Kostní markery
Olga Bálková Roche s.r.o., Diagnostics Division
Laboratorní yvšetření při podezření na osteopatii • KO + diff., FW • Ionty v séru • Kreatinin, močovina, kyselina močová, glykémie, albumin, AST, ALT, GMT, ALP, TSH • U mužů testosteron, SHBG, LH a prostatický sérový antigen U žen po menopauze FSH, elektroforéza bílkovin • Z kostních markerů: OC a CTx (nebo U − CTx) nebo U − NTx nebo U − DPD nebo P − ACP 5b • Základní vyšetření moče: chemické vyšetření, sediment, dU − Ca • Doplňující vyšetření: hyperkalcemický a hypokalcemický syndrom, Pagetova kostní choroba (Ca2+, PTH, 25-hydroxyvitamin D, kostní izoenzym ALP, PINP, (1,25dihydroxyvitamin D), 2hodinový test: U − Ca, U − PO4, U − kreatinin, renální tubulární práh pro fosfáty Mnohočetný myelom, nádor. difer. diagnostika paraproteinémie, nádorové markery Hyperkortizolismus: dU − volný kortizol Hyperthyreóza: T3, T4 Hypogonadismus: estradiol (supersenzitivní), SHBG, u mužů volný testosteron Zdroj: Štěpán J., www.euni.cz
Kostní markery • Enzymy, peptidy, minerální složky • Specifický odraz kostní novotvorby a resorpce • Klasifikace – podle metabolické úlohy v kosti: Dmarkery osteoformace Dmarkery osteoresorpce • Klinické využití: monitorování léčby metabolických nemocí kostí, poruch růstu predikce osteoporotických fraktur vyhledávání jedinců s rizikem osteoporózy určení rychlosti ztráty kostní hmoty zjištění klinicky němých metastáz maligních tumorů
Výhody a nevýhody kostních markerů • Jednoduchý odběr krve, moči
• Obraz celotělové rychlosti osteoformace a osteoresorpce, nikoli změny jednotlivých oblastí skeletu
• Rychlá reakce na změny kostní denzity: - predikce úbytku kostní hmoty • Málo vhodné pro diagnózu (osteoporóza vysokoobratová osteoporózy vs. nízkoobratová) - monitorování úspěšnosti léčby • Cut-off hodnoty: nejsou pevné (kostní markery reagují na léčbu hranice, intraindividuální variabilita rychleji, než denzitometrie nebo rtg) - vyhledávání rizikových pacientů • Preanalytické faktory - ovlivnění klinické využitelnosti • Elevace markerů u klinicky němých metastáz do kostí
Osteokalcin
Osteokalcin Kostní sialoprotein
Kostní ALP
Tartarát-rezistentní kyselá fosfatáza Hydroxyprolin
Prokolageny typ I (PINP, PICP)
Kalcium, fosfor Glykosidy hydroxylyzinu Cross Links (DPD, PYD) Telopeptidy kolagenu I (ICTP) Telopeptické fragmenty (CTx, NTx) Osteoblast
Matrix
Osteoklast
Zdroj: Seibel MJ, Woitge HW 1999: Biochemical Markers of Bone Metabolism
+ PTH + vitamín D
Osteokalcin • Hlavní nekolagenní protein kostní hmoty, m.h. 5800 D, 49 AMK • Vysoká afinita pro vápník ☞ vazba hydroxyapatitu na kostní matrix • 70 % osteokalcinu (dospělí) inkorporováno do kostní matrix, zbytek v cirkulaci – degradace a vyloučení v ledvinách • Falešně vyšší hodnoty při ↓ funkci ledvin, mírně podléhá cirkadiánním změnám (nejvyšší hodnoty v noci) • Hodnocení aktivity osteoblastů, koncentrace ≈ rychlost kostního obratu • Hladiny vyšší u dětí (než dospělých) • Využití: a) monitorování léčby osteoporózy (na začátku léčby, po 6 měsících, po roce), úspěšná léčba = ↓ o 20-40 % b) identifikace vysokoobratové osteoporózy H vyhledání rizikových pacientů c) klinické studie: dg. kostních meta a sledování léčby Ca prostaty a Ca prsu
Kostní alkalická fosfatáza
• Celková ALP: 4 izoenzymy (kódovány různými geny) – kostní, střevní, jaterní, ledvinná (event. placentární, event. nádorová) • Kostní ALP = cca 40 % celkové ALP • Lokalizována v membráně osteoblastů, poločas 1-2 dny, podléhá cirkadiánním změnám, vylučování ledvinami • Využití: marker první volby při ↑↑↑ novotvorbě kosti (osteoporóza, m. Paget, osteomalacie, primární hyperparatyreoidismus, meta skeletu osteoplastickými nádory)
Syntéza kolagenu typu I
