i
KARAKTERISASI GEN ODORANT RECEPTOR (OR) PARSIAL SERANGGA PENGGEREK BATANG PADI KUNING Scirpophaga incertulas (Walker)
ESA AYU PRATAMA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ii
ABSTRAK ESA AYU PRATAMA. Karakterisasi Gen Odorant Receptor (OR) Parsial Serangga Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan I MADE SAMUDRA. Penggerek batang padi kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae) merupakan serangga penting yang mengakibatkan kerusakan pada tanaman padi. Secara alami ngengat S. incertulas betina mengeluarkan feromon seks yang ditangkap oleh pheromone binding protein (PBP) yang terdapat pada hemolimfa antena S. incertulas jantan dan dikirim ke protein odorant receptor di membran dendrit sensila kemosensorik yang mendeteksi stimulus kimia. Tujuan penelitian ini adalah mengkarakterisasi gen Odorant Receptor (OR) yang memperantarai sistem informasi kimia pada perilaku kawin penggerek batang padi kuning S. incertulas. RNA diekstraksi dari antena ngengat jantan dan betina yang berasal dari Karawang dan pemeliharaan dilakukan di BB-Biogen. Amplifikasi cDNA dilakukan dengan standard PCR, touchdown PCR, dan touchdown-nested PCR. Karakterisasi parsial gen odorant receptor (OR) pada S. incertulas jantan berhasil dilakukan dengan teknik touchdown-nested PCR. Sekuen parsial OR S. incertulas yang berukuran 133 bp memiliki homologi dengan sekuen gen OR Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) OnubOR7a (Nomor Aksesi Genbank AB597005.1). Bagian gen OR S. incertulas yang homolog menunjukkan bahwa gen tersebut merupakan kandidat gen OR yang berfungsi sebagai mediator sistem informasi kimia pada perilaku kawin penggerek batang padi kuning S. incertulas. Penelitian ini juga berhasil mengamplifikasi gen beta-aktin yang berukuran 681 bp baik dari ngengat jantan maupun betina sebagai verifikasi keberhasilan ekstraksi RNA. Kata kunci: Crambidae, feromon, Scirpophaga incertulas, odorant receptor, touchdown-nested PCR
ABSTRACT ESA AYU PRATAMA. Characterization of Partial Odorant Receptor (OR) Gene of Yellow Rice Stem Borer Moth Scirpophaga incertulas (Walker). Supervised by RIKA RAFFIUDIN and I MADE SAMUDRA. Yellow rice stem borer S. incertulas (Lepidoptera: Crambidae) is an important insect causes the damage of the rice crop. The females of S. incertulas naturally release sex pheromones and then captured by pheromone binding protein (PBP) in the haemolymph of male antennaes; subsequently sent to the odorant receptor proteins located on the olfactory sensory neuron dendrites on the antennae sensillae membrane which detect the chemical stimuli. The aim of this study was to characterize the odorant receptor (OR) gene that mediates the chemical information systems on the mating behavior of S. incertulas. RNA was extracted from male and female imago antennaes collected from Karawang and from rearing in Indonesian Centre for Agricultural Biotechnology and Genetic Resources Research and Development (BB-BIOGEN). The OR gene amplification from cDNA was performed by standard PCR, touchdown PCR and nestedtouchdown PCR. The characterization of partial OR gene of S. incertulas male successfully performed by using touchdown-nested PCR. The OR partial gene sequence of S. incertulas revealed 133 bp size was homolog to the OR gene sequence of Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) OnubOR7a (GenBank Accession No. AB597005.1). The homologous part showed that 133 bp sequence of S. incertulas was a candidate of OR genes that mediated the chemical information systems on the mating behavior of yellow rice stem borer. This study also successfully amplified beta-actin gene sequence 681 bp size from both male and female insects as the verification to the success of RNA extraction. Keywords: Crambidae, odorant receptor (OR), Pheromone, Scirpophaga incertulas, touchdownnested PCR
iii
KARAKTERISASI GEN ODORANT RECEPTOR (OR) PARSIAL SERANGGA PENGGEREK BATANG PADI KUNING Scirpophaga incertulas (Walker)
ESA AYU PRATAMA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
iv
Judul
:
Nama NIM
: :
Karakterisasi Gen Odorant Receptor (OR) Parsial Serangga Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) Esa Ayu Pratama G34080011
Menyetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. NIP. 19670617 199203 2 001
Dr. Ir. I Made Samudra, M.Sc. NIP. 19601220 198903 1 001
Mengetahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S. NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
v
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan hidayat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Karakterisasi Gen Odorant Receptor (OR) Parsial Serangga Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker)”. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si dan Dr. Ir. I Made Samudra, M.Sc. selaku pembimbing atas bimbingan, nasihat, waktu, dan sarana yang telah diberikan. Terima kasih kepada Hibah Penelitian I-MHERE tahun 2012 atas nama Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si yang telah memberikan dana penelitian. Terima kasih juga saya sampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku penguji yang telah memberikan saran sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih kepada seluruh staf Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor terutama Ibu Tini, Ibu Ani, dan Bapak Adi atas bantuan dan sarana dalam pelaksanaan penelitian ini. Terima kasih kepada Bapak Jusuf dan Bapak Suwito yang sangat membantu pada saat koleksi sampel dan pemeliharaan S. incertulas di Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Bogor. Terima kasih kepada Bapak Wawan dari Departemen Proteksi Tanaman yang telah membantu saat koleksi sampel di Karawang. Terima kasih kepada Ibu Dr. Utut Widiyastuti untuk kesempatannya bekerja di Lab BIORIN. Terima kasih kepada Mbak Pevi Elvavina, Ibu Dr. Saleha Hanum M.Si, dan Kak Hayatul Fajri, S.Si atas seluruh bimbingan, nasihat, dan waktu diskusi yang telah diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua dan adik-adik yang senantiasa mencurahkan doa, kasih sayang, dukungan, dan semangat sehingga penulis mampu menyelesaikan karya ilmiah ini. Terima kasih untuk teman-teman Biologi angkatan 45, dan keluarga besar Biosains Hewan di Zoo Corner, Issanto Putra, S.Si, Rani Parawitasari Den Ka’a, Roby Saputra, S.P, dan Indah Prastiwi S.P atas bantuannya selama pemeliharaan serangga dan kegiatan di lab. Semoga karya ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan. Bogor, Februari 2013 Esa Ayu Pratama
