FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2009 - 2010
DE AMBIVALENTE ROL VAN NKT-CELLEN BIJ AUTO-IMMUUNZIEKTEN: Type 1 Diabetes, Multiple Sclerose en Reumatoïde Artritis
Saartje JOORIS
Promotor: Prof. Dr. D. Elewaut Co-promotor: Dr. P. Jacques
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum
(handtekening student (en))
(handtekening promotor)
(Naam student)
(Naam promotor)
i
INHOUDSTAFEL Abstract ...................................................................................................................................................1 Inleiding...................................................................................................................................................3 Auto-immuunziekten ............................................................................................................................3 Type 1 Diabetes................................................................................................................................3 Multiple Sclerose..............................................................................................................................7 Reumatoïde Artritis ........................................................................................................................10 NKT-cellen .........................................................................................................................................13 Situering van NKT-cellen binnen het immuunsysteem..................................................................13 Kenmerken van NKT-cellen ..........................................................................................................14 T-cel receptoren..............................................................................................................................15 De rol van NKT-cellen binnen het immuunsysteem ......................................................................16 Types NKT-cellen ..........................................................................................................................16 Liganden van CD1d .......................................................................................................................17 Stimulatie van NKT-cellen.............................................................................................................17 Aantallen ........................................................................................................................................19 Methodologie.........................................................................................................................................20 Resultaten ..............................................................................................................................................21 NKT-cellen en auto-immuunziekten ..................................................................................................21 Cytokines: Th1 vs. Th2 ..................................................................................................................21 Cytokines: Th17 .............................................................................................................................22 Cel-cel contacten ............................................................................................................................23 De rol van NKT-cellen bij T1D/NOD muizen ..................................................................................24 De NOD muis: algemene informatie .........................................................................................24 Diersoorten en -modellen .............................................................................................24 Observaties i.v.m. NKT-cellen ..................................................................................................25 In NOD-muizen .................................................................................................................25 ii
Aantallen en lokalisatie.................................................................................................25 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................26 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................26 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................27 In T1D ...............................................................................................................................28 Aantallen en lokalisatie.................................................................................................28 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................28 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................29 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................29 De rol van NKT-cellen bij MS/EAE ..................................................................................................30 EAE: algemene informatie .............................................................................................................30 Diersoorten ................................................................................................................................30 Diermodellen .............................................................................................................................30 Observaties i.v.m. NKT-cellen .......................................................................................................31 In EAE ...............................................................................................................................31 Aantallen en lokalisatie.................................................................................................32 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................32 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................34 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................35 In MS ......................................................................................................................................35 Aantallen en lokalisatie.................................................................................................35 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................36 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................36 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................36 De rol van NKT-cellen bij RA .......................................................................................................36 De verschillende diermodellen .....................................................................................37 CIA ...............................................................................................................................37 Observaties i.v.m. NKT-cellen ..................................................................................................38 In CIA ................................................................................................................................38
iii
Aantallen en lokalisatie.................................................................................................38 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................38 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................39 αGalCer vs. OCH .............................................................................................39 αGalCer vs. α-C-GalCer .................................................................................41 Anti-CD1d antilichamen ..................................................................................41 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................42 In RA .................................................................................................................................43 Aantallen en lokalisatie.................................................................................................43 Activering van NKT-cellen ..........................................................................................43 Modulatie van NKT-cellen ...........................................................................................43 Profiel van NKT-cellen.................................................................................................44 Relatie tussen NKT-cellen en botaanmaak en –afbraak in RA.....................................44 Discussie ................................................................................................................................................45 Referenties.............................................................................................................................................47
iv
ABSTRACT NKT-cellen vormen een subtype van de lymfocyten met fenotypische kenmerken van zowel NKcellen als T-cellen. In de mens komen Vα24-Jα18/Vβ11 NKT-cellen voor, terwijl het in muizen gaat om Vα14-Jα18/Vβ8, Vβ7, Vβ2 NKT-cellen. In hun functie vormen zij een brug tussen het aangeboren en verworven immuunsysteem. Ze zijn evolutief sterk bewaard gebleven, waardoor de verschillen tussen mens en muis of rat klein zijn. Hierdoor zijn er vele diermodellen beschikbaar om de functie van NKT-cellen in het algemeen – en meer specifiek hun rol in diverse aandoeningen zoals tumoren, auto-immuunziekten, allergieën en infecties – verder te bestuderen. Met betrekking tot multiple sclerosis, reumatoïde artritis en diabetes type 1 zijn respectievelijk experimentele auto-immune encephalitis (EAE), collageen-geïnduceerde artritis (CIA) en diabetes in NOD muizen het vermelden waard. De NKT-cel kan worden geactiveerd door antigenpresentatie via CD1d (een MHC-achtige molecule) aan de TCR. Ook cytokines en cel-cel contacten kunnen een rol spelen bij activering. Activering leidt tot snelle productie van Th1 en Th2 type cytokines. Deze zijn ofwel afkomstig van de NKT-cellen zelf, of worden downstream vrijgesteld door effector cellen. Recent onderzoek heeft ook een mogelijke invloed van IL-17 aan het licht gesteld. Dit cytokine zou door de NKT-cel zelf kunnen geproduceerd worden, en ook downstream vrijgesteld worden door Th17 cellen. Net zoals Th1 cytokines heeft dit interleukine een negatieve impact op het ontstaan en verloop van de auto-immuniteit. Liganden
van
CD1d
zijn
over
het
algemeen
glycolipide
antigenen.
Het
zelf-antigen
isoglobothrihexosylceramide (iGb3) is hiervan een voorbeeld, en verder zijn er exogene glycosiden zoals αGalactosylCeramide (αGalCer), het C-glycoside van αGalCer (α-C-GalCer) en OCH. Deze laatste 3 vertonen, indien op het juiste moment en de geschikte wijze toegediend, therapeutische effecten bij verschillende auto-immuunziekten. In dit werk werd verder enkel aandacht besteed aan de rol van NKT-cellen bij type 1 diabetes, reumatoïde artritis en multiple sclerosis en de overeenkomstige diermodellen. Hier kan men algemeen stellen dat vrijstelling van Th1 type cytokines – met name IFN-γ en IFN-α – een exacerbatie van de ziekte tot gevolg hebben, hoewel de rol van IFN-γ in reumatoïde artritis eerder controversieel is. Th2 type cytokines, zoals IL-4 en IL-10, hebben een eerder beschermende functie. Een aantal therapeutische benaderingen proberen de balans in de productie van Th1 en Th2 cytokines, vrijgesteld door de NKT-cellen, te laten doorslaan in het voordeel van IL-4 en IL-10.
1
Zo is in EAE – het studiemodel voor MS – het aantal NKT-cellen over het algemeen gedaald. Tegelijk worden NKT-cellen teruggevonden in het centraal zenuwstelsel, waar deze normaal niet voorkomen. Dit suggereert dat de lokale stijging in NKT-cellen een rol speelt in het ziekteproces. Anderzijds lijkt ook de daling van NKT-cellen in lever en milt een rol te spelen, gezien hogere concentraties NKTcellen in deze organen gepaard gaan met een milder klinisch verloop. Ook is het cytokineprofiel veranderd in EAE-muizen: ze produceren IFN-γ , granzyme B, IL-17, terwijl IL-4 en IL-10 niet langer detecteerbaar zijn. Ondanks dit alles lijkt het therapeutisch effect van α-GalCer hier beperkt: dit stimuleert NKT-cellen, waarbij zowel Th1 als Th2 cytokines worden vrijgesteld. Deze cytokines werken elkaar tegen, waardoor het totaal effect op het verloop van de EAE beperkt is. Dit staat in contrast met het effect van OCH, dat dankzij stimulatie van voornamelijk de Th2 productie, wel een positieve invloed heeft op de EAE. Ook in MS stelt men een stijging vast van de NKT-cellen – voornamelijk DN cellen – in het centraal zenuwstelsel, op momenten van inflammatie. Tegelijkertijd vindt er een opregulatie van CD1d plaats, waardoor deze NKT-cellen ook makkelijker geactiveerd kunnen worden. Tijdens klinische relapses wordt bovendien een cytokineprofiel vastgesteld dat verschilt van dat tijdens remissies. In NOD muizen – zeer geschikt voor het bestuderen van type 1 diabetes – werden kwantitatieve en kwalitatieve defecten in iNKT-cellen vastgesteld, met andere woorden was het aantal NKT-cellen gedaald en was er bovendien sprake van een gewijzigd cytokineprofiel (onder andere een laag IL-4). In geval van diabetes heeft α-GalCer meer therapeutische mogelijkheden dan OCH, indien de behandeling vroegtijdig gestart wordt en verschillende injecties worden gegeven in de loop van enkele weken. De resultaten in verband met diabetes zijn meer tegenstrijdig: zowel een stijging als een daling van de NKT-cellen werd reeds aangetoond. Deze verschillen kunnen mogelijks verklaard worden door verschillende leeftijden, genetische achtergrond, verschillende markers gebruikt bij onderzoek, enz. In CIA – het diermodel voor RA – is de concentratie aan NKT cellen gedaald, en zijn deze NKT cellen bovendien minder functioneel (voornamelijk Th1 cytokines). Zowel stimulatie met α-GalCer, met αC-GalCer als met OCH werden bestudeerd. Hier viel vooral op dat IFN-γ, een Th1-cytokine, een bifasische rol speelt, waarbij het in een eerste fase van ziekte een ernstiger klinisch beeld veroorzaakt, terwijl het in een latere fase het verloop van de ziekte afremt. Het aantal NKT-cellen is verminderd in het perifeer bloed en het synovium van patiënten met RA. Ook zou er sprake zijn van een Th1-bias van de NKT-cellen in het perifeer bloed. Dit geldt niet voor de NKT-cellen in het synovium. 2
INLEIDING Auto-immuunziekten Volgens het Pinkhof Geneeskundig Woordenboek is een auto-immuunziekte “een aandoening die berust op de vorming van antistoffen, gericht tegen lichaamseigen cellen en weefsels, doordat het lichaam het vermogen heeft verloren om eigen en lichaamsvreemde eiwitten van elkaar te onderscheiden, met als gevolg een reactie met afbraak van eigen weefsel” (1). Het gaat om een heterogene groep van aandoeningen, die als gemeenschappelijk kenmerk hebben dat mediatoren van het immuunsysteem – zoals auto-antilichamen of autoreactieve lymfocyten – het eigen lichaam aanvallen. Hoewel de ziekten zich dikwijls manifesteren met zeer gelijkende symptomen, liggen zeer verschillende en complexe moleculaire processen aan de basis. Een gemeenschappelijk kenmerk is echter dat het tot uiting komen van de ziekte afhangt van de activiteitsstatus van het immuunsysteem. Bij het ontstaan van de aandoeningen spelen verschillende genetische en omgevingsfactoren een belangrijke rol (2). Voorbeelden van auto-immuunziekten zijn reumatoïde artritis, systeem lupus erythematosus, het syndroom van Guillain-Barré, vitiligo, psoriasis, diabetes type 1, multiple sclerose, …
Diabetes Type 1 Diabetes is een chronische aandoening, waarbij er ofwel een tekort is aan insuline, ofwel het lichaam resistent is geworden tegen de aanwezige insuline. Het eerste wordt aangeduid als type 1 diabetes (juveniele diabetes), het laatste is type 2 of ouderdomsdiabetes. Beide types hebben een hyperglycemie tot gevolg.
Type 1 kan verder onderverdeeld worden in type 1A en type 1B. Type 1B komt echter enkel voor binnen de Japanse populatie. Terwijl beide types gekenmerkt worden door een insulinetekort, is de oorzaak van dit insulinetekort verschillend. Type 1B – gekenmerkt door een zeer plots begin en hoge pancreatische enzymeconcentraties bij diagnose – is geen auto-immuunziekte, dit in tegenstelling tot type 1A. Hierbij produceert het immuunsysteem antilichamen tegen de β-cellen van de pancreas, die normaal gezien instaan voor de productie van insuline. 3
Insuline is nodig voor de opname van glucose uit de voeding. Een slechte opname veroorzaakt een tekort in de cellen (waar het dient als energiebron) en een teveel in het bloed (hyperglycemie), wat aanleiding geeft tot veel van de complicaties van diabetes. Type 1 diabetes ontstaat vanaf de kindertijd, met een piekincidentie rond de puberteit. De incidentie stijgt elk jaar met 3-4%, vooral bij kinderen jonger dan 5 jaar. In type 2 diabetes zijn insulineresistentie, onaangepaste insuline secretie en gestegen glucoseproductie de belangrijkste pathofysiologische mechanismen. Hier is geen sprake van een auto-immune destructie van de pancreaseilandjes, zoals bij type 1A het geval is. In tegendeel, de insulineproductie is – zeker in het begin – nog normaal, maar de insulinebehoefte is gestegen doordat het lichaam resistent is geworden tegen deze insuline. De pancreas kan de gestegen vraag niet bijhouden, waardoor een relatief insulinetekort ontstaat. Type 2 diabetes begint gemiddeld op latere leeftijd, en wordt frequent vooraf gegaan door een periode van gestoorde glucosetolerantie.
Klinische presentatie van diabetes:
De presentatie kan acuut of subacuut zijn, dikwijls is er een overlapping tussen deze beiden. Acute presentatie: Het gaat hier meestal om jonge mensen, waarbij de symptomen in de loop van de voorbije 2 tot 6 weken zijn komen opzetten. Typisch is de triade van polyurie, dorst en gewichtsverlies. Polyurie wordt veroorzaakt door het gestegen glucosegehalte in de urine, dat een osmotische diurese op gang brengt. Dorst is het gevolg van het verhoogd vochtverlies ten gevolge van deze verhoogde diurese. Het gewichtsverlies tenslotte komt door
het
vochttekort
(door
polyurie)
enerzijds, en anderzijds door de versnelde
Figuur 1: symptomen bij diabetes
afbraak van vet en spieren (dit doordat de
Kristen Nadeau, et al. Insulin Resistance in Adolescents with
cellen
Type 1 Diabetes and Its Relationship to Cardiovascular
door
het
glucosetekort
moeten
overschakelen op andere energiebronnen).
Function. J. Clin. Endocrinol. Metab. doi:10.1210/jc.20091756.
4
Ketonurie – dit is het voorkomen van ketonen in urine – ontstaat in het geval van langdurige hyperglycemie. Het is een acute complicatie van diabetes type 1. Door het gebrek aan insuline gaat glucose zich opstapelen in het bloed en ontstaat er een hoge glycemie. De glucose aanwezig in het bloed kan – door het insulinetekort – echter niet opgenomen worden door de lichaamscellen. Het lichaam moet dan overschakelen op een andere energiebron, met name de vrije vetzuren. Ketonen zijn de eindproducten van dit vetzuurmetabolisme. Deze ketonlichamen verschijnen frequent in de urine (ketonurie). Ketonurie kan, als het niet tijdig behandeld wordt, de voorloper zijn van een ketoacidose. Hierbij geven de hoge concentraties ketonen in het bloed aanleiding tot het ontstaan van een metabole acidose.
Subacute presentatie: Hier loopt het klinisch begin over maanden tot jaren. Het komt vooral voor bij oudere patiënten. Naast dorst, polyurie en gewichtsverlies is er hier ook sprake van energietekort, wazig zicht (de hyperglycemie veroorzaakt veranderingen in de brekingsindex van het licht in het oog), en pruritus vulvae of balanitis ten gevolge van een candida-infectie. Soms komt de patiënt ook voor de eerste keer met klachten veroorzaakt door complicaties van de diabetes. Het gaat hier om stafylokokken huidinfecties, retinopathie, polyneuropathie (tintelingen en doof gevoel in de voeten), erectiestoornissen of arteriële aantasting (dit geeft aanleiding tot myocardinfarct of perifeer gangreen). Voor een overzicht van de algemene symptomen van diabetes en hyperglycemie: zie figuren 1 en 2.
