Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta
Genetické aspekty dvoudomosti u rostlin Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
RNDr. Roman Hobza, Ph.D.
Veronika Obšívačová
Odborný konzultant: RNDr. Jitka Žlůvová, Ph.D. Brno 2010
1
Zadání
2
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Genetické aspekty dvoudomosti u rostlin“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ………………………………………. podpis diplomanta ……………………….
3
Tímto bych ráda poděkovala své odborné konzultantce RNDr. Jitce Žlůvové, Ph.D. za vedení diplomové práce a vedoucímu diplomové práce RNDr. Romanu Hobzovi Ph.D. Dále bych ráda poděkovala RNDr. Martině Talianové a RNDr. Bohuslavu Janouškovi, Ph.D. za cenné připomínky a rady při vypracování této práce. Neméně bych chtěla poděkovat prof. Borisu Vyskotovi DrSc. za poskytnutí možnosti práce v Laboratoři vývojové genetiky rostlin Biofyzikálního ústavu AV ČR.
4
ABSTRAKT Okolnosti, které vedou ke vzniku dvoudomosti u rostlin, jsou předmětem mnoha studií. Pomocí fylogenetických analýz bylo možné navrhnout různé mechanizmy vedoucí k vývoji odděleného pohlaví, které se u rostlin vyskytuje poměrně vzácně. K těmto účelům se velice dobře hodí studium rodu Silene. A to především z důvodu výskytu rozmanitých rozmnožovacích systémů, které zahrnují hermafroditizmus, gynodioecii a dvoudomost. Naše fylogenetické analýzy založené na více genetických markerech potvrdily, že se dvoudomost u rodu Silene vyvinula dvakrát nezávisle na sobě a to pravděpodobně z jaderně-cytoplazmatické gynodioecie. Z druhového rozložení vyplývá, že okolnosti vzniku dvoudomosti se u těchto skupin liší. O tom svědčí vznik pohlavních chromozómů, které jsou odlišné a v každé sekci vznikaly odlišným způsobem. Sekce Elisanthe je striktně dvoudomá, zatímco v sekci Otites existují různá přechodná stádia. Rozdíly mezi sekcí Elisanthe a Oties mohou být vysvětleny dvěma způsoby. Buď v sekcích působily rozdílné selekční tlaky vyvolané ekologickými podmínkami, nebo dvoudomost v sekci Elisanthe vznikla dříve, než v sekci Otites.
ABSTRACT Accounts which have risen to dioecy in plants are the subject of many studies. Using phylogenetic analysis to be able to design different mechanisms leading to the evolution of separate sexes, which occurs relatively rarely in plants. For these purposes genus Silene is very suitable. The reason is presence of various reproductive systems which include hermafroditism, gynodioecy and dioecy. Our phylogenetic analysis based on multiple genetic markers reveal that dioecy has evolved twice independently in the genus Silene possibly by nucleo-cytoplasmic gynodioecy. The species distribution shows that the conditions of dioecy evolution differ in these groups. This indicated the sex chromosomes development which were created in a different way in each section. Section Elisanthe is strictly dioecy but in section Otites various intermediate stages exist. Differences between the sections Elisanthe and Oties can be explained in two ways. One way is convergence of selective pressures caused by environmental conditions or in section Elisanthe dioecy arose before the section Otites.
5
OBSAH 1 ÚVOD..............................................................................................................8 1.1 Rozmnožování organismů............................................................................8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED...............................................................................10 2.1 Pohlavní rozmnožování..............................................................................10 2.1.1 Třídění gonochoristů.........................................................................10 2.2 Rozmnožování u rostlin..............................................................................13 2.2.1 Modely vzniku dvoudomosti.............................................................14 2.2.2 Vnější vliv na determinaci pohlaví u krytosemenných rostlin..........16 2.2.3 Původ a evoluce pohlavních chromozómů........................................16 2.3. Klasické modely dvoudomých rostlin.......................................................18 2.3.1 Rod šťovík (Rumex)..........................................................................18 2.3.2 Bažanka roční (Mercurialis annua)...................................................19 2.3.3 Tykvovité (Cucurbitaceae)................................................................20 2.3.4 Chmel otáčivý (Humulus lupulus) ...................................................20 2.3.5 Konopí seté (Cannabis sativa)...........................................................20 2.3.6 Papája obecná (Carica papaya)..........................................................20 2.3.7 Rod silenka (silene)...........................................................................21 2.4 Molekulární fylogenetika...........................................................................23 2.4.1 Konstrukce fylogenetických stromů..................................................24 2.4.2 Data pro konstrukci fylogenetických stromů....................................24 2.4.3 Matematické modely pro konstrukci fylogenetických stromů..........25 2.4.4 Metody konstrukce fylogenetických stromů.....................................26 3 CÍL PRÁCE ..................................................................................................28 4 MATERIÁL A METODY ............................................................................29 4.1 Použitý materiál .........................................................................................29 4.1.1 Používané roztoky.............................................................................29 4.1.2 Používané chemikálie........................................................................30 4.1.3 Používané komerční sady..................................................................30 4.1.4 Přístrojové vybavení..........................................................................30 4.1.5 Použitý software................................................................................31 4.1.6 Použitý rostlinný materiál.................................................................32 4.2 Homogenizace rostlinného materiálu pomocí oscilačního mlýnu MM301 (Retsch).............................................................................................................33 4.3 Izolace DNA z rostlinného materiálu pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen) ..........................................................................................................33 4.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR) .....................................................33 4.5 „Long“ polymerázová řetězová reakce ....................................................35 4.6 Polymerázová řetězová reakce s postupným snižováním Ta "touchdown" ..........................................................................................................................36 4.7 Gelová elektroforéza ..................................................................................36 6
4.8 Příprava DNA pro sekvenování ................................................................37 4.8.1 Extrakce PCR produktů z gelu pomocí kitu QIA Gel Extraction Kit (QIAgen) ..................................................................................................37 4.8.2 Klonování PCR produktů..................................................................38 4.8.3 Transformace kompetentních buněk Escherichia coli .....................40 4.8.4 PCR na koloniích ............................................................................41 4.8.5 Izolace plazmidů pomocí QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen) . . .41 4.8.6 Stanovení koncentrace plazmidové DNA .......................................42 4.8.7 Sekvenace PCR produktů..................................................................42 4.8.8 Analýza získaných sekvencí .............................................................42 4.9 Fylogenetické analýzy .............................................................................43 5 VÝSLEDKY.................................................................................................44 5.1 Volba genů pro analýzy .............................................................................44 5.1.1 Analyzované geny.............................................................................44 5.2 Získávání sekvencí pro fylogenetické analýzy...........................................45 5.2.1 Gen CCLS1.......................................................................................45 5.2.2 Gen EiF..............................................................................................47 5.2.3 Ribozomální DNA.............................................................................48 5.2.4 Spermidin syntáza.............................................................................49 5.2.5 Men 524.............................................................................................50 5.3 Příprava dat k fylogentickým analýzám.....................................................51 5.4 Vytvoření fylogenetického stromu ............................................................51 5.5 Fylogenetické analýzy................................................................................53 6 DISKUZE......................................................................................................54 7 POUŽITÁ LITERATURA............................................................................57 8 PŘÍLOHA......................................................................................................66
7
1 ÚVOD
1.1 Rozmnožování organismů Rozmnožování je základním smyslem života všech živých organizmů. Umožňuje udržení a rozšíření daného druhu v přírodě. U organizmů existují dva základní způsoby reprodukce. Při nepohlavním (amixis, vegetativním) rozmnožování je rodičem jediný organizmus a ten sám předává potomkům kopie svých genů. Nedochází ke splývání vajíčka a spermie tedy k oplození a meióze. Nepohlavní rozmnožování je zastoupeno několika mechanizmy. Nejběžnější mitotické dělení se vyskytuje u jednobuněčných organizmů, jako jsou archaea, bakterie a protista. Pučení je známé jak na jednobuněčné, tak na mnohobuněčné úrovni. Příkladem mnohobuněčného živočicha rozmnožujícího se pučením je nezmar (Hydra), příbuzný medúzám. Další možností je vegetativní reprodukce, která dává u rostlin vznik jedincům bez produkce semen nebo spór. Příkladem je tvorba malých klíčních rostlin na listech rodu kolopejka (Kalanchoe). Při partenogenezi se nový jedinec vyvíjí z neoplodněného vajíčka. Vyskytuje se u bezobratlých, obratlovců, u rostlin se označuje spíše jako apomixie. Tento způsob rozmnožování je považován za evolučně nejmladší, odvozený od pohlavního rozmnožování. Nový jedinec vzniká bez splynutí samčích a samičích gamet a nevyvíjí se tedy ze zygoty. Apomixie se vyskytuje nejen u některých kapraďorostů s nezávislým gametofytem, ale i u mnoha semenných rostlin (smetánka lékařská – Taraxacum officinale, jeřáb – Sorbus). Pohlavní (amfimixis, generativní) rozmnožování je podmíněné odděleným pohlavím. Potomstvo vzniká splýváním haploidních gamet za vzniku zygoty, která je diploidní. Pohlavní rozmnožování zvyšuje genetickou variabilitu potomstva díky vytváření jedinečných kombinací genů zděděných od dvou rodičů. Příslušníci pohlavně se rozmnožující populace vděčí za své genetické rozdíly unikátním kombinacím existujících alel, které každý jedinec přijímá od svých rodičů. Během meiózy homologní chromozómy, zděděné po jednom od každého z rodičů, vyměňují některé ze svých genů pomocí crossing-overu a poté se homologní chromozómy a jimi přenášené alely náhodně rozdělují do různých gamet. V procesu crossing-overu vznikají díky 8
zlomům rekombinantní chromozómy, které nesou geny od obou rodičů. Dochází tak k výměně části nesesterských chromatid. Gamety jednoho jedince se v genetické povaze výrazně mění a každá zygota, vytvořená příslušným párem, má unikátní uspořádání alel. Populace obsahuje obrovské množství kombinací. Tato alelová proměnlivost má základ v minulých mutacích. Pohlavní míšení alel a jejich náhodné rozdělení určuje individuální genotypy. Je charakteristickým rysem u eukaryotních organismů. V případě, kdy se samčí i samičí gamety nacházejí u jednoho jedince, jedná se o hermafroditismus. V případě oddělených jedinců jde o gonochorismus dvoudomost.
9
nebo
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Pohlavní rozmnožování Základním rysem pohlavnosti jsou u všech eukaryotických organizmů shodné. Vyvinuly se dva typy pohlaví, tedy pohlavních orgánů a v nich vznikajících gamet. Na „volbu“ pohlaví mají vliv dva mechanizmy. Jako původní mechanizmus determinace pohlaví se označuje vliv faktorů vnějších podmínek. Nejznámější je vliv teploty, která působí na vývoj plodu během embryonální fáze. Tento mechanizmus je možné pozorovat u ryb (Schartl, 2004). Dále je proces determinace pohlaví podmíněn působením genů, které se vyskytují na pohlavních chromozómech nebo autozómech. Chromozómové sady jsou u samců a samic odlišné. Somatické diploidní buňky jednoho pohlaví mohou mít dva morfologicky totožné pohlavní chromozómy, pak jsou označovány za homogametní. Druhé pohlaví má pak somatické buňky s morfologicky odlišnými pohlavními chromozómy, které je označováno jako heterogametní. Heterogametní nebo homogametní může být buď pohlaví samčí nebo samičí. Podle tohoto dělení rozeznáváme tři systémy třídění gonochoristů. Existence pohlavního rozmnožování a evoluce pohlaví představuje hlavní strategii zachování genetické informace. Největší výhodou je udržování výhodných znaků a potlačování nefunkčních genů. Dochází k vytváření nových genotypů. Pohlavní rozmnožování může představovat i určité nevýhody. Při meióze a splynutí samčích a samičích pohlavních buněk je nutná energie, která není při nepohlavním rozmnožování nutná. Hlavní nevýhodou je, že samci neposkytují nové jedince, tak ze dvou jedinců vzniká pouze jeden nový jedinec. Zatímco u hermafroditů z každého jedince může vzniknout nový jedinec. 2.1.1 Třídění gonochoristů Typ Drosophila (savčí) •
Vyskytuje se u savců, většiny řádů hmyzu, u některých druhů ryb, obojživelníků
a plazů. •
Samice (homogametní pohlaví) má genotyp AAXX. 10
•
Samec (heterogametní pohlaví) má genotyp AAXY.
