11. 10. 2015
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Distribuční konstanta
HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi.
Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail:
[email protected] http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/
Distribuční konstanta KD je poměr rovnovážné koncentrace analytu ve stacionární fázi a mobilní fázi
KD
A A
A
s
s
A
m
m
je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi je rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi
1
4
Retenční charakteristiky
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
1/ Úvod do HPLC, její význam a využití. JC 5.10. 2/ Základní chromatografické charakteristiky. Teorie chromatografického patra. PK 12.10. 3/ Instrumentace v LC. Detektory v LC. PK 19.10. 4/ Separační systémy: Chromatografie s normálními a obrácenými fázemi. ZB 26.10. 5/ Separační systémy: Iontově výměnná chromatografie. Afinitní chromatografie. Gelová chromatografie. Chirální separace ZB 2.11. 6/ Praxe v LC. Vývoj kapalinové chromatografické metody. PK 9.11. 7/ Validace chromatografické metody. Problémy a jejich řešení v LC. PK. 16.11. 8/ Kvalitativní analýza v HPLC. Způsoby kvalitativní analýzy, PDA, MS, NMR, identifikace z retenčních dat. JC 23.11. 9/ Využití HPLC pro různé typy analytů, aplikace ve farmaceutické analýze, analýze potravin a životního prostředí. JC 30.11. 10/ Trendy a novinky v HPLC. Vícedimenzionální separační systémy. Miniaturizace, mikrofluidní systémy. Využití počítačových programů pro optimalizace separačních systémů. JC 7.12. 11/ Exkurze do Quinta Analytica. ZB (termín bude upřesněn). předtermín: 14.12.? 2
tR , i t M t ' R , i
tM
VR , i VM V ' R , i
tR , i
Retenční čas tR je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky Mrtvý čas tM je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován.
Redukovaný retenční čas t‘R je čas, který stráví analyt ve stacionární fázi. Retenční objem VR je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony. Mrtvý objem VM je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony.
5
Retenční charakteristiky
Sylabus přednášky:
Lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min]
Základní chromatografické charakteristiky: distribuční konstanta retenční čas retenční objem průtok mobilní fáze kapacitní faktor separační faktor rozlišení symetrie píku
u
L tM
Objemová průtoková rychlost mobilní fáze Fm [ml/min]
Fm Kapacitní faktor
Teorie chromatografického patra: účinnost separačního procesu Van Deemterova rovnice ovlivnění rozlišení
k
3
tR , i tM tM
Separační faktor - selektivita
k
VM tM
n n
i s
i m
KD , I *
k 2 KD , 2 k 1 KD ,1
Vs Vm
6
1
11. 10. 2015
Rozlišení píků
R1 , 2
Retenční charakteristiky
Teorie chromatografického patra
Počet teoretických pater
tR , i tR , i N 16 * 5.545 * wb w0.5
(tR , 2 tR ,1) 1 * ( wB , 2 wB ,1) 2
t R ,1
2
2
Výškový ekvivalent teoretického patra
L H N
tR , 2
Typický počet teoretických pater za optimálních separačních podmínek
Dva píky jsou rozděleny na základní linii, pokud R>1.5 7
10
Symetrie píku
Faktor asymetrie píku
Van Deemterova teorie
Tailing faktor píku
H Hp Hd Hm
Hp Hd
Hm Nesymetrické (¨fronting nebo tailing¨) píkí mohou způsobit
vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi
nepřesnou kvantifikaci zhoršení rozlišení zakrytí minoritních píků nereprodukovatelnost retenčních časů Snažíme se o co možná nejsymetričtější píky!
8
Teorie chromatografického patra
11
Hp vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi
Účinnost chromatografického procesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšiřována při průchodu HPLC systémem a kolonou.
Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo předbíhají)
Hp 2 * * d p A
Gaussova křivka tr – střední hodnota δ – směrodatná odchylka
geometrický faktor
velikost částic
Jak minimalizovat vířivou difuzi:
9
používat dobře naplněné kolony používat malé částice používat kolony s malou distribucí velikosti částic 12
2
11. 10. 2015
Hd molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi Molekuly analytu difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací.