vi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Seputih Banyak pada tanggal 15 Juni 1990 dari pasangan Sujiat dan Tri Supeni. Penulis merupakan anak pertama dari delapan bersaudara. Penulis lulus dari SMA Negeri 1 Kotagajah pada tahun 2008. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) mayor Biologi. Selama masa perkuliahan penulis aktif di berbagai organisasi kemahasiswaan sebagai Bendahara I Organisasi Mahasiswa Daerah Keluarga Mahasiswa Lampung (OMDA KEMALA) periode 2008-2009, Bendahara II Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 20092010, dan Bendahara I Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2010-2011, serta menjadi panitia dalam Open House Mahasiswa Baru IPB Angkatan 46 tahun 2009, IPB Green Festival 2009, Biologi Interaktif 2009 dan 2010, Lomba Cepat Tepat Biologi yang merupakan rangkaian kegiatan Pesta Sains Nasional 2009 dan 2010, dan Masa Perkenalan Departemen Biologi 2010 dan 2011. Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Genetika Dasar (2011), Fungsi Hayati Hewan (2012), Pengantar Genetika Molekuler (2012), dan Perkembangan Hewan (2012-2013). Selain itu, penulis juga mendapatkan prestasi sebagai Juara III Olimpiade Sains dan Teknologi Nasional Bidang Biologi tahun 2010, Juara II Mahasiswa Berprestasi Departemen Biologi tahun 2011, peraih medali perunggu (Juara III) Olimpiade Nasional MIPA (ON-MIPA) Bidang Biologi yang diadakan oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan (Ditjen Dikti, Kemendikbud) pada tahun 2011, dan finalis Olimpiade Nasional MIPA (ON-MIPA) Bidang Biologi yang diadakan oleh Ditjen Dikti, Kemendikbud pada tahun 2012. Penulis melaksanakan studi lapangan di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran pada tahun 2010 yang berjudul “Pengembangan Produk Kerajinan Berbahan Dasar Keanekaragaman Hayati dan Aspek Pelestariannya di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran” dan praktik lapangan di Taman Nasional Way Kambas pada tahun 2011 dengan judul “Aspek Biologi, Identifikasi Tumbuhan Pakan, dan Perawatan Gajah Sumatera (Elephas maximus sumatranus) di Pusat Latihan Gajah Taman Nasional Way Kambas”.
vii
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. viii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................................. viii PENDAHULUAN Latar Belakang............................................................................................................................ 1 Tujuan ........................................................................................................................................ 1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat ...................................................................................................................... 1 Bahan ......................................................................................................................................... 2 Koleksi Sampel S. incertulas....................................................................................................... 2 Pemeliharaan S. incertulas .......................................................................................................... 2 Ekstraksi RNA ............................................................................................................................ 2 RT-PCR, Verifikasi mRNA, dan Amplifikasi cDNA................................................................... 2 Analisis Sekuen cDNA ............................................................................................................... 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Koleksi Sampel dan Pemeliharaan S. incertulas .......................................................................... 5 Verifikasi mRNA ........................................................................................................................ 5 Amplifikasi Gen OR ................................................................................................................... 6 SIMPULAN .................................................................................................................................. 9 SARAN ......................................................................................................................................... 9 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................... 9
viii
DAFTAR TABEL 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Halaman Daftar degenerate primer untuk gen Odorant Receptor (OR) S. incertulas ....................... 3 Jumlah antena S. incertulas yang dikoleksi dari sawah di Kabupaten Karawang dan pemeliharaan di BB-Biogen ................................................................................................. 5 BLASTn sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas yang berasal dari Karawang ............. 6 BLASTx sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas yang berasal dari Karawang ............. 6 BLASTn sekuen nukleotida OR S. incertulas yang berasal dari Karawang ........................ 8 Prediksi sekuen protein Ostrinia nubilalis OnubOR7a dengan menggunakan basis data PSORT ................................................................................................................................. 9
DAFTAR GAMBAR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Halaman Imago penggerek batang padi kuning S. incertulas ............................................................... 1 Posisi degenerate primer untuk mengamplifikasi gen OR S. incertulas pada sekuen gen OR Ostrinia furnacalis AB467327 (OfurOR1) ...................................................................... 4 Pita amplikon gen beta-aktin S. incertulas dengan suhu penempelan primer 73˚C diperkirakan berukuran 800 bp. M: marker 100 bp DNA Ladder ......................................... 5 Sekuen nukleotida gen beta-aktin S. incertulas asal Karawang ............................................. 6 Hasil amplifikasi cDNA bagian I OR S. incertulas ............................................................... 7 Sekuen nukleotida OR S. incertulas jantan asal Karawang .................................................. 7 Hasil alignment BLASTn OR S. incertulas jantan asal Karawang dengan Ostrinia nubilalis OnubOR7a (AB597005.1) ...................................................................................... 8
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Penggerek batang padi kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae) merupakan serangga penting pada tanaman padi di Asia termasuk di Indonesia (Gambar 1). Larva S.incertulas menginfestasi tanaman pada stadium vegetatif dengan menggerek pangkal batang padi muda sehingga aliran hara dan air ke tanaman bagian atas terganggu. Hal ini akan menyebabkan pucuk layu kemudian mati. Gejala serangan pada stadium ini disebut gejala sundep. Kehilangan hasil padi pada serangan fase vegetatif tidak terlalu besar dibandingkan dengan serangan yang terjadi pada fase generatif, karena tanaman masih mungkin untuk membentuk anakan baru. Pada stadium generatif, larva menggerek tanaman pada pangkal malai yang dapat menyebabkan aliran fotosintat dan air tidak sampai ke dalam malai padi, sehingga malai hampa dan mengering. Gejala serangan pada stadium ini disebut gejala beluk (Hendarsih & Sembiring 2007).