Metabole urgenties ten gevolge van diabetes zijn: -
diabetische ketoacidose
-
niet-ketotische hyperosmolaire status
-
lactaatacidose
5
Complicaties van diabetes: -
macrovasculair (atherosclerose) en microvasculair (retina, renale glomerulus, zenuwschede)
-
diabetische retinopathie
-
diabetische nefropathie
-
diabetische neuropathie
-
diabetesvoet
-
infecties
-
huid en gewrichten: gewrichtscontracturen (meestal in de handen) zijn een frequent gevolg van diabetes sinds de kindertijd
Aanwijzingen voor type 1 diabetes zijn: aanzienlijk gewichtsverlies, hyperglycemie die niet onder controle gebracht kan worden met behulp van een dieet en orale medicatie, sterke of persisterende ketonurie bij diagnose en een positieve auto-antilichamen test (3).
Figuur 2: symptomen ten gevolge van hypoglycemie/hyperglycemie Bron: www.irishealth.com
Gezien het onderwerp van deze thesis beperk ik me verder tot Type 1A diabetes.
6
Multiple Sclerose Multiple sclerose is een ontstekingsproces gericht tegen zelfantigenen in de witte stof van de hersenen en het ruggenmerg. Dit leidt tot demyelinisatieplaques, die ontstaan door een ongepaste immuunreactie van het lichaam tegen myeline. Hierdoor wordt de myeline afgebroken. De plaques bevinden zich op anatomisch verschillende plaatsen in het centraal zenuwstelsel en komen voor op verschillende tijdstippen. Met andere woorden zijn ze van elkaar gescheiden in tijd en ruimte. Deze plaques veroorzaken
een
vertraagde
geleiding
over
de
aangetaste zenuwbanen, wat de symptomen verklaart (zie figuur 3). De klachten verminderen wanneer de inflammatie voorbij is, maar er blijft steeds een restlitteken achter. De demyelinisatieplaques zijn initieel 10-20 mm groot en komen voor rond venulen, dit zijn kleine venen die een verbinding vormen tussen het Figuur 3: signaaltransductie in een gezonde en
arterieel
netwerk
Voorkeurslokalisaties
zijn
en de
de N.
grote
venen.
opticus,
de
beschadigde zenuwvezel
periventriculaire regio’s, de hersenstam en cerebellaire
Bron: http://www.msaustralia.org.au/msra/about-ms/
connecties, en de cervicale medulla spinalis (met name truncus corticospinalis en columnalis posterior).
De ziekte kenmerkt zich door fasen van relapsen en remissies die elkaar opvolgen. De acute relapsen worden gekenmerkt door focale inflammatoire demyelinisatie, die een geleidingsblok veroorzaakt. Inflammatie trekt macrofagen aan, die lokaal stikstofoxide (NO) produceren, waardoor de zenuwvezels beschadigd worden. Gedurende de remissie treedt remyelinisatie en herstel op. Wanneer het gaat om ernstige schade, blijft echter een secundaire permanente axonale destructie, ook na deze remyelinisatie. Bij 80-90% van de patiënten komt deze relapsing-remitting multiple sclerose voor, in een later stadium gevolgd door secundair progressieve MS. Hiertegenover staat de primair progressieve MS, die bij 10-20% van de patiënten voorkomt. In minder dan 10% van de gevallen gaat het om een fulminante MS, met een zwaar verloop over enkele maanden.
7
Relapsing-remitting MS geeft aanleiding tot: 1.
optische neuropathie (ON) Dit maakt dat het beeld in één oog op enkele uren tot dagen tijd wazig wordt. Dit geeft aanleiding tot een wijd spectrum van zichtafwijkingen, gaande van het gevoel door mat glas te kijken tot unilateraal gezichtsverlies. Volledige blindheid is zelden; bilaterale aantasting kan voorkomen. Deze afwijkingen kunnen gepaard gaan met milde oogpijn. Herstel doet zich meestal voor binnen de 2 maanden. Er is geen blijvend gezichtsverlies. Late sequelen zijn kleine scotoma en defecten in het kleurenzicht. Visueel geëvoceerde potentialen (VER) blijven gestoord.
2.
demyelinisatie van de hersenstam Dit geeft aanleiding tot één of meerdere van volgende symptomen: diplopie, vertigo, motorische en sensoriële stoornissen van het aangezicht, dysarthrie en dysfagie. Wanneer ook de tractus corticospinalis aangetast is, uit dit zich bovendien in piramidale symptomen in de ledematen. Het typische beeld – plotse diplopie en vertigo (met nystagmus, maar geen tinnitus) – kan soms weken aanhouden.
3.
laesie van de medulla spinalis Deze wordt veroorzaakt door een plaque in de medulla spinalis ter hoogte van de cervicale of thoracale segmenten. Hierdoor ontwikkelt zich een spastische parese over dagen tot weken. Patiënten ervaren een doof gevoel, en hebben moeilijkheden met stappen. Ook urinaire symptomen zijn aanwezig.
4.
ongewone presentaties Het gaat hier om epilepsie en trigeminale neuralgie, tonische spasmen. Heel af en toe komt een organische psychose voor in de beginfase van MS.
De eindfase van MS wordt gekenmerkt door spastische tetraparese, ataxie, optische atrofie, nystagmus, pseudobulbaire paralyse, urinaire incontinentie en problemen in de hersenstam (vb. bilaterale internucleaire oftalmoplegie). Dementie komt frequent voor. Uiteindelijk kan de patiënt overlijden door uremie – ten gevolge van een verminderde nierfunctie
– of door een
bronchopneumonie bij een algemeen verzwakte patiënt. 8
De prevalentie van MS is hoog in gebieden rond de evenaar. In Europa en Noord-Amerika is MS weinig prevalent: 2-10/100 000. Hiermee is het wel de frequentste neurologische aandoening bij jong volwassenen in deze streken. (zie figuren 4 en 5) De incidentie is het grootst bij mensen uit de leeftijdscategorie 20-45 jaar. Voor de puberteit en bij 60plussers is het optreden van MS zeldzaam. Over het algemeen komt het meer voor bij vrouwen dan bij mannen. Er is geen duidelijk overervingpatroon gekend, maar verwanten in de eerste graad hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van de ziekte. Daartegenover staat dat immigranten die verhuizen van gebieden met lage prevalentie naar gebieden met hoge prevalentie de prevalentie van hun bestemming overnemen, op voorwaarde dat ze voor de leeftijd van 10 jaar daar komen wonen. Dit wijst op het belang van omgevingsfactoren. Mogelijks speelt ook infectie een rol (3).
Figuur 4: wereldwijde prevalentie van MS per 100 000 inwoners
Figuur 5: wereldwijde incidentie van MS per 100 000 inwoners Bron: http://www.atlasofms.org/index.aspx
9
Reumatoïde artritis Reumatoïde artritis (RA) is een chronische systemische aandoening waarbij gewrichten symmetrisch worden aangetast. Hierbij is sprake van inflammatie van het synovium van voornamelijk perifere gewrichten. Afhankelijk van de definitie varieert de prevalentie wereldwijd van 0,5 tot 3%. Het is een belangrijke oorzaak van handicap en mortaliteit,
waaraan
een
hoge
socio-
economische kost verbonden is. RA kan iedereen aantasten, maar komt vooral voor in de leeftijdscategorie 30-50 jaar. Het is drie maal meer
frequent
menopauze,
bij
vanaf
vrouwen de
voor
menopauze
hun is
de
incidentie bij vrouwen gelijk aan die bij mannen. Dit suggereert een etiologische rol van
Figuur 6: verschillen tussen een gezond gewricht en een
de geslachtshormonen. Contraceptiva kunnen
gewricht aangetast door reumatoïde artritis
het begin vertragen, maar doen het risico niet
Bewerking van de figuur op: http://www.medicinenet.com /rheumatoid_arthritis_pictures_slideshow/article.htm.htm
dalen. Er bestaat een verband tussen de aanwezigheid van welbepaalde HLA klasse 2 moleculen – meer bepaald HLA DR antigenen – en het ontstaan van RA. Het risico is verhoogd bij dragers van HLA DR4, HLA DR1 en HLA DR10. Binnen deze DR families kan men verder nog ‘reumatogene’ en ‘nietreumatogene’ subtypes herkennen op basis van een bepaalde aminozuursequentie in het variabele gedeelte van de molecule.
Pathologie: Het gaat om een in het lichaam wijdverspreide persisterende synovitis – dit is een inflammatie van de synoviale aflijning, peesbladen of bursae (zie figuur 6). De oorzaak is niet duidelijk, maar de productie van de reumafactor (RF) door plasmacellen in het synovium speelt zeker een rol. Dit geeft aanleiding tot lokale vorming van immuuncomplexen. Dit alles heeft tot gevolg dat het synovium verdikt, wat voelbaar is als een zwelling rond de gewrichten. Infiltratie door inflammatoire cellen zoals polymorfonucleairen (PMN), lymfocyten en plasmacellen leidt tot proliferatie van het synovium, wat er op zijn beurt voor gaat zorgen dat er in feite plaatstekort is en het synovium in bochten geplooid ligt rondom het gewricht; dit in tegenstelling tot het gezonde gewricht, waar het een mooie, niet-geplooide zak vormt rond de gewrichten. Er vindt
10
een desorganisatie van de lymfefollikels plaats, met reactie op exogene antigenen. Naast proliferatie van het synovium is er ook een gestegen vascularisatie. Het hyperplastische synovium bedekt ook het kraakbenig gedeelte van het gewricht. Hierdoor wordt dit kraakbeen afgesloten van toevoer van nutriënten. Het kraakbeen wordt dunner. Bovendien wordt het blootgesteld aan de directe effecten van cytokines, afkomstig van de inflammatoire cellen die zich in de pannus van hyperplastisch synovium bevinden. Ook deze hebben een negatieve invloed op de kwaliteit van het kraakbeen. Uiteindelijk worden onder deze omstandigheden fibroblasten tot groei gestimuleerd, wat aanleiding geeft tot botbeschadiging.
Reumafactor is een collectieve benaming voor een groep circulerende auto-antilichamen die voornamelijk (maar niet uitsluitend) aangetroffen worden bij reumapatiënten. Ze zijn gericht tegen het Fc-gedeelte van IgG. Dit geeft aanleiding tot immuuncomplexvorming en activering van het complementsysteem, en zo tot verdere stimulatie van de inflammatie. In 65-75% van de gevallen is de RF positief bij patiënten met RA, maar de hoogte van de titer correleert verder niet met de ernst van de ziekte. RF kan dus niet beschouwd worden als een biomerker voor ziekteactiviteit. Hoe ouder men is, hoe meer kans op een positieve RF. In het begin van de ziekte komt een negatieve RF nog relatief frequenter voor. Na opstarten van de behandeling kan het voorkomen dat een voordien positieve RF terug negatief wordt. Tegenwoordig is het aantonen van anti-cyclisch gecitrullineerd peptide (afgekort: anti-CCP)
antilichamen echter van groter belang bij het stellen van de diagnose dan de bepaling van de RF. Anti-CCP antilichamen zijn immers extreem specifiek voor RA, terwijl de sensitiviteit vergelijkbaar is met die van RF. Bovendien zijn ze reeds zeer vroegtijdig in het ziekteproces aanwezig. Dit laat toe een vroege diagnose te stellen wat vroegtijdige behandeling mogelijk maakt. Verder hebben ze ook een prognostische waarde, gezien ze voornamelijk voorkomen bij patiënten met grotere kans op erosief lijden.
11
Klinische presentatie: Patiënten komen meestal met een traag progressieve, symmetrische perifere polyartritis. Uitzonderlijk is er een snel begin over enkele dagen, met ernstige symmetrische polyarticulaire betrokkenheid. Deze vorm heeft echter wel een betere prognose. Pijn en stijfheid van de kleine gewrichten van hand en voet staan hier op de voorgrond. Voornamelijk de proximale interfalangeale
(PIP)
en
metacarpofalangeale
(MCP)
gewrichten van de hand en de metatarsofalangeale gewrichten van de voet zijn aangetast. Ook pols, elleboog, schouder, knie
Figuur 7: Frequent aangetaste gewrichten bij RA
en enkel kunnen aangetast zijn. (zie figuur 7) De distale
Bron: http://adam.about.com/encyclopedia/
interfalangeale gewrichten (DIP) zijn nooit aangetast bij
Rheumatoid-arthritis.htm
reuma. De klachten zijn erger ’s morgens, en kunnen verbeteren met matige activiteit. Verder is er sprake van een algemeen gevoel van onwel zijn en vermoeidheid. Ook de slaap is gestoord: typisch ontwaakt de patiënt in de vroege ochtend door de pijn. De gewrichten zijn warm, gevoelig en gezwollen. De bewegingsmogelijkheden zijn beperkt en de spiermassa kan afnemen. Bij het voortschrijden van de ziekte ontstaan deformaties in de gewrichten. (zie figuur 8) Figuur 8: deformaties bij RA van de hand Bron: http://adam.about.com/encyclopedia/ Rheumatoid-arthritis.htm
Complicaties: Op lange termijn zijn de cardiovasculaire complicaties – waaronder verhoogd risico op atheromatose – het meest ernstig. Bij acute problematiek moet men vooral bedacht zijn op een septische artritis. Dit gaat gepaard met een significante mortaliteit en morbiditeit. Verder komt ook amyloïdose voor, aantasting van de huid rondom de gewrichten, longaandoeningen, vasculitiden, Raynaud syndroom, pericardiale betrokkenheid zonder pericarditis, aantasting van het zenuwstelsel, de ogen, milt, lymfenkopen en bloed. De amyloïdose kan secundair aanleiding geven tot het nefrotisch syndroom en nierfalen (3). 12
NKT-cellen Situering van NKT-cellen binnen het immuunsysteem Het immuunsysteem van de mens kan opgedeeld worden in 2 grote subsystemen: de aangeboren immuniteit en de verworven immuniteit (zie figuur 9). De aangeboren immuniteit is een verzameling van immuunmechanismen die aanwezig zijn van bij de geboorte. Het systeem bestaat uit mastcellen, neutrofielen, basofielen, eosinofielen, macrofagen, dendritische cellen, NK-cellen en het complementsysteem. Kenmerkend voor de aangeboren immuniteit is dat het om een snelle reactie gaat, die op gang komt binnen enkele uren na blootstelling aan het pathogeen. Het gaat om een algemene reactie als antwoord op blootstelling aan om het even welk pathogeen. Het gevolg van activering van dit deel van het immuunsysteem is inflammatie, gekenmerkt door calor, dolor, rubor, tumor en functio laesa. De verworven immuniteit vult dit aangeboren immuunsysteem verder aan. In veel gevallen is een algemene immuunreactie onvoldoende en is een meer specifieke reactie tegen een infectie noodzakelijk. Dit is dan de taak van de verworven immuniteit. Het is een heel gespecialiseerd verdedigingsmechanisme tegen één bepaald pathogeen, dat weinig invloed heeft op het verloop van bijvoorbeeld een infectie met een ander pathogeen. De verworven immuniteit bestaat uit lymfocyten, met name T-cellen en B-cellen. T-lymfocyten spelen een rol in de cel-gemedieerde immuniteit, terwijl B-lymfocyten antilichamen produceren. De reactie komt trager op gang, dagen tot weken na blootstelling aan het organisme. Dit komt omdat de receptoren/actoren gericht tegen de indringer nog aangemaakt moeten worden.
Figuur 9: functies van de aangeboren en verworven immuniteit Bron: Parham P, editor. The Immune System. 2 ed: Garland Science; 2005.
