Kvalita v laboratorní a kontrolní praxi Část: Validace analytických metod vhodnost pro daný účel Vladimír Kocourek
Praha, 2016
Výběr zkušebních metod pro daný účel Kvalimetrie 9. Vhodnost analytických metod pro daný účel (laboratorní příručka pro validaci metod a související činnosti), Miloslav Suchánek, EURACHEM ČR, Praha 1999
Procesem VALIDACE se zjišťují PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY analytické metody: „je metoda vhodná pro zamýšlený účel ?“
Co je tedy „VALIDACE“ ? …poskytnutí důkazu, že metoda je vhodná pro daný účel = zjišťování její „platnosti (validity)“.
Analytická metoda je definována: principem a rovnicí měření algoritmem pracovního postupu, požadavky na materiály, přístroje, zařízení,.. pracovními (provozními) charakteristikami způsobem kvantifikace (kalibrace a výpočet) SOP: „Standard Operation Procedure“
Analytická metoda jako součást řešení problému Definování problému
Výběr vhodné metody Úprava vzorku (sample handling)
Zpracování a měření vzorku Kalibrace a výpočet
Statistické zpracování
Interpretace, Prezentace
Struktura SOP – ČSN/EN/ISO
Normalizovaná analytická (zkušební) metoda:
podstata zkoušky (princip, definice analytu) chemikálie (činidla, rozpouštědla, standardy,..) přístroje, zařízení pracovní postup (algoritmus vč. kalibrace a výpočtu) konfirmační zkoušky (identita, kvantita) preciznost (opakovatelnost, reprodukovatelnost) pravdivost (výtěžnost – odchylka) protokol o zkoušce (uvádění výsledků, interpretace)
VALIDUJÍ se pracovní charakteristiky: 1. PŘESNOST: opakovatelnost, reprodukovatelnost – náhodné vlivy pravdivost (zpravidla výtěžnost) - vychýlení 2. SPECIFIČNOST, SELEKTIVITA: specifická metoda - zcela oproštěna od vlivu matrice selektivní metoda – výsledky ovlivňuje složení matrice (interference, cross-reactivity,…) 3. CITLIVOST: směrnice kalibrační přímky
VALIDUJÍ se pracovní charakteristiky: 4. MEZ DETEKCE a MEZ STANOVITELNOSTI: LOD – jaké množství analytu lze ještě spolehlivě prokázat LOQ – jaké množství analytu lze s definovanou přesností ještě stanovit nebo nejnižší bod kalibrační křivky (LCL) 5. PRACOVNÍ ROZSAH a LINEARITA: v jakém koncentračním rozsahu lze měřit/kalibrovat a v jakém rozsahu je kalibrační závislost lineární Měření má probíhat za stejných podmínek jako kalibrace !
6. ROBUSTNOST (ruggedness, robustness): jak je výsledek ovlivněn malými změnami v dodržení SOP (test robustnosti parametrů).
Požadavek ISO 17025 čl. 5.4: Laboratoř musí používat takových zkušebních metod, (a metod vzorkování), které splňují potřeby zákazníka a jsou vhodné pro zkoušky, které laboratoř provádí. V řadě sektorů, zejména při kontrole kvality a bezpečnosti potravin, se požaduje „plně“ validovaná metoda. Zhodnocení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti ČSN ISO 5725: Přesnost metod a výsledků měření
Mezilaboratorní studie
MEZILABORATORNÍ VALIDACE Zhodnocení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti
Nákladný a zdlouhavý proces Obtížné sehnat dostatečný počet kompetentních laboratoří Pro multireziduální metody, prakticky nemožné zahrnout všechny existující analyty, matrice a koncentrační hladiny
Tato cesta validace je ve stopové analýze spíše ojedinělá, zvláště organických sloučenin v biotických matricích, ojedinělá - většina laboratoří má „svoji“ metodu
„in-house“ validace
„Dlouhodobá“ opakovatelnost („intralaboratorní přesnost“) (i) Preciznost opakování v rámci jedné série měření – směrodatná odchylka σr (ii) Preciznost mezi více sériemi, zahrnující jednotlivé systematické vlivy (dílčí odchylky) – směrodatná odchylka σrun
σtot = (σr2/n + σ run2)1/2 Rozptýlení výsledků se hodnotí opakovanou analýzou duplikátních vzorků, resp. referenčního materiálu (např. při vedení regulačního diagramu).
