procesu. Dále poukazuje na možnosti množení enterokoků v potravinách s vyšším obsahem soli a sníženou aktivitou vody (Görner a Valík, 2004). Enterokoky jsou obecně považovány za sekundární kontaminanty potravin a často mohou hrát roli i ve znehodnocování potravin. Na druhou stranu některé druhy ovlivňují rozvoj zrání a aroma u některých druhů sýrů (De Vos a kol., 2009). V potravinách se také mohou vyskytovat enterokoky produkující bakteriociny. Tyto enterokoky byly izolovány z mléčných výrobků, fermentovaného masa a ze zeleniny (De Vos a kol., 2009).

35

7.5.1

Výskyt enterokoků v mléce a mlékárenských výrobcích

Obsah enterokoků v mléčných výrobcích závisí na počtu enterokoků na dojícím zařízení a na ostatním nářadí a zařízení používaném při prvním ošetření mléka. Dále pak na počtu enterokoků v syrovém mléce, na dekontaminaci mléka po pasterizaci, na množení enterokoků při průběhu technologických procesů zpracování mléka na mléčné produkty, na frekvenci a účinnosti sanitačních prostředků a na obsahu soli v mléčných produktech a i v jiných potravinách (Görner a Valík, 2004). Nejčastější druhy enterokoků kontaminující mléko a mléčné výrobky jsou E. faecalis a E. faecium (De Vos a kol., 2009). Enterokoky jsou stálou součástí fermentovaných potravin, které obsahují vyšší obsah soli. Mezi tyto výrobky patří sýry, bryndza, syrové zralé klobásy a šunky, fermentované ryby i rostlinné potraviny. Důvodem jejich přítomnosti v těchto potravinách je zvýšený obsah NaCl a s ním spojená snížená aktivita vody. Sýry typu ementál, které obsahovali málo enterokoků, měli málo výraznou chuť (Görner a Valík, 2004). Devriese a kolektiv zjistili, že v sýru, nebo v kombinaci sýru a masa převládá výskyt druhu Enterococcus faecium (De Vos a kol., 2009). Výskyt enterokoků může u tvrdých dlouho zrajících sýrů podporovat dodatečnou tvorbu ok, i když nevytvářejí plyn. Je to dáno tím, že enterokoky mohou být synergisty užitečné mikroflóry. Stimulace je pravděpodobně způsobena rychlou tvorbou štěpných produktů bílkovin proteolytickými kmeny, které jsou pak lehko přístupným zdrojem dusíku pro jiné bakterie mléčného kvašení (Görner a Valík, 2004). Druh Enterococcus faecalis když je obsažený ve velkém množství, tak způsobuje v sýrech ementálského typu tzv. „bílou hnilobu“ kde inhibuje tvorbu ok propionovými bakteriemi a také vznik typické chuti těchto sýrů. Tato bílá hniloba se projevovala na řezu sýru tvorbou bílých skvrn (Görner a Valík, 2004). Enterokoky se také vyskytují v sušeném mléce. Díky tomu, že jsou schopny růstu i při 45°C a jsou odolní vůči zvýšenému osmotickému tlaku (rostou i při 6,5 % NaCl). Přesněji v zahuštěném mléce ve vakuových odparkách, čili v mléce před sušením (Görner a Valík, 2004). V roce 1977 Kielwein dokázal, že mezi hlavními druhy enterokoků v kravských fekáliích a v syrovém mléce není žádná souvislost. V jeho pokusech se E. faecalis nacházel v syrovém mléce u 40 % izolátů, na strojích na dojení to bylo také 40 % a v sýrech 30 % izolátů. Z kravských výkalů ho však nevypěstoval. Usuzuje z toho, že 36

enterokoky které se nacházejí v syrovém mléce, nepocházejí z feces, ale právě z dojících strojů a v nich z krmiva. Výskyt enterokoků na dojících zařízeních může být způsoben nedostatečnou koncentrací či teplotou sanitačních roztoků (Görner a Valík, 2004). Díky tomu že enterokoky patří mezi termorezistentní bakterie, protože některé kmeny přežívají pasterační teploty, tak jsou součástí mikroflóry pasterovaného mléka. Nejvíce termorezistentní enterokok, který přežívá teploty 70°C po dobu 8,5 minuty je E. faecium (Görner a Valík, 2004).

7.5.2

Výskyt enterokoků v mase

Masné výrobky obsahují nejčastěji druhy E. faecium. Následují druhy E. faecalis, E. durans anebo E. hirae. U výrobků obsahujících krůtí maso byla zjištěna přítomnost druhu E. gallinarum. Druh E. hermanniensis byl izolován z masa brojlerů. Kirk a kolektiv v roce 1997 izolovali E. faecium a E. faecalis jako převažující druh z mražených kuřat (De Vos a kol., 2009).

7.5.3

Výskyt enterokoků u vodních živočichů

U korýšů byl zaznamenán častý výskyt E. faecalis (De Vos a kol., 2009).