Pohlavní determinace u savců U savců je pohlaví determinováno systémem XX/XY. Pár pohlavních chromozómů se vyvinul z páru autozómů (Ohno, 1967). Lidský chromozóm Y tvoří asi 5 % pseudoautozomální oblasti PAR (pseudo-autosomal region, Graves et al. 1998), která je lokalizována na obou terminálních koncích pohlavních chromozómů. Během meiózy u samců dochází k rekombinaci mezi pseudoautozomálními oblastmi chromozómu X a Y. Většina identifikovaných pseudoautozomálních genů byla nalezena na krátkém rameni. Velká zbývající část chromozómu Y nerekombinuje ani s chromozómem X ani jinými chromozómy. Tato nerekombinující oblast (NRY – non-recombining region) obsahuje velké množství vysoce repetitivních sekvencí, které jsou bohaté na transpozony. Ze 60 megabází nerekombinující oblasti lidského chromozómu Y je 35 megabází euchromatických, které se vyznačují přítomností aktivních genů. Zbytek na dlouhém rameni je tvořen heterochromatinem, který je málo transkribovaný a patří sem i centromera (Erlandson et al. 2000). V euchromatické části NRY bylo identifikováno 21 odlišných genů, které byly rozděleny do tří tříd. První třída obsahuje osm genů, které tvoří homology s chromozómem X. Druhá třída obsahuje také osm genů, které jsou exprimovány pouze ve varlatech. Ve třetí třídě se vyskytuje gen SRY (sex-determining region Y), který je zodpovědný za vývoj varlat (Stevanovic et al. 1993). U samic nedochází z důvodu nepřítomnosti chromozómu Y k expresi genu SRY, tedy nedochází ke vzniku varlat. Jelikož ženy mají geny na chromozómu X ve dvou kopiích, dochází k náhodné inaktivaci jednoho ze dvou chromozómů X a tím ke kompenzaci dávky genů u muže. Geny vázané na X tak mohou být rovnoměrně dávkovány mezi samci a samicemi (Lyon, 1961). V buňkách je s 50% pravděpodobností inaktivován chromozóm parentálního původu a se stejnou pravděpodobností maternálního původu. Stáří lidských pohlavních chromozómů se odhaduje na 240 až 320 milionů let. Za tu dobu došlo ke značné degeneraci a ztrátě většiny genů na chromozómu Y (Lahn a Page, 1999) Pohlavní determinace u druhu Drosophila melanogaster (octomilka obecná) 11
Drosophila má sysytém XY/XX, avšak pohlaví je určováno poměrem X/A:X. (XXY – fertilní samičky a X0 – sterilní samci). Důležitá je exprese genu sex-lethal (Sxl), která je aktivní u samic a inaktivní u samců. Exprese je řízena transkripčními faktory, které jsou kódovány čtyřmi numerátorovými geny (vázané na X) a jediným denominátorovým genem (autozomální). Jedinci s poměrem jedna nebo více jsou pak samice a jedinci s poměrem 1:2 nebo méně jsou samci. Jedinci s hodnotou mezi těmito poměry vykazují charakteristiky jak samce, tak samice (Vyskot, 1999) . Typ abraxas (ptačí) •
Vyskytuje se u ptáků, motýlů, některých ryb, obojživelníků a plazů, ale také
rostlinného druhu jahodník (Frgaria). •
Samice (heterogametní pohlaví) má genotyp AAZW.
•
Samec (homogametní pohlaví) má genotyp AAZZ.
Typ habrobracon •
u diplo-haploidních jedinců (včely), kdy samice mají diploidní počet
chromozómů a samci haploidní počet (vznik z neoplozených vajíček).
12
2.2 Rozmnožování u rostlin U rostlin se vyskytují různé strategie reprodukce. Většina rostlinných druhů je hermafroditních. Tyto rostliny mají květy oboupohlavné, které jsou vybaveny pestíkem i tyčinkami. Přesto většina z nich upřednostňuje opylení jinými jedinci. Tímto způsobem je možné zabránit inbrední depresi a tak zvýšit genetickou variabilitu v populaci. Nebezpečí inbrední deprese spočívá právě ve snižování genetické variability populace
křížením
příbuzných
jedinců.
Z
hermafroditních
květů
původních
krytosemenných rostlin se během evoluce vyvinuly květy jednopohlavné. Květ má buď prašník nebo pestík, je tedy samčí nebo samičí. Pokud jsou oba druhy květů na jedné rostlině, pak se označují jako jednodomé (monoecie). Vyskytují-li se květy oddělené na různých jedincích, jedná se pak o druhy dvoudomé (dioecie). Možný je i případ výskytu květů oboupohlavných a jednopohlavných na jedné rostlině. Takové se označují jako mnohomanželné (polygamie). Mnohomanželné druhy mohou být v různých kombinacích a představují následující varianty: – trimonoecie – na jedné rostlině květy samčí, samičí a oboupohlavné (šťovík tupolistý, Rumex obtusifolius). – gynomonoecie – na jedné rostlině květy samičí a oboupohlavné, samčí chybí (sedmikráska chudobka, Bellis perennis). – andromonoecie – na jedné rostlině jsou samčí a oboupohlavné květy, samičí chybí (hadí kořen větší, Bistorta major). – gynodioecie – rostliny s oboupohlavnými květy a jedinci se samičími květy (chrastavec rolní, Knautia arvensis). – andordioecie – rostliny s oboupohlavnými květy a jedinci se samčími květy (koniklec jarní, Pulsatilla vernalis). – trioecie (trojdomost) – jedinci s oboupohlavnými květy, jedinci samčí a samičí.
13
Celkem tvoří hermafroditní druhy 72 % rostlinných druhů, 7 % jednodomé a 4 % dvoudomé druhy. Zbývající část je složena z 10 % andromonoecických a gynomoecických druhů (Yampolski a Yampolski, 1922). Podobně jako u živočichů je pohlavní determinace rostlin ovlivněna geneticky a hormonálně. Existuje pouze několik druhů, u kterých
se vyvinuly pohlavní
chromozómy. 2.2.1 Modely vzniku dvoudomosti Nejběžnější rozmnožovací strategie u živočichů je gonochorismus. U rostlin se naopak nejčastěji vyskytuje hermafroditismus. Jako původní reproduktivní systém je považováno cizosprášení, které se vyskytuje nejčastěji u jednodomých nebo dvoudomých rostlin. Tento reproduktivní systém nalézáme u kapraďorostů, mechorostů a nahosemenných rostlin, předků dnešních krytosemenných rostlin. Následnou evolucí vznikly rostliny krytosemenné, u kterých převládají spíše oboupohlavné květy. A tak zde převládá spíše samosprášení. Z tohoto druhového rozložení vyplývá, že se dvoudomost vyvinula několikrát nezávisle na sobě (Charlesworth, 2002). Jelikož se dvoudomost u rostlin vyvinula několikrát nezávisle na sobě, je málo pravděpodobné, aby tento pohlavně determinující systém měl stejný základ (Weiblen et al. 2000). Samosprášení s sebou nese řadu nevýhod, jako je inbrední deprese, při které dochází ke zvýšení mutantních alel v homozygotním stvavu. Dochází ke snižování vitality populace. Jednou z možností zabránění inbrední deprese je využití autoinkompatibilty přes polyploidizaci (např. druhy rodu kustovnice, Lycium, Miller a Venable, 2000), která zabrání opylení vlastním nebo příliš příbuzným pylem. Dalším možným mechanizmem je proteandrie, kdy pyl dozrává dříve než blizna nebo protogynie, kdy naopak dozrává dříve blizna než pyl. Dalším mechanizmem je vznik dvoudomosti. Při vývoji odděleného pohlaví se uplatnily dvě dráhy (obr. č. 1). V první, dvoudomost vznikla z hermafroditismu přes gynodioecii, kde se v hermafroditní populaci, na základě vzniku mutace způsobující samčí sterilitu, rozšířily samičí rostliny. K vytvoření dvoudomosti je zapotřebí genetické změny nejméně ve dvou genech, které jsou ve vazbě. Jeden gen způsobuje zastavení vývoje samičího orgánu, pak dojde k tvorbě samičích rostlin a druhý gen podporuje pouze tvorbu samčích orgánů, které produkují samčí rostliny (Charlesworth a Charlesworth, 1978). Recesivními mutacemi, které
14
zabránily tvorbě samčích orgánů, došlo k tvorbě gynodioecických rostlin (rostliny samičí a hermafroditní: shrnuto v Delpf a Wolf, 2005). Následně vytvoření modifikačních genů způsobilo potlačení samičí fertility u hermafroditů (Charlesworth a Charlesworth, 1978). Tito rekombinanti obsahovali alelu pro samčí sterilitu a modifikační alely, což vedlo ke vzniku samic s potlačenou fertilitou. Silným evoluční tlakem se docílilo těsné vazby mezi geny pro samčí sterilitu a modifikačními geny. Tímto došlo k vytěsnění těchto rekombinantů. Druhou možností je vývoj dvoudomosti z jednodomosti. Tato dráha je méně prostudovaná, nicméně předpokládá vznik selekce, která má za následek rozdělení oboupohlavných květů na jednopohlavné. Dochází tak k tomu, že někteří jedinci měli více samčích nebo samičích květů. Tato schopnost byla determinována geneticky a pak se tyto rostliny stávaly více samčí nebo samičí, až v populaci došlo ke vzniku samčích nebo samičích rostlin (Westergaard, 1958).
Obrázek č. 1: Dvě dráhy vzniku dvoudomosti (Barrett 2002). Další možností vzniku dvoudomosti je přes cytoplazmatickou samčí sterilitu. Rostliny se sterilní cytoplazmou opylené normálním pylem z jiných rostlin mají opět potomstvo
15
se sterilním pylem a tím se samčí sterilita rozšíří v celé populaci. Za vznik samčích jedinců je zodpovědný obnovitel fertility rf, který je jaderného původu. Pokud se sterilní cytoplazma rozšíří v celé populaci je za vznik samčích jedinců zodpovědný obnovitel fertility, který je jaderného původu. Následně se může objevit mutace v jaderném genu, která způsobí samičí fertilitu. Pokud bude obnovitel fertility a mutace způsobující samičí fertilitu ve vazbě, vzniknou samičí a samčí rostliny. Další možností je vznik dvoudomosti z autoinkompatibility přes polyploidii následným vznikem gynodioecie a konečně dvoudomosti. Tento způsob vzniku dvoudomosti byl studován u severoamerického druhu Lycium (kustovnice), u kterého se z diploidního druhu vyvinul druh polyploidní. Polyploidie přerušila autoinkompatibilitu, což vedlo k inbrední depresi. Nálsedně došlo ke vzniku gynodiecie a dvoudomosti (Miller a Venable, 2000). 2.2.2 Vnější vliv na determinaci pohlaví u krytosemenných rostlin Působení prostředí, jako jsou intenzita světla, délka dne, teplota a minerální výživa, mohou mít vliv na pohlaví jednodomých a dvoudomých druhů. Příklady takto citlivých rostlin jsou kukuřice, okurka, špenát a konopí. Ovšem účinky mohou být u různých druhů opačné (Heslop-Harrison, 1957). Dalším významným faktorem může být vliv rostlinných hormonů. U mnoha druhů s jednopohlavnými květy byly nalezeny rozdíly v hladinách fytohormonů v květech samčích a samičích. Opět není účinek hormonů u různých rostlinných druhů shodný. Například cytokininy podporují u špenátu, konopí setého a bažanky roční tvorbu samičích květů (Durand, 1990), ovšem daný účinek nebyl pozorován u okurky. Aplikace giberelinů u kukuřice přeměňuje samčí květy v samičí (Hansen et al. 1976), avšak u okurky vede k přeměně samičích květů v samčí (Wittwer a Bukovac 1958). 2.2.3 Původ a evoluce pohlavních chromozómů Vznik dvoudomosti má často za následek také vznik pohlavních chromozómů. Jedním modelem může být lokalizace genu determinujícího pohlaví na jednom lokusu primitivního chromozómu Y (obr. č. 2). Vzniká tak dominantní alela determinující pohlaví. Dochází ke kumulaci genů, které jsou výhodné pouze pro samčí pohlaví. Následným potlačením rekombinace dále pokračuje evoluce chromozómu Y. Pohlaví
16
determinující lokus M+ pak představuje dominantní alelu, která zakládá vývoj samčích pohlavních orgánů (samec M+M−, samice M−M−). Geny, které podporují vznik samčího pohlaví, se kumulují v blízkosti M+ a tyto geny mutují nebo translokují. Po úplném zastavení rekombinace vznikla samčí specifická oblast. Chromozómy nesoucí alelu M− zachovávají rekombinaci a mění jedince v samici. Zatímco alela M+ a vázající geny na samčím specifickém chromozómu vytvoří kompletně oddělené pohlaví (Rice, 1996).
Obrázek č. 2: Rozšíření samčí specifické oblasti na chromozómu Y. Jedinci mohou mít pohlavní chromozómy homomorfní, pak nejsou morfologicky odlišitelné (XX), nebo heteromorfní (XY). Pokud se v jednom jedinci nachází více jak dva typy pohlavních chromozómů, nazývá se polymorfní. Příkladem takové rostliny je šťovík kyselý (Rumex acetosa – samec XY1Y2, samice XX) a chmel otáčivý (Humulus lupulus var. cordiflorus – samec X1X2Y1Y2, samice X1X1X2X2). Z evolučního hlediska je možné předpokládat, že relativně mladý jednoduchý systém pohlavní determinace spadá do kategorie homomorfních pohlavních chromozómů. Inverze, delece a duplikace, které mohou být součástí degenerativních procesů, které se vyskytují na chromozómu Y, mohou vést k dalšímu evolučnímu kroku, vzniku heteromorfního XY (shrnuto v Vyskot a Hobza, 2004). Vznik odděleného pohlaví je spojené se vznikem pohlavních chromozómů, které ovšem mohou být v různém stádiu vývoje. Tímto vzniká variabilita v pohlavních chromozómech u různých druhů, u kterých se vyskytují. Na obrázku č. 3 jsou
17
znázorněny pohlavní chromozómy čtyř rostlinných druhů, které jsou v různých stádiích vývoje.