13
T-cellen kunnen nog verder opgesplitst worden in verschillende soorten: CD4+ cellen of T-helper cellen, cytotoxische T-cellen (CD8+), geheugen T-cellen, regulerende T cellen, γδ cellen en tenslotte ook Natural Killer T (NKT)-cellen. Deze laatste zijn cellen die zowel kenmerken vertonen van NKcellen (zie aangeboren immuniteit) als deze van T-cellen (4). Op deze manier vormen zij een brug tussen de aangeboren en de verworven immuniteit (5).
Kenmerken van NKT-cellen NKT cellen vormen een T-cel subset met receptoren uit de NK-cellijn (onder andere NK1.1), in combinatie met semi-invariante CD1d-gerestricteerde α/β T-cel receptoren (TCR). Van deze TCR’s zijn meer dan 80% Vα24-Jα18/Vβ11 in mensen en Vα14-Jα18/Vβ8, Vβ7, Vβ2 bij muizen (zie verder) (5-6). Figuur 10 toont de verschillen tussen de NKT-cellen in muizen en in mensen.
Figuur 10: Vergelijking van NKT-cellen bij muizen en mensen Bron: Hammond KJ, Kronenberg M. Natural killer T cells: natural or unnatural regulators of autoimmunity? Curr Opin Immunol. 2003 Dec;15(6):683-9.
14
T-cel receptoren T-cel receptoren (TCR) zijn receptoren die antigenen in combinatie met andere moleculen herkennen. Dit wil zeggen dat er steeds andere cellen deze antigenen aan hen presenteren. In de meeste gevallen herkennen ze enkel peptiden die door het major histocompatibiliteitscomplex (MHC) klasse I of II worden gepresenteerd. Een uitzondering hierop is echter de TCR die op NKT-cellen voorkomt: deze herkent glycolipiden gepresenteerd door CD1d (een familie van MHC-achtige moleculen, zie verder). Een TCR is een heterodimere molecule bestaande uit 2 verschillende polypeptide ketens: een α- en een β-keten. Het extracellulaire gedeelte van de receptor kan opgedeeld worden in een constant gedeelte (C-regio, bevindt zich het dichtst tegen de membraan van
Figuur 11: structuur van de T-cel receptor (TCR) Bron: Parham P, editor. The Immune System. 2 ed: Garland Science; 2005.
de cel), en een variabel (V) gedeelte dat instaat voor de antigenbinding (zie figuur 11). Dit variabel gedeelte ontstaat na verschillende gen-herschikkingen, en maakt het mogelijk verschillende micro-organismen zeer specifiek te herkennen, waardoor T-cellen hun functie kunnen uitoefenen (4). De TCR van NKT-cellen verschilt echter van de TCR op andere cellen. Niet alleen herkent de TCR op T-cellen enkel glycolipiden in combinatie met CD1d, maar ook is het zo dat de variabele regio in de TCR in feite semi-invariant is. Dit wil zeggen dat meer dan 80% van de humane TCR’s beschikt over een Vα24-Jα18/Vβ11 keten; in muizen gaat het om Vα14-Jα18/Vβ8, Vβ7, Vβ2 TCR’s. De overige 20% bestaat uit zeldzame – maar weerkerende – combinaties van α- en een β-ketens (5). Figuur 12: Vergelijking T-cellen en NKT-cellen bij mensen Merk op dat de CD4+ en CD8+ T-cel beiden beschikken over een variabele TCR, terwijl bij de TCR bij NKT-cellen semi-invariant is (Vα24Jα18).
Verder
herkennen
T-cellen
peptiden,
gepresenteerd door MHC-moleculen, terwijl NKTcellen glycolipiden herkennen, die gepresenteerd worden door CD1d (maakt deel uit van de MHCfamilie).
CD1d is een familie van MHC-achtige moleculen, die gespecialiseerd zijn in de presentatie van lipiden-antigenen aan thymocyten (5). Het is een onder de zoogdieren zeer sterk geconserveerde molecule, die voornamelijk tot expressie wordt gebracht op cellen van hematopoietische oorsprong: dendritische cellen (DC’s), macrofagen en B-lymfocyten. Dit wijst erop dat NKT-cellen in de eerste plaats interageren met antigeenpresenterende cellen (APC’s), en niet met weefselcellen (6-7). Zo 15
wordt, door middel van NKT-cellen, een brug gevormd tussen de aangeboren en de verworven immuniteit (8).
De rol van NKT-cellen binnen het immuunsysteem NKT-cellen worden verondersteld een rol te spelen bij verschillende processen waarbij het immuunsysteem betrokken is, gaande van infecties, allergieën, tumoren en atherosclerose tot verschillende vormen van auto-immuniteit (5). Er wordt gedacht dat ze mogelijks een regulerende functie uitoefenen binnen het immuunsysteem (9).
Figuur 13: NKT-cel functie CD1d-stimulatie door glycolipide antigenen leidt tot een cascade van gebeurtenissen waaronder vrijstelling van cytokines en co-stimulatoire molecules. Dit resulteert in de activatie van APC’s en andere cellen (NK cellen, B- en T-cellen, niet weergegeven op figuur). De diverse cytokines hebben verscheidene effecten, waaronder cel-gemedieerde immuniteit (Th1-cellen), maar ook juist onderdrukking van deze cel-gemedieerde immuniteit (Th2-cellen). Bron: Godfrey DI, Berzins SP. Control points in NKT-cell development. Nat Rev Immunol. 2007 Jul;7(7):505-18.
Types NKT-cellen De twee belangrijkste types NKT-cellen zijn: -
Type I:
invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze worden zo genoemd omwille van
hun invariante Vα-keten. (Vα14-Jα18 TCR α ketens bij muizen). Deze cellen reageren allemaal op stimulatie met αGalactosylCeramide (αGalCer) en zijn voor stimulatie afhankelijk van CD1d. -
Type II:
dit zijn de zogenaamde ‘non-typical’ NKT-cellen. Ze hebben diverse TCR α-
ketens en reageren niet op α-GalCer-stimulatie, maar zijn voor antigen-recognitie wel nog steeds afhankelijk van CD1d (10). Uit onderzoek van deze twee types NKT-cellen in tumormodellen blijkt dat ze elkaar vermoedelijk antagoneren, maar hierover is nog onvoldoende onderzoek gedaan met betrekking tot autoimmuunziekten (11).
16
Verder kunnen iNKT-cellen (zowel bij mensen als in muizen) nog opgedeeld worden naargelang de aanwezigheid van CD4+ op het celmembraan. Deze CD4+ en CD4- (‘dubbel negatieve’ of DN) cellen verschillen in functie. De onderlinge verhoudingen tussen deze 2 types iNKT-cellen zijn individueel verschillend, maar gewoonlijk is 40-60% van de iNKT-cellen CD4+ (6-7, 12).
Liganden van CD1d Figuur 14 toont een aantal mogelijke liganden van CD1d. Welke lipiden gepresenteerd worden en waar deze vandaan komen blijft echter onduidelijk. Het eerste natuurlijke ligand dat werd ontdekt voor Vα14/24 NKT-cellen is αGalCer, afkomstig uit een zeespons Agelas mauritianus. Verder is er ook nog interactie met het zelf-antigen isoglobothrihexosylceramide (iGb3), onder andere noodzakelijk voor de ontwikkeling van NKT-cellen in de thymus. α-galactosyldiacylglycerolen hebben een structuur die gelijkt op αGalCer en zijn bijgevolg in staat NKT-cellen te stimuleren; deze vindt men terug in de Gram-negatieve LPS-negatieve bacterie Borrelia burgdorferi. Daarnaast bestaan ook synthetische liganden, zoals (2S,3S,4R)-1-O-(-Dgalactopyranosyl)-Ntetracosanoyl-2-amino-1,3,4-nonanetriol (OCH). Dit wordt frequent in experimentele therapeutische setting gebruikt. Het gaat om een getrunceerde vorm van αGalCer, met kortere hydrofobe ketens, voornamelijk ter hoogte van de sphingosine basis, maar met dezelfde hydrofiele kop als αGalCer (5, 7, 13). Figuur 14: chemische structuur van αGalCer, OCH en iGb3 Uit: Yamamura T, Sakuishi K, Illes Z, Miyake S. Understanding the behavior of invariant
NKT
diseases.
J
cells
in
autoimmune
Neuroimmunol.
2007
Nov;191(1-2):8-15.
Het substraat van non-Vα14/24 NKT cellen is nog niet gekend .
Stimulatie van NKT-cellen Zoals getoond wordt op figuur 15, kan stimulatie van NKT-cellen indirect verlopen in het geval van Gram-negatieve bacteriën met LPS in hun celwand. LPS wordt opgenomen door DC’s en via een nog ongekend proces binnen deze cel leidt dit tot presentatie van iGb3 (via CD1d) en IL-12 productie, wat leidt tot activering van de NKT-cel. Directe stimulatie daarentegen gebeurt door bacteriële antigenen 17
(glycosylceramides), afkomstig van de celwand van gram-negatieve LPS-negatieve bacteriën, die vervolgens door DC’s gepresenteerd worden aan de NKT-cellen (5, 7).
Figuur 15: Directe versus indirecte stimulatie van NKT-cellen
Alle
NKT-cellen
herkennen
endogene liganden, zoals glycolipiden
iGb3,en
afkomstig
van
microbiële celwand (bijboorbeeld de α-glycuronylceramides). Na exogene toediening van α-GalCer volgt reciproke activatie van NKTcellen en dendritische cellen (zie figuur 16). Dit omdat α-GalCer eerst door
dendritische
opgenomen
en
cellen
wordt
vervolgens
in
combinatie met CD1d aan de NKTcellen
wordt
gepresenteerd.
De
geactiveerde NKT-cellen gaan meer Figuur 16
brengen en Th1 en Th2
CD40 ligand (CD40L) tot expressie
cytokines produceren. Hierop volgt CD40 cross-linking, waardoor de
dendritische cellen op hun beurt een aantal molecules, die ook in rust al in kleine mate terug te vinden zijn op hun celmembraan, nu in veel grotere aantallen tot expressie gaan brengen. Het gaat hier onder andere om CD40 en een verhoogde vrijstelling van IL-12. Dit laatste gaat dan weer NKT-cel activatie en cytokineproductie bevorderen (5). Bovendien beschikken NKT-cellen na stimulatie over
18
cytotoxische eigenschappen via perforine- en granzyme-vrijstelling en door expressie van membraangebonden moleculen van de TNF-familie (vb. FasL) (8). Na stimulatie daalt de TCR-expressie op NKT-cellen drastisch (downregulatie). De NKT-cellen worden anergisch, dit wil zeggen dat bij stimulatie met een antigen geen activering van de NKT-cellen meer optreedt. Waar geactiveerde iNKT-cellen de maturatie van immunogene DC’s stimuleren korte tijd na priming, leidt restimulatie van deze anergische iNKT-cellen tot het activeren van noninflammatoire DC’s. Hieruit kan worden afgeleid dat anergische differentiatie een regulatorische gebeurtenis is: iNKT-cellen die oorspronkelijk promotoren zijn van de immuunreactie, worden in hun anergische vorm – dit is na restimulatie – suppressoren. Hierdoor wordt de inflammatoire respons die op dat moment aan de gang is sterk afgeremd. Na activering en de vervolgens optredende anergie vertienvoudigt binnen de 2-3 dagen het aantal NKT-cellen, om nadien weer te zakken naar de baseline concentraties (5, 7, 10, 14-15). De vrijgestelde cytokines die een gevolg zijn van NKT-cel stimulatie zetten een cascade aan immuunreacties in gang, met als gevolg uiteindelijk maturatie van onder andere. DC’s, NK-cellen, Bcellen en T-cellen. Op deze manier vormen iNKT-cellen een brug tussen de aangeboren en verworven immuniteit (7, 12).
Aantallen In muizen vormen Vα14 NKT-cellen ongeveer 0,5% van de totale T-cel populatie in het bloed en de perifere lymfeknopen, 2,5% van de T-cellen in de milt, de mesenterische en de pacreatische lymfeknopen, en tot 30% van de T-cellen in de lever. In de thymus vormen ze ongeveer 0,5% van de T-cel populatie, maar ze vormen tot 5% van de recent vanuit de thymus geëmigreerde cellen aanwezig in de milt (5). Tussen muizen onderling zijn er grote verschillen: zo zijn er de zogenaamde ‘lage expressoren’ versus ‘hoge expressoren’. Voorbeelden van muizenstammen met een lage Vα14 NKT-cel expressie zijn onder andere de NOD en SJL muizen (5). In mensen is de verdeling der NKT-cellen minder goed bestudeerd. Over het algemeen kan men echter stellen dat Vα24 NKT-cellen gemiddeld 10 keer minder frequent zijn vergeleken met muizen, onafhankelijk van de lokalisatie. Ook tussen mensen onderling kan de frequentie sterk verschillen. Hierbij speelt vooral genetica een rol (5).
19
METHODOLOGIE Het Pinkhof Geneeskundig Woordenboek, Harrison's Principles of Internal Medicine, Clinical Medicine en The Immune System zijn algemene naslagwerken waarin onderwerpen zoals autoimmuunziekten, diabetes, multiple sclerose, reumatoïde artritis en de werking van het immuunsysteem werden opgezocht. Voor meer specifieke informatie werd vooral gebruik gemaakt van PubMed. Algemene zoektermen waren hier: NKT-cells, auto-immunity, auto-immune diseases, RA, CIA, T1D, MS, EAE, IL-17, Th17, … Dit leverde volgende resultaten op: -
Artikels 8, 13, 14, 17, 25, 27 en 28 (zie referentielijst) werden gevonden met behulp van "Encephalomyelitis, Autoimmune, Experimental"[Mesh] AND "Autoimmune Diseases"[Mesh] AND "NKT" AND ("last 5 years"[PDat] AND (English[lang] OR French[lang] OR Dutch[lang])) en "Nervous System Autoimmune Disease, Experimental"[Mesh] AND "NKT".
-
De zoekterm "Autoimmune Diseases"[Mesh] AND "Arthritis"[Mesh] AND "NKT" AND ("last 5 years"[PDat] AND (English[lang] OR French[lang] OR Dutch[lang])) leverde artikels 35 en 41 op.
-
“rheumatoid arthritis” AND “NKT”: artikels 31 en 32
-
“type 1 diabetes” AND “NKT”: artikels 10 en 18
-
Vervolgens werd in de reeds gevonden artikels gekeken naar auteurs die verschillende artikels hadden geschreven. Deze werden afzonderlijk opgezocht: o “Coppieters K” AND “NKT cells”: artikel 36 o “Bendelac” AND “NKT”: artikels 6 en 7
-
Bijkomende informatie werd opgezocht over Th17 en IL-17, nadat in verschillende artikels zeer korte verwijzingen naar een mogelijks verband met NKT-cellen en auto-immuunziekten werden teruggevonden. De zoektermen “NKT” AND “IL-17” gaven volgend resultaat: artikels 11 en 16
-
Met de zoektermen “[alpha]galactosylcermaide” AND “CIA” werden volgende artikels gevonden: artikels 38 en 40
-
"[alpha]galactosylceramide" AND "rheumatoid arthritis": artikel 42
-
De overige artikels werden teruggevonden in de referentielijsten van reeds gevonden artikels, of door door te klikken naar ‘related articles’ bij ingeven van de hierboven vermelde zoektermen.