5 mm Gambar 1 Imago penggerek batang padi kuning S. incertulas Pengendalian serangga penggerek batang padi terutama menggunakan pestisida telah diketahui dapat membawa dampak negatif, misalnya bagi serangga non-target, predator dan juga meninggalkan residu bagi lingkungan (Cork et al. 2003). Selain itu, penggunaan pestisida juga tidak efektif mancapai serangga target karena larva yang menetas langsung masuk dan menggerek batang padi hingga berkembang menjadi pupa. Oleh karena itu, diperlukan cara lain untuk pengendalian, misalnya dengan memanipulasi perilaku kawin melalui pemanfaatan feromon seks sintetik.
Secara alami, serangga betina mengeluarkan feromon seks dari abdomen sebagai sinyal kimia yang dapat dikenali oleh sistem olfaktori (penciuman) serangga jantan. Hemolimfa pada antena S. incertulas jantan yang mengandung pheromone binding protein (PBP) mengikat feromon dari serangga betina dan dibawa ke protein reseptor di membran dendrit sebagai sinyal kehadiran serangga betina (Merrit et al. 1998). Odorant receptor (OR) merupakan protein membran yang terdapat pada permukaan dendrit sensila kemosensorik yang mendeteksi stimulus kimia (Garczynski et al. 2012). Serangga jantan merespon sinyal dengan mendekati serangga betina untuk berkopulasi. Penelitian terhadap gen OR S. incertulas merupakan suatu langkah penting untuk mengenali informasi kimia dalam sistem komunikasi serangga. Karakterisasi gen OR telah dilakukan pada beberapa spesies serangga, misalnya pada lalat buah Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) dan ulat sutera Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae) (Hallem et al. 2006). Gen OR pada Ostrinia spp. (Lepidoptera: Crambidae) juga telah dikarakterisasi dan didaftarkan ke bank data DDJB/GenBank/EBI (Miura et al. 2009). Pengetahuan sekuen DNA pada gen OR pada Ostrinia spp. dapat digunakan untuk mendesain primer untuk mengamplifikasi gen OR pada S. incertulas. Tujuan Tujuan penelitian ini adalah mengkarakterisasi gen Odorant Receptor (OR) yang memperantarai sistem informasi kimia pada perilaku kawin S. incertulas.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 hingga Oktober 2012 di Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Pemelihara-an S. incertulas dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BBBIOGEN), Bogor.
2
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah RNA yang diekstraksi dari antena S. incertulas yang dikoleksi dari sawah di Kabupaten Karawang dan Bogor. Koleksi Sampel S. incertulas Koleksi imago S. incertulas jantan dan betina dari sawah di Kabupaten Karawang dan Bogor dilakukan pada malam hari dengan menggunakan insect net dan juga dengan penangkapan langsung (hand capture). Pemeliharaan S. incertulas Imago asal Bogor dimasukkan ke dalam pot berdiameter 12 cm yang berisi tanaman padi varietas Pelita dan diberi sungkup berupa tabung plastik silindris agar dapat melakukan kopulasi. Sehari kemudian terlihat beberapa kelompok telur yang menempel di daun atau batang padi. Lima hari kemudian, kelompok telur diambil dengan cara memotong daun-daun tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu disumbat dengan kapas. Kelompok telur dibiarkan hingga muncul larva instar 1 yang berwarna hitam kecokelatan, yaitu sekitar 23 hari kemudian. Larva diinokulasikan ke dalam tanaman padi yang berumur 45 hari sebanyak 25 individu/pot dengan menggunakan tabung reaksi. Sebelum inokulasi, tanaman padi telah dipersiapkan sampai umur 45 hari pada pot berdiameter 30 cm. Pada hari ke-30 setelah inokulasi, tanaman padi ditutup dengan kasa nyamuk. Imago mulai keluar pada hari ke-38 setelah inokulasi, selama 23 hari. Setiap pagi ngengat yang berumur 1 hari dikoleksi untuk mendapatkan antena. Selanjutnya antena dipotong dan disimpan di dalam RNAlater® (Ambion) dan digunakan untuk ekstraksi RNA. Ekstraksi RNA RNA diekstraksi dari dua sumber, yaitu imago asal Karawang dan imago hasil pemeliharaan di Bogor. Total RNA diekstraksi dari 80-150 antena S. incertulas dengan menggunakan Kit RNAqueous®4PCR (Ambion). RNA diekstraksi dari antena ngengat jantan dan betina secara terpisah untuk mengetahui ekspresinya. Antena digerus dalam larutan lysis/binding dengan menggunakan grinder, lalu ditambahkan 1x volume etanol 64%, dipindahkan ke dalam filter cartridge dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1
menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 700 µL wash solution #1 dan 2x 500 µL wash solution #2/3 kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya RNA dielusi dengan 60 µL elution solution kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1,5 mL yang baru kemudian ditambahkan 0,1 µL Buffer DNase 1 dan 1 µL enzim DNase bebas-RNase (2 U/µL) untuk memurnikan RNA, lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,1 µL DNase innactivation reagent, diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang merupakan total RNA selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung baru. RT-PCR, Verifikasi mRNA, dan Amplifikasi cDNA RT-PCR. RNA hasil ekstraksi digunakan sebagai cetakan bagi sintesis cDNA melalui RT-PCR. Proses ini dilakukan dengan mencampur 5 µL RNA dengan 7,6 µL ddH2O-DPEC 0,1%, 2 µL primer oligo dT21 (5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’), 4 µL 5x buffer reaksi, 0,2 µL dNTP 10 mM, 1 µL dTT, dan 0,2 µL enzim Reverse Transcriptase-SuperScript III (Invitrogen) (200 U/ µL). Reaksi transkripsi balik (RT) dilakukan pada suhu 30 ºC selama 10 menit, 42 ºC selama 50 menit, dan 95 ºC selama 5 menit sebanyak 1 siklus dengan menggunakan mesin PCR Esco. Verifikasi mRNA. Verifikasi mRNA dilakukan dengan mengamplifikasi gen betaaktin menggunakan primer forward sBACT (5’AACTGGGATGCATGGGAAGATCTGGC3’) dan primer reverse aBACT (5’GAGATCCACATCTGCTGGAAGGTGGACA3’) (Miura et al. 2009). PCR dilakukan dengan mencampur 1,5 µL cDNA hasil RT-PCR dengan 4,65 µL ddH2O, 1 µL primer forward 10 µM, 1 µL primer reverse 10 µM, 1 µL buffer taq10x, 0,25 µL dNTP 10 mM, 0,4 µL DMSO, dan 0.2 µL enzim taq polimerase. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: denaturasi pra-PCR 95 ºC selama 5 menit, denaturasi 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer 73 ºC selama 1 menit, pemanjangan DNA 72 ºC selama 1 menit, dengan 35 siklus, pemanjangan pasca-PCR selama 5 menit, dan pendinginan 15 ºC selama 15 menit.
3
Amplifikasi cDNA. Amplifikasi gen OR S. incertulas dilakukan dengan menggunakan primer degenerate yang didesain berdasarkan gen OR Ostrinia spp. (Miura et al. 2009) yang telah didaftarkan ke bank data DDJB/GenBank/EBI dengan nomor aksesi AB467318 (OscaOR2), AB467319 (OlatOR2), AB467320 (OscaOR1), AB467321 (OzagOR1), AB467322 (OzeaOR1), AB467323 (OpalOR1), AB467324 (OovaOR1), AB467325 (OnubOR1), AB467326 (OlatOR1), dan AB467327 (OfurOR1). Sekuen OR Ostrinia digunakan untuk mendesain primer karena Ostrinia termasuk ke dalam famili yang sama dengan S. incertulas, yaitu Crambidae, sehingga diharapkan terdapat konservasi di antara keduanya. Gen OR pada Ostrinia spp. yang diketahui berukuran besar, yaitu 1280 bp (OfurOR1) dibagi menjadi empat bagian untuk mengoptimalkan amplifikasi pada 300-450 bp. Selanjutnya enam pasang primer degenerate didesain pada keempat bagian tersebut, yang terdiri atas empat pasang primer eksternal dan dua pasang primer internal. Posisi keenam pasang primer pada gen OR O. furnacalis AB467327 (OfurOR1) ditunjukkan pada Gambar 2 dan urutan nukleotida primer ditunjukkan pada Tabel 1. Terdapat tiga jenis PCR yang dilakukan untuk mengamplifikasi gen OR, yaitu standard PCR, touchdown PCR, dan touchdown-nested PCR. (1) Standard PCR mengamplifikasi bagian I OR S. incertulas dengan menggunakan pasangan primer eksternal OR_Os_F1 dan OR_Os_R1. Kondisi dan komposisi PCR gen OR sama dengan PCR gen beta-aktin, namun menggunakan suhu penempelan primer 50 ºC. (2) Touchdown PCR menggunakan komposisi PCR sama dengan standard PCR namun berbeda dalam hal pengaturan suhu penempelan primer yaitu menggunakan suhu penempelan primer yang bertingkat (53 ºC pada 10 siklus pertama, 50 ºC pada 10 siklus kedua, dan 47 ºC pada 10 siklus terakhir). Teknik PCR ini dilakukan untuk amplikon hasil standard PCR dengan konsentrasi rendah dan beberapa pita DNA. (3) Touchdown-nested PCR dilakukan dengan mengamplifikasi amplikon touchdown PCR dengan menggunakan pasangan primer internal (OR_Os_F1a dan OR_Os_R1a) dengan suhu penempelan primer sebesar 52 ºC. Kondisi dan komposisi PCR ini sama dengan standard PCR.