Obrázek č. 3: Schéma čtyř hlavních kroků evoluce pohlavních chromozómů u rostlin od nejprimitivnějšího vlevo po evolučně pokročilý a degenerovaný vpravo. a) Tykvice stříkavá (Ecballium elaterium), u které není pozorována blokace genetické rekombinace a pohlavní determinace je založena na jednom lokusu. b) Papája (Carica papaya) s homomorfními pohlavními chromozómy X a Y s krátkou nerekombinující oblastí na chromozómu Y. c) Knotovka bílá (Silene latifolia) s velkými pohlavními chromozómy. d) Šťovík kyselý (Rumex acetosa) má polymorfní chromozómy s dvěma odlišnými chromozómy Y, které jsou heterochromatické. (Vyskot a Hobza 2004).
2.3. Klasické modely dvoudomých rostlin Dvoudomé druhy jsou zastoupeny jak u jednoděložných, tak dvouděložných rostlin (Renner a Ricklefs, 1995, Yampolsky a Yampolsky, 1922). V následujících kapitolách jsou uvedeny významné studované dvoudomé druhy. 2.3.1 Rod šťovík (Rumex) Reproduktivní systém šťovíku je velmi variabilní a zahrnuje hermafroditismus, mnohomanželnost, gynodioecii, jednodomost a dvoudomost (shrnuto v Navajas-Pérez et al. 2005). U dvoudomých druhů šťovíku byly popsány dva různé systémy pohlavních chromozómů a mechanizmy pohlavní determinace. První je založen na systému XX/XY 18
s aktivním chromozómem Y (šťovík menší, Rumex acetosella) a druhý má systém XX/XY1Y2, kde pohlavní determinace závisí na poměru X/A (šťovík kyselý, Rumex acetosa, shrnuto v Navajas-Pérez et al. 2005). Dále se zde vyskytuje jeden zvláštní druh Rumex hastatulus, který má dvě chromozomální dráhy. Jedna s chromozómy XX/XY a druhá s XX/XY1Y2. Pohlavní determinaci zde ovlivňuje poměr X/A, ale přesto je pro samčí fertilitu nezbytná přítomnost chromozómu Y (Smith, 1963). Podobnost repetitivních sekvencí u obou chromozómů Y druhu R. acetosa dokazuje, že došlo ke štěpení centromery a tak došlo ke vzniku dvou metacentrických chromozómů, které mají identická ramena (izochromozómy). Tyto izochromozómy podstupují řadu delecí (Rejón et al. 1994). Fylogenetické analýzy dokazují (Navajas-Pérez et al. 2005), že všechny dvoudomé druhy rodu Rumex, se vyvinuly ze společného hermafroditního předka. Z toho vyplývá, že pohlavně determinující systém se zde mění z aktivní úlohy chromozómu Y na mechanismus založený na poměru X/A. K této změně došlo nejméně dvakrát nezávisle na sobě (Navajas-Peréz, 2005). 2.3.2 Bažanka roční (Mercurialis annua) U dvoudomého druhu bažanka se vyskytuje složitý a variabilní systém pohlavní determinace. Byly popsány tři lokusy, které ovlivňují pohlaví. Dominantní alela vyskytující se na lokusu A společně s nejméně jedním ze dvou lokusů (B 1 a/nebo B2) způsobí samčí fenotyp. Recesívní alela přítomná na lokusu A bez ohledu na lokusu B 1 a B2 má za následek vznik samice (Louis, 1989). Je možná teorie, že lokus A je původní pohlavně determinující lokus a lokusy B1 a B2 jsou modifikátory, které se vyvinuly později. V pohlavní determinaci u druhu bažanka hrají významnou roli rostlinné hormony, které mají vliv na pohlavní dimorfisimus. Auxiny mají maskulinizační účinky na samičí rostliny a cytokininy naopak feminizační účinky na samčí rostliny (Hamdi et al. 1987). Přizpůsobivost pohlavního fenotypu je v rozporu s výrazným pohlavním dimorfismem, který vzniká jako výsledek specifické genové exprese (Khadka, 2005). Tudíž u druhů, u nichž pohlavní determinace vznikla poměrně nedávno, by měl být pohlavní dimorfismus minimální. Tyto studie tak mohou odhalit mechanizmy ovlivňující pohlavní dimorfismus a jeho evoluci.
19
2.3.3 Tykvovité (Cucurbitaceae) Čeleď tykvovité je na rozdíl od ostatních krytosemenných rostlin charakteristická přítomností jednopohlavných květů. Z přibližně 800 druhů této rodiny je 460 jednodomých a 340 dvoudomých. Některé druhy tvoří populace andromonoecické, androdioecické, gynomonoeciciké i gynodioecické (shrnuto v Kocyan et al. 2007). Mezi nejprostudovanější druh čeledi tykovité patří dvoudomý posed dvoudomý (Bryonia dioica), jehož pohlavně determinující systém je tvořen chromozómy X a Y (Correns, 1907). Fylogenetické studie dokazují, že čeleď tykovité má jako původní způsob rozmnožování dvoudomost (Zhang et al. 2006). Během vývoje se zde vystřídala jednodomost, ale také ostatní reprodukční systémy jako androdioecie. Z toho důvodu je obtížné určit jak jsou pohlavní chromozómy v tomto rodě staré (Renner, 2007). 2.3.4 Chmel otáčivý (Humulus lupulus) Samec je heterogametní a samice homogametní. Pohlavní determinace je dána poměrem X/A (Shephard et al. 1999). Chmel má nejméně pět typů pohlavních chromozómů, kdy nejběžnější je typ jednoho páru pohlavních chromozómů s devíti páry autozomálními (Winge, 1923). Přídavek auxinu má za následek produkci samčích květů na samičích rostlinách (Patzak et al. 2002). 2.3.5 Konopí seté (Cannabis sativa) Konopí seté je další zástupce dvoudomých druhů s heteromorfními pohlavními chromozómy. Genom tvoří devět párů autozómů a jeden pár pohlavních chromozómů, kdy samice má XY a samec XX. Ovšem pohlavní determinace je založena na poměru autozómu a chromozómu X (Mittwoch, 1996). Chromozóm Y má velké množství repetitivních sekvencí a je dvakrát větší než chromozóm X (Sakamoto et al. 2000). 2.3.6 Papája obecná (Carica papaya) Papája se stala významným modelovým organizmem díky malému genomu (372Mbp) s počtem chromozómů 2n=18 a mladým pohlavním chromozómům (Liu et al. 2004, Yu et al. 2008). Jedná se o hojně pěstovanou tropickou a subtropickou rostlinu, u které se můžeme setkat s jedinci samčími, samičími a hermafroditními. Pohlaví papáji je 20
determinováno jedním genem se třemi typy alel (M1 – samec, M2 – hermafrodit a m – samice: Hofmeyr, 1938, Storey, 1938). Vyskytuje se zde pohlavně determinující systém XY, kdy samci jsou heterogametní a samice homogametní. 2.3.7 Rod silenka (silene) Pro studium vzniku pohlavních chromozómů je vhodný rod Silene, protože jsou oproti savčím podstatně mladší a přesto je mechanizmus evoluce pohlavních chromozómů shodný (Nicolas et al. 2005). Je pak možné sledovat evoluční proces degenerace chromozómu Y. Dvoudomé druhy se nachází v sekci Elisanthe a Otites. Sekce Elisnathe vznikla před 20 – 25 miliony lety (Desfeux et al., 1996). Do sekce Elisanthe patří druhy S. heuffelii, S. dioica, S. latifolia, S. diclinis a S. marzii, u kterých se předpokládalo, že u těchto velmi příbuzných druhů jsou morfologicky podobné pohlavní chromozómy (Nicolas et al. 2005). Dvoudomost a pohlavní chromozómy se tak pravděpodobně vyvinuly uvnitř této skupiny (Desfaux et al.1996). Tento rod je modelový pro studium pohlavních chromozómů především z důvodu jejich poměrně nedávnému vzniku (Filatov et al. 2000, Desfaux et al. 1996). Chromozóm Y nepodléhá rozsáhlé degeneraci, jak je tomu u savců. Rod Silene je využíván jako model evoluce pohlavních chromozómů a reprodukce, protože zahrnuje různé způsoby rozmnožování, od hermafroditismu, přes gynodioecii, až po dvoudomost (Ainswotrh, 2000). Pohlavní chromozómy se vyvinuly z páru autozómů, které prodělaly mutace zodpovědné za vznik pohlavního monomorfismu a došlo ke vzniku prvotních pohlavně determinujících genů (shrnuto v Charlesworth, 1991). 2.3.7.1 Silenka širolistá (Silene latifolia) Tento modelový druh pro studium pohlavních chromozómů má 2n = 24 chromozómů, které se vyvinuly z páru autozómů. Samičí rostlina má 11 párů autozómů a dva velké submetacentrické chromozómy X a samčí rostlina má jeden X a jeden metacentrický chromozóm Y, který je v poměru o 40 % větší než X (Ciupercescu et al 1990). Na q rameni chromozómu Y je krátká pseudoautozomální oblast (Lengerová et al. 2003), která během metafáze I samčí gametofytické meiózy nerekombinuje s chromozómem X
21
(Westergaard, 1948). Nerekombinující oblasti chromozómu Y, které tvoří většinu délky a podléhají degenerativním procesům, ztrácejí důležité geny a akumulují repetitivní DNA (Lengerová et al. 2003). Částečné mutace na chromozómu Y u S. latifolia ukázaly, že se v nerekombinující oblasti vyskytují tři oblasti kontrolující různé pohlavní funkce (obr. č. 4). Jedna oblast potlačuje vývoj samičích pohlavních orgánů (deleční kmen poskytuje hermafroditní květy; Westergaard, 1946, Lardon et al. 1999). Delece v dalších dvou oblastech pozastavuje vývoj prašníku nebo způsobuje pozdější samčí sterilitu (deleční kmen má asexuální květy, u nichž se základ samčích pohlavních orgánů podobá samičím; Donninson et al. 1996, Farbos et al. 1999). Oblast zajišťující samčí fertilitu se vyskytuje na q rameni (Žlůvová et al. 2007).
Obrázek č. 4: Pohlavní chromozómy Silene latifolia a model pohlavní determinace podle Negrutiu at al. 2001 a Charlesworth 2002. Přestože systém pohlavní determinace je u tohoto druhu založen na aktivní úloze chromozómu Y, je náchylný ke změnám, které jsou způsobené dominantní autozomální mutací. Tyto mutace způsobují přeměnu samců v androhermafrodity (jedinci samčí a hermafroditní, Lardon et al. 1999). Zvlášť hojný výskyt androhermafroditů (Taylor 1994) je v oblasti severní Ameriky, odkud tento druh pochází (Wolfe, 2002).
22
2.3.7.2 Silene diclinis Pohlavní chromozómy S. diclinis prodělaly značné změny, jejichž výsledkem je poměrně složitý systém neo-pohlavních chromozómů. Na základě molekulárních analýz byla mezi původním chromozómem Y a atozómem zjištěna oboustranná translokace, která měla za výsledek vznik Y1 a Y2 samčích specifických chromozómů. Y1 se páruje s chromozómem X a s autozómem (neo-X). Y2 se páruje pouze s neo-X a tvoří řetězec X-Y1-neoX-Y2. Přestože u S. diclinis vznikly neo-pohlavní chromozómy poměrně nedávno, jejich výskyt je prokázán u všech zmapovaných jedinců tohoto druhu. Teorií evoluce neo-pohlavních chromozómů u tohoto druhu může být reprodukční izolace (Howell et al. 2009). Alternativní možností vzniku oboustranné translokace je selekce, která zajistí ochranu proti inbrední depresi. Tvorba dvou balancovaných chromozomálních sad by mohla zajistit ochranu heterozygotnosti (Darlington, 1958). 2.3.7.3 Sekce Otities Do sekce Otites náleží skupina morfologicky podobných dvoudomých druhů (Wrigley, 1986), které jsou od Silene latifolia evolučné odlišné (Desfeux et al. 1996, Mráčková et al. 2008). Podle Corrense (1928) a Sansome (1938) je pohlavně determinující systém u nejprostudovanějšího druhu této sekce S. otites založen na ZW/ZZ. Ovšem další práce Warmkeho (1942) poukazuje na XX/XY pohlavně determinující systém. Genetické mapování provedené u příbuzného druhu S. colpophylla odhalilo, že pohlavní chromozómy se na rozdíl od dvoudomých druhů sekce Elisanthe vyvinuly z odlišného páru autozómů (Mráčková, 2008).