20
Nadat op Pubmed voldoende geschikte artikels gevonden waren, werd per onderdeel – NKT-cellen in het algemeen, NKT-cellen in auto-immuunziekten, multiple sclerose, type 1 diabetes en reumatoïde artritis – geselecteerd op basis van de impact factor en de relevantie van het artikel. Uiteindelijk werd zo gekomen tot de selectie artikels die terug te vinden zijn in de referentielijst. De afbeeldingen werden voornamelijk via Google ‘afbeeldingen’ gezocht. Zoektermen hierbij waren: MS, TCR structure, NKT-cells structure, MS prevalence, T1D, RA, … Ook komen een aantal figuren uit studieboeken die aangeraden werden in de opleiding geneeskunde, met name ‘The Immune System’ van Peter Parham en ‘Clinical Medicine’ van Kumar & Clark. Als laatste werden ook een aantal figuren gebruikt uit de reviews die ook als bron dienden voor deze thesis.
RESULTATEN NKT-cellen en auto-immuunziekten
Dat NKT-cellen een rol spelen bij auto-immuniteit is ondertussen zeer gekend. Hoe ze deze rol uitoefenen blijft echter minder geweten. Verschillende studies zijn hiernaar uitgevoerd, en hieruit blijkt dat vooral enerzijds cytokines en anderzijds cel-cel contacten van belang zijn. Hierop volgend worden beiden afzonderlijk besproken.
Cytokines: Th1 versus Th2 Uitgerijpte NKT-cellen produceren grote hoeveelheden interferon- γ (IFN-γ), maar tegelijk zijn ze ook in staat zeer snel zeer grote hoeveelheden interleukine-4 (IL-4) te produceren (zie figuur 17). Dit maakt hen zo uniek binnen de lymfocytenpopulatie. Uiteraard kunnen ze naast deze twee cytokines ook nog andere type Th1- en Th2-cytokines produceren, maar IFN-γ en IL-4 zijn de belangrijkste. Wat de cellen aanzet tot productie van het ene type of het andere is op dit moment nog niet volledig duidelijk. Mogelijks triggeren αGalCer-achtige liganden met kortere sfingosineketens (cfr. OCH) een Th2-respons, terwijl signalen via NK1.1 eerder leiden tot een Th1-respons. αGalCer leidt tot zowel vrijstelling van IL-4 als IFN-γ. Ook de toedieningsroute (mucosaal of systemisch) lijkt het Th1/Th2 evenwicht te kunnen beïnvloeden. Hiertegenover staat dat het net zo goed mogelijk is dat er gewoon verschillende subsets van NKT-cellen bestaan, die Th1, respectievelijk Th2 cytokines produceren. Dit is verder nog onvoldoende onderzocht. 21
Dit alles heeft tot gevolg dat NKT-cellen regulerende eigenschappen hebben, die mee de uitkomst van een ziekte kunnen controleren door overwegend Th1-cytokines, ofwel juist cytokines van het Th2-type te produceren (5-6, 12). Th2 cytokines worden over het algemeen verondersteld een protectief effect te hebben bij auto-immune aandoeningen, terwijl Th1-type cytokines auto-immuunziekten in een aantal gevallen zouden kunnen promoten (15). Deze kennis kan gebruikt worden bij de behandeling van auto-immuunziekten, waarbij toediening van αGalCer leidt tot zowel vrijstelling van IL-4 als IFN-γ, terwijl toediening van OCH eerder een Th2respons zou promoten (6, 12). In contrast hiermee staat dat stimulatie van NKT cellen met αGalCer preventief gebruikt kan worden bij auto-immuunziekten. Echter, afhankelijk van de gevolgde protocols en de genetische achtergrond van de subjecten, kan toediening van αGalCer de AIZ ook juist aanwakkeren. Hieruit kan men concluderen dat stimulatie/onderdrukking van de T-cel immuniteit door geactiveerde NKT cellen verschilt naargelang de omgeving waarin de NKT cel geactiveerd wordt. Dit leidt tot minder voorspelbare resultaten na αGalCer-stimulatie in patiënten met een heterogene achtergrond (15). Eens iNKT-cellen anergisch geworden zijn evolueren ze echter naar een regulatorische rol: αGalCerinjectie wordt gevolgd door een tijdelijke downregulatie van de TCR, wat bij de iNKT-cellen leidt tot repopulatie en expansie, en een duidelijk gedaalde cytokineproductie (15). Na restimulatie met αGalCer induceren deze anergische iNKT cellen non-inflammatoire DC’s. Deze laatste inhiberen de differentiatie van geactiveerde T-cellen. Dit mechanisme zou mogelijks zorgen voor een balans in de rol van iNKT cellen: enerzijds moeten zij in staat zijn tot een effectieve respons op infecties, anderzijds moet toch ook de mogelijkheid tot zelf-tolerantie bewaard blijven. Een tekort aan NKT-cellen kan dan ook bijdragen tot het ontstaan van auto-immuniteit (15). Interactie tussen NKT-cellen en DC’s gebeurt via cel-cel contact en ligand-receptor interactie (15).
Cytokines: Th17 IL-17 is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine, vrijgesteld door Th17-cellen. Deze worden gestimuleerd door IL-6, terwijl IL-23 instaat voor het onderhouden van de IL-17-productie. Recent werd echter aangetoond dat IL-17 ook door iNKT-cellen wordt geproduceerd, waarbij IL-6 en IL-23 niet noodzakelijk zijn (10).
22
Bijgevolg is het mogelijk dat in een aantal gevallen IL-12 geïnduceerde Th1-cellen niet noodzakelijk zouden zijn voor de inductie van auto-immuniteit. Mogelijks onderdrukt IFN-γ zelfs pathogene Th17cellen, en onderdrukken Th1-cellen zo de auto-immuniteit (16). Recent werd aangetoond dat iNKT-cellen de ontwikkeling van Th17 kunnen inhiberen en zo autoimmuniteit kunnen onderdrukken. In NKT-cel deficiënte muizen werd een versterkte Th17 respons vastgesteld in vergelijking met wild-type muizen. Van Th17 cellen is geweten dat ze een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van auto-immuniteit (17).
Figuur 17: NKT-cellen beïnvloeden de immuunrespons in Th1 of Th2 richting (A) model beïnvloed door omgevingsfactoren; groen: factoren die sturen in de richting van een Th1 respons; rood: bevorderen Th2 respons. De omgeving waarin de NKT-cellen voorkomen – waaronder het type cytokines en APC’s – en de intensiteit van TCR-stimulatie bepalen welke cytokines geproduceerd worden. (B) Subset model. Voorafbestaande subsets van NKT-cells werden geprogrammeerd om verschillende Th1/Th2 cytokine ratio’s te produceren. In dit geval zou de immuunrespons afhangen van de prevalentie en/of relatieve betrokkenheid van deze 2 subsets. Deze twee modellen sluiten elkaar niet noodzakelijkerwijs uit. Bron: Godfrey DI, Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells. J Clin Invest. 2004 Nov;114(10):1379-88.
Cel-cel contacten In het kader van bescherming tegen auto-immuniteit zijn cel-cel contacten vereist om NKT-cellen hun functie (inhibitie van de maturatie van auto-immune cellen) te laten uitoefenen. Deze celcontacten zouden hierbij zelfs belangrijker zijn dan de cytokines die vrijgesteld worden (18).
23
De rol van NKT-cellen bij T1D De NOD muis: algemene informatie Diersoorten en -modellen Diabetes wordt voornamelijk bestudeerd in ratten en muizen. Modellen die hierbij frequent gebruikt zijn, zijn de BB rat en de NOD (non-obese diabetic) muis (9). De NOD muis Algemeen: Deze muis bestaat reeds 20 jaar en is zeer nuttig bij het bestuderen van het auto-immune type 1 diabetes. De incidentie van T1D in deze muizen bedraagt 60-80% in vrouwtjes en 20-30% in mannetjes. Opvallend is dat de incidentie het hoogst is wanneer de muizen opgroeien in een kiemvrije omgeving. Contact met kiemen doet de incidentie drastisch dalen. Diabetes ontwikkelt zich typisch bij vrouwtjes van 12-16 weken (zie figuur 18), en iets later bij de mannetjes (19).
Figuur 18: Ontwikkeling van auto-immune diabetes in de non-obese diabetic (NOD) muis Rond de leeftijd van 2 weken gaan de pancreatischeβ-cellen van de eilandjes van Langerhans in apoptose. Dit maakt deel uit van de normale pancreatische ontwikkeling(A) . Dit leidt tot β-cel antigen presentatie aan dendritische cellen in e pancreatische lymfeknopen en activering van β-cel specifieke T-lymfocyten (B). Op de leeftijd van 3-4 weken beginnen lymfoïde cellen de pancreas te infiltreren (C), dit manifesteert zich initieel als een non-invasieve inflitratie rondom de eilandjes (D). Na verloop van tijd ontwikkelt de benigne inflitratie zich tot een meer agressieve vorm, waarbij T-cellen de eilandjes binnendringen en β-cellen vernietigen (E). Wanneer uiteindelijk minder dan 10% van de β-cel massa overblijft – rond de leeftijd van 10-12 weken (F) –, kan de normale glycemie niet langer behouden worden en worden de muizen diabetisch. Rond de leeftijd van 25-30 weken hebben 80% van de vrouwelijke NOD-muizen de ziekte ontwikkelt (G), terwijl slechts 20-30% van de mannelijke muizen aangetast zijn. Bron: Cardell SL. The natural killer T lymphocyte: a player in the complex regulation of autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Clin Exp Immunol. 2006 Feb;143(2):194-202.
Novak et. al. (2007) hanteert echter een ruimere marge, waarbij volgens hen gemiddeld genomen (zonder onderscheid op basis van het geslacht) de muizen diabetes krijgen op de leeftijd van 4-6 maanden. Vrouwtjes worden meer aangetast dan mannetjes. Er kunnen twee fasen onderscheiden worden in het ontstaan van diabetes: eerst ontstaat er insulitis, waarbij hematopoietische cellen de eilandjes infiltreren zonder significante β-cel destructie, in een tweede fase gevolgd door destructieve
24
insulitis met specifieke destructie van de insuline-roducerende β-cellen. Tussen beide fasen is er een lang interval, wat wijst op de rol van een regulatoir proces. Gedurende het hele verloop van de ziekte zijn macrofagen, dendritische cellen, NK cellen, B-cellen en T-cellen aanwezig (9). NOD muizen zijn niet enkel gevoeliger voor het ontwikkelen van diabetes type 1, maar ook voor het ontwikkelen van andere auto-immuunziekten. In het geval van diabetes – en mogelijks ook bij andere auto-immuunziekten – valt dit deels te verklaren door defecten in de verschillende signaalcascades in verband met tolerantie (19). Genotype:
Er zijn verschillende loci verantwoordelijk voor de susceptibiliteit van deze muizenstam voor T1D. Als belangrijkste kan men stellen dat NOD muizen beschikken over een uniek MHC II haplotype, maar daarnaast zijn vele andere loci ook betrokken (19). Het genoom van de NOD muizen is goed gekend en bovendien bestaan er vele genetisch gemodificeerde muizenlijnen. Hierdoor is dit diermodel bijzonder bruikbaar voor het bestuderen van onder andere type 1 diabetes (9).
Fenotype:
Door de het grote aantal immuundefecten zijn NOD muizen gevoeliger voor een aantal auto-immuunziekten. Veel aandacht is reeds uitgegaan naar de rol van T-cellen in het verloop van de T1D, maar ook andere leukocyten blijken een rol te spelen, waaronder macrofagen, NK-cellen, NKT-cellen, defecten in de regulatorische CD4+CD25+ T-cel populatie en de afwezigheid van C5a en hemolytisch complement. In deze thesis wordt verder enkel de rol van NKT-cellen besproken (19).
Observaties in verband met NKT-cellen In NOD-muizen Aantallen en lokalisatie In NOD muizen werden kwantitatieve en kwalitatieve defecten in iNKT-cellen vastgesteld. De gedaalde frequentie was reeds vanaf de leeftijd van 3 weken aantoonbaar in thymus en milt, en er zijn aanwijzingen dat deze zich reeds zou ontwikkelen voor de geboorte. Het functioneel deficit uit zich door een ander cytokineprofiel (vergeleken met de controlegroep) (9). Dit idee wordt verder versterkt door de observatie dat transfer van NKT-cellen naar NOD muizen het begin inhibeerde (20).
25
NKT-cellen kunnen een protectieve rol uitoefenen bij diabetes. Dit blijkt uit onderzoek met transgene muizen met verhoogde aantallen NKT-cellen, waar minder diabetes voorkomt. Er bestaat een correlatie tussen de frequentie van iNKT-cellen en de graad van bescherming. Afwezigheid van NKTcellen in CD1d-deficiënte NOD muizen leidt tot een hogere frequentie en sneller optreden van symptomen van diabetes. Van deze laatste observatie is het echter niet geweten of dit verband houdt met de hinder in werking van NKT-cellen, of het gevolg is van genetische verschillen in deze muizen (9).
Activering van NKT-cellen NKT-cellen worden geactiveerd door TCR triggering. Verder is er ook een rol voor direct cel-cel contact en allerhande oppervlakte molecules, waaronder CD1d. Ook bestaat er een mogelijke rol voor APC’s: iNKT-cellen zouden een immunoregulatorische functie kunnen uitoefenen door downregulatie van expressie van co-stimulatoire molecules en onaangepaste IL-12 expressie door APC’s. Na activering van NKT-cellen zijn deze in staat T-cel anergie te induceren van de pathogene T-cellen, dit zijn BDC2.5 T-cellen, een diabetogene CD4+ T-cel kloon. Hierdoor kunnen deze cellen wel nog prolifereren, maar niet meer verder differentiëren in Th1 effector cellen. Bijgevolg zijn deze ook niet meer in staat tot cytokineproductie. Bij volledige anergie valt ook de mogelijkheid te prolifereren weg. Dit speelt ongetwijfeld een belangrijke rol bij de bescherming tegen diabetes (9).
Als laatste is het belangrijk te vermelden dat cel-cel contact nodig is voor bescherming tegen diabetes; het is onder andere noodzakelijk voor: o αGalCer geactiveerde iNKT-cellen om de
proliferatie van BDC2.5 T-cellen te kunnen
inhiberen o geactiveerde/rustende iNKT-cellen om de IFN-γ productie van BDC2.5 T-cellen te kunnen inhiberen. (9) Cel-cel contact wijst op de aanwezigheid van oppervlakte-moleculen die belangrijk zijn voor de onderdrukkende rol van iNKT-cellen; andere oppervlaktereceptoren dan de TCR – mogelijks NK cel receptoren – zouden hierbij een rol spelen (9, 21).
Modulatie van NKT-cellen αGalCer:
Dit heeft effect indien het gaat om herhaalde injecties gedurende verschillende weken. Het effect is groter wanneer vroegtijdig gestart wordt (leeftijd 3-5 weken, dit is het moment waarop eiland-infiltratie begint). Hierbij lijkt
26
presentatie αGalCer via B-lymfocyten essentieel (9). Ook volgens Mercer et al. (2005) zouden αGalCer-injecties het ontstaan van diabetes type 1 kunnen voorkomen (20). Na αGalCer-toediening vindt een accumulatie van iNKT-cellen en DC’s plaats in de pacreatische lymfeknopen (22). Ook treedt er een Th2-polarisatie op, door stimulatie van de NKT-cellen. Nochtans is deze Th2-polarisatie niet terug te vinden bij gezonde muizen, wat doet vermoeden dat ook andere mechanismen belangrijk zijn in de bescherming tegen diabetes. Ook in CD1ddeficiënte muizen, waar diabetes sneller optreedt, is er geen verstoring van de Th1/Th2 cytokinebalans. Toediening van αGalCer bij muizen zonder diabetes veroorzaakt bovendien geen shift in de Th1/Th2 cytokine productie (9). αGalCer-analogen:
Best bestudeerd is OCH. Deze molecule heeft echter een suboptimale aviditeit voor iNKT-cellen, met een zwakkere IFN-γ en sterkere IL-4 respons tot gevolg. Langdurige behandeling van diabetes met OCH voorkomt diabetes (9).