Vývoj a optimalizace metody
vzorky s přídavkem
Postup validace
(spiked samles)
zvládnutí procesu
opakovaná měření
Referenční materiál
Nezávislá metoda
Mezilaboratorní studie OPAKOVATELNOST
PRAVDIVOST REPRODUKOVATELNOST
LOD/LOQ
Selektivita
Pracovní charakteristiky Rozsah
Robustnost
Účel analýzy ?
? Citlivost ? Mez detekce (Limit Of Detection): nejmenší koncentrace analytu, která ještě vyvolá odezvu měřicího systému rozpoznatelnou (s přijatelnou statistickou jistotou) od ostatních vlivů.
Mez stanovitelnosti (Limit Of Quantitation): nejnižší koncentrace analytu, kterou lze s definovanou přesností kvantitativně stanovit a pro kterou byla metoda validována (odpovídá zpravidla nejnižšímu bodu kalibrační křivky). LOD a LOQ se doporučuje vyjadřovat jako koncentraci analytu v původním vzorku, zejména pokud na daných koncentračních hladinách existují rušivé vlivy matrice.
Matriční vlivy: např. pokles a deformace signálu
Vysoký obsah matrice
Nízký obsah matrice
Mez detekce: odlišení signálu od šumu ? S/N > 6 S/N > 2
signál
šum
S/N dle různých autorit: 1. Evropský lékopis:
2. Alternativně:
Limit detekce (LOD) – kdy lze prohlásit, že látka je přítomna Limit kvantifikace (LOQ) – kdy lze obsah látky dobře změřit LOD je koncentrace, kdy látka vyvolá odezvu (S) měřicího přístroje větší než je trojnásobek úrovně šumu (N) pozadí S/N = 3 LOQ je koncentrace, kdy látka vyvolá odezvu měřicího přístroje větší než je desetinásobek úrovně šumu pozadí S/N = 10
Konverze signálu na koncentraci v oblasti nízkých koncentrací 1·0
Pracovní rozsah
0·8
Signál
0·6
0·4
LOD LOQ
0·2
Lineární rozsah 0 0
0·2
0·4
0·6 Koncentrace
0·8
1·0
1·2
Nejnižší kalibrační hladina (LCL) nejnižší koncentrace, od které vyjadřujeme výsledky analýzy kvantitativně – nižší koncentrace nelze měřit i když je přítomnost látky kvalitativně prokázána (> LOD); LCL nesmí být nižší než LOQ Signál
Lineární rozsah
Strmost = citlivost < LCL
Oblast kvantifikace
(S/N = 3)
Intercept LOD LOQ
(S/N = 10)
LCL
Koncentrace
DETEKTABILITA – jak snížit LOD ? Zvýšení poměru S/N v GC/MS-NCI analýze nitronaftalenů (vzorek trávy) pomocí zvýšení napětí na fotonásobiči detektoru (1-nitroNAP = 0,1 ppb, 2-nitroNap = 0,08 ppb) A - EMV = 1300 V 84
1-nNap
B - EMV = 1800 V 280
A
82
1-nNap
260
2-nNap
B 2-nNap
240
80
220 200
78
180
76
160 140
74
120 100
72
80
70 Time-->
60
11.80
12.00
12.20
12.40
12.60
Time-->
11.80
12.00
12.20
12.40
Mez detekce: odlišení signálu od slepých pokusů 30
Soubor slepých pokusů + vzorek
LOD
25
3 x směrodatná odchylka σ0
20
ug/kg
průměr slepých pokusů X0
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pokus č.
9
10
11
12
13
14
15
LOD = X0 + k* σ 0
Mez detekce: odlišení signálu po korekci pozadí 5
Soubor slepých pokusů + vzorek 4
3
3 x směrodatná odchylka σ 0
ug/kg
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
-1
-2
-3
Pokus č.
LOD = X0 + k*σ 0 X0 = 20,6 ug/kg; k = 3
Vztah mezi LOD a slepými pokusy (blank)
1,64*sblank
1,64*sblank
=5%
=5%
sblank
yblank Odezva blank
YLOD
Signál analytu
Jak malé množství látky lze ještě zjistit ? Moderní analytické techniky: …….. často už ani nejde o to Jak nízkou koncentraci látky lze ještě zjistit (resp. měřit) ? ale o spíše to Jak nízkou koncentraci látky je nutno ještě zjistit (resp.měřit) ?
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED.
Document N° SANTE/11945/2015
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED.