2.4 Molekulární fylogenetika Prvním osekvenovaným živým organizmem byla v roce 1995 gramnegativní bakterie Haemophilus influenzae, která způsobuje onemocnění horních cest dýchacích. Tímto byla odstartována významná etapa molekulární biologie. Brzy nato byly osekvenovány eukaryotické organizmy, např. Saccharomyces cerevisiae a Methanococcus jannaschii, které se řadí do skupiny Archaea. Sekvence biologických makromolekul pak poskytují
bohatý zdroj informací
o příbuzenských vztazích mezi organizmy a jejich geny. S takto rychle narůstajícím 23
množstvím biologických dat bylo nutné vyvinout techniky, které umožní tyto informace zpracovat. Metody molekulární fylogenetiky jsou využívané nástroje v mnoha výzkumných oblastech, jako jsou evoluční biologie, systematika, epidemiologie genomika a další (Talianová, 2007). Studium evolučních procesů pomocí fylogenetiky umožní nejen určit vztahy mezi druhy, ale také poskytuje předpověď strukturálních, fyziologických a biochemických vlastností biomolekul (Chambers et al. 2000). Biologické sekvence jsou zdrojem genetické variace, které jsou způsobeny změnami (genové, chromozómové a genomové) ve struktuře DNA sekvence nebo horizontálním přenosem genetické informace (shrnuto v Arber, 2000), kde jeden organizmus přejímá genetický materiál jiného jedince, ačkoliv není jeho potomkem. 2.4.1 Konstrukce fylogenetických stromů Výsledkem většiny technik, které využívají fylogenetické analýzy, jsou fylogenetické stromy, které představují historii vývoje sledovaných druhů nebo genů. Sestavovaní molekulárně fylogenetických vztahů je proces skládající se ze čtyř kroků: 1.
vytvoření alignmentu z homologických sekvencí,
2.
výběr metody k sestavení stromu s ohledem na analyzovaná data,
3.
je-li nutné, výběr vhodného matematického modelu popisujícího evoluční
procesy, 4.
vyhodnocení a interpretace získaného výsledku (Steel, 2005).
2.4.2 Data pro konstrukci fylogenetických stromů Data pro molekulární fylogenetiku, převážně sekvence DNA, RNA a aminkyseliny, jsou získány buď v laboratoři z daného materiálu nebo mohou být vyhledány v databázích. Z těchto sekvencí se vytvoří alignment, který je pro sestavení fylogenetického vztahu nezbytný (Harrison a Langdale, 2006). Pro účely molekulární systematiky organizmů je žádoucí, aby studované sekvence byly ortologní, což je specifická homologie mezi geny. Jako homologní jsou označovány geny odvozené z jednoho společného (ancestrálního) genu. Již v roce 1970 bylo navrženo dělení homologiích genů na dva typy: geny paralogní a geny ortologní. 24
Paralogní geny jsou výsledkem duplikace ancestrálního genu. Ortologní geny existují v genomech v jediné kopii, která u všech zkoumaných organizmů vykonává tutéž funkci.
Obrázek č. 5: Geny paralogní a ortologní Fylogenetický strom je matematická struktura, která je používána jako model skutečné evoluční historie skupiny sekvencí nebo organizmů. Strom se skládá z uzlů, které spojují jednotlivé větve. Terminální uzly, zvané také jako operační terminální jednotky (OTUs – Operational Taxonomic Units), představují sekvence nebo organizmy, buď existující nebo vyhynulé, ze kterých jsou data získána. Uzly spojující jednotlivé větve předpokládají hypotetické předky a hypotetický předek všech sekvencí tvoří kořen stromu, určující správný směr evoluce. Délka větví může vyjadřovat různé informace, nejčastěji se jedná o evoluční vzdálenost (Cvrčková, 2006) 2.4.3 Matematické modely pro konstrukci fylogenetických stromů Některé metody pro sestavování fylogenetických stromů vyžadují matematický model. Parametry matematického modelu popisují do různé míry skutečnost evolučních procesů. Na základě matematických modelů se buď vypočítají vzdálenosti mezi sekvencemi
(množství
změn,
stejných
nebo
odlišných
substitucí)
nebo
pravděpodobnost změn mezi nukleotidy nebo aminokyselinami. Nejjednodušší JukesCantorův model (Jukes a Cantor, 1969) předpokládá shodnou frekvenci substituce mezi všemi nukleotidy. Reálnější modely jsou HKY model (Hasegawa et al. 1985), General Time Reversible model (GTR) (Rodríguez et al. 1990), Gamma-distributed model (Wakeley, 1994, Yang, 1994). Další modely jsou na úrovni aminokyselin (JTT model;
25
Jones et al. 1992, VT model; Muller a Vingron, 2000, WAG model; Whelan a Goldman 2001). 2.4.4 Metody konstrukce fylogenetických stromů Metody pro sestrojování fylogenetických stromů se dělí do dvou skupin. První skupina používá alignment sekvencí jen na výpočet evolučních vzdáleností. Patří sem metoda nejmenších čtverců (Cavalli-Sforza a Edwards, 1967, Fitch a Margoliash, 1967), která se dnes již nepoužívá. V dnešní době je nejrozšířenější technikou metoda nejbližšího souseda (Neighbour-joining - NJ, Saitou a Nei, 1987). Druhá skupina metod, která je založená na znacích, pracuje přímo s alignmentem. Do této skupiny patří metody Maximum parsimony (Edwards a Cavalli-Sforza, 1963, Fitch, 1977), maximální věrohodnost (Cavalli-Sforza a Edwards 1967, Felsenstein 1981) a Bayesovské metody (Rannala a Yang, 1996). 2.4.4.1 Neighbor-joining (NJ, Saitou a Nei, 1987, Oota a Saitou, 1999) Algoritmus vychází z konstrukce hvězdicovitého, nerozlišeného stromu, v němž z jediného centrálního uzlu vycházejí
větve ke všem koncovým operačním
taxanomickým jednotkám. Algoritmus postupně spojuje dvojice uzlů tak, aby co možná nejvíce minimalizoval součet délek větví. Spojená dvojice je v každém kroku nahrazena hypotetickým předkem, což sníží počet větví o jednu a tento postup se opakuje, dokud z jednoho uzlu nevychází pouze jedna větev (Cvrčková, 2006). 2.4.4.2 Maximální parsimonie (Edwards a Cavalli-Sforza, 1963, Fitch, 1977, MP) Metoda hledá dendrogram (jedná se o druh diagramu, používaný ke znázornění jednotlivých kroků) odpovídající minimálnímu úhrnnému počtu mutací nezbytných k dosažení pozorovaného stavu. Výsledný strom vzniká jako konsensus stromů pro jednotlivé pozice, nejlepších stromů může být i více. V úvahu jsou brány pouze fylogeneticky informativní pozice, to jest pozice, které umožňují konstrukci jednoznačných stromů. Program tedy využívá jen zlomku dostupných dat. Této metody se používá málo, protože je dost náchylná ke vzniku artefaktů, jestliže od evolučního oddělení zkoumaných sekvencí uplynula dlouhá doba, a tudíž se nahromadilo mnoho mutací. Citlivá je na rozdílnou rychlost evoluce v jednotlivých liniích.
26
2.4.4.3 Maximální věrohodnost (ML, Cavalli-Sforza a Edwards, 1967, Felsenstein, 1981) Hledání nejvěrohodnějších stromů patří z hlediska spolehlivosti mezi nejlepší metody. Metoda prohledává všechny možné dendrogramy a pro evoluční scénář odpovídající každému z těchto stromů stanovuje pravděpodobnost, s jakou mohl generovat daný znak, odpovídající vloženým datům. Bere potom na rozdíl od metody maximální parsimonie v úvahu všechny pozice. Podstatnou nevýhodou je velká výpočetní náročnost (Cvrčková, 2006). 2.4.4.4 Bayesovské metody (Rannala a Yang 1996) Jedná se o velmi používanou metodu, která se hojně využívá v systematické a evoluční biologii. Je velmi podobná metodě maximální věrohodnosti. Je velice efektivní pro velké množství dat protože využívá alignmentu MCMC (Monte Carlo Markov Chain). Při zpracovávaní stromů by se mělo používat více jak jedné metody. Správnost vyhodnocení fylogenetických stromů se provádí různými testy. Nejčastějším je tzv. „bootstrap test“ (Felsenstein, 1985), který udává frekvenci, s jakou byla daná topologie nalezena při příslušném počtu opakování. Tzn. do jaké míry je seskupení sekvencí pravděpodobné. Další možností, která je použita u Bayesovských metod využívá posteriorní pravděpodobnosti (shrnuto v Huelsenbeck et al. 2001). Oba způsoby (bootstrap i ohodnocení poteriorní pravděpodobností) jsou výsledkem velice odlišných algoritmů, proto nemusí vždy znamenat stejnou statistickou významnost.
27
3 CÍL PRÁCE •
Cílem práce bylo klonování a sekvenování analyzovaných genů u vybraných druhů rodu Silene za účelem sestrojení fylogenetického stromu.
•
Ověření příbuznosti dvoudomých druhů.
•
Zjištění postavení dvoudomosti mezi ostatními hermafroditními, gynodioecickými, gynomono-gynodioecickými a trioecickými druhy.
•
Zjištění příbuznosti dvoudomých druhů rodu Silene s ostatními analyzovanými druhy.
28
4 MATERIÁL A METODY 4.1 Použitý materiál
4.1.1 Používané roztoky −
TAE pufr: pH 7,5 – 7,8
Tris acetát................0,4 M (0,84 Tris báze, 0,114% kys. octová) EDTA......................0,001 M −
TE pufr: pH 8
Tris-HCl.......... 10 mM EDTA.............. 1mM −
LB médium (Luira-Bertani)
k 950 ml deionozované vody přidat: trypton.....................10 g kvasnicový extrakt....5 g NaCl.........................10 g −
Pevné LB médium (Luira-Bertani)
typton.......................10 g kvasnicový extrakt.....5 g NaCl..........................10 g Agar...........................20 g
29
4.1.2 Používané chemikálie −
RNáza A, izopropanol (Sigma-Aldrich)
−
Taq polymeráza + pufr (TopBio)
−
LA DNA Polymerases Mix (výrobce)
−
směs dNTP (Promega)
−
Extrakční pufr RNA Blue (Top Bio)
−
Restrikční endonulkeáza EcoRI a pufr (New Englad Biolabs)
−
Standardy pro gelovou elektroforézu – Gene Ruler 100bp DNA Ladder a Gene Ruler TM
1kb DNA ladder (MBI Fermentas) −
Loading Dye (MBI Fermentas)
−
Agaróza (Serva)
−
Ethidium bromid (Sigma-Aldrich)
−
ampicilin (Serva)
4.1.3 Používané komerční sady −
izolace DNA – Dneasy Plant Mini Kit (QIAgen)
−
extrakce PCR produktů z gelu – QIA Gel Extraction Kit (QIAgen)
−
ligace – pGEM-T Easy Vector (Promega)
−
ligace – pDNR-CMV linearized Vector Information (Clontech)
−
izolace plazmidů – QIA Prep Spin Miniprep Kit (QIAgen)
4.1.4 Přístrojové vybavení −
homogenizace rostlinného materiálu – oscilační mlýn MM301 (Retsch)
30
TM
−
termocykler – PTC 200 (NJ Research)
−
termocykler – T3 (Biometra)
−
inkubační třepačka – C24 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific)
−
centrifuga – Spectrafuge 24D (Labnet International)
−
termoblok – Dry Bath Incubator MD02 (Major Science)
−
váhy – Ohaus No.S200 – (Ohaus Corporation)
−
vortex – Vortex-Genie 2 (Scientific Instruments)
−
mikropipety – Pipetman P (Gilson)
−
geldokumentační systém (kamera, transiluminátor) – In Genius (SynGene)
4.1.5 Použitý software −
GeneTools, GeneSnap (SynGene)
−
BLAST (www.ncbi.com/blast; Altschul et al. 1997, Basic Local Alignment Search Tool)
−
BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html)
−
GBlocks (Talavera a Catresavna, 2007)
−
T-COFFEE (Notredame et al. 2004)
−
Tree Puzzle (Schmidt et al. 2007)
−
Phyml (Guindon and Gascuel, 2003)
−
MrBayes - (Rannala a Yang 1996)
−
MrAic (Burnham a Anderson, 2002)
31
4.1.6 Použitý rostlinný materiál K analýzám byla použita genomická DNA, která byla získána z durhů rodu Silene, u kterých se vyskytují různé způsoby rozmnožování od hermafroditismu, gynodioecie, gynomonogynodioecie, trioecie až po dvoudomost (tab. č. 1). Jako dvoudomé druhy byly vybrány druhy, které náleží do sekce Elisanthe a Otites. Jako vnější člen, který určuje směr evoluce, byl použit druh mydlice bazalkovitá (Saponaria occymoides), Petrocoptis glaucifolia a kohoutek chalcedonský Lychnis chalcedonica, (čeleď Caryophyllaceae, hvozdíkovité). Rozmnožování Druh - latinsky
Druh - česky
Dvoudomé
Silene diclinis
nemá český ekvivalent
Silene latifolia
silenka širolistá
Silene dioica
knotovka červená
Silene heuffelii
nemá český ekvivalent
Silene otites
silenka ušnice
Silene colpophylla
silenka záhybolistá
Silene marizzii
nemá český ekvivalent
Silene acaulis
silenka bezlodyžná
Silene viscosa
silenka lepkavá
Silene zawadskii
nemá český ekvivalent
Silene noctiflora
silenka noční
Silene conica
silenka kuželovitá
Silene saxifraga
nemá český ekvivalent
Silene nutans
silenka nící
Silene vulgaris
silenka obecná
Silene pendula
nemá český ekvivalent
Silene dichotoma
nemá český ekvivalent
Hermafroditní
Gynodioecie
Gynomonodioecie Trioecie
Tabulka č. 1: Druhy rodu Silene použité k analýzám.