Kolagen specifický pro kost, nejdůležitější organická složka osteoformace Krok 1: Od polypeptidů k prokolagenu 1a: Osteoblasty produkují jednovláknové polypeptidy alfa-1 a alfa-2 α1
α1 α2 α1(OH) α1(OH) α2(OH)
1b: Hydroxylace 1c: Trojitá šroubovice ⇒ prokolagen
Prokolagen
Syntéza kolagenu typu I Odštěpení dvou analyticky důležitých propeptidů Krok 2: Prokolagen
Tropokolagen
Prokolagen Propeptidy kolagenu typu I PINP = N-terminální propeptid
Markery osteoforrmace
N-telopeptid
Prokolagenpeptidáza
Propetidy kolagenu typu I PICP = C-terminální propeptid
Helikální oblast
C-telopeptid
Tropokolagen (novotvorba kosti)
Propeptidy prokolagenu typu I (PINP)
• Vznik při syntéze kolagenu I, produkt osteoblastů, 70 kD, vysoce specifický pro kosti • Marker volby pro hodnocení osteoformace • Koncentrace nezávisí na funkci ledvin, termostabilní marker, žádné cirkadiánní změny, žádný vliv potravy • ↑ hodnoty: osteopenie, postmenopauzální osteoporóza, sekundární hyperparatyreóza, osteoblastické meta u Ca prostaty • Využití: a) sledování úspěšnosti léčby osteoporózy (při zahájení, po 6 měsících, po roce) b) léčba růstovým hormonem u dětí s jeho nedostatkem (už po měsíci se ↑) c) časný záchyt kostních meta u Ca prostaty a prsu
Propeptidy prokolagenu typu I (PICP) • 115 kD, hodnocení stupně novotvorby kolagenu • Homologie s PIIICP • ↑ hodnoty: rostoucí organismus, osteomalacie, m. Paget, osteoblastické meta skeletu, hypertyreóza, hyperparatyreóza • RIA, ELISA • Sleduje cirkadiánní rytmus
Markery kostní resorpce
Telopeptické fragmenty (CTx)/ϐ-CrossLaps • Vysoce specifické pro kolagen I • Marker volby pro hodnocení kostní resorpce • Koncentrace podléhá cirkadiánním změnám, odběr krve před 09:00 hod., nalačno • Využití: a) odhalení časných změn kostního obratu žen v menopauze, detekce žen s vysokým rizikem kostních ztrát a osteoporotických zlomenin b) monitorování úspěšnosti léčby osteoporózy - výrazný a rychlý ↓ hladiny (o 35-55 %) c) časný záchyt kostních meta u Ca prostaty a prsu
Telopeptické fragmenty (NTx)
• Hodnocení stupně osteoresorpce, odbourávání kolagenu, alternativa k CTx • ↑ koncentrace: osteoporóza, osteomalacie, m. Paget, hyperparatyreóza, tyreotoxikóza, nádory skeletu, meta do skeletu • Využití: a) monitorování léčby osteoporózy antiresorpčními léky (↓ U-NTx o 45-65 %) b) predikce kostních ztrát a fraktur • RIA, ELISA, koncentrace závisí na cirkadiánním rytmu, sérové koncentrace neklesají tak výrazně jako močové
Syntéza vitamínu D cholesterol
7-dehydrocholesterol – provitamín D UVB záření 290-315 nm
kůže cholekalciferol = vitamín D3
játra, 25-hydroxyláza
rostliny, kvasinky
25-(OH) cholekalciferol = kalcidiol 25-(OH) vitamín D3 Roche, Elecsys 25-(0H) Vit. D3
nízké kalcium ergosterol = vitamín D2
nízký fosfát
ledviny, 1-α-hydroxyláza 1,25-dihydroxycholekalciferol = kalcitriol 1,25-(OH)2 vitamín D3 Zdroj: Thomas L., Labor und Diagnose, 6. Auflage, 2005
PTH 25-(OH) vitamín D2
aktivní metabolity
1,25-(OH)2 vitamín D2
V plazmě vitamíny D3 a D2 vázány na vitamin-binding-protein → transportovány do jater a ledvin.
25-(OH): hlavní zásobní forma vitamínu D v těle. Měří se v krvi pro určení celkových zásob vitamínu D. Nejlépe vypovídá o zásobení organismu vitamínem D. Biologický poločas v krvi cca 3 týdny.
Zdroje: Thomas L., Labor und Diagnose, 6. Auflage, 2005
Zima T. a kol., Laboratorní diagnostika, 2. vydání, 2007
Vitamín D • > 95 % 25-(OH) vitamínu D měřitelných v séru tvoří 25-(OH) vitamín D3, zatímco 25-(OH) vitamín D2 dosahuje měřitelných hladin jen u pacientů se suplementací vitamínem D2. • 1,25-(OH)2 vitamín zvýšený u pacientů se suplementací vitamínu D, nikoli forma 25-(OH) vitamín D. • Vitamín D: podílí se na metabolismu kalcia a fosfátů, které mají četné metabolické úkoly v těle.
