Distribuční konstanta. Retenční charakteristiky. Retenční charakteristiky. Sylabus přednášky: Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

11. 10. 2015

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Distribuční konstanta

HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi.

Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: [email protected] http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/

Distribuční konstanta KD je poměr rovnovážné koncentrace analytu ve stacionární fázi a mobilní fázi

KD 

A A

 A

s

s

 A

m

m

je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi je rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi

1

4

Retenční charakteristiky

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

1/ Úvod do HPLC, její význam a využití. JC 5.10. 2/ Základní chromatografické charakteristiky. Teorie chromatografického patra. PK 12.10. 3/ Instrumentace v LC. Detektory v LC. PK 19.10. 4/ Separační systémy: Chromatografie s normálními a obrácenými fázemi. ZB 26.10. 5/ Separační systémy: Iontově výměnná chromatografie. Afinitní chromatografie. Gelová chromatografie. Chirální separace ZB 2.11. 6/ Praxe v LC. Vývoj kapalinové chromatografické metody. PK 9.11. 7/ Validace chromatografické metody. Problémy a jejich řešení v LC. PK. 16.11. 8/ Kvalitativní analýza v HPLC. Způsoby kvalitativní analýzy, PDA, MS, NMR, identifikace z retenčních dat. JC 23.11. 9/ Využití HPLC pro různé typy analytů, aplikace ve farmaceutické analýze, analýze potravin a životního prostředí. JC 30.11. 10/ Trendy a novinky v HPLC. Vícedimenzionální separační systémy. Miniaturizace, mikrofluidní systémy. Využití počítačových programů pro optimalizace separačních systémů. JC 7.12. 11/ Exkurze do Quinta Analytica. ZB (termín bude upřesněn). předtermín: 14.12.? 2

tR , i  t M  t ' R , i

tM

VR , i  VM  V ' R , i

tR , i

Retenční čas tR je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky Mrtvý čas tM je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován.

Redukovaný retenční čas t‘R je čas, který stráví analyt ve stacionární fázi. Retenční objem VR je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony. Mrtvý objem VM je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony.

5

Retenční charakteristiky

Sylabus přednášky:

Lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min]

Základní chromatografické charakteristiky: distribuční konstanta retenční čas retenční objem průtok mobilní fáze kapacitní faktor separační faktor rozlišení symetrie píku

u

L tM

Objemová průtoková rychlost mobilní fáze Fm [ml/min]

Fm  Kapacitní faktor

Teorie chromatografického patra: účinnost separačního procesu Van Deemterova rovnice ovlivnění rozlišení

k

3

tR , i  tM tM

Separační faktor - selektivita

k

VM tM

n  n 

i s

i m



 KD , I *

k 2 KD , 2  k 1 KD ,1

Vs Vm

6

1

11. 10. 2015

Rozlišení píků

R1 , 2 

Retenční charakteristiky

Teorie chromatografického patra

Počet teoretických pater

 tR , i   tR , i  N  16 *    5.545 *    wb   w0.5 

(tR , 2  tR ,1) 1 * ( wB , 2  wB ,1) 2

t R ,1

2

2

Výškový ekvivalent teoretického patra

L H   N

tR , 2

Typický počet teoretických pater za optimálních separačních podmínek

Dva píky jsou rozděleny na základní linii, pokud R>1.5 7

10

Symetrie píku

Faktor asymetrie píku

Van Deemterova teorie

Tailing faktor píku

H  Hp  Hd  Hm

Hp Hd

Hm Nesymetrické (¨fronting nebo tailing¨) píkí mohou způsobit

vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi

nepřesnou kvantifikaci zhoršení rozlišení zakrytí minoritních píků nereprodukovatelnost retenčních časů Snažíme se o co možná nejsymetričtější píky!

8

Teorie chromatografického patra

11

Hp vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi

Účinnost chromatografického procesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšiřována při průchodu HPLC systémem a kolonou.

Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo předbíhají)

Hp  2 *  * d p  A

Gaussova křivka tr – střední hodnota δ – směrodatná odchylka

geometrický faktor

velikost částic

Jak minimalizovat vířivou difuzi:

9

používat dobře naplněné kolony používat malé částice používat kolony s malou distribucí velikosti částic 12

2

11. 10. 2015

Hd molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi Molekuly analytu difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací.