32
4.2 Homogenizace rostlinného materiálu pomocí oscilačního mlýnu MM301 (Retsch) Držáky mikrozkumavek příslušející k oscilačnímu mlýnu se předmrazí asi na –20 °C. Do 2ml plastových mikrozkumavek se dá společně s mlecími kuličkami 100 mg čerstvého rostlinného materiálu a zamrazí se v tekutém dusíku. Homogenizace se spustí na 1 minutu při 30 Hz, po uplynutí času se držáky obrátí a znovu se spustí cyklus na 1 minutu při 30 Hz.
4.3 Izolace DNA z rostlinného materiálu pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen) Metoda je založená na technologii silikagelových membrán a jednoduché centrifugační techniky. Pro rozrušení buněčných stěn a membrán se do zhomogenizovaného materiálu přidá 400 μl pufru AP1 a 4 μl RNázy A (100 mg/ml) a řádně protřepe. Lyze buněk se provede inkubací směsi při 65 °C 10 minut. K vysrážení detergentů, proteinů a polysacharidů se přidá 130 μl pufru AP2 a inkubuje 5 minut na ledu. Centrifugace. Vzniklý supernatant se odpipetuje a přemístí na kolonku, centrifugace. K vysrážení DNA se do frakce z předešlého kroku přidá 1,5 objemu pufru AP3/E a opatrně promíchá,
aby nedošlo k poškození DNA. Na novou kolonku se přemístí 650 μl směsi.
Centrifugace. Opakuje se se zbytkem směsi. Pro eluci DNA z kolonky se přidá 500 μl pufru AW. Centrifugace. Přidá se 500 μl pufru AW. Centrifugace. V posledním kroku se napipetuje 100 μl pufru AE přímo na membránu kolonky. Inkubuje se 5 minut při pokojové teplotě. Centrifugace.
4.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Reakce se prováděly na termocyklerech PTC 200 (MJ Research) a T3 (Biometra). Úseky, které se mají namnožit, musí být ohraničeny na začatku a na konci tzv. primery (krátkými oligonukleotidy DNA).Složení reakční směsi je v tabulce č. 2.
33
Složení reakční směsi
Výsledné koncentrace
10x reakční pufr
1krát
dNTP (dATP, dCTP, dGTP,
200 µM
dTTP) levý primer (forward)
200 nM
pravý primer (reverse)
200 nM
Taq polymeráza
0,4 U
DNA templát
5-100ng genomické DNA
Deionizovaná voda
doplnit na výsledný objem 20 μl Tabulka č. 2: Složení reakční směsi
Reakční směs rozpipetovaná v mikrozkumavce se přenese na termocykler a zvolí se reakční profil, jehož obecný charakter je v tabulce č. 3. počáteční denaturace denaturace
94˚C/3 minuty 94˚C/30 vteřin
nasedání primerů elongace
T ˚C/1 minuta a
72˚C/ t
finální extenze
e
72˚-15 minu
Tabulka č. 3: Obecný reakční profil Krok 2. až 4. se opakuje 35krát. Parametry T a t jsou závislé na použitém primeru a jsou a
e
uvedeny v tabulce č.4. Součástí PCR je i negativní kontrola, která obsahuje pouze master mix bez DNA templátu.
34
Gen Plazmid CCLS1
Sperm. syntáza
Specifický primer
Sekvence (5´- 3´)
SP6-R
ATTTAGGTGACACTATAG
T7-F
TAATACGACTCACTATAGGG
CCLS1R1
TGGCCTCGATAAACCAATGGCA
CCLS1F1
GCATATTGCTGAATGCTGATCTCC
Sapon F1SS
AGCTCGTCATTCATCAGTGGAGC
SSR17
AGCCCTTGAAAATCTCGCGGCAG
SaponklonF1
AAGTTATCAGTCGACAGCTCGTCATTCATCAGTGG AGC
R1spermklon ATGGTCTAGAAAGCTTCCCTAGTGTCGACT EIF Men524 rDNA
EIF-F
AAGGTTATGCGAGCTCTTGG
EIF-R
TTCTTCCTTGTCCACGTTC
Men524 R1
AAGGTAAGCTAGCCTCTAGG
Men524 F1
CACCATTAAGAACATACTGGCTCG
18Sforw
AAGGTTTCCGTAGGTGAAC
26Srev
TATGCTTAAACTCAGCGGG
Tabulka č. 4: Použité primery, sekvence a podmínky.
4.5 „Long“ polymerázová řetězová reakce Metoda se pužívá pro přesnou amplifikaci fragmentů DNA až 20 kb dlouhých. Reakce se provádí za speciálních reakčních podmínek (tab. č. 6). Při amplifikaci delších fragmentů je metoda náročnější na kvalitu templátu, podmínky denaturace, správnou koncentraci dNTP/Mg a paramtery cyklu. Účinná denaturace DNA se zajistí přidáním směsi DMSO 2+
o koncentraci 1-4 %.V tabulce č. 5 je uvedeno složení reakční směsi a v tabulce č. 6 obecný reakční profil.
35
Složení reakční směsi
Konečná koncentrace
10x LA PCR pufr
1krát
DMSO
2%
PCR dNTP Mix
500 µM každý nukleotid
5´primer
300 nM
3´primer
300 nM
DNA templát
10 µg/ml
LA DNA polymerases Mix
50 U/ml
Deionizovaná voda
Doplnit na výsledný objem 20 µl
Tabulka č. 5: Složení reakční směsi "Long" PCR.
počáteční denaturace
94ºC/60 vteřin
denarurace
94ºC/15 vteřin 60ºC/30 vteřin (optimální
nasedání primerů
teplota podle složení primerů) 68ºC/1 – 25 minut (podle
elongace
délky amplifikovaných fragmentů, na 3kb fragmentu 2 minuty
finální extenze
68ºC/15 minut
Tabulka č. 6: Obecný reakční profil pro „Long „ PCR.
4.6 Polymerázová řetězová reakce s postupným snižováním Ta "touchdown" Metoda, která umožní amplifikaci PCR produktů v případě, kdy je obtížné předem stanovit optimální teplotu nasedání primerů. Během reakce se v každém cyklu snižuje teplota nasedání primerů.
36
Program použité touchdown PCR: Touchdown od 55 °C do 50 °C - 94 °C/3 minuty – počáteční denaturace - 94 °C/30 vteřin – denaturace - 55 °C/1 minuta – nasedání primerů; -1°C/cyklus
5 cyklů;
- 72 °C/2 minuty – elongace - 94 °C/30 vteřin - 50 °C/1 minuta −
15 cyklů
72 °C/2 minuty
4.7 Gelová elektroforéza Jde o separační metodu, která k dělení látek využívá jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Metoda je používána k separaci a detekci PCR produktů, stanovení koncentrace a přípravu fragmentů ke klonování. Koncentrace gelu se stanoví podle očekávané délky DNA fragmentů (tab. č. 7; dle Sambrook a Russel, 2001). Koncentrace agarózy (% [w/v])
Rozsah separace lineárních molekul DNA (kb)
0,3
5 - 60
0,6
1 - 20
0,7
0,8 - 10
0,9
0,5 - 7
1,2
0,4 - 6
1,5
0,2 - 3
2,0
0,1 - 2
Tabulka č. 7: Koncentrace agarózy podle délky separovaných fragmentů.
37
Agaróza se rozvaří v TAE pufru. Ihned po rozvaření se přidá fluorescenční barvivo ethidium bromid (výsledná knocentrace gelu 0,5 μl/ml), které slouží pro zviditelnění průběhu elektroforézy. Do vzorků se přidá nanášecí pufr 6x Loading Dye Solution (MBI Fermentas). Jako délkový standard se použil GeneRuler™ 100bp DNA Ladder nebo Gene Ruler
TM
1kb DNA
ladder. Gel se ponoří do TAE pufru tak, aby byl celý pod hladinou. Elektroforéza probíhá při voltáži nastavené podle vzdálenosti elektrod (5 – 10 V/cm gelu). Po ukončení elektroforézy se gel snímá CCD kamerou (SynGene) s využitím Gene Snap softwaru na UV transiluminátoru. Následně se výsledek zdokumentuje a upraví v programu Gene Tools.
4.8 Příprava DNA pro sekvenování 4.8.1 Extrakce PCR produktů z gelu pomocí kitu QIA Gel Extraction Kit (QIAgen) Metoda slouží k odstranění primerů a nespecifických produktů PCR ze studovaných PCR produktů. Je založena na schopnosti DNA se v koncentrovaném roztoku chaotropní soli guanidin hydrochloridu vázat na silikagelovou matrix, která se nachází na kolonkách. DNA se uvolní roztokem soli o nízké iontové síle. V prvním kroku dochází k vazbě DNA na silikagelovou matrix. Na jeden objem gelu se přidají 3 objemy pufru QG (1 gram představuje 1 ml gelu). Inkubace při 50 °C 10 minut. Protřepávat. K 1 objemu gelu se přidá 1 objem isopropanolu. Roztok se přepipetuje do dodávané kolonky. Centrifugace. K odstranění zbytků agarózy se přidá 0,5 ml QG pufru. Centrifugace. Na kolonku se přidá 0,75 ml PE pufru. 2–5 min inkubace při pokojové teplotě. Centrifugace. Pro eluci DNA se do středu kolonky přidá 6x zředěný EB pufr, nechá stát 1 minutu. Centrifugace.
4.8.2 Klonování PCR produktů
4.8.2.1 pGEM - T Easy (Promega) Tato metoda slouží ke klonování PCR produktů. Vektor má schopnost přijmout cizorodou DNA, 38
spojit se s ní a autonomně se replikovat v hostitelské buňce. Vektor obsahuje dále gen, který zajišťuje rezistenci bakterií k ampicilinu. Ampicilin je obsažen v mediu, pak brání růstu bakteriálních kolonií, které neobsahují plazmid. Sekvence T7 a SP6 usnadňují amplifikaci a sekvenaci vloženého inzertu (obr. č. 6 ).
Obrázek č. 6: Kruhová mapa vektoru pGEM-T Easy (Promega) Pro přípravu ligační směsi je nutné určit množství PCR produktu, který je přečištěný pomocí předešlého kroku extrakce PCR produktu.
vektor (ng ) =
vektor (ng ) ⋅ velikostinzertu (kb) ⋅ molárnípoměrinzertu ÷ vektor velikostvektoru (kb)
Při přípravě ligační směsi je nutné následující složky (tab. č. 8) řádně promíchat pipetováním.
Složení reakční směsi
Množství
2x Rapid Ligation Buffer
5 µl
pGEM – T Easy Vector
0,5 µl
PCR produkt
množství podle výpočtu
T4 DNA ligáza
1 µl
voda
doplnit do 10 µl 39
Tabulka č. 8: Složení ligační směsi. Inkubovat minimálně 1 hodinu při pokojové teplotě.
4.8.2.2 pDNR-CMV linearizovaného vektoru (Clontech) Vektor umožňuje klonování dlouhých PCR produktů. Linearizovaný vektor je odvozen od lidského cytomegaloviru. Tento vektor má také gen pro rezistenci na ampicilin, která umožňuje selekcí pozitivních kolonií. Sekvence T7 a M13 usnadňují amplifikaci a sekvenaci vloženého inzertu (obr. č. 7)
Obrázek č. 7: Kruhová mapa vektoru pDNR-CMV Pro nejefektivnější provedení ligace je doporučený molární poměr inzert:vektor 2:1. Což odpovídá 100 ng na 4-5 kb linearizovaného vektoru a 50 ng na 1 kb PCR fragmentu. Výsledný objem se doplní na 10 μl. Inkubuje se 15 minut při 37 °C a následně 15 minut při 50 °C. Do směsi se přidá 40 μl TE pufru (pH 8). Před transformací se uchová na ledu.
40
4.8.3 Transformace kompetentních buněk Escherichia coli Na ledu se rozmrazí kompetentní buňky a přidá se 2 µl předem připravené ligační směsi, jemně promíchá a nechá stát na ledu. Poté se provede teplotní šok zahřátím ve vodní lázni na 42 °C po dobu 100 vteřin a okamžitě se vrátí na led. Přidá se 950 µl tekutého LB media a za stálého třepání (C24 Incubator Shaker – New Brunswick Scientific) se ponechá 1,5 hodiny při pokojové teplotě. Připraví se Petriho misky s pevným LB mediem obsahující ampicilin (60 µg/ml). Na misky se pomocí kličky přenesou připravené bakterie a ponechají 16 – 24 hodin při 37 °C.
4.8.4 PCR na koloniích PCR na koloniích slouží pro odlišení kolonií obsahující vektor s inzertem a kolonií, které obsahují pouze prázdný vektor. Jako templát se použily narostlé kolonie. PCR se provede podle postupu kapitoly polymerázová řetězová reakce s primery T7 (forward) a SP6 (reverse) při T = 60 °C a t = 3 min. Následná detekce proběhla gelovou elektroforézou. a
e
4.8.5 Izolace plazmidů pomocí QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen) Tato metoda slouží k izolaci plazmidové DNA z bakteriální kultury. Metoda je založena na alkalické lyzi bakterií. Po neutralizaci hydroxidů dochází k vysrážení proteinů a následně se izolovaná DNA zachytí na kolonku. Kolonie obsahující plazmid s inzertem se přenese do 5 ml LB media (60 µg/ml ampicilin). Inkubuje se 12 – 16 hodin při 37 °C za intenzivního třepání (C24 Incubator Shaker). Odebere se 3 ml kultury. Centrifugace a odstranění supernatantu. Buňky se resuspendují v 250 µl pufru P1. Přidá se 250 µl pufru P2, promíchá se, inkubace 5 minut při pokojové teplotě. V tomto bodě dochází k alkalické lyzi bakterií. Přidá se 350 µl pufru N3 a okamžitě se promíchá až do vzniku zakaleného roztoku, centrifugace. V tomto bodě se zneutralizuje hydroxid použitý v předchozím kroku a zároveň dochází k vysrážení proteinů. Supernatant se přepitetuje na QIAprep spin kolonu, centrifugace. V tomto kroku se DNA naváže na membránu kolonky.