Profiel van de NKT-cellen Na TCR-triggering werden een lage IL-4 productie vastgesteld, terwijl IFN-γ normaal tot gestegen was. IL-4 wordt – meer dan IL-10 – gedacht een beschermende functie uit te oefenen in diabetes. Over de rol van IFN-γ bestaat echter meer discussie: een laag IFN-γ zou volgens Novak et al. (2007) beschermend werken, terwijl volgens Cardell et al. (2006) het defect in IFN-γ productie door NKTcellen NOD muizen juist gevoeliger maakte voor het ontwikkelen van diabetes (9, 22). Verder moet opgemerkt worden dat hoewel er qua cytokineproductie geen verschil wordt vastgesteld tussen DN en CD4+ CD8- NKT-cellen, er wel een functioneel verschil zou zijn dat vergelijkbaar is met het verschil tussen deze twee subsets in mensen. Zo zouden DN cellen eerder een cytotoxische effector functie uitoefenen, terwijl CD4+ CD8- NKT-cellen belangrijk zijn in de regulatie van het immuunsysteem (9).
27
In T1D Aantallen en lokalisatie NKT-cellen kunnen naast de gebruikelijke plaatsen (lever, milt) ook specifiek teruggevonden worden in de pancreatische lymfeknopen (23). Onderzoek in verband met het aantal NKT-cellen dat kan teruggevonden worden in type 1 diabetes is echter controversieel: zo is er onderzoek (Kukreja et al., 2002) dat aantoont dat er kwantitatieve en kwalitatieve defecten zijn met gedaalde cytokineproductie, onderzoek (Lee at al., 2002) dat geen verschil toont met de gezonde referentiepopulatie, en zelfs onderzoek (Oikawa et al., 2002) dat juist een stijging toont van iNKT-cellen tijdens de periodes dat de ziekte meer actief is. Deze verschillen kunnen mogelijks verklaard worden door verschillende leeftijden, genetische achtergrond, verschillende markers gebruikt bij onderzoek, enz. (6, 9, 24-25) Ook volgens Griseri et al. (2005) zou het aantal NKT-cellen in diabetes type 1 juist gestegen zijn en de ziekte zo promoten (26).
Activering NKT-cellen Activering gebeurt na TCR triggering. Het geactiveerde fenotype van iNKT-cellen is CD69+, CD44hoog en CD62L-. Activering van NKT-cellen zet een kettingreactie in gang met als uiteindelijk resultaat activering van vele andere immunologische celtypes (onder andere NK-cellen, DC’s, B-cellen en Tcellen). De diversiteit in deze verschillende types cellen verklaart waarom iNKT-cellen een rol lijken te spelen in zoveel biologische pathways (9). Ook zou er bij T1D een plaats weggelegd zijn voor cel-cel contacten, waarbij andere receptoren dan de TCR een belangrijke rol zouden spelen. Automatische denkt men hierbij dan aan de NK-receptoren als mogelijke kandidaten (21). Antigenen afkomstig van de β-cellen in de pancreas worden opgenomen door APC’s (zie figuur 19). (a) Deze migreren naar de pancreatische lymfeknopen waar ze deze presenteren aan NKT-cellen en naïeve T-cellen, welke zo geactiveerd worden. De geactiveerde T-cellen migreren vervolgens naar perifere weefsels, zoals de pancreaseilandjes. (b) In een eerste stadium van insulitis worden de eilandjes van Langerhans geïnfiltreerd door hematoïetische cellen, terwijl de insulineproductie nog steeds efficiënt verloopt. (c) De insulitis evolueert naar een destructieve fase die gekenmerkt wordt door massieve invasie van de eilandjes met destructive van de β-cellen en een gestoorde insulineproductie (zie figuur 19) (9).
28
Figuur 19: Schematische descriptie van de opeenvolgende stappen in de ontwikkeling van T1D Bron: Novak J, Griseri T, Beaudoin L, Lehuen A. Regulation of type 1 diabetes by NKT cells. Int Rev Immunol. 2007 Jan-Apr;26(1-2):49-72.
Modulatie NKT-cellen gemoduleerd iNKT-cellen kunnen zoals altijd geactiveerd worden door toediening van αGalCer en OCH. Ook bij diabetes type 1 geldt dat αGalCer stimulatie zowel IL-4 als IFN-γ productie tot gevolg heeft, terwijl OCH meer een Th2 respons met voornamelijk IL-4 productie uitlokt. Dit resultaat van Cardell et al. (2006) staat in contrast met het onderzoek van Wu et al. (2007), waar αGalCer een Th2 deviatie uitlokt. Gezien de controversiële rol van IFN-γ in diabetes bestaat nog discussie over welke molecule het meest effect heeft. Gezien Cardell et al. (2006) aantoonde dat IFN-γ protectief zou zijn geven zij bijgevolg de voorkeur aan αGalCer (21-22, 27).
Figuur 20: Mogelijke mechanismen betrokken bij de regulatie van T1D door NKT-cellen. NKT-cellen promoten Th2 responsen, induceren anergie in autoantigen specifieke CD4- en CD8- T-cellen, induceren de differentiatie van DC’s in tolerogenische DC en promoten da activiteiten van CD4CD25- regulatorische T-cellen. Al deze reacties samen kunnen de activiteit van pathogene Th1 cellen en cytotoxische T-lymfocyten afremmen. De omcirkelde symbolen duiden de stappen aan waar NKT-cellen gedacht worden een directe impact te hebben op immunoregulatoire mechanismen. Bron: Wu L, Van Kaer L. Role of NKT cells in the digestive system. II. NKT cells and diabetes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Nov;293(5):G919-22.
Profiel van de NKT-cellen Ook bij diabetes type 1 is er sprake van een Th1-bias. Bescherming tegen ziekte gaat gepaard met een shift van Th1 naar Th2 in de NKT-cellen. Volgens Cardell et al. (2006) is IL-4 in belangrijke mate 29
verantwoordelijk voor onderdrukking van auto-immuniteit bij type 1 diabetes, en een daling van dit cytokine gaat gepaard met een grotere vatbaarheid voor diabetes type 1 (22). Deze resultaten zijn in overeenstemming met de resultaten van het onderzoek van Kent et al. (2005), die toonden dat NKTcellen in pancreatische lymfeknopen enkel IFN-γ secreteren en geen IL-4 (23). Ook andere NKT-cel subsets – met andere cytokineprofielen zoals IFN-γhoog en IL-4laag – kunnen het ontstaan en verloop van T1D moduleren (9).
De rol van NKT-cellen bij MS/EAE EAE: algemene informatie Experimentele auto-immune encephalomyelitis (vroeger: experimentele allergische encephalomyelitis, afgekort EAE) is een verzamelnaam voor alle diermodellen gebruikt voor het bestuderen van acute veralgemeende encephalomyelitis en MS. Op deze manier worden de neuropathologische kenmerken van MS gereproduceerd in diermodellen (28-29).
Diersoorten Er zijn verschillende diersoorten gevoelig aan inductie van EAE, met name muizen, ratten, cavia’s, varkens en primaten (mensen uitgezonderd). Daarnaast bestaat ook een ‘humane EAE’, dit is een accidentele EAE die voorkomt bij mensen (30).
Diermodellen In de 75 jaren dat dit model bestaat zijn er al vele aanpassingen gebeurd, en ondertussen bestaan ook al vele variaties op dit model. Zo bestaan er modellen voor het bestuderen van acute of chronische EAE, voor neuritis optica, voor relapsing-remitting EAE of progressieve EAE (28, 30). Verschillende modellen focussen zich op de aan- of juist afwezigheid van bepaalde genen, immuunmechanismen, enz. om op deze manier de rol van deze specifieke factoren in MS te kunnen bestuderen. Het moet dus duidelijk zijn dat, wanneer gesproken wordt over EAE, het niet gaat om één enkel diermodel, maar dat verdere specificatie dikwijls noodzakelijk is (28). Inductie van EAE kan op verschillende manieren gebeuren. Zo kan EAE geïnduceerd worden door immunisatie met ‘mouse spinal cord homogenate’ (MSCH), of met proteïnen en peptiden geïsoleerd uit ruggenmerg (geselecteerd op basis van immunodominante epitopen – zie verder). Ook kan EAE
30
zich ontwikkelen na toediening van T-cellen, die vooraf in vivo en/of in vitro geactiveerd werden voor myeline antigenen (30). Identificatie van immunodominante epitopen voor myeline componenten hebben geleid tot ontwikkeling van peptide-representerende epitopen van ‘myelin basic protein’ (MBP), ‘proteolipid protein’ (PLP) en ‘myelin oligodendrocyte glycoprotein’ (MOG), welke geschikt zijn voor de inductie van EAE. Welk peptide gebruikt wordt verschilt naargelang de gebruikte muizenstam (14, 30). Actief geïnduceerde EAE ontstaat gemiddeld na 7 tot 12 dagen post-immunisatie, met een maximale klinische ernst van dag 9 tot 14. Nadien gaat de ziekte in remissie, hoewel relapses kunnen voorkomen. Dit in tegenstelling tot volledig herstel, dat zeldzaam voorkomt na transfer van myeline antigen-specifieke T-lymfocyten. De ziekte ontwikkelt zich hier na 6 tot 12 dagen, met een maximale klinische ernst tussen dag 8 en 14. Het verloop en de duur van de ziekte variëren naargelang de gebruikte diersoort en stam (30).
De EAE wordt geëvalueerd aan de hand van een score op een schaal van 0 tot 5. EAE Kliniek 0 1 2 3 4 5
Score Geen klinische ziektetekenen Zwakte van de staart Hemi- of paraparesis (onvolledige paralyse van 1 of 2 achterpoten) Hemi- of paraplegia (volledige paralyse van 1 of 2 achterpoten) Paraplegia met zwakte of paralyse van de voorpoten Dode of stervende dieren
Tabel 1: Klinische scores in EAE Vertaald uit: Brocke EB-CaS, editor. Experimental Models of Multiple Sclerosis: Springer US; 2005
Observaties in verband met NKT-cellen: In EAE Over de rol van NKT-cellen in EAE wordt dikwijls tegenstrijdige resultaten bekomen. Dit kan verklaard worden door het gebruik van verschillende modellen (detectie van andere antigenen, gebruik van verschillende muizenlijnen, …). Ook het tijdstip van toediening, de administratieroute en de dosis van de α-GalCer-injectie spelen een rol (14).
31
Aantallen en lokalisatie NKT-cellen zijn terug te vinden op de gebruikelijke plaatsen, met name in het bloed, de lymfeknopen, milt, lever en thymus (zie eerder). Daarnaast waren in muizen met EAE ook in het centraal zenuwstelsel NKT-cellen terug te vinden, welke bij inflammatie vanuit de milt daarheen migreren (5, 31). Zoals reeds eerder vermeld, zijn de NOD en SJL muizen voorbeelden van muizenstammen met een lage Vα14 NKT-cel expressie (5). In SJL-muizen met chronische EAE werd een gedaald aantal NKTcellen en een defect in IL-4 productie vastgesteld (31). Mars et. al. (2008) toonden aan dat in NOD muizen de klinische score van de ziekte hoog was, terwijl bij muizen met een hoge concentratie aan iNKT-cellen in lever en milt over het algemeen een lage klinische score wordt gerapporteerd (29).
Activering van NKT-cellen iNKT-cellen kunnen beschermen tegen EAE door middel van infiltratie in het centraal zenuwstelsel en door lokale CD1d-expressie. Dit betekent dat ook cellen in het centraal zenuwstelsel in staat moeten kunnen zijn in periodes van inflammatie of andere stress glycolipiden te presenteren. Echter is aangetoond dat, ook al is CD1d-expressie mogelijk, endogene lipidenpresentatie niet noodzakelijk is voor NKT-cellen voor het uitvoeren van hun functie. Hier treedt bescherming dan op door het onderdrukking van de de encephalitogene T-cel respons in de milt, gereguleerd door NKT-cellen. Het is echter niet duidelijk of deze regulatie zich ook voordoet in het centraal zenuwstelsel. Wel is aangetoond dat het om dezelfde subtypes NKT-cellen gaat, met bijgevolg vermoedelijk ook dezelfde immunoregulatorische functies (namelijk lyse van ofwel infiltrerende T-cellen, ofwel APC’s). Ook moet men zich ervan bewust zijn dat, hoewel afremming van de encephalitogene T-cel respons gepaard gaat met een anti-inflammatoir cytokineprofiel van de NKT-cellen in de milt, men gelijktijdig in het centraal zenuwstelsel
een pro-inflammatoir, cytotoxisch cytokineprofiel (IFN-γ, IL-17 en
granzyme B) kan vaststellen (29, 31). Uit verdere observaties kan men concluderen dat de relapsing-remitting EAE onder controle gebracht kan worden in transgene muizen met verhoogde iNKT-cel expressie (32). Dit omdat de iNKT-cellen voorkomen dat de encephalitogene T-cellen accumuleren in de milt. Deze bescherming is niet absoluut; CZS-infiltrerende CD4+ T-cellen kunnen nog steeds aangetoond worden in beschermde muizen (31).
32
Uit onderzoek van Mars et al. (2008) waarbij het belang van CD1d-expressie bij EAE verder werd onderzocht, blijkt dat CD1d niet noodzakelijk is voor de NKT-cel regulatie. Hierbij maakte men gebruik van een muizenlijn die geen CD1d tot expressie kan brengen, waardoor het mogelijk werd de noodzakelijkheid na te gaan van antigenpresentatie bij activering van regulerende NKT-cellen. Verwacht werd dat, naar analogie met conventionele T-cellen, in afwezigheid van CD1d in de periferie de NKT-cellen niet meer geactiveerd zouden kunnen worden, en bijgevolg hun regulerende functie niet meer zouden kunnen uitvoeren. Immers, indien dit niet het geval was geweest, zou men verwachten dat deze muizen resistent zijn aan EAE. Tegen de verwachtingen in werd in dit onderzoek echter aangetoond dat, ook al spelen NKT-cellen inderdaad een regulerende rol in EAE, deze niet afhankelijk is van de CD1d-TCR signaalcascade. Zowel CD1d-sufficiënte als CD1d-deficiënte muizen beschikken over een even werkzame NKT-cel regulatie: CD1d-deficiëntie had geen effect op recrutering van NKT-cellen in het centraal zenuwstelsel, en ook de onderdrukking van encephalitogene T-cellen – dit zijn T-cellen die encefalitis kunnen veroorzaken – verliep hier normaal (29). In muizen met transgene verrijking met NKT-cellen – met andere woorden muizen die door genetische modificatie een hogere NKT-cel expressie vertoonden – bleek dat degene die ook deficiënt waren in de extrathymische CD1d-expressie een zeer sterke resistentie vertoonden tegen MOG-geïnduceerde EAE. Deze bescherming vertoonde echter geen verschil met de bescherming die werd aangetoond in CD1d-sufficiënte muizen. Hieruit kan men concluderen dat de bescherming in de transgene muizen onafhankelijk is van CD1d-expressie. Wel interfereerde deze NKT-cel respons met de encephalitogene T-cel respons, door afremming van de MOG-geïnduceerde T-cel proliferatie en bijgevolg ook afremming van de encephalitogene Th1- en Th17-responsen. In de milt was er een verhoogde productie van IL-4 en IL-10 – dus anti-inflammatoire cytokines – door NKT-cellen. Dit alles samen suggereert een mechanisme van anergie, eliminatie en/of gewijzigd migratiegedrag van deze T-cellen. Gezien de afwezigheid van cytotoxische moleculen, zoals granzyme B, in de splenische NKT-cellen, is er vermoedelijk geen sprake van eliminatie van deze cellen (31). Ook speelt CD1d geen rol in de selectie van het type NKT-cel dat terug te vinden is in het centraal zenuwstelsel. Dit hangt immers af van het weefseltype waar de NKT-cel voorkomt. Zoals eerder vermeld heeft elk type NKT-cel zijn eigen gespecialiseerde functie. In het centraal zenuwstelsel gaat het voornamelijk om DN cellen (31). Daarnaast werd aangetoond dat NKT-cellen de ziekte kunnen moduleren via Th2 cytokine productie. Dit wordt verder bevestigd door therapieën die de Th2-respons van NKT-cellen stimuleren: hierbij wordt de ontwikkeling van EAE vertraagd (7).