7.5.4

Výskyt enterokoků v pivu

Bakterie rodu Enterococcus se mohou vyskytovat i v pivu. Do piva se tyto škodlivé mikroorganismy mohou dostat z vody, anebo se mohou dostat do kvasnic a z nich pak do piva. Kromě enterokoků lze zde nalézt zástupce rodů Lactococcus a Streptococcus. Abychom co nejvíce zabránili této kontaminaci, tak se musí mikrobiologická čistota vody řídit místními předpisy pro kvalitu pitné vody (Basařová a kol., 2010).

7.5.5

Výskyt enterokoků v obilninách

Enterokoky se mohou vyskytovat i v obilninách. Mikroflóra obilovin a obilných výrobků je pestrá a zahrnuje tak různé formy kvasinek a bakterií. Mezi ně řadíme bakterie kyseliny mléčné tvořící řetízky, nebo bakterie tvořící spory (Bacillus spp.), bakteriální patogeny, koliformní bakterie a bakterie rodu Enterococcus. Koliformní 37

bakterie a enterokoci jsou také ukazatelé nehygienické manipulace a špatných zpracovatelských podmínek, nebo možného fekálního znečištění (Heredia, Wesley, Garcia, 2009).

8 VÝZNAM RODU ENTEROCOCCUS 8.1 Význam enterokoků v potravinářském průmyslu Význam bakterií rodu Enterococcus v potravinářském průmyslu je na první pohled protichůdný. Využívá se jejich pozitivních biochemických vlastností. Enterokoky intenzivně fermentují sacharidy. U sýrů, bryndzy, fermentovaných ryb, fermentovaných klobás a šunek se podílí na jejich aroma a chuti. Na druhou stranu se řeší jejich souvislost s tvorbou biogenních aminů a v škrobovém prostředí se jim připisuje i jejich toxicita (Görner a Valík, 2004). Dále mohou v potravinářské mikrobiologii sloužit jako indikátorové mikroorganismy s ohledem na znečištění fekálního původu v případech, kdy koliformní bakterie byly zničeny působením vyšší teploty při technologickém zpracování (Komprda, 2003). Naopak v nefermentovaných potravinách poukazuje zvýšená přítomnost enterokoků na nedostatečný tepelný ohřev, nebo na kontaminaci z ploch, které nebyly dostatečně vyčištěné a dekontaminované (Görner a Valík, 2004).

8.1.1

Význam enterokoků v mléčných výrobcích

Skupina bakterií mléčného kvašení zahrnuje grampozitivní fakultativně anaerobní acidotolerantní nesporotvorné kokovité a tyčinkovité bakterie. Tyto bakterie mají podobné metabolické a fyziologické vlastnosti. Jejich hlavním produktem při fermentaci sacharidů je kyselina mléčná. Do této skupiny bakterií patří rody: Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconosto a Pediococcus (Brindza a kol., 2011). Zákysová mikroflóra i kontaminující enterokoky tvoří biogenní aminy v sýrech s mírně kyselým pH. Některé druhy bakterií, mezi které řadíme právě enterokoky si adaptativně zvyšují suboptimální pH prostředí dekarboxylací aminokyselin histidinu a fenylalaninu na histamin a tyramin což jsou tzv. „biogenní aminy“. Pokud se biogenní

38

aminy nahromadí v potravině v toxickém množství, mohou způsobit alimentární otravu (Jičínská a Havlová, 1995). Bakterie rodu Enterococcus jsou také významným indikátorem mikrobiologické jakosti sušeného mléka. Díky své termorezistenci a schopnosti růstu v prostředí s nízkou aktivitou vody se rozmnožuje v mléku před jeho sušením. Při sušení zahuštěného roztoku mléka horkým vzduchem se enterokoky nedevitalizují a jejich konečný počet v sušeném mléku závisí na důkladnosti čištění a dekontaminaci odparky, sušárenského zařízení a od času trvalého odpařování mléka. Jejich obsah je omezený ve sladkých, solených a okyselených pasterizovaných vaječných přípravcích (Görner a Valík, 2004). Některé kmeny E. faecalis se využívají v sýrařství při výrobě sýru typu Čedar a dalších druhů tvrdých sýrů, jako doplňková kultura ke zvýraznění chuti a aroma. Jsou také součástí mikroflóry používané při výrobě ovčích sýrů. Také E. faecium se uplatňuje při zrání sýrů čedarového typu (Klaban, 1999). Enterokoky také slouží jako vhodné indikátorové bakterie v termizovaných potravinových výrobcích (Görner a Valík, 2004). Některé druhy enterokoků mají navíc technologický význam, protože některé kmeny druhu Enterococcus faecium byly popsány jako probiotické (Burdychová a Sládková, 2007). Bakterie rodu Enterococcus mohou způsobit i zkázu potravin. E. faecium spolu s B. subtilis jako reziduální bakterie ve sterilizovaném kondenzovaném mléce, způsobily za 3 měsíce při 37°C jeho kyselou koagulaci. Když byly tyto organismy kultivované samostatně, tak mléko neokyselovaly, ale při společné kultivaci snížily pH mléka z 6,40 na 5,52 a mléko koagulovalo. Autoři z tohoto výsledku vydedukovali, že snížení hodnoty pH které bylo způsobené E. faecium bylo stimulované proteolytickou činností B. subtilis, a tím i tvorbou štěpných produktů bílkovin. Tyto bílkoviny sloužili E. faecium jako lehce využitelný zdroj dusíku (Görner a Valík, 2004).