41
Kolonka se promyje 0,5 ml PB pufru a centrifugace. Napipetuje 50 µl EB pufru. Po 1 minutě se zcentrifuguje. V tomto kroku dochází k eluci DNA z kolonky.
4.8.6 Stanovení koncentrace plazmidové DNA Před stanovením koncentrace se plazmidy linearizují restrikčním štěpením pomocí restrikční endonukleázy EcoRI. Jedná se o endonukleázu, která je izolovaná z E. Coli. Následně se na základě intenzity proužků stanoví koncentrace programem GeneTools. Reakční směs pro štěpení restrikční endonukleázou EcoRI: - 1 µl pufru pro štěpení restrikční endonukleázou EcoRI - 3 µl DNA - 0,2 µl restrikční endonukleáza EcoRI - Doplnit vodou na objem 6 µl Inkubovat 60 minut při teplotě 37 °C Výsledek restrikčního štěpení se detekuje na agarózovém gelu společně s několika různými koncentracemi hmotnostního standardu. Gel se snímá programem GeneSnap a v programu GeneTools se zjistí intenzita proužku a porovná s intenzitou hmotnostního standardu, který je ve stejné délce, jako stanovovaný vzorek.
4.8.7 Sekvenace PCR produktů Sekvenace PCR produktů byly provedeny v německé firmě MWG Biotech and Medigenomix. Podle požadavků firmy se připraví PCR produkt, který obsahuje na každých 1000 bp 120 ng DNA. Odešle se společně s požadovaným množstvím primeru, se kterým má být reakce provedena. 4.8.8 Analýza získaných sekvencí Sekvence se zpracovávají v programu BioEdit. Jedná-li se o plazmid s inzertem, je nutné odstranit sekvenci plazmidu. K ověření identity sekvencí se vloží do programu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. 1997), který vyhledá homologní proteinové anebo nukleotidové sekvence. 42
4.9 Fylogenetické analýzy Ze získaných sekvencí se vytvoří alingment sekvencí pomocí programu T–COFFEE (Notredame et al. 2004). V programu Gblocks (Talavera a Catresavna 2007) se odstraní nedostatečně homologní části sekvencí, které by způsobovaly informační šum. K tvorbě fylogenetických stromů jsem použila dvě metody: – maximální věrohodost (Maximum Likelihood) programem Tree Puzzle (Schmidt et al. 2007) a Phyml (Guindon and Gascuel, 2003) s použitím 500 opakování pro zjištění hodnot „bootstrap“ (hodota, která udává frekvenci, s jakou byla daná topologie nalezena při příslušném počtu opakování). −
Program MrBayes – analýza byla provedena v několika opakováních pro zabezpečení
konvergence. Každé opakování bylo provedeno se čtyřmi řetězci a jedním milionem generací (lokální statistická podpora vyjádřená pomocí posteriorní pravděpodobnosti). Vysoká efektivita metody se docílí použitím MCMC (Monte Carlo Markov Chain). Obě metody vyžadují volbu matematického modelu programem MrAic (Burnham and Anderson, 2002). Vyhodnocením bylo použití modelu GTR (Rodríguez et al. 1990).
43
5 VÝSLEDKY Cílem práce bylo klonování a sekvenování analyzovaných genů u vybraných druhů rodu Silene. Ze získaných dat se prováděly fylogenetické analýzy, které mají poukázat na evoluční vztahy sekce Elisanthe a Otites. Dále z jakého rozmnožovacího systému se dvoudomost u těchto druhů vyvinula.
5.1 Volba genů pro analýzy Na práci jsem spolupracovala s paní RNDR. Jitkou Žlůvovou PhD. a paní Mgr. Elleni Michu. Před započetím mé diplomové práce již byly vybrány geny. Podmínky, které ovlivňovaly zvolení těchto genů jsou získat sekvence, které jsou natolik polymorfní, aby obsahovaly informace pro sestrojení fylogenetických stromů, které zobrazují evoluční histroii analyzovaných druhů a dále výskyt těchto genů u všech analyzovaných druhů. S tímto souvisí kompromis, který musí mezi zvolenými geny existovat. Jelikož příliš pomalu vyvíjející se geny poskytují málo informací a na druhou stranu příliš rychle vyvíjející se geny způsobují vznik informačního šumu, který znehodnocuje výsledek. Na těchto základech je možné zjistit příbuznost jednotlivých druhů a postavení dvoudomých druhů mezi ostatními druhy. K vybraným genům byly navrhnuty specifické primery, které umožňují zmnožení genomické DNA a tak i další analýzy. V tabulce č. 1 kapitole materiály a metody, jsou uvedeny všechny druhy, které byly k analýze vybrány. V tabulce č. 4 jsou mnou použité specifické primery.
5.1.1 Analyzované geny V tabulce č. 9 jsou uvedeny všechny geny a druhy, které byly podrobeny analýzám. Červeně jsou označeny geny, které byly mnou analyzované. A jedná se o gen CCLS1, EiF4A, gen pro spermidin syntázu, ribozomální DNA a Men 524. Zelenou barvou jsou v tabulce označeny geny a druhy, které byly z analýz vyřazeny, z důvodu nedostatečného množství dat.
44
mat
men-
K
194
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
ano
ano
ne
ano
ano
ano
ano
ano ano
L. chalcedonica ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
S. latifolia
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
S. diclinis
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
ano
S. dioica
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
ano
S. heuffelii
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
S. colpophylla
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
S. otites
ano
ano
ano
ano
ano
Druh
COB
S. occymoides P. glaucifolia
S. marizzii
ano
S. acaulis
ano
mtSsu rDNA
Sperm. synt.
CCLS1 eIF rbcl
ano ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
S. viscosa
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
S. zawadskii
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
ano ano
S. pendula
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano ano
S. vulgaris
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
S. saxifraga
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
S. nutans S. dichotoma
ano
ano
524
ano
S. noctiflora
S. conica
men-
ano
ano
Tabulka č. 9: Analyzované druhy a geny.
5.2 Získávání sekvencí pro fylogenetické analýzy
5.2.1 Gen CCLS1 Gen CCLS1 (Chemical cross-linking subtraction) se nachází u všech rostlinných druhů, proto je jistota výskytu u rodu Silene. Jeho exprese byla zjištěna v tapetu a mikrospórách. Kóduje protein homologní k fosfolipidovému transferovému proteinu (Barbacar et al. 1997). Sekvence genu CCLS1 byly získány pomocí specifických primerů CCLS1R1 a CCLS1F1, které jsou uvedeny
45
v seznamu použitých primerů (tabulka č. 4). Mezi analyzované druhy patří Saponaria occymoides, Petrocoptis glaucifolia, S. diclinis, S. dioica, S. heuffelii, S. colpophylla, S. viscosa, S. conica, S. pendula, S. vulgaris, S. saxifraga, S. dichotoma U všech druhů byl použit reakční profil, při kterém byla teplota nasedání primerů 60 °C a doba elongace 1 minuta. Pouze u druhu Saponaria occymoides se tento reakční profil jevil jako nedostatečný, proto se zvolil profil s postupným snižováním teploty nasedání primerů „touch down“ 55–50 °C, který je uvedený v kapitole 4.6 Polymerázová řetězová reakce s postupným snižováním Ta "touchdown". Z této reakce vyšly dva proužky o délce 500 a 400 bp (obr. č. 8b). Oba byly zaslány k osekvenování. Homologie ke genu CCLS1 byla nalezena u proužku 500 bp. Ostatní druhy byly z důvodu nekvalitních sekvencí klonovány (obr. č. 8a).
Obrázek č. 8: a) Plazmid s inzertem (100 bp DNA ladder, (1) P. glaucifolia, 950 bp, (2) S. diclinis, 900bp, (3) S. heuffelii, 900 bp, (4) S. dioica, 850bp, (5) S. dichotoma, 950 bp, (6) S. colpophylla, 900 bp, (7) S. pendula, 800 bp, (8) S. viscosa, 900 bp, (9) S. conica, 900 bp, (10) S. vulgaris 900 bp, (11) S. saxifraga, 900 bp). b) PCR produkt (Saponaria occymoides, 400 a 500 bp).
46
5.2.2 Gen EiF EiF4A – eukaryotický iniciační faktror 4A. Jeho úkolem je navázání mRNA na 40S ribozomální podjednotku. Další funkcí je helikázová aktivita, která proplétá dvouvláknovou RNA. Sekvence genu EiF byly získány pomocí specifických primerů EiF – R a EiF – F, které jsou uvedeny v tabulce použitých primerů (tab. č. 4). Mnou analyzované druhy jsou Petrocoptis occymoides, S. colpophylla, S. conica, S. pendula, S. vulgaris, S. saxifraga a S. dichotoma. Gen u druhu Petrocoptis occymoides byl z důvodu získání kvalitnější sekvence klonován (obr. č. 9a). Ostatní druhy byly sekvenovány z PCR produktu (obr. č. 9b,c) Gen EiF u všech druhů amplifikován při reakčním profilu, kdy teplota nasedání primerů byla 60 °C, 57 °C a 54 °C a doba elongace 1 minuta.
47
Obrázek č. 9: a) Plazmid s inzertem (Saponaria petrocoptis, 1500 bp). b) (1) S. saxifraga, 650 bp 60 °C, (2) 57 °C, (3) 54 °C, (4) S. colpophylla, 650, 60 °C, (5) 57 °C, (6) 54 °C, (7) S. pendula, 1800 bp 60 °C, (8) 57 °C, (9) 54 °C. c)
(1) S. conica, 750 bp 60 °C, (2) 57 °C, (3) 54°C, (4) S. dichotoma, 750 bp, 60 °C, (5) 57
°C, (6) 54 °C. 5.2.3 Ribozomální DNA Ribozomální DNA reguluje amplifikaci a iniciaci transkripce a obsahuje jednotky NTS (netranskribovaná oblast) a ETS (vnější transkribovaná oblast) a ITS (vnitřní transkribovaná oblast). 48
Sekvence genu pro rDNA byly získány u druhů Lychnis chlacedonica, S. viscosa a S. colpophylla (obr. č. 10). Specifické primery pro rDNA jsou uvedeny v tabulce použitých primerů (tab. č. 4). Reakční profil byl u všech druhů stejný a teplota nasedání primerů byla 60 °C a doba elongace 1 minuta.
Obrázek č. 10: (1) Lychnis chalcedonica, 750 bp, (2) S. viscosa, 750 bp, (3) S. colpophylla, 750 bp. 5.2.4 Spermidin syntáza Při amplifikaci genu pro spermidin syntázu byla u všech druhů délka PCR produktu 500 bp. Ovšem při amplifikaci spermidin syntázy u samčí rostliny S. diclinis se pomocí Taq polymerázy nepodařilo nic naamplifikovat. Z toho důvodu byla použita metoda Long PCR, pro amplifikaci dlouhých PCR produktů, který zde mohl být očekáván. Použité specifické primery SAPONF1 a R17 jsou uvedeny v tabulce použitých primerů (tab. č. 4). Reakci jsem prováděla při třech teplotách nasedání primerů 54 °C, 57 °C, 60 °C a době elongace 7 minut. Pro optimalizaci podmínek reakce jsem použila různé koncentrace DMSO a to 0 %, 2%, 4 % a 8 %. Výsledek reakce (obr. č. 11) ukázal, že u samičí rostliny Silene diclinis se vykytuje pouze jeden proužek o délce 500 bp. U samce bylo v podmínkách 0 a 2 % několik proužků, které byly vyřezány a příslušné množství společně s jedním primerem (R17) zaslala do laboratoře, kde byl PCR produkt osekvenován. Homologie k spermidin syntáze se prokázala u nejtěžšího proužku, jehož 49
délka je 7,5 kb. Jelikož jedna sekvenační reakce osekvenuje pouze přibližně 1000 bp, rozhodla jsem se daný vzorek naklonovat do speciálního vektoru pDNR - CMV, který pochází z lidského cytomegaloviru a následně osekvenovat celý 7,5 kb PCR inzert. Tím je možné vyřešit problém s nedostatkem PCR produktu, kterého je při sekvenování dlouhého PCR produktu je potřeba mít dostatek. Reakce vyžaduje navrhnutí speciálních primerů, které obsahují přesahy o délce 15 nukleotidů, které umožní úspěšnou ligaci inzertu do vektoru. Jedná se o primery SaponklonF1 a R1spermklon, které sou uvedeny v tabulce použitých primerů (tab. č. 4). PCR produkt byl obtížně klonovatelný a práce vyžaduje více času, který je nad rámec diplomové práce. Předpoklad je, že dlouhý PCR produkt obsahuje dlouhý intron. Předpokládáme, že příčinou dlouhého PCR produktu je dlouhý intron, který sám o sobě může způsobit problém při klonování.