Hladiny vitamínu D v krvi
Fyziologické hodnoty: v létě v zimě
100 - 300 nmol/l 50 - 150 nmol/l
• Doporučená hladina: 60 – 200 nmol/l (24 – 80 ng/ml) • Mírná insuficience: 25 – 60 nmol/l (10 – 24 ng/ml) • Středně těžká insuficience: 12,5 – 25 nmol/l (5 – 10 ng/ml) • Těžká insuficience: < 12,5 nmol/l (< 5 ng/ml) • Toxické hladiny: > 500 nmol/l (> 200 ng/ml) Tkáňové koncentrace 25-(OH) vit. D jsou velmi nízké, sérové vysoké. Koncentrace vit. D 1,25-(OH)2 v séru až 1000x nižší, než vit. 25-(OH).
Doporučený příjem vitamínu D: RDA 400 IU / den Toxicita 10 000 - 40 000 IU / den
Insuficience až deficience vitaminu D se zjišťuje u třetiny zdravé evropské populace, a to ve všech věkových kategoriích. Uvádí se však až u dvou třetin hospitalizovaných osob.
Zdroj: Zima T. a kol., Laboratorní diagnostika, 2. vydání, 2007
Lehká insuficience • Jedním z prvních příznaků jeho skrytého nedostatku je nízká hladina vápníku a fosforu v krevním séru a současně zvýšená aktivita alkalické fosfatázy. • Tento stav je manifestován svalovou slabostí a ztuhlostí a také zvýšenou citlivostí k infekcím. U dětí se mohou vyskytovat nespecifické symptomy, např. roztěkanost, dráždivost, nadměrná potivost a zmenšená chuť k jídlu. • Nedostatek může vést ke zvýšené křehkosti kostí ve stáří.
Chronická insuficience vitamínu D nádory sekundární hyperparathyreoidismus
sekundární osteoporóza
rachitis
deprese
roztroušená skleróza DM I. typu
osteomalacie svalová slabost a pády starších osob
m. Parkinson
revmatoidní arthritis
Sjőgrenův sy thyreoiditis
Klinické využití stanovení vit. D • Podezření na deficit: hypokalcemie, hypofosfatemie, hypokalciurie, zvýšení ALP, rtg známky přestavby kostí Důvody: nedostatek oslunění, malabsorbční sy, léčba antiepileptiky, barbituráty, nefrotický sy, dialýza, … • Podezření na intoxikaci vit. D • Pomocné vyšetření k posouzení kostního metabolismu u metabolických onemocnění skeletu: - renální osteodystrofie • Pomocné vyšetření v dg. primární vs sekundární hypera hypoparathyroidismus • Pomocné vyšetření pro odlišení primární vs. sekundární osteoporózy Zdroje: Masopust J. Klinická biochemie, 2004
Zima T. a kol., Laboratorní diagnostika, 2. vydání, 2007
Patologické snížení hladiny
Zdroj: Masopust J. Klinická biochemie, 2004
Příčina
25-(OH)-D
Patofyziologické poznámky
Nedostatečný přívod nebo vstřebávání vitamínu D
Nutriční rachitida; nedostatek slunečního svitu 50-20 (často u starých lidí zlomeniny krčku os (těžká forma femoris). Při malabsorpčním. syndromu i < 20) (celiakie, atrofie sliznice, steatorea) < 50
Snížení pro malabsorpci i pro nedostatečnou 25-hydroxylaci v játrech
Ovlivnění hydroxylace v játrech
< 50
Dlouhodobé podávání hydantoinátů (antiepileptika), barbiturátů, dále nitrosourey a rifampicinu.
Zvýšené ztráty transkalciferonu močí
< 50
U nefrotického syndromu jsou zvýšené ztráty 25-(OH)-D vázajícího proteinu
Biliární cirhóza
Zvýšená tvorba dihydroxyderivátu z 25-(OH)-D
Při hyperparatyreóze se stimuluje hydroxylace pozici 1α a v pozici 24 a vznikají tak 1,25-(OH)2D a 24,25-(OH)2D
Pseudodeficit vitamínu D • Vrozené vady metabolizmu vitaminu D. Např. vitamín D dependentní rachitis. • VDDR typ I: klasický deficit tvorby 1-α-hydroxylázy 25-(OH)-vit. D (autosomálně recesivní dědičnost). Gen kódující 1-α-hydroxylázu lokalizován na 12. chromozomu. Nemocní mají normální nebo zvýšené koncentrace 25-(OH)-vit. D a nízké hladiny kalcitriolu. • VDDR typ II.: mutace genu zodpovědného za intracelulární receptor pro kalcitriol. Normální hodnota 25-(OH)-vit. D, koncentrace cirkulujícího kalcitriolu významně zvýšena. • Vitamín D dependentní rachitidy: typické klinické, laboratorní a rentgenové nálezy jako deficitní křivice, a to přes doloženou suplementaci vitamínem D a nepřítomnost malabsorpčního syndromu. •
Koncentrace 1,25-(OH)2D3 v séru se má měřit u dětí, u kterých se rachitida jeví jako rezistentní vůči terapeutickým dávkám vitamínu D. U obou typů onemocnění se zjišťuje rachitis s hypokalcémii, hypofosfatémii a vzestupem hladiny alkalické fosfatázy. Bývá přítomna sekundární hyperparathyreóza, někdy i povšechně zvýšená aminoacidurie. Zdroj: Zima T. a kol., Laboratorní diagnostika, 2. vydání, 2007
Patologicky zvýšené hladiny • Intoxikace vitamínem D při nadměrné suplementaci • Biogeneze vitamínu D3 v kůži pod vlivem UV-záření nemůže vytvořit toxickou hladinu (tj. více než 373 nmol/l).