Tabel 1 Daftar degenerate primer untuk gen Odorant Receptor (OR) S. incertulas Nama
Sekuen primer (5'-3')
Primer eksternal 1.OR1_Os_F1 CTCCGCTATATGARGATGCTCAG 2.OR1_Os_R1 GYCTGTGGTGAAAGAGATGCAC 3.OR1_Os_F2 GTGGTCGGRTTGCAAAGAATTAC 4.OR1_Os_R2 CAGAARGCYAGGAGRCAGTCGT 5.OR1_Os_F3 CYCTSCCCTTCAACTACCAYAC 6.OR1_Os_R3 GTTACWGTCAAGKCTGCARATCG 7.OR1_Os_F4 ATGTTYCATCAAGTCRSCGGTTG 8.OR1_Os_R4 ATGGGCTCCTGCACGTTRTAGA Primer internal 1.OR1_Os_F1a CATAYAAGYTRCTGGGCGAGGA 2.OR1_Os_R1a GTAATTCTTTGCAARCCGACCAC 3.OR1_Os_F2a TCATATCRGCAAGCGATCAAGGA 4.OR1_Os_R2a GTRTGGTAGTTGAAGGSCAGRG
Hasil amplifikasi cDNA dipisahkan dengan elektroforesis PAGE 6% pada 200 V dalam 1x TBE selama 50 menit. Amplikon cDNA divisualisasi dengan pewarnaan sensitif perak nitrat Byun et al. (2009). Analisis sekuen cDNA DNA gen beta-aktin hasil amplifikasi disekuen ke perusahaan 1st BASE yang menerima jasa sekuen. Hasil sekuen (lampiran 1) diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0 lalu sekuen forward dan reverse cDNA beta-aktin S. incertulas disejajarkan menggunakan program Clustal X (Thompson et al. 1997) dan program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Homologi sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas dengan sekuen serangga lain dieksplorasi berdasarkan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST: blast.ncbi.nlm.nih.gov/) melalui BLASTn (homologi nukleotida) dan BLASTx (homologi protein) dengan pilihan organisme berdasarkan subset pencarian “Crambidae” sehingga pencarian dibatasi pada urutan dalam basis data yang sesuai dengan subset tersebut. Hasil sekuen OR S. incertulas diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0 lalu dianalisis dengan menggunakan program BLASTn untuk mengetahui kesamaan nukleotida dan BLASTx untuk mengetahui kesamaan protein dengan memasukkan subset pencarian “Ostrinia” (taxid: 29056) pada kolom organisme. Sekuen asam amino dari hasil BLASTn yang menunjukkan homologi dengan OR S. incertulas selanjutnya dianalisis berdasarkan software analisis protein Protein Subcellular Localization Prediction (WoLF PSORT: http://wolfpsort. seq.cbrc.jp/) yang merupakan ekstensi dari program PSORT II
4
F1
F1a
F2
Bagian I 1
R1a
F2a
F3
R1
Bagian II
319 bp
R2a
F4
R2
Bagian III R3
Bagian IV
448 bp 386 bp
R4 1280 250 bp
Gambar 2 Posisi primer degenerate untuk mengamplifikasi gen OR S. incertulas pada sekuen gen OR Ostrinia furnacalis AB467327 (OfurOR1)
5
untuk mengetahui prediksi lokalisasi protein di dalam sel. Asam amino dibandingkan dengan basis data sekuen protein UniProt (http://www.uniprot.org).
HASIL DAN PEMBAHASAN Koleksi Sampel dan Pemeliharaan S. incertulas Pemeliharaan S. incertulas yang telah dilakukan pada bulan Desember 2011-April 2012 menghasilkan 67 antena dari 64 imago jantan (ScRearM) dan 129 antena dari 63 imago betina (ScRearF). Sampel yang dikoleksi dari Karawang pada tanggal 26 Februari 2012 berjumlah 11 antena jantan (ScKrM) dan 142 antena betina (ScKrF) ditunjukkan pada Tabel 2. Seluruh antena yang berhasil dikoleksi kemudian diekstraksi sehingga dapat diketahui perbedaan ekspresi gen OR antara imago jantan dan imago betina. Menurut Miura et al. (2009), mRNA OscaOR1 Ostrinia spp. secara spesifik diekspresikan pada antena jantan, sedangkan mRNA OscaOR2 diekspresikan pada kepala larva, tungkai depan, belalai (proboscis) dan antena imago betina. Verifikasi mRNA berdasarkan Gen BetaAktin S. incertulas Sebelum mengamplifikasi gen OR, terlebih dahulu dilakukan amplifikasi gen beta-aktin yang merupakan house-keeping gene sehingga keberhasilan ekstraksi RNA dapat diketahui. Amplikon gen beta-aktin berukuran 800 bp muncul pada jantan (ScKrM) maupun betina (ScKrF) (Gambar 3), namun amplikon tersebut tidak muncul pada cDNA ScRearM maupun ScRearF. Hal ini disebabkan karena penyimpanan antena dalam larutan RNAlater® (Ambion) selama 3 minggu ternyata tidak cukup baik untuk mempertahankan kualitas RNA dalam sampel tersebut, sehingga untuk amplifikasi selanjutnya hanya dilakukan pada sampel ScKrM. Hasil sekuen amplikon gen beta aktin yang diperoleh berukuran 681 bp (Gambar 4). Hasil analisis homologi nukleotida menggunakan program BLASTn menunjukkan bahwa beta-aktin ScKrM homolog dengan skor alignment ≥ 200 untuk 100 BLAST hits pertama, dengan tiga hits teratas yaitu Spodoptera frugiperda (HQ008727.1), Helicoverpa armigera (HM629437.1), dan Papilio polytes (AK402249.1) dengan nilai
Tabel 2 Jumlah antena S. incertulas yang dikoleksi dari sawah di Kabupaten Karawang dan pemeliharaan di BB-Biogen Jumlah antenna Sumber antenna Jantan Betina Pemeliharaan di ScRearM: ScRearF: BB-Biogen 67 129 Karawang ScKrM: ScKrF: 11 142 Keterangan: ScRearM: imago S. incertulas jantan hasil pemeliharaan di BB-Biogen, ScRearF: imago S. incertulas betina hasil pemeliharaan di BB-Biogen, ScKrM: imago S. incertulas jantan dari sawah di Karawang, ScKrF: imago S. incertulas betina dari sawah di Karawang.