Obrázek č. 11: S. Diclinis. Samice proužek o délce 500 bp. Samec proužky o délce 500 bp, 600 bp a 7,5 kb.
5.2.5 Men 524 Men 524 představuje gen pro 4-kumarát koenzym A ligázu. Sekvence pro gen Men524 byly získány pomocí specifických primerů Men524-F a Men524-R, které jsou uvedeny v seznamu použitých primerů (tab. č. 4). Tento gen jsem analyzovala u druhů S. diclinis a S. noctiflora a S. dioica (obr. č. 12). Reakční profil byl použit 55°C a doba elongace 1 minuta. Všechny vzorky byly klonovány.
50
Obrázek č. 12: Plazmid s inzertem. (1) S. dioica (900 bp), (2) S. diclinis (900 bp), S. noctiflora (900 bp).
5.3 Příprava dat k fylogentickým analýzám U všech získaných nukleotidových sekvencí jsem zjistila homologii k příslušnému genu srovnáním v databázi BLAST. Pro každý gen se pomocí programu T-COFFEE, vytvořil alignment, který se skládal ze sekvencí všech druhů, které byly u daného genu získány. Z každého alignmetu byly odstraněny v programu Gblocks nehomologní části sekvencí, které by způsobovaly šum.
5.4 Vytvoření fylogenetického stromu Pomocí dvou metod maximální věrohodnosti a Bayesovskou metodou byl pro každý gen sestrojen fylogenetický strom. Tyto metody vyžadují zvolení matematického modelu. K tomu byl použit program MrAic, který spočítá, jaký model je pro daná data nejlepší. Prokázalo se, že zvlášť analyzované geny daly odlišné informace. Situaci bylo možné předpokládat, protože evoluční historie genu se často liší od evoluční historie druhů. Běžnou praxí, jak se s tímto problémem vypořádat je spojit všechny geny dohromady a vytvořit tak strom z jediného alignmentu. Fylogenetické stromy sestrojené pro každý gen zvlášť jsou uvedeny v příloze. 51
Tento superalignment byl zpracován programem MrBayes a maximální věrohodnosti. Jako matematický model byl zvolen GTR. Další parametry pro sestrojení fylogenetického stromu jsou uvedeny v kapitole materiál a metody. Pro program maximální věrohodnosti bylo použito 500 boostrapového opakování. Oba výsledné stromy byly totožné, proto uvádím jeden vytvořený metodou MrBayes (obr. č. 13), u které se využívá statistická lokální podpora pomocí posteriorní pravděpodobnosti.
Větve stromu jsou dostatečně statisticky podporovány (za dostatečné se
považuje pravděpodobnost větší než 0,95). Pro určení směru evoluce byly zvoleny tři druhy, jako vnější člen, který určí správný směr evoluce. K tomuto účelu byly zvoleny mydlice bazalkovitá (Saponaria occymoides), Petrocoptis glaucifolia, Lychnis chalcedonica, které náleží do stejné čeledi hvozdíkovité (Caryophyllaceae). Nároky na vnější člen jsou, aby druh byl příbuzný s ostatními analyzovanými druhy, ale dostatečně, aby tvořil kořen stromu. K tomuto účelu byl nejvíce vhodný druh Saponaria ocymoides.
52
Obrázek č. 13: Výsledný fylogenetický strom vytvořený programem MrBayes. Číselné hodnoty udávají posteriorní pravděpodobnost.
5.5 Fylogenetické analýzy Finální superalignment obsahuje 11235 nulkeotidových pozicí, 9 genů a 17 druhů, přičemž ne každý gen obsahoval sekvence pro všechny druhy. Je patrné, že během evoluce duhů rodu Silene došlo k vytvoření dvou dvoudomých skupin, které jsou na sobě nezávislé (Desfeux et al. 1996). Ovšem okolnosti, na základě kterých se dvoudomost vyvinula se zdají být poněkud odlišné. U každé skupiny se vyskytují blízce příbuzné duhy, které mají odlišný systém rozmnožování. U sekce Elisanthe předchází dvoudomosti hermafroditismus a u sekce Otites gynodioecie. 53
6 DISKUZE Rod Silene je velice vhodný ke studiu evoluce reprodukčních systémů, protože zahrnuje různé reprodukční strategie od hermafroditizmu, přes gynodiecii, až po dvoudomost (Ainsworth, 2000). DNA sekvence, získané z rostlinných druhů slouží jako důležitý zdroj informací pro fylogenetické rekonstrukce. Již práce Desfeux et al. 1996, se věnovala otázkám vzniku dvoudomosti u rodu Silene. Pomocí fylogenetických analýz bylo možné do různé míry odpovědět na některé otázky. A to například, jaký byl původní reprodukční systém, který předcházel vzniku dvoudomosti. Kolikrát a z čeho se zde vyvinuly dvoudomost, hermafroditizmus a gynodioecie. A dále mohou fylogenetické analýzy odhalit podmínky a selekční tlak, které mohou způsobit změny v reproduktivním systému anebo zda existuje vztah mezi ekologií druhů (např. nadmořská výška, klimatické podmínky, atd.) a jejich reprodukčním systémem. Také jaký je vztah mezi dvoudomými a gynodioecickými druhy, u kterých je možné očekávat jaderně-cytoplazmatickou determinaci pohlaví, jako je tomu např. u S. vulgaris, (Marsden-Jones a Turrill 1957). Nevýhodou studie Desfeux et al. (1996) je, že k fylogenetickým analýzám byl použit pouze jeden marker ITS (vnitřní přepisovaný mezerník) oblasti jaderné ribozomální DNA (Baldwin, 1992) a výsledné fylogenetické stromy neměly dostatečnou statistickou podporu. My jsme se rozhodli ověřit výsledky použitím většího množství dat, analýzou DNA sekvencí získaných z celkem devíti markerů. Námi získaný fylogenetický strom měl vysokou statistickou podporu nejenom u dvoudomých skupin, jak tomu bylo u Desfeux et al. (1996), ale také i u ostatních analyzovaných druhů. Potvrdilo se, že dvoudomost se vyvinula nejméně dvakrát nezávisle na sobě u druhů sekce Elisanthe a Oties, ačkoli okolnosti vzniku u těchto dvou skupin se zdají být odlišné. Reprodukčních strategií u rodu Silene je velké množství a nedá se vždy s přesností určit o jaký reproduktivní systém se jedná, protože je možný výskyt řady přechodných stavů. Například, ačkoliv se u některých druhů vyskytuje samoopylení, mohou se u jedince vyskytovat kromě hermafroditních květů i samičí květy (S. noctiflora). Jako původní reprodukční systém se považoval hermafroditizmus, ze kterého následně přes gynodioecii došlo ke vzniku dvoudomosti (Charlesworth a Charlesworth, 1978). Striktní hermafroditizmus byl popsán pouze u druhu S. conica a S. gallica, které jsou vysoce autogamní až kleistogamní, kdy dochází k opylení, již před 54
rozkvětem. Ovšem, hojný výskyt samičích květů v mnoha druzích rodu Silene, tuto hypotézu vyvrací a přiklání se spíše k tomu, že ancestrální reprodukční systém je gynodioecie. Za předpokladu, že gynodioecie byla ancestrální reprodukční systém, k nezávislému vzniku dvoudomosti mohlo vést několik různých okolností. Můžeme předpokládat, že podmínkou k udržení samičích květů v jinak hermafroditní populaci je fixace sterilní cytoplazmy vedoucí k cytoplazmatické samčí sterilitě a současně přítomnost jaderného restoreru, který zabezpečuje uchování samčí funkce v hermafroditním květu. Za určitých okolností je tato strategie uchování samičích a hermafroditních květů v populaci velmi výhodná, protože při relativně nízkých energetických nákladech (poloviční množství samců v populaci) na tvorbu samčích pohlavních orgánů se zvýší rozmnožovací potenciál populace. Tento jednoduchý model gynodioecie se mohl vyvinout do různé míry složitosti. U S. vulgaris například existuje vysoká míra polymorfizmu jak sterilní cytoplazmy, tak i restorerů. Gynodioecie je zde natolik stabilní systém, ze kterého by dvoudomost mohla vzniknout velice těžko. Dvoudomost se mohla vyvinout z takového gynodioecického systému, který nebyl příliš složitý. A to fixací mutace, která by brzdila vznik samičích orgánů a dala vznik samčích květů. V souladu s Desfeux et al. (1996) je možné předpokládat, že v sekci Otites vznikla dvoudomost přímo z gynodioecie. Kdežto u druhů sekce Elisanthe
vznikla dvoudomost postupně skrze různé
nestabilní gynodioecické systémy, které mohly vést až k reverzi k hermafroditizmu. Například S. noctiflora byla považována za hermafroditní druh, ovšem byl prokázán výskyt samičích květů a S. conica je striktně hermafroditní. Okolnost vedoucí k těmto změnám by mohl být selekční tlak v populaci vyvolaný různými ekologickými vlivy (změna teploty, klimatu). Předpoklad, že dvoudomost u rodu Silene, vznikla několikrát, nezávisle na sobě za jiných okolností je kromě fylogenetických analýz podpořen i dalšími fakty. U větve, která zahrnuje sekci Elisanthe se vyvinuly heteromorfní dobře morfologicky odlišitelné pohlavní chromozómy (Armstrong a Filatov, 2008). V druhé větvi zahrnující sekci Otites pohlavní chromozómy nejsou heteromorfní. Geny vázané na pohlaví u S. latifolia (sekce Elisanthe) se liší od genů vázaných na pohlaví u S. colpophylla (sekce Otites) a předpokládá se, že pohlavní chromozomy u obou skupin vznikly z jiného autozomálního předka (Mráčková et al. 2008). Dále se u sekce Otites vyskytují přechodná hermafroditní stádia, zatímco u sekce Elisanthe jsou jedinci čistě dvoudomí, což také může poukazovat na různé selekční tlaky a podmínky, které 55
vedly k dvoudomosti . Jiná možnost je, že dvoudomost vznikla v sekci Elisanthe dříve, než v Otites. Závěrem je možno říci, že v souladu s prací Desfeux et al. (2006) je možné předpokládat, že dvoudomost se vyvinula z jaderně-cytoplazmatické gynodioecie nejméně dvakrát nezávisle na sobě za velice různých ekologických podmínek. Vznik dvoudomosti z gynodioecie může být spjat s evolucí směrem k samoopylení, jako je to u sekce Elisanthe.
56
7 POUŽITÁ LITERATURA Ainsworth C. Boys and girls come out to play: the molecular biology of dioecious plants. Ann Bot (Lond). 86:211-22 (2000). Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genration of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389 – 402 (1997). Barbacar N, Hinnisdaels S, Farbos I, Monéger F, Lardon A, Delichere C, Mouras A, Negruitu I. Isolation of early genes expresses in reproductivr organs of the dioecious white campion (Silene latifolia by subtraction cloning using an asexual mutant. The Plant Journal. 12: 805 – 817 (1997). Baldwin BG. Phylogenetics utility of the internal transcribed spacer of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Comositae. Mol. Phyl. Evol. 1: 3 – 16 (1992). Barrett SCH. The evolution of plant sexual diversity. Nature. 3: 274 - 284 (2002). Burnham, K. P., and D. R. Anderson. Model selection and multimodel inference, a practical information-theoretic approach. Second edition. Springer, New York (2002) Ciupercescu DD, Veuskens J, Mouras A, Ye D, Biquet M, Negruitu I. Karyotiping Melandrium album, a dioecious plant with heteromorphic sex chromosomes. Genome. 33: 556 - 562 (1990). Correns C. Die bestimmung und vererbung des geschlechtes nach versuchen mit hoheren pflanzen. Verhandlungen der Gesselschaft Deutscher Naturforcher und Artze. 764 - 802 (1907). Correns C. Handbuch der Verebungswissenschaft, Vol. 2. E. Baur And M Hartmann, Berlin (1928). Cvrčková F. Úvod do praktické bioinformatiky. Academia. 80-200-13-60 (2006).
57
Delpf LF, Wolf DE. Evolutionary consequences of gender plasticity in genetically dimorphic breeding sysytem. New Phytologist. 166: 19 – 128 (2005). Donninson LS, Široký J, Vyskot B, Saedler H, Grant SR. Isolation of Y chromosome-specific sequencs from Silene latifolia and mapping of male sex-determination genes using representational differrence analysis. Gentics. 144: 1803 -1901 (1996). Erlandson R, Wilson, J., Paabo, S. Sex chromosomal transposable element accumulation and male-driven substitutional evolution in humans. Mol. Biol. Evol. 17: 804-812 (2000). Farbos L, Veuskens J, Vyskot B, Oliveira M, Hinnisdaels. Sexual dimorphism in white campion deletion on the Y chromosome results in a floral asexual phenotype. Genetics. 151: 1187 – 1196 (1999). Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies :An approach using the bootstrap. Evolution. 39: 783 - 791 (1985).