Test s terapeutickou odpovědí vitamínu D
Užívá se pro ověření diagnózy primární hyperparatyreózy. Princip: Po aplikaci vitamínu D dochází pod vlivem PTH ke konverzi 25-(OH)-D3 na 1,25-(OH)2D3 v ledvině s jeho následným účinkem na cílové orgány. Provedení: Pacientovi se podá 5 mg kalciferolu a sleduje se S-Ca po dobu 6 dní. Hodnocení: U jedinců bez zvýšeného PTH nedochází k výraznějšímu vzestupu kalcemie. Při hyperparatyreóze dochází k plynulému vzestupu S-Ca. Zdroj: Masopust J. Klinická biochemie, 2004
Role vitamínu D v prevenci nádorů • Metaanalýzy klinických studií: jedinci se sérovými hladinami 25-(OH)-D ve výši cca 52 ng/ml měli o 50 % nižší riziko rakoviny prsu ve srovnání s jedinci se sérovými hladinami < 13 ng/ml. • Protektivní hladiny odpovídají příjmu cca 4000 IU/den. Tento externí přívod přesahuje horní limit doporučení National Academy of Sciences, který je 2000 IU/den. • Hladina 25-(OH)-D 52 ng/ml může být dosažená denní příjmem 2000 IU a při denním pobytu na slunci alespoň 12 min. odpovídá perorálnímu příjmu 3000 IU vitamín D3. • ZÁVĚR: Denní příjem 2000 IU vitamínu D3 a pokud možno mírná denní expozice slunci může vést ke zvýšení sérových hladin 25-(OH)-D na 52 ng/ml, což je hladina spojená se snížením rizika rakoviny prsu o 50 %. Zdroj: Garland CF: Vitamin D and prevention of breast cancer: Pooled analysis.
J Steroid Biochem Mol Biol. 2007 Mar;103(3-5):708-11.
Role vitamínu D v prevenci nádorů • Dřívější studie, např. WHI, ukázaly, že nízké dávky vitamínu D nemají protektivní efekt vůči kolorektálnímu karcinomu. Níže uvedená metaanalýza ukázala, že vyšší dávky mohou snížit jeho incidenci. • Data ukazují, že denní příjem 1000-2000 IU/den vitamín D3 a mírná expozice slunci může snížit incidenci karcinomu kolorekta na minimum.
Zdroj: Gorham ED et al. Optimal vitamin d status for colorectal cancer prevention a quantitative meta analysis. Am J Prev Med. 2007 Mar;32(3):210-6.
Jedna perlička • Palomba 2005: Účinnost některých antiresorpčních léků používaných v léčbě postmenopauzální osteoporózy je závislá i na genetické výbavě žen. • Genový polymorfismus receptoru pro vitamín D způsobuje rozdílnou účinnost antikatabolik u žen s postmenopauzální osteoporózou. • Studovány HRT, bisfosfonáty, raloxifen
Zdroj: Palomba S. et al.: BsmI vitamin D receptor genotypes influence the efficacy of antiresorptive treatments in postmenopausal osteoporotic women. A 1-year multicenter, randomized and controlled trial Osteoporos Int (2005) 16: 943-952
Léčiva s vitamínem D na českém trhu D2
D3
Calciferol (ergokalciferol)
Alpha D3 (kalcidiol)
Infadin (ergokaciferol)
Calcijex (kalcitriol)
Vitamin AD Slovakofarma (ergokalciferol)
Osteod (kalcitriol)
Vitamin D Slovakofarma (ergokalciferol) Rocaltrol (kalcitriol) Tachystin (dihydrotachysterol, analog D3) Vigantol (cholekalciferol)
Volně prodejné léky, doplňky výživy s vitamínem D na českém trhu
D2 Pharmaton Geriavit (ergokalciferol)
D3 MultiTabs Multivitamín (cholekalciferol) Pikovit (cholekalciferol) Duovit (cholekalciferol) Osteocare (cholekalciferol) Caltrate (cholekalciferol) Centrum (cholekalciferol)
Metody stanovení 25-(OH)-vit. D3 • RIA • HPLC • ELISA • ECLIA – plně automatická metoda
Přístroj Elecsys®
Elecsys® Vitamin D3 25-(OH)
Podíl vyšetření vitamínu D3 Stát
D3 podíl na trhu
Nizozemí
99
Belgie
96
Španělsko
92
SRN
92
Francie
91
Švýcarsko
81
Rakousko
60
Velká Británie
55
USA
43
Japonsko
40
Turecko
24
Portugalsko
21
Zdroj: Copyright© 2003. IMS. Health Incorporated or its affiliates. All rights reserved. MIDAS 18/11/04
Stanovení 1,25-(OH)2 vit. D3 • V klinické praxi zpravidla není stanovení kalcitriolu v séru indikováno. • Při diferenciální diagnostice hyperkalcemického syndromu se doporučuje měřit S-kalcitriol, pouze když nejsou zvýšené koncentrace S-PTH, S-PTHrP a S-25-(OH)-vit. D3 (hyperkalcemie způsobená předávkováním kalcitriolem, při sarkoidóze nebo jiných granulomatózách, nebo vzácně při hypersekreci kalcitriolu v nádorech). • Koncentrace S-kalcitriolu nevypovídají o zásobení organismu vitamínem D, mohou být normální jak při deficitu vitamínu D, tak při intoxikaci tímto vitamínem.