Hd
2 * * Dm B u u
zavisí na objemu a geometrii detekční cely
difúzní koeficient
lineární rychlost mobilní fáze
korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony Jak minimalizovat vířivou difuzi:
2 2 2 2 2 celkem kolona injektor spoje det ektor
spojovací kapiláry mají být co nejkratší s malým vnitřním průměrem
používat vyšší průtoky mobilní fáze používat krátké spojovací kapiláry s vhodným vnitřním průměrem
Příspěvek molekulární difúze v LC je při běžných průtocích mobilní fáze zanedbatelný
Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón
objem vzorku má být co nejmenší
13
16
Hm odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi
průměr částic náplně kolony
* d p2 * d p2 *u C *u H Dm Dp
intračásticový difúzní koeficient
difúzní koeficient analytu v mobilní fázi
koeficient závislý na distribuci velikosti částic a distribuci pórů Jak minimalizovat odpor proti převodu hmoty: používat nižší průtoky mobilní fáze používat menší rozměry částic používat vyšší teplotu na koloně
H (µm)
14
17
15
18
Van Deemterova rovnice
minimální H
optimální průtoková rychlost
lineární průtoková rychlost (cm)
3
11. 10. 2015
Jak ovlivnit rozlišení? R1 , 2
(tR , 2 tR ,1) 1 * ( wB , 2 wB ,1) 2
R1, 2
N 1 k * * 4 1 k
účinnost kinetický aspekt rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu teoretických pater kolony
R1, 2
R1, 2
Skutečná rovnice rozlišení
selektivita
Jak ovlivnit rozlišení?
N 1 k * * 4 1 k
retence
termodynamický aspekt rozlišení je přímo úměrné selektivitě a blíží se k nule pokud se selektivita blíží k jedné
kapacitní aspekt rozlišení je přímo úměrné retenci a blíží se k nule pokud se retence blíží k nule 19
Jak ovlivnit rozlišení?
N 1 k * * 4 1 k
22
R1, 2
Jak ovlivnit rozlišení?
N 1 k * * 4 1 k
Faktory ovlivňující účinnost
průtok mobilní fáze délka kolony velikost částic
největší efekt změny k pro k < 2 pro k > 10 nemá smysl dále zvyšovat k 20
Jak ovlivnit rozlišení?
N 1 k R1, 2 * * 4 1 k Parametr
organická složka mobilní fáze pH mobilní fáze síla mobilní fáze + aditiva mobilní fáze stacionární fáze teplota
23
Jak ovlivnit rozlišení?
N 1 k R1, 2 * * 4 1 k
selektivita je nejúčinější nástroj jak ovlivnit rozlišení Použití
změna organické složky (acetonitril X metanol X tetrahydrofuran)
změna stupně ionizace analytů (změna hydrofobicity) změna poměru organické a vodné složky mobilní fáze největší vliv na selektivitu
nejmenší vliv na selektivitu, často používán v chirálních separacích
21
24
4
11. 10. 2015
Gradientová eluce
Gradientová eluce
V průběhu gradientové eluce dochází ke změně složení mobilní fáze.
ke
Příklad celkové doby gradientu na selektivity některých píku
mrtvý čas kolony
1 2,3 * bg
bg
strmost gradientu
eluční síla organického modifikátoru
t 0 * S tg změna složení mobilní fáze během gradientu
doba trvání gradientu
Píková kapacita
P 1
tg 1 n * 1 w b n
25
Gradientová eluce
28
Použité zdroje a zároveň doporučená literatura
Monografie: Snyder R. L., Kirkland J. J.: Practical HPLC method development Snyder R. L., Kirkland J. J.: Introduction to modern chromatography Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi (první a druhý díl) Snyder R. L., Dolan J. W.: High performance gradient elution Meyer V. R.: Practical high performance liquid chromatography Dong M. W.: Modern HPLC for practicing scientists Kromidas S.: More practical problem solving in HPLC
gradientový průběh je charakterizován gradientovými křivkami
Internetové zdroje: www.hpst.cz www.waters.com www.chromacademy.com www.hplc.cz http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/ www.shimadzu.com
26
Časopisy: Journal of Chromatography A, B Journal of Separation Science Analytical Chemistry Chromatographia Journal of Liquid Chromatography LCGC
29
Gradientová eluce
píky 8 a 9 jsou velmi široké a eluují ve vysokých retenčních časech
vyřešen problém s píky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlišení píku 1 a 2, které koeluují
Problémy isokratické eluce řeší gradientová eluce, kdy všechny píky jsou rozděleny na základní linii s krátkou dobou celkové analýzy 27
5