M
ScKrM ScKrF 1 2 3 4
1500 bp 800 bp
800 bp
500 bp
Gambar 3 Pita amplikon gen beta-aktin S. incertulas dengan suhu penempelan primer 73 ˚C diperkirakan berukuran 800 bp. M: marker 100 bp DNA Ladder e-value 0.0 (Tabel 3). E-value merupakan ukuran similiaritas sekuen, semakin rendah e-value menunjukkan semakin tinggi kesamaan sekuen query dengan BLAST hits. Nilai e-value 0.0 menunjukkan bahwa pencocokan sangat tepat untuk sekuen tersebut (Baxivanis & Quillette 2001). Sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas juga dianalisis dengan menggunakan program BLASTx. Melalui program ini diketahui bahwa sekuen betaaktin S. incertulas memiliki homologi dengan sekuen aktin O. scapulalis, Cnaphalocrocis medinalis, dan O. furnacalis (Lepidoptera:Crambidae) (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan adanya keselarasan antara hasil BLASTn dengan BLASTx. Adanya sekuen beta-aktin S. incertulas menunjukkan bahwa ekstraksi RNA telah berhasil sehingga amplifikasi gen OR dapat dilakukan.
6
>ScKrM_BACT_contig nukleotida CCTGACTGAG TGAAACCTTC CTCCGGTCGT CATCTACGAA CTTGACCGAC TGAGCGGGAA GCAGGAAATG CGGTCAGGTC TTCCTTCCTG GTGCGACGTT CATGTACCCC CATCAAGATC
GCCCCCCTGA AACTCCCCGG ACCACTGGTA GGTTATGCCC TACCTCATGA ATTGTTCGTG GCCACCGCCG ATCACCATCG GGTATGGAAT GACATCCGTA GGTATCGCTG AAGATCATCG
ACCCTAAGGC CTATGTATGT TCGTCTTGGA TTCCCCACGC AGATCCTTAC ACATCAAGGA CTGCCTCCAC GTAACGAGAG CGTGCGGCAT AGGACCTGTA ACAGGATGCA C
CAACAGGGAA AGCCATCCAA CTCTGGTGAT CATCCTCCGT TGAGAGGGGT GAAGCTTTGC CTCCCTGGAG GTTCCGTTGC CCACGAGACT TGCCAACACC GAAGGAAATC
AAGATGACCC GCCGTGCTGT GGTGTCTCTC CTGGACTTGG TACTCATTCA TATGTCGCTC AAGTCGTACG CCTGAGGCCC GTGTACAACT GTCATGTCCG ACCGCCCTCG
AAATCATGTT CCCTGTACGC ACACCGTACC CTGGCCGTGA CCACCACCGC TGGACTTCGA AACTTCCCGA TGTTCCAGCC CCATCATGAA GTGGTACCAC CTCCCTCCAC
ke60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 681
Gambar 4 Sekuen nukleotida gen beta-aktin S. incertulas yang berasal dari Karawang Tabel 3 BLASTn sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas asal dari Karawang Nomor Skor Skor Cakupan EDeskripsi aksesi maks total query value AK402249.1 Papilio polytes mRNA for 1024 1024 98% 0.0 aktin, muscle-type A1, complete cds HM629437.1 Helicoverpa armigera 998 998 100% 0.0 aktin mRNA, complete cds HM629436.1 Helicoverpa armigera 998 998 100% 0.0 aktin mRNA, complete cds L13764.1 Manduca sexta aktin 996 996 98% 0.0 mRNA, complete cds JN857938.1 Grapholita molesta aktin 992 992 100% 0.0 mRNA, partial cds
Ident maks 94%
93% 93% 93% 93%
Tabel 4 BLASTx sekuen nukleotida beta-aktin S. incertulas yang berasal dari Karawang Aksesi Deskripsi Skor Skor Cakupan EIdent maks total query value maks BAJ49799.1 Homolog aktin (Ostrinia 465 465 99% 6e-168 99% scapulalis) AEG78682.1 Aktin (Cnaphalocrocis 462 462 99% 4e-166 99% medinalis) AFJ19355.1 Aktin, parsial (Chilo 134 134 28% 1e-39 100% infuscatellus) ADB45332.1 Aktin (Ostrinia furnacalis) 132 132 27% 7e-39 100% ABY77908.1 beta-aktin (Maruca vitrata) 52.8 52.8 10% 2e-10 100% ADN83103.1 isositrat dehidrogenase 25.8 25.8 24% 2.1 23% (Noorda blitealis) Amplifikasi Gen OR Amplifikasi gen OR telah dilakukan pada bagian 1, 2 3, dan 4 (Gambar 2). Amplikon cDNA yang diperoleh, selain dari bagian 1 adalah pita cDNA yang tidak spesifik (multiband) dan tidak sesuai dengan ukuran amplikon target. Dengan demikian, karakterisasi selanjutnya dilakukan hanya pada bagian 1. Amplifikasi bagian 1 dengan metode standard PCR yang dilakukan pada suhu penempelan primer 50ºC menghasilkan amplikon multiband (Gambar 5a) dengan amplikon utama mendekati ukuran target,
yaitu 500 bp. Melalui PCR ini dapat diketahui bahwa amplikon OR_Os_F1 dan OR_Os_R1 hanya terdapat pada sumur 1 dan 2 yaitu cDNA ScKrM. Artinya, gen OR yang diamplifikasi hanya terekspresi pada antena S. incertulas jantan, tidak pada antena betina. Teknik PCR dimodifikasi dengan touchdown PCR yang merupakan PCR dengan suhu penempelan primer bertingkat, yaitu 53 ºC pada 10 siklus pertama, 50 ºC pada 10 siklus kedua, dan 47 ºC pada 10 siklus ketiga. Melalui teknik ini diperoleh
7