Zdroj: Zima T. a kol., Laboratorní diagnostika, 2. vydání, 2007
Další kostní markery • Deoxypyridinolin = lyzylpyridinolin (DPD)
• Kostní sialoprotein
• Degradační produkt kolagenu ☞ přestup do krve a do moče
• Glykosidy hydroxylyzinu
• Stanovení pouze z moči • Hodnocení stupně osteoresorpce – méně specifické než ϐ-CrossLaps • Podléhá cirkadiánním změnám, fotosenzitivní analyt • ELISA, RIA, HPLC
• Hydroxyprolin (U) • TRACP • Vápník (S), kalciurie • Fosfor (S), fosfaturie, renální tubulární reabsorpce • Mg (S) • PTH • IL-1, IL-6, IL-18, TNF, interferon gama, … = výzkumné účely
Pyridiniové spojky kolagenu • Deoxypyridinolin = lyzylpyridinolin (DPD), pyridinolin = hydroxylyzylpyridinolin (PYD) • Při osteoresorpci - můstky proteolyticky oddělovány od vláken kolagenu ☞ přestup do krve a do moče, stanovení pouze z moči • Hodnocení stupně osteoresorpce – méně specifické než ϐ-CrossLaps • Využití: DPD (U) – vysoce specifický marker pro kosti, často používaný a) monitoring léčby m. Paget bisfosfonáty b) záchyt kostních meta Ca prosu, Ca mammy c) vyhledávání rizikových žen po menopauze • Podléhá cirkadiánním změnám, fotosenzitivní analyt! • PYD – není specifický pro kosti, rovněž ve svalech, vazivech a kardiovaskulárních tkáních • ELISA, RIA, HPLC
Kostní sialoprotein • Tvoří 5-10 % nekolagenních proteinů kostní matrix. • Hodnocení stupně osteoresorpce • Monitorování léčby bisfosfonáty • Klinický význam zatím málo validní • RIA, ELISA
Hydroxyprolin
• Ukazatel metabolismu kolagenu • Silně ovlivněn potravou • Méně specifický marker osteoresorpce (24-h U) • U dětí: vyšší hodnoty během růstu, velké interindividuální rozdíly • Vyšší hodnoty u kostních meta nebo mnohočetném myelomu • Kolorimetrie, HPLC • Nahrazen citlivějšími a specifičtějšími markery
Glykosidy hydroxylyzinu
• Málo validní marker osteoresorpce (U) • HPLC
Tartarát-rezistentní kyselá fosfatáza
• Izoenzymy v krvi: trombocytový, erytrocytový, prostatický (při Ca prostaty), kostní (produkt osteoklastů) • Hodnocení stupně osteoresorpce • ↑ hladiny: primární hyperparatyreoidismus, renální osteodystrofie, meta do kostí, m. Paget, m. Gaucher, trombocytopenie • Spektrofotometrie, ELISA
Parathormon • Identifikace pacientů s rizikem osteoporózy diferenciální dg. poruch kalciového/fosfátového metabolismu dg. renální osteodystrofie • Elecsys®PTH: CV <6 %, intra-operační stanovení (9 min.)
Hladiny kostních markerů u různých osteopatií Roche heterogenní imunoanalýza
1
Roche klinická biochemie
Mimo nabídky Roche
PTH
Vitamin 25(OH)-D3
ß-CrossLaps
PINP
Osteokalcin
Ca
P
ALP
Kostní ALP
Osteoporóza
N
N
+
(+)
+
N
N
N
N/(+)
Senilní osteoporóza
(+)
(-)
+
(+)
(+)
N
N
nd
(+)
Osteomalacie
+
(-)
+
+
+
(-)
-
(+)
+
Osteogenesis imperfecta
N
n.d.
(+)
+
N
N
N
N
N
Pagetova choroba Hyperparathy roidismus nebo hyperkalcémie
N
N
+
++
(+)
N
N
+
+
+
N
+
n.d.