8.1.2

Význam enterokoků v masných výrobcích

Enterokoky kolonizují čerstvé i upravené maso a výrobky z něho vyrobené (Giraffa, 2002). Enterokoky produkují bakteriociny, které jsou schopné potlačovat růst jiných, většinou patogenních druhů bakterií, např. listerií. Geny odpovědné za jejich výrobu jsou umístěny jak na chromozomu, tak na plasmidech. Několik bakteriocinů, zejména od E. faecalis a E. faecium bylo detailně popsáno. Obecně paří do třídy bakteriocinů II.

39

I z tohoto důvodu můžeme enterokoky považovat za ochranné mikroorganismy při procesu fermentace (De Vos a kol., 2009). Dále se enterokoky využívají u tradičních fermentovaných výrobků (např. u italských salámů). Při fermentaci nepůsobí enterokoky samostatně. Pracují spolu s jinými bakteriemi. Některé mají pozitivní vliv, některé negativní. Mezi tyto pomocné bakterie řadíme bakterie rodu Lactobacillus (pozitivní) a Stafylococcus (negativní) (Hugas, Garriga, Aymerich, 2003). Díky vlastnosti některých druhů přežívat teploty 68°C po dobu 30 minut (např. E. faecium) kontaminují enterokoky i tepelně upravené masné výrobky jako je třeba konzervované maso. Můžeme je také najít v polokonzervách např. v pasterizované šunce, v mražených, sušených, chemicky a radiačně ošetřených poživatinách (Görner a Valík, 2004). Při výrobě fermentovaných masných výrobků se nejvíce využívá kmenů Enterococcus faecium. Z masa však můžeme izolovat i jiné druhy, jako např. Enterococcus faecalis a Enterococcus hermanniensis (Hugas, Garriga, Aymerich, 2003). V roce 1997 byli jako převažující druhy izolovány z mražených kuřat E. faecium a E. faecalis (De Vos a kol., 2009).

8.2 Význam enterokoků v pitné vodě Enterokoky také indikují kontaminaci pitné vody. Využívá se jejich vlastnost, že pocházejí z lidského střeva a to, že ve vodě přežívají kratší čas než bakterie koliformní. Podle mikrobiologů, kteří se zabývají kvalitou vody, poukazuje přítomnost enterokoků na nedávné fekální znečištění (Görner a Valík, 2004). V roce 1982 Althaus a kol. izolovali z lidských fekálií hlavně Enterococcus faecalis, a z odpadových vod nejčastěji Enterococcus faecium a Enterococcus durans. Proto je důležité při stanovení enterokoků ve vodě přihlédnout také k materiálu, ve kterém byly stanovované (Görner a Valík, 2004).

8.3 Význam enterokoků pro organismus lidí a živočichů Co se týká choroboplodnosti, patří enterokoky mezi důležité podmíněné patogenní mikroorganismy (Klaban, 1999). Jsou to oportunistické patogeny, které mohou způsobit závažné infekce v různých částech těla a to zejména u lidí, kteří mají oslabený imunitní