33
Uit al deze gegevens kan men concluderen dat CD1d-Ag presentatie vermoedelijk een rol kan spelen tijdens de initiatie van een immuunrespons, wanneer nog een evenwichtssituatie (steady state) bestaat met weinig of geen cytokines, terwijl in situaties waar cytokines overvloedig aanwezig zijn de rol van CD1d eerder beperkt is (29). Enerzijds kan EAE therapeutisch beïnvloed worden door CD1d-dependente activering van NKTcellen, anderzijds kan transgene verrijking van de NKT-cel populatie het ontstaan van EAE voorkomen. Alhoewel beide mechanismen leiden tot hetzelfde resultaat, namelijk een demping van de encephalitogene T-cel respons, werken beiden volgens een verschillend mechanisme. Behandeling met exogene glycolipiden is CD1d-dependent. Hier is myeline-specifieke immuundeviatie, gemedieerd door IL-4 en IL-10 belangrijk. Een additionele rol is weggelegd voor IFN-γ. Bij de muizenpopulatie met transgenische verrijking van de NKT-cellen is de rol van CD1d nog niet gekend. De regulatie van de encephalitogene T-cel respons vindt plaats na T-cel priming en er is geen rol weggelegd voor IL-4 en immuundeviatie. Bescherming is hier geassocieerd met NKT-cel infiltratie in het centraal zenuwstelsel en concomitante lokale expressie van CD1d (29).
Modulatie van NKT-cellen Studies suggereren dat CD1d-gerestricteerde NKT-cellen een regulerende rol spelen bij autoimmuunziekten. Dit betekent echter niet dat stimulatie van NKT-cellen zonder meer leidt tot suppressie of zelfs preventie van auto-immuunziekten. In tegendeel: in vivo activatie van NKT-cellen door toediening van α-GalCer kan de ontwikkeling van EAE in wild-type B6 muizen niet tegengaan. Dit komt omdat IFN-γ, afkomstig van de NKT-cellen, het therapeutisch effect van IL-4 maskeert. Dit blijkt ook uit de observatie dat stimulatie met OCH wel protectief is tegen EAE. Zoals eerder vermeld is OCH een α-GalCer-analoog dat voornamelijk de IL-4 productie – en in mindere mate IFN-γ productie – stimuleert bij NKT-cellen. Naast deze Th2-bias leidt stimulatie met OCH bovendien tot een stijging in het aantal NKT-cellen in de lever, terwijl stimulatie met α-GalCer apoptose van de NKT-cellen veroorzaakt. Dit laatste is echter controversieel (13). NKT-cellen kunnen dus gemoduleerd worden door toediening van αGalCer of van OCH. Dit heeft aanleiding gegeven tot verder onderzoek naar therapeutische mogelijkheden: iNKT-cellen kunnen concomitante T-cel responsen ofwel potentiëren, ofwel afremmen, afhankelijk van het tijdstip van activering en van het soort cytokine dat ze produceren en αGalCer en OCH hebben een invloed op het cytokineprofiel van de NKT-cellen. Verder lijkt ook de administratieroute van αGalCer een rol te spelen. Zo hing het protectief effect van subcutane toediening van αGalCer samen met een opmerkelijk gestegen IFN-γ productie in NKT-cellen in de lever. Deze onderdrukten op hun beurt de Th1-cytokine productie en bevorderden IL-10 secretie van MOG35-55 specifieke T-cellen. In vivo 34
neutralisatie van IFN-γ onderdrukt dit protectief effect. Bescherming tegen EAE door behandeling met αGalCer subcutaan is geassocieerd met suppressie van Th1 cytokines door encephalitogene T-cellen. Dit vereist bovendien ook secretie van IFN-γ (maar niet IL-4) door iNKT-cellen (Furlan et al., 2003). Alhoewel αGalCer algemeen bekend staat myeline antigen-specifieke Th1 responsen te onderdrukken door activering van iNKT-cellen – en zo de hieraan gevoelige muizen te beschermen tegen EAE – werd recent aangetoond dat, tegen alle verwachtingen in, hoge dosissen αGalCer juist het omgekeerde effect hebben. Deze hoge dosissen activeren juist rechtstreeks de Th17 en Th1 responsen door activering van CD4+CD44+ geheugen T cellen, dit in tegenstelling tot activering met lage dosissen αGalCer (33).
Profiel van de NKT-cellen NKT-cellen, afkomstig uit de milt, die vervolgens infiltreren in het centraal zenuwstelsel, vertonen een verandering in hun cytokineprofiel: ze produceren IFN-γ , granzyme B, IL-17, terwijl IL-4 en IL-10 niet langer detecteerbaar zijn. Hiervoor zijn verschillende verklaringen mogelijk: ofwel wordt enkel een bepaalde subpopulatie van NKT-cellen gerekruteerd, of mogelijks vindt in het centraal zenuwstelsel een verdere differentiatie plaats van de NKT-cellen afkomstig uit de milt, onafhankelijk van de CD1d-presentatie (29, 31). Deficiëntie van IL-17 leidt tot resistentie tegen EAE; dit bewijst verder het belang van dit cytokine bij het ontstaan van de aandoening (34).
In MS Aantallen en lokalisatie Bij inflammatie van het centraal zenuwstelsel – wat het geval is tijdens de klinische relapses in MS – is het aantal NKT-cellen (lokaal) gestegen. Het gaat hier om een transiënte stijging in het cerebrospinaal vocht, die ook vastgesteld kan worden in het perifeer bloed. Over het algemeen echter is er sprake van een daling van NKT-cellen in MS-patiënten. Bescherming tegen auto-immune demyelinisatie gaat gepaard met een stijging van het aantal NKTcellen in het CZS (voornamelijk DN cellen), wat gepaard gaat met de lokale inductie van CD1d expressie. Op deze manier kan CD1d-antigen (Ag) presentatie de infiltrerende NKT-cellen activeren. Aan de hand van de stijging van zowel transcripten voor invariante TCR-α ketens als voor CD1d heeft men kunnen aantonen dat dit mechanisme ook in MS-laesies een rol speelt (31).
35
Activering van NKT-cellen De witte stof letsels in MS induceren CD1-expressie. Er bestaan verschillende subtypes CD1, maar ook CD1d wordt opgereguleerd op de microglia en reactieve astrocyten, dit voornamelijk tijdens de inflammatoire demyelinisatie. Tegelijkertijd brengt de APC-populatie die steeds aanwezig is in het centraal zenuwstelsel bij ontsteking CD1d tot expressie. CD1d-dependente activering van NKT-cellen leidt tot uitstel van de relapse en een minder ernstig verloop van deze relapses (31).
Modulatie van NKT-cellen Specifieke informatie omtrent de modulatie van NKT-cellen in MS-patiënten werd niet teruggevonden.
Profiel van de NKT-cellen De anti-inflammatoire rol van deze NKT-cellen wordt gesuggereerd door een hogere IL-4/IFN-γ verhouding in de NKT-cellen tijdens de remissie. Een daling van het Vα24 iNKT mRNA – en daarmee samengaand een daling van de IL-4 secretie door DN NKT-cellen – valt samen met de relapses tijdens de evolutie van MS. Bovendien is er gedurende de remissies een sterke Th2-bias – afkomstig van de CD4+ NKT-cellen – ten opzichte van de relapses. Dit suggereert een regulerende functie voor de Vα24 iNKT-cellen (7, 14, 31).
De rol van NKT-cellen bij RA Reumatoïde artritis is een progressieve aandoening die gekenmerkt wordt door een persisterende inflammatie van de gewrichten. Zowel bot als kraakbeen zijn hierbij betrokken, en uiteindelijk leidt deze inflammatie tot veranderingen en remodellering van de gewrichten. Deze schade is onomkeerbaar, en resulteert in vermindering of zelfs verlies aan functie van de gewrichten. Betrokken gewrichten vertonen hyperplasie van de synovia. Verder zijn er cellulaire infiltraten, bestaande uit onder andere neutrofielen, macrofagen, T-cellen, B-cellen, dendritische cellen en fibroblasten. Er zijn complement-afzettingen en de pro-inflammatoire cytokines zijn gestegen in de synoviale en periarticulaire regio’s (35-37). De boterosie, die kenmerkend is voor reumatoïde artritis, is een gevolg van lokale botresorptie aan de gewrichten. Osteoclasten accumuleren en degraderen periarticulair bot en kraakbeen (35).
36
De verschillende diermodellen Er bestaan verschillende diermodellen om artritis te bestuderen, voornamelijk in ratten en muizen. De meest gekende worden hieronder opgesomd: I.
Modellen in ratten (erosieve artritis): a.
Collageen-geïnduceerde artritis (CIA, collagen induced arthritis)
b.
Kraakbeen oligomeer matrix proteïne-geïnduceerde artritis (cartilage oligomeric matrix protein (COMP) induced arthritis)
c.
Adjuvant-geïnduceerde arthritis (AIA, adjuvant induced arthritis)
d.
Avridine-geïnduceerde artritis (avridine induced arthritis)
e.
Pristaan-geïnduceerde artritis (PIA, pristane induced arthritis)
f.
Olie-geïnduceerde artritis (OIA, oil induced arthritis)
g.
Streptococcen celwand geïnduceerde arthritis (streptococcal cell wall induced arthritis)
II.
Muismodellen voor erosieve artritis: a. Collageen-geïnduceerde artritis (CIA, collagen induced arthritis) b. Pristaan-geïnduceerde artritis (PIA, pristane induced arthritis) c. Proteoglycaan-geïnduceerde artritis (proteoglycan induced arthritis) d. Antilichaam-geïnduceerde artritis (ABIA, antibody-induced arthritis) (38)
In dit werk wordt verder enkel CIA in muizen besproken omdat hierover in de literatuur de meeste informatie terug te vinden is.
CIA CIA is een experimenteel muismodel voor reumatoïde artritis in DBA/1 muizen (niet in Jα281knockout muizen) (37). Het wordt wereldwijd gebruikt om inzicht te verwerven in de pathogenese van reumatoïde artritis en om nieuwe behandelingsmogelijkheden uit te werken. Over het algemeen wordt de artritis in de hiervoor gevoelige muizen of ratten geïnduceerd door immunisatie met heteroloog collageen type II (CII). Dit lokt een sterke B- en T-cel respons uit. De susceptibiliteit van de muizen is sterk geassocieerd met MHC types I-Aq and I-Ar, net zoals mensen met HLA-DR4 en HLA-DR1 vatbaarder zijn voor RA. De belangrijkste kenmerken van CIA zijn onder andere: een symmetrische aantasting van de perifere gewrichten met synoviale hyperplasie, infiltratie van inflammatoire cellen, pannus formatie, degradatie van kraakbeen, boterosie, fibrose en de aanwezigheid van reumafactor. Net zoals in reumatoïde artritis is er een hoge concentratie aan pro-inflammatoire cytokines, zoals TNF-α en IL-1β, aanwezig in de 37
aangetaste gewrichten van muizen met CIA. Ook hier leidt blokkade van deze molecules tot een verminderde activiteit van de aandoening (38-40). Samengevat kan men stellen dat CIA vooral veroorzaakt wordt door een overdreven Th1-respons (41). Er zijn twee manieren om de rol van iNKT-cellen in CIA te bestuderen: enerzijds kan men specifiek iNKT-cellen activeren door toediening van glycolipiden zoals αGalCer, anderzijds kan men ook gebruik maken van CD1d of iNKT-cel knock-out muizen om zo de intrinsieke functies van de iNKT-cel subset te gaan bestuderen (40). CIA kan geïnduceerd worden in verschillende muizenstammen, zoals DBA/1, wild type B6, C57BL/6 of SJL muizen. Hierbij zijn C57BL/6 en SJL muizen minder vatbaar voor CIA dan de DBA/1 stam (41).
Observaties in verband met NKT-cellen: In CIA Aantallen en lokalisatie Naast de gebruikelijke plaatsen, blijken NKT-cellen ook voor te komen in het synovium, een plaats waar ze gewoonlijk niet teruggevonden worden. Dit doet vermoeden dat ze in het geval van CIA bijdragen tot de inflammatie, en staat in contrast tot de eerdere observatie dat het aantal en de functie van de NKT cellen gedaald zou zijn in CIA en auto-immuunziekten in het algemeen (37, 42). Vooral de NKT-cellen in lever en milt schijnen een belangrijke rol te spelen (43-44). Jung et al. (2009) hebben aangetoond dat in DBA/1 muizen met CIA het aantal NKT-cellen niet gedaald is in lever en milt. Ook konden zij geen enkel verschil aantonen in cytokineproductie. Verder werd vastgesteld dat de afwezigheid van NKT-cellen een gunstig effect zou hebben op het verloop van de CIA. Deze resultaten suggeren dat NKT-cellen bijdragen tot het ontstaan en het verder verloop van CIA in DBA/1 muizen. Dit staat in scherp contrast met de resultaten van onderzoek van Chiba et al. (2004), waaruit juist blijkt dat de concentratie aan NKT-cellen gedaald is in CIA, en dat deze NKT cellen bovendien minder functioneel zijn (37, 44).
Activering van NKT-cellen Zoals eerder vermeld kan stimulatie van NKT cellen kan direct (via bacteriële antigenen = glycosaminoglycanen) of indirect (LPS bij gram-negatieve bacteriën) verlopen. Belangrijk hierbij is de
38
snelle productie van Th1- en Th2-type cytokines kort na stimulatie. Deze zijn ofwel afkomstig van de iNKT-cellen zelf, of van downstream effector cellen. Dit is niet anders in CIA (5, 7, 41). Verderop wordt besproken hoe activering van NKT-cellen kan gebeuren door toediening van αGalCer of OCH. In het geval van een gedaalde en minder functionele NKT-cel populatie, zoals beschreven door Chiba et al., lijkt natuurlijke activatie niet echt van toepassing. Echter, indien de NKT-cellen inderdaad – zoals omschreven door Jung et al. (2009) – in normale concentraties aanwezig en functioneel zijn, moet men ervan uitgaan dat CII toediening onrechtstreeks zorgt voor NKT-cel activering (44).
Modulatie van NKT-cellen Allereerst is het belangrijk te beseffen dat de intrinsieke capaciteit van iNKT-cellen om CIA te beïnvloeden onafhankelijk is van hun onderdrukkende rol bij activering met glycolipiden antigen (40). Er zijn verschillende therapeutische mogelijkheden waarmee NKT-cellen gemoduleerd kunnen worden. Hier wordt verder aandacht besteed aan toediening van αGalCer, α-C-GalCer – dit is het Cglycoside analoog van αGalCer – OCH en neutraliserende antilichamen gericht tegen IFN-γ. Aangezien reeds het meest onderzoek is gedaan naar αGalCer, wordt verder telkens een vergelijking gemaakt tussen het effect van αGalCer en een van de andere drie stoffen.
a. αGalCer versus OCH Het effect van αGalCer-toediening in CIA lijkt tegenstrijdig, en sterk af te hangen van het tijdstip van toediening, dosering en toedieningsvorm. Terwijl eenmalige toediening een langdurige hyporesponsiviteit induceerde in NKT-cellen, zouden herhaalde toedieningen NKT-cellen wel kunnen activeren (40-41, 43). Vroegtijdige stimulatie met αGalCer in DBA/1 muizen leidt tot stijging van IL-10, 2 weken na toediening, terwijl een daling van IL-6 en IL-1β werd vastgesteld. Verder werd ook aangetoond dat na toediening van αGalCer 3 tot 4 keer minder histopathologisch aangetaste gewrichten werden vastgesteld in muizen (41). De resultaten van dit onderzoek – met betrekking tot αGalCer – staan in scherp contrast met het onderzoek van Chiba et al. uit 2004, waar stimulatie met αGalCer leidde tot productie van IFN-γ, IL-4 en IL-10. Volgens dit onderzoek zou αGalCer geen effect hebben op de minder functionele NKTcellen (37).