+
+
-
+
+
Renální osteodystrofie
+
(-)
(+)
(+)
N
(-)
+
(+)
(+)
(-)
N+
Meta skeletu +NN = normální hladina n.d. = neznámá data
+ (+)
++ N = zvýšená hladina = mírně zvýšená hladina
+ (-)
N(+) (+) = snížená hladina = mírně snížená hladina
(+)
• Alkaline Phosphatase (AP) is not considered a specific marker as AP is not bone specific. Bone AP (BAP) can be replaced by P1NP. Both are bone formation markers.
Source: L. Thomas, Clinical Laboratory Diagnostics (1998); 1C. Merlin, Osteoporosis (1998)
Preanalytické faktory • Neovlivnitelné: věk, pohlaví, menopauza, rasa, geografické vlivy, zlomeniny, těhotenství, kojení, léky, imobilizace, metabolické změny v jiných tkáních, poruchy funkce ledvin, jater, …
• Ovlivnitelné: cirkadiánní rytmus markerů, strava, sezónní vlivy, několikaleté cykly, tepelné podmínky skladování vzorku, UV záření, hemolýza vzorků, ...
Preanalytické faktory - věk • Kostní + chronologický věk, pohlavní dospívání, tělesná hmotnost + výška – nezávislé prediktory vývoje kostní hmoty a stupně remodelace • Všechny biochemické markery osteoformace i osteoresorpce – u dětí a dospívajících >> než v dospělosti • Puberta: osteomarkery závisejí více na stadiu pohlavního zrání než na chronologickém věku • Po 30. roce věku: stabilní hodnoty osteomarkerů • Ženy: ↑ osteomarkerů po menopauze
Preanalytické faktory - pohlaví
• Před pubertou: obdobné hodnoty markerů u chlapců i dívek • V pubertě: markery u chlapců > dívek • Po pubertě ↓ hladiny osteomarkerů pomaleji u chlapců než u dívek • Muži: nejnižší hodnoty markerů osteoresorpce mezi 30.- 50. rokem věku • Muži: nejnižší hodnoty markerů osteoformace mezi 40.- 60. rokem věku • Po 50. roce věku: markery osteoresorpce asi o polovinu ↑ u žen než u mužů
Preanalytické faktory etnické a geografické vlivy
• Markery osteoresorpce: černé děti < bílé děti • V dospělosti ± stejné hodnoty • Po menopauze: černošky < bělošky • Bělošky v Kanadě > Bělošky v SRN, Španělsku
Preanalytické faktory - zlomeniny
• Hodnoty markerů se mění během hojení zlomenin. • U starých osob se ↑ S-OC a S-kostní ALP v prvních dnech po zlomenině kyčle. Vyšší hodnoty přetrvávají celý rok. Méně se zvyšují markery osteoresorpce. • Stupeň zvýšení markerů se liší při různých zlomeninách.
Preanalytické faktory gravidita + laktace • Kostní remodelace matky ↑ ve II. trimestru • Markery osteoresorpce se zvyšují dříve než markery osteoformace • Další zvýšení ve III. trimestru • ↓ markerů pomalejší u kojících než nekojících žen
Preanalytické faktory - léky • Kortikosteroidy – ↓↓ markerů novotvorby kosti • Antikonvulziva - ↑ markerů remodelace • Thiazidová diuretika: ↓ remodelace • Hormony štítné žlázy: ↑ markerů resorpce • Heparin: ↓↓ markerů novotvorby (tyto změny nenavozuje warfarin) • GnRH agonisté u žen před menopauzou: ↑↑ markerů remodelace
Preanalytické faktory - imobilizace
• ↑↑ osteoresorpce • Markery resorpce ↑ již po 2 – 4 dnech znehybnění, po týdnu ↑ o dalších 30-50 % • Po opětné mobilizaci se přechodně ↑
markery osteoresorpce pomalu ↓, PICP
Preanalytické faktory poruchy funkce jater a ledvin • Renální insuficience = ↓ vylučování OC, PYD, DPD, CTx, NTx ⇒ kumulace v plazmě • Jaterní poruchy: ovlivnění markerů metabolizovaných v játrech: S-kostní ALP, PICP, PINP, TRACP
Preanalytické faktory cirkadiánní rytmy • Kostní remodelace podléhá diurnálním rytmům ⇒ odběr biologického materiálu nutný ve stejnou denní dobu (nejlépe nalačno, v 7-9 hod.). Kolísání hodnot jednoho markeru při odběrech v různou denní dobu se může lišit až o 50 %. • Koncentrace vápníku: nejvyšší v 13:00 hod., nejnižší ve 3:00 hod. • Vrchol PTH: v časných ranních hodinách • Fosfáty: minimální koncentrace v 11:00 hod., maximum ve 3:00 hod. • Markery osteoresorpce: maximum 2:00 – 8:00 hod., minimum 14:00 – 23:00 hod. • Markery novotvorby: maximum 2:00 – 4:00 hod., minimum 12:00 – 16:00 hod.