40

systém (Baldassarri a kol., 2001). Řadíme je mezi typické etiologické agens (Málek a kol., 2001). Některé druhy rodu Enterococcus se uplatňují při zánětech močových cest, žlučových cest, nebo při zánětech v gynekologii a při pooperačních infekcích v břišní chirurgii (Klaban, 1999). Dále mohou způsobovat otravu krve (septikémie), zánět kostní dřeně (osteomyelitida), nebo zánět vnitřní výstelky srdce (endokarditida) u lidí, drůbeže a kachen (De Vos a kol., 2009). Enterokoky způsobují 5-15% všech případů endokarditid (Fraser, 2011). Jsou velmi agresivní a často mohou způsobit u lidí destrukci chlopně (Málek a kol., 2001). V lékařské mikrobiologii je právě Enterococcus faecalis spojován s infekcemi močových cest a infekcí chlopní srdce (Görner a Valík, 2004). Bakterie rodu Enterococcus se totiž nacházejí hlavně v močových cestách (Sedláček, 2004). Bylo zjištěno, že 80-90 % Enterococcus faecalis je izolováno z lidského klinického materiálu. 8-16 % z toho je izolováno z rodu Enterococcus faecium. E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. dispar, E. durans, E. gallinarum, E. gilvus, E. hirae, E. mundtii, E. pallens a E. raffinosus jsou izolovány jen zřídka (De Vos a kol., 2009). Enterokoky mohou vyvolávat různé typy infekcí. Nozokominální infekce močového traktu jsou podmíněny instrumentálními výkony, mezi které patří katetrizace, nebo endoskopie (Vrána, 2004). Dále mohou vyvolat sporadické infekce u lidí, anebo u různých druhů zvířat. Méně často se podílí na onemocnění dýchacích cest, žlučových cest, centrálního nervového systému, zánětu nitroočních tkání (endoftalmitida), infekční artritidy, nebo u popálenin. E .gallinarum, E. casseliflavus a E. mundtii byly nalezeny ve stolici lidí v roce 1998. Bakterie rodu Enterococcus jsou méně často izolovány z pochvy a z dutiny ústní. (De Vos a kol., 2009). Obvykle jsou přítomny v gastrointestinálním traktu a v přední části urey (Málek a kol., 2001). Enterococcus faecalis je převládající druh enterokoka, který kolonizuje lidský trávicí trakt, ale Enterococcus faecium může převládat u některých osob v závislosti na jejich věku, potravě nebo fyziologických podmínkách organismu (De Vos a kol., 2009). E. faecalis způsobuje většinu případů endokarditid (Fraser, 2011). Závažné infekce způsobené vancomycin rezistentní E. faecium se léčí pomocí antimikrobiální látky Synercidu (Varman, 2012). Bylo zjištěno, že jeden gram lidských výkalů obsahuje asi 102-107 buněk enterokoků. Přilnavost buněk enterokoků do lidských buněk a následné narušení 41

hostitelské tkáně je podporováno látkami agregace (povrchové sacharidy, cytolysin, proteásy, hyaluronidásy, lipásy aj.). U E. faecalis jsou tyto vlastnosti podrobně popsány, ale u E. faecium a ostatních druhů jsou méně známé (De Vos a kol., 2009).

8.4 Indikátorový význam termorezistentních bakterií Termorezistentní bakterie, mezi které řadíme některé příslušníky rodu Enterococcus, přežívají terminační a pasterizační teploty a časy (60°C po dobu 30 minut) a nerozmnožují se při nich. Hlavním zdrojem kontaminace těmito bakteriemi jsou půda, prach a nedokonale omyté a dekontaminované nářadí. Dále pak zařízení, která používáme při získávání a technologii zpracování potravin (Görner a Valík, 2004).

9 STANOVENÍ BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS Ačkoliv mají bakterie rodu Enterococcus široké nutriční požadavky, jejich růst na běžně používaných bakteriologických médiích je většinou hojný. Potřebují několik aminokyselin, vitamíny B a purinové a pyrimidinové báze. Kolonie, které tvoří, jsou vždy pravidelné a kruhové s hladkým povrchem. Mají až 5mm v průměru. Pro izolaci enterokoků bylo popsáno více než 60 druhů selektivních médií. Bohužel všechna média umožňují růst i některým jiným bakteriím a naopak růst mnoha druhů enterokoků je částečně nebo zcela tlumen (De Vos a kol., 2009). Dobře rostou na krevním agaru. Vytvářejí na něm šedobílé kolonie bez hemolýzy (Klaban, 1999). Nejčastěji používané médium pro izolaci a stanovení počtu enterokoků z různých vzorků obsahuje azid sodný jako selektivní činidlo (De Vos a kol., 2009). Některé druhy např. E. gilvus, E. pallens, E. casseliflavus a E. sulfureus produkují na agarových médiích žlutý karotenoid. U druhu E. casseliflavus byl nalezen neobvyklý C32 karotenoid (De Vos a kol., 2009).

42

Obrázek 3: Enterococcus faecalis na krevním agaru (dostupné na: http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Enterococcus_faecalis-krevni_agar.jpg)

9.1 Stanovení enterokoků plotnovou metodou Při tomto stanovení je možno použít jak roztěr na povrch selektivně diagnostické půdy, tak zalití do této půdy. (Komprda, 2003). Při posuzování obsahu enterokoků musíme přihlédnout k materiálu, ve kterém enterokoky stanovujeme (Burdychová a Sládková, 2007).

9.2 Biochemické stanovení Pro klasické biochemické stanovení kmenů patřících do rodu Enterococcus a jejich odlišení od dalších souvisejících rodů je dosaženo především prostřednictvím identifikace druhů. Identifikace enterokoků založená na základě biochemických testů je obtížná a často nespolehlivá Pro praktické účely se používá následující postup: kataláza negativní, grampozitivní koky dobře rostou na selektivních médiích, jsou schopné růstu v přítomnosti 6,5 % NaCl aj. Většinou pouze kolonie kmene Streptococcus bovis vykazují podobnou charakteristiku jako bakterie rodu Enterococcus na selektivních médiích. Rozdíl je však v tom, že tyto kmeny nerostou v přítomnosti 5 % NaCl (De Vos a kol., 2009).