Document N° SANTE/11945/2015
Within-laboratory method validation should be performed to provide evidence that a method is fit for the purpose for which it is to be used. Method validation is a requirement of accreditation bodies, and must be supported and extended by method performance verification during routine analysis (analytical quality control and on-going verification). The method must be tested to assess – at least - for mean recovery (as a measure of trueness or bias), precision, limit of quantification (LOQ), and sensitivity. If the analytical method does not permit determination of recovery (for example, direct analysis of liquid samples, SPME, or headspace analysis), the precision is determined from repeat analyses of calibration standards. The bias is usually assumed to be zero, although this is not necessarily so. In SPME and headspace analysis, the trueness and precision of calibration may depend on the extent to which the analyte has equilibrated !
ANALYTICAL QUALITY CONTROL AND VALIDATION PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED.
Document N° SANTE/11945/2015
Validation of qualitative screening methods is focused on detectability: the lowest spiking level for which has been demonstrated that a certain analyte can be detected in at least 95% of the samples (i.e. a false-negative rate of 5% is accepted).
Codex Alimentarius: numerical values for the criteria Applicability: The method has to be applicable for the specified provision, specified commodity and the specified level: maximum and/or minimum - ML. The minimum applicable range of the method depends on the specified level (ML) to be assessed, and can either be expressed in terms of the reproducibility standard deviation (sR) or in terms of LOD and LOQ. CL 2008/7-MAS, March 2008
Minimum applicable range: ML ≥ 0.1 mg/kg → [ML - 3 sR , ML + 3 sR ] ML < 0.1 mg/kg → [ML - 2 sR , ML + 2 sR ]
Limit of Detection (LOD): ML ≥ 0.1 mg/kg → LOD ≤ ML · 1/10 ML < 0.1 mg/kg → LOD ≤ ML · 1/5 Limit of Quantification (LOQ): ML ≥ 0.1 mg/kg → LOQ ≤ ML · 1/5 ML < 0.1 mg/kg → LOQ ≤ ML · 2/5
Codex Alimentarius: numerical values for the criteria
CL 2008/7-MAS, March 2008
Parametry pro stopovou analýzu - biotické matrice
Kompletní návod pro validaci metod a kriteria jejich vhodnosti pro úřední kontrolu
KLASIFIKACE ANALYTICKÝCH METOD (charakteristiky, které musí být verifikovány) COMMISSION DECISION 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. CCβ [k.LOD]
CCα [DL]
S
+
-
-
K
+
+
KVANTITATIVNÍ S
+
K
+
Typ metody KVALITATIVNÍ
Pravdivost Opakovatelnost
Selektiv./ specific.
Pouzit./ robust.
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
pro všechny oblasti stopové analýzy se spíše uvažuje LOD a DL
S – screeningová; K - konfirmační + - stanovení je závazné
SCREENINGOVÉ METODY - nutno validovat požadavek: falešně negativní výsledky < 5% (chyba 2. řádu - β) na rozhodovací koncentrační hladině
koncentrace
Požadovaná úroveň detekce, DL
NEGATIVNÍ vzorky STOP
POSITIVNÍ vzorky KONFIRMACE
ROZHODNUTÍ KOMISE 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků.
CCβ Detekční schopností CCß se rozumí nejmenší množství látky, které může být s chybou ß ve vzorku detekováno a/nebo identifikováno. V případě látek, pro něž není stanovena nejvyšší přípustná hodnota, je to nejnižší koncentrace, kdy lze identifikovat skutečně kontaminované vzorky se spolehlivostí 1 – ß. V případě látek, pro něž je stanovena nejvyšší přípustná hodnota, se detekční schopností rozumí koncentrace, při jejímž dosažení lze metodou detekovat nejvyšší přípustné koncentrace s pravděpodobností 1 – β.
CCα Rozhodovací mezí CCα se rozumí mez, při jejímž dosažení a překročení lze konstatovat, že vzorek s pravděpodobností α nesplňuje požadavky.