Vliv potravy na hladinu kostních markerů
Sérum vs moč • Kostní markery stanovené v séru a moči spolu dobře korelují. • Sérové markery: ↓ variabilita, snadnější odběr vzorku chyby ve srovnání s močovými markery
snížení analytické
• Eastell et al. (2000): sledování intraindividuální variability NTx v séru a moči: ☺ dlouhodobý CV S-NTx – 7,5 % dlouhodobý CV U-NTx – 15,6 % • Clowes et al. (2002) prokázal, že při léčbě antiresorpčními léky „least significant change (LSC)“ je nižší u sérových, než u močových markerů. •
LSC močové markery ~ 50%
•
LSC sérové markery ~ 25% Zdroj: Peichl P et al. Clin Biochem, 2001;34:131-139
Eastell R et al. J Bone Miner res. 2000;15:594-598 Clowes JA et al. Bone. 2002 ;30:886.-890
Sérum vs moč • Sérové hodnoty vykazují nižší variabilitu Elecsys® β-CrossLaps sérum
0.6 0.5
ES β-CrossLaps moč ng/mL
nmol/mmol krea
střední hodnoty všech pac.
12 10
0.4
8
0.3
6
0.2
4
0.1
2
0.0 14:00 16:30 19:00 21:30 23:30 2:00 4:30 8:00 10:30 12:30
0
čas
Zdroj: Roche 2000
Preanalytické faktory několikaleté cykly • Typické pro ženy po menopauze • V perimenopauze ↑ kostní remodelace • V prvních dvou letech menopauzy ↑ markerů osteoresorpce • V 5. roce menopauzy procesy resorpce a formace v rovnováze • Pak v několikaletých cyklech – střídání fáze zvýšené a snížené remodelační aktivity • Po 10-12 letech menopauzy – akcelerace úbytku kostní hmoty
Monitorování úspěšnosti léčby osteoporózy
4. Clinical Application of Roche Bone Markers
Kontrola compliance pacienta Posouzení rizika zlomenin
• IOF (International Osteoporosis Foundation) doporučuje kostní markery ke sledování úspěšnosti podávané terapie a predikci osteoporotických fraktur. • Kostní markery umožňují posoudit aktivitu kostní novotvorby nebo ztráty kostní hmoty. • Kostní markery nenahrazují stanovení denzity kostní hmoty (BMD), ale jsou doplňkovým vyšetřením, které poskytuje informace o intenzitě ztrát kostní hmoty.
Proces kostní remodelace
Osteoresorpce
2. Aktivace
CTx 3. Kostní resorpce
1. Klidová fáze
Osteokalcin
Vitamín D
6. Klidová fáze
4. Obrat fází
PNIP
Osteoblastická aktivita 5. Osteoformace
IOF Guidelines Monitorování terapie • Hladina kostních markerů před začátkem léčby a po 3 měsících (markery resorpce) nebo 6 měsících (markery osteoformace) trvání léčby (S, U) • Doporučení dvou měření na začátku terapie. • Sérové markery: odběr před 9:00 hod. po celonočním hladovění • Resorpce:
β-CrossLaps & NTx (pro léčbu bisfosfonáty) β-CrossLaps, NTx a DPD (pro HRT)
• Novotvorba:
kostní ALP, osteokalcin, PINP/PICP (anabolická léčba)
• Cut-Off :
nárůst kostní hmoty o 3 % (při 90% specifičnosti) ⇒ sérové hladiny markerů příčných spojek musí ↓ o 35-55 %, o 20-40 % osteokalcin nebo kostní ALP
Předpověď patologických zlomenin Markery resorpce: průměr + 2 SD → dvojnásobné riziko vzniku osteoporotické zlomeniny Zdroj: Delmas et al. (2000), Osteoporos Int. 6
Sledování efektu léčby (CTx) Antiresorpční léčba • Pacienti léčení ibandronátem vykazují výrazný pokles CTx již po třech týdnech účinné léčby. • >35-55% pokles hladin v porovnání se vstupními hodnotami znamená terapeutický úspěch. • Náhlé přerušení léčby u nespolupracujícího pacienta vede bezprostředně ke zvýšení hladiny CTx (β-Cross-Laps), což ukazuje vysokou senzitivitu tohoto markeru. • Stejnou křivku dostaneme i při léčbě jinými bisfosfonáty. Zdroj: Tanko LB, et al: Bone 2003;32:687-93
Sledování efektu léčby (PINP) • Anabolická léčba (PTH):
Pacienti léčení PTH vykazují 150% vzestup hladin PINP již tři měsíce po začátku účinné léčby. >40% zvýšení hodnot oproti vstupním hladinám ukazuje léčebný úspěch.
• Antiresorpční léčba:
Pacienti léčení alendronátem vykazují výrazný pokles PINP. Snížení hladiny markeru osteoformace ukazuje normalizaci kostního obratu a tedy léčebný úspěch. Při antiresorpční léčbě se snižují hladiny markerů osteoresorpce i osteoformace. >40% snížení hodnot oproti vstupním hladinám ukazuje léčebný úspěch.