43

10 REZISTENCE BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS Rezistentní kmeny rodu Enterococcus na vancomycin byly poprvé izolovány od pacientů v roce 1988 ve Spojeném království a Francii. Od té doby, se rezistentní kmeny rodu Enterococcus rozšířily do mnoha dalších zemí, včetně Malajsie. Rozšířili se např. v mase z hospodářských zvířat, nebo lidmi (Yean a kol., 2007). V roce 1989 byly poprvé vancomycin rezistentní enterokoky zaznamenány v New Yorku a následně se rozšířily po celých Spojených státech. Uvádí se, že v roce 2003 podíl nozokominálních infekcí způsobených enterokoky u pacientů na jednotce intenzivní péče vzrostl na více než 20 %, což odstavuje nárust o 12 % ve srovnání s léty 1998-2002. V Evropě nebezpečí této infekce není zdaleka tak velké. Vancomycin rezistentní enterokoky byly izolovány s různých hospodářských zvířat, kuřat, masných výrobků, odpadních vod aj (Fraser, 2011). Enterokoky

jsou

velmi

odolné

vůči

mnoha

β-laktamů,

fluorochinolony,

linkosamidům a nízké koncentraci aminoglykosidů. Vysoká je také jejich rezistence vůči antibiotikům a jiným látkám, jako je chloramfenikol, tetracyklin, makrolid, linkosamid, streptograminy, aminoglykosidy, betalaktamová antibiotika, chinoliny a glykopeptidy. Rezistence k antibiotikům je zprostředkována elementy DNA a to plasmidy a transpozony. Rezistence k vancomycinu bakterií rodu Enterococcus je závážný problém. Bylo popsáno šest fenotypů rezistence vůči vancomycinu. VaA, VanB, VanD, VanC, VanE a VanG. Fenotyp VanC je nepřenosný, fenotyp VanB je charakterizován mírně inducibilní odolností vůči vancomycinu a nejčastěji se vyskytuje u E. faecalis a E. faecium. Fenotyp VanC je charakterizován mírným odporem a je typický pro E. gallinarum a E. casseliflavus (De Vos a kol., 2009). Odolnost vůči beta-laktamovým antibiotikům byla objevena u klinických kmenů E. faecalis a E. faecium. Produkce beta-laktámazy u těchto dvou druhů je velmi vzácná. Obecně E. faecium prokazuje vyšší výskyt rezistence než E. faecalis a jiné druhy enterokoků (De Vos a kol., 2009).

44

11 CHARAKTERIZACE

OPATŘENÍ

V BOJI

PROTI

NEŽÁDOUCÍM ENTEROKOKŮM Enterokoky podle nedávných průzkumů patří mezi 3 nejčastější patogeny, které způsobují nozokominální infekce (Fraser, 2011). Největší problém je v jejich stále větší odolnosti vůči mnoha druhům antibiotik, včetně vancomycinu. Studie prokázaly zvýšený výskyt bakterií toho rodu hlavně u pediatrické populace. V roce 1986 bylo 7 případů nákazy na 1000 dětí a v roce 1991 už to bylo 48 případů na 1000 dětí. V roce 2004 byl zaznamenán 12% nárust vankomycin rezistentních enterokoků (Varman, 2012). Obecně platí, že virulence enterokoků je nižší než u bakterií rodu Staphylococcus. Nicméně infekce vyvolané enterokoky se vyskytují u oslabených jedinců (Fraser, 2011). Bylo zjištěno, že dospělí lidé jsou infikováni častěji než děti, kromě dětí v novorozeneckém období. Pohlaví neovlivňuje vznik onemocnění způsobené enterokoky, avšak enterokoková endokarditida je častější u dospělých mužů a dětí, protože enterokoky jen zřídka infikují srdeční chlopně dětí (Varman, 2012). Naopak infekce močových cest je častější u zdravých žen, než u zdravých mužů (Fraser, 2011). Obecně mezi rizikové faktory infekce způsobené enterokoky patří delší hospitalizace v nemocnici, dlouhodobý pobyt na jednotce intenzivní péče, opětovný chirurgický zákrok po transplantaci jater, lidé s oslabenou imunitou, vyšší věk pacienta, neurochirurgické postupy a používaní chirurgických zařízení. Nozokominální infekce močových cest se obvykle vyskytují u dětí. Mezi rizikové faktory infekce močových cest způsobené enterokoky patří permanentní močový katetr, instrumentace močových cest, strukturální abnormality močových cest, bakterémie (Varman, 2012). Pokud se u pacienta objeví infekce způsobena enterokoky, obecně se doporučuje antimikrobiální léčba. Léky vybíráme podle druhu enterokoka, který infekci způsobil, protože každý má specifickou rezistenci vůči jiným antibiotikům. V první řadě se podají léky hlavně ampiciliny nebo peniciliny. Tyto léky používáme, pokud se jedná o novorozeneckou sepsi, endokarditidu či meningitidu. Ampicilin se může používat i samostatně k léčbě drobných zánětů. Dále můžeme použít antibiotika obsahující inhibitory beta-laktamázy (např. klavulanát). U kmenů s vysokou úrovní rezistence vůči beta-laktamům můžeme použít synercid, který ale není účinný proti E. faecalis (Varman, 2012).