amplikon yang lebih spesifik, sehingga multiband berkurang, yaitu berukuran 600 bp dan 1500 bp (Gambar 5b) namun konsentrasinya rendah, sehingga dilakukan teknik ketiga yaitu touchdown-nested PCR. Teknik Touchdown-nested PCR merupakan teknik PCR yang menggunakan pasangan primer internal (OR_Os_F1a dan OR_Os_R1a) dan menggunakan amplikon touchdown PCR sebagai cetakan DNA. Amplikon yang tampak pada visualisasi PAGE 6% muncul sebagai pita tunggal yang berukuran 400 bp (Gambar 5c). Amplikon tersebut disekuen dan diedit sehingga pada kromatogram diperoleh sekuen yang memiliki puncak-puncak yang jelas. Sekuen tersebut berukuran 133 bp yang diduga merupakan sekuen parsial OR S. incertulas. (Gambar 6). Sekuen tersebut dianalisis dengan menggunakan program BLASTx namun tidak diperoleh hasil sekuen yang memiliki homologi. Oleh karena itu, sekuen nukleotida OR S. incertulas dianalisis dengan menggunakan BLASTn untuk mengetahui homologi nukleotidanya. Analisis dengan menggunakan program BLASTn menghasilkan 6 BLAST hits (Tabel 5), di antaranya adalah OnubOR7a (AB597005.1) yang merupakan gen OR serangga penggerek batang jagung Eropa O. nubilalis pada posisi keempat. Melalui M 1
2
3
penyejajaran dengan program BLASTn diketahui bahwa sekuen parsial gen OR S. incertulas homolog pada nukleotida ke 98133 dengan sekuen gen OR O. nubilalis OnubOR7a yang berukuran 18.320 bp (Gambar 7). Sekuen tersebut terdapat pada nukleotida ke 9798-9881 OnubOR7a. Gen OR OnubOR7a terpaut kromosom Z dan diketahui bertanggung jawab terhadap perilaku serangga jantan merespon feromon seks yang dikeluarkan oleh serangga betina secara konspesifik (Yasukochi et al. 2011). Sistem olfaktori memiliki peranan yang penting dalam kesuksesan reproduksi dan pertahanan hidup serangga, memperantarai respon terhadap pasangan lawan jenis, makanan, dan situs oviposisi (Hallem et al. 2006). Dalam sistem ini terdapat proses yang melibatkan dua stimulus utama, yaitu odorant dan feromon (Touhara & Vosshall 2009). Ngengat S. incertulas adalah serangga nokturnal yang sistem penglihatan dan pendengarannya tidak berkembang dengan baik, sehingga memerlukan sistem olfaktori yang baik untuk kelangsungan hidupnya (Tegoni 2004). Odorant dan feromon adalah molekul organik yang berukuran kecil, umumnya hidrofobik dan volatil. Odorant ditangkap oleh Odorant Binding Protein (OBP) dan feromon oleh Pheromone Binding Protein M 1
4
2
3
4
M
1
2
3
4
1500 bp 1500 bp
500 bp
1000 bp 600 bp
400 bp
500 bp 500 bp (a)
(b)
(c)
Gambar 5 Hasil amplifikasi cDNA bagian I OR S. incertulas Keterangan: M: marker 100 bp DNA Ladder; (a) amplikon OR_Os_F1 dan OR_Os_R1 dengan metode standard PCR, kolom 1-2: ScKrM, 3- 4: ScKrF; (b) amplikon OR_Os_F1 dan OR_Os_R1 dengan metode touchdown PCR, kolom 1-5: ScKrM; (c) amplikon OR_Os_F1a dan OR_Os_R1a dengan metode touchdown nested PCR, 1’: ScKrM dari amplikon 1 touchdown PCR, 2’: ScKrM dari amplikon 2 touchdown PCR OR_Reg1_ScKrM CCTTACGTAG GAGACTATAT AATCCAAATT AGCGCCCATC GGATGGATCA GGAGGAATGC 60 CGTCATGACA CTAATAAGTT TGCCCTCTAA CGGCGAGTTA TGGCCAGATT TCATGATCTT 120 CATTTCATCA GGA 133
Gambar 6 Sekuen nukleotida OR S. incertulas jantan asal Karawang
8
(PBP) kemudian diterima oleh protein Odorant Receptor (OR) yang terdapat pada sensila khusus yang terdapat pada antena dan palpus maksilla. Protein OR merupakan protein tujuh domain transmembran yang berpasangan dan mangaktivasi protein G (Touhara & Vosshall 2009). Karakterisasi protein OR pertama kali dilakukan pada tikus dan sampai saat ini telah dilakukan pada berbagai spesies hewan. Walaupun ribuan jenis, namun terdapat bagian yang conserve dari protein OR, terutama pada bagian integral membran. Hasil analisis mengguna-
kan basis data PSORT menunjukkan bahwa protein OfurOR7a merupakan protein integral membran yang memiliki jarak genetik sebesar 63,6 dengan ikan zebra Danio rerio (EDG5_BRARE), 66,0 dengan lalat buah Drosophila melanogaster (ACH2_DROME) dan tikus Ratus norvegicus (TA12_RAT) (Tabel 6). Adanya homologi antara sekuen parsial OR S. incertulas dengan OfurOR7a menunjukkan bahwa gen OR S. incertulas juga berfungsi sebagai mediator sistem informasi kimia pada perilaku kopulasi penggerek batang padi kuning S. incertulas.