39
In contrast met de vorige resultaten staat het onderzoek van Miellot et al. (2005) waarbij minder uitgesproken klinische tekens van artritis aangetoond werden na herhaalde profylactische en semi-therapeutische behandeling met αGalCer in CIA. CII-specifieke restimulatie leidde tot een gestegen productie van IL-10, maar niet van IL-4 en IFN-γ (40, 45). Vroegtijdige toediening van OCH in C57BL/6 en SJL muizen zorgde voor een stijging van IL-4 en IL-10 (41). Chiba et al. (2004) kon aantonen dat OCH in staat is CIA af te remmen op een IL-4 en IL-10 dependente manier – met een toename in serumconcentratie –, terwijl stimulatie met αGalCer geen aantoonbare invloed heeft op het verloop ervan. Zowel stimulatie met OCH als met αGalCer veroorzaakt een stijging van IL-10. Deze cytokines zijn afkomstig van NKT-cellen, of van cellen die gestimuleerd worden door de met OCH geactiveerde NKT-cellen (37). Hoewel sprake is van een kleiner aantal en minder functionele NKT-cellen in CIA, verschijnen na stimulatie met OCH toch vrij snel IL-4 en IL-10, echter in veel lagere concentraties, terwijl IFN-γ nauwelijks detecteerbaar was in het serum (37). Als laatste werd vastgesteld dat bij toediening van OCH lagere hoeveelheden TNF en RANKL mRNA aanwezig was in de iNKT-cellen, vergeleken met dezelfde situatie na stimulatie met αGalCer. Dit werd ook aangetoond door Chiba et al. (2004): de expressie van Receptor Activator voor NF κ B Ligand (RANKL) door NKT cellen was veel hoger na αGalCer stimulatie dan na OCH stimulatie. Een gestegen RANKL-expressie promoot de osteoclastogenese, en zo ook de botafbraak. Afhankelijk van waarmee NKT-cellen gestimuleerd worden, kunnen zij dus moduleren welke stoffen zij vrijstellen, en zo een immunoregulatorische functie uitoefenen (37, 40). Samenvattend kan men stellen dat CIA gekenmerkt wordt door activering van voornamelijk Th1 cellen. Beïnvloeding van het Th1/Th2 evenwicht in de richting van Th2 – door het afremmen van de Th1-respons enerzijds, of het stimuleren van een Th2-respons anderzijds – lijkt op zijn minst een deel van de werking van de huidige behandelingen te verklaren. Toch is stimulatie met αGalCer niet zinvol, gezien dit leidt tot zowel vrijstelling van Th1 als Th2 cytokines (zie eerder). Zelfs herhaaldelijke toediening van αGalCer – iets waarvan aangetoond is dat het een Th2-bias induceert – lijkt geen significant effect te hebben op CIA. OCH is hiervoor echter wel geschikt, gezien dit voornamelijk secretie van Th2-cytokines bevordert in wild type muizen. Het effect van OCH verdwijnt wanneer men gelijktijdig neutraliserende antilichamen gericht tegen IL-4 en IL-10 toedient (40). Dit wijst op een belangrijke rol van deze cytokines bij protectie tegen CIA. Th1-type 40
cytokines blijken een verergering van de inflammatie teweeg te brengen in reumatoïde artritis (37). b. αGalCer versus α-C-GalCer Gezien α-C-GalCer voornamelijk een Th1 cytokineprofiel uitlokt bij iNKT-cellen, werd verwacht dat bij toediening geen therapeutisch effect zou waargenomen worden. Wanneer toegediend tijdens de vroege inductiefase van CIA in DBA/1 muizen, werd echter een algemene daling vastgesteld van alle cytokines, met uitzondering van IFN-γ – dat 16h na αGalCer-toediening wel gedaald was, maar op 24h gestegen bleek te zijn –, IL12p70 en IL-6. Ondanks de verwachtingen was het effect op de klinische artritis scores vergelijkbaar met dat van vroegtijdige toediening van αGalCer. Dit heeft te maken met de bifasische rol van IFN-γ: in een vroege fase heeft het een ongunstige invloed op het verloop van de artritis, terwijl dit niet het geval is in een later stadium. Dit blijkt uit onderzoek waarin IFN-γ werd geblokkeerd: vroegtijdige blokkering door toediening van neutraliserende antilichamen resulteerde in een verbetering van de kliniek, terwijl laattijdige toediening van neutraliserende antilichamen juist een sneller begin van de artritis uitlokte. Het effect van IFN-γ neutraliserende antilichamen werd daarnaast ook met ofwel αGalCer, ofwel α-C-GalCer. Hieruit blijkt dat de combinatie van αGalCer en IFN-γ neutraliserende antilichamen als therapie effectiever is dan elk afzonderlijk. Wanneer IFNγ neutraliserende antilichamen worden toegediend in combinatie met α-C-GalCer, gaan deze antilichamen de daling van cytokines, die het gevolg is van α-C-GalCer toediening, tegen. Het klinisch effect van deze beide samen is ongeveer hetzelfde als bij de combinatie van αGalCer en IFN-γ neutraliserende antilichamen (41). Een lagere concentratie aan IL-2 dan na stimulatie met αGalCer suggereert dat α-CGalCer toch een minder potente stimulator is van iNKT-cellen (41). c. Anti-CD1d antilichamen Ook studies waarin muizen de interactie tussen CD1d en iNKT-cellen geblokkeerd werd met behulp van anti-CD1d mAntilichamen – dit in contrast met de studies waarin gekeken werd naar het effect op NKT-cellen na CD1d-stimulatie met αGalCer of OCH – werden uitgevoerd. Op deze wijze werden de klinische artritis scores onderdrukt (40). Voor dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Jα18-/-, dit zijn muizen die geen TCR Jα18-keten hebben en bijgevolg ook geen iNKT cellen. Zo werden iNKT-cellen verhinderd hun functie uit te oefenen. Jα18-/- iNKT-cel deficiënte knock-out muizen ontwikkelen minder ernstige artritis dan de wild-type muizen. Dit toont aan dat een functionele iNKT-cel subset een rol speelt in het ontstaan van CIA. Deze Jα18-/- muizen 41
vertoonden eveneens een gestegen CII-specifiek IgG1/IgG2a antilichaam ratio in het serum. Deze ratio wordt over het algemeen gezien als een afspiegeling van het Th2/Th1 evenwicht, waarbij IgG1 productie wijst op een Th2-bias (40). Dit werd ook al eerder aangetoond door Chiba et al. (2005). Ook hier werd gebruik gemaakt van Jα18-/- muizen, maar daarnaast ook nog van CD1d-/- muizen – muizen zonder de CD1d molecule. Ook dit verhindert activering van de NKT-cellen. Bij immunisatie met CII – inductie van CIA – werd vastgesteld dat de incidentie en artritis scores lager waren dan de controlegroep. Dit wijst op een rol van iNKT-cellen bij het ontstaan van deze ziekte. Bovendien werd vastgesteld dat ook bij Vα14-deficiënte muizen CIA minder ernstig was, door een minder uitgesproken Th1-deviatie als antwoord op blootstelling aan CII (36). Indien vroegtijdig toegediend, leidt iNKT-cel neutralisatie door toediening van anti-CD1d tot een verbeterde klinische en histologische score van CIA. Deze blokkade gaat gepaard met een verminderde maturatie van splenische dendritische cellen en macrofagen in een latere fase van de ziekte (43). Analoge resultaten werden verkregen uit een tweede studie met Jα18-/- en CD1d-/muizen, waar na inductie zich ook een mildere CIA ontwikkelde. Hier werd aangetoond dat, hoewel de titer van CII-specifieke antilichamen, net zoals de CD69-geactiveerde T en B-cellen in de milt verlaagd waren in de mutante muizen, er geen verschil was in IFN-γ en IL-4 productie na ex vivo restimulatie van de splenische T cellen met CII. Ook de rol van de Th2-shift werd nogmaals bevestigd (40).
Profiel van de NKT-cellen CIA wordt gekenmerkt door activering van voornamelijk Th1-cellen, dit door een verstoring van het Th1/Th2 evenwicht door NKT-cellen (36, 40). In CIA zijn de aantallen NKT-cellen gedaald, en zijn deze NKT-cellen bovendien minder functioneel. Dit draagt verder bij tot de auto-immuniteit, door gedaalde productie van Th2 cytokines en bijgevolg een verminderde bescherming. Na stimulatie met OCH verschijnen toch vrij snel IL-4 en IL-10, echter in veel lagere concentraties, terwijl IFN-γ nauwelijks detecteerbaar was in het serum. αGalCer heeft weinig tot geen effect op deze minder functionele NKT cellen (37). Na in vitro restimulatie van miltlymfocyten met CII in muizen met functionele NKT-cellen werd, in vergelijking met de controlegroep, een significante stijging vastgesteld in de pro-inflammatoire 42
cytokines (onder andere IFN-γ en IL-17). Deze stijging werd niet vastgesteld in CD1d-/- muizen. Daar waar in de loop van het ziekteproces de IFN-γ secretie door NKT-cellen in de milt constant bleef, nam deze van IL-17 opvallend toe. Dit doet vermoeden dat NKT-cel gedreven IL-17 productie bijdraagt tot het onderhoud en exacerbatie van CIA door middel van CII-specifieke CD4+ cellen (Jung et al., 2009). Deficiëntie van IL-17 leidt tot resistentie tegen CIA; dit bewijst verder het belang van dit cytokine bij het ontstaan van de aandoening (9). Alles samen lijkt het zo dat de intrinsieke capaciteit van iNKT-cellen om CIA te moduleren verschilt van hun suppressieve rol na activatie met glycolipide antigenen (40).
In RA Aantallen en lokalisatie Het aantal NKT-cellen is verminderd in het perifeer bloed en het synovium van patiënten met RA (46). Ook Linsen et al. toonde deze daling in perifeer bloed aan, hoewel hier eerder een stijging van het aantal NKT-cellen in het synovium werd vastgesteld. Dit laatste kon echter niet aangetoond worden voor alle patiënten (47). Het aantal DN NKT-cellen in het perifeer bloed van reumapatiënten zou afwijkend zijn, net zoals de functionaliteit van deze cellen (42).
Activering van NKT-cellen Hoe NKT-cellen geactiveerd worden in reumatoïde artritis blijft onduidelijk, gezien iGb3 voorlopig de enige molecule in de mens is die geïdentificeerd werd als een mogelijk ligand voor CD1d. Ook cytokines zouden een rol kunnen spelen (zie eerder).
Modulatie van NKT-cellen Stimulatie met αGalCer leidt tot productie van zowel Th1 als Th2 cytokines. Aangezien vooral Th2 cytokines een protectief effect hebben in reumatoïde artritis, is stimulatie met OCH – dat voornamelijk een Th2 respons uitlokt – meer geschikt om de NKT-cel respons te beïnvloeden (42). Linsen et al. (2005) toonde aan dat αGalCer-gestimuleerde NKT-cellen in het perifeer bloed voornamelijk een Th1-bias vertoonden. Ook het aantal NKT-cellen was na αGalCer-stimulatie lager bij de reumapatiënten dan bij de controles. Bij interpretatie van het resultaat van deze case-control studie moet echter rekening gehouden worden met het beperkt aantal cases dat bestudeerd werd (47). 43
Volgens Coppieters et al. (2007) resulteert herhaaldelijke toedoening van αGalCer in een gestegen Th2 productie door NKT-cellen en andere celtypes (zie figuur 21). Dit stimuleert cellen tot differentiatie in Th2 cellen. Bovendien zijn de cytokines in staat pathogenen Th1 cellen in de drainerende lymfeknopen en op de plaats van inflammatie te onderdrukken (40). Figuur 21: Deviatie van Th1 naar Th2 respons
bij
NKT-cellen
drainerende
in
de
lymfeknopen
en
gewrichten. Bron: Coppieters K, Dewint P, Van Beneden
K,
Verbruggen
Jacques G,
et
P, al.
Seeuws
S,
NKT
cells:
of
joint
manipulable
managers
inflammation.
Rheumatology
(Oxford).
2007 Apr;46(4):565-71.
Profiel van de NKT-cellen Er zou sprake zijn van een Th1-bias van de NKT-cellen in het perifeer bloed. Dit geldt niet voor de NKT-cellen in het synovium (46). Mogelijks zouden NKT-cellen kort na stimulatie ook IL-17 produceren (40). Linsen et al. (2005) toonde een significante stijging van het aantal IFN-γ producerende cellen in reumapatiënten, terwijl het aantal cellen dat zowel IFN-γ als IL-4 produceerde gedaald was in vergelijking met de gezonde controles (47).
Relatie tussen NKT-cellen en botaanmaak en -afbraak in RA Een belangrijk aspect van reumatoïde artritis is de botafbraak door osteoclasten. Osteoclast formatie wordt gestimuleerd door zowel Th1 cellen als Th17 cellen. Welk van beide hierbij de belangrijkste rol speelt is tot op heden niet geweten. Als reactie op de IL-17 vrijstelling door Th17 cellen worden TNF en IL-1 geproduceerd. Deze drijven op hun beurt de inflammatie in artritische gewrichten, door inductie van Receptor Activator voor NF κ B Ligand (RANKL) en regulatie (via TNF-receptor 1) van osteoclasten vorming. Ook IL-6 is een pro-inflammatoir cytokine, dat via inductie van RANKL-expressie osteoclastogenese promoot. Anti-inflammatoire cytokines daarentegen, zoals IL-4 en IL-10, en vermoedelijk ook TGF-β inhiberen osteoclasten-vorming. 44
Al deze mechanismen stimuleren de botafbraak. Botaanmaak is bovendien ook gestoord: cytokines zoals TNF induceren DKK-1, dat op zijn beurt Wnt-signaling inhibeert. Dit laatste proteïne speelt een rol in de signaalcascade die de differentiatie van mesenchymale cellen naar osteoblasten drijft. In het serum van RA-patiënten
kunnen verhoogde concentraties van DKK-1 aangetoond worden.
Systemische blokkade van TNF bij deze patiënten leidt tot normalisering van de DKK-1 levels, wat de hypothese ondersteunt dat TNF bij deze patiënten verantwoordelijk is voor de stijging in DKK-1. Uit deze gegevens kan afgeleid worden dat TNF bepaalde molecules induceert die nieuwe botvorming tegengaan. TNF, zelf een pro-inflammatoir cytokine, induceert zowel DKK-1 als RANKL, het eerste verantwoordelijk voor verminderde botaanmaak, het tweede voor gestegen botresorptie. In feite vormt TNF op deze manier dus een link tussen inflammatie en botresorptie, en inflammatie en verminderde botaanmaak. Inflammatie verstoort bijgevolg het evenwicht dat normaal bestaat tussen botaanmaak en –resorptie (35). Een aantal van de net vermelde cytokines – vb. Th1-cytokines, IL-17, … – worden bovendien ook geproduceerd door NKT-cellen (zie eerder). Zij kunnen rechtstreeks, via voornoemde signaalcascades, osteoclastensynthese stimuleren en botaanmaak inhiberen, maar ook onrechtstreeks, door inductie van effector cellen. Op deze manier kunnen NKT-cellen een pro-inflammatoire rol spelen. Echter kan de cytokinebalans in NKT-cellen na toediening van OCH ook doorslaan naar IL-4 en IL-10, waarvan geweten is dat zij de botaanmaak bevorderen.