Hd 

2 *  * Dm B  u u

zavisí na objemu a geometrii detekční cely

difúzní koeficient

lineární rychlost mobilní fáze

korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony Jak minimalizovat vířivou difuzi:

2 2 2 2 2  celkem   kolona   injektor   spoje   det ektor

spojovací kapiláry mají být co nejkratší s malým vnitřním průměrem

používat vyšší průtoky mobilní fáze používat krátké spojovací kapiláry s vhodným vnitřním průměrem

Příspěvek molekulární difúze v LC je při běžných průtocích mobilní fáze zanedbatelný

Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón

objem vzorku má být co nejmenší

13

16

Hm odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi

průměr částic náplně kolony

  * d p2  * d p2  *u  C *u H    Dm Dp  

intračásticový difúzní koeficient

difúzní koeficient analytu v mobilní fázi

koeficient závislý na distribuci velikosti částic a distribuci pórů Jak minimalizovat odpor proti převodu hmoty: používat nižší průtoky mobilní fáze používat menší rozměry částic používat vyšší teplotu na koloně

H (µm)

14

17

15

18

Van Deemterova rovnice

minimální H

optimální průtoková rychlost

lineární průtoková rychlost (cm)

3

11. 10. 2015

Jak ovlivnit rozlišení? R1 , 2 

(tR , 2  tR ,1) 1 * ( wB , 2  wB ,1) 2

R1, 2 

N   1  k  *  *  4    1 k 

účinnost kinetický aspekt rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu teoretických pater kolony

R1, 2 

R1, 2 

Skutečná rovnice rozlišení

selektivita

Jak ovlivnit rozlišení?

N   1  k  *  *  4    1 k 

retence

termodynamický aspekt rozlišení je přímo úměrné selektivitě a blíží se k nule pokud se selektivita blíží k jedné

kapacitní aspekt rozlišení je přímo úměrné retenci a blíží se k nule pokud se retence blíží k nule 19

Jak ovlivnit rozlišení?

N   1  k  *  *  4    1 k 

22

R1, 2 

Jak ovlivnit rozlišení?

N   1  k  *  *  4    1 k 

Faktory ovlivňující účinnost

průtok mobilní fáze délka kolony velikost částic

největší efekt změny k pro k < 2 pro k > 10 nemá smysl dále zvyšovat k 20

Jak ovlivnit rozlišení?

N   1  k  R1, 2  *  *  4    1 k  Parametr

organická složka mobilní fáze pH mobilní fáze síla mobilní fáze + aditiva mobilní fáze stacionární fáze teplota

23

Jak ovlivnit rozlišení?

N   1  k  R1, 2  *  *  4    1 k 

selektivita je nejúčinější nástroj jak ovlivnit rozlišení Použití

změna organické složky (acetonitril X metanol X tetrahydrofuran)

změna stupně ionizace analytů (změna hydrofobicity) změna poměru organické a vodné složky mobilní fáze největší vliv na selektivitu

nejmenší vliv na selektivitu, často používán v chirálních separacích

21

24

4

11. 10. 2015

Gradientová eluce

Gradientová eluce

V průběhu gradientové eluce dochází ke změně složení mobilní fáze.

ke 

Příklad celkové doby gradientu na selektivity některých píku

mrtvý čas kolony

1 2,3 * bg

bg 

strmost gradientu

eluční síla organického modifikátoru

t 0 * S tg změna složení mobilní fáze během gradientu

doba trvání gradientu

Píková kapacita

P  1

tg 1 n * 1 w b n

25

Gradientová eluce

28

Použité zdroje a zároveň doporučená literatura

Monografie: Snyder R. L., Kirkland J. J.: Practical HPLC method development Snyder R. L., Kirkland J. J.: Introduction to modern chromatography Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi (první a druhý díl) Snyder R. L., Dolan J. W.: High performance gradient elution Meyer V. R.: Practical high performance liquid chromatography Dong M. W.: Modern HPLC for practicing scientists Kromidas S.: More practical problem solving in HPLC

gradientový průběh je charakterizován gradientovými křivkami

Internetové zdroje: www.hpst.cz www.waters.com www.chromacademy.com www.hplc.cz http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/ www.shimadzu.com

26

Časopisy: Journal of Chromatography A, B Journal of Separation Science Analytical Chemistry Chromatographia Journal of Liquid Chromatography LCGC

29

Gradientová eluce

píky 8 a 9 jsou velmi široké a eluují ve vysokých retenčních časech

vyřešen problém s píky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlišení píku 1 a 2, které koeluují

Problémy isokratické eluce řeší gradientová eluce, kdy všechny píky jsou rozděleny na základní linii s krátkou dobou celkové analýzy 27

5