Zdroj: Black DM, et al.: N Eng J Med 2003;349:1207-15
Hodnocení rizika zlomenin Hladiny osteomarkerů u postmenopauzálních žen v predikci ztrát kostní hmoty v oblasti předloktí • Ženy po menopauze s vysokým kostním obratem (> průměr + 2 SD = 2- až 6-násobně vyšší ztráty kostní hmoty), u kterých byly sledovány různé osteomarkery:
S-CTX U-CTX vysoký kostní obrat U-NTX
nízký kostní obrat
S-PINP S-Osteokalcin -3
-2.5
-2
-1.5
Zdroj: Garnero et. al (1999), J Bone Miner Res.
-1
-0.5
0 % ztrát BMD (4 roky)
Compliance pacienta • Responder:
Pacient s pozitivní odezvou na léčbu. Hladina CTx snížena po celou dobu léčby.
• Nespolupracující pacient:
Pacient nejdříve užívá předepsané léky a vykazuje odpovídající pokles hladin CTx. Zvýšení hladin ve 12. týdnu ukazuje na přerušení užívání léčby.
• Non-Responder nebo nespolupracující pacient:
bez poklesu CTx. Pacient buď neužívá léky, nebo na léčbu nereaguje.
Zdroj: Tanko LB, et al: Bone 2003;32:687-93
Využití kostních markerů Kostní denzitometrie (BMD) Většinou pro screening
Screening & Hodnocení rizika zlomenin Dostatek důkazů pro hodnocení rizika zlomenin 1 Nejlépe v kombinaci s BMD 2
Zlatý standard pro diagnózu 3
Diagnóza
Nedoporučeny 1
Kostní markery
Hodnotitelné změny dostupné za 1-2 roky 4,5
Monitoring
Ideální využití kostních markerů; průkazné změny dostupné po 3 měsících léčby 1
1. Delmas PD, et al. Osteoporos Int. 2000;6:S2-S17., 2. Kanis JA. Lancet. 2002;359:1929-1936. 3. US Department of Health and Human Services. Bone Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Rockville, MD: US Department of Health and Human Services, Office of the Surgeon General; 2004. 4. Christgau S, et al (2000) Bone Vol.26, No.5 5. Roux C, et al. (2005) Joint Bone Spine 72: 26–31
Srovnání osteomarkerů s BMD Kostní markery Pro • jednoduché měření • předpověď kostních ztrát a rizika zlomenin • monitorování léčby & compliance pacienta • doporučeny IOF
Proti • vysoká intraindividuální variabilita (mimo PINP) • nejasné cut-off hodnoty • (pro intraindividuální variabilitu) • vliv preanalytiky
Bone Mineral Density (BMD) Pro • „zlatý standard“ (WHO) • posouzení kostního obratu v různých oblastech těla • jasné cut-off hodnoty • BMD koreluje s rizikem fraktur
Proti • statické měřítko • často nepřesné hodnoty (2-3 %) • různé metody měření → rozdílné výsledky • zhodnocení efektu léčby – až po 2 letech • zachytí osteoporózu příliš pozdě
Nabídka kostních markerů Roche Diagnostics
Strava • ryby • vejce • mléko Strava • mléčné výrobky • maso
ß-CrossLaps
Vápník
PINP Osteokalcin
PTH
Vitamín D (25-(OH)-D3)
Fosfáty
ALP Other Factors - sex hormones Pohlavn í hormony: - growth hormones E2, testosteron - calcitonin SHBG, DHEA-S - life style
Automatické stanovení kostních markerů imunochemickými technikami na platformě Elecsys® zajišťuje spolehlivost kostních markerů s CV < 8 %.
Elecsys® β-CrossLaps
Elecsys® total P1NP
Elecsys® N-MID Osteocalcin
Elecsys® PTH
marker kostní resorpce
marker kostní novotvorby
marker kostního obratu
parathormon
žilní krev, odběr ráno, nalačno
žilní krev
žilní krev, odběr ráno, nalačno
žilní krev
střed
střed
50% percentil
15-65 pg/ml
premenopauz premenopauzálně lně
0.3 ng/ml
30.1 ng/ml
23 ng/ml
/
postmenopauz ostmenopauz.
0.6 ng/ml
45.05 ng/ml
27 ng/ml
/
muži (věk 5151-70)
0.3 ng/ml
-
24 ng/ml
/
Lower detection limit
0.01 ng/ml
< 5 ng/ml
< 0.5 ng/ml
1.20 pg/ml
< 8%
< 5%
< 7%
< 6%
Parametr
Krevní Krevní vzorek
Referenč Referenční hodnoty
Total Assay Precision CV
Automatizované Automatizované metody
Firma
Beckman
DPC
Abbott
Manuá Manuální lní metody Ortho Clinical
Bayer
tP1NP BAP CTx NTx
U
DPD
U
U
OC Vit D
ve vývoji
ve vývoji
Fosfáty
ne SWA
ne SWA
Vápník
ne SWA
ne SWA
PTH
ve vývoji
E2
ultra sensitivní
Testosteron
ultra sensitivní
DHEA-S SHBG
ve vývoji
Nordic Biosc
Orion
Ostex