DISCUSSIE Onderzoek naar de rol van NKT-cellen bij auto-immuunziekten heeft zich tot nu toe voornamelijk toegelegd op stimulatie met αGalCer en andere exogene liganden. Dit heeft al veel resultaten opgeleverd en het inzicht in de werking en functie van NKT-cellen is toegenomen. Tegelijk heeft deze kennis echter minstens even veel andere vragen opgeroepen. Zo is gebleken dat in auto-immuunziekten dikwijls sprake is van een Th1-bias van de NKT-cellen. In dit werk werd aangetoond dat het cytokineprofiel van NKT-cellen beïnvloed kan worden door de liganden waarmee gestimuleerd wordt. Waar αGalCer zowel een Th1 als Th2 respons uitlokt, veroorzaakt OCH eerder een Th2-bias. 45
Bovendien bestaan er verschillende NKT-cel subtypes, die mogelijks elk hun eigen functie uitoefenen binnen het immuunsysteem. Van deze subtypes zijn de iNKT-cellen het beste bestudeerd. Zo werd eerder aangetoond dat DN iNKT-cellen voornamelijk een Th1 respons vertonen, terwijl de CD4+ iNKT-cellen zowel Th1 als Th2 cytokines produceren. Verderop bleek dat in EAE in het centraal zenuwstelsel voornamelijk DN cellen voorkomen, terwijl normaal de CD4+ cellen talrijker zijn. Naast de iNKT-cellen bestaan er ook ander soorten NKT-cellen, waarover nog veel minder gekend is. Hoewel hun rol binnen het imuunsysteem minder bestudeerd is, bleek dat zij elkaar binnen tumoren mogelijks antagoneren. In theorie zou dit ook het geval kunnen zijn in auto-immuunziekten, maar om deze hypothese verder te bevestigen of ontkrachten is verder onderzoek noodzakelijk. Verder bestaat er ook controverse rond de rol van cytokines, met uitzondering van de Th2 cytokines waar alle onderzoek in de richting wijst van een protectieve rol. Hoewel in eerste instantie onderzoek ook unaniem lijkt aan te tonen dat Th1 cytokines, in combinatie met een aantal andere factoren, autoimmuunziekten kunnen bevorderen of uitlokken, blijkt de rol van IFN-γ toch minder eenduidig. Zo werd in CIA een bifasische rol aangetoond, waarbij vroeg in het verloop van de aandoening het een uitlokkende factor lijkt te zijn, terwijl in een latere fase het een protectieve functie uitoefent. In T1D is de rol van IFN-γ ook fel bediscussieerd: enerzijds werd door Novak et al. aangetoond dat een laag IFN-γ bescherming zou bieden tegen diabetes, anderzijds wijst onderzoek van Cardell et al. uit dat een defect in IFN-γ productie NOD muizen juist gevoeliger maakt voor het ontwikkelen van diabetes. Ook werd aangetoond dat IFN-γ de Th17 cellijn inhibeert, wat ook weer zou wijzen op een protectieve, eerder dan een exacerberende, rol voor IFN-γ in het geval van een auto-immuunziekte. Th17 is een T-cel subset die recent frequent wordt aangehaald omwille van hun pro-inflammatoire rol in auto-immuunziekten. IL-17 is een cytokine dat zowel door deze Th17 cellen kan geproduceerd worden, maar ook door NKT-cellen. Enerzijds worden Th1 en Th17 cytokines in één adem genoemd wanneer het gaat om bevorderende factoren bij het ontstaan van auto-immuunziekten, anderzijds bleek uit recent onderzoek dat IFN-γ, hét prototype van de Th1 cytokines, de Th17 cellijn juist afremt in een gezond individu. Daarnaast roepen de frequenties van NKT-cellen in auto-immuunziekten verdere vraagtekens op: over het algemeen kan gezegd worden dat deze gedaald zijn in het perifeer bloed van patiënten en muizen met auto-immuunziekten, hoewel de resultaten hieromtrent soms toch tegenstrijdig zijn. Dit, in combinatie met de Th1-bias van de nog aanwezige NKT-cellen, zou dan een mogelijks verklaringsmodel vormen voor de rol van NKT-cellen in auto-immuunziekten. Echter heeft onderzoek in EAE en CIA muizen uitgewezen dat deze NKT-cellen ook aanwezig zijn in de ontstekingszones – respectievelijk het centraal zenuwstelsel en het synovium van de aangetaste gewrichten – , plaatsen waar deze cellen normaal nooit aangetroffen worden. Er is dus tegelijkertijd sprake van een lokale stijging van de NKT-cellen. Op het eerste zicht lijkt deze waarneming in strijd te zijn met de 46
hypotheses dat
juist een daling in NKT-cellen en het daarmee gepaard gaande gebrek aan
bescherming die deze cellen in normale omstandigheden zouden bieden een rol zou spelen in het ontstaan van EAE en CIA. Een mogelijke hypothese waarbij beide waarnemingen elkaar niet uitsluiten zou echter zijn dat de NKT-cellen dalen in het bloed omdat ze specifiek ‘homen’ naar respectievelijk het centraal zenuwstelsel en de gewrichten. Ook in diabetes zijn de resultaten met de betrekking tot de frequentie van de NKT-cellen tegenstrijdig. Specifiek in EAE blijkt dat tijdens een acute opstoot sprake is van een gedaald aantal perifere NKTcellen, en ondanks het verhoogde aantal NKT-cellen in het centraal zenuwstelsel gaat een stijging van de perifere NKT-cellen gepaard met een verbetering in de klinische scores. Dit doet ook weer vermoeden dat het hier gaat om twee verschillende subsets, die elk een verschillende rol kunnen spelen tijdens het ontstaan van een auto-immune aandoening. Ter conclusie kunnen we stellen dat er verschillende manieren zijn waarop NKT-cellen het ontstaan en verloop van auto-immuunziekten kunnen beïnvloeden. Er zijn hierbij zeer veel verschillende factoren betrokken, en verstoring van één van deze factoren kan al aanleiding geven tot het ontstaan van een aandoening.
REFERENTIES 1.
Pinkhof, editor. Pinkhof Geneeskundig Woordenboek: Bohn Stafleu van Loghum
2.
Ogura H, Murakami M, Okuyama Y, Tsuruoka M, Kitabayashi C, Kanamoto M, et al.
Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 2008 Oct 17;29(4):628-36. 3.
Clark K, editor. Clinical Medicine. 6th edition ed: Elsevier.
4.
Parham P, editor. The Immune System. 2 ed: Garland Science; 2005.
5.
Bendelac A, Savage PB, Teyton L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol.
2007;25:297-336. 6.
Lee PT, Benlagha K, Teyton L, Bendelac A. Distinct functional lineages of human V(alpha)24
natural killer T cells. J Exp Med. 2002 Mar 4;195(5):637-41. 7.
Linsen L, Somers V, Stinissen P. Immunoregulation of autoimmunity by natural killer T cells.
Hum Immunol. 2005 Dec;66(12):1193-202.
47
8.
Fujii S, Shimizu K, Hemmi H, Steinman RM. Innate Valpha14(+) natural killer T cells mature
dendritic cells, leading to strong adaptive immunity. Immunol Rev. 2007 Dec;220:183-98. 9.
Novak J, Griseri T, Beaudoin L, Lehuen A. Regulation of type 1 diabetes by NKT cells. Int
Rev Immunol. 2007 Jan-Apr;26(1-2):49-72. 10.
Rachitskaya AV. Cutting Edge: NKT Cells Constitutively Express IL-23 Receptor and
ROR(gamma)t and Rapidly Produce IL-17 upon Receptor Ligation in an IL-6-Independent Fashion. J Immunol. [Cutting Edge]. 2008;180:5. 11.
Berzofsky JA, Terabe M. The contrasting roles of NKT cells in tumor immunity. Curr Mol
Med. 2009 Aug;9(6):667-72. 12.
Yamamura T, Sakuishi K, Illes Z, Miyake S. Understanding the behavior of invariant NKT
cells in autoimmune diseases. J Neuroimmunol. 2007 Nov;191(1-2):8-15. 13.
Miyamoto K, Miyake S, Yamamura T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune
encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 2001 Oct 4;413(6855):531-4. 14.
Hammond KJ, Kronenberg M. Natural killer T cells: natural or unnatural regulators of
autoimmunity? Curr Opin Immunol. 2003 Dec;15(6):683-9. 15.
Wang J, Cho S, Ueno A, Cheng L, Xu BY, Desrosiers MD, et al. Ligand-dependent induction
of noninflammatory dendritic cells by anergic invariant NKT cells minimizes autoimmune inflammation. J Immunol. 2008 Aug 15;181(4):2438-45. 16.
Mills KH. Induction, function and regulation of IL-17-producing T cells. Eur J Immunol. 2008
Oct;38(10):2636-49. 17.
Mars LT, Araujo L, Kerschen P, Diem S, Bourgeois E, Van LP, et al. Invariant NKT cells
inhibit development of the Th17 lineage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 14;106(15):6238-43. 18.
Novak J, Beaudoin L, Griseri T, Lehuen A. Inhibition of T cell differentiation into effectors by
NKT cells requires cell contacts. J Immunol. 2005 Feb 15;174(4):1954-61. 19.
Anderson MS, Bluestone JA. The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annu Rev
Immunol. 2005;23:447-85. 20.
Mercer JC, Ragin MJ, August A. Natural killer T cells: rapid responders controlling immunity
and disease. Int J Biochem Cell Biol. 2005 Jul;37(7):1337-43. 21.
Fletcher JM, Jordan MA, Baxter AG. Type 1 diabetes and NKT cells: a report on the 3rd
International Workshop on NKT cells and CD1-mediated antigen presentation, September 2004, Heron Island, QLD, Australia. Rev Diabet Stud. 2004 Fall;1(3):141-4. 22.
Cardell SL. The natural killer T lymphocyte: a player in the complex regulation of
autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Clin Exp Immunol. 2006 Feb;143(2):194-202. 23.
Kent SC, Chen Y, Clemmings SM, Viglietta V, Kenyon NS, Ricordi C, et al. Loss of IL-4
secretion from human type 1a diabetic pancreatic draining lymph node NKT cells. J Immunol. 2005 Oct 1;175(7):4458-64.
48
24.
Oikawa Y, Shimada A, Yamada S, Motohashi Y, Nakagawa Y, Irie J, et al. High frequency of
valpha24(+) vbeta11(+) T-cells observed in type 1 diabetes. Diabetes Care. 2002 Oct;25(10):1818-23. 25.
Kukreja A, Cost G, Marker J, Zhang C, Sun Z, Lin-Su K, et al. Multiple immuno-regulatory
defects in type-1 diabetes. J Clin Invest. 2002 Jan;109(1):131-40. 26.
Griseri T, Beaudoin L, Novak J, Mars LT, Lepault F, Liblau R, et al. Invariant NKT cells
exacerbate type 1 diabetes induced by CD8 T cells. J Immunol. 2005 Aug 15;175(4):2091-101. 27.
Wu L, Van Kaer L. Role of NKT cells in the digestive system. II. NKT cells and diabetes. Am
J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Nov;293(5):G919-22. 28.
Steinman L, Zamvil SS. How to successfully apply animal studies in experimental allergic
encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 2006 Jul;60(1):12-21. 29.
Mars LT, Gautron AS, Novak J, Beaudoin L, Diana J, Liblau RS, et al. Invariant NKT cells
regulate experimental autoimmune encephalomyelitis and infiltrate the central nervous system in a CD1d-independent manner. J Immunol. 2008 Aug 15;181(4):2321-9. 30.
Brocke EB-CaS, editor. Experimental Models of Multiple Sclerosis: Springer US; 2005.
31.
Furlan R, Bergami A, Cantarella D, Brambilla E, Taniguchi M, Dellabona P, et al. Activation
of invariant NKT cells by alphaGalCer administration protects mice from MOG35-55-induced EAE: critical roles for administration route and IFN-gamma. Eur J Immunol. 2003 Jul;33(7):1830-8. 32.
Mars LT, Laloux V, Goude K, Desbois S, Saoudi A, Van Kaer L, et al. Cutting edge: V alpha
14-J alpha 281 NKT cells naturally regulate experimental autoimmune encephalomyelitis in nonobese diabetic mice. J Immunol. 2002 Jun 15;168(12):6007-11. 33.
Qian G, Qin X, Zang YQ, Ge B, Guo TB, Wan B, et al. High doses of alpha-
galactosylceramide potentiate experimental autoimmune encephalomyelitis by directly enhancing Th17 response. Cell Res. 2010 Apr;20(4):480-91. 34.
Novak J, Beaudoin L, Park S, Griseri T, Teyton L, Bendelac A, et al. Prevention of type 1
diabetes by invariant NKT cells is independent of peripheral CD1d expression. J Immunol. 2007 Feb 1;178(3):1332-40. 35.
Schett G. Joint remodelling in inflammatory disease. Ann Rheum Dis. 2007 Nov;66 Suppl
3:iii42-4. 36.
Chiba A, Kaieda S, Oki S, Yamamura T, Miyake S. The involvement of V(alpha)14 natural
killer T cells in the pathogenesis of arthritis in murine models. Arthritis Rheum. 2005 Jun;52(6):19418. 37.
Chiba A, Oki S, Miyamoto K, Hashimoto H, Yamamura T, Miyake S. Suppression of
collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of alpha-galactosylceramide. Arthritis Rheum. 2004 Jan;50(1):305-13. 38.
Joe B, Wilder RL. Animal models of rheumatoid arthritis. Mol Med Today. 1999
Aug;5(8):367-9.
49
39.
Williams RO. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods Mol
Med. 2004;98:207-16. 40.
Coppieters K, Dewint P, Van Beneden K, Jacques P, Seeuws S, Verbruggen G, et al. NKT
cells: manipulable managers of joint inflammation. Rheumatology (Oxford). 2007 Apr;46(4):565-71. 41.
Coppieters K, Van Beneden K, Jacques P, Dewint P, Vervloet A, Vander Cruyssen B, et al. A
single early activation of invariant NK T cells confers long-term protection against collagen-induced arthritis in a ligand-specific manner. J Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2300-9. 42.
Elewaut D. Natural killer T cells and rheumatoid arthritis: friend or foe? Arthritis Res Ther.
2005;7(2):88-9. 43.
Miellot-Gafsou A, Biton J, Bourgeois E, Herbelin A, Boissier MC, Bessis N. Early activation
of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 2010 Jan 27. 44.
Jung S, Shin HS, Hong C, Lee H, Park YK, Shin JH, et al. Natural killer T cells promote
collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Dec 18;390(3):399403. 45.
Miellot A, Zhu R, Diem S, Boissier MC, Herbelin A, Bessis N. Activation of invariant NK T
cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. Eur J Immunol. 2005 Dec;35(12):3704-13. 46.
Wu L, Van Kaer L. Natural killer T cells and autoimmune disease. Curr Mol Med. 2009
Feb;9(1):4-14. 47.
Linsen L, Thewissen M, Baeten K, Somers V, Geusens P, Raus J, et al. Peripheral blood but
not synovial fluid natural killer T cells are biased towards a Th1-like phenotype in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2005;7(3):R493-502.
50