45

Jednotné úsilí všech lékařů je, že je nutné zpomalit zvyšování nákazy a úmrtnosti spojené s vancomycin rezistentními kmeny bakterií rodu Enterococcus. Proto byly vydány zásady k omezení šíření těchto enterokoků, mezi které patří např. kontaktní izolace infikovaných osob (tj. šaty, rukavice, vysoká osobní hygiena), omezení používaných nástrojů v péči o infikovaného pacienta, aktivní screening rezistence vancomycinu u klinických izolátů, důkladná dekontaminace ekologických ploch, vancomycin nepředepisovat pro běžnou chirurgickou profylaxi a aktivní dozor na jednotce intenzivní péče (Varman, 2012).

46

12 ZÁVĚR Tato bakalářská práce je souhrnem informací týkajících se problematiky, využití a významu rodu Enterococcus. Skladba bakterií rodu Enterococcus se stále mění. V současné době je validně popsáno na 34 druhů enterokoků. Původně byly do tohoto rodu zahrnuty i druhy jako např. Enterococcus flavescens, který byl izolován od lidí z těžkými infekcemi. Při pozdějším přezkoumání v roce 2004 bylo navrženo, aby druhy E. casseliflavus a E. flavescens byly sjednoceny pod stejný název. Dále byly z tohoto rodu neklasifikovány druhy Enterococcus porcinus, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus thailandicus a Enterococcus viikiensis. První objevené a doposud nejvýznamnější druhy (Enterococcus fecalis a Enterococcus faecium), které v roce 1984 popsali Schleiffer a Kilpper-Bälz, byly izolovány z výkalů člověka, a z výkalů teplokrevných a studenokrevných živočichů. E. faecium a E. faecalis jsou součástí běžné mikroflóry v tlustém střevě, ale lze je prokázat i tenkém střevě. Enterokoky mají široké spektrum výskytu a s tím souvisí i jejich význam. V potravinářství je jejich význam protichůdný, protože jejich vliv může být jak pozitivní tak negativní. Jejich pozitivní význam souvisí s jejich využitím v masném či mléčném průmyslu, kde napomáhají ke zlepšení aroma a chuti. Této vlastnosti se využívá u zrání sýru čedar, nebo u fermentovaných masných výrobků. Na druhou stranu schopnost enterokoků vytvářet biogenní aminy v prostředí, není vlastnost pozitivní. Bakterie tohoto rodu jsou také významným indikátorem mikrobiologie jakosti. Například u sušeného mléka, termizovaných potravinových výrobků, vody aj. Některé druhy Enterococcus faecium byly dokonce popsány jako probiotické a naopak některé druhy mohou způsobit zkázu potraviny. Enterokoky se také hojně vyskytují ve vodě, kde slouží také jako indikátorové bakterie fekálního znečištění. V povrchových vodách se vyskytují hlavně rody Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans a Enterococcus hirae.

Enterococcus

moraviensis

a

Enterococcus

silesiacus

byly

izolovány

z povrchových vod na území České republiky. Enterokoky obecně patří mezi podmíněné patogenní mikroorganismy. Často způsobují infekce močových cest, žlučových cest méně často pak zánět kostní dřeně, zánět nitroočních tkání, nebo zánět vnitřní výstelky srdce. Dále pak enterokoky způsobují nozokominální infekce, což jsou infekce získané ve zdravotnickém prostředí. 47

Mezi tyto infekce řadíme například infekce močového traktu, nebo gynekologické infekce. Na vznik těchto infekcí má vliv zdravotní stav pacienta, věk, délka pobytu pacienta v nemocnici, zejména dlouhodobý pobyt na jednotce intenzivní péče a obecně hygiena prostředí a nástrojů. U pacientů s infekcí způsobenou enterokoky se obecně doporučuje antimikrobiální léčba. Jedním z největších problému u těchto bakterií, je však jejich rezistence vůči antibiotikům, zejména na vancomycin. Z tohoto důvodu se vybírají léky podle druhu enterokoka, který infekci způsobil. Mezi nejčastěji používané patří hlavně ampiliciny a peniciliny.

48

PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY: Baldassarri L., Cecchini R., Bertuccini L., Ammendolia M. G., Iosi F., Arciola C. R., Montanaro L., di Rosa R., Gherardi G., Dicuonzo G., Orefici G., Creti R. (2001): Enterococcus ssp. Produces slime and survives in rat peritoneal macrophages. Med Microbiolo Immunol. 190: 113-120.

Basařová G., Šavel J., Basař P., Lejsek T. (2010): Pivovarství. Vysoká škola chemickotechnologická v Praze, Praha. 904 s.