Filatov DA, Monéger F, Negrutiu I, Charlesworth D. Evolution of a plant Y-chromosome: variability in a Y-linked gene of Silene latifolia. Nature, 404: 388–390 (2000). Fitch WM, Margoliash E. Construction of phylogenetics trees. Science. 155:279 - 284 (1967). Graves, J., Wakefield, M., Toder, R. The origin and evolution of the pseudoautosomal regions of human sex chromosomes. Hum. Mol. Genet. 7: 1991-1996 (1998). Guindon, S., and O. Gascuel. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate phyogenies by maximum likelihood. Systematic Biology. 52:696-704 (2003). Hansen DJ, Bellman SK, Sacher RM. Crop Sci. 16: 371 (1976). Hamdi S, Teller G, Louis JP. Master regulatory genes, auxin levels, and sexual organogeneses in the dioecious plant Mercurialis annua. Plant Physiology. 85: 393 - 399 (1987). Helsop-Harisson J. Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc. 32:38 (1957).
58
Hofmeyr JDJ. Genetical studies of Carica papaya L.I. The inheritance and relation of sex and certain plant characteristic. Sex reversal and sex forms. South Africa Department of Agriculture, Science Bulletin. 187: 64 (1938). Huelsenbeck JP, Ronquist F, Nielsen R, Bollback JP. Bayesian inference of phylogeny and its impact on evolutionary biology. Science . 294: 2310 - 2314 (2001). Charlesworth B, Charlesworth D. A model for the evolution of dioecy and gynodioecy. American Naturalist. 112: 975 – 997 (1978). Charlesworth D. Plant sex determinatin and sex chromosomes. Heredity. 88:94 – 1001 (2002). Charlesworth, B. The evolution of sex chromosomes. Science. 251:1030 – 1033 (1991). Jones DT, Taylor WR, Thorton JM. A rapid generation of mutation data matrices from protein molecules. In: Munro HN: Mammalian Protein Metabolism. Academic, NY (1992). Jukes TH, Cantor CR. Evolution of protein molecules. In Munro HN: Mammalian Protein Metabolism Academy, NY. Khadka DK, Nejidat A, Tal M, Golan-Goldhirsh A. Molecular characterisation of a genderlinked DNA marker and a related gene in Mercurialis annua L. Planta. 222: 1063-70. Kocyan A, Zhang LB, Schaefer H, Renner SS. A multi-locus chloroplast phylogeny for the Cucurbitaceae and its implications for character evolution and classification. Molecular Phylogenetics an Evolution. 44: 553 - 77 (2007). Lahn BT, Page DC. Four evolutionary starta on the human X chromosome. Science. 286: 964967 (1999). Lardon A, Georgiev S, Aghmis A, Le Merrer G, Negruitu I. Sexual dimorphism in white campion: complex control of carpel number is revealed by Y chromosome deletions. Genetics. 151: 1173 – 1185 (1999). Lengerová M, Moore RC, Grant SR, Vyskot B. The sex chromosomes of Silene latifolia revisited and revised. Genetics. 165: 935 – 938 (2003). 59
Liu Z, Moore PH, Ma H, Ackerman CM, Ragiba M, Yu Q, Pearl HM, Kim MS, Charlton JW, Stiles JI, Zee FT, Paterson AH, Ming R. A primitive Y chromosome in papaya marks incipient sex chromosome evolution. Nature. 427: 348 - 352 (2004). Louis JP. Genes for the regulation of sex differentiation and male fertility in Mercurialis annua L. Journal of Heredity. 80: 104 - 111 (1989)¨. Lyon M. Gene action in the X chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature. 190: 372373 (1961). Marsden-Jones EM, Turril WB. The bladder campions. London: The Ray Society. (1957). Miller JS, Venable DL. Polyploidy and the evolution of gender dimorphism in plants. Science. 289: 2335 - 2338 (2000). Mitwoch U. Genetics of sex determination. An overview. Advances in Genetics. 4: 1 - 28 (1996). Muller T, Vingron M. Modeling amino acid replacement. J. Comput Biol. 7: 761 - 776 (2000). Navajas-Pérez R, de la Herrán R, López González G, Jamilena M, Lozano R, Ruiz Rejón C, Ruiz Rejón M, Garrido-Ramos MA. The evolution of reprodictive systems and sex determining mechanisms within rumex (polygonaceae) inferred from nucelar and chloroplastidial sequence data. Molecular Biology and Evolution. 22: 1929 - 39 (2005). Nicolas M, Marais G, Hykelova V, Janousek B, Laporte B, Mouchiroud D, Negruitu I, Charleworth D, Monéger F. A gradual and ongoing process of recombination in the evolutionary history of the sex chromosomes in dioecious plants. PLoS Biology. 3: 47 - 56 (2005). Noterdame C, Suhre K. Computing multiple sequence structure alignments with the T-coffee pakage. Curr. Protoc. Bioinformatic. 3 (2004). Ohno S. Sex Chromosomes and Sex-linked Genes, Springer, Berlin (1967).
60
Patzak J, Vejl P, Skupinova S. Nesvadba V. Identification of sex in F1 progenies of hop (Humulus lupulus L.) by molecular marker. Plant production. 48: 318 - 321 (2002). Rannala B, Yang Z. Probability distribuction of molecular evolutionar trees: A new method of phylogenetic inference. Journal Mol. Evol. 43: 304 - 311 (1996). Rejón R, Jemilena CM, Garrido-Ramos MA, Parker JS, Ruiz Rejón M. Cytogenetic and molecular analysis of the multiple sex chromosome system of Rumex acetosa. Heredity. 72: 209 215 (1994). Renner SS, Beenken L, Grimm GW, Kocyan A, Ricklefs RE. The evolution of dioecy, heterodichogamy, and labile sex expression in Acer. Evolution. 61: 2701 - 2719 (2007). Renner SS, Ricklefs RE. Dioecy and its correlates in the flowering plants. American Journal Bot. 82: 596 - 606 (1995). Rice WR. Evolution of the Y sex chromosome in animals. Biosciences 46: 331 - 343 (1996). Rodríguez F. Oliver JL, Marian A, Medina R. The general stochastic model of nucleotide substitution.
Journal
Theor.
Biol.
142:
485
-
501
(1990).
Saitou N, Nei M. The Neighbour-Joining method: A new method for recontruction phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406 - 425 (1987). Sambrook J, Russel DW. Molecular cloning a laboratory manual. USA. CSHL Press. (2001) Sansome FW. Sex determination in Silene otites and related species. Journal of Genetics. 35: 387 – 396 (1938). Sakamoto K, Ohmido A, Fukui K, Kamada H, Satoh S. SIte-specific accumulation of a LINElike retrotransposones in a sec chromosome of the dioecious plant Cannabis sativa. Plant Molecular Biology. 44: 723 - 732.
61
Shephard H, Parker J, Darby P, Ainsworth CC. Sex expression in hop (Humulus lupulus L. and H. japonicus Siev. et Zucc): floral morphology and sex chromosomes. Sex Determination in Plants, Bios, Oxford. 149 - 162 (1999). Schartl M. Sex chromosome evolution in non-mammalian vertebrates. Current Opinion in Genetics and Development. 14: 634 – 641 (2004). Schmidt HA, von Haeseler A. Maximum-likelyhood analysis using TREE-PUZZLE. Cu. Protoc. Bioinformatic. 6 (2007) Smith BW. The mechanism of sex determination in Rumex hastatulus. Gnetics. 48: 1265 – 1288 (1963). Stevanovic, M., Lovell Badge, R., Collignon, J., Goodfellow, P. SOX3 is an X-linked gene related to SRY. Hum. Mol. Genet. 2: 2013-2018 (1993). Storey WB. Papaya. Hawaii Agriculture Experimental Station Report. 11 - 12. (1938). Talavera G, Castresana J. Improvment of phylogenies after removing divergent and ambiously aligned blocks from protein sequence alignments. Syst. Biol. 56: 564-77 (2007). Taylor DR. The genetics basis of sex ratio in Silene alba (= S. latifolia). Genetics. 136: 641 - 651 (1994). Howell EC, Armstrong SJ, Filatov DA. Evolution of Neo-sex chromosomes in Silene diclinis. Genetics
(dosud
nepublikováno,
2009).
Darlington C. The evolution og genetic systems. Oliver and Boyd, London (1958). Desfeux C, Maurice S, Henry JP, Lejeune B, Gouyon PH. Evolution of reproductive systems in
the
genus
Silene.
Biological
Sciences.
263:
409
-
414
(1996).
Mráčková M, Nicolas M, Hobza R, Negruitu I, Monéger F, Widmer A, Vyskot B, Janoušek B. Independent origin of sex chromosomes in two species of the genus Silene. Gnetics. 179: 1129 -
1133
(2008).
Talianová M. Survey of molecular phylogenetics. Plant Soil Enviroment. 9: 413 - 416 (2007). Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol.
Rev.
24:
1
-
7
(2000).
Chambers JK, Macdonald LE, Sarou HM, Ames RS, Freeman K, Foley JJ, Zhu Y, 62
McLaughlin MM, Mudrock P, McMillan L, Trill J, Swift A, Aiyar N, Taylor P, Vawter L, Naheed S, Szekers P, Hervieu G, Scott C, Watson JM, Murphy A, DUzic E, Klein C, Bergsma DJ, Wilson S, Livi P. A G protein-coupled receptor for UDP-glucose. J. Biol. Chem. 15:
10767
-
10771
(2000).
Steel M. Should phylogenetic models by trying to "fit an elephant". Trends Genet. 21: 307 - 309 (2005). Harisson CJ, Langdale JA. A step by step guide to phylogeny recontruction. Plant Journal. 45: 561
-572
(2006).
Edwards AWF, Cavalli-Sfororza LL. The reconstruction of evolution. Heredity. 18: 553 (1963). Fitch WM. On the problem of discovering the most parsimonious tree. American Nat. 111: 223 257
(1977).
Cavalli-Sforza LL, Edwards AWF. Phylogenetic analysis: Model and estimation procedures. Amercan
Journal
Human
Genetics.
19:
233
-
257
(1967).
Felsestein J. Evolutionary trees from DNA sequences: A maximum likelihood apporach. Journal Molecular Evolution. 17: 368 - 376 (1981). Vyskot B. Přehled vývojové biologie a genetiky. Ústav molekulární genetiky AV ČR. 80902588-1-6 (1999). Vyskot B, Hobza R. Gender in plants: sex chromosomes are emerging from the fog. Trends in gnetics. 20: 432 – 438 (2004). Wakeley J. Substitution rate variation among sites and the estimation of transition bias. MOl. Biol. Evol. 11: 436 - 442 (1994). Warmke HE. A new method for determining the sex heterozygote in species with morphologicallly undifferentited sex chromosomes and its application to Silene otites. Genetics. 27: 174 (1942). Weiblen GD, Oyama RK, Donoghue MJ. Phylogentic analysis of Dioecy in Monocotyledons. American Naturalist. 155: 46 - 58 (2000).
63
Westergaard M. Aberrant Y chromosomes and sex expression in Melandrium album. Hereditas. 32: 419 – 443 (1946). Westergaard M. The correlation between chromosome constitution and sex in the offspring of triploid Melandrium. Hereditas. 34: 217 - 281 (1948). Westwergaard M. Aberrant Y chromosomes and sex expression in Melandrium album. Hereditas. 32: 419 – 443 (1946). Whelan S, Goldman N. A general empirical model of protein evolution derived from multiple protein families using a maximum-likelihood approach. Mol. Evol. Biol. 18: 691 - 699 (2001). Winge O. On sex chromosomes, sex determination and preponderance of famels in some dioecious plants. Compets Rendus des Traqvaux du Laboratorie Carlsberg. 15: 1 - 26 (1923). Wirgley F. Taxonomy and chorology of Silene section Otites (caryophyllaceae). Annales Botanici Fennici. 23: 69 – 81 (1986). Witwer SW, Bukovac MC. Econ. Bot. 12: 213 (1958). Wolfe LM. Why aliwn invaders succed: support for the escape-from-enemy hypothesis. American Naturalist. 160: 705 - 711 (2002). Yampolsky C, Yampolsky H. Distribution of sex forms in the phanerogamic flora. Bibliotheca Genet. 3: 1 - 62 (1922). Yang Z. Estimating the pattern of nucleotide substitution. J. Mol. Evol. 39: 105 - 111 (1994). Yu Q, Hou S, Feltus FA, Jones MR, Murray JE, Veatch O, Lemke C, Saw JH, Moore RC, Thimmapuram J, Liu L, Moore PH, Alam M, Jiang J, Paterson AH, Ming R. Low X/Y devergence in four pairs of papaya sex-linked genes. Plant Journal. 53: 124-132 (2008).
64
Zhang LB, Simmons MP, Kocyan A, Renner SS. Phylogeny of the Cucurbitales based on DNA sequences of nine loci from three genomes: implications for morphological and sexual system evolution. Molecular Phylogenetics and evolution. 39: 305 - 322 (2006). Žlůvová J, Georgiev S, Janoušek B, Charleworth D, Vyskot B. Negruitu I. Early events in the evolution of the Silene latifolia Y chromosome: male specialization and recombination arrest. Genetics. 177: 375 – 386 (2007).
65
8 PŘÍLOHA
Fylogenetický strom pro gen EiF
Fylogenetický strom pro gen Men 194
Fylogenetický strom pro gen MtSsu 66
Fylogenetický strom pro gen CCLS1
Fylogenetický strom pro gen COB
Fylogenetický strom pro gen MatK
67
Fylogenetický strom pro gen rbcl
Fylogenetický strom pro gen rDNA
Fylogenetický strom pro gen spermidin syntáza 68