Tabel 5 BLASTn sekuen nukleotida OR S. incertulas yang berasal dari Karawang Nomor aksesi GQ225749.1
GQ225748.1
GQ225747.1
AB597005.1
AB597004.1
DQ333883.2
Deskripsi Ostrinia nubilalis clone BAC 57P12 acyl-CoA desaturase Z9-1 gene, complete cds Ostrinia nubilalis clone BAC 48C4 acyl-CoA desaturase Z9-1 gene, partial cds Ostrinia nubilalis clone BAC 31B16 acyl-CoA desaturase Z9-1 gene, compl Ostrinia nubilalis OnubOR7a, OnubOR5b genes, complete cds and complete sequence, clone: 11K16 Ostrinia nubilalis OnubOR5a gene for odorant receptor, complete cds Ostrinia furnacalis prophenoloxidase mRNA, complete cds
Skor maks
Skor total
Cakupan query
Evalue
Ident max
33.7
33.7
17%
0.011
91%
33.7
33.7
17%
0.011
91%
33.7
33.7
17%
0.011
91%
24.7
24.7
12%
5.7
94%
24.7
24.7
12%
5.7
94%
24.7
24.7
12%
5.7
94%
>dbj|AB597005.1|Ostrinia nubilalis OnubOR7a, OnubOR5b genes, complete cds and complete sequence, clone: 11K16 Length=18320 Score = 24.7 bits (26), Expect = 5.7 Identities = 15/16 (94%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Minus Query
98
Sbjct
9811
TTATGGCCAGATTTCA || ||||||||||||| TTTTGGCCAGATTTCA
113 9796
Gambar 7 Hasil alignment BLASTn OR S. incertulas jantan asal Karawang dengan O. nubilalis OnubOR7a (AB597005.1)
9
Tabel 6 Prediksi sekuen protein Ostrinia PSORT Id Jarak Identitas EDG5_BRARE 63,6 12% ACH2_DROME 66,0 15% TA12_RAT 66,0 17%
nubilalis OnubOR7a dengan menggunakan basis data Keterangan [Uniprot] SWISS-PROT: protein integral membran [Uniprot] SWISS-PROT: protein integral membran [Uniprot] SWISS-PROT: protein integral membran
Selain sebagai mediator perilaku kopulasi, banyak protein OR lain yang memiliki peran penting dalam kelangsungan hidup, keberhasilan reproduksi, memperantarai respon terhadap makanan dan pasangan (Hallem et al. 2006). Dengan mengetahui struktur OR maka dimungkinkan untuk memblokir reseptor tersebut sehingga dapat dikembangkan dan dimanfaatkan untuk pengendalian populasi serangga penggerek batang padi kuning S. incertulas.
SIMPULAN Sekuen parsial gen Odorant Receptor (OR) pada penggerek batang padi kuning S. incertulas jantan berukuran 133 bp. Gen tersebut memiliki homologi pada nukleotida ke 98-133 dengan sekuen gen OnubOR7a (AB597005.1) yaitu gen OR Ostrinia nubilalis yang diketahui memperantarai sistem komunikasi kimia dalam perilaku kopulasi O. nubilalis.
SARAN Kualitas RNA akan terjaga lebih baik bila antena dipotong dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berada di dalam dry ice. Amplikon gen OR S. incertulas yang berukuran 400 bp hanya menghasilkan sekuen yang berukuran 133 bp karena tidak dilakukan klon. Oleh karena itu, perlu dilakukan klon sehingga ukuran hasil sekuen lebih optimal.
DAFTAR PUSTAKA Baxevanis AD, Quellette BFF. 2001. Bioinformatics: A Practical Guide Analysis of Genes and Proteins, Ed ke-2. New York: John Willey & Sons. Byun SO, fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver staining DNA in large number of
polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. Cork A, Quarishi KN, Alam SN, Saha CCJ, Talekar NS. 2003. Pheromones and their application to insect pest control. Bangladesh J Entomol 13: 1-13. Garczynski SF, Wanner KW, Unruh TR. 2012. Identification and initial characterization of the 3’ end of gene transcripts encoding putative members of the pheromone receptor subfamily in Lepidoptera. Insect Sci 19: 64-74. Hallem EA, Dahanukar A, Carlson JR. 2006. Insect odor and taste receptors. Annu Rev Entomol 51: 113-135. Hendarsih, Sembiring. 2007. Status Hama Penggerek Batang Padi di Indonesia. Apresiasi Penelitian Hama Padi. Balai Besar Penelitian Tanaman Padi : 6171. Merritt TJS, LaForest S, Prestwich GD, Quattro JM, Vogt RG. 1998. Patterns of gene duplication in Lepidopteran Pheromone Binding Proteins. J Mol Evol 46: 272–276. Miura N, Nakagawa T, Tatsuki S, Touhara K, Ishikawa Y. 2009. A male-specific odorant receptor conserved through the evolution of sex pheromones in Ostrinia moth species. Int J Biol Sci 5: 319-330. Tamura K et al. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. Tegoni M, Campanacci V, Cambillau C. 2004. Structural aspects of sexual attraction and chemical communication in insects. Trends in Biochem Scie 5:257-264. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgin DG. 1997. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence
10
alignment aided by quality analysis tools. Nucl Acid Res 25: 4876–4882. Yasukochi Y, Miura N, Nakano R, Sahara K, Ishikawa Y. 2011. Sex-linked pheromone receptor genes of the European corn borer Ostrinia nubilalis, are in tandem arrays. PLOSone 6: 1-10.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1
Kromatogram sekuen beta-aktin S. incertulas