Bridge P. D., Sneath P. H. A. (1982): Streptococcus gallinarum sp. nov. and Streptococcus oralis sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 32 (4): 410-415.

Burdychová R., Sládková P. (2007): Mikrobiologická analýza potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno. 218 s.

Carvalho M. S., Shewmaker P. L., Steigerwalt A. G., Morey R. E., Sampson A. J., Joyce K., Barrett T. J., Teixeira L. M., Facklam R. R. (2006): Enterococcus caccae sp. nov., isolated from human stools. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56 (7): 1505-1508.

Collins M. D., Facklam R. R., Farrow J. A. E., Williamson R. (1989): Enterococcus raffinosus sp. nov., Enterococcus solitarius sp. nov. and Enterococcus pseudoavium sp. nov. FEMS Microbiology Letters. 57: 283-288.

Collins M. D., Farrow J. A. E., Jones D. (1986): Enterococcus mundtii sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 36 (1): 8-12.

Collins M. D., Jones D., Farrow J. A. E., Kilpper- Bälz R., Schleifer K. H. (1984): Enterococcus avium nom. rev., comb. nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb. nov.; E. durans nom. rev., comb. nov.; E. gallinarum comb. nov.; E. malodoratus sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 34 (2): 220-223.

49

De Graef E. M., Devriese L. A., Vancanneyt M., Baele M., Collins M. D., Lefebre K., Swings J., Haesebrouck F. (2003): Description of Enterococcus canis sp. nov. from dogs and reclassification of Enterococcus porcinus Teixeira et al. 2001 as a junior synonym of Enterococcus villorum Vancanneyt et al. 2001. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 53 (4): 1069-1074.

De Vaux A., Laguerre G., Diviès Ch., Prévost H. (1998): Enterococcus asini sp. nov. isolated from the caecum of donkeys (Equus asinus). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 48: 383-387.

De Vos P., Garrity G. M., Jones D., Krieg N. R., Ludwig W., Rainey F. A., Schleifer K. H., Whitman W. (2009): Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. Springer Dordrecht Heidelberg London, New York. 1450 s.

Devriese L. A., Ceyssens K., Rodrigues U. M., Collins M. D. (1990): Enterococcus columbae, a species from pigeons intestines. FEMS Microbiol. Lett. 71: 247-252.

Devriese L. A., Dutta G. N., Farrow J. A. E., Van de Kerckhove A., Phillips B. A. (1983): Streptococcus cecorum, a new species isolated from chickens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 33 (4): 772-776.

Farrow J. A. E., Collins M. D. (1985): Enterococcus hirae, a new species that includes amino acid assay strain NCDO 1258 and strains causing growth depression in young chickens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 35 (1): 73-75.

Fortina M. G., Ricci G., Mora D., Manachini P. L. (2004): Molecular analysis of artisanal Italian cheeses reveals Enterococcus italicus sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54 (5): 1717-1721.

Fraser S. L. (2011): Enterococcal infections. Medscape reference. Dostupné na: http://emedicine.medscape.com/article/216993-overview.

50

Görner F., Valík L. (2004): Aplikovaná mikrobiológia poživatín. Malé centrum Bratislava, Bratislava. 528 s.

Hampl B. (1968): Potravinářská mikrobiologie. Státní nakladatelství technické literatury, Praha. 276 s.

Heredia N., Wesley I., Garcia J. S. (2009): Microbiologically safe foods. Hoboken, New Yersey. 667s.

Hudecová D., Majtán V. (2002): Mikrobiológia 1. Slovenská technická univerzita v Bratislavě, Bratislava. 189 s.

Hugas M., Garriga M., Aymerich M. T. (2003): Functionality of Enterococci in meat products. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 88: 223233.

Jičínská E., Havlová J. (1995): Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha. 106 s.

Kalina A. P. (1970): The taxonomy and nomenclature of Enterococci. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 20 (2): 185-189.

Komprda T. (2007): Obecná hygiena potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno. 148 s.

Koort J., Coenye T., Vandamme P., Sukura A., Björkroth J. (2004): Enterococcus hermanniensis sp. nov., from modified-atmosphere-packaged broiler meat and canine tonsils. Int. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54 (5): 1823-1827.

Kusuda R., Kawai K., Salati F., Banner C. R., Fryer J. L. (1991): Enterococcus seriolocida sp. nov., a fis patogen. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41 (3): 406-409. 51

Law-Brown J., Meyers P. R. (2003): Enterococcus phoeniculicola sp.nov., a novel member of the enterococci isolated from the uropygial gland of the Red-billed Woodhoopoe, Phoeniculus purpureus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 53 (3): 683-685.

Lukášová J. a kol. (1997): Mikrobiologie potravin – praktická cvičení. Ediční středisko VFU Brno, Brno. 55 s.

Málek F., Karell I., Frídl P., Polášek R., Špaček R., Koudelková E. (2001): Enterokoková infekční endokarditida nativní aortální chlopně jako následek diagnostické transrektální punkční biopsie prostaty. Kardiocentrum FN Královské vinohrady, III. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Praha. 321-322.