Mez detekce: kvalita rozhodnutí ? Skutečnost
signál šum
nepřítomen
přítomen
nedetekován
Správné rozhodnutí
Falešně Negativní (chyba II. druhu)
detekován
Falešně Pozitivní (chyba I. druhu)
Správné rozhodnutí
Rozhodnutí
Pravděpodobnost pozitivního nálezu
Graf operativní charateristiky ilustrující detekční schopnost (CCβ analytické metody)
Limit 0.5
Mez detekce: spolehlivost rozhodnutí
k
0,5000
0,0
0,1587
1,0
0,0228
2,0
0,0062
2,5
0,0026
2,8
0,0013
3,0
0,0005
3,3
X0
XLOD = XD
- riziko, že výsledek bude falešně pozitivní (FP): rozhodneme, že analyt je přítomen ale ve skutečnosti tam není
Mez detekce: riziko FP () a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí XDL = XLOD
X0
XLOD= XD
Mez detekce: riziko FP () a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí XDL > XLOD
X0
XLOD XD
Mez detekce: riziko FP () a FN (β) výsledků Mez rozhodnutí XDL = 2 x XLOD
X0
XLOD
XD
Mez detekce: riziko FP () a FN (β) výsledků LOD
XDL
FP ()
FN (β)
3σ
3σ
0,1 %
50 %
3σ
4σ
0,1 %
16 %
3σ
5σ
0,1 %
2,3 %
3σ
6σ
0,1 %
0,1 %
2,33 σ
2,33 σ
1%
50 %
2,33 σ
4,66 σ
1%
1%
1,64 σ
3,28 σ
5%
5%
Mez stanovitelnosti (LOQ) - pravidla LOQ se zpravidla stanoví jako nejnižší koncentrace, pro kterou ještě metoda splňuje kriteria přijatelnosti pro preciznost a pravdivost (tj. opakovatelnost, výtěžnost) LOQ nelze deklarovat nižší, nežli odpovídá nejnižšímu bodu kalibrační křivky (LCL) LOQ nejnižší bod kalibrační křivky nemá být níže, nežli odpovídá trojnásobku LOD (tedy asi 9-10 x σ). Výsledky ležící mezi LOD a LOQ se nepovažují za kvantitativní (uvedou se např. „stopy“ nebo semikvantitativní vyjádření)
Hmotnostní rozlišení - MASS RESOLVING POWER
nízkorozlišovací (LR) hmotnostní spektrometr
C4H7Cl2O4P1
C4H7Cl2O4P1
Relative Intensity 100
vysokorozlišovací (HR) hmotnostní spectrometr
500 FWHM (jednotkové rozlišení)
219.9459
Relative Intensity 100
50
50
0
0
220.0 220
221
222.0 222
223
224
224.0 m/z
m/z Separace hmot: iontů 220 a 221
6,000 FWHM
219.9459
220
226.0
221
222
228.0
223
224
m/z Možná separace iontů: 220,00 a 220,08
Hmotnostní rozlišení - MASS RESOLVING POWER Mass resolving power – schopnost hmotnostního analyzátoru rozlišit ionty podobné hmotnosti Mass resolution
Full Width at Half Maximum (FWHM)
Defined for the profile (continuum) spectra
1,0
Normalised intensity
m FWHM m
m1
Δm
m2
Max. Δm
0,5
50% of Max.
FWHM
10% Valley 5% of Max.
Δm
0,0 99
100
101
102 m/z
Spolehlivost identifikace: hmotnostní spektrometrie
Steven J. Lehotay, Katerina Mastovska et al. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 27, No. 11, 2008
„MASS ACCURACY“ Rozdíl mezi hmotou iontu experimentálně naměřenou a teoreticky vypočtenou (accurate mass vs. exact mass) Vyjádřeno jako chyba hmotnosti (mDa, ppm)
(mDa) mexp . mteor. 103 (ppm)
mexp . mteor. mteor.
106
Unit resolution (LR) mass spectrometers • Přesnost hmoty ≈ 0,1–0,2 Da (např. 200,0 and 200,1 Da) High-resolution (HR) mass spectrometers • Přesnost hmoty ≈ 0,001 Da (< 5 ppm) (např. 200,000 and 200,001 Da)
ROZHODNUTÍ 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků a SANTE/11945/2015 o validaci metod a QC v analýze reziduí pesticidů Metody vhodné pro identifikaci a konfirmaci analytů kriteria kvality identifikace
Tolerance relativních intensit iontů
ROZHODNUTÍ 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků Vztah mezi typem fragmentace a dosaženým počtem identifikačních bodů
Hmotnostně spektrometrická technika
Dosažený počet identifikačních bodů na iont
Hmotnostní spektrometrie s nízkým rozlišením (LR)MS
1,0
LC-MSn prekurzorový iont
1,0
LC-MSn dceřiný produkt
1,5
Hmotnostní spektrometrie s vysokým 2,0 rozlišením (HR-MS) HR-MSn prekurzorový iont
2,0
HR-MSn dceřiný produkt
2,5
Poznámky: (1) Každý iont může být počítán pouze jednou. (2) GC-MS s elektronovou ionizací a GC-MS s chemickou ionizací se považují za odlišné techniky.
ROZHODNUTÍ 2002/657/EC o provádění analytických metod a interpretaci výsledků Příklady počtu identifikačních bodů