Marth E. H., Steele J. L. (2001): Applied dairy mikrobiology. 744 s.

Martinez-Murcia A. J., Collins M. D. (1991): Enterococcus sulfureus, a new yellowpigmented Enterococcus species. FEMS Microbiology Letters. 80: 69-74.

Naser S. M., Vancanneyt M., De Graef E., Devriese L. A., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Švec P., Decostere A., Haesebrouck F., Swings J. (2005): Enterococcus canintestini sp. nov., from faecal samples of healthy dogs. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55 (5): 2177-2182.

Naser S. M., Vancanneyt M., Hoste B., Snauwaert C., Vandemeulebroecke K., Swings J. (2006): Reclassification of Enterococcus flavescens Pompei et al. 1992 as a later synonym of Enterococcus casseliflavus (ex Vaughan et al. 1979) Collins et al. 1984 and Enterococcus saccharominimus Vancanneyt et al. 2004 as a later synonym of Enterococcus italicus Fortina et al. 2004. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 56 (2): 413-416.

Rahkila R., Johansson P., Säde E., Björkroth J. (2011): Identification of Enterococci from Broiler Products and a Broiler Processing Plant and Description of Enterococcus viikkiensis sp. nov. Applied and Environmental mikrobiology. 77 (4): 1196-1203. 52

Rodrigues U., Collins M. D. (1990): Phylogenetic analysis of

Streptococcus

saccharolyticus based on 16S rRNA sequencing. FEMS Microbiology Letters. 71: 231234.

Sedláček Ivo (2006): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno. 270 s.

Schleifer K. H., Kilpper-Bälz R. (1984): Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 34 (1): 31-34.

Sukontasing S., Tanasupawat S., Moonmangmee S., Lee J., Suzuki K. (2007): Enterococcus camelliae sp. nov., isolated from fermented tea leaves in Thailand. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 57 (9): 2151-2154.

Šilhánková L. (2002): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha. 363 s.

Švec P., Devriese L. A., Sedláček I., Baele M., Vancanneyt M., Haesebrouck F., Swings J., Doškař J. (2001): Enterococcus haemoperoxidus sp. nov. and Enterococcus moraviensis sp. nov., isolated from water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 51: 1567-1574.

Švec P., Vancanneyt M., Devriese L. A., Naser S. M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2005): Enterococcus aquimarinus sp. nov., isolated from sea water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55 (5): 2183-2187.

Švec P., Vancanneyt M., Koort J., Naser S.M., Hoste B., Vihavainen E., Vandamme P., Swings J., Björkroth J. (2005): Enterococcus devriesei sp. nov., associated with animal sources. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55 (6): 2479-2484.

53

Švec P., Vancanneyt M., Sedláček I., Naser S. M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2006): Enterococcus silesiacus sp. nov. and Enterococcus termitis sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56 (3): 577-581.

Tanasupavat S., Sukontasing S., Lee J. S. (2008): Enterococcus thailandicus sp. nov., isolated from fermented sausage (‘mum‘) in Thailand. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 58 (7): 1630-1634.

Teixeira L. M., Carvalho M. G. S., Espinola M. M. B., Steigerwalt A. G., Douglas M. P., Brenner D. J., Facklam R. R. (2001): Enterococcus porcinus sp. nov. and Enterococcus ratti sp. nov., associated with enteric disorders in animals. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 51 (5): 1737-1743.

Tyrrell G. J., Turnbull L., Teixeira L. M., Lefebvre J., Carvalho M. S., Facklam R. R., Lovgren M. (2002): Enterococcus gilvus sp. nov. and Enterococcus pallens sp. nov. Isolated from Human Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4): 1140-1145.

Valenzuela A. S., Benomar N., Abriouel H., Pulido R. P., Can˜amero M. M., Galvez A. (2011): Characterization of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from wild flowers. Springer Science+Business Media B.V. 2011.

Vancanneyt M., Snauwaert C., Cleenwerck I., Baele M., Descheemaeker P., Goossens H., Pot B., Vandamme P., Swings J., Haesebrouck F., Devriese L. A. (2001): Enterococcus villorum sp. nov., an enteroadherent bacterium associated with diarrhoea in piglets. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 51 (2): 393-400.

Vancanneyt M., Zamfir M., Devriese L. A., Lefebrve K., Engelbeen K., Vandemeulebroecke K., Amar M., Vuyst L. D., Haesebrouck F., Swings J. (2004): Enterococcus saccharominimus sp. nov., from dairy products. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54 (6): 2175-2179.

54

Vrána J. (2004): Infekce močových cest u dětí. Urologická klinika, FN Olomouc.

Yean Ch. Y., Yin L. S., Lalitha P., Ravichandran M. (2007): A nanoplex PCR assay for the rapid detection of vancomycin and bifunctional aminoglycoside resistance genes in Enterococcus species. BMC Microbiology.